EP1326645A1 - Komplexe zur einführung von nukleinsäuren in zellen - Google Patents

Komplexe zur einführung von nukleinsäuren in zellen

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Publication number
EP1326645A1
EP1326645A1 EP01969802A EP01969802A EP1326645A1 EP 1326645 A1 EP1326645 A1 EP 1326645A1 EP 01969802 A EP01969802 A EP 01969802A EP 01969802 A EP01969802 A EP 01969802A EP 1326645 A1 EP1326645 A1 EP 1326645A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
complex according
dependent
carbon atoms
independently
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01969802A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Joachim Simon
Martin Vollmer
Ulrich Betz
Philip Scuderi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Covestro Deutschland AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10145134A external-priority patent/DE10145134A1/de
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1326645A1 publication Critical patent/EP1326645A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0233—Polyamines derived from (poly)oxazolines, (poly)oxazines or having pendant acyl groups

Definitions

  • the invention relates to complexes of cationic polymers and nucleic acids, the use of such complexes for the introduction of nucleic acids into cells, and the use of the complexes as medicaments.
  • the invention also relates to new ones
  • nucleic acids for gene therapy or 1-mmunization
  • Protection of the nucleic acids against degradation by nucleases is essential here.
  • exposure of the mucous membranes to parenteral administration is preferable to
  • MALT Mucosa Associated Lymphoid Tissue
  • HIN Human Immunodeficiency Virus
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • Viral vectors such as retroviruses or adenoviruses run the risk of triggering inflammatory or immunogenic processes (Mc Coy et al., Human Gene Therapy 1995, 6, 1553-1560; Yang et al., Immunity 1996, 1, 433-442).
  • Non-viral, synthetic transport systems have so far been worked on as an alternative, but do not yet show the desired properties.
  • Biophysically, systems based on mixtures of lipids and possibly other admixed cell-specific ligands, in particular, are difficult or inadequate to characterize and continue to harbor the risk of dynamic structural change processes during storage and application. In particular, there is no application security as a prerequisite for use as a pharmaceutical.
  • PEI Polyethyleneimine
  • a cationic polymer with a three-dimensional, branched structure is suitable for complexing and condensing nucleic acids (W. T. Godbey, J. of Controlled Release 1999, 60, 149-160).
  • Nucleic acids are shown in cells, wherein in particular polymers with low molecular weights (LMW-PEI, LMW: low molecular weight) in the range around Mw 2000 g / mol showed high activity (EP-A 0 905 254).
  • LMW-PEI low molecular weight polymers with low molecular weight
  • EP-A 0 905 254 A disadvantage of the branched polymers is their undefined structure.
  • Linear polyethyleneimines on the other hand, can be produced with defined molecular weights and have been used in numerous applications for in vitro and in vivo gene transfer (WO 96/02655). Efforts to improve the transfection efficiency of the linear polyethyleneimines have led in two directions (MC Garnett, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1999, 16, 147-207):
  • a targeting effect could be achieved by introducing cell-specific ligands, mostly hydrophilic carbohydrate or peptide structures.
  • the transfer efficiency of the complexed nucleic acids in cells depends on many factors, above all on the interaction between complexes and cell membranes, the type of cell type, the size of the complexes and the charge ratio between the components of the complex. Little is known about the interaction between complexes and cell membrane and the uptake in cells.
  • hydrophobically substituted polyethyleneimines with model membranes consisting of anionic phospholipids could be determined by comparing branched unsubstituted polyethyleneimines with substituted polyethyleneimines (degree of substitution of up to 50 mol% of hexyl- or dodecyl-
  • hydrophobically functionalized polyethyleneimines for the complexation of nucleic acids has only been described for alkyl-substituted systems (WO 99/43752).
  • hydrophobic monomer units are responsible for the transfection increase efficiency (M. Kurisawa et al., J. ControUed Release 2000, 68, 1-8).
  • hydrophobized poly-L-lysine with 25 mol% stearyl units it could be shown that ternary complexes of nucleic acids with lipoproteins in combination with these polymers lead to an increase in transfection efficiency in muscle cells (K.-S. Kim, J. of ControUed Release 1997, 47, 51-59).
  • EP-A
  • polyallylamines which can optionally carry linear and branched alkyl chains or also aryl groups.
  • Hydrophobized polyethyleneimines with long-chain alkyl radicals have already been in the form of quaternary, fully alkylated and thus highly charged structures
  • the present invention relates to complexes which comprise a water-soluble or dispersible linear cationic polymer with hydrophobic substituents and at least one nucleic acid.
  • the polymer is preferably a polyamine and particularly preferably a polyethyleneimine.
  • the hydrophobic substituents can be arranged as side chains or at the end of the polymer.
  • the degree of substitution is preferably between 0.1 and 10 percent.
  • hydrophobic substituents are alkyl chains, acyl chains or steroid-like substituents.
  • Acyl chains are particularly suitable as hydrophobic substituents.
  • hydrophobic substituents which can be introduced by adding the nitrogen functions of the main polymer chain to isocyanates or to ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compounds.
  • a polymer which can preferably be used for complex formation has the following general formula:
  • R 1 is hydrogen, methyl or ethyl
  • R 2 is alkyl having 1 to 23 carbon atoms, preferably alkyl having 12 to 23 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 17 carbon atoms,
  • R 3 and R 4 (end groups) independently of one another are hydrogen and alkyl with 1 to 24
  • carbon atoms preferably alkyl having 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 18 carbon atoms, or have a structure dependent on the initiator,
  • R 5 (end group) is a substituent dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR, where the radicals R den
  • End groups R and R can correspond,
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • Another polymer which can preferably be used for complex formation has the following general formula:
  • R 1 is hydrogen, methyl or ethyl
  • R 2 is alkyl having 1 to 22 carbon atoms, preferably alkyl having 11 to 22 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 16 carbon atoms,
  • R 3 and R 4 (end groups) independently of one another are hydrogen or acyl with 1 to 24 carbon atoms, preferably acyl with 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably acyl with 18 carbon atoms, or have a structure dependent on the initiator,
  • R 5 is a substituent which is dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR 2 , where the radicals R can correspond to the end groups R 3 and R 4 ,
  • the units m and n are not block structures, but statistically in
  • the polymer is new and as such is the subject of the present invention.
  • Another polymer which can preferably be used for complex formation has the following general formula:
  • R, ⁇ , R and .d .. R D3 are hydrogen or hydroxy
  • R 4 and R 5 independently of one another denote hydrogen or bile acids, or have a structure dependent on the initiator
  • R (end group) is a substituent which is dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR 2 , where the radicals R can correspond to the end groups R 4 and R 5 ,
  • the units m and n are not block structures, but statistically in
  • the polymer is new and as such is the subject of the present invention.
  • all stereoisomers are included.
  • the substituents R 1 , R 2 and R 3 can be arranged both in the ⁇ and in the ⁇ configuration.
  • the substituent can be in the 5-position in the ⁇ as well as in the ⁇ configuration (nomenclature according to Römpp-Chemie-Lexikon, 9th edition, Georg Thieme Verlag, 1992).
  • Another polymer which can preferably be used for complex formation has the following general formula:
  • R 1 means OR 4 or NR 4 R 5 , where
  • R 4 and R 5 independently of one another are hydrogen or alkyl having 1 to 24 carbon atoms, preferably alkyl having 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 18 carbon atoms,
  • R 2 and R 3 (end groups) independently of one another correspond to the substituents of the nitrogen atoms of the main polymer chain or have a structure dependent on the initiator,
  • R (end group) is a substituent which is dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH, NHR or NR 2 , where the radicals R can correspond to the end groups R and R,
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • the polymer is new and as such is the subject of the present invention.
  • Another polymer which can preferably be used for complex formation has the following general formula:
  • R 1 is alkyl with 1 to 24 carbon atoms, preferably alkyl with 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably alkyl with 18 carbon atoms,
  • R 2 and R 3 (end groups) independently of one another correspond to the substituents of the nitrogen atoms of the main polymer chain or one which is dependent on the initiator
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • the polymer is new and as such is the subject of the present invention.
  • the polymer preferably has an average molecular weight below 220,000 g / mol, particularly preferably a molecular weight between 2000 and 100,000 g / mol, very particularly preferably a molecular weight between 20,000 and 100,000 g / mol.
  • hydrophobic groups are introduced in polymer-analogous reactions, for example by alkylation with haloalkanes, acylation with carboxylic acid chlorides, acylation with reactive esters, Michael addition to ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compounds (carboxylic acids, carboxamides, carboxylic acid esters) or by
  • the linear polyethyleneimines are prepared, for example, by cationic ring-opening polymerization of 2-ethyloxazoline with cationic initiators, preferably according to a specification by BL Rivas et al. (Polymer Bull. 1992, 28, 3-8).
  • the poly (ethyloxazolines) thus obtained are converted quantitatively into the linear polyethyleneimines by treatment with a mixture of concentrated hydrochloric acid and water, preferably a 1: 1 mixture of concentrated hydrochloric acid and water, with elimination of propanoic acid.
  • the reaction temperature is preferably between 80 and 100 ° C, particularly preferably 100 ° C.
  • the reaction time is preferably between 12 and 30 hours, particularly preferably 24 hours.
  • the product is preferably purified by repeated recrystallization from ethanol.
  • the linear polyethyleneimines can be produced in the desired molecular weight range from 2000 to 220,000 g / mol.
  • alkyl groups e.g. C 18 alkyl groups
  • reaction of a 5% solution of the corresponding linear polyethyleneimine in absolute ethanol at a reaction temperature of 40 to 75 ° C, preferably
  • the reaction time is preferably between 10 and 24 hours, particularly preferably 17 hours.
  • acyl groups e.g. C18 acyl groups
  • the dosing amount of the acid chloride is based exactly on the desired degree of substitution (0.1 to 10%).
  • the reaction time is preferably between 10 and 24 hours, particularly preferably 20 hours.
  • Acyl groups can also be introduced using a reactive ester method with activation of a carboxylic acid derivative with N-hydroxysuccinimide.
  • This method is preferably used in the case of polyethylemmin functionalization with bile acids.
  • the bile acid derivative chenodeoxycholic acid (3, 7 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholic acid), hereinafter abbreviated as a substituent with CDC is reacted with N-hydroxysuccinimide in dimethoxyethane as solvent in the presence of dicyclohexylcarbodiimide.
  • the reaction takes place at room temperature, the reaction time is 16 hours.
  • the reactive ester thus produced is reacted with a 5% solution of the corresponding linear polyethyleneimine in absolute ethanol.
  • the metered amount of the reactive ester is based exactly at the desired degree of substitution (0.1 to 10%).
  • the reaction temperature is between 20 and 60 ° C, preferably 50 ° C.
  • the reaction time is preferably between 10 and 24 hours, particularly preferably 20 hours.
  • chenodeoxycholic acid in oligoamines such as, for example, spermine or pentaethylene hexamine via the reactive ester method
  • oligoamines such as, for example, spermine or pentaethylene hexamine
  • the bile acid-substituted polymers according to the invention have hydrophobic substituents, the degree of hydrophobicity being able to be controlled by the number of hydroxyl groups, analogously to that described by S. Walker et al. described "cationic facial amphiphiles".
  • hydrophobic linear polyethylene imines in water at pH 7 in a concentration of 0.1 to 1 mg / ml, preferably
  • the concentration of the polyethyleneimine solutions for the complex preparation is preferably between 0.1 and 1 mg / ml, particularly preferably 0.5 mg / ml.
  • Standard methods such as 1H NMR spectroscopy, FT-IR spectroscopy and zeta potential measurements can be used to characterize the cationic polymers.
  • the nucleic acid to be used for the complex formation can be, for example, a DNA or RNA.
  • the nucleic acid can be an oligonucleotide or a nucleic acid construct.
  • the nucleic acid preferably comprises one or more genes.
  • the nucleic acid is particularly preferably a plasmid.
  • the nucleic acid can comprise a nucleotide sequence which codes for a pharmacologically active substance or its precursor and / or which codes for an enzyme.
  • the nucleic acid can comprise a nucleotide sequence which codes for an antigen of a pathogen.
  • Pathogens and relevant associated antigens include: herpes simplex virus (HSV-1, HSV-2) and glycoprotein D; Human Immunodeficiency Virus (HIV) and Gag, Nef, Pol; Hepatitis C virus and NS3; Anthrax and Lethal Factor, Leishmania and ImSTIl and TSA; Tuberculosis bacteria and Mtb 8.4.
  • HSV-1, HSV-2 herpes simplex virus
  • HSV-2 Human Immunodeficiency Virus
  • Gag Nef, Pol
  • Hepatitis C virus and NS3 Hepatitis C virus and NS3
  • Anthrax and Lethal Factor Leishmania and ImSTIl and TSA
  • Tuberculosis bacteria and Mtb 8.4 any nucleic acid can be used which codes for an antigen against which there is an immune response. If necessary, various nucleic acids coding
  • the nucleic acid can comprise a nucleotide sequence which codes for an allergen.
  • Allergens include f2 (house dust mite), Bet vl
  • any nucleic acid can be used that codes for an antigen that causes allergic reactions in humans or animals. If necessary, various nucleic acids coding for allergens must be combined.
  • the nucleic acid can comprise a nucleotide sequence which codes for an immunomodulatory protein.
  • Immunomodulatory proteins are, for example, cytokines (e.g. IL-4, IFN ⁇ , IL-10, TNF ⁇ ), chemokines (e.g. MCP-1, MlPl ⁇ , RANTES), co-stimulators (e.g. CD80, CD86, CD40, CD40L) or others (e.g. heat shock protein ).
  • CpG motifs in DNA sequences also have immunomodulatory properties.
  • the nucleic acid can comprise a nucleotide sequence which codes for a fusion protein consisting of antigen allergen and immunomodulatory protein.
  • the nucleic acid preferably further comprises sequences which lead to a specific gene being expressed specifically, for example virus-specifically (ie for example only in virus-infected cells), (target) cell-specific, metabolically specific, cell cycle-specific, development-specific or non-specifically.
  • the nucleic acid comprises a gene which encodes the desired protein and specific promoter sequences and, if appropriate, further regulatory sequences.
  • promoter and / or enhancer sequences are, for example, in Dillon,
  • LTR sequences of Rous sarcoma viruses and of retroviruses examples include the LTR sequences of Rous sarcoma viruses and of retroviruses, the promoter and enhancer region of CMV viruses, the ITR sequences and / or promoter sequences p5, pl9 and p40 of AAV viruses, the ITR and / / or promoter sequences of adenoviruses, the ITR and / or promoter sequences of vaccinia viruses, the ITR and / or promoter sequences of herpes viruses, the promoter sequences of parviruses and the promoter sequences (upstream regulator region) of papillomaviruses.
  • the complexes according to the invention can also comprise polymers to which cell-specific ligands are coupled.
  • Such cell-specific ligands can, for example, be such that they bind to the outer membrane of a target cell, preferably an animal or human target cell.
  • Complexes according to the invention which contain ligands can be used for the target cell-specific transfer of a nucleic acid.
  • the target cell can be, for example, an endothelial cell, a muscle cell, a macrophage, a lymphocyte, a glial cell, a blood-forming cell, a tumor cell, for example a leukemia cell, a virus-infected cell, a bronchial epithelial cell or a liver cell, for example a sinusoidal cell of the liver.
  • a ligand that binds specifically to endothelial cells can, for example, be selected from the group consisting of monoclonal antibodies or their fragments that are specific for endothelial cells, glycoproteins that carry mannose and glycoproteins, glycolipids or polysaccharides, cytokines, Growth factors, adhesion molecules or, in a particularly preferred embodiment, glycoproteins from the envelope of viruses that have a tropism for endothelial cells.
  • a ligand that binds specifically to smooth muscle cells can be selected, for example, from the group comprising monoclonal antibodies or their fragments that are specific for actin, cell membrane receptors and growth factors or, in a particularly preferred embodiment, from glycoproteins from the envelope of viruses who have tropism for smooth muscle cells.
  • a ligand that binds specifically to macrophages and / or lymphocytes can, for example, be selected from the group comprising monoclonal antibodies that are specific for membrane antigens
  • Macrophages and / or lymphocytes intact immunoglobulins or Fc fragments of polyclonal or monoclonal antibodies, which are specific for membrane antigens on macrophages and / or lymphocytes, cytokines, growth factors, peptides bearing terminal mannose, proteins, lipids or polysaccharides or, in a particularly preferred one Embodiment of glycoproteins from the envelope of viruses, in particular the HEF protein from the influenza C virus with a mutation in the nucleotide position 872 or HEF cleavage products of the influenza C virus containing the catalytic triad serine-71, histidine-368 or -369 and aspartic acid 261st
  • a ligand that binds specifically to glial cells can, for example, be selected from the group comprising antibodies and antibody fragments that specifically bind to
  • a ligand that binds specifically to hematopoietic cells can, for example, be selected from the group comprising antibodies or A- ⁇ tikö ⁇ erfragmente, which are specific for a receptor of the stem cell factors, IL-1 (especially receptor type I or II), IL-3 ( in particular receptor type or ⁇ ), IL-6 or GM-CSF, and intact immunoglobulins or Fc fragments which have this specificity and growth factors such as SCF, IL-1, IL-3, IL-6 or GM-CSF and their fragments, the related ones
  • a ligand that specifically binds to leukemia cells can for example, selected from the group comprising antibodies, antibody fragments, immunoglobulins or Fc fragments that bind specifically to membrane structures on leukemia cells, such as CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, sialosyl-Le, CD5, CDle, CD23, M38, IL- 2-receptors, T-cell receptors, CALLA or CD 19, as well as growth factors or fragments derived from them
  • a ligand that binds specifically to virus-infected cells can, for example, be selected from the group comprising antibodies, antibody fragments, intact immunoglobulins or Fc fragments which are specific for a virus antigen which, after infection by the virus, is expressed on the cell membrane of the infected cell ,
  • a ligand that can bind specifically to bronchial epithelial cells, sinusoidal cells of the liver or liver cells can be selected, for example, from the group comprising transferrin, asialoglycoproteins, such as asialoorosomucoid, neoglycoprotein or galactose, insulin, peptides carrying terminal mannose, proteins, lipids or polysaccharides, intact Immunoglobulins or Fc fragments that bind specifically to the target cells and, in a particularly preferred embodiment, from glycoproteins from the envelope of viruses that bind specifically to the target cells. Further detailed examples of ligands are e.g. in EP-A 0 790 3
  • the invention further relates to the use of the invention
  • the complexes can be used for introducing a nucleic acid into a cell or target cell (transfection), for producing a medicament and / or in gene therapy as well as for prophylactic and therapeutic vaccination and tolerance induction for allergies.
  • the invention preferably relates to the use of the complexes according to the invention for introducing non-viral or viral nucleic acid constructs into a cell and the administration of this (transfected) cell to a patient for the purpose of prophylaxis or therapy of a disease, the cell being, for example, an endothelial cell, a lymphocyte , a macrophage, a liver cell, a fibroblast, a muscle cell or an epithelial cell and this cell can be applied locally to the skin, for example, or subcutaneously, intramuscularly, into a wound, into a body cavity, into one Organ or can be injected into a blood vessel.
  • the invention relates to the use of the complexes according to the invention for the prophylaxis or therapy of a disease, wherein the complexes according to the invention can be administered in a customary manner, preferably orally, parenterally or topically.
  • the complexes according to the invention can be administered or injected, for example, perlingually, intranasally, dermally, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, rectally, into a wound, into a body cavity, into a body opening, into an organ or into a blood vessel.
  • An advantage of the complexation of nucleic acids according to the invention before introduction into the patient lies in the fact that the formation of anti-DNA antibodies is thereby made more difficult.
  • naked DNA introduced into experimental animals, led to an increase in the formation of lupus prone mice
  • the present invention furthermore relates to a method for producing a transfected cell or target cell, the complexes according to the invention being incubated with this cell.
  • the transfection is preferably carried out in vitro.
  • the invention further relates to a transfected cell or target cell which contains the complexes according to the invention.
  • the invention further relates to the use of the transfected cell, for example as a medicament or for
  • the present invention furthermore relates to a medicament which contains the complexes according to the invention and / or a cell transfected therewith.
  • the present invention also relates to a method for producing a medicament, the complexes according to the invention being mixed with further additives.
  • the present invention also relates to the coupling of the polymers according to the invention to a cell-specific ligand and the use of the coupling product in a complex with a viral or non-viral nucleic acid for the introduction of this nucleic acid into a cell or for the administration of the complex to a mammal for prophylaxis or therapy an illness.
  • the possibilities of producing and coupling cell-specific ligands have already been described in detail in patent applications EP-A 0 790 312 and DE-A 196 49 645. Reference is expressly made to these patent applications.
  • the complexes of polymer according to the invention represent a gene transfer material for gene therapy.
  • these complexes are administered externally or internally, locally, into a body cavity, administered into an organ, into the bloodstream, into the airway, into the gastrointestinal tract, into the urogenital tract, orally, intranasally, intramuscularly or subcutaneously.
  • the present invention also relates to cells, in particular from yeasts or mammals, into which a nucleic acid construct has been introduced with the aid of the complexes according to the invention.
  • the nucleic acid constructs are introduced into cell lines with the aid of the complexes according to the invention, which can then be used after transfection to express the selected gene. These cells can thus be used to provide a drug to patients.
  • the invention furthermore relates to the use of mammalian cells into which a nucleic acid has been introduced with the aid of the complexes according to the invention for the production of a medicament for the treatment or prophylaxis of a disease.
  • endothelial cells can be obtained from the blood, treated in vitro with the complexes according to the invention and injected into the patient, for example intravenously.
  • dendritic cells antigen-presenting cells
  • Such in vitro transfected cells can also in combination with the invention
  • Complex patients are administered. This combination means that cells and complexes are administered or injected at the same time or at different times, at the same or at different locations.
  • the polymers according to the invention are complexed with the nucleic acid by mixing the two starting substances.
  • the mixing ratio is determined by the target charge ratio between negatively charged nucleic acid and positively charged polymer. From zeta potential measurements it could be determined that in the case of the hydrophobically functionalized linear polyethyleneimines (H-LPEI) the degree of protonation at pH 7 is approx. 50%.
  • H-LPEI hydrophobically functionalized linear polyethyleneimines
  • DNA / polymer can vary between 1: 0.1 and 1:10.
  • the preferred charge ratio is between 1: 2 and 1:10. With charge ratios of 1: 5 to 1:10, turbidity or precipitation can occur with a DNA concentration of 100 ⁇ g / ml. If precipitates occur, they can be resuspended or redispersed before application.
  • the complexes according to the invention are preferably prepared by adding the H-LPEI solution to the corresponding nucleic acid solution.
  • concentrations are particularly preferably set such that a 1: 1 vol. Mixture is produced.
  • the complexes can be examined by agarose gel electrophoresis to characterize the charge ratios. Selected complexes can be examined by atomic force microscopy to obtain information about the DNA condensation and the size of the complexes.
  • hydrophobic groups which are bonded to the polymer chain show particularly good results despite reduced water solubility and form defined condensed complexes.
  • hydrophobically modified polymers such as surfactants or emulsifiers work and are therefore not able to form particulate complexes with nucleic acids.
  • the hydrophobic substituents determine the surface characteristics of the nucleic acid / polymer complexes, which consequently leads to an increased cell-membrane interaction and thus to an increased transfection efficiency.
  • H-LPEI hydrophobic linear polyethyleneimines
  • LPEI linear unsubstituted polyethyleneimines
  • acylated polyethyleneimines in particular proved to be effective, preferably with a C18 side chain.
  • the degree of acylation is between 0.1 and 10 percent, preferably between 1 and 5 percent and particularly preferably 3 percent.
  • the average molecular weight is preferably in the range from 20,000 to 100,000 g / mol.
  • linear polyethyleneimines with bile acid substituents in particular have been identified as effective, preferably with CDC substituents.
  • the degree of acylation is between 0.1 and 10 percent, preferably between 1 and 5 percent and particularly preferably 3 percent.
  • the molecular weight is preferably in the
  • Linear polyethylenes were obtained by cationic ring-opening polymerization of 2-ethyloxazoline to poly (ethyloxazoline) (analogously to B.L. Rivas, S.I. Anamas, Polymer Bull.
  • a quantitative hydrolysis was achieved by reacting, for example, 24.7 g of poly (ethyloxazoline) (Mw 200,000 g / mol) in a mixture of 40 ml of water and 40 ml of concentrated hydrochloric acid at 100 ° C. After 24 hours, the voluminous precipitate formed was dissolved by adding 250 ml of water. After cooling to 20 ° C., the product was adjusted to pH 11 with the addition of 20% NaOH and precipitated. After suction and washing the precipitate (wash water pH 7) was dried in a high vacuum over Phospho ⁇ entoxid. The crude product was then recrystallized from ethanol (yield 9.5 g / 88%). Highly pure batches (milligram amounts) were obtained by column chromatography over Sephadex G25
  • H-LPEI hydrophobically functionalized linear polyethyleneimines
  • the alkylated linear polyethyleneimines were characterized by IH-NMR and FT-IR, whereby the desired degree of alkylation could be confirmed.
  • H-LPEI hydrophobically functionalized linear polyethyleneimines
  • the acylated linear polyethyleneimines were characterized by IH-NMR and FT-IR, whereby the desired degree of acylation could be confirmed.
  • H-LPEI hydrophobically functionalized linear polyethyleneimine
  • High-purity batches (milligram amounts) were obtained by column chromatography over Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) of saturated aqueous solutions (pH 7) of the polyethyleneimine with Millipore water as eluent and subsequent
  • Zeta potential measurements were carried out to determine the charge or the degree of protonation of the linear polyethyleneimines and the hydrophobically functionalized polyethyleneimines in aqueous solution at a physiological pH. Regardless of the average molecular weight and regardless of the polymer type, an average degree of protonation of 50% could be determined at pH 7, i.e. approx. 50% of the nitrogen atoms are protonated in aqueous solution at pH 7.
  • the aim was the production of polynucleotide / polymer complexes using the example of
  • PCY2 is 9164 bp long and contains the "thyroid hormone binding globulin" promoter, two copies of the alpha-1 microglobulin / bikunin enhancer and the 5 'region of a rabbit beta globulin gene. Introns that control the expression of a human B region deleted FV-H gene.
  • the plasmid also contains an ampicillin antibiotic resistance gene, the ColEl origin of replication and a polyA site.
  • Dilution series were prepared from the stock solutions (1 ml each, Table 1) which, by reaction with polynucleotide solutions with a concentration of 500 ⁇ g / ml in a volume ratio of 1: 1, gave rise to a polynucleotide complex with a defined charge and a polynucleotide concentration of 250 ⁇ g / ml lead (Table 2).
  • Table 2 Dilution series
  • precipitates can occur which can be resuspended or redispersed before the respective application.
  • the polymer solutions were pipetted at room temperature under sterile conditions to the polynucleotide solutions and then mixed in vortex. After an incubation period of 4 hours at room temperature, the polynucleotide / polymer complexes were stored at 4 ° C., the storage stability of the complexes extended over several weeks. For animal experiments, the complex solutions can be diluted as desired. Table 1: Preparation of dilution series from LPEI or H-LPEI stock solutions
  • Table 2 Overview of the preparation of polynucleotide / LPEI or H-LPEI complexes (aqueous solutions) with different charge ratios for in vivo experiments and for gel electrophoretic studies
  • the complexation behavior of the polymers and the charge situation of the polynucleotide / polymer complexes were investigated by agarose gel electrophoresis.
  • the gels were each made from 0.4 g agarose and 40 ml trisacetate buffer (0.04 M, pH 8.3 with 0.01 M EDTA) (thickness approx. 0.6 cm).
  • the gel electrophoresis was usually carried out at a current of 100 to 150 mA (110 V).
  • a DNA marker (PeqLab, 1 kb ladder) and bare (uncomplexed) polynucleotide were also analyzed in each gel electrophoresis run.
  • Selected polynucleotide / polymer complexes which were prepared in aqueous solution, were characterized by AFM (Digital Instruments).
  • AFM Digital Instruments
  • the solutions of the complexes were diluted with water to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ g / ml and between 1 and 5 ⁇ l of the diluted solutions were pipetted onto a silicon substrate. After the water has evaporated (approx. 5 min), the sample is analyzed in the AFM. It was shown that from a polynucleotide / polymer ratio of 1: 0.15 DNA condensation and particle formation takes place, the particle size being in the range from 100 to 200 ⁇ m.
  • H-LPEI hydrophobically functionalized polyethyleneimines
  • Plasmid pCY2 prepared.
  • mice Female C57Bl / 6 mice, 5-6 weeks old, each weighing approximately 20 g, were used. The mice were purchased from Simonsen Labs Ine, USA.
  • mice / group were used and in the tail vein with either 50 ug plasmid DNA alone or 50 ug plasmid DNA + polymer in
  • the DNA polymer charge ratio was 1: 0.5.
  • 10 mice / group and different charge ratios of DNA polymer / LPEI or polymer / H-LPEI used. The animals were bled retro-orbitally 24 hours after injection.
  • Plasma samples from these animals were examined using a modified FVIII activity test.
  • the plasma was first buffered 1: 4 in phosphate
  • C7F7 mouse monoclonal antibody Dilute saline before transferring it to a 96-well microtiter plate coated with the C7F7 mouse monoclonal antibody.
  • the C7F7 antibody is specific for the light chain of human FVIII and does not react with mouse FVIII. After 2 hours of incubation at 37 ° C, the plate was washed twice with PBS containing 0.05% Tween 20. After that, the
  • Coating buffer Either Sigma P-3813, pH 7.4 or 0.1 M hydrogen carbonate buffer pH 9.2;
  • Blocking buffer 1x Coatest buffer solution + 0.8% BSA + 0.05% Tween 20; Wash buffer: 20mM Tris-HCl, 0.1M NaCl, 0.05% Tween 20 pH 7.2, filter before use;
  • Incubation buffer blocking buffer without Tween 20;
  • Coatest VIII C / 4 test kit: Chromogenix AB, # 82-19-18-63 / 2 Nerfahren:
  • LPEI Polyethyleneimine
  • Table 4a FNIII gene expression after injection of D ⁇ A / polymer complexes: group 1, 5 mice (la-le), polymer: H-LPEI, Mw 86980, C18, acyl, 3 mol% (* dilution factor 4)
  • Table 4b FVIII gene expression after injection of DNA / polymer complexes: Group 2, 5 mice (2a-2e), polymer: H-LPEI, Mw 86980, CDC, 3 mol% (* dilution factor 4)
  • Table 5a FVIII gene expression after injection of naked DNA: group 3, 5 mice (DNA1-DNA5), (* dilution factor 4)
  • Table 5b FVIII gene expression after injection of DNA / polymer complexes: Group 4, 5 mice (4a-4e), polymer: LPEI, Mw 86,980 g / mol, unsubstituted (* dilution factor 4)

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Abstract

Die Erfindung betrifft Komplexe aus kationischen Polymeren und Nukleinsäuren, die Verwendung solcher Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen und Organismen, die Verwendung der Komplexe als Arzneimittel, sowie neue Polymere, die für die Herstellung der Komplexe verwendet werden können.

Description

Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen
Die Erfindung betrifft Komplexe aus kationischen Polymeren und Nukleinsäuren, die Nerwendung solcher Komplexe zur Einfiihrung von Nukleinsäuren in Zellen, sowie die Nerwendung der Komplexe als Arzneimittel. Die Erfindung betrifft auch neue
Polymere, die für die Herstellung der Komplexe verwendet werden können.
Weiterführende Erfolge bei der therapeutischen Anwendung von Nukleinsäuren (DNA und RNA) in vivo haben sich am Menschen bisher noch nicht realisieren lassen. Gründe hierfür liegen vermutlich in der begrenzten Expression der notwendigen genetischen Information, die wiederum durch eine unzureichende Effizienz des Gentransfers bzw. der Verfügbarkeit der zu exprimierenden Nukleinsäuren begründet ist. Daneben spielen Gründe wie die unzureichende Stabilität eingesetzter Transportbzw. Vektorsysteme sowie unzureichende Biokompatibilität eine wichtige Rolle.
Besonders attraktiv ist die Möglichkeit einer oralen oder intranasalen Verabreichung von Nukleinsäuren zur Gentherapie oder 1-mmunisierung (Page & Cudmore, Drug Discovery Today 2001, 6, 92-101). Hierbei ist ein Schutz der Nukleinsäuren vor einem Abbau durch Nukleasen essentiell. Insbesondere im Falle der Nakzinierung ist eine Exposition der Schleimhäute der parenteralen Applikation vorzuziehen, um eine
Stimulation des MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) zu gewährleisten, welches in die immunologische Protektion der Schleimhäute involviert ist. Eine Verhinderung von Infektionen in diesem Bereich ist z.B. bei Pathogenen wie HIN (Humanes Immundefizienzvirus) oder HSV (Herpes Simplex Virus) von großer Bedeutung.
Virale Vektoren wie Retroviren oder Adenoviren bergen die Gefahr, inflamma- torische oder immunogene Prozesse auszulösen (Mc Coy et al., Human Gene Therapy 1995, 6, 1553-1560; Yang et al., Immunity 1996, 1, 433-442). Nicht-virale, synthetische Transportsysteme werden bislang als Alternative bearbeitet, zeigen jedoch noch nicht die gewünschten Eigenschaften. Biophysikalisch sind insbesondere auf Mischungen von Lipiden sowie gegebenenfalls weiteren zugemischten zellspezifischen Liganden basierende Systeme nur schwer oder unzurei- chend charakterisierbar und bergen weiterhin die Gefahr von dynamischen Struk- turänderungsprozessen bei Lagerung und Applikation. Insbesondere eine Applikationssicherheit als Voraussetzung für die Verwendung als Arzneimittel ist hierbei nicht gegeben.
Komplexe auf der Basis von synthetischen kationischen Polymeren haben daher eine bevorzugte Rolle sofern ihre strukturellen Merkmale reproduzierbar hergestellt und eindeutig charakterisiert werden können (M.C. Garnett, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1999, 16, 147-207).
Zahlreiche beschriebene Herstellungsverfahren von synthetischen kationischen Polymeren zur Komplexherstellung führen zu Undefinierten Produkten hinsichtlich des Verzweigungsgrades der Polymere und deren Milα.ostruktur. Weiterhin sind zahlreiche zur Transfektion eingesetzte Polymere nur durch sehr breite Molekulargewichtsverteilungen charakterisiert oder nur durch ihre Molekulargewichts- mittelwerte beschrieben.
Insbesondere Polyethylenimin (PEI), ein kationisches Polymer mit dreidimensionaler, verzweigter Struktur, eignet sich zur Komplexierung und Kondensierung von Nukleinsäuren (W.T. Godbey, J. of Controlled Release 1999, 60, 149-160). In einer Reihe von in vitro Experimentalserien konnte die Eignung zum Einschleusen von
Nukleinsäuren in Zellen gezeigt werden, wobei insbesondere Polymere mit niedrigen Molekulargewichten (LMW-PEI, LMW: low molecular weight) im Bereich um Mw 2000 g/Mol hohe Aktivität zeigten (EP-A 0 905 254). Als Nachteil der verzweigten Polymere ist deren Undefinierte Struktur zu werten. Lineare Polyethylenimine hingegen können mit definierten Molekulargewichten hergestellt werden und wurden in zahlreichen Applikationen für in vitro und in vivo Gentransfer eingesetzt (WO 96/02655). Bemühungen, die Transfektionseffizienz der linearen Polyethylenimine zu verbessern, führten in zwei Richtungen (M.C. Garnett, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1999, 16, 147-207):
1) Durch Einführung von hydrophilen Substituenten konnte einerseits die Was- serlöslichkeit der DNA/Polymer-Komplexe erhöht werden, und andererseits konnten die Komplexe hinsichtlich Proteinwechselwirkung inertisiert werden. Daneben wurden auch Blockcopolymere aus Polyethylenglykol und Poly- ethylenimin beschrieben.
2) Durch Einfühning von zellspezifischen Liganden, meist hydrophilen Kohlenhydrat- oder Peptidstnikturen, konnte ein Targeting-Effekt erzielt werden.
Die Transfereffizienz der komplexierten Nukleinsäuren in Zellen hängt von vielen Faktoren ab, vor allem von der Wechselwirkung zwischen Komplexen und Zellmembranen, der Art des Zelltyps, der Größe der Komplexe und des Ladungsverhältnisses zwischen den Komponenten des Komplexes. Wenig ist über die Wechselwirkung zwischen Komplexen und Zellmembran sowie die Aufnahme in Zellen bekannt.
Eine erhöhte Wechselwirkung von hydrophob substituierten Polyethyleniminen mit Modellmembranen bestehend aus anionischen Phospholipiden konnte anhand eines Vergleichs von verzweigten unsubstituierten Polyethyleniminen mit substituierten Polyethyleniminen (Substitutionsgrad von bis zu 50 mol-% an Hexyl- bzw. Dodecyl-
Alkylketten) gezeigt werden (D.A. Tirell et al., Macromolecules 1985, 18, 338-342).
Die Verwendung von hydrophob fiinktionalisierten Polyethyleniminen für die Kom- plexierung von Nukleinsäuren ist nur für Alkyl-substituierte Systeme beschrieben (WO 99/43752). Daneben konnte bei kationischen Polymeren auf Basis von Poly- acrylaten gezeigt werden, dass hydrophobe Monomereinheiten die Transfektions- effizienz erhöhen (M. Kurisawa et al., J. ControUed Release 2000, 68, 1-8). Für hydrophobisiertes Poly-L-Lysin mit 25 mol-% Stearyl-Einheiten konnte gezeigt werden, dass ternäre Komplexe aus Nukleinsäuren mit Lipoproteinen in Kombination mit diesen Polymeren zu einer Erhöhung der Transfektionseffizienz in Muskelzellen führen (K.-S. Kim, J. of ControUed Release 1997, 47, 51-59). In EP-A
0 987 029 sind Polyallylamine beschrieben, die optional lineare und verzweigte Alkylketten oder auch Arylgruppen tragen können.
Hydrophobisierte Polyethylenimine mit langkettigen Alkylresten wurden bereits in Form quarternärer vollständig alkylierter und damit hochgeladener Strukturen als
Katalysatorsysteme in beispielsweise Esterspaltungen eingesetzt. Daneben wurden auch acylierte Strukturen zur Stabilisierung von Enzymen eingesetzt (US 4950596).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Komplexe, die ein in Wasser lösliches oder dispergierbares lineares kationisches Polymer mit hydrophoben Substituenten und zumindest eine Nukleinsäure umfassen.
Vorzugsweise stellt das Polymer ein Polyamin und besonders bevorzugt ein Polyethylenimin dar.
Die hydrophoben Substituenten können als Seitenketten oder endständig an dem Polymer angeordnet sein. Der Substitutionsgrad (prozentualer Anteil funktionali- sierter N- Atome in der Polymerhauptkette) beträgt vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 Prozent.
Als hydrophobe Substituenten kommen insbesondere Alkylketten, Acylketten oder Steroid-artige Substituenten in Frage. Besonders geeignet als hydrophobe Substituenten sind Acylketten. Des Weiteren kommen hydrophobe Substituenten in Frage, die durch Addition der Stickstofffunktionen der Polymerhauptkette an Isocyanate oder an α,ß-ungesättigte Carbonylverbindungen eingeführt werden können. Ein vorzugsweise für die Komplexbildung verwendbares Polymer weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R2 Alkyl mit 1 bis 23 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 12 bis 23 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 17 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 24
Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR , wobei die Reste R den
Endgruppen R und R entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Ein weiteres vorzugsweise für die Komplexbildung verwendbares Polymer weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH -CH2-N]-Einheit
R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R2 Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 11 bis 22 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 16 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Acyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Acyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Stniktur aufweisen,
wobei R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R3 und R4 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a - P mit 0,001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im
Polymer verteilt.
Das Polymer ist neu und als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiteres vorzugsweise für die Komplexbildung verwendbares Polymer weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in j eder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R ,ι, R un .d.. R D3 Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten,
und worin R4 und R5 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Gallensäuren bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R4 und R5 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03.
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im
Polymer verteilt.
Das Polymer ist neu und als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dabei sind im Hinblick auf das Steroid-Grundgerüst alle Stereoisomeren mitumfasst. Insbesondere können die Substituenten R1, R2 und R3 sowohl in der α- als auch in der ß-Konfiguration angeordnet sein. Ebenso kann der Substituent in der 5-Position in der α- als auch in der ß-Konfiguration vorliegen (Nomenklatur gemäß Römpp- Chemie-Lexikon, 9. Auflage, Georg Thieme Verlag, 1992).
Ein weiteres vorzugsweise für die Komplexbildung verwendbares Polymer weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 OR4 oder NR4R5 bedeutet, wobei
R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten,
und worin
R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoff- atome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Stπαktur aufweisen,
wobei
R (Endgruppe) ein von der Abbruchreaktion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH , NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R und R entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03. Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Das Polymer ist neu und als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiteres vorzugsweise für die Komplexbildung verwendbares Polymer weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoff- atome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige
Struktur aufweisen,
wobei
R4 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R2 und R3 entsprechen können, und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a P mit 0,001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03.
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Das Polymer ist neu und als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Vorzugsweise weist das Polymer ein mittleres Molekulargewicht unter 220000 g/mol, besonders bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 2000 und 100000 g/mol, ganz besonders bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 20000 und 100000 g/mol, auf.
Die hydrophoben Gruppen werden in polymeranalogen Reaktionen eingeführt, beispielsweise durch Alkylierung mit Halogenalkanen, Acylierung mit Carbonsäurechloriden, Acylierung mit Reaktivestern, Michael-Addition an α,ß-ungesättigte Car- bonylverbindungen (Carbonsäuren, Carbonsäureamide, Carbonsäureester) oder durch
Addition an Isocyanate. Es handelt sich hierbei um literaturbekannte Reaktionstypen (J. March, Advanced Organic Chemistry, Wiley, New York, 4. Auflage, 1992).
Die Herstellung der linearen Polyethylenimine erfolgt beispielsweise durch kationi- sehe Ringöffiiungspolymerisation von 2-Ethyloxazolin mit kationischen Initiatoren, vorzugsweise nach einer Vorschrift von B.L. Rivas et al. (Polymer Bull. 1992, 28, 3-8). Die so erhaltenen Poly(ethyloxazoline) werden quantitativ durch Behandlung mit einer Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Wasser, vorzugsweise einer 1 : 1 Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Wasser, unter Abspaltung von Propan- säure in die linearen Polyethylenimine überführt. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 80 und 100°C, besonders bevorzugt bei 100°C. Die Reaktions- zeit liegt vorzugsweise zwischen 12 und 30 Stunden, besonders bevorzugt bei 24 Stunden. Die Reinigung des Produkts erfolgt vorzugsweise durch mehrfache Um- kristallisation aus Ethanol.
Mit dem beschriebenen Verfahren lassen sich die linearen Polyethylenimine im gewünschten Molekulargewichtsbereich von 2000 bis 220000 g/mol herstellen.
Die Einführung der Alkylgruppen, wie z.B. C 18- Alkylgruppen, erfolgt beispielsweise durch Reaktion einer 5 %-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 75°C, vorzugsweise
60°C, mit Octadecylchlorid. Die Dosiermenge des Alkylchlorids orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10 %). Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 17 Stunden.
Die Einführung von Acylgruppen, wie z.B. C18 Acylgruppen, erfolgt beispielsweise durch Reaktion einer 5 %-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 60°C, vorzugsweise 50°C, mit Octadecansäurechlorid. Die Dosiermenge des Säurechlorids orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10 %). Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 20 Stunden.
Die Einführung von Acylgruppen kann auch über eine Reaktivestermethode unter Aktivierung eines Carbonsäurederivates mit N-Hydroxysuccinimid erfolgen. Dieses Verfahren wird vorzugsweise im Fall der Polyethylemmin-Funktionalisierung mit Gallensäuren angewendet. Dazu wird beispielsweise das Gallensäure-Derivat Cheno- desoxycholsäure (3 ,7α-Dihydroxy-5ß-cholansäure), im folgenden als Substituent mit CDC abgekürzt, mit N-Hydroxysuccinimid in Dimethoxyethan als Lösungsmittel in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur, die Reaktionszeit beträgt 16 Stunden. Der so hergestellte Reaktiv- ester wird mit einer 5 %-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol umgesetzt. Die Dosiermenge des Reaktivesters orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10 %). Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 20 und 60°C, vorzugsweise bei 50°C. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 20 Stunden.
Die Einführung von beispielsweise Chenodesoxycholsäure in Oligoamine wie beispielsweise Spermin oder Pentaethylenhexamin über die Reaktivestermethode ist in der Literatur beschrieben (S. Walker et al. Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 30, 61-71.). Die erfindungsgemäßen Gallensäure-substituierten Polymere weisen hydrophobe Substituenten auf, wobei sich der Grad der Hydrophobizität durch die Anzahl der Hydroxygruppen steuern lässt, analog wie in den von S. Walker et al. beschriebenen "cationic facial amphiphiles".
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe werden vorzugsweise hochgereinigte Proben eingesetzt. Dazu werden die hydrophoben linearen Polyethylen- imine in Wasser bei pH 7 in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/ml, vorzugsweise
0,5 mg/ml, gelöst und durch eine Säulenchromatographie über Sephadex und anschließender Gefriertrocknung gereinigt. Anschließend werden die Polymere erneut in Wasser oder vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung unter kurzer Ultraschallbehandlung gelöst und auf pH 7 eingestellt. Die Konzentration der Poly- ethyleniminlösungen liegt für die Komplexherstellung vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,5 mg/ml.
Zur Charakterisierung der kationischen Polymere können Standardmethoden wie 1H- NMR-Spektroskopie, FT-IR-Spektroskopie und Zetapotentialmessungen angewendet werden.
Die für die Komplexbildung zu verwendende Nukleinsäure kann z.B. eine DNA oder RNA sein. Die Nukleinsäure kann ein Oligonukleotid oder ein Nukleinsäure- konstrukt sein. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure ein oder mehrere Gene. Be- sonders bevorzugt stellt die Nukleinsäure ein Plasmid dar. Die Nukleinsäure kann eine Nukleotidsequenz umfassen, welche für einen pharma- kologischen Wirkstoff oder dessen Vorstufe kodiert und/oder welche für ein Enzym kodiert.
Die Nukleinsäure kann eine Nukleotidsequenz umfassen, welche für ein Antigen eines Pathogens kodiert. Pathogene und relevante zugehörige Antigene sind beispielsweise: Herpes Simplex Virus (HSV-1, HSV-2) und Glykoprotein D; Humanes Immunodefizienzvirus (HIV) und Gag, Nef, Pol; Hepatitis C Virus und NS3; Anthrax und Lethal Factor, Leishmania und ImSTIl und TSA; Tuberkulose- Bakterien und Mtb 8.4. Grundsätzlich ist jede beliebige Nukleinsäure einsetzbar, die für ein Antigen kodiert, gegen welches eine Immunantwort erfolgt. Gegebenenfalls sind diverse für Antigene kodierende Nukleinsäuren zu kombinieren.
Die Nukleinsäure kann eine Nukleotidsequenz umfassen, welche für ein Allergen kodiert. Allergene sind beispielsweise der f2 (Hausstaubmilbe), Bet vl
(Birkenpollen), Ära h2 (Erdnuß), Hev b5 (Latex). Grundsätzlich ist jede beliebige Nukleinsäure einsetzbar, die für ein Antigen kodiert, welches im Menschen oder Tier allergischen Reaktionen hervorruft. Gegebenenfalls sind diverse für Allergene kodierende Nukleinsäuren zu kombinieren.
Die Nukleinsäure kann eine Nukleotidsequenz umfassen, welche für ein immun- modulatorisches Protein kodiert. Immunmodulatorische Proteine sind beispielsweise Zytokine (z.B. IL-4, IFNγ, IL-10, TNFα), Chemokine (z.B. MCP-1, MlPlα, RANTES), Co-Stimulatoren (z.B. CD80, CD86, CD40, CD40L) oder sonstige (z.B. Hitzeschockprotein). Auch CpG-Motive in DNA-Sequenzen weisen immun- modulatorische Eigenschaften auf.
Gegebenenfalls kann die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfassen, welche für ein Fusionsprotein aus Antigen Allergen und immunmodulatorischem Protein kodiert. Die Nukleinsäure umfasst vorzugsweise weiterhin Sequenzen, die dazu führen, dass ein bestimmtes Gen spezifisch, beispielsweise virusspezifisch (d.h. z.B. nur in virusinfizierten Zellen), (ziel-)zellspezifisch, metabolisch spezifisch, zellzyklusspezifisch, entwicklungsspezifisch oder aber unspezifisch exprimiert wird.
Im einfachsten Fall umfasst die Nukleinsäure ein Gen, welches das gewünschte Protein kodiert, und spezifische Promotorsequenzen und gegebenenfalls weitere regulatorische Sequenzen. Zur Verstärkung und/oder Verlängerung der Expression des Gens können z.B. virale Promotor- und/oder Enhancersequenzen enthalten sein. Derartige Promotor- und/oder Enhancersequenzen sind beispielsweise in Dillon,
TiBTech 1993, 11, 167 übersichtlich dargestellt. Beispiele hierfür sind die LTR- Sequenzen von Rous-Sarcomaviren und von Retroviren, die Promotor- und Enhancer-Region von CMV-Viren, die ITR-Sequenzen und/oder Promotorsequenzen p5, pl9 und p40 von AAV- Viren, die ITR- und/oder Promotorsequenzen von Adenoviren, die ITR- und/oder Promotorsequenzen von Vaccinia Viren, die ITR- und/oder Promotorsequenzen von Herpesviren, die Promotorsequenzen von Parvo- viren und die Promotorsequenzen (upstream regulator region) von Papillomaviren.
Die erfindungsgemäßen Komplexe können auch Polymere umfassen, an welche zellspezifischen Liganden gekoppelt sind. Solche zellspezifischen Liganden können beispielsweise derart beschaffen sein, dass sie an die äußere Membran einer Zielzelle, vorzugsweise einer tierischen bzw. menschlichen Zielzelle binden. Erfindungs- gemäße Komplexe, die Liganden enthalten, können für den zielzellspezifischen Transfer einer Nukleinsäure verwendet werden. Die Zielzelle kann beispielsweise eine Endothelzelle, eine Muskelzelle, ein Makrophage, ein Lymphozyt, eine Glia- zelle, eine blutbildende Zelle, eine Tumorzelle, z.B. eine Leukämiezelle, eine virusinfizierte Zelle, eine Bronchialepithelzelle oder eine Leberzelle, z.B. eine sinusoidale Zelle der Leber sein. Ein Ligand, der spezifisch an Endothelzellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten, die spezifisch sind für Endothelzellen, endstän- dig Mannose tragende Glykoproteine, Glykolipide oder Polysaccharide, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle oder, in einer besonders bevorzugten Aus-ührungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an glatte Muskelzellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend monoklonale Antikörper oder deren Fragmente, die spezifisch sind für Aktin, Zellmembran- rezeptoren sowie Wachstumsfaktoren oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für glatte Muskelzellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an Makrophagen und/oder Lymphozyten bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend monoklonale Antikörper, die spezifisch sind für Membranantigene auf
Makrophagen und/oder Lymphozyten, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die spezifisch sind für Membranantigene auf Makrophagen und/oder Lymphozyten, Zytokine, Wachstumsfaktoren, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide oder, in einer besonders bevorzugten Auslϊührungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, insbesondere das HEF-Protein vom Influenza C-Virus mit Mutation in der Nukleotidposition 872 oder HEF-Spaltprodukte des Influenza C-Virus enthaltend die katalytische Triade Serin-71, Histidin-368 oder -369 und Asparaginsäure-261. Ein Ligand, der spezifisch an Gliazellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch an
Membranstmkturen von Gliazellen binden, Adhäsionsmoleküle, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide, Wachstumsfaktoren oder, in einer besonders bevorzugten Ausfiihrungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an blutbildende Zellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper oder A-αtiköφerfragmente, die spezifisch sind für einen Rezeptor des stem cell factors, IL-1 (insbesondere Rezeptortyp I oder II), IL-3 (insbesondere Rezeptortyp oder ß), IL-6 oder GM-CSF, sowie intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die diese Spezifität aufweisen und Wachstumsfaktoren wie SCF, IL-1, IL-3, IL-6 oder GM-CSF sowie deren Fragmente, die an die zugehörigen
Rezeptoren binden. Ein Ligand, der spezifisch an Leukämiezellen bindet, kann bei- spielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch an Membranstrukturen auf Leukämiezellen binden, wie CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, Sialosyl-Le, CD5, CDle, CD23, M38, IL-2-Rezeptoren, T-Zell-Rezeptoren, CALLA oder CD 19, sowie Wachstumsfaktoren oder davon abstammende Fragmente oder
Retinoide. Ein Ligand, der spezifisch an virusinfizierte Zellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch sind für ein Virusantigen, das nach Infektion durch das Virus auf der Zellmembran der infizierten Zelle exprimiert wird. Ein Ligand, der spezifisch an Bronchialepithelzellen, sinusoidale Zellen der Leber oder Leberzellen binden kann, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Transferrin, Asialoglykoproteine, wie Asialoorosomucoid, Neoglykoprotein oder Galaktose, Insulin, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide, intakte hnmunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch an die Zielzellen binden und, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die spezifisch an die Zielzellen binden. Weitere detaillierte Beispiele für Liganden sind z.B. in EP-A 0 790 312 und EP-A 0 846 772 offenbart.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen
Komplexe. Beispielsweise können die Komplexe zur Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle bzw. Zielzelle (Transfektion), zur Herstellung eines Arzneimittels und/oder in der Gentherapie sowie der prophylaktischen und therapeutischen Vakzinierung und der Toleranzinduktion bei Allergien verwendet werden. Vor- zugsweise betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Komplexe zur Einführung von nichtviralen oder viralen Nukleinsäurekonstrukten in eine Zelle und die Verabreichung dieser (transfizierten) Zelle an einen Patienten zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung, wobei die Zelle beispielsweise eine Endothelzelle, ein Lymphozyt, ein Makrophage, eine Leberzelle, ein Fibroblast, eine Muskelzelle oder eine Epithelzelle sein kann und diese Zelle z.B. lokal auf die Haut appliziert oder subkutan, intramuskulär, in eine Wunde, in eine Körperhöhle, in ein Organ oder in ein Blutgefäß injiziert werden kann. In einer weiteren bevorzugten Auslführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Komplexe zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung, wobei die erfindungsgemäßen Komplexe in üblicher Weise, vorzugsweise oral, parenteral oder topisch verabreicht werden können. Die erfmdungsgemäßen Komplexe können beispielsweise perlingual, intranasal, dermal, subkutan, intravenös, intramuskulär, rektal, in eine Wunde, in eine Körperhöhle, in eine Köφeröffhung, in ein Organ oder in ein Blutgefäß gegeben bzw. injiziert werden.
Gegebenenfalls kann es sinnvoll sein, die erfindungsgemäßen Komplexe mit weiteren Zusätzen zu kombinieren (Adjuvants, Anästhetikum etc.).
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Komplexierung von Nukleinsäuren vor dem Einbringen in den Patienten liegt darin begründet, dass die Bildung von anti-DNA- Antikörpern hierdurch erschwert wird. Nackte DNA, in Versuchstiere eingebracht, führte hingegen in Lupus-prone-Mäusen zu einer Erhöhung der Bildung von
Autoimmunantikörpern und einer Verdreifachung der Anzahl von Autoantikörper sezernierenden B-Zellen (Klinman et al., DNA vaccines: safety and efficacy issues, in Gene Vaccination: Theory and Practice, ed. E.Raz, Springer).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer transfizierten Zelle bzw. Zielzelle, wobei die erfmdungsgemäßen Komplexe mit dieser Zelle inkubiert werden. Vorzugsweise wird die Transfektion in vitro durchgeführt. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine transfizierte Zelle bzw. Zielzelle, die die erfmdungsgemäßen Komplexe enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der transfizierten Zelle, beispielsweise als Arzneimittel bzw. zur
Herstellung eines Arzneimittels und/oder zur Gentherapie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Arzneimittel, das die erfindungsgemäßen Komplexe und/oder eine damit transfizierte Zelle enthält. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei die erfindungsgemäßen Komplexe mit weiteren Additiven gemischt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Kopplung der erfindungsgemäßen Polymere an einen zellspezifischen Liganden und die Verwendung des Kopplungsproduktes im Komplex mit einer viralen oder nicht viralen Nukleinsäure für die Einführung dieser Nukleinsäure in eine Zelle oder für die Verabreichung des Komplexes an einen Säuger zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung. Die Möglichkeiten der Herstellung und Kopplung von zellspezifischen Liganden sind bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 790 312 und DE-A 196 49 645 ausführlich beschrieben worden. Auf diese Patentanmeldungen wird ausdrücklich Bezug genommen.
Die erfindungsgemäßen Komplexe aus Polymer, gegebenenfalls gekoppelt mit einem zellspezifischen Liganden, und einem viralen oder nichtviralen Nukleinsäurekon- strukt, stellen ein Gentransfer-Material für die Gentherapie dar. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Komplexe Patienten äußerlich oder innerlich, lokal, in eine Köφerhöhle, in ein Organ, in den Blutkreislauf, in den Atemweg, in den Magen-Darm-Trakt, in den Urogenitaltrakt, oral, intranasal, intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen, insbesondere von Hefen oder Säugern, in die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Komplexe ein Nukleinsäure- konstrukt eingeführt worden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Nukeinsäurekonstrukte mit Hilfe der erfindungsgemäßen Komplexe in Zellinien eingebracht, die dann nach Transfektion zur Expression des gewählten Gens verwendet werden können. Diese Zellen können somit zur Bereitstellung eines Arzneimittels für Patienten verwendet werden. Gegenstand der Erfindung ist des Weiteren die Verwendung von Säugerzellen, in die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Komplexe eine Nukleinsäure eingeführt worden ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung. Beispielsweise können Endothelzellen aus dem Blut gewonnen, in vitro mit den erfindungsgemäßen Komplexen behandelt und dem Patienten beispielsweise intravenös injiziert werden. Weiterhin können beispielsweise dendritische Zellen (antigenpräsentierende Zellen) aus dem Blut gewonnen, in vitro mit den erfindungsgemäßen Komplexen behandelt und zur Induktion einer prophylaktischen oder therapeutischen Immunantwort dem Patienten injiziert werden. Derartige in vitro transfizierte Zellen können auch in Kombination mit den erfindungsgemäßen
Komplexen Patienten verabreicht werden. Diese Kombination beinhaltet, dass Zellen und Komplexe jeweils gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten, an gleichen oder an unterschiedlichen Orten verabreicht oder injiziert werden.
Die erfindungsgemäßen Polymere werden mit der Nukleinsäure durch Vermischen beider Ausgangssubstanzen komplexiert. Das Mischungsverhältnis wird durch das angestrebte Ladungsverhältnis zwischen negativ geladener Nukleinsäure und positiv geladenem Polymer bestimmt. Aus Zetapotentialmessungen konnte ermittelt werden, dass im Falle der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) der Protonierungsgrad bei pH 7 ca. 50 % beträgt. Das Ladungsverhältnis von
DNA/Polymer kann zwischen 1:0,1 und 1:10 variieren. Das bevorzugte Ladungsverhältnis liegt zwischen 1:2 und 1:10. Bei Ladungsverhältnissen von 1:5 bis 1:10 kann bei einer DNA-Konzentration von 100 μg/ml eine Trübung bzw. Präzipitation auftreten. Falls Präzipitate entstehen, können diese vor der Applikation resuspendiert oder redispergiert werden.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Komplexe durch Zugabe der H-LPEI- Lösung zu der entsprechenden Nukleinsäure-Lösung hergestellt. Besonders bevorzugt sind die Konzentrationen so eingestellt, dass eine 1:1 Vol.-Mischung hergestellt wird. Die Komplexe können durch Agarose-Gelelektrophorese untersucht werden, um die Ladungsverhältnisse zu charakterisieren. Ausgewählte Komplexe können durch Rasterkraftmikroskopie untersucht werden, um Informationen über die DNA- Kondensation und die Größe der Komplexe zu erhalten.
Es ist überraschend, dass insbesondere hydrophobe Gruppen, die an die Polymerkette gebunden sind, trotz einer verringerten Wasserlöslichkeit besonders gute Ergebnisse zeigen und definierte kondensierte Komplexe bilden. Man musste erwarten, dass hydrophob modifizierte Polymere wie Tenside oder Emulgatoren wirken und daher nicht in der Lage sind, partikuläre Komplexe mit Nukleinsäuren zu bilden. Weiterhin war zu erwarten, dass die hydrophoben Substituenten die Oberflächencharakteristik der Nukleinsäure/Polymer-Komplexe bestimmen, was folglich zu einer erhöhten Zellmembran- Wechselwirkung und damit zu einer gesteigerten Transfektionseffizienz führt.
Beispiele
Allgemeines
Überraschend stellte sich heraus, dass die hydrophoben linearen Polyethylenimine, im folgenden als H-LPEI abgekürzt, in Bezug auf Wirksamkeit als Vektor für die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen und in seiner biologischen Verträglichkeit den linearen unsubstituierten Polyethyleniminen (LPEI) deutlich überlegen sind. In Mausexperimenten wurden Nukleinsäure-Komplexe enthaltend H-LPEI und DNA- Plasmid, welches das menschliche Faktor VIII (FVIII)-Protein kodiert, im Vergleich zu linearem unsubstituiertem Polyethyleniminen jeweils mit gleichem Molekulargewicht getestet. Proteinexpression konnte nur im Falle der H-LPEI-Komplexe nachgewiesen werden. Ebenso waren Transfektionsexperimente mit nackter DNA stets negativ.
Bei den Untersuchungen zur FVHI-Gentherapie erwiesen sich insbesondere acylierte Polyethylenimine als wirksam, vorzugsweise mit C18 Seitenkette. Der Acylierungs- grad liegt zwischen 0,1 und 10 Prozent, vorzugsweise zwischen 1 und 5 Prozent und besonders bevorzugt bei 3 Prozent. Das mittlere Molekulargewicht liegt vorzugs- weise im Bereich 20 000 bis 100 000 g/Mol.
Weiterhin wurden insbesondere lineare Polyethylenimine mit Gallensäure-Substitu- enten als wirksam identifiziert, vorzugsweise mit CDC-Substituenten. Der Acylie- rungsgrad liegt zwischen 0,1 und 10 Prozent, vorzugsweise zwischen 1 und 5 Prozent und besonders bevorzugt bei 3 Prozent. Das Molekulargewicht liegt vorzugsweise im
Bereich 20 000 bis 100 000 g/Mol.
Gleichzeitig wurden im Rahmen der in vivo Tests keinerlei toxische Reaktionen beobachtet. Die Analytik und die Bestimmung der FVIII-Proteinexpression der in vivo Experimente sowie die entsprechenden Protokolle sind in den nachfolgenden Beispielen detailiert beschrieben.
Beispiel 1
Synthese der linearen Polyethylenimine (LPEI):
Lineare Polyethylene wurden durch kationische ringöffnende Polymerisation von 2- Ethyloxazolin zu Poly(ethyloxazolin) (analog B.L. Rivas, S.I. Anamas, Polymer Bull.
1992, 28, 3-8) und anschließender saurer Hydrolyse durch Abspaltung von Propansäure synthetisiert. Bestimmte Vorläufer-Polymere (Poly(ethyloxazoline)) sind auch kommerziell erhältlich (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland). Die Vorläufer-Polymere wurden durch Gelpermeationschromatographie, IH-NMR und FT-IR charakterisiert.
Eine quantitative Hydrolyse gelang durch Umsetzung von beispielsweise 24,7 g Poly(ethyloxazolin) (Mw 200000 g/mol) in einer Mischung aus 40 ml Wasser und 40 ml konzentrierter Salzsäure bei 100°C. Nach 24 Stunden wurde der gebildete voluminöse Niederschlag durch Zusatz von 250 ml Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf 20°C wurde das Produkt unter Zusatz von 20 %-iger NaOH auf pH 11 eingestellt und gefallt. Nach Absaugen und Waschen des Niederschlags (Waschwasser pH 7) wurde im Hochvakuum über Phosphoφentoxid getrocknet. Das Rohprodukt wurde anschließend aus Ethanol umkristallisiert (Ausbeute 9,5 g/88 %). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25
(Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.
Die linearen Polyethylenimine wurden durch IH-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch die quantitative Hydrolyse bestätigt werden konnte. Beispiel 2
Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einl-ührung von 3 mol-% C 18- Alkylgruppen in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol:
Dazu wurden 0,5 g LPEI unter Argon in 10 ml Ethanol bei 60°C gelöst und nach langsamer Zugabe von 0,11 g (0,13 ml) Octadecylchlorid 17 Stunden gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde bei 20°C durch Zusatz von 20 ml Wasser gefällt, abfiltriert, mit Wasser gewaschen (Waschwasser pH 7) und im Hochvakuum über Phosphor- pentoxid getrocknet (Ausbeute 0,48 g/96 %). Hochreine Chargen (Milligramm- Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender Gefrier- trocknung erhalten.
Die alkylierten linearen Polyethylenimine wurden durch IH-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Alkylierungsgrad bestätigt werden konnte.
Beispiel 3
Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Eiriführung von 3 mol-% C18-Acylgruppen in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol:
Dazu wurden 0,5 g LPEI unter Argon in 10 ml Ethanol bei 50°C gelöst und nach langsamer Zugabe von 0,11 g (0,12 ml) Octadecansäurechlorid 20 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Filtration im Vakuum quantitativ eingeengt. Der Rückstand wurde in der Hitze in 4 ml Ethanol gelöst und das Produkt wurde bei 20°C durch Zusatz von 8 ml Wasser gefällt. Nach Filtration und Waschen mit Wasser
(Waschwasser pH 7) wurde im Hochvakuum über Phosphoφentoxid getrocknet (Ausbeute 0,38 g/76 %). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.
Die acylierten linearen Polyethylenimine wurden durch IH-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Acylierungsgrad bestätigt werden konnte.
Beispiel 4
Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einführung von 3 mol-% Chenodesoxycholsäure-Gruppen (3α,7α- Dihydroxy-5ß-cholansäure) in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol:
Chenodesoxycholsäure (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) wurde dazu mit N-Hydroxysuccinimid in eine Reaktivester-Verbindung überfuhrt. 1 g Chenodesoxycholsäure und 0,32 g N-Hydroxysuccinimid wurden in 5 ml Dimethoxyethan gelöst und bei 0- 5°C mit 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Die Reakionsmischung wurde 16 Stunden gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Reaktivester wurde im Hochvakuum getrocknet (stabiler Schaum) und durch IH-NMR charakterisiert. Ohne weitere Reinigung wurden 179 mg des Chenodesoxycholsäure-Reaktivesters bei Raumtemperatur unter Argon zu einer Lösung von 0,5 g LPEI in 10 ml Ethanol gegeben. Anschließend wurde die Reak- tionsmischung 20 Stunden bei 50°C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Produkt durch Zusatz von 25 ml Wasser gefällt. Der Rückstand wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen (Waschwasser pH 7) und im Hochvakuum über Phosphoφentoxid getrocknet. (Ausbeute 0,41 g/82 %). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender
Gefriertrocknung erhalten. Die mittels Reaktivester-Methode Acyl-funktionalisierten linearen Polyethylenimine wurden durch IH-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Acy- lierungsgrad bestätigt werden konnte.
Beispiel 5
Zetapotentialmessungen:
Zur Ermittlung der Ladung bzw. des Protonierungsgrades der linearen Polyethylen- imine und der hydrophob fiinktionalisierten Polyethylenimine in wässriger Lösung bei physiologischem pH- Wert wurden Zetapotentialmessungen durchgeführt. Unabhängig vom mittleren Molekulargewicht und unabhängig vom Polymertyp ließ sich bei pH 7 ein mittlerer Protonierungsgrad von 50 % ermitteln, d.h. ca. 50 % der Stickstoffatome liegen in wässriger Lösung bei pH 7 protoniert vor.
Beispiel 6
Präparation der Polynukleotid/Polymer-Komplexe:
Ziel war die Herstellung von Polynukleotid/Polymer-Komplexen am Beispiel der
Komplexierung des FVIÜ-Plasmids pCY2 mit unterschiedlichen PolynukleotiαV- Polymerladungsverhältnissen (1:0,1 bis 1:10) und einer konstanten Polynukleotid- Konzentration von 250 μg/ml. Die Ladungsverhältnisse und die korrespondierenden Konzentrationen lassen sich auf Basis der in Beispiel 5 vorgestellten Zetapotential- messungen kalkulieren.
Das Plasmid pCY2 ist in der Literatur beschrieben (C.R. 111, C.Q. Yang, S.M. Budlingmaier, J.N. Gonzales, D.S. Burns, R.M. Bartholomew and P. Scuderi, Blood Coagulation and Fibrinolysis 1997, 8(2), 23-30). PCY2 ist 9164 Bp lang und enthält den "thyroid hormone binding globulin" Promotor, zwei Kopien des alpha-1 Micro- globulin/Bikunin-Enhancers und den 5 '-Bereich eines Kaninchen beta-Globulingen- Introns, welches die Expression eines humanen B-Region-deletierten FV-H-Gens steuert. Das Plasmid enthält weiterhin ein Ampicillin-Antibiotikaresistenz-Gen, den ColEl-Replikationsursprung und eine polyA-Stelle.
Von allen Polyethyleniminen (LPEI, H-LPEI) wurden Stammlösungen sowohl in
Wasser als auch in physiologischer Kochsalzlösung bei pH 7 mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml hergestellt. Dazu wurden 25 mg des LPEI bzw. des H-LPEI unter Erhitzen und kurzer Ultraschallbehandlung in 30 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst, mit 0,1 N HC1 auf pH 7 eingestellt und auf ein Endvolumen von 50 ml aufgefüllt. Die Stammlösungen wurden steril filtriert (0,2 μ ) und können bei 20°C über lange Zeit gelagert werden. Aus den Stammlösungen wurden Verdünnungsreihen hergestellt (je 1 ml, Tabelle 1) die durch Umsetzung mit Polynukleotid- lösungen der Konzentration 500 μg/ml im Volumenverhältnis 1:1 zu einem Poly- nukleotid-Komplex mit definierter Ladung und einer Polynukleotid-Konzentration von 250 μg/ml führen (Tabelle 2). Bei Standardexperimenten wurde häufig ein
Volumen von 300 μl der Polynukleotid LPEI- bzw. Polynukleotid/H-LPEI-Lösung gewählt. Bei Komplexen mit hohem Polyethylenimin-Anteil können Präzipitate auftreten, die vor der jeweiligen Applikation resuspendiert oder redispergiert werden können.
Die Polymerlösungen wurden bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen zu den Polynukleotid-Lösungen pipettiert und anschließend im Vortex gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Polynukleo- tid/Polymer-Komplexe bei 4°C gelagert, die Lagerstabilität der Komplexe erstreckte sich über mehrere Wochen. Für die Tierexperimente können die Komplexlösungen wie gewünscht verdünnt werden. Tabelle 1: Herstellung von Verdünnungsreihen aus LPEI- bzw. H-LPEI- Stammlösungen
Tabelle 2: Übersicht über die Präparation von Polynukleotid/LPEI- bzw. H- LPEI-Komplexen (wässrige Lösungen) mit unterschiedlichen Ladungsverhältnissen für in vivo-Experimente und für die gelelektro- phoretische Untersuchungen
Beispiel 7
Charakterisierung der Polynukleotid/Polymer-Komplexe durch Gelelektrophorese:
Das Komplexierungsverhalten der Polymere und die Ladungssituation der Polynukleotid/Polymer-Komplexe wurde durch Agarose-Gelelektrophorese untersucht. Die Gele wurden jeweils aus 0,4 g Agarose und 40 ml Trisacetat-Puffer (0,04 M, pH 8,3 mit 0,01 M EDTA) hergestellt (Dicke ca. 0,6 cm). Proben bestehend aus 4 μl Polynukleotid/Polymer-Komplex (c = 250 μg/ml), 9,5 μl Wasser (Millipore) sowie 1,5 μl Stoppmix wurden im Vortex vermischt und quantitativ in die Geltaschen überführt. Die Gelelektrophorese erfolgte in der Regel bei einem Strom von 100 bis 150 mA (110 V). Zum Vergleich wurde in jedem Gelelektrophorese-Lauf zusätzlich ein DNA-Marker (PeqLab, 1 kb Ladder) und nacktes (nicht komplexiertes) Poly- nukleotid analysiert.
Nach Entwicklung des Gels in einer wässrigen Lösung von Ethidiumbromid und Bestrahlung bei 254 nm wurde die Lokalisation der DNA-Banden visualisiert. Im Falle des FVITI-Plasmids sind 2 Banden sichtbar, die der supercoiled und der zirkulären Form des Plasmids entsprechen und in Richtung der Anode wanderten. LPEI und H-LPEI waren mit Ethidiumbromid nicht detektierbar. Zunehmender
Polymeranteil in den Komplexen führte zu einer partiellen, noch unvollständigen Retardierung des Plasmids am Auftragsort. Komplexe ab einem Polynukleotid/Poly- mer-Ladungsverhältnis von 1:1 waren nicht mehr detektierbar, d.h. eine Interkalation von Ethidiumbromid in die DNA war nicht mehr möglich. Es ist anzunehmen, dass die kompaktierte DNA ab einem Ladungsverhältnis von 1:1 bereits als polymerverkapselte Partikel vorliegt. Die gelelektrophoretischen Ergebnisse sind unabhängig vom Typ (Molekulargewicht, Substitution) der untersuchten linearen Polyethylenimine. Die kalkulierten Ladungsverhältnisse (siehe Beispiel 5) lassen sich durch Gelelektrophorese bestätigen. Beispiel 8
Charakterisierung der Polynukleotid/Polymer-Komplexe durch Rasterkraftmikroskopie (AFM):
Ausgewählte Polynukleotid/Polymer-Komplexe, die in wässriger Lösung präpariert wurden, wurden durch AFM (Digital Instruments) charakterisiert. Dazu wurden die Lösungen der Komplexe auf eine Konzentration von 0,5 bis 1 μg/ml mit Wasser verdünnt und zwischen 1 und 5 μl der verdünnten Lösungen auf ein Silicium-Substrat pipettiert. Nach Verdampfen des Wasser (ca. 5 min) wird die Probe im AFM analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass ab einem Polynukleotid/Polymer- Verhältnis von 1:0,15 DNA-Kondensation und Partikelbildung stattfindet, wobei die Partikelgröße im Bereich von 100 bis 200 um liegt.
Beispiel 9
In vivo Transfektionsexperimente mit hydrophob funktionalisierten Polyethyleniminen (H-LPEI):
Die Polynukleotid/Polymer-Komplexe wurden mit dem für FVIII kodierenden
Plasmid pCY2 hergestellt.
Es wurden weibliche C57Bl/6-Mäuse verwendet, die 5-6 Wochen alt waren und jeweils ungefähr 20 g wogen. Die Mäuse wurden von Simonsen Labs Ine, USA erworben.
In den Experimenten wurden 5 Mäuse/Gruppe verwendet und über die Schwanzvene mit entweder 50 μg Plasmid-DNA allein oder 50 μg Plasmid-DNA + Polymer in
200 μl/Tier injiziert. Das DNA : Polymer-Ladungsverhältnis betrug 1:0,5. In nach- folgenden Experimenten wurden 10 Mäuse/Gruppe und verschiedene Ladungs- verhältnisse von DNA : Polymer/LPEI bzw. Polymer/H-LPEI verwendet. Die Tiere wurden 24 Stunden nach Injektion retro-orbital geblutet.
Plasma-Proben dieser Tiere wurden unter Verwendung eines modifizierten FVIII- Aktivitätstests untersucht. Das Plasma wurde zuerst 1:4 in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung verdünnt, bevor es in eine Mikrotiteφlatte mit 96 Vertiefungen, die mit dem monoklonalen Maus-Antiköφer C7F7 beschichtet waren, überführt wurde. Der C7F7-Antiköφer ist spezifisch für die leichte Kette des humanen FVIII und reagiert nicht mit Maus-FVIII. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurde die Platte zweimal mit PBS enthaltend 0,05 % Tween 20 gewaschen. Danach wurden die
Reagenzien und Testbedingungen, wie vom Hersteller des "Coatest-Kits" (Diapharma Inc., Schweden) beschrieben, verwendet. Der letzte Testschritt bestand in der Bestimmung der optischen Dichte bei 405/450 nm. Alle FVIII- Werte wurden ausgehend von einer Standard-Kurve, die durch Zufügen von rekombinantem humanen FVIII zu dem verdünnten Maus-Plasma erstellt wurde, extrapoliert
(Kalibrierung gezeigt in Tabelle 3).
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt.
FVπi-Aktivitätstest (C7F7 modifizierter "Coatest"):
Reagenzien und Puffer:
Beschichtungs-Puffer: Entweder Sigma P-3813, pH 7,4 oder 0,1 M Hydrogen- carbonat-Puffer pH 9,2;
Blockierungs-Puffer: lx Coatest-Pufferlösung + 0,8 % BSA + 0,05 % Tween 20; Wasch-Puffer: 20 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween 20 pH 7,2, Filtrieren vor Gebrauch;
Inkubations-Puffer: Blockierungs-Puffer ohne Tween 20;
Coatest VIII: C/4-Testkit: Chromogenix AB, #82-19-18-63/2 Nerfahren:
1. Beschichten einer Immulon-Platte mit 96 Vertiefungen mit 5 μg/ml C7F7 in Beschichtungs-Puffer (100 μl/Vertiefung) bei 4°C über Nacht;
2. 3 x Waschen; Zufügen von Blockierungs-Puffer (100 μl/Vertiefung); Inkubation bei 37°C für mindestens 1 Stunde;
3. 3 x Waschen; Zufügen der in Blockierungs-Puffer (100 μl/Nertiefung); verdünnten Proben; Inkubation bei 37°C für 1 -2 Stunden;
4. 3 x Waschen; Zufügen von Inkubationspuffer (25 μl/Vertiefung); danach Zufügen der "Coatest-Reagenzien" (Kit: 50 μlNertiefung von gemischtem FD a, FX + Phospholipid); Befolgen der Mischungsanweisungen des Kits; Inkubation bei 37°C für 5 Minuten; danach Zugabe von 50 μl des Substrats
S-222 zu jeder Vertiefung und Inkubation bei 37°C für 5 Minuten, oder 10 Minuten für Werte im niedrigeren Bereich (die 4. Stufe kann in einem Heizblock mit Schüttler durchgeführt werden);
5. Stop-Reaktion mit 2 %iger Zitronensäure (50 μlNertiefung);
6. O.D.-Messung bei 405-450 nm.
Beispiel 10
Vergleichsexperimente (Tabelle 5a,b):
In vivo Vergleichsexperimente mit dem nacktem FVIII-Plasmid pCY2 waren stets negativ, d.h. es konnte keine Proteinexpression nachgewiesen werden. In Vergleichs- experimenten mit Plasmid/Polymer-Komplexen auf Basis unsubstituierter linearer
Polyethylenimine (LPEI) mit drei unterschiedlichen Molekulargewichtsverteilungen (Mw 22000, 87000, 217000 g/Mol) und einem Plasmid/LPEI-Ladungsverhältnis von beispielsweise 1 :0,5 (IV-Injektion von 200 μl, c = 250 μg/ml bezogen auf DNA) konnte ebenfalls keine Proteinexpression nachgewiesen werden.
Tabelle 3; UVNis-spektroskopische Kalibrierung der FVIII-Protein-Standards (Doppelbestimmung)
Tabelle 4a: FNIII-Genexpression nach Injektion von DΝA/Polymer-Komplexen: Gruppe 1, 5 Mäuse (la-le), Polymer: H-LPEI, Mw 86980, C18, Acyl, 3 mol% (*Verdünnungsfaktor 4)
Tabelle 4b: FVIII-Genexpression nach Injektion von DNA/Polymer-Komplexen: Gruppe 2, 5 Mäuse (2a-2e), Polymer: H-LPEI, Mw 86980, CDC, 3 mol% (* Verdünnungsfaktor 4)
Tabelle 5a: FVIII-Genexpression nach Injektion von nackter DNA: Gruppe 3, 5 Mäuse (DNA1-DNA5), (* Verdünnungsfaktor 4)
Tabelle 5b: FVIII-Genexpression nach Injektion von DNA/Polymer-Komplexen: Gruppe 4, 5 Mäuse (4a-4e), Polymer: LPEI, Mw 86980 g/Mol, unsub- stituiert (*Verdünnungsfaktor 4)
Beispiel 11
Um das Verhalten der Polynukleotid Polymer-Komplexe bei pH-Änderung zu testen und damit den Einfluss des endosomal-lysosomalen Kompartiments der Zelle zu simulieren, wurden Agarose-Gelelektrophorese-Studien in unterschiedlichen Puffersystemen und damit unter variablen pH-Bedingungen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass beim Übergang von pH 8,3 (TAE-Puffer) zu pH 5,9 (MES- Puffer) der Grad der Komplexierung abnimmt, was einer partiellen Freisetzung gleichkommt.

Claims

Patentansprtiche
1. Komplex umfassend ein in Wasser lösliches oder dispergierbares lineares kationisches Polymer mit hydrophoben Substituenten und zumindest eine Nukleinsäure.
2. Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polyamin darstellt.
3. Komplex gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein
Polyethylenimin darstellt.
4. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten als Seitenketten oder endständig an dem Polymer ange- ordnet sind.
5. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten Alkylketten, Acylketten oder Steroid-artige Substituenten sind, sowie hydrophobe Substituenten, die durch Addition der Stickstoff- funktionen der Polymerhauptkette an Isocyanate oder an α,ß-ungesättigte
Carbonylverbindungen eingeführt werden können.
6. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit Rl Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R Alkyl mit 1 bis 23 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
7. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und R2 Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit
R ,ι1, T R und RJ Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten, und worin
R4 und R5 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Gallensäuren bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit
R > 11 Λ ODR4* bedeutet,
wobei R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten,
und worin
R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
10. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R4 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einlieiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
11. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein mittleres Molekulargewicht unter 220000 g/Mol aufweist.
12. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Molekulargewicht von 2000 bis 100000 g/Mol aufweist.
13. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer an einen zellspezifischen Liganden gekoppelt ist.
14. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Plasmid darstellt.
15. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen pharmako- logischen Wirkstoff kodiert.
16. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Antigen, Allergen oder immunmodulatorisches Protein kodiert.
17. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Ladungsverhältnis von Nukleinsäure/Polymer zwischen 1:0,1 und 1:10, insbesondere zwischen 1:2 und 1:10 liegt.
18. Verfahren zum Herstellen eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man eine entsprechende Menge des in wässriger Lösung vorliegenden Polymeren mit einer entsprechenden Menge einer Nukleinsäure-Lösung mischt.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung anschließend getrocknet wird.
20. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Verwendung als Arzneimittel.
21. Mittel enthaltend einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 und weitere Zusätze.
22. Verwendung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle.
23. Zelle enthaltend einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
24. Mittel enthaltend eine Zelle gemäß Anspruch 23 und weitere Zusätze.
25. Verwendung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Gentherapie.
26. Verwendung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vakzinierung.
27. Verwendung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Toleranzinduktion bei Allergien.
28. Polymer der allgemeinen Formel
worin in jeder einzelnen [CH2-CH -N] -Einheit
R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
29. Polymer der allgemeinen Formel
worin in jeder einzelnen [CH2-CH -N] -Einheit
R .11, R und R* Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten,
und worin
R4 und R5 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Gallensäuren bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Stn-ktur aufweisen,
wobei
R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
30. Polymer der allgemeinen Formel
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 OR4 oder NR4R5 bedeutet,
wobei
R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten,
und worin
R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a χ P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
31. Polymer der allgemeinen Formel
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei
R4 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P^m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
32. Polymer gemäß einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Molekulargewicht unter 220000 g/Mol aufweist.
33. Polymer gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Moleku- largewicht von 2000 bis 100000 g/Mol aufweist.
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