EP1347985A2 - Derives de la biotine, leurs procedes de fabrication et leurs utilisations en tant que vecteurs - Google Patents

Derives de la biotine, leurs procedes de fabrication et leurs utilisations en tant que vecteurs

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Publication number
EP1347985A2
EP1347985A2 EP01997495A EP01997495A EP1347985A2 EP 1347985 A2 EP1347985 A2 EP 1347985A2 EP 01997495 A EP01997495 A EP 01997495A EP 01997495 A EP01997495 A EP 01997495A EP 1347985 A2 EP1347985 A2 EP 1347985A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
formula
biotin
bccp
protein
dna sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01997495A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Abdelakim Kharrat
Khalil Bouayadi
Jean-Charles Faye
Emmanuelle Fourcade
Rudi Baron
Daniel Tovar
Casimir Blonski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
MilleGen SA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
MilleGen SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, MilleGen SA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1347985A2 publication Critical patent/EP1347985A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/557—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells the modifying agent being biotin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the subject of the invention is derivatives of biotin, and their uses as vectors, in particular in the context of the implementation of methods for detecting interactions between biological compounds, as well as in pharmaceutical compositions.
  • Small molecule-large molecule interactions play an important role in biological processes. They include all ligand-receptor, ligand-transport protein, hormone-receptor, enzyme-substrate, enzyme-inhibitor interactions ...
  • Gal4 protein which consists of two independent functional domains: a DNA binding domain and a transactivator domain.
  • the complex formed from these two domains acts on a promoter of the chimeric Gall-LacZ fusion gene, "reporter gene" for the interaction, and thus induces the biosynthesis of ⁇ -galactosidase.
  • reporter gene reporter gene for the interaction
  • transcription does not take place.
  • the DNA binding domain of Gal4 can be fused to a protein X, and the transactivating region of the transcription fused to a protein Y. If X and Y have the capacity to bind, the proximity of the two domains allows activation of the transcription of the Gall-LacZ gene.
  • biotin binds to its carrier proteins covalently via its COOH end, and in particular to a protein designated BCCP (for Biotin Carboxylase Carrier Protein), which. in E. coli, is the only protein that accepts to bind to biotin (under the action of an intracellular ligase designated Bir A).
  • BCCP Biotin Carboxylase Carrier Protein
  • BCCP is thus biotinylated by the formation of an amide bond between the COOH function of biotin (represented above), and the NH2 group of a lysine residue (located approximately 34 to 35 residues from the carboxyterminal end of the amino acid sequence of BCCP).
  • the protein thus biotinylated has an enzymatic role in metabolic carboxylation / decarboxylation reactions.
  • biotin or derivatives whose nitrogen atom located in position I '(NI') is substituted by a determined compound, makes it possible to integrate this compound with inside target cells, without there being:
  • biotinyiés while preserving the property of biotin to bind to its carrier protein, such as BCCP) inside target cells, in particular bacterial cells, advantageously E. cells. coli, or yeast, or cells of the human or animal organism (in particular CHO cells).
  • target cells in particular bacterial cells, advantageously E. cells. coli, or yeast, or cells of the human or animal organism (in particular CHO cells).
  • target cells in particular bacterial cells, advantageously E. cells. coli, or yeast, or cells of the human or animal organism (in particular CHO cells).
  • bacterial cells advantageously E. cells. coli, or yeast
  • cells of the human or animal organism in particular CHO cells.
  • the subject of the invention is the derivatives of biotin substituted with the of general formula (I) below
  • - Xi represents a carbon chain, preferably from 1 to 10 carbon atoms, substituted or not, optionally comprising one or more carbonyl or oxycarbonyl groups. and / or a group -NH-, in particular a chain of formula HN- (CH 2 ) nO-CO- in which n is an integer from 1 to 5, and optionally comprising one or more ether, amide and / or amine.
  • - Y represents a hydrocarbon chain of 1 to 5 carbon atoms, substituted or not, - R-2 represents a hydrogen atom, or a protective group, in particular R? represents an alkyl group of 1 to 5 carbon atoms.
  • a more particular subject of the invention is the biotin derivatives of formula (I) mentioned above in which X ⁇ represents a chain of formula -HN- (CH 2 ) nO-CO in which n represents 2 or 4, Y represents a chain hydrocarbon of 4 carbon atoms, and R.2 is a hydrogen atom or a methyl group.
  • biotin of formula (I) are chosen from the following: the compounds of formula (la) below:
  • Ri represents a radical derived from estradiol hemisuccinate of the following formula
  • Ri represents a radical derived from 1 estradiol of the following formula
  • Ri represents a radical derived from N-acetyl-S-farnesyl-cysteine of the following formula
  • Rj represents a radical derived from N-acetyl-S-geranylgeranylcysteine of the following formula:
  • the invention relates more particularly still to the biotin derivatives of formula (I) described above, in which R2 is a hydrogen atom.
  • a subject of the invention is also the biotin derivatives of formula (II) described below, and their use for the preparation of the derivatives of formula (I) mentioned above, by coupling an appropriate function of a determined compound (this function being, where appropriate, previously grafted onto said determined compound) and the function R of said derivatives of formula (II), in particular according to one of the coupling methods described below.
  • biotin derivatives of general formula (II) above correspond to the following formula:
  • -R represents a function -COOH, -NH2, -N3, or a halogen atom
  • -X represents a carbon chain, preferably from 1 to 10 carbon atoms, substituted or not, optionally comprising one or more carbonyl or oxycarbonyl groups, in particular a chain of formula - (CH2) nO- CO in which n is a whole number from 1 to 5,
  • - Y represents a hydrocarbon chain of 1 to 5 carbon atoms, substituted or not, - R-2 represents a hydrogen atom, or a protective group, in particular
  • R.2 represents an alkyl group of 1 to 5 carbon atoms, in particular a methyl group.
  • a more particular subject of the invention is the biotin derivatives of formula (II) above in which R is a halogen atom such as I or Cl, X represents a chain of formula - (CH 2 ) nO-CO- in which n represents 2 or 4, Y represents a hydrocarbon chain of 4 carbon atoms, and R-2 is a methyl group.
  • biotin of formula (II) are those of the following formulas:
  • biotin derivatives of formula (I) and (II) above are advantageously carried out according to the method comprising the following stages: treatment of a biotin derivative of the following formula:
  • RX-CI in which R is as defined above, in particular R represents a halogen atom such as Cl or I, and X is as defined above, in particular X represents a chain of formula - (CH 2 ) n-0-.C0- in which n represents 2 or 4, advantageously at approximately 65 ° C. for 4 days, which leads to obtaining of the compound of formula (Ha) below:
  • esterase such as pig liver esterase (PLE, for Pig Liver Esterase), advantageously at room temperature for approximately 10 days, or
  • the invention relates to the use of biotin derivatives of formula (II) above, as vectors allowing the introduction of a determined compound inside target cells, when said determined compound is linked to the radical R of said derivatives of formula (II).
  • the invention also relates to the use of analogs of biotin of formula (I), as vectors for introducing a 'compound determined within target cells.
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of biotin derivatives defined above, in the context of the implementation of a method for detecting proteins or other non-protein molecules capable of interacting with said determined compound, or in the context of the preparation of medicaments allowing the introduction of a determined compound of therapeutic interest inside cells of the organism.
  • the object of the invention is to provide new methods for detecting interactions between biological compounds, making it possible to study the interaction between on the one hand a determined compound, proteinaceous or not, and, on the other hand a proteinaceous compound or not, tested for its ability to interact with said determined compound.
  • non-protein compound is meant any compound which cannot be produced by a transcription mechanism of a nucleic acid, as opposed to a protein compound capable of being produced by such a mechanism.
  • the subject of the invention is more particularly any method of detecting proteins capable of interacting with the radical Ri (corresponding to the determined compound) of a biotin derivative of formula (I) as defined above, characterized in that that she understands:
  • biotin derivative of formula (I) into contact with host cells transformed so as to contain: • a DNA sequence encoding a first fusion protein comprising BCCP and a first revealing protein, and
  • a DNA sequence encoding a second fusion protein comprising a protein capable of interacting with the radical Ri mentioned above and a second revealing protein, the two revealing proteins being chosen in such a way that their approximation, following an interaction between the protein capable of interacting with the radical R ] in said second fusion protein, and the radical Ri of said derivative of biotin, generates a reaction process the result of which can be detected, this contacting being carried out for a time sufficient to allow the transport of said biotin derivative inside said host cells, and the binding of said biotin derivative to the BCCP of said first fusion protein,
  • the invention relates more particularly to the application of the aforementioned method to the detection of proteins capable of interacting with a determined non-proteinaceous compound, in particular within the framework of the screening of a bank of nucleic acids coding for proteins capable of interact with said determined compound.
  • the different nucleic acids of said library are coupled with the DNA sequence coding for the second aforementioned revealing protein, and the fusion sequences thus obtained, placed under the control of a transcription promoter, are used to transform host cells. using an appropriate vector.
  • the host cells in which a reaction taking place indicating an interaction between the protein or proteins encoded by one or more nucleidic acids mentioned above and the determined compound occurs, are isolated and the amino acid sequences of said proteins are analyzed.
  • the subject of the invention is also any method of detecting molecules, protein or not, still designated below tested molecules, capable of interacting with the radical Ri of a biotin derivative of formula (I) as described below above, characterized in that it comprises
  • a DNA sequence encoding a first fusion protein comprising the BCCP and a first revealing protein
  • the screening methods described above are applied to the detection of interactions between said proteins or non-protein molecules tested, and a determined non-protein biologically active compound, in particular a compound of therapeutic interest.
  • the two revealing proteins used in the above-mentioned detection methods are chosen in such a way that: - the first revealing protein corresponds to a DNA binding domain (such as the GAL4 binding domain described in the article by M. Johnston et al., A model for fungal gene regulatory mechanism the Gay genes of Saccharomyces cerevisiae, Microbiological Rewiews, 51, 458-476, 1987), while the second revealing protein corresponds to a domain of activation of the transcription of a reporter gene (such as the activation domain of GAL4 activating the transcription of the gene coding for galactosidase, in particular £ GalHis3), so that the detection of the transcription product of the reporter gene corresponds to the detection an interaction between the determined compound and the protein or non-protein molecule tested, or
  • a DNA binding domain such as the GAL4 binding domain described in the article by M. Johnston et al., A model for fungal gene regulatory mechanism the Gay genes of Saccharomyces cerevisiae, Microbio
  • the first revealing protein corresponds to a DNA binding domain (such as the LexA binding domain described in the following articles B.E. Markham et al.,
  • galactosidase corresponds to the detection of an interaction between the determined compound and the protein or non-protein molecule tested, or the first revealing protein corresponds to a first fluorescent protein (such as GFP, for Green Fluorescent Protein, described in the article by A.
  • the host cells used in the context of the implementation of the abovementioned methods are bacterial cells, advantageously E. coli cells, or are yeasts, or else are higher eukaryotic cells.
  • the compounds of formula (I) defined above and more particularly those of formulas (la), (lb), (le), (Id), (le), used in the context of the implementation of the The above-mentioned methods are compounds of formula (I) in which R2 represents a hydrogen atom.
  • the invention also aims to provide new compounds for the implementation of such detection methods.
  • the subject of the invention is thus any nucleotide sequence coding for a fusion protein comprising BCCP fused to a revealing protein as described above, in particular the BCCP of escherichia Coli,
  • the subject of the invention is more particularly:
  • nucleotide sequence containing the DNA sequence coding for the activation domain of GAL4 said DNA sequence being linked to the DNA sequence coding for BCCP, the nucleotide sequence containing the DNA sequence coding for the DNA binding domain of LexA, said DNA sequence being linked to the DNA sequence coding for BCCP,
  • nucleotide sequence containing the DNA sequence coding for BFP said DNA sequence being linked to the DNA sequence coding for BCCP.
  • the subject of the invention is also any vector, in particular plasmid, containing a nucleotide sequence as defined above.
  • the invention also relates to host cells, in particular of E. coli, transformed by a vector defined above.
  • the subject of the invention is also any fusion protein comprising BCCP fused to a revealing protein as described above.
  • the subject of the invention is more particularly: the fusion protein between the DNA binding domain of GAL4, and BCCP, - the fusion protein between the activation domain of GAL4, and BCCP ,
  • the invention also relates to the biotin derivatives of formula (I) mentioned above, in which a fusion protein as defined above, is linked to the carboxyl function carried by Y.
  • nucleotide sequences coding for the fusion proteins described in the abovementioned methods can be replaced by a sequence encoding another protein capable of being recognized by and binding to biotin in the cell host system used.
  • kits or kits capable of being used for the implementation of a detection method as described above of the invention comprising
  • a subject of the invention is also the biotin derivatives of formula (I), as described above, in which the radical R ⁇ represents a compound of therapeutic interest.
  • the invention more particularly relates to the biotin derivatives of formulas (la), (Ib), (le), (Id), (le) above.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more biotin derivatives of formula (I), as described above, in which the radical R ⁇ represents a compound of therapeutic interest, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle .
  • a subject of the invention is also the use of biotin derivatives of formula (I), as described above, in which the radical Ri represents a compound of therapeutic interest, for the preparation of medicaments allowing the introduction of said compound of therapeutic interest inside cells of the organism, said drugs being intended for the treatment of pathologies against which said compound of therapeutic interest is active.
  • the invention more particularly relates to the use of compounds of formulas (la), (Ib), (le), (Id) and (le) above for the preparation of a medicament intended for the treatment of breast cancer, atheroma, osteoporosis, or usable as part of wound healing.
  • the invention relates more particularly to the use of compounds of the above-mentioned formula (Ie), in particular of the compound (10) described below, as regulators of the cell proliferation, in particular for the preparation of a medicament intended for the treatment of atheroma, or usable as a healing agent.
  • the invention relates more particularly to the use of compounds of formula (Id) and (the) above, in particular compounds (20) and (13) described below, as inhibitors of cell proliferation, in particular for the preparation of a medicament for the treatment of cancers, such as breast cancer.
  • the invention also relates to the use of biotinyied compounds consisting of biotin, or derivatives thereof, whose nitrogen atom in position l (NI ') is directly or indirectly linked to a determined compound, as as vectors allowing the introduction of a determined compound inside target cells.
  • biotin derivatives any molecule derived by substitution of one or more atoms of biotin other than NI ', in particular by substitution of the carbonyl group adjacent to the atom NI' by a group -NH-, or by substitution of the atom of S by
  • said determined compound is directly linked to the atom NI 'by one of its functions capable of reacting with the atom NI'.
  • said determined compound is modified so as to carry this function capable of reacting with the hydrogen atom carried by NI '.
  • the nitrogen atom NI 'of biotin, or derivatives thereof is substituted by a function capable of forming a covalent bond with a function of said determined compound, the latter being if necessary modified so as to carry this other function.
  • the invention also relates to the use of biotin, or biotin derivatives, mentioned above, in which the nitrogen atom NI 1 is directly or indirectly substituted by a determined compound for the implementation of methods for detecting proteins or other non-protein molecules capable of interacting with said determined compound, and more particularly of methods as described above.
  • the invention also relates to the use of biotin, or biotin derivatives, mentioned above, whose nitrogen atom NI 'is directly or indirectly substituted by a determined compound of therapeutic interest, for the preparation of drugs allowing the introduction of said compound of therapeutic interest inside cells of the organism, said drugs being intended for the treatment of pathologies against which said compound of therapeutic interest is active.
  • the compounds used come from Sigma-Aldrich.
  • d-biotin methyl ester (2) The d-biotin (1) (10 mmol, 2.44 g) is dissolved in 75 ml of anhydrous methanol. 2.6 g of Amberlite 1R120 ion exchange resin, previously washed with 2N hydrochloric acid, rinsed with water until neutral and then dried, are added. The solution is brought to reflux (70 °) for 7 hours under an inert atmosphere. After returning to room temperature, the resin is filtered and rinsed several times with hot methanol. The filtrate is recovered and the methanol evaporated under reduced pressure. 2g (yield 79.5%) of product (2) are obtained in the form of a white powder.
  • N-l ⁇ (4-chloro-l-butoxycarbonyl) -d-biotin methyl ester (3) The d-biotin methyl ester (2) (Immole, 258mg) is dissolved in 5ml of hot anhydrous chloroform, l ⁇ mmoles (3, lg, 2.46ml) of 4-chlorobutyl chloroformate are added and the solution is brought to reflux (65 ° C) for 4 days. After returning to ambient temperature, the chloroform is evaporated under reduced pressure and the yellow solution obtained added dropwise to 250 ml of petroleum ether at 4 ° C. The mixture is kept at 4 ° C. for approximately 15 minutes, until a pale yellow precipitate appears, which is recovered by filtration.
  • the d-biotin methyl ester (2) (Immoles, 258mg) is dissolved in 5ml of hot anhydrous chloroform, l ⁇ mmoles (2,57g, 1,86ml) of 2-chloroethyl chloroformate are added and the solution is brought to reflux (65 C ) during 4 days. After returning to ambient temperature, the chloroform is evaporated under reduced pressure and the yellow solution obtained added dropwise to 250 ml of petroleum ether at 4 C. The mixture is kept at
  • N-acetyl-S-farnesyl cysteine (8) (synthesized according to the method of L. Zhang and P. Casey, The Journal of Biological Chemistry, vol269, N ° 23, ppl5973-15976, 1994) are dissolved in 5 ml of anhydrous dimethylformamide.
  • the solution is placed under an inert atmosphere. 107.2 mmoles (40 mg) of Nl '- (4-amino-1-butoxycarbonyl) -d-biotin methyl ester (S) are dissolved in 4 ⁇ l of anhydrous dimethylformamide to which 214.4 mmoles (30 ml) of triethylamine have been added.
  • the biotin solution is added to the N-acetyl-S-farnesyl cysteine solution, and the mixture placed under an inert atmosphere is stirred at room temperature for 4 days. The solution becomes dark yellow. Dimethylformamide is evaporated under reduced pressure by formation of an azeotrope with toluene.
  • Immoles (28.25 mg) of oleic acid (11) are dissolved in 5 ml of anhydrous dimethylformamide. 0.15 mmoles (16.5 ⁇ l) of N-methylmorpholine are added, 0.2 mmoles (88 mg) of BOP (benzotriazolyl hexafluorophosphate (dimethylamino) phosphonium) and 0.2 mmoles (27 mg) of BOH (N-hydroxybenzotriazole) . The solution is placed under an inert atmosphere.
  • BOP benzotriazolyl hexafluorophosphate (dimethylamino) phosphonium
  • 0.37mmoles (lOOmg) of 17 i-oestradiol (14) and 0.37mmoles (30 ⁇ l) of anhydrous pyridine are dissolved in 3ml of anhydrous tetrahydrofuran.
  • a solution containing 0.37 mmol (571) of 1,2,2,2-tetrachloroethyl chloroformate dissolved in 2 ml of anhydrous tetrahydrofuran is added.
  • a yellow precipitate immediately appears.
  • the solution is stirred at room temperature for 16 hours.
  • the precipitate is filtered through a b ⁇ chner and rinsed with 2 ml of tetrahydrofuran.
  • the filtrate is recovered and the tetrahydrofuran evaporated under reduced pressure.
  • the residue is purified by Flash Chromatography (MeOH: CH2Cl2, 1:99). 25 mg (14.4% yield) of product (15) are obtained in the form of a yellow oil.
  • N-l '- (4- (l 7 i-oestradioI-l 7-oxy-amido) -l-butoxycarbonyl) -d-biotin methyl ester (16) 41.5 ⁇ moles (20mg) of 17y6-oestradiol-l7carbonate of 1, 2,2,2-tetrachloroethyl (15) and 41.5 ⁇ moles (15 mg) of N- - (4-amino-1-butoxycarbonyl) -d-biotin methyl ester (5) are dissolved in 6 ml of tetrahydrofuran and 100 ⁇ l of water. 41.5 ⁇ moles (3.5 ⁇ l) of pyridine are added. A precipitate forms immediately.
  • the biotin solution is added to the N-acetyl-S-geranylgeranylcysteine solution, and the mixture placed under an inert atmosphere is stirred at room temperature for 4 days.
  • the solution becomes dark yellow.
  • Dimethylformamide is evaporated under reduced pressure by formation of an azeotrope with toluene.
  • the residue is dissolved in 10 ml of dichloromethane and the solution obtained washed 4 times with water, then 1 time with an aqueous solution saturated with NaCl.
  • the organic phase is then dried over MgSO 4, then purified by Flash chromatography (MeOH: CH 2 Cl 2 , 3: 97). 44.5 mg (70% yield) of product (19) are obtained in the form of a yellow oil.
  • the BCCP gene was amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) from genomic DNA from Escherichia coli.
  • GAL4 DNA binding domain - BCCP the BCCP gene is inserted (Ncol / BamHI sites) in the eukaryotic expression vector pAS1-CYH2, in fusion with the gene corresponding to the binding domain has GAL4 DNA (amino acids 1 to 147 of GAL4).
  • the fusion gene is under the control of a constitutive promoter.
  • the BCCP gene is inserted (Apal / BamHI sites) in the prokaryotic expression vector pTTQ19CAT, in fusion with the gene corresponding to the binding domain DNA of LexA (amino acids 1 to 81 of LexA) itself inserted by the SphI / Apal sites.
  • the fusion gene is under the control of an IPTG-inducible ptac promoter.
  • a cDNA library of human placenta cells is fused with the GAL4 activator domain gene. Fragments of 500 to 1500 base pairs cloned into Pact2 in fusion with GAL4-ad, marketed by Clontech.
  • the double-hybrid test is developed according to the method of Chang Bai and Stéphen J. Elledge, Methods in Enzymology, 283, ppl41-156, 1997.
  • the plasmids used are vectors of eukaryotic expression: pAS1-CYH2-BCCP which contains the gene of the Biotin Carboxylase Carrier Protein (BCCP) in fusion with the gene of the DNA binding domain of GAL4, and the gene of l 'auxotrophy vis-à-vis tryptophan; pACTII-RhoGDB which contains the RhoGDB gene in fusion with the gene for the activating domain of GAL4, and the gene for auxotrophy with respect to leucine.
  • BCCP Biotin Carboxylase Carrier Protein
  • the yeast strain Y 190 (operator of GAL4-gene for b-galactosidase, deficient in tryptophan and leucine) is transformed by pASl-CYH2-BCCP and pACTII-RhoGDB. spread on a dish containing medium a medium deficient in Leu and Trp: SC Leu-Trp- and incubated for 3 days at 30 C.
  • the transformed yeasts are cultured on SC medium Leu-Trp- deficient in biotin for 24 hours at 30 ° C., then on SC Leu-T ⁇ - medium deficient in biotin and supplemented with InM biotin-ligand for 6 h at 30 ° C.
  • a ⁇ -galactosidase activity test is carried out.
  • biotin derivatives in accordance with the invention find a particularly advantageous application in the following fields, without limitation:
  • Application B development of hormonal assays in vivo (allowing the assay of a global activity) marketable in the form of ready-to-use kits.
  • Application D Identification of primary protein targets (search for targets for new molecules) and secondary (determination of side effects) of small non-peptide molecules in Escherichia coll.
  • the compounds according to the invention can be administered in pharmaceutical preparations at doses of between 0.1 mg to 10 mg per day and per kilo of the person's weight.

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Abstract

Dérivés de la biotine de formule générale (I) suivante, dans laquelle: R1 représente un composé déterminé, X1 représente une chaîne carbonnée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, et/ou un groupe -NH- notamment une chaîne de formule -HN(CH2)n-O-CO- dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5 et comportant le cas échéant une ou des fonctions ether, amide, et/ou amine. Y représente une chaîne hycdrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, R2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de l à 5 atomes de carbone. Application: utilisation en tant que vecteurs, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de méthodes de détection d'interactions entre des composés biologiques, ainsi que dans des compositions pharmaceutiques.

Description

DERIVES DE LA BIOTINE, LEURS PROCEDES DE FABRICATION ET LEURS
UTILISATIONS EN TANT QUE VECTEURS
L'invention a pour objet des dérivés de la biotine, et leurs utilisations en tant que vecteurs, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de méthodes de détection d'interactions entre des composés biologiques, ainsi que dans des compositions pharmaceutiques.
Les interactions petites molécules-grosses molécules ont un rôle important dans les processus biologiques. Elles incluent toutes les interactions ligand-récepteur, ligand-protéine de transport, hormone-récepteur, enzyme-substrat, enzyme-inhibiteur...
Leur mise en évidence ouvre la porte à la compréhension des mécanismes d'action des molécules physiologiques, et à la définition de nouvelles molécules utilisables en pharmacologie.
La mise au point dans la levure de la méthode "double hybride" (Yang et al.,
Science, 257, 680-682, 1992) a permis l'étude des interactions protéine-protéine ou peptide-protéine. Ce système met en jeu la protéine Gal4, qui est constituée de deux domaines fonctionnels indépendants : un domaine de fixation à l'ADN et un domaine transactivateur. Le complexe formé de ces deux domaines agit sur un promoteur du gène chimérique de fusion Gall-LacZ, "gène rapporteur" de l'interaction, et induit ainsi la biosynthèse de β -galactosidase. Lorsque les domaines sont séparés, la transcription n'a pas lieu. Ainsi, le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 peut être fusionné à une protéine X, et la région transactivatrice de la transcription fusionnée à une protéine Y. Si X et Y ont la capacité de se lier, la proximité des deux domaines permet l'activation de la transcription du gène Gall-LacZ.
Cependant, Si cette technique est efficace pour l'étude in vivo d'interactions peptide-protéine, elle ne permet pas de s'intéresser aux ligands non peptidiques. Un autre inconvénient de cette technique est l'outil biologique utilisé : les cellules eucaryotes des levures possèdent un noyau, où a lieu la transcription. Il faut donc que les protéines d'intérêt soient adressées dans le noyau. La biotine est une coenzyme, aussi appelée Vitamine H, synthétiséE par les plantes, les bactéries et certains champignons. Sa structure est la suivante :
A l'intérieur des cellules, la biotine se lie à ses protéines porteuses de façon covalente par son extrémité COOH, et notamment à une protéine désignée BCCP (pour Biotin Carboxylase Carrier Protein), qui. chez E. coli, est la seule protéine acceptant de se lier à la biotine (sous l'action d'une ligase intracellulaire désignée Bir A).
La BCCP se trouve ainsi biotinylée par formation d'une liaison amide entre la fonction COOH de la biotine (représentée ci-dessus), et le groupement NH2 d'un résidu lysine (situé à environ 34 à 35 résidus de l'extrémité carboxyterminale de la séquence en acides aminés de la BCCP). La protéine ainsi biotinylée a un rôle enzymatique dans les réactions de carboxylation/décarboxylation métaboliques.
La présente invention découle de la découverte réalisée par les Inventeurs du fait que la biotine (ou dérivés) dont l'atome d'azote situé en position I' (NI') est substitué par un composé déterminé, permet d'intégrer ce composé à l'intérieur de cellules cibles, sans pour autant qu'il y ait :
- d'une part, rupture de la liaison entre ledit composé déterminé et la biotine,
- et, d'autre part, masquage du site de liaison (à savoir de la fonction COOH susmentionnée) de la biotine à la BCCP.
Ainsi les Inventeurs ont mis en évidence un nouveau mode d'introduction de composés déterminés qui sont biotinyiés (tout en conservant la propriété de la biotine de se lier à sa protéine porteuse, telle que la BCCP) à l'intérieur de cellules cibles, notamment de cellules bactériennes, avantageusement des cellules d'E. coli, ou des levures, ou des cellules de l'organisme humain ou animal (notamment des cellules CHO). L'invention a pour objet les dérivés de la biotine substitués en l' de formule générale (I) suivante
dans laquelle " Ri représente un composé déterminé,
- Xi représente une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle. et/ou un groupe -NH-, notamment une chaîne de formule HN-(CH2)n-O-CO- dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5, et comportant le cas échéant une ou des fonctions éther, amide et/ou amine.
- Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, - R-2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R ? représente un groupe alkyle de 1 à 5 atomes de carbone.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la biotine de formule (I) susmentionnée dans laquelle X\ représente une chaîne de formule -HN-(CH2)n-O-CO dans laquelle n représente 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R.2 est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle.
Par composé déterminé, on entend dans ce qui précède et ce qui suit, toute molécule chimique d'origine synthétique ou naturelle, ou toute molécule biologique d'origine synthétique ou naturelle, protéinique ou non, et notamment toute molécule susmentionnée biologiquement active, et, le cas échéant, susceptible de posséder une action pharmacologique d'intérêt dans l'organisme humain ou animal. Il peut également s'agir non limitativement d'un composé fluorescent, d'un peptide ou d'un oligonucléotide.
Des dérivés de la biotine de formule (I) particulièrement préférés, sont choisis parmi les suivants : les composés de formule (la) suivante:
ans aque e
Ri représente un radical dérivé de l'hémisuccinate d'oestradiol de formule suivante
X\ représente une chaine de formule -HN-(CH2)n-O-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou - CH3.
- les composés de formule (Ib) suivante
dans laquelle
Ri représente un radical dérivé de 1 oestradiol de formule suivante
Xi représente une chaîne de formule -HN-(CH2)n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou -CH3, - les composés de formule (le) suivante
dans laquelle
Ri représente un radical dérivé de laN-acétyl-S-farnésyl-cystéine de formule suivante
• Xi représente une chaîne de formule HN-(CH2)n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou - CH3, les composés de formule (Id) suivante :
dans laquelle
Rj représente un radical dérivé de la N-acétyl-S-géranylgéranylcystéine de formule suivante :
Xi représente une chaîne de formule HN-(CH2)n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou - CH3, les composés de formule (le) suivante,
H3C — (CH2)r— CH
dans laquelle
• Rj représente un radical dérivé de l'acide oléique de formule suivante H3C-(CH2)7-CH = CH -(CH2)7-CO-
• Xj représente une chaîne de formule -HN-(CH2)n-0-CO- dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou -CH3.
L'invention concerne plus particulièrement encore les dérivés de la biotine de formule (I) décrits ci-dessus, dans laquelle R2 est un atome d'hydrogène. L'invention a également pour objet les dérivés de la biotine de formule (II) décrits ci-après, et leur utilisation pour la préparation des dérivés de formule (I) susmentionnés, par couplage d'une fonction appropriée d'un composé déterminé (cette fonction étant, le cas échéant, préalablement greffée sur ledit composé déterminé) et la fonction R desdits dérivés de formule (II), notamment selon l'une des méthodes de couplage décrite ci- après.
Les dérivés de la biotine de formule générale (II) susmentionnés, répondent à la formule suivante :
O
l^ - X -
dans laquelle
-R représente une fonction -COOH, -NH2, -N3, ou un atome d'halogène,
-X représente une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, notamment une chaîne de formule -(CH2)n-O- CO dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5,
- Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non, - R-2 représente un atome d hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment
R.2 représente un groupe alkyle de 1 à 5 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la biotine de formule (II) susmentionnée dans laquelle R est un atome d'halogène tel que I ou Cl, X représente une chaîne de formule -(CH2)n-O-CO- dans laquelle n représente 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R-2 est un groupe méthyle.
Des dérivés de la biotine de formule (II) particulièrement préférés, sont ceux de formules suivantes :
La synthèse des dérivés de la biotine de formule (I) et (II) susmentionnées est avantageusement effectuée selon le procédé comprenant les étapes suivantes : - traitement d'un dérivé de la biotine de formule suivante :
dans laquelle Y est tel que défini ci-dessus, par un composé de formule R2-OH, dans laquelle R2 représente un groupe protecteur tel que défini ci-dessus, notamment un groupe CH3, en présence d'une résine échangeuse d' ions, avantageusement à environ 70 C pendant environ 7 heures, ce qui conduit au composé de formule suivante :
dans laquelle Y et R2 sont tels que définis ci-dessus,
- mise en présence de l'ester obtenu à l'étape précédente avec un composé de formule R-X-CI dans laquelle R est tel que défini ci-dessus, notamment R représente un atome d'halogène tel que Cl ou I, et X est tel que défini ci-dessus, notamment X représente une chaîne de formule -(CH2)n-0-.C0- dans laquelle n représente 2 ou 4, avantageusement à environ 65 C pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ha) suivante :
dans laquelle X, R et Y sont tels que définis ci-dessus, et R2 représente un groupe protecteur, le cas échéant, traitement du composé de formule (Ha) susmentionnée dans laquelle R représente un atome d'halogène, par NaNβ/Nal, avantageusement à environ 60°C pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ilb), à savoir d'un composé de formule (II) dans laquelle R représente N3, X et Y sont tels que définis ci-dessus, et R2 représente un groupe protecteur. le cas échéant, hydrogénation du composé de formule (Ilb) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ile), à savoir d'un composé de formule (II) dans laquelle R représente NH2, X et Y sont tels que définis ci-dessus, et R2 représente un groupe protecteur, le cas échéant, couplage des composés de formules (Ha), (Ilb), (Ile) susmentionnées avec un composé déterminé, à l'aide d'un réactif de couplage, tel que BOP/BOH en présence de triethylamine, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (I) susmentionnée, notamment:
couplage de l'hemisuccinate-17 de β -oestradiol de formule suivante
au composé de formule (Ile) ci-après
dans laquelle n représente 2 ou 4, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (la) susmentionnée suivante :
dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3. couplage du 17-oestradiol-17carbonate de 1,2,2,2-tétrachloroéthyle de formule suivante :
au composé de formule (IIc-1) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (Ib) susmentionnée suivante
dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3,
- couplage de la N-acétyl farnésylcystéine de formule suivante
au composé de formule (IIc-1) susmentionné ce qui conduit à l'obtentiou de composés de formule (le) susmentionnée suivante :
dans laquelle n = 2 ou 4, et 2 = CH3, - couplage de la N-acétyl-S-géranylgéranylcystéine de formule suivante
au composé de formule (IIc-1) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (Id) susmentionnée suivante :
dans laquelle n = 2 ou 4, et R2 = CH3,
- couplage de l'acide oléique de formule suivante
H3C-(CH2).-CH = CH-(CH2)7-COOH
au composé de formule (Ile) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (le) susmentionnée suivante :
H3C— (CHrfT— CH
dans laquelle n - 2 ou 4, et R2 = CH3,
- le cas échéant, déprotection des composés de formules (lia), (Ilb), (Ile), et de formule (I), à savoir de formules (la), (lb), (le), (Id) et (le) susmentionnées, notamment :
. par traitement desdits composés avec une esterase, telle que l'estérase de foie de porc (PLE, pour Pig Liver Esterase), avantageusement a température ambiante pendant environ 10 jours, ou
. par catalyse acide desdits composés, notamment par traitement à l'acide sulfurique à 65 C pendant 24 heures, ce qui conduit à l'obtention des composés de formules (lia), (Ilb), (Ile), et de formule (I), à savoir de formules (la), (Ib), (le), (Id) et (le) susmentionnées, dans lesquelles
R2 = H.
L'invention concerne l'utilisation de dérivés de la biotine de formule (II) susmentionnée, en tant que vecteurs permettant l'introduction d'un composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles, lorsque ledit composé déterminé est lié au radical R desdits dérivés de formule (II).
L'invention concerne également l'utilisation des analogues de la biotine de formule (I), en tant que vecteurs permettant l'introduction d'un ' composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de dérivés de la biotine définis ci-dessus, dans le cadre de la mise en œuvre d'une méthode de détection de protéines ou autres molécules non protéiniques susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé, ou dans le cadre de la préparation de médicaments permettant l'introduction d'un composé déterminé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme.
Ainsi, l'invention a pour but de fournir de nouvelles méthodes de détection d'interactions entre des composés biologiques, permettant d'étudier l'interaction entre d'une part un composé déterminé, protéinique ou non, et, d'autre part un composé protéinique ou non, testé pour sa capacité à intéragir avec ledit composé déterminé. Par composé non protéinique. on entend tout composé ne pouvant pas être produit par un mécanisme de transcription d'un acide nucléique, par opposition à un composé protéinique susceptible d'être produit par un tel mécanisme. L'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de détection de protéines susceptibles d'interagir avec le radical Ri (correspondant au composé déterminé) d'un dérivé de la biotine de formule (I) tel que défini ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en présence dudit dérivé de la biotine de formule (I), avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir : • une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et
• une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de fusion comprenant une protéine susceptible d'interagir avec le radical Ri susmentionné et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre la protéine susceptible d'interagir avec le radical R] dans ladite deuxième protéine de fusion, et le radical Ri dudit dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport dudit dérivé de la biotine à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison dudit dérivé de la biotine à la BCCP de ladite première protéine de fusion,
- l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite protéine susceptible d'interagir avec le radical Ri , et ledit radical Ri
L'invention vise plus particulièrement l'application de la méthode susmentionnée à la détection de protéines susceptibles d'interagir avec un composé déterminé non protéinique, notamment dans le cadre du criblage d'une banque d'acides nucléiques codant pour des protéines susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé.
Les différents acides nucléiques de ladite banque sont couplés avec la séquence d'ADN codant pour la deuxième protéine de révélation susmentionnée, et les séquences de fusion ainsi obtenues, placées sous le contrôle d'un promoteur de transcription, sont utilisées pour transformer des cellules hôtes a l'aide d'un vecteur approprié.
Les cellules hôtes dans lesquelles se produit une réaction témoignant d'une interaction entre la ou les protéines codées par un ou plusieurs acides nucléidiques susmentionnés, et le composé déterminé, sont isolées et les séquences en acides aminés desdites protéines sont analysées. L'invention a également pour objet toute méthode de détection de molécules, protéiniques ou non, encore désignées ci-après molécules testées, susceptibles d'interagir avec le radical Ri d'un dérivé de la biotine de formule (I) tel que décrit ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend
- la mise en présence
• d'un premier dérivé de la biotine de formule (I) dans laquelle Ri représente le composé déterminé avec lequel est susceptible d'interagir une molécule testée, et
• d'un deuxième dérivé de la biotine de formule (I) dans laquelle Rj représente la molécule testée, avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir :
• une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et
• une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de fusion comprenant la BCCP et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical Ri du premier dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport des premier et deuxième dérivés de la biotine susmentionnés à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison desdits dérivés de la biotine aux BCCP desdites protéines de fusion,
- l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical Ri du premier dérivé de la biotine. Avantageusement, les méthodes de criblage décrites ci-dessus, sont appliquées à la détection d'interactions entre lesdites protéines ou molécules non protéiniques testées, et un composé déterminé non protéinique biologiquement actif, notamment un composé d'intérêt thérapeutique.
De préférence, les deux protéines de révélation utilisées dans les méthodes de détection susmentionnées, sont choisies de telle façon que : - la première protéine de révélation correspond à un domaine de liaison à l'ADN (tel que le domaine de liaison de GAL4 décrit dans l'article de M. Johnston et al., A model for fungal gène regulatory mechanism the Gai gènes of Saccharomyces cerevisiae, Microbiological Rewiews, 51, 458-476, 1987), tandis que la deuxième protéine de révélation correspond à un domaine d'activation de la transcription d'un gène rapporteur (tel que le domaine d'activation de GAL4 activant la transcription du gène codant la galactosidase, notamment la £GalHis3), de sorte que la détection du produit de transcription du gène rapporteur correspond à la détection d'une interaction entre le composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée, ou
- la première protéine de révélation correspond à un domaine de liaison à l'ADN (tel que le domaine de liaison de LexA décrit dans les articles suivants B.E. Markham et ai.,
Nucleotide séquence of the lexA gène of Escherichia coli K-12, Nucleic Acids Research, 9, 4149-4160, 1981 P. Oertel-Buchheit et al., Spacing requirements between LexA operator half-sites can be relaxed by fusing the LexA DNA binding domain with some alternative dimerization domains, J Mol Biol, 229, 1-7, 1993), tandis que la deuxième protéine de révélation correspond à un domaine de dimérisation (tel que le domaine de dimérisation de LexA), de sorte que l'absence de détection du produit de transcription d'un gène rapporteur (tel que le gène codant la ?galactosidase) correspond à la détection d'une interaction entre le composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée, ou - la première protéine de révélation correspond à une première protéine fluorescente (telle que la GFP, pour Green Fluorescent Protein, décrite dans l'article de A. Crameri et al., Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling, Nature Biotechnology, 14, 315-319, 1996; GFP : Mutant de Clontech, pGFPuv Bacterial Nector, GenBank Accession #U62636), tandis que la deuxième protéine de révélation correspond à une deuxième protéine fluorescente (telle que la BFP, pour Blue Fluorescent Protein, mutant de Clontech, pBBFP-Νl Nector, Catalog # 6069-1), les deux protéines fluorescentes étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre ledit composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée, engendre un processus de transfert de fluorescence, de sorte que la détection de la fluorescence caractéristique de la première protéine fluorescente à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième protéine fluorescente, correspond à la détection d'une interaction entre le composé déterminé et la protéine ou la molécule non protéinique testée.
De préférence, les cellules hôtes utilisées dans le cadre de la mise en œuvre des procédés susmentionnés, sont des cellules bactériennes, avantageusement des cellules de E. coli, ou sont des levures, ou encore sont des cellules eucaryotes supérieures.
Avantageusement, les composés de formule (I) définie ci-dessus, et plus particulièrement ceux de formules (la), (lb), (le), (Id), (le), utilisés dans le cadre de la mise en œuvre des procédés susmentionnés, sont des composés de formule (I) dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène.
L'invention a également pour but de fournir de nouveaux composés pour la mise en œuvre de telles méthodes de détection. A ce titre, l'invention a ainsi pour objet toute séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite ci-dessus, .notamment la BCCP d'escherichia Coli,
Notamment, l'invention a plus particulièrement pour objet :
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine d'activation de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de dimérisation de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la GFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la BFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP.
L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également les cellules hôtes, notamment de E. coli, transformées par un vecteur défini ci-dessus.
L'invention a également pour objet toute protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet : la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, et la BCCP, - - la protéine de fusion entre le domaine d'activation de GAL4, et laBCCP,
- - la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de LexA, et la BCCP,
- la protéine de fusion entre le domaine de dimérisation de LexA et la BCCP, - la protéine de fusion entre la GFP et la BCCP, - - la protéine de fusion entre la BFPet la BCCP.
L'invention concerne également les dérivés de la biotine de formule (I) susmentionnée, dans laquelle une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, est liée à la fonction carboxyle portée par Y.
S'agissant des séquences nucléotidiques codant les protéines de fusion décrites dans les procédés susmentionnés, la partie de ces séquences codant la BCCP peut être remplacée par une séquence codant une autre protéine susceptible d'être reconnue par la biotine et de se lier à cette dernière dans le système d'hôte cellulaire utilisé.
L'invention a également pour objet les trousses ou kits susceptibles d'être utilisés pour la mise en œuvre d'un procédé de détection tel que décrit ci-dessus de l'invention, comprenant
- des cellules hôtes transformées avec des séquences nucléotidiques susmentionnées codant des protéines de fusion décrites ci-dessus, et/ou - des dérivés de la biotine tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement des dérivés susmentionnés de formule (II) sur le radical R desquels est susceptible d'être greffé le composé déterminé ou la molécule testée susmentionnés.
L'invention a également pour objet les dérivés de la biotine de formule (I), tels que décrits ci-dessus, dans laquelle le radical R\ représente un compose d'intérêt thérapeutique. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la biotine de formules (la), (Ib), (le), (Id), (le) susmentionnées.
L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs dérivés de la biotine de formule (I), tels que décrits ci-dessus, dans laquelle le radical R\ représente un composé d'intérêt thérapeutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention a également pour objet l'utilisation de dérivés de la biotine de formule (I), tels que décrits ci-dessus, dans laquelle le radical Ri représente un composé d'intérêt thérapeutique, pour la préparation de médicaments permettant l'introduction dudit composé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme, lesdits médicaments étant destinés au traitement de pathologies contre lesquelles ledit composé d'intérêt thérapeutique est actif.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de composés de formules (la), (Ib), (le), (Id) et (le) susmentionnées pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer du sein, de l'athérome, de l'ostéoporose, ou utilisable dans le cadre de la cicatrisation.
L'invention vise plus particulièrement l'utilisation de composés de formule (le) susmentionnée, notamment du composé (10) décrit ci-après, en tant que régulateurs de la prolifération cellulaire, notamment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'athérome, ou utilisable en tant que cicatrisant. L'invention vise plus particulièrement l'utilisation de composés de formule (Id) et (le) susmentionnées, notamment des composés (20) et (13) décrits ci-après, en tant qu'inhibiteurs de la prolifération cellulaire, notamment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cancers, tel que le cancer du sein.
L'invention concerne également l'utilisation de composés biotinyiés constitués de la biotine, ou de dérivés de cette dernière, dont l'atome d'azote en position l' (NI') est directement ou indirectement lié à un composé déterminé, en tant que vecteurs permettant l'introduction d'un composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles.
Par dérivés de la biotine, on entend toute molécule dérivée par substitution d'un ou plusieurs autres atomes de la biotine que NI', notamment par substitution du groupe carbonyle adjacent de l'atome NI' par un groupe -NH-, ou par substitution de l'atome de S par
Se ou O, et/ou dont la chaîne latérale de formule -(CH2)4.COOH est modifiée dans sa longueur et/ou par substitution.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit composé déterminé est directement lié à l'atome NI' par l'une de ses fonctions susceptibles de réagir avec l'atome NI'. Le cas échéant, ledit composé déterminé est modifié de manière à porter cette fonction capable de réagir avec l'atome d'hydrogène porté par NI'.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'atome d'azote NI' de la biotine, ou de dérivés de cette dernière, est substitué par une fonction susceptible de former une liaison covalente avec une fonction dudit composé déterminé, ce dernier étant le cas échéant modifié de manière à porter cette autre fonction.
L'invention concerne également l'utilisation de la biotine, ou dérivés de la biotine, susmentionnés, dont l'atome d'azote NI1 est directement ou indirectement substitué par un composé déterminé pour la mise en œuvre de méthodes de détection de protéines ou autres molécules non protéiniques susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé, et plus particulièrement de méthodes telles que décrites ci-dessus.
L'invention a également pour objet l'utilisation de la biotine, ou dérivés de la biotine, susmentionnés, dont l'atome d'azote NI' est directement ou indirectement substitué par un composé déterminé d'intérêt thérapeutique, pour la préparation de médicaments permettant l'introduction dudit composé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme, lesdits médicaments étant destinés au traitement de pathologies contre lesquelles ledit composé d'intérêt thérapeutique est actif.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit des méthodes de préparation de dérivés de la biotine de l'invention, et de la construction de vecteurs et de cellules hôtes pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection selon l'invention d'interactions entre des composés non protéiniques, et des composés protéiniques ou non.
I) Partie expérimentale - Synthèse
Les composés utilisés proviennent de Sigma-Aldrich.
d-biotin methyl ester (2). La d-biotin (1) (10 mmoles, 2,44g) est dissoute dans 75ml de méthanol anhydre. 2,6g de résine échangeuse d'ions Amberlite 1R120, préalablement lavée avec de l'acide chlorhydrique 2N, rincée à l'eau jusqu'à neutralité puis séchée, sont ajoutés. La solution est portée à reflux (70°) pendant 7 heures sous atmosphère inerte. Après retour à température ambiante, la résine est filtrée et rincée plusieurs fois avec du méthanol chaud. Le filtrat est récupéré et le méthanol évaporé sous pression réduite. On obtient 2g (rendement 79,5%) de produit (2) sous forme de poudre blanche.
CCM sur silice : Rf ≈ 0,41 (MeOH:CHCl3, 5:95).
N-l'~(4-chloro-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (3). La d-biotin methyl ester (2) (Immole, 258mg) est dissoute dans 5ml de chloroforme anhydre chaud, lδmmoles (3, lg, 2,46ml) de 4-chlorobutyl chloroformate sont ajoutés et la solution est portée à reflux (65°C ) pendant 4 jours. Après retour à température ambiante le chloroforme est évaporé sous pression réduite et la solution jaune obtenue ajoutée goutte à goutte dans 250ml d'éther de pétrole à 4°C. Le mélange est maintenu à 4 C pendant environ 15 minutes, jusqu'à apparition d'un précipité jaune pâle, qui est récupéré par filtration. Ce précipité est solubilisé dans 1ml de dichlorométhane, et purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOH:CH2Cl2, 3:97). On obtient 350mg (rendement 89,5%) de produit (3) sous forme d'huile jaune épaisse. CCM sur silice : Rf = 0,33 (MeOH:CH2CI2, 3:97).
Analyse élémentaire pour C16H25C1N205S (392,90) : calculé C 48.91, H 6.41, N 7,13, O 20,36. Trouvé C 48,97, H 6,46, N 7.12, 020,36.
N-l'-(2-Chloro-l-ethoxycarboRyl)-d-biotin methyl ester (3'). La d-biotin methyl ester (2) (Immoles, 258mg) est dissoute dans 5ml de chloroforme anhydre chaud, lδmmoles (2,57g, 1,86ml) de 2-chloroéthyl chloroformate sont ajoutés et la solution est portée à reflux (65 C) pendant 4 jours. Après retour à température ambiante, le chloroforme est évaporé sous pression réduite et la solution jaune obtenue ajoutée goutte à goutte dans 250ml d'éther de pétrole à 4 C. Le mélange est maintenu à
4 C pendant environ 15 minutes, jusqu'à apparition d'un précipité jaune pâle, qui est récupéré par filtration. Ce précipité est solubilisé dans 1ml de dichlorométhane, et purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOH:CH2Cl2, 3:97). On obtient 291rng (rendement 80%) de produit (3') sous forme d'huile jaune épaisse.
CCM sur silice : Rf = 0,33 (MeOH:CH2CI2, 3:97).
N-l'-(4-azido-l-etoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (4). Immole (392mg) de (3) et
0. Immole (17mg) de Nal sont dissoutes dans 8ml d'acétone. La solution est rendue homogène par agitation. 5mmoles (325mg) de NaN3 dissoutes dans 2ml d'eau sont ajoutées. La solution est portée à reflux (60 C) pendant 4 jours à l'abri de la lumière. Après retour à température ambiante, l'acétone est évaporée sous pression réduite et l'eau éliminée par lyophilisation. L'huile jaune obtenue est reprise dans 5ml de dichlorométhane. Un précipité blanc apparaît, qui est séparé de la solution par filtration. Le filtrat est récupéré et le dichlorométhane évaporé sous pression réduite. Le résidu est purifié par Flash Chromatographie sur silice (MeOH:CH2Cl2, 4:96). On obtient 379mg (rendement 95%) de produit (4) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf = 0,33 (MeOH:CH2Cl2, 3:97). Analyse élémentaire pour Cι6H25N505S (399,47): calculé C 48.11, H 6,31, N 17,53, 0 20,03. Trouvé C 45,03,H 6,49, N 17,29.
N-l'-(2-azido-l-ethoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (4') Immole (364mg) de (3') et
0. Immole (17mg) de Nal sont dissoutes dans 8ml d'acétone. La solution est rendue homogène par agitation. 5mmoles (325mg) de NaN3 dissoutes dans 2ml d'eau sont ajoutées. La solution est portée à reflux (60°C) pendant 4 jours à l'abri de la lumière. Après retour à température ambiante, l'acétone est évaporée sous pression réduite et l'eau éliminée par lyophilisation. L'huile jaune obtenue est reprise dans 5ml de dichlorométhane. Un précipité blanc apparaît, qui est séparé de la solution par filtration. Le filtrat est récupéré et le dichlorométhane évaporé sous pression réduite. Le résidu est purifié par
Flash Chromatographie sur silice (MeOH:CH2CI2, 4:96). On obtient 289mg (rendement 78%) de produit (4') sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf 0,33 (MeOH:CH2CI2, 3:97).
N-l'-(4-amino-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5).
0,75mmoles (300mg) de (4) sont dissoutes dans lOml d'éthanol. 150mg de Pd/C sont ajoutés, et la solution est placée sous atmosphère de H2. Après 4 heures d'agitation à température ambiante, la solution est filtrée sur papier filtre, et le Pd/C rincé plusieurs fois au méthanol. Le filtrat est récupéré et le méthanol évaporé sous pression réduite. On obtient 210mg (rendement 75%) de produit (5) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf = O (MeOH:CH2Cl2, 3:97).
Chlorhydrate de (S): le composé (5) est repris dans 3ml d'eau. De l'acide chlorhydrique est ajouté jusqu'à obtention d'un pH = 4. La solution est lyophilisée et le chlorhydrate obtenu sous forme de cristaux jaune pâle.
Analyse élémentaire pour C16H28C1N305S (409,93): calculé C 46.88, H 6,88, N 10,25. Trouvé C 47,05, H 6,95, N 10,12.
N-l'-(2-amino-l-ethoxycarbonyI)-d-biotin methyl ester (5').
0,75mmoles (278mg) de (4') sont dissoutes dans 10ml d'éthanol. 150mg de Pd/C sont ajoutés, et la solution est placée sous atmosphère de H2. Après 4 heures d'agitation à température ambiante, la solution est filtrée sur papier filtre, et le PdIC rincé plusieurs fois au méthanol. Le filtrat est récupéré et le méthanol évaporé sous pression réduite. On obtient 181mg (rendement 70%) de produit (5') sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf = O (MeOH:CH2Cl2, 3 :97). N-l'-(4-(b-estradiol- 17-(succin- l-ate-4-amido))- 1-butoxycarbonyl-d-biotin methyl ester (7). 54mmoles (20mg) de b-estradiol-17-hemisuccinate (6) sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre.
Sont ajoutées 8 Immoles (8,9μl) de N-méthylmorpholine, 108mmoles (47.8mg) de BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl~N~oxytris(diméthylamino)phosphoflium) et 108mmoles (14,6mg) de BOH (N-hydroxyberzotriazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 108mmoles (40,3mg) de N-l'-(4-amino — butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5) sont dissoutes dans 4ml de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 216mmoles (30,4μl) de triethylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution de b-estradioll7-hemisuccinate, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans lOml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis i fois avec une solution aqueuse saturée en NaCll. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis purifiée par Flash Chromatographie sur silice (MeOH:CH2CI2, 5:95). La fraction de purification obtenue n'étant toujours pas pure, elle est purifiée par Chromatographie Liquide Haute Performance (colonne C18, éluant acétonitrile/eau 95/5, débit 1 ml/min, détection en UN à 280nm). On obtient 19,2mg (rendement 49%) de produit (7) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf = 0,35 (MeOH:CH2Cl2, 8:92). Ν-l'-(4-(Ν-acetyl-S-farnesylcystéinamido)-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (9).
53,6mmoles (19,7mg) de N-acétyl-S-farnésyl cystéine (8) (synthétisée suivant la méthode de L.Zhang et P.Casey, The Journal of Biological Chemistry, vol269, N°23, ppl5973-15976, 1994) sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 80,4mmoles (8,8μl) de N-méthylmorpholine, 107,2mmoles (47,4mg) de BOP benzotriazolyl-N- oxytris(dimemylamino) phosphonium hexafluorophosphate et 107,2 mmoles (14,5 mg) de BOH (N-hydroxybenzotriazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 107,2mmoles (4Omg) de N-l' -(4-amino-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (S) sont dissoutes dans 4μl de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 214,4mmoles (30ml) de triethylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution de N-acétyl-S-farnésyl cystéine, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10ml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis 1 fois avec une solution aqueuse saturée en NaCI. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis purifiée par Flash Chromatographie sur silice (MeOH:CH2Cl2, 5:95). La fraction de purification obtenue n'étant toujours pas pure elle est purifiée par Chromatographie Liquide Haute
Performance (colonne Cl 8, éluant acétonitrile/eau 50/50, débit 2ml/min, détection en UN à 220nm).
On obtient 17mg (rendement 44%) de produit (9) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf = 0,5 (MeOH:CH2Cl2, 8:92).
Ν-l'-(4-(Ν-acetyl-S-farnesyIcysteinamido)- l-butoxycarbonyl)-d-biotin (10).
7mmoles (5mg) de (9) sont solubilisées dans 500ml d'éthanol. Cette solution est ajoutée à
4,5ml d'une solution tampon KH2PO4/Na2HPO pH=8 contenant 70U de Pig Liver Esterase (1U d'enzyme déprotège Immole de substrat par minute à pH8 et 25 C). La solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3 jours, en ajoutant 70U de Pig Liver Esterase chaque jour. Le mélange réactionnel est acidifié à pH=3 avec une solution d'HCI à 0,1 M, puis on réalise 3 extractions avec 5ml d'acétate d'éthyle. La solution organique est ensuite séchée sur MgSO4 et l'acétate d'éthyle évaporé sous pression réduite. On obtient 0,8mg (rendement 16%) de produit (10) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf = O (MeOH:CH2CI2, 8:92).
N-l'- (4-oleylamido-l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (12).
0, Immoles (28,25mg) d'acide oléique (11) sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 0,15mmoles (16,5μl) de N-méthylmorpholine, 0,2mmoles (88mg) de BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl-N-oxytris(diméthylamino)phosphonium) et 0,2mmoles (27mg) de BOH (N-hydroxybenzotriazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 0,1 8mmo les (71 mg) de N-l'-(4-amino- 1 -butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (5) sont dissoutes dans 4μl de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 0,4mmoles (56ml) de Mé ylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution d'acide oléique, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10ml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis 1 fois avec une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur MgSO4. Le dichlorométhane est évaporé sous pression réduite et le résidu repris dans 5rnl d'éther diéthylique. On observe l'apparition d'un précipité blanc, qui est filtré sur bûchner. Le filtrat est récupéré, l'éther évaporé sous pression réduite et le résidu est purifié par Flash Chromatographie sur silice (MCOH:CH2Cl2, 3:97). On obtient 35mg (rendement 54%) de produit (12) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice . Rf = 0,45 (MeOH:CH2CI2, 8:92).
HRMS (FAB+, MeOH) m/z : 638.41958 (638.42028 cale. Pour C34H59N3065, M+-H)
N-l'-(4-oleylamido-l-butoxycarbonyl)-d-biotin (13).
Hydrolyse acide. A une solution de (12) (80 mg, 0.13 mmol) dans un mélange de 30 ml d'acétonitrile et 10 ml d'eau. Sont ajoutés 100 μl de H2 SO 2N. La solution résultante est agitée à 70° C pendant 48 heures. L'acétonitrile est évaporé et la phase aqueuse extraite 3 fois avec 10 ml de dichlorométhane. Les phases organiques combinées sont lavées 1 fois avec de l'eau saturée en NaCl, séchées (Na2SO ) et concentrées sous pression réduite, pour obtenir 39 mg de (13) sous forme d'huile jaune (rendement 48 %).
CCM sur silice : Rf = 0,25 (MeOH:CH2Cl2, 8:92).
HRSM (FAB+ MeOH) m/z : 646.38715 (646.38658 cale. Pour C33H57N3O6S Mna+)
17 J-oestradiol-17 carbonate de 1,2,2,2-tétrachloroéthyIe (15)
0.37mmoles (lOOmg) de 17 i-oestradiol (14) et0.37mmoles (30μl) de pyridine anhydre sont dissoutes dans 3ml de tétrahydrofurane anhydre. Une solution contenant 0.37mmoles (571) de chloroformate de 1,2,2,2-tétrachloroéthyle dissoutes dans 2ml de tétrahydrofurane anhydre est ajoutée. Un précipité jaune apparaît immédiatement. La solution est mise sous agitation à température ambiante pendant 16 heures. Le précipité est filtré sur bϋchner et rincé par 2ml de tétrahydrofurane. Le filtrat est récupéré et le tétrahydrofurane évaporé sous pression réduite. Le résidu est purifié par Flash Chromatographie (MeOH:CH2Cl2, 1:99). On obtient 25mg (rendement 14.4%) de produit (15) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf 0.49 (MeOH:CH2CI2, 1:99)
N-l'-(4-(l 7 i-oestradioI-l 7-oxy-amido)-l-butoxycarbonyl)-d-biotine methyl ester (16) 41.5μmoles (20mg) de 17y6-oestradiol-l7carbonate de 1,2,2,2-tétrachloroéthyle (15) et 41.5μmoles (15mg) de N- -(4-amino-l-butoxycarbonyl)-d-biotine methyl ester (5) sont dissoutes dans 6ml de tétrahydrofurane et lOOμl d'eau. 41.5 μmoles (3.5 μl) de pyridine sont ajoutées. Un précipité se forme immédiatement. La réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 48 heures. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est repris dans 5ml d'acétate d'éthyle. Cette solution est lavée 3 fois par 5ml d'eau, puis Ifois par 5ml d'eau saturée en NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur Na2S04- Après évaporation de l'acétate d'éthyle sous pression réduite, le résidu est purifié par Flash Chromatographie (MeOH:CH2Cl2, 3:997). On obtient 6mg (rendement 21.5%) de produit (16) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf 0.30 (MeOH:CH2CL,, 5:95)
N-l'-(4-(17/J-oestradioI- 17-(succin-l-ate-4-amido))- 1-butoxycarbonyl) d-biotin (17)
5.5 μmoles (40mg) de N- -(4-(17>6-oestradiol-17-(succin-l-ate-4-amido))-l -butoxycarbonyl) d-biotine methyl ester (7) sont dissoutes dans 15 ml d'un mélange acétonitrile/eau (2 :1). Le pH de la solution est amené à 0.7 par ajout d'H25Û4 concentré. La solution est laissée sous agitation à. 65 C pendant 24 heures. Elle est ensuite neutralisée par ajout de NaOH IN. L'acétonitrile est éliminé par évaporation sous pression réduite, et la phase aqueuse restante extraite plusieurs fois par 5ml d'acétate d'éthyle. On obtient 26mg (rendement 66%) de produit (17) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf 0.14 (MeOH:CH2Cl2, 8:92)
N-l'-(4-(N-acetyI-S-geranylgéranylcystéinamido)~ l-butoxycarbonyl)-d-biotin methyl ester (19) 92 μmoles (40mg) de N-acétyl-S-géranylgéranylcystéine (18) sont dissoutes dans 5ml de diméthylformamide anhydre. Sont ajoutées 38μmoles (15.2μl) de N-méthylmorphoine, 92μmoles (40.7mg) de BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl-N-oxytris(diméthylamino)phosphonium) et 92μmoles (12.4mg) de BOH ~-hydroxybenzotnazole). La solution est placée sous atmosphère inerte. 1 84μmoles (68.6mg) de N- -(4-amino-l-butoxycarbonyi)-d-biotine methyl ester (5) sont dissoutes dans 4μl de diméthylformamide anhydre auquel ont été ajoutées 368μmoles (51.3μl) de triethylamine. La solution de biotine est additionnée à la solution de N-acétyl-S-géranylgéranyl- cystéine, et le mélange placé sous atmosphère inerte est mis sous agitation à température ambiante pendant 4 jours. La solution devient jaune foncé. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite par formation d'un azéotrope avec du toluène. Le résidu est solubilisé dans 10ml de dichlorométhane et la solution obtenue lavée 4 fois à l'eau, puis 1 fois avec une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis purifiée par Flash Chromatographie (MeOH:CH2Cl2,3:97). On obtient 44.5 mg (rendement 70 %) de produit (19) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf= 0.56 (MeOH:CH2CI2, 4:96)
N-l'-(4-(N-acétyl-S-geranyIgéranylcystéinamido)-l-butoxycarbonyl)-d-biotine 2(!>
50.6μmoles (40mg) de N-r-(4-(N-acétyl-S-géranylgéranylcystéinamido)-l-butoxycarbonyl)-d- biotine methyl ester (19) sont dissoutes dans 15 ml d'un mélange acétone/eau (2:1). Le pH de la solution est amené à 0.7 par ajout d'H2S04 2M. [~a solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3 jours. Elle est ensuite neutralisée par ajout de NaOHIN. L'acétone est éliminée par évaporation sous pression réduite, et la phase aqueuse restante extraite plusieurs fois par 5ml de dichiorométhane. On obtient 3 lmg (rendement 90%) de produit (20) sous forme d'huile jaune.
CCM sur silice : Rf 0.30 (MeOH:CH2CI2, 4:96)
N-l'-[ (4-n-butan-4-oic-amido)-l-butoxycarbonyl ] -d-biotin methyl ester (21).
Une solution de 200 mg (0.54 mmol) de (5) et 108 mg (1.08 mmol) d'anhydre succinique dans 5 ml de diméthylformamide est agitée à température ambiante pendant 24 heures. Le diméthylformamide est évaporé sous pression réduite. 10 ml de dichlorométhane sont ajoutés au résidu et la solution est extraite 3 fois avec 10 ml d'eau et lavée 1 fois avec de l'eau saturée en NaCl. La phase organique est séchée (Na2S04) et concentrée pour donner 71 mg de N-l'- [ (4-N-butan-4-oic-amido)-l- butoxycarbonyl ] -d-biotin methyl ester sous forme d'huile jaune (rendement 28 %).
CCM sur silice : RF=0.73 (CH2CI2:MeOH:acide acétique 85:14:1) HRMS (FAB+MeOH) m/z: 474.19169 (474.19101 cale. Pour C2oH3ιN3OgS Mît) Les synthèses des composés (1) à (21), sont résumées dans le schéma suivant
^?J ^ NaI O.léq. Acétoπe/Ea faO O, 4/ours
95% (n=4) / 78% (n=2)
Tamb, 4h 75%(n=4)/70%(n=2)
N-mét ylmorp oiιr,e ÎA-.N. DM F s
H3C- (CH2)7 — CH
υ
BOP. BOH, N-méthylmorpholine, Et3N. DMF
Tamb, 4jours
54%
H3C— (CH2)7— CH =CH (CH2)7 ? C.— H
Me
H3C — (CH2)τ— CH
II) Clonage des gènes de fusion de la BCCP et des protéines de révélation
Le gène de la BCCP a été amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir d'ADN génomique d'Escherichia coli.
- fusion " domaine de liaison à l'ADN de GAL4 - BCCP " : le gène de la BCCP est inséré (sites Ncol/ BamHI) dans le vecteur d'expression eucaryote pASl-CYH2, en fusion avec le gène correspondant au domaine de liaison a l'ADN de GAL4 (acides aminés 1 à 147 de GAL4). Le gène de fusion est sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
- fusion " domaine de liaison à l'ADN de LexA - BCCP " : le gène de la BCCP est inséré (sites Apal / BamHI) dans le vecteur d'expression procaryote pTTQ19CAT, en fusion avec le gène correspondant au domaine de liaison à l'ADN de LexA (acides aminés 1 à 81 de LexA) lui-même inséré par les sites SphI /Apal. Le gène de fusion est sous le contrôle d'un promoteur ptac inductible à l'IPTG.
Les séquences codant pour les protéines de fusion sont indiquées ci-après :
- domaine de liaison à l'ADN de GAL4 - BCCP: MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEI PKCAKSLKNNWECRYSPKT RS PLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMIFKMDSLQDIKALLTGLFVQ DNV KDAVTDRFASVETDMPLTLRQHRISATSSSEES-INKGQRQLTNSPEF MAYPYDVPDYASLGGHMDIRKIKKLIELNEESGISELEISEGEESNRISRAA PAASFPNMQQAYAAPMMQQPAQSΝAAAPATNPSMEAPAAAEISGHINRS PMNGTFYRTPSPDAKAFIENGQKVΝNGDTLCINEAMK MΝQIEADKSGT NKAILVESGQPNEFDEPLNNIEZGS
domaine de liaison à l'ADΝ de LexA - BCCP:
ACQSNΝGQATRGNZSHPZSHQPDRYAADACGΝRAAFGNPFPKRGZ RTSEGAGTQRRYZΝCFRRITRDSSNAGRGRRNAAGRS WARYSZDZKTDR AGZRIRHLRTGΝFZRRRNSTHZPCSSCRKFPCDATSLRCTΝDAAAS SIZRSR SGDRSFHGSASSSGΝQWSHRTFPDGWYFLPHPKPGRKSNHRSGSESQRGR YPNHRZSHEΝDEPDRSGQIRYRESΝSGRKWTTGRIZRAAGRHRVRI A = Ala C = Cys D = Asp E = Glu F = Phe G=Gly
H = His I = Ile K = Lys L = Leu M = Met N = Asn
P = Pro Q = Gin R=Arg S = Ser T = Thr V=Val W=TrpY=Tyr
Partie expérimentale - test double-hybride dans la levure
Une banque d'ADNc de cellules de placenta humain est mise en fusion avec le gène du domaine activateur de GAL4. Fragments de 500 à 1500 paires de bases clones dans Pact2 en fusion avec GAL4-ad, commercialisée par Clontech.
Le test double-hybride est développé suivant la méthode de Chang Bai et Stéphen J. Elledge, Methods in Enzymology, 283, ppl41-156, 1997.
Les plasmides utilisés Sont des vecteurs d'expression eucaryote : pASl-CYH2-BCCP qui contient le gène de la Biotin Carboxylase Carrier Protein (BCCP) en fusion avec le gène du domaine de liaison à l'ADN de GAL4, et le gène de l'auxotrophie vis-à-vis du tryptophane ; pACTII-RhoGDB qui contient le gène de RhoGDB en fusion avec le gène du domaine activateur de GAL4, et le gène de l'auxotrophie vis à vis de la leucine.
La souche de levure Y 190 (opérateur de GAL4-gène de la b-galactosidase, déficiente en tryptophane et leucine) est transformée par pASl-CYH2-BCCP et pACTII-RhoGDB. étalée sur boîte contenant du milieu un milieu déficient en Leu et Trp : SC Leu-Trp- et incubée 3 jours à 30 C. Les levures transformées sont cultivées sur milieu SC Leu-Trp- déficient en biotine pendant 24h à 30° C, puis sur milieu SC Leu-Tφ- déficient en biotine et additionné de InM biotine-ligand pendant 6h à 30° C. Un test d'activité β-galactosidase est effectué.
IN. Applications industrielles
Les dérivés de la biotine conformes à l'invention trouvent une application particulièrement intéressante dans les domaines suivants, non limitativement :
Application A : Production de biotines bi-fonctionnelles flurorescentes utilisables comme marqueurs de protéines. d'ARΝ, d'ADN et commercialisables sous forme de kit de marquage fluorescent spécifique. Applications industrielles : ces produits s'adressent au marché de la recherche en biochimie, biologie moléculaire. Leur potentiel d'utilisation est varié, les principaux avantages étant suivants :
- ils permettent une amélioration de la technologie biotine-avidine, qui trouve actuellement des domaines d'application multiples en recherche fondamentale et appliquée et utilise des biotines non fluorescentes.
- les molécules de biotine fluorescentes peuvent être utilisées en remplacement des molécules radioactives, avec un bénéfice évident pour la sécurité des utilisateurs et les problèmes d'environnement. De plus, leur utilisation permettrait d'éviter les procédés longs et coûteux de stockage et décontamination des déchets radioactifs.
- on peut envisager des applications nouvelles, comme le marquage de protéines in vivo, et l'utilisation simultanée de biotines couplées à différents groupements fluorescents, qui permettraient d'obtenir en même temps plusieurs informations sur les mécanismes moléculaires de la cellule.
Application B : mise au point de dosage hormonaux in vivo (permettant le dosage d'une activité globale) commercialisables sous forme de kits prêts à l'emploi.
Applications industrielles : les applications sont multiples :
au niveau des laboratoires d'analyses médicales: pour le contrôle des taux hormonaux des individus. En effet, les taux d'hormones sont responsables de l'équilibre physiologique de l'individu, et il est important de pouvoir les doser à différentes occasions puberté, ménopause,, pour le traitement des cancers hormon- dépendants pour une utilisation optimale de l'oestrogéno-thérapie de substitution, pour le rééquilibrage hormonal des sportifs... en contrôle qualité chez les vétérinaires pour déceler le taux on hormone des viandes (veau poulet...), pour la détection chez les sportifs des produits dopants - dans l'industrie pharmaceutique pour la définition de nouveaux agonistes et antagonistes des hormones. Application C i Couplage de molécules d'intérêt sur la biotine et association à des peptides permeants~ pour des utilisations en tant que biovecteurs en fonction du peptides couplé, possibilité de transporter la molécule au niveau du cytoplasme ou du noyau des cellules.
Applications industrielles : le principal marché est ici celui de la thérapie génique, pour le transport des pro-drogues ou des adénovirus dans la cellule.
Application D : Identification de cibles protéiques primaires (recherche des cibles de nouvelles molécules) et secondaires (détermination d'effets secondaires) des petites molécules non peptidiques chez Escherichia coll.
Applications industrielles : elles se situent dans la recherche et le développement des médicaments, à deux niveaux distincts : identification des cibles primaires et secondaires des molécules. Ceci est nécessaire pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments, amélioration de l'efficacité des médicaments.
Application E : Sélection d'anticorps catalytiques à partir d'une banque d'anti-coφs (méthode du «phage display»).
Applications industrielles : elles sont multiples. On peut citer par exemple; - en médecine pour la transformation de pro-drogues a des endroits précis de la cellule ou pour corriger des fonctions défectueuses des cellules. dans l'industrie chimique : pour le recyclage des polymères par exemple. V. Application pharmaceutique
Les composés selon l'invention peuvent être administrés dans des préparations pharmaceutiques à des doses comprises entre 0,1 mg à 10 mg par jour et par kilo de poids de la personne.

Claims

REVENDICATIONS
I. Dérivés de la biotine de formule générale (I) suivante :
dans laquelle
Rj représente un composé déterminé, - Xj représente une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, et/ou un groupe -NH-, notamment une chaîne de formule -HN(CH )π-O-CO- dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5 et comportant le cas échéant une ou des fonctions ether, amide, et/ou amine. - Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non,
R2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de là 5 atomes de carbone.
2. Dérivés de la biotine de formule (I) selon la revendication 2, choisis parmi les suivants
- les composés de formule (la) suivante:
dans laquelle
. R] représente un radical dérivé de l'hémisuccinate d'oestradiol de formule suivante
. X\ représente une chaîne de formule HN-(CH2)n-O-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -
H ou CH3, - les composés de formule (Ib) suivante
dans laquelle
. R\ représente un radical dérivé de l'oestradiol de formule suivante
. Xj représente une chaîne de formule HN-(CH2)n-0-CO dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou -CH3,
les composés de formule (le) suivante
Ri représente un radical dérivé de la N-acétyl-S-farnésyl-cystéine de formule
"suivante
Xi représente une chaîne de formule -HN-(CH2)-0-CO- dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou -CH3,
- les composés de formule (Id) suivante
dans laquelle
. Ri représente un radical dérivé de la N-acétyl-Sgéranylgéranylcystéine de formule suivante
. X\ représente une chaîne de formule -HN-(CH2)n-0-CO- dans laquelle n = 2 ou 4, Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou -CH3,
- les composés de formule (le) suivante,
. Ri représente un radical dérivé de l'acide oléique de formule suivante
H3C-(CH2)7-CH = CH-(CH2)7-CO-
. X\ représente une chaîne de formule HN-(CH2)n-0-CO- dans laquelle n = 2 ou 4. Y représente une chaîne hydrocarbonée de 4 atomes de carbone, et R2 représente -H ou -CH3.
3. Dérivés de la biotine de formule générale (H) suivante
O - x
dans laquelle
R représente une fonction -COOH, -NH2, -N3, ou un atome d'halogène, X représente une chaîne carbonée de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, substituée ou non, comportant le cas échéant un ou plusieurs groupes carbonyle ou oxycarbonyle, notamment une chaîne de formule -(CH2)n-O-CO dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 5,
Y représente une chaîne hydrocarbonée de 1 à 5 atomes de carbone, substituée ou non,
R2 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement protecteur, notamment R2 représente un groupe alkyle de 1 à 5 atomes de carbone
4. Dérivés de la biotine de formule (II) selon la revendication 3, de formules suivantes :
5. Procédé de préparation de dérivés de la biotine selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant les étapes suivantes : - traitement d'un dérivé de la biotine de formule suivante
dans laquelle Y est tel que défini dans la revendication 1 ou 3, par un composé de formule R2-OH dans laquelle R2 représente un groupe protecteur, en présence d'une résine échangeuse d'ions, avantageusement à environ 70°C pendant environ 7 heures, ce qui conduit au composé de formule suivante :
dans laquelle Y et R2 sont tels que définis ci-dessus.
mise en présence de l'ester obtenu à l'étape précédente avec un composé de formule R-X-Cl dans laquelle R est tel que défini dans la revendication 3. notamment R représente un atome d'halogène tel que Cl ou I, et X est tel que défini dans la revendication 3, notamment X représente une chaîne de formule -(CH2)n-0-CO- dans laquelle n représente 2 ou 4, avantageusement à environ 65 C pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ha) suivante
dans laquelle X, R, Y et R2 sont tels que définis ci-dessus,
- le cas échéant, traitement du composé de formule (lia) susmentionnée dans laquelle
Ra représente un atome d'halogène, par NaN3tNaI, avantageusement à environ
60 C pendant 4 jours, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ilb), à savoir d'un composé de formule (II) dans laquelle R représente N3, et X, Y et R2 sont tels que définis ci-dessus, - le cas échéant, hydrogénation du composé de formule (Ilb) susmentionnée, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (Ile), à savoir d'un composé de formule (II) dans laquelle R représente NH2, et X, Y et R2 sont tels que définis ci-dessus, le cas échéant, couplage des composés de formules (Ha), (Ilb), (Ile) susmentionnées avec un composé déterminé, à l'aide d'un réactif de couplage, tel que BOP/BOH en présence de triethylamine, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (I) dans laquelle RI, XI et Y sont tels que définis dans la revendication 1, et R2 est tel que défini ci-dessus. le cas échéant, déprotection des composés de formules (1} et (II) , susmentionnées, notamment : • par traitement desdits composés avec une esterase, telle que l'estérase de foie de porc, à température ambiante pendant environ 10 jours, ou
• par catalyse acide desdits composés, notamment par traitement à l'acide sulfurique à 65 C pendant 24 heures, ce qui conduit à l'obtention des composés de formules (I) et (II) susmentionnées, dans lesquelles R2 = H.
6. Utilisation de dérivés de la biotine selon la revendication 1 ou 2, en tant que vecteurs permettant l'introduction dudit composé déterminé à l'intérieur de cellules cibles, dans le cadre de la mise en œuvre d'une méthode de détection de protéines ou autres molécules non protéiniques susceptibles d'interagir avec ledit composé déterminé, ou dans le cadre de la préparation de médicaments permettant l'introduction d'un composé déterminé d'intérêt thérapeutique à l'intérieur de cellules de l'organisme.
7. Méthode de détection de protéines susceptibles d interagir avec le radical R\ d'un dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en présence d'un dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2, avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir : • une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et
• une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de , fusion comprenant une protéine susceptible d'interagir avec le radical Ri susmentionné et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre la protéine susceptible d'interagir avec le radical R\ dans ladite deuxième protéine de fusion, et le radical Ri dudit dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté, cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport dudit dérivé de la biotine à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison dudit dérivé de la biotine à la
BCCP de ladite première protéine de fusion,
- l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite protéine susceptible d'interagir avec le radical Ri et ledit radical R 8. Méthode de détection de molécules, protéiniques ou non, testées pour leur capacité à interagir avec le radical Ri d'un dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2. caractérisée en ce qu'elle comprend
- la mise en présence
• d'un premier dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle Ri représente le composé déterminé avec lequel est susceptible d'interagir la molécule testée, et
• d'un deuxième dérivé de la biotine selon la revendication 1 ou 2. de formule (1) dans laquelle R représente la molécule testée, avec des cellules hôtes transformées de manière à contenir : «une séquence d'ADN codant une première protéine de fusion comprenant la BCCP et une première protéine de révélation, et
• une séquence d'ADN codant une deuxième protéine de fusion comprenant la BCCP et une deuxième protéine de révélation, les deux protéines de révélation étant choisies de telle façon que leur rapprochement, consécutif à une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical Ri du premier dérivé de la biotine, engendre un processus réactionnel dont le résultat peut être détecté,
cette mise en présence étant effectuée pendant un temps suffisant pour permettre le transport des premier et deuxième dérivés de la biotine susmentionnés à l'intérieur desdites cellules hôtes, et la liaison desdits dérivés de la biotine aux BCCP desdites protéines de fusion, l'éventuelle détection du résultat du processus réactionnel dû au rapprochement des deux protéines de révélation, témoignant alors d'une interaction entre ladite molécule testée du deuxième dérivé de la biotine et ledit radical R\ du premier dérivé de la biotine.
9.Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent un ou plusieurs dérivés de la biotine selon la revendication 1 ou 2, de formule (1) dans laquelle Ri représente un composé d'intérêt thérapeutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
10. séquence nucléotidique codant une protéine de fusion comprenant la BCCP et une protéine de révélation pour la mise en œuvre d'une méthode selon la revendication 7 ou 8. choisie parmi
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine d'activation de GAL4, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de liaison à l'ADN de LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP, - la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant le domaine de dimérisation de
LexA, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la GFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP,
- la séquence nucléotidique contenant la séquence d'ADN codant la BFP, ladite séquence d'ADN étant liée à la séquence d'ADN codant la BCCP.
11. Vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique définie dans la revendication 10.
12. Cellules hôtes transformées par un vecteur défini dans la revendication 11.
13. Protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite
13. Protéine de fusion comprenant la BCCP fusionnée à une protéine de révélation telle que décrite dans la revendication 10, notamment
- la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, et la BCCP,
- la protéine de fusion entre le domaine d'activation de GAM, et la BCCP, la protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de LexA, et la BCCP, la protéine de fusion entre le domaine de dimérisation de LexA et la BCCP, - la protéine de fusion entre la GFP et la BCCP, la protéine de fusion entre la BFP et la BCCP.
14. Trousse ou kit pour la mise en œuvre d'une méthode de détection selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- des cellules hôtes transformées selon la revendication 12, et /ou - des dérivés de la biotine selon la revendication 3 ou 4.
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