DE69935526T2 - Supramolekulare komplexe enthaltende arzneimittel - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines supramolekularen Komplexes, der mindestens ein therapeutisches Mittel (z.B. DNS) und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk enthält. Ein solcher supramolekularer Komplex kann als ein Abgabevehikel für ein therapeutisches Mittel verwendet werden. Die Erfindung betrifft auch den durch das Verfahren der Erfindung erhältlichen supramolekularen Komplex.
  • Cyclodextrine sind cyclische Polysaccharide, die Einheiten natürlich vorkommender D(+)-Glucopyranose in einer α-(1,4)-Verknüpfung enthalten. Die häufigsten Cyclodextrine sind alpha-(α)-Cyclodextrine, beta-(β)-Cyclodextrine und gamma-(γ)-Cyclodextrine, die jeweils sechs, sieben oder acht Glucopyranoseeinheiten enthalten. Strukturell bildet die cyclische Natur eines Cyclodextrins eine torus- oder ringartige Form mit einer apolaren oder hydrophoben inneren Höhle, wobei die sekundären Hydroxylgruppen auf einer Seite des Cyclodextrintorus und die primären Hydroxylgruppen auf der anderen liegen. Somit wird unter Verwendung von (β)-Cyclodextrin als Beispiel ein Cyclodextrin oft schematisch wie folgt dargestellt:
    Figure 00010001
  • Die Seite, auf der sich die sekundären Hydroxylgruppen befinden, weist einen größeren Durchmesser als die Seite, auf der sich die primären Hydroxylgruppen befinden, auf. Die hydrophobe Natur der inneren Cyclodextrinhöhle ermöglicht den Einschluss einer Vielzahl von Verbindungen (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Band 3, J. L. Atwood et al., Hrsg., Pergamon Press (1996); T. Cserhati, Analytical Biochemistry, 225: 328-332 (1995); Husain et al., Applied Spectroscopy, 46: 652-658 (1992); FR 2 665 169).
  • Cyclodextrine wurden als ein Abgabevehikel für verschiedene therapeutische Verbindungen verwendet, indem mit verschiedenen Arzneistoffen, die in die hydrophobe Höhle des Cyclodextrins passen können, Einschlussverbindungen gebildet wurden, oder indem mit anderen biologisch wirksamen Molekülen, wie Oligonukleotiden und Derivaten davon, nicht-kovalente Assoziationskomplexe gebildet wurden. Das U.S.-Patent 4,727,064 beschreibt zum Beispiel Arzneimittelzubereitungen, die aus einem Arzneistoff mit einer im Wesentlichen geringen Wasserlöslichkeit und einem amorphen, wasserlöslichen Gemisch auf Cyclodextrinbasis bestehen. Der Arzneistoff bildet mit den Cyclodextrinen des Gemisches eine Einschlussverbindung. In dem U.S.-Patent 5,691,316 ist ein zelluläres Cyclodextrinabgabesystem für Oligonukleotide beschrieben. In einem solchen System ist ein Oligonukleotid mit einem Cyclodextrin nicht-kovalent komplexiert oder in einer anderen Ausführungsform kann das Oligonuldeotid kovalent an Adamantin gebunden sein, das wiederum mit einem Cyclodextrin nicht-kovalent assoziiert ist.
  • Verschiedene Cyclodextrin enthaltende Polymere und Verfahren zu ihrer Herstellung sind ebenfalls in dem Fachgebiet bekannt (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Band 3, J. L. Atwood et al., Hrsg., Pergamon Press (1996)). Ein Verfahren zur Herstellung eines Polymers, das immobilisiertes Cyclodextrin enthält, ist in dem U.S.-Patent 5,608,015 beschrieben. Gemäß dem Verfahren wird ein Cyclodextrinderivat entweder mit einem Säurehalogenidmonomer einer α,β-ungesättigten Säure oder einem Derivat davon oder mit einer α,β-ungesättigten Säure oder einem Derivat davon mit einer endständigen Isocyanatgruppe oder einem Derivat davon umgesetzt. Das Cyclodextrinderivat wird durch Umsetzen von Cyclodextrin mit solchen Verbindungen, wie Carbonylhalogeniden und Säureanhydriden, erhalten. Das so erhaltene Polymer enthält Cyclodextrineinheiten als Seitenketten einer linearen Polymerhauptkette.
  • Das U.S.-Patent 5,276,088 beschreibt ein Verfahren zur Synthese von Cyclodextrinpolymeren, indem entweder Polyvinylalkohol oder Cellulose oder Derivate davon mit Cyclodextrinderivaten umgesetzt werden oder indem ein Cyclodextrinderivat mit Vinylacetat oder Methylmethacrylat copolymerisiert wird. Wieder enthält das so erhaltene Cyclodextrinpolymer eine Cyclodextrineinheit als eine Seitenketteneinheit der Hauptkette des Polymers.
  • Eine biologisch abbaubare, medizinische Polymeranordnung mit supermolekularer Struktur ist in WO 96/09073 A1 und in dem U.S.-Patent 5,855,900 beschrieben. Die Anordnung umfasst eine Reihe von Arzneistoff-tragenden, cyclischen Verbindungen, die hergestellt werden, indem ein Arzneistoff an ein α-, β- oder γ-Cyclodextrin gebunden wird, und dann die Arzneistoff/Cyclodextrinverbindungen entlang eines linearen Polymers aufgereiht werden, wobei die biologisch abbaubaren Einheiten an die beiden Enden des Polymers gebunden werden. Eine solche Anordnung ist angeblich in der Lage, einen Arzneistoff als Antwort auf einen spezifischen biologischen Abbau, der bei einer Krankheit vorkommt, freizusetzen. Diese Anordnungen werden allgemein als Cyclodextrinpolymere vom "Halskettentyp" bezeichnet.
  • Die Erfindung stellt ein spezielles Verfahren zur Herstellung eines supramolekularen Komplexes bereit, der mindestens ein therapeutisches Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk umfasst, wobei das Verfahren wie in Anspruch 1 definiert ist. Gemäß einem solchen Verfahren wird mindestens ein therapeutisches Mittel mit mindestens einem Polymer kombiniert, um einen Verbund zu bilden. Das Polymer des Verbunds wird dann unter vernetzenden Reaktionsbedingungen behandelt, die ausreichen, um einen supramolekularen Komplex, der das therapeutische Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk enthält, zu bilden.
  • Die Erfindung stellt auch einen supramolekularen Komplex bereit, der durch das Verfahren der Erfindung erhältlich ist.
  • Die Erfindung stellt ferner die Verwendung des supramolekularen Komplexes bei der Herstellung eines Arzneimittels bereit, wobei der supramolekulare Komplex als ein Abgabevehikel des therapeutischen Mittels verwendet werden soll.
  • 1. Agarosegel der reversiblen Vernetzung von verzweigtem PEI (25 kD) mit DTBP.
  • Die Erfindung betrifft ein spezielles Verfahren zur Herstellung eines supramolekularen Komplexes, der mindestens ein therapeutisches Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk enthält, wobei das Verfahren wie in Anspruch 1 definiert ist. Gemäß einem Verfahren der Erfindung wird mindestens ein therapeutisches Mittel mit mindestens einem Polymer kombiniert, um einen Verbund zu bilden, und dann wird das Polymer des Verbunds unter vernetzenden Reaktionsbedingungen behandelt, die ausreichen, um einen supramolekularen Komplex, der das therapeutische Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk enthält, zu bilden.
  • Bin Verbund aus mindestens einem therapeutischen Mittel und mindestens einem Polymer kann als eine Kombination oder Integration von mindestens einem therapeutischen Mittel und mindestens einem Polymer, jeweils wie nachstehend beschrieben, definiert werden. Gemäß der Erfindung wird ein "Polymer" entweder als ein einzelnes Polymermolekül (z.B. ein einzelner Polymerstrang oder Fragment) oder als eine Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen (z.B. eine Gruppe aus zwei oder mehr Polymersträngen oder Fragmenten) definiert. Somit enthält gemäß der Erfindung ein Verbund mindestens ein einzelnes Polymermolekül; mindestens eine Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen, die gleich oder verschieden sein können; oder ein Gemisch aus mindestens einem einzelnen Polymermolekül und mindestens einer Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen, die gleich oder verschieden sein können. Ein Polymermolekiul kann linear oder verzweigt sein. Folglich kann eine Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen linear, verzweigt oder ein Gemisch aus linearen und verzweigten Polymeren sein. Gemäß der Erfindung existiert vor der Bildung des Verbunds das Polymer des Verbunds nicht als eine im Wesentlichen assoziierte Struktur, wie zum Beispiel ein Polymergel. Das Polymer als Teil des Verbunds kann jedoch, abhängig von der Natur der Polymere und des therapeutischen Mittels, eine solche im Wesentlichen assoziierte Struktur bilden. Jedes Polymer des Verbunds kann ferner mindestens eine funktionelle Gruppe enthalten oder kann weiter modifiziert werden, um mindestens eine funktionelle Gruppe zu enthalten, durch die, wie nachstehend beschrieben, eine Assoziation des Polymers des Verbunds erzielt werden kann.
  • Der Verbund kann durch ein beliebiges geeignetes Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt werden. Der Verbund kann zum Beispiel durch einfaches Inkontaktbringen, Mischen oder Dispergieren eines therapeutischen Mittels mit einem Polymer, jeweils wie hier beschrieben, gebildet werden. Ein Verbund kann auch durch Polymerisieren von Monomeren, die gleich oder verschieden sein können und in der Lage sind, in Gegenwart eines therapeutischen Mittels ein lineares oder verzweigtes Polymer zu bilden, hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein Verbund durch Polymerisieren von Monomeren, die gleich oder verschieden sein können und in der Lage sind, in Gegenwart eines therapeutischen Mittels ein lineares oder verzweigtes Polymer zu bilden, wobei das therapeutische Mittel als eine Matrize für die Polymerisation wirkt, hergestellt werden. Trubetskoy et al., Nucleic Acids Research, Bd. 26, Nr. 18, S. 4178-4185 (1998). Der Verbund kann mit mindestens einem Liganden, wie nachstehend beschrieben, weiter modifiziert werden. Der Ligand kann bei oder nach der Bildung des Verbunds durch Ligandenmodifikation des therapeutischen Mittels und/oder des Polymers des Verbunds, wie hier beschrieben, eingeführt werden. Der Verbund kann eine beliebige geeignete Form annehmen und liegt bevorzugt in Form von Partikeln vor.
  • Gemäß der Erfindung wird das Polymer des Verbunds unter vernetzenden Reaktionsbedingungen behandelt, die ausreichen, um einen supramolekularen Komplex, umfassend ein therapeutisches Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk, jeweils wie hier beschrieben, zu bilden. "Behandlung des Polymers des Verbunds unter vernetzenden Reaktionsbedingungen, die ausreichen, um einen supramolekularen Komplex zu bilden", kann als (eine) beliebige Reaktionsbedingung(en), einschließlich der Zugabe von zusätzlichen Mitteln oder Recktanten, die die Assoziation (Vernetzung) des Polymers des Verbunds fördern, definiert werden. Das Polymer, wie vorstehend beschrieben, kann durch interpolymere kovalente Bindungen, nicht-kovalente Bindungen (z.B. Ionenbindungen) oder nicht-kovalente Wechselwirkungen (z.B. van-der-Waals-Wechselwirkungen) assoziiert sein. Die Assoziation durch eine intrapolymere kovalente Bindung, nicht-kovalente Bindung oder nicht-kovalente Wechselwirkungen des Polymers kann ebenso stattfinden. Als Folge dieser Assoziation tritt das Polymer des Verbunds in Wechselwirkung, wobei ein mehrdimensionales Polymernetzwerk gebildet wird. Die Bildung eines mehrdimensionalen Polymernetzwerks kann unter Verwendung von Spektroskopie bestimmt werden. Ein mehrdimensionales Polymernetzwerk zeigt andere spektrographische Daten (z.B. Infrarotspektroskopie oder Kernspinresonanz-(NMR)-Spektroskopie) als das nicht-assoziierte Polymer des Verbunds. Zusätzlich weist ein mehrdimensionales Netzwerk aus mindestens zwei Polymeren ein größeres mittleres Molekulargewicht als das der einzelnen Polymere des Verbunds auf.
  • Im Hinblick auf die vernetzenden Reaktionsbedingungen kann zum Beispiel, wenn das Polymer des Verbunds aus (einem) einzelnen Polymermolekül(en) besteht, das Polymer mit (einem) Molekül(en), Oligomer(en) oder (einem) anderen Polymer(en), das (die) die Vernetzung fördert (fördern) oder Vernetzungen bildet (bilden), umgesetzt werden, so dass die intrapolymere Vernetzung des einzelnen Polymermoleküls des Verbunds oder die tatsächliche Vernetzung mit dem einzelnen Polymermolekül des Verbunds resultiert. Entsprechend kann, wenn das Polymer des Verbunds aus einer Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen besteht, das Polymer mit (einem) Moleküle(en), Oligomer(en) oder (einem) anderen Polymer(en), das (die) die Vernetzung fördert (fördern) oder Vernetzungen bildet (bilden), umgesetzt werden, so dass die intrapolymere und/oder interpolymere, bevorzugt interpolymere Vernetzung der Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen des Verbunds oder die tatsächliche Vernetzung mit der Gruppe aus zwei oder mehr Polymermolekülen des Verbunds resultiert.
  • Das Vernetzungsmittel kann ein beliebiges Vernetzungsmittel sein, das in dem Fachgebiet bekannt ist. Das Vernetzungsmittel kann ein beliebiges Oligomer oder Polymer (z.B. Polyethylenglycol-(PEG)-polymer oder Polyethylenpolymer) sein, das in der Lage ist, die Vernetzung innerhalb des Polymers des Verbunds zu fördern oder tatsächlich mit dem Polymer des Verbunds vernetzen kann. Das vernetzende Oligomer oder Polymer kann das gleiche oder ein anderes als das Polymer des Verbunds sein. Desgleichen kann das Vernetzungsmittel ein beliebiges geeignetes Molekül sein, das in der Lage ist, mit dem Polymer des Verbunds zu vernetzen.
  • Beispiele von Vernetzungsmitteln schließen Dihydrazide und Dithiole ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vernetzungsmittel eine instabile Gruppe, so dass, wie gewünscht, die Vernetzung eines vernetzten, mehrdimensionalen Polymernetzwerks aufgehoben werden kann. Ein Gemisch aus verschiedenen Vernetzungsmitteln kann ebenfalls verwendet werden. Die verschiedenen Vernetzungsmittel können verschiedene Instabilitätsgrade zeigen. Folglich kann der Vorteil einer gerichteten Bioverfügbarkeit (z.B. wie in Formulierungen mit "zeitgesteuerter Freisetzung") erzielt werden. Beispiele geeigneter Vernetzungsmittel schließen Adipinsäuredihydrazid, Polyethylenglycol-600-(PEG600)- dihydrazid, Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat (DTBP), Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP), Disuccinimidylsuberat (DSS) und Dimethylsuberimidat (DMS) ein. Das Vernetzungsmittel kann mit mindestens einem Liganden, wie über hier beschrieben weiter modifiziert werden.
  • "Behandlung des Polymers des Verbunds unter vernetzenden Reaktionsbedingungen, die ausreichen, um einen supramolekularen Komplex" zu bilden, kann auch geeignete Reaktionsbedingungen einschließen, die die Vernetzung von an dem Polymer des Verbunds gefundenen funktionellen Gruppen fördern, so dass eine Assoziation durch eine neue Bindung oder Wechselwirkung, wie vorstehend beschrieben, resultiert. Die funktionelle Gruppe kann eine beliebige funktionelle Gruppe sein, die in dem Fachgebiet bekannt ist und unter vernetzenden Reaktionsbedingungen eine neue Bindung oder Wechselwirkung, wie vorstehend beschrieben, bildet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Polymer des Verbunds mit mindestens zwei Thiolgruppen funktionalisiert oder kann so modifiziert werden, dass es mit mindestens zwei Thiolgruppen funktionalisiert wird, die unter geeigneten Oxidationsbedingungen reagieren, wobei eine Disulfidbrücke gebildet wird. Ein thiolfunktionalisiertes Polymer kann durch in dem Fachgebiet bekannte Wege, einschließlich zum Beispiel der Zugabe eines Thiolierungsreagenzes (z.B. Traut-Reagenz, das von Pierce Chemical Company, Rockford, IL, im Handel erhältlich ist), hergestellt werden. Ein thiolfunktionalisiertes Polymer kann auch durch Polymerisation eines geschützten Thiolmonomers hergestellt werden. Nach der Polymerisation kann dann von den Thiolgruppen die Schutzgruppe entfernt werden, wobei sich die freien Thiolgruppen ergeben, die anschließend unter Oxidationsbedingungen umgesetzt werden können, wobei (eine) Disulfidbrücke(n) gebildet wird (werden). Geeignete Oxidationsbedingungen schließen zum Beispiel Oxidation durch Luft und die Verwendung eines Oxidationsmittels (z.B. ALDRITHIOL, das von Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, im Handel erhältlich ist) ein.
  • Der Assoziationsgrad (Vernetzung), wie vorstehend beschrieben, des Polymers des Verbunds, das das mehrdimensionale Polymernetzwerk bildet, kann von partieller Assoziation bis zu vollständiger Assoziation variieren. Durch Variation des Assoziationsgrads des Polymers kann ein kurzkettiges Polymer die Eigenschaften eines langkettigen Polymers zeigen, während die gewünschten Eigenschaften eines kurzkettigen Polymers nach der Dissoziation beibehalten werden. Der Charakter des langkettigen Polymers fördert zum Beispiel die Gesamtstabilität, d.h. die Beständigkeit gegenüber einem Abbau, bis die Zielzelle erreicht ist, während der Charakter des kurzkettigen Polymers die DNS-Freisetzung innerhalb Zielezelle fördert. Diese Dualität ergibt einen supramolekularen Komplex, der mindestens ein therapeutisches Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk enthält, der eine größere Stabilität sowohl bei nicht-physiologischen als auch bei physiologischen Bedingungen und eine größere Lagerstabilität zeigt. Eine Variation des Assoziationgrads des Polymers des supramolekularen Komplexes ermöglicht auch eine gesteuerte Freisetzung des therapeutischen Mittels.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer des Verbunds ein im Wesentlichen lineares Polymer. Ein im Wesentlichen lineares Polymer kann ein beliebiges geeignetes im Wesentlichen lineares Polymer oder im Wesentlichen lineares Copolymer sein, das in dem Fachgebiet bekannt ist und als Teil eines Verbunds zur Vernetzung in der Lage ist, um ein mehrdimensionales Polymernetzwerk, wie vorstehend beschrieben, zu bilden. Gemäß der Erfindung kann ein im Wesentlichen lineares Polymer durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt werden. Ein im Wesentlichen lineares Polymer kann bevorzugt durch ein beliebiges geeignetes Polymerisationsverfahren, das in dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die in Trubetskoy et al., Nucleic Acids Research, Bd. 26, Nr. 18, S. 4178-4185 (1998), beschriebenen (z.B. Matrizenpolymerisation, Stufenpolymerisation oder Kettenpolymerisation), hergestellt werden. Ein im Wesentlichen lineares Polymer kann aus einem geeigneten Monomer hergestellt werden. Beispiele von für die Polymerisation geeigneten Monomeren, um ein im Wesentlichen lineares Polymer zu bilden, schließen Monomere, wie zum Beispiel Bis-(2-aminoethyl)-1,3-propandiamin (AEPD) und N2,N2,N3,N3-(3'-PEG5000-aminopropan)bis-(2-aminoethyl)-1,3-propandiammoniumditrifluoracetat (AEPD-PEG), ein. Das im Wesentlichen lineare Polymer kann ferner eine funktionelle Gruppe enthalten oder kann, wie vorstehend beschrieben, weiter modifiziert werden, um eine funktionelle Gruppe (z.B. eine Thiolgruppe) zu enthalten. Das im Wesentlichen lineare Polymer ist bevorzugt lineares Polyethylenimin (PEI) oder ein lineares, Cyclodextrin enthaltendes Polymer, stärker bevorzugt ein lineares, Cyclodextrin enthaltendes Polymer. Ein lineares, Cyclodextrin enthaltendes Polymer kann ein beliebiges wasserlösliches, lineares Polymer sein, das mindestens eine Cyclodextrineinheit als Teil des Polymergerlists enthält. Das lineare, Cyclodextrin enthaltende Polymer ist stärker bevorzugt ein lineares Cyclodextrincopolymer oder lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer, jeweils wie nachstehend beschrieben.
  • Ein lineares Cyclodextrincopolymer ist ein Polymer, das Cyclodextrineinheiten als einen integralen Teil seines Polymergerüsts enthält. Bisher waren Cyclodextrineinheiten kein Teil der Polymerhauptkette, sondern vielmehr als Seitenketteneinheiten an ein Polymergerüst gebunden.
  • Ein lineares Cyclodextrincopolymer weist eine Wiederholungseinheit der Formel Ia, Ib oder eine Kombination davon auf:
    Figure 00090001
  • In den Formeln Ia und Ib ist C ein substituiertes oder unsubstituiertes Cyclodextrinmonomer, und ist A ein Comonomer, das an Cyclodextrin C gebunden, d.h. kovalent gebunden, ist. Die Polymerisation einer Vorstufe des Cyclodextrinmonomers C mit einer Vorstufe des Comonomers A führt zu einem linearen Cyclodextrincopolymer. Innerhalb eines einzelnen linearen Cyclodextrincopolymers kann die Einheit des Cyclodextrinmonomers C gleich oder verschieden sein und desgleichen kann das Comonomer A gleich oder verschieden sein.
  • Eine Cyclodextrinmonomervorstufe kann ein beliebiges Cyclodextrin oder ein Derivat davon sein, das in dem Fachgebiet bekannt ist. Wie vorstehend diskutiert, ist ein Cyclodextrin als ein cyclisches Polysaccharid, das am häufigsten sechs bis acht Einheiten natürlich vorkommender D(+)-Glucopyranose in einer α-(1,4)-Verknüpfung enthält, definiert. Die Cyclodextrinmonomervorstufe ist bevorzugt ein Cyclodextrin mit sechs, sieben und acht Glucoseeinheiten, d.h. ein alpha-(α)-Cyclodextrin, ein beta-(β)-Cyclodextrin beziehungsweise ein gamma-(γ)-Cyclodextrin. Ein Cyclodextrinderivat kann ein beliebiges substituiertes Cyclodextrin sein, das in dem Fachgebiet bekannt ist, wobei der Substituent die Copolymerisation mit der Vorstufe des Comonomers A, wie nachstehend beschrieben, nicht stört. Ein Cyclodextrinderivat kann neutral, kationisch oder anionisch sein. Beispiele geeigneter Substituenten schließen Hydroxyalkylreste, wie zum Beispiel Hydroxypropyl und Hydroxyethyl; Ethergruppen, wie zum Beispiel Dihydroxypropylether, Methylhydroxyethylether, Ethylhydroxyethylether und Ethylhydroxypropylether; Alkylreste, wie zum Beispiel Methyl; Saccharide, wie zum Beispiel Glucosyl und Maltosyl; Säuregruppen, wie zum Beispiel Carbonsäuren, Phosphorigsäuren, Phosphinigsäuren, Phosphonsäuren, Phosphorsäuren, Thiophosphonsäuren und Sulfonsäuren; Imidazolgruppen; Sulfatgruppen; und geschützte Thiolgruppen ein.
  • Eine Cyclodextrinmonomervorstufe kann ferner chemisch modifiziert (z.B. halogeniert oder aminiert) werden, um die Copolymerisation der Cyclodextrinmonomervorstufe mit einer Vorstufe des Comonomers A, wie nachstehend beschrieben, zu erleichtern oder zu beeinflussen. Die chemische Modifikation einer Cyclodextrinmonomervorstufe ermöglicht eine Polymerisation an nur zwei Positionen jeder Cyclodextrineinheit, d.h. die Erzeugung einer bifunktionellen Cyclodextrineinheit. Das Nummerierungsschema für die C1-C6-Positionen jedes Glucopyranoserings ist wie folgt:
    Figure 00100001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform findet die Polymerisation an zwei von beliebigen C2-, C3- und C6-Positionen, einschließlich Kombinationen davon, der Cyclodextrineinheit statt. Eine Cyclodextrinmonomervorstufe kann zum Beispiel an zwei C6-Positionen polymerisiert werden, während eine andere Cyclodextrinmonomervorstufe an einer C2- und einer C6-Position der Cyclodextrineinheit polymerisiert werden kann. Unter Verwendung von β-Cyclodextrin als ein Beispiel ist das Beschriftungsschema für die relative Position jedes Glucopyranoserings in einem Cyclodextrin wie folgt:
    Figure 00110001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines linearen Cyclodextrincopolymers weist das Cyclodextrinmonomer C die folgende allgemeine Formel (II) auf:
    Figure 00110002
  • In der Formel (II) stellen n und m ganze Zahlen dar, die zusammen mit den anderen zwei Glucopyranoseringen die Gesamtzahl der Glucopyranoseeinheiten in dem Cyclodextrinmonomer definieren. Die Formel (II) stellt ein Cyclodextrinmonomer dar, das an zwei C6-Positionen der Cyclodextrineinheit polymerisiert werden kann. Beispiele von Cyclodextrinmonomeren der Formel (II) schließen 6A,6B-Dideoxy-α-cyclodextrin (n=0, m=4), 6A,6C-Dideoxy-α-cyclodextrin (n=1, m=3), 6A,6D-Dideoxy-α-cyclodextrin (n=2, m=2), 6A,6B- Dideoxy-β-cyclodextrin (n=0, m=5), 6A,6C-Dideoxy-β-cyclodextrin (n=1, m=4, 6A,6D-
  • Dideoxy-β-cyclodextrin (n=2, m=3), 6A,6B-Dideoxy-γ-cyclodextrin (n=0, m=6), 6A,6C-Dideoxy-γ-cyclodextrin (n=1, m=5), 6A,6D-Dideoxy-γ-cyclodextrin (n=2, m=4) und 6A,6E-Dideoxy-γ-cyclodextrin (n=3, m=3) ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform eines linearen Cyclodextrincopolymers weist eine Einheit des Cyclodextrinmonomers C die folgende allgemeine Formel (III) auf
    Figure 00120001
    wobei p = 5-7. In der Formel (III) unterlag mindestens eine der D(+)-Glucopyranoseeinheiten eines Cyclodextrinmonomers einer Ringöffnung, um eine Polymerisation an einer C2- und einer C3-Position der Cyclodextrineinheit zu ermöglichen. Cyclodextrinmonomere der Formel (III), wie zum Beispiel 2A,3A-Diamino-2A,3A-dideoxy-β-cyclodextrin und 2A,3A-Dialdehyd-2A,3A-dideoxy-β-cycloclextrin, sind von Carbomer aus Westborough, MA, im Handel erhältlich. Beispiele von Cyclodextrinmonomeren der Formel (III) schließen 2A,3A-Dideoxy-2A,3A-dihydro-α-cyclodextrin, 2A,3A-Dideoxy-2A,3A-dihydro-β-cycloclextrin und 2A,3A-Dideoxy-2A,3A-dihydro-γ-cyclodextrin, die allgemein als 2,3-Dideoxy-α-cyclodextrin, 2,3-Dideoxy-β-cyclodextrin beziehungsweise 2,3-Dideoxy-γ-cyclodextrin bezeichnet werden, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Eine Vorstufe des Comonomers A kann eine beliebige geradkettige oder verzweigte, symmetrische oder asymmetrische Verbindung sein, die bei der Reaktion mit einer Cyclodextrinmonomervorstufe, wie vorstehend beschrieben, zwei Cyclodextrinmonomere miteinander verknüpft. Eine Vorstufe des Comonomers A ist bevorzugt eine Verbindung, die mindestens zwei funktionelle Gruppen, durch die eine Reaktion und somit eine Verknüpfung der Cyclodextrinmonomere erzielt werden kann, enthält. Bespiele mögicher funktioneller Gruppen, die gleich oder verschieden, endständig oder innen liegend sein können, jeder Vorstufe des Comonomers A schließen Amino-, Säure-, Ester-, Imidazol- und Acylhalogenidgruppen und Derivate davon ein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die zwei funktionellen Gruppen gleich und endständig. Bei der Copolymerisation einer Vorstufe des Comonomers A mit einer Cyclodextrinmonomervorstufe können zwei Cyclodextrinmonomere miteinander verknüpft werden, indem die Seite des primären Hydroxyls eines Cyclodextrinmonomers mit der Seite des primären Hydroxyls eines anderen Cyclodextrinmonomers verbunden wird, indem die Seite des sekundären Hydroxyls eines Cyclodextrinmonomers mit der Seite des sekundären Hydroxyls eines anderen Cyclodextrinmonomers verbunden wird, oder indem die Seite des primären Hydroxyls eines Cyclodextrinmonomers mit der Seite des sekundären Hydroxyls eines anderen Cyclodextrinmonomers verbunden wird. Folglich können Kombinationen solcher Verknüpfungen in dem Endcopolymer vorkommen. Sowohl die Vorstufe des Comonomers A als auch das Comonomer A des Endcopolymer können neutral, kationisch (z.B. indem sie protonierte Gruppen, wie zum Beispiel quartäre Ammoniumgruppen enthalten) oder anionisch (z.B. indem sie deprotonierte Gruppen, wie zum Beispiel anionische Sulfat-, Phosphat- oder Carboxylatgruppen enthalten) sein. Das Gegenion einer geladenen Vorstufe des Comonomers A oder des geladenen Comonomers A kann ein beliebiges geeignetes Gegenanion oder Gegenkation sein (z.B. das Gegenanion einer kationischen Vorstufe des Comonomers A oder des kationischen Comonomers A kann ein Halogenidanion (z.B. ein Chloridanion) sein). Die Ladung des Comonomers A des Copolymers kann durch Einstellung der pH-Wertbedingungen eingestellt werden. Beispiele geeigneter Vorstufen des Comonomers A schließen Cystamin, 1,6-Diaminohexan, Diimidazol, Dithioimidazol, Spermin, Dithiospermin, Dihistidin, Dithiohistidin, Succinimid (z.B. Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP) und Disuccinimidylsuberat (DSS)) und Imidate (z.B. Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat (DTBP)) ein. Die Copolymerisation einer Vorstufe des Comonomers A mit einer Cyclodextrinmonomervorstufe führt zur Bildung eines linearen Cyclodextrincopolymers, das Comonomer-A-Verknüpfungen enthält, der folgenden allgemeinen Formeln:
    -HNC(O)(CH2)xC(O)NH-, -HNC(O)(CH2)xSS(CH2)xC(O)NH-,
    -+H2N(CH2)xSS(CH2)xNH2 +-, -HNC(O)(CH2CH2O)xCH2CH2C(O)NH-,
    -HNNHC(O)(CH2CH2O)xCH2CH2C(O)NHNH-,
    -+H2NCH2(CH2CH2O)xCH2CH2CH2NH2 +-,
    -HNC(O)(CH2CH2O)xCH2CH2SS(CH2CH2O)xCH2CH2C(O)NH-,
    -HNC(NH2 +)(CH2CH2O)xCH2CH2C(NH2 +)NH-,
    -SCH2CH2NHC(NH2 +)(CH2)xC(NH2 +)NHCH2CH2S-,
    -SCH2CH2NHC(NH2 +)(CH2)xSS(CH2)xC(NH2 +)NHCH2CH2S-,
    -SCH2CH2NHC(NH2 +)CH2CH2(OCH2CH2)xC(NH2 +)NHCH2CH2S-,
    Figure 00140001
    Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • In den vorstehenden Formeln gilt x = 1-50 und y+z = x. Bevorzugt gilt x = 1-30. Stärker bevorzugt gilt x = 1-20. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Comonomer A biologisch abbaubar oder säureempfindlich. Auch in einer bevorzugten Ausführungsform können die Vorstufe des Comonomers A und daher das Comonomer A selektiv ausgewählt werden, um die gewünschte Anwendung zu erzielen. Zur Abgabe niedermolekularer therapeutischer Mittel ist zum Beispiel kein geladenes Polymer notwendig, und das Comonomer A kann eine Polyethylenglycolgruppe sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein lineares Cyclodextrincopolymer durch Copolymerisieren einer Cyclodextrinmonomervorstufe, die mit einer geeigneten Abgangsgruppe disubstituiert ist, mit einer Vorstufe des Comonomers A, die die Abgangsgruppen ersetzen kann, hergestellt werden. Die Abgangsgruppe, die gleich oder verschieden sein kann, kann eine beliebige Abgangsgruppe sein, die in dem Fachgebiet bekannt ist und bei der Copolymerisation mit einer Vorstufe des Comonomers A ersetzt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein lineares Cyclodextrincopolymer durch Iodieren einer Cyclodextrinmonomervorstufe, um eine diiodierte Cyclodextrinmonomervorstufe zu bilden, und Copolymerisieren der diiodierten Cyclodextrinmonomervorstufe mit einer Vorstufe des Comonomers A hergestellt werden, wobei ein lineares Cyclodextrincopolymer mit einer Wiederholungseinheit der Formel Ia, Ib oder einer Kombination davon, jeweils wie vorstehend beschrieben, gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform, einem Verfahren zur Herstellung eines linearen Cyclodextrins, wird eine Cyclodextrinmonomervorstufe, wie vorstehend beschrieben, iodiert, wobei eine diiodierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel IVa, IVb, IVc oder eines Gemisches davon gebildet wird:
    Figure 00170001
  • Das diiodierte Cyclodextrin kann durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt werden (siehe z.B. Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 5267-5270 (1984); Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 4580-4584 (1984)). Das β-Cyclodextrin kann zum Beispiel mit Biphenyl-4,4'-disulfonylchlorid in Gegenwart von wasserfreiem Pyridin umgesetzt werden, um ein Biphenyl-4,4'-disulfonylchlorid-überkapptes β-Cyclodextrin zu bilden, das dann mit Kaliumiodid umgesetzt werden kann, wobei Diiod-β-cyclodextrin hergestellt wird. Die Cyclodextrinmonomervorstufe wird an nur zwei Positionen iodiert. Durch Copolymerisieren der diiodierten Cyclodextrinmonomervorstufe mit einer Vorstufe des Comonomers A, wie vorstehend beschrieben, kann ein lineares Cyclodextrinpolymer mit einer Wiederholungseinheit der Formel Ia, Ib oder einer Kombination davon, ebenfalls wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. Falls geeignet, können das Iod oder die Iodatome durch andere bekannte Abgangsgruppen ersetzt werden.
  • Die Iodatome oder andere geeignete Abgangsgruppen können durch eine Gruppe, die eine Reaktion mit einer Vorstufe des Comonomers A, wie vorstehend beschrieben, ermöglicht, ersetzt werden. Eine diiodierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel IVa, IVb, IVc oder eines Gemisches davon kann zum Beispiel aminiert werden, wobei eine diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel Va, Vb, Vc oder eines Gemisches davon gebildet wird:
    Figure 00180001
    .
  • Die diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe kann durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt werden (siehe z.B. Tabushi et al., Tetrahedron Lett. 18: 1527-1530 (1977); Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662 (1975)). Ein Diiod-β-cyclodextrin kann zum Beispiel mit Natriumazid umgesetzt und dann reduziert werden, wobei ein Diamino-β-cyclodextrin gebildet wird. Die Cyclodextrinmonomervorstufe wird an nur zwei Positionen aminiert. Die diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe kann dann mit einer Vorstufe des Comonomers A, wie vorstehend beschrieben, copolymerisiert werden, wobei ein lineares Cyclodextrinpolymer mit einer Wiederholungseinheit der Formel Ia, Ib oder einer Kombination davon, ebenfalls wie vorstehend beschrieben, hergestellt wird. Die Aminofunktionalität einer diaminierten Cyclodextrinmonomervorstufe muss jedoch nicht direkt an die Cyclodextrineinheit gebunden werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Aminofunktionalität durch den Ersatz des Iods oder anderer geeigneter Abgangsgruppen einer Cyclodextrinmonomervorstufe durch Aminogruppen enthaltende Einheiten, wie zum Beispiel –SCH2CH2NH2, eingeführt werden, wobei eine diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel Vd, Ve, Vf oder eines Gemisches davon gebildet wird:
    Figure 00190001
  • Ein lineares Cyclodextrincopolymer kann auch durch Reduzieren eines linearen, oxidierten Cyclodextrincopolymers, wie nachstehend beschrieben, hergestellt werden. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden, vorausgesetzt, dass das Comonomer A keine reduzierbare Einheit oder Gruppe, wie zum Beispiel eine Disulfidbrücke, enthält.
  • Ein lineares Cyclodextrincopolymer kann oxidiert werden, um mindestens ein oxidiertes Cyclodextrinmonomer in das Copolymer einzuführen, so dass das oxidierte Cyclodextrinmonomer ein integraler Teil des Polymergerüsts ist. Ein lineares Cyclodextrincopolymer, das mindestens ein oxidiertes Cyclodextrinmonomer enthält, ist als ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer definiert. Das Cyclodextrinmonomer kann entweder an der Stelle des sekundären oder des primären Hydroxyls der Cyclodextrineinheit oxidiert sein. Wenn mehr als ein oxidiertes Cyclodextrinmonomer in einem linearen, oxidierten Cyclodextrincopolymer vorhanden ist, können die gleichen oder verschiedene Cyclodextrinmonomere, die entweder an der Stelle des primären Hydroxyls der Stelle des sekundären Hydroxyls oder beiden oxidiert sind, vorhanden sein. Zu Veranschaulichungszwecken, ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer mit oxidierten, sekundären Hydroxylgruppen weist zum Beispiel mindestens eine Einheit der Formel VIa oder VIb auf:
    Figure 00200001
  • In den Formeln VIa und VIb ist C ein substituiertes oder ursubstituiertes, oxidiertes Cyclodextrinmonomer, und ist A ein Comonomer, das an das oxidierte Cyclodextrin C gebunden, d.h. kovalent gebunden, ist. Auch in den Formeln VIa und VIb führt die Oxidation der sekundären Hydroxylgruppen zu einer Ringöffnung der Cyclodextrineinheit und der Bildung von Aldehydgruppen.
  • Ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer kann durch Oxidation eines linearen Cyclodextrincopolymers, wie vorstehend diskutiert, hergestellt werden. Die Oxidation eines linearen Cyclodextrincopolymers kann durch in dem Fachgebiet bekannte Oxidationsverfahren erfolgen (Hisamatsu et al., Starch 44: 188-191 (1992)). Bevorzugt wird ein Oxidationsmittel, wie zum Beispiel Natriumperiodat, verwendet. Für einen Durchschnittsfachmann ist es selbstverständlich, dass unter Standardoxidationsbedingungen der Oxidationsgrad pro Copolymer variieren kann oder variiert werden kann. Somit kann in einer Ausführungsform ein lineares oxidiertes Copolymer ein Cyclodextrinmonomer enthalten. In einer anderen Ausführungsform sind im Wesentlichen alle Cyclodextrinmonomere des Copolymers oxidiert.
  • Ein anderes Herstellungsverfahren eines linearen, oxidierten Cyclodextrincopolymers umfasst die Oxidation einer diiodierten oder diaminierten Cyclodextrinmonomervorstufe, wie vorstehend beschrieben, wobei eine oxidierte, diiodierte oder diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe gebildet wird, und die Copolymerisation der oxidierten, diiodierten oder diaminierten Cyclodextrinmonomervorstufe mit einer Vorstufe des Comonomers A. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine oxidierte, diiodierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel VIIa, VIIb, VIIc oder eines Gemisches davon:
    Figure 00210001
    durch Oxidation einer diiodierten Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel IVa, IVb, IVc oder eines Gemisches davon, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann eine oxidierte, diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel VIIIa, VIIIb, VIIIc oder eines Gemisches davon:
    Figure 00220001
    durch Aminierung einer oxidierten, diiodierten Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel VIIa, VIIb, VIIc oder eines Gemisches davon, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann eine oxidierte, diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe der Formel IXa, IXb, IXc oder eines Gemisches davon:
    Figure 00220002
    Figure 00230001
    durch den Ersatz des Iodatoms oder anderer geeigneter Abgangsgruppen einer oxidierten Cyclodextrinmonomervorstufe, die mit einem Iodatom oder einer anderen geeigneten Abgangsgruppe disubstituiert ist, durch die eine Aminogruppe enthaltende Einheit –SCH2CH2NH2 hergestellt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine oxidierte, diiodierte oder diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe, wie vorstehend beschrieben, durch Oxidieren einer Cyclodextrinmonomervorstufe, wobei eine oxidierte Cyclodextrinmonomervorstufe gebildet wird, und dann Diiodieren und/oder Diaminieren des oxidierten Cyclodextrinmonomers, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. Wie vorstehend diskutiert, kann die Cyclodextrineinheit mit anderen Abgangsgruppen als Iodatomen und anderen Aminogruppen enthaltenden Funktionalitäten modifiziert werden. Die oxidierte, diiodierte oder diaminierte Cyclodextrinmonomervorstufe kann dann mit einer Vorstufe des Comonomers A, wie vorstehend beschrieben, copolymerisiert werden, wobei ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer gebildet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist ein lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer mindestens eine endständige Vorstufe des Comonomers A oder ein endständiges, hydrolysiertes Produkt der Vorstufe des Comonomers A, jeweils wie vorstehend beschrieben, auf. Als Folge der Termination des Cyclodextrincopolymers mit mindestens einer Vorstufe des Comonomers A existiert mindestens eine freie funktionelle Gruppe, wie vorstehend beschrieben pro linearem Cyclodextrincopolymer oder pro linearem, oxidiertem Cyclodextrincopolymer. Die funktionelle Gruppe kann zum Beispiel eine Säuregruppe oder eine funktionelle Gruppe, die zu einer Säuregruppe hydrolysiert werden kann, sein. Gemäß der Erfindung kann die funktionelle Gruppe, wie gewünscht, weiter chemisch modifiziert werden, um die Eigenschaften des Cyclodextrincopolymers, wie zum Beispiel die kolloidale Stabilität und die Transfektionsleistung, zu verbessern. Die funktionelle Gruppe kann zum Beispiel durch die Reaktion mit PEG, wobei ein Cyclodextrincopolymer mit endständigem PEG gebildet wird, um die kolloidale Stabilität zu verbessern, oder mit Histidin, wobei ein Cyclodextrincopolymer mit endständigem Imidazolyl gebildet wird, um die intrazelluläre Leistung (z.B. die endosomale Freisetzung) und die Tranfektionsleistung zu verbessern, modifiziert werden.
  • Eine weitere Chemie kann an dem Cyclodextrincopolymer durch die modifizierte funktionelle Gruppe durchgeführt werden. Die modifizierte funktionelle Gruppe kann zum Beispiel zur Verlängerung einer Polymerkette verwendet werden, indem ein lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer, wie hier beschrieben, mit demselben oder einem anderen Cyclodextrincopolymer oder einem Nicht-Cyclodextrinpolymer verknüpft wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das anzuhängende Polymer das gleiche oder ein anderes lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer, das ebenfalls mindestens eine endständige Vorstufe des Comonomers A zur weiteren Modifikation, jeweils wie hier beschrieben, aufweisen kann.
  • In einer anderen Ausführungsform können mindestens zwei gleiche oder verschiedene lineare Cyclodextrincopolymere oder lineare, oxidierte Cyclodextrincopolymere, die eine endständige funktionelle Gruppe oder eine endständige modifizierte funktionelle Gruppe, wie vorstehend beschrieben, enthalten, umgesetzt und durch die funktionelle oder modifizierte funktionelle Gruppe miteinander verknüpft werden. Bei der Reaktion der funktionellen oder modifizierten funktionellen Gruppen wird bevorzugt eine abbaubare Einheit, wie zum Beispiel eine Disulfidbrücke, gebildet. Die Modifikation der endständigen funktionellen Gruppe mit Cystein kann zum Beispiel verwendet werden, um ein lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer mit mindestens einer freien Thiolgruppe herzustellen. Die Reaktion mit dem gleichen oder einem anderen Cyclodextrincopolymer das ebenfalls mindestens eine freie Thiolgruppe enthält, bildet zwischen den zwei Copolymeren eine Disulfidbrücke. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die funktionellen oder modifizierten funktionellen Gruppen so ausgewählt werden, dass Verknüpfungen angeboten werden, die verschiedene Abbaugeschwindigkeiten (z.B. durch enzymatischen Abbau) zeigen, und dadurch, falls gewünscht, ein System zur zeitlich gesteuerten Abgabe eines therapeutischen Mittels bereitgestellt wird. Das so erhaltene Polymer kann, wie hier beschrieben, vernetzt werden. Ein therapeutisches Mittel, wie hier beschrieben, kann vor oder nach der Vernetzung des Polymers zugegeben werden. Ein Ligand, wie hier beschrieben, kann ebenfalls durch die modifizierte funktionelle Gruppe gebunden werden.
  • Gemäß der Erfindung kann ein lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer an ein Substrat gebunden oder auf ein Substrat aufgepfropft werden. Das Substrat kann ein beliebiges Substrat sein, wie es von Durchschnittsfachleuten anerkannt ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer zu einem Polymer vernetzt werden, wobei ein vernetztes Cyclodextrincopolymer beziehungsweise ein ein vernetztes, oxidiertes Cyclodextrincopolymer gebildet wird. Das Polymer kann ein beliebiges Polymer sein, das in der Lage ist, mit einem linearen oder einem linearen, oxidierten Cyclodextrincopolymer zu vernetzen (z.B. Polyethylenglycol-(PEG)-polymer oder Polyethylenpolymer). Das Polymer kann auch das gleiche oder ein anderes lineares Cyclodextrincopolymer oder lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer sein. Somit kann zum Beispiel ein lineares Cyclodextrincopolymer zu einem beliebigen Polymer, einschließlich sich selbst, eines anderen linearen Cyclodextrincopolymers und eines linearen, oxidierten Cyclodextrincopolymers, vernetzt werden. Ein vernetztes, lineares Cyclodextrincopolymer kann durch Umsetzung eines linearen Cyclodextrincopolymers mit einem Polymer in Gegenwart eines Vernetzungsmittels hergestellt werden. Ein vernetztes, lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer kann durch Umsetzung eines linearen, oxidierten Cyclodextrincopolymers mit einem Polymer in Gegenwart eines geeigneten Vernetzungsmittels hergestellt werden. Das Vernetzungsmittel kann ein beliebiges Vernetzungsmittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, sein. Beispiele von Vernetzungsmitteln schließen Dihydrazide und Dithiole ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vernetzungsmittel eine instabile Gruppe, so dass, falls gewünscht, die Vernetzun ein vernetzten Copolymers aufgehoben werden kann.
  • Ein lineares Cyclodextrincopolymer und ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer können durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, charakterisiert werden. Solche Charakterisierungverfahren oder -techniken schließen Gelpermeationschromatographie (GPC), matrixgestützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF Massenspek.), 1H- und 13C-NMR, Lichtstreuung und Titration ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer des Verbunds ein im Wesentlichen verzweigtes Polymer, wie zum Beispiel verzweigtes Polyethylenimin (PEI) oder ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer, bevorzugt ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer. Ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer kann ein beliebiges wasserlösliches, verzweigtes Polymer sein, das mindestens eine Cyclodextrineinheit, die ein Teil des Polymergerlists und/oder eine Seitengruppe des Polymergerlists sein kann, enthält. Ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer ist bevorzugt ein verzweigtes Cyclodextrincopolymer oder ein verzweigtes, oxidiertes Cyclodextrincopolymer. Ein verzweigtes Cyclodextrincopolymer oder ein verzweigtes, oxidiertes Cyclodextrincopolymer ist ein lineares Cyclodextrincopolymer beziehungsweise ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer, wie vorstehend beschrieben, von dem sich eine Nebenkette abzweigt. Die sich abzweigende Nebenkette kann eine beliebige gesättigte oder ungesättigte, lineare oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette sein. Die sich abzweigende Nebenkette kann ferner verschiedene funktionelle Gruppen oder Substituenten, wie zum Beispiel Hydroxyl-, Amino-, Säure-, Ester-, Amido-, Keto-, Formyl- und Nitrogruppen, enthalten. Die sich abzweigende Nebenkette kann auch mindestens eine Cyclodextrineinheit enthalten. Die sich abzweigende Nebenkette kann auch mit einem Liganden, wie hier beschrieben, modifiziert werden. Eine solche Ligandenmodifikation schließt die Bindung eines Liganden an eine Cyclodextrineinheit in der sich abzweigenden Nebenkette ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Das verzweigte, Cyclodextrin enthaltende Polymer ist bevorzugt ein verzweigtes Cyclodextrincopolymer oder ein verzweigtes, oxidiertes Cyclodextrincopolymer, wie vorstehend definiert, dessen sich abzweigende Nebenkette mindestens eine Cyclodextrineinheit enthält. Gemäß der Erfindung kann, wenn die sich abzweigende Nebenkette mindestens eine Cyclodextrineinheit enthält, die Cyclodextrineinheit die Einkapselung eines therapeutischen Mittels, wie hier beschrieben, erleichtern. Eine Cyclodextrineinheit einer sich abzweigenden Nebenkette erleichtert bevorzugt die Einkapselung eines therapeutischen Mittels in Verbindung mit einer Cyclodextrineinheit in dem Polymergerüst. Ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer kann durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich Derivatisierung (z.B. Substitution) eines Polymers (z.B. lineares oder verzweigtes PEI) mit einer Cyclodextrinmonomervorstufe, wie vorstehend definiert, hergestellt werden. Ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer kann durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, charakterisiert werden. Solche Charakterisierungverfahren oder -techniken schließen Gelpermeationschromatographie (GPC), matrixgestützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF Massenspek.), 1H- und 13C-NMR, Lichtstreuung und Titration ein.
  • Gemäß der Erfindung kann ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer unter vernetzenden Reaktionsbedingungen, jeweils wie vorstehend beschrieben, vernetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer mit sich selbst vernetzt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer mit einem Polymer vernetzt. Das Polymer kann das gleiche oder ein anderes verzweigtes, Cyclodextrin enthaltendes Polymer, ein im Wesentlichen lineares Polymer oder ein im Wesentlichen verzweigtes Polymer, jeweils wie vorstehend beschrieben, sein.
  • Gemäß der Erfindung kann ein im Wesentlichen verzweigtes Polymer an ein Substrat gebunden oder auf ein Substrat, wie vorstehend beschrieben, aufgepfropft werden. Eine weitere Chemie kann an dem im Wesentlichen verzweigten Polymer durch eine modifizierte funktionelle Gruppe, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden.
  • Ein Poly(ethylenimin) (PEI) zur Verwendung in der Erfindung weist ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 800 und etwa 800000 Dalton, bevorzugt zwischen etwa 2000 und 100000 Dalton und stärker bevorzugt zwischen etwa 2000 und etwa 25000 Dalton auf. Das PEI kann linear oder verzweigt sein. Geeignete PEI-Verbindungen sind von vielen Quellen im Handel erhältlich, einschließlich Polyethylenimin von Aldrich Chemical Company, Polyethylenimin von Polysciences und POLYMIN Poly(ehylenimin) und LUPASOLTM Poly(ethylenimin), die von BASF Corporation erhältlich sind.
  • Gemäß der Erfindung kann ein Polymer des Verbunds oder eines der Monomere, die ein Polymer des Verbunds bilden, mit mindestens einem Liganden modifiziert werden, so dass der so erhaltene Verbund oder supramolekulare Komplex mit mindestens einem Liganden, jeweils wie hier beschrieben, assoziiert ist. In einer anderen Ausführungsform gemäß einem Verfahren der Erfindung kann, sobald ein Verbund oder ein supramolekularer Komplex gebildet ist, er anschließend mit einem Liganden in Kontakt gebracht werden, so dass der Verbund oder supramolekulare Komplex mit mindestens einem Liganden derart modifiziert wird, dass der Ligand mit dem Verbund oder supramolekularen Komplex, jeweils wie hier beschrieben, assoziiert ist. Der Ligand eines solchen Liganden enthaltenden Verbunds oder Liganden enthaltenden supramolekularen Komplexes ermöglicht die gezielte Einwirkung auf und/oder die Bindung an eine gewünschte Zelle. Wenn mehr als ein Ligand gebunden wird, kann der Ligand der gleiche oder ein anderer sein. Beispiele geeigneter Liganden schließen Vitamine (z.B. Folsäure), Proteine (z.B. Transferrin und monoklonale Antikörper) und Polysaccharide ein. Die Wahl eines Liganden kann abhängig vom gewünschten Abgabetyp variieren. Eine rezeptorvermittelte Abgabe kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Folsäureliganden erzielt werden, während eine Antisens-Oligo-Abgabe durch die Verwendung eines Transferrinliganden erzielt werden kann.
  • Der Ligand kann mit dem Verbund oder supramolekularen Komplex durch ein in dem Fachgebiet bekanntes Mittel assoziiert werden. Ein lineares Cyclodextrincopolymer oder ein lineares, oxidiertes Cyclodextrincopolymer kann zum Beispiel mit mindestens einem Liganden, der an das Cyclodextrincopolymer gebunden ist, modifiziert werden. Der Ligand kann durch das Cyclodextrimonomer C oder Comonomer A an das Cyclodextrincopolymer gebunden werden. Der Ligand wird bevorzugt an mindestens eine Cyclodextrineinheit des Cyclodextrincopolymers gebunden. Der Ligand ermöglich bevorzugt die gezielte Einwirkung eines Cyclodextrincopolymers auf eine Zelle und die Bindung an eine Zelle. Wenn mehr als ein Ligand, der gleich oder verschieden sein kann, an ein Cyclodextrincopolymer gebunden wird, kann der zusätzliche Ligand oder die zusätzlichen Liganden an dieselbe oder eine andere Cyclodextrineinheit oder dasselbe oder ein anderes Comonomer A des Copolymers gebunden werden. Ein Cyclodextrincopolymer kann auch weiter modifiziert werden, um eine funktionelle Gruppe zur Förderung der Assoziation des Cyclodextrincopolymers mit dem therapeutischen Mittel und/oder (einem) anderen Polymer(en) des Verbunds zu enthalten.
  • Gemäß einem Verfahren der Erfindung wird bei der Bildung des supramolekularen Komplexes das therapeutische Mittel in dem mehrdimensionalen Polymernetzwerk eingekapselt, das aus dem Polymer eines Verbunds, wie vorstehend beschrieben, erzeugt wurde. Die Einkapselung wird als ein beliebiges Mittel (z.B. elektrostatische Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung oder tatsächliche Einkapselung), durch das das therapeutische Mittel mit dem mehrdimensionalen Polymernetzwerk in Assoziation tritt, definiert. Der Assoziationsgrad kann durch in dem Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich zum Beispiel Fluoreszenzuntersuchungen, DNS-Mobilitätsuntersuchungen, Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie, bestimmt werden und variiert abhängig von dem therapeutischen Mittel. Als Abgabeart kann zum Beispiel ein supramolekularer Komplex, der ein mehrdimensionales Polymernetzwerk, das aus dem Polymer eines Verbunds, wie vorstehend beschrieben, erzeugt wurde, und DNS enthält, zur Unterstützung der Transfektion, d.h. der DNS-Aufnahme in eine Tierzelle (z.B. eine menschliche Zelle), verwendet werden. (Boussif, O., Proceedings of the National Academy of Sciences, 92: 7297-7301 (1995); Zanta et al., Bioconjugate Chemistry, 8: 839-844 (1997)).
  • Das therapeutische Mittel ist kein integraler Teil des mehrdimensionalen Polymernetzwerks des supramolekularen Komplexes. Nach der Einkapselung kann das therapeutische Mittel seine biologische oder therapeutische Wirksamkeit beibehalten oder nicht. Ungeachtet dessen wird nach der Komplexspaltung oder Aufhebung der Vernetzung des supramolekularen Komplexes, speziell des mehrdimensionalen Polymernetzwerkes, die Wirksamkeit des therapeutischen Mittels wiederhergestellt. Folglich gewährt die Einkapselung des therapeutischen Mittels vorteilhafterweise einen Schutz vor Wirksamkeitsverlust, zum Beispiel auf Grund eines Abbaus, und bietet eine verbesserte Bioverfügbarkeit. Die Einkapselung eines lipophilen therapeutischen Mittels bietet eine verbesserte, wenn nicht vollständige, Löslichkeit des lipophilen therapeutischen Mittels. Das therapeutische Mittel kann vor oder nach der Bildung des Verbunds oder supramolekularen Komplexes mit mindestens einem Liganden weiter modifiziert werden, wie vorstehend beschrieben.
  • Das therapeutische Mittel kann ein beliebiges lipophiles oder hydrophiles, synthetisches oder natürlich vorkommendes, biologisch wirksames therapeutisches Mittel, einschließlich der in dem Fachgebiet bekannten, sein. Beispiele geeigneter therapeutischer Mittel schließen Antibiotika, Steroide, Polynukleotide (z.B. genomische DNS, cDNS, mRNS und Antisens-Oligonukleotide), Plasmide, Peptide, Peptidfragmente, kleine Moleküle (z.B. Doxorubicin), Chelatbildner z.B. Deferoxamin (DESFERAL), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)), Naturprodukte (z.B. Taxol und Amphotericin) und andere biologisch wirksame Makromoleküle, wie zum Beispiel Proteine und Enzyme, ein.
  • Ein supramolekularer Komplex der Erfindung kann zum Beispiel ein Feststoff, eine Flüssigkeit, eine Suspension oder eine Emulsion sein. Ein supramolekularer Komplex der Erfindung liegt bevorzugt in einer Form vor, die intravenös injiziert werden kann. Andere Verabreichungsarten eines supramolekularen Komplexes der Erfindung schließen, abhängig vom Zustand des supramolekularen Komplexes, in dem Fachgebiet bekannte Verfahren, wie orale Verabreichung, topische Anwendung, parenterale, intravenöse, intranasale, intraokulare, intrakraniale oder intraperitoneale Injektion, ein. Vor der Verabreichung kann ein supramolekularer Komplex isoliert und durch ein beliebiges Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich zum Beispiel Zentrifugation, Dialyse und/oder Lyophilisation, gereinigt werden.
  • Abhängig vom Typ des verwendeten therapeutischen Mittels kann ein supramolekularer Komplex der Erfindung in einer Vielzahl von therapeutischen Verfahren (z.B. DNS-Impfstoffen, Antibiotika und antiviralen Mitteln) für die Behandlung von genetischen oder erworbenen Erkrankungen, wie zum Beispiel cystischer Fibrose, Gaucher-Krankheit, Muskeldystrophie, AIDS, Krebserkrankungen (z.B. multiplem Myelom, Leukämie, Melanom, und Ovarialkarzinom), kardiovaskulären Krankheiten (z.B. progressivem Herzversagen, Restenose und Hämophilie) und neurologischen Krankheiten (z.B. Hirntrauma), verwendet werden. Ein Behandlungsverfahren verabreicht eine therapeutisch wirksame Menge eines durch ein Verfahren der Erfindung hergestellten supramolekularen Komplexes. Eine therapeutisch wirksame Menge, wie sie von Fachleuten anerkannt ist, wird auf einer Fall-zu-Fall-Basis bestimmt. Zu berücksichtigende Faktoren schließen die zu behandelnde Erkrankung und die physischen Eigenschaften des an der Erkrankung Leidenden ein.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das therapeutische Mittel mindestens eine biologisch wirksame Verbindung mit landwirtschaftlichem Nutzen. Die landwirtschaftlich, biologisch wirksamen Verbindungen schließen die in dem Fachgebiet bekannten ein. Geeignete landwirtschaftlich, biologisch wirksame Verbindungen schließen zum Beispiel Fungizide, Herbizide, Insektizide und Antimehltaumittel ein.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben.
  • BEISPIELE
  • Materialien. β-Cyclodextrin (Cerestar USA, Inc., aus Hammond, IN) wurde vor der Verwendung im Vakuum (<0,1 mTorr) 12 h bei 120°C getrocknet. Biphenyl-4,4'-disulfonylchlorid (Aldrich Chemical Company, Inc., aus Milwaukee, WI) wurde aus Chloroform/Hexan umkristallisiert. Kaliumiodid wurde mit einem Mörser und Pistill pulverisiert und in einem Ofen bei 200°C getrocknet. Alle anderen Reagenzien wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten und wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet. Die Polymerproben wurden auf einem HPLC-System von Hitachi, das mit einem RT-Detektor von Anspec, einem DLS-Detektor von Precision Detectors und einer Progel-TSK G3000PWXL-Säule ausgestattet war, unter Verwendung von 0,3 M NaCl oder Wasser als Elutionsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml·min–1 analysiert.
  • Beispiel 1: Mit Biphenyl-4,4'-disulfonyl A,D-überkapptes β-Cyclodextrin, 1 (Tabushi et al., J. Am. Chem. Soc. 106, 5267-5270 (1984))
  • Ein 500 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen, einem Schlenkadapter und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 7,92 g (6,98 mmol) trockenem β-Cyclodextrin und 250 ml wasserfreiem Pyridin (Aldrich Chemical Company, Inc.) beschickt. Die so erhaltene Lösung wurde bei 50°C unter Stickstoff gerührt, während 2,204 g (6,28 mmol) Biphenyl-4,4'-disulfonylchlorid in vier gleichen Portionen und 15-minütigen Zeitabständen zugegeben wurden. Nach zusätzlichem 3-stündigen Rühren bei 50°C wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde einer Umkehrphasensäulenchromatographie unter Verwendung einer Gradientenelution mit 0-40 % Acetonitril in Wasser unterzogen. Die Fraktionen wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert, und die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt. Nach dem Entfernen der Hauptmenge des Acetonitrils auf einem Rotationsverdampfer wurde die so erhaltene wässrige Suspension bis zur Trockene lyophilisiert. Dies ergab 3,39 g (38 %) von 1 als einen farblosen Feststoff.
  • Beispiel 2: 6A,6D-Diiod-6A,6D-dideoxy-β-cyclodextrin, 2 (Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 4580-4584 (1984))
  • Ein 40 ml Zentrifugenröhrchen, das mit einem Magnetrührstäbchen, einem Schlenkadapter und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 1,02 g (7,2 mmol) von 1, 3,54 g (21,3 mmol) trockenem, pulverisiertem Kaliumiodid (Aldrich) und 15 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) (Aldrich) beschickt. Die so erhaltene Suspension wurde bei 80°C unter Stickstoff 2 h gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Feststoffe durch Filtration abgetrennt, und der Überstand wurde aufgenommen. Der feste Niederschlag wurde mit einer zweiten Portion wasserfreiem DMF gewaschen, und die Überstände wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde dann in 14 ml Wasser gelöst und in einem Eisbad gekühlt, bevor 0,75 ml (7,3 mmol) Tetrachlorethylen (Aldrich) unter schnellem Rühren zugegeben wurden. Die gefällte Einschlussverbindung wurde durch eine mittlere Glasfritte filtriert und mit einer kleinen Portion Aceton gewaschen, bevor er unter Vakuum über P2O5 14 h getrocknet wurde. Dies ergab 0,90 g (92 %) von 2 als einen weißen Feststoff.
  • Beispiel 3: 6A,6D-Diazido-6A,6D-dideoxy-β-cyclodextrin, 3 (Tabushi et al., Tetrahedron Lett. 18, 1527-1530 (1977))
  • Ein 100 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen, einem Schlenkadapter und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 1,704 g (1,25 mmol) β-Cyclodextrindiiodid, 0,49 g (7,53 mmol) Natriumazid (EM Science aus Gibbstown, NJ) und 10 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) beschickt. Die so erhaltene Suspension wurde bei 60°C unter Stickstoff 14 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum entfernt. Der so erhaltene Rückstand wurde in ausreichend Wasser gelöst, um eine 0,2 M Lösung des Salzes herzustellen, und dann durch 11,3 g AG501-X8(D)-Harz von Biorad geleitet, um verbliebene Salze zu entfernen. Das Elutionsmittel wurde dann bis zur Trockene lyophilisiert, wobei sich 1,232 g (83 %) von 3 als ein weißer, amorpher Feststoff ergaben, der ohne weitere Reinigung in den nächsten Schritt übernommen wurde.
  • Beispiel 4: 6A,6D-Diamino-6A,6D-dideoxy-β-cyclodextrin, 4 (Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662 (1975))
  • Ein 250 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 1,232 g (1,04 mmol) β-Cyclodextrinbisazid und 50 ml wasserfreiem Pyridin (Aldrich) beschickt. 0,898 g (3,42 mmol) Triphenylphosphin wurde unter Rühren zu dieser Suspension gegeben. Die so erhaltene Suspension wurde 1 h bei Umgebungstemperatur gerührt, bevor 10 ml konzentrierter, wässriger Ammoniak zugegeben wurden. Die Zugabe von Ammoniak wurde von einer schnellen Gasentwicklung begleitet, und die Lösung wurde homogen. Nach 14 h wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit 50 ml Wasser verrieben. Die Feststoffe wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde mit 10 %iger HCl angesäuert (pH <4), bevor es auf eine Ionenaustauschersäule, die Toyopearl SP-650M-Harz (NH-Form) enthielt, aufgebracht wurde. Das Produkt 4 wurde mit einem Gradienten aus 0-0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat eluiert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 0,832 g (71 %) des Produkts 4 als das Bis(hydrogencarbonat)salz ergaben.
  • Beispiel 5: β-Cyclodextrin-DSP-Copolymer, 5
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen wurde mit einer Lösung von 92,6 mg (7,65 × 10-5 mol) des Bis(hydrogencarbonat)salzes von 4 in 1 ml Wasser beschickt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 M NaOH auf 10 eingestellt, bevor eine Lösung von 30,9 mg (7,65 × 10-5 mol) Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP, Pierce Chemical Co. aus Rockford, IL) in 1 ml Chloroform zugegeben wurde. Das so erhaltene zweiphasige Gemisch wurde mit einem Vortexmischer 0,5 h geschüttelt. Die wässrige Schicht wurde dann dekantiert und mit 3 × 1 ml frischem Chloroform extrahiert. Die wässrige Polymerlösung wurde dann einer Gelpermeationschromatographie (GPC) auf Toyopearl HW-40E-Harz unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel unterzogen. Die Fraktionen wurden durch GPC analysiert, und geeignete Fraktionen wurden lyophilisiert, wobei sich 85 mg (85 %) als ein farbloses, amorphes Pulver ergaben.
  • Beispiel 6: β-Cyclodextrin-DSS-Copolymer, 6
  • Ein β-Cyclodextrin-DSS-Copolymer, 6, wurde auf eine zu dem DSP-Polymer, 5, analoge Art und Weise hergestellt, außer dass das DSP-Reagenz durch Disuccinimidylsuberat (DSS, Pierce Chemical Co. aus Rockford, IL) ersetzt wurde. Die Verbindung 6 wurde in einer Ausbeute von 67 % erhalten.
  • Beispiel 7: β-Cyclodextrin-DTBP-Copolymer, 7
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen wurde mit einer Lösung von 91,2 mg (7,26 × 10–5 mol) des Bis(hydrogencarbonat)salzes von 4 in 1 ml Wasser beschickt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 M NaOH auf 10 eingestellt, bevor 22,4 mg (7,26 × 10–5 mol) Dimethyl-3,3'-dithiobis(propionimidat)·2 HCl (DTBP, Pierce Chemical Co. aus Rockford, IL) zugegeben wurden. Die so erhaltene homogene Lösung wurde mit einem Vortexmischer 0,5 h geschüttelt. wurden. Die wässrige Polymerlösung wurde dann einer Gelpermeationschromatographie (GPC) auf Toyopearl HW-40E-Harz unterzogen. Die Fraktionen wurden durch GPC analysiert, und geeignete Fraktionen wurden lyophilisiert, wobei sich 67 mg (67 %) eines farblosen, amorphen Pulvers ergaben.
  • Beispiel 8: Polyethylenglycol-600-dihydrazid, 8
  • Ein 100 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen und einem Rückflusskühler ausgestattet war, wurde mit 1,82 g (3,0 mmol) Polyethylenglycol 600 (Fluka Chemical Corp. aus Milwaukee, WI), 40 ml absolutem Ethanol (Quantum Chemicals Pty Ltd. aus Tuscola, IL) und ein paar Tropfen Schwefelsäure beschickt. Die so erhaltene Lösung wurde 14 h unter Rückfluss erhitzt. Festes Natriumcarbonat wurde zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Lösung des PEG-Diesters wurde unter Stickstoff in einen Zugabetrichter überführt. Diese die Lösung wurde dann tropfenweise zu einer Lösung von 0,6 ml (9,0 mmol) Hydrazinhydrat (Aldrich) in 10 ml absolutem Ethanol gegeben. Eine kleine Menge eines trüben Niederschlags bildete sich. Die so erhaltene Lösung wurde 1 h unter Rückfluss erhitzt, bevor sie filtriert und konzentriert wurde. Eine GPC-Analyse offenbarte eine das Produkt kontaminierende Verunreinigung mit höherem Molekulargewicht. Eine Gelpermeationschromatographie auf Toyopearl HW-40-Harz ermöglichte eine partielle Reinigung dieses Materials bis zu einer Reinheit von ungefähr 85 %.
  • Beispiel 9: Oxidation des β-Cyclodextrin-DSS-Copolymers, 9 (Hisamatsu et al., Starch 44, 188-191 (1992))
  • Das β-Cyclodextrin-DSS-Copolymer 6 (92,8 mg, 7,3 × 10–5 mol) wurde in 1,0 ml Wasser gelöst und in einem Eisbad gekühlt, bevor 14,8 mg (7,3 × 10–5 mol) Natriumperiodat zugegeben wurden. Die Lösung wurde sofort hellgelb, und man ließ sie im Dunkeln bei 0°C 14 h rühren. Die Lösung wurde dann einer Gelpermeationschromatographie (GPC) auf Toyopearl HW-40-Harz unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel unterzogen. Die Fraktionen wurden durch GPC analysiert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockene lyophilisiert, wobei sich 84,2 mg (91 %) eines hellbraunen, amorphen Feststoffes ergaben. Beispiel 10: Polyethylenglycol(PEG)-600-disäurechlorid, 10
    Figure 00350001
  • Ein 50 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen und einem Rückflusskühler ausgestattet war, wurde mit 5,07 g (ca. 8,4 mmol) Polyethylenglycol-600-disäure (Fluka Chemical Corp. aus Milwaukee, WI) und 10 ml wasserfreiem Chloroform (Aldrich) beschickt. 3,9 ml (53,4 mmol) Thionylchlorid (Aldrich) wurden unter Rühren zu dieser Lösung gegeben, und die so erhaltene Lösung wurde 1 h unter Rückfluss erhitzt, währenddessen sich eine Gasentwicklung zeigte. Man ließ die so erhaltene Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor das Lösungsmittel und überschüssiges Thionylchlorid im Vakuum entfernt wurden. Das so erhaltene Öl wurde in einem Trockenschrank aufbewahrt und ohne Reinigung verwendet. Beispiel 11: β-Cyclodextrin-PEG-600-Copolymer, 11
    Figure 00360001
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen wurde mit einer Lösung von 112,5 mg (8,95 × 10–5 mol) des Bis(hydrogencarbonat)salzes von 6A,6D-Diamino-6A,6D-dideoxy-β-cyclodextrin, 50 μl (3,6 × 10–4 mol) Triethylamin (Aldrich) und 5 ml wasserfreiem N,N-Dimethylacetamid (DMAc, Aldrich) beschickt. Die so erhaltene Suspension wurde dann mit 58 mg (9,1 × 10–5 mol) Polyethylenglycol-600-disäurechlorid, 10, behandelt. Die so erhaltene Lösung wurde mit einem Vortexmischer 5 Minuten geschüttelt, und dann ließ man sie bei 25°C 1 h stehen, währenddessen sie homogen wurde. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde einer Gelpermeationschromatographie auf Toyopearl HW-40E-Harz unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel unterzogen. Die Fraktionen wurden durch GPC analysiert, und geeignete Fraktionen wurden bis zur Trockene lyophilisiert, wobei sich 115 mg (75 %) eines farblosen, amorphen Pulvers ergaben. Beispiel 12: β-Cyclodextrin-DSP-Copolymer, 12
    Figure 00360002
  • Ein 8 ml Fläschchen wurde mit einer Lösung von 102,3 mg (8,80 × 10–5 mol) 2A,3A-Diamino-2A,3A-dideoxy-β-cycloclextrin in 1 ml Wasser beschickt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 M NaOH auf 10 eingestellt, bevor eine Lösung von 36,4 mg (8,80 × 10–5 mol) Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP, Pierce Chemical Co. aus Rockford, IL) in 1 ml Chloroform zugegeben wurde. Das so erhaltene zweiphasige Gemisch wurde mit einem Vortexmischer 0,5 h geschüttelt. Die wässrige Schicht wurde dann dekantiert und mit 3 × 1 ml frischem Chloroform extrahiert. Die wässrige Polymerlösung wurde dann einer Gelpermeationschromatographie unterzogen. Beispiel 13: 6A,6D-Bis-(2-aminoethylthio)-6A,6D-dideoxy-β-cyclodextrin, 13 (Tabushi, I.; Shirokawa, K; Fugita, K., Tetrahedron Lett. 1977, 1527-1530)
    Figure 00370001
  • Ein 25 ml Schlenkkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 0,91 ml (7,37 mmol) einer 0,81 M Lösung von Natrium-2-aminoethylthiolat in Ethanol (Fieser, L. F.; Fiester, M., Reagents for Organic Synthesis; Wiley: New York, 1967; Bd. 3, S. 265-266) beschickt. Die Lösung wurde bis zur Tockene eingedampft, und der Feststoff wurde erneut in 5 ml wasserfreiem DMF (Aldrich) gelöst. 6A,6D-Diiod-6A,6D-dideoxy-β-cyclodextrin (100 mg, 7,38 × 10–5 mol) wurde zugegeben, und die so erhaltene Suspension wurde bei 60°C unter Stickstoff 2 h gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde erneut in Wasser gelöst. Nach dem Ansäuern mit 0,1 N HCl wurde die Lösung auf eine Toyopearl SP-650M-Ionenaustauschersäule (NH4 +-Form) aufgetragen, und das Produkt wurde mit einem Ammoniumhydrogencarbonatgradienten von 0 bis 0,4 M eluiert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockene lyophilisiert. Dies ergab 80 mg (79 %) von 13 als ein weißes Pulver. Beispiel 14: β-Cyclodextrin(cystamin)-DTBP-Copolymer, 14
    Figure 00380001
  • Ein 4 ml Fläschchen wurde mit einer Lösung von 19,6 mg (1,42 × 10–5 mol) des Bis(hydrogencarbonat)salzes von 13 in 0,5 ml 0,1 M NaHCO3 beschickt. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, bevor 4,4 mg (1,4 × 10–5 mol) Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat·2 HCl (DTBP, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) zugegeben wurden. Die so erhaltene Lösung wurde dann mit einem Vortexmischer geschüttelt, und man ließ sie bei 0°C 1 h stehen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 M Tris-HCl gelöscht, bevor es mit 0,1 N HCl auf einen pH-Wert von 4 angesäuert wurde. Die wässrige Polymerlösung wurde dann einer Gelpermeationschromatographie auf Toyopearl HW-40E-Harz unterzogen. Die Fraktionen wurden durch GPC analysiert, und geeignete Fraktionen wurden bis zur Trockene lyophilisiert. Dies ergab 21,3 mg (100 %) von 14 als ein weißes Pulver. Beispiel 15: β-Cyclodextrin(cystamin)-DMS-Copolymer, 15
    Figure 00390001
  • Ein 10 ml Schlenkkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 200 mg (1,60 × 104 mol) von 13, 44 μl (3,2 × 10–4 mol) Triethylamin (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), 43,6 mg (1,60 × 104 mol) Dimethylsuberimidat·2 HCl (DMS, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) und 3 ml wasserfreiem DMF (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) beschickt. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde 18 Stunden unter einem konstanten Stickstoffstrom auf 80°C erwärmt, währenddessen der größte Teil des Lösungsmittels verdampfte. Der verbliebene Rückstand wurde erneut in 10 ml Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde anschließend mit 10 %iger HCl auf einen pH-Wert von 4 angesäuert. Diese Lösung wurde dann durch ein Centricon Plus-20 5000 NMWL-Zentrifugalfilter von Amicon geleitet. Nach dem Waschen mit Portionen von 2 × 10 ml Wasser wurde die Polymerlösung bis zur Trockene lyophilisiert, wobei sich 41,4 mg (18 %) eines grauweißen, amorphen Feststoffes ergaben.
  • Beispiel 16: Komplexierung eines fixierten, permanent geladenen Copolymers mit einem Plasmid
  • Im Allgemeinen werden gleiche Volumina eines fixierten, geladenen CD-Polymer und von DNS-Plasmidlösungen in Wasser in geeigneten Polymer/Plasmid-Ladungsverhältnissen gemischt. Man lässt das Gemisch dann bei Raumtemperatur über Nacht ins Gleichgewicht kommen und sich selbst organisieren. Der Komplexierungserfolg wird durch Überführen eines kleinen aliquoten Teils des Gemisches auf ein 0,6 %iges Agarosegel und Überprüfen der DNS-Mobilität überwacht. Freie DNS wandert unter einer angelegten Spannung, während komplexierte DNS in der Vertiefung zurückgehalten wird.
  • 1 μg DNS mit einer Konzentration von 0,1 μg/μl in destilliertem Wasser wurde mit 10 μl des Copolymers 14 mit Ladungsverhältnissen Polymeramin:DNS-Phosphat von 2,4, 6, 12, 24, 36, 60 und 120 gemischt. Die Lösung wurde mit einer Mikropipette manuell gemischt und dann über Nacht auf einem Laborrotationsapparat gemischt. 1 μg/μl Ladepuffer (40 % Saccharose, 0,25 % Bromphenolblau und 200 mM Tris-Acetat-Puffer, der 5 mM EDTA enthielt (Gao et al., Biochemistry 35: 1027-1036 (1996))) wurde am nächsten Morgen in jede Lösung gegeben. Jede DNS/Polymer-Probe wurde auf ein 0,6 %iges Agaroseelektrophoresegel, das 6 μg EtBr/100 ml in 1 × TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat/1 mM EDTA) enthielt, geladen, und an das Gel wurden 1 Stunde 40 V angelegt. Der Grad der DNS/Polymer-Komplexbildung wurde durch die DNS-Verlangsamung in dem Migrationsmuster des Gels angezeigt. Das Polymer (14) verlangsamte die DNS bei Ladungsverhältnissen von 6 und mehr, was eine Komplexbildung unter diesen Bedingungen anzeigte. Beispiel 17: Vernetzung des Copolymer-Plasmid-Komplexes
    Figure 00400001
  • Das Copolymer 14 oder das Copolymer 15 wurde wie in Beispiel 9 oxidert. Das oxidierte Copolymer 14 oder 15 wurde dann mit einem DNS-Plasmid wie in Beispiel 16 komplexiert. Die Lösung wurde mit einem Boratpuffer auf einen pH-Wert von 8,5 gepuffert, und ein Vernetzungsmittel, PEG600-Dihydrazid, wurde anschließend zugegeben, und der gebildete supramolekulare Komplex wurde durch Lichtstreuung, Zeta-Potential und Elektronenmikroskopie analysiert. Unter Verwendung des oxiderten Copolymers 15 ergab der Polymer-Plasmid-DNS-Verbund gemäß der Lichtstreuung eine mittlere Teilchengröße von 90 nm und wies eine durch Messung des Zeta-Potentials bestimmte Oberflächenladung von 40 mV auf. Nach der Zugabe von PEG600-Dihydrazid wies der supramolekulare Komplex eine mittlere Größe von 120 nm und eine Oberflächenladung von 17 mV auf. Eine Elektronenmikroskopie zeigte, dass der Verbund eine einheitliche Größe aufwies, während der supramolekulare Komplex eine gewisse Größenverteilung offenbarte.
  • Beispiel 18: Transfektionsuntersuchungen mit Luciferase-Reportergen-kodierenden Plasmiden
  • BHK-21-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion auf Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Zelldichte von 60000 Zellen/Vertiefung plattiert. Plasmide, die das Luciferasegen kodieren, wurden mit dem CD-Polymer wie in Beispiel 16 gemischt, außer dass das Copolymer 14 durch das Copolymer 15 ersetzt wurde. Eine Lösung des Mediums, die die DNS/Polymer-Komplexe enthielt, wurde zu den gezüchteten Zellen gegeben und nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion lysiert. Für den Luciferase-Lichttest geeignete Substrate wurden zu dem Zelllysat gegeben. Die in Form von erzeugten Lichteinheiten gemessene Luciferaseaktivität wurde mit einem Luminometer quantitativ bestimmt. Die DNS/Polymer-Komplexe transfizierten BHK-21-Zellen erfolgreich bei Ladungsverhältnissen von 10, 20, 30 und 40 mit einer maximalen Transfektion bei einem Polymeramin:DNS-Phosphat-Ladungsverhältnis von 40. Das Zelllysat wurde auch zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch den Lowry-Proteintest verwendet (Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 193, 265-275 (1951)). Bis zu Ladungsverhältnissen von 40 wurde keine Toxizität beobachtet.
  • Beispiel 19: Transfektionsuntersuchungen mit einem supramolekularen Komplex
  • Der in Beispiel 17 gebildete supramolekulare Komplex wurde zur Transfektion von BHK-21-Zellen gemäß dem Verfahren von Beispiel 18 verwendet. Es wurde keine Transfektion beobachtet.
  • Beispiel 20: Vernetzung des Polyethylenimin-Plasmid-Komplexes
  • Polyethylenimin (PEI) wird mit einem DNS-Plasmid wie in Beispiel 16 komplexiert. Ein Vernetzungsmittel (zum Beispiel Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat (DTBP, von Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois, im Handel erhältlich); Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP, von Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois, im Handel erhältlich) für eine biologisch abbaubare Vernetzung und Disuccinimidylsuberat (DSS, von Pierce Chemical Co. im Handel erhältlich) oder Dimethylsuberimidat (DMS, von Pierce Chemical Co. im Handel erhältlich) für eine biologisch weniger abbaubare Vernetzung) wird dann zugegeben, und der gebildete supramolekulare Komplex wird durch Lichtstreuung, Zeta-Potential und Elektronenmikroskopie analysiert.
  • Beispiel 21: Durch DNS-Matrizenpolymerisation gebildete vernetzende Polymere
  • Die Matrizenpolymerisation unter Verwendung von DNS als Matrize erfolgte wie von Trubetskoy et al., Nucleic Acids Research, Bd. 26, Nr. 18, S. 4178-4185 (1998), beschrieben.
  • Die DNS wird mit AEPD und den Comonomeren A in Kontakt gebracht. Der so erhaltene Verbund aus im Wesentlichen linearem Polymer und DNS wird durch die Zugabe geeigneter Vernetzungsmittel (zum Beispiel DTBP, DSP, DSS und DMS) vernetzt, und der gebildete supramolekulare Komplex wird durch Lichtstreuung, Zeta-Potential und Elektronenmikroskopie analysiert.
  • Beispiel 22: Durch DNS-Matrizenpolymerisation gebildete vernetzende Polymere
  • Die Matrizenpolymerisation unter Verwendung von DNS als Matrize erfolgte wie von Trubetskoy et al., Nucleic Acids Research, Bd. 26, Nr. 18, S. 4178-4185 (1998), beschrieben.
  • Die DNS wird mit oxiderten Cyclodextrindiaminen (zum Beispiel IXa, IXb oder IXc) und den Comonomeren A in Kontakt gebracht. Der so erhaltene Verbund aus im Wesentlichen linearem Polymer und DNS wird durch die Zugabe geeigneter Vernetzungsmittel (zum Beispiel Adipinsäuredihydrazid oder Polyethylenglycol-600-dihydrazid 8 von Beispiel 8) vernetzt, und der gebildete supramolekulare Komplex wird durch Lichtstreuung, Zeta- Potential und Elektronenmikroskopie analysiert.
  • Beispiel 23: Thiolierung des Cyclodextrin-(CD)-polymers mit Traut-Reagenz
  • 10,1 mg (7,34 × 10–5 mol) Traut-Reagenz (Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) wurden unter Stickstoff zu 1,00 ml einer 5,0 mM Lösung des β-CD(cystamin)-DMS-Copolymers 15 in 0,1 M Na2CO3 (pH 10,0), das 1,0 mM EDTA enthielt, gegeben. Man ließ die so erhaltene Lösung unter Stickstoff, N2, bei Umgebungstemperatur 2 Stunden stehen. Die Lösung wurde dann Luft ausgesetzt und durch ein 5000 NMWL-Zentrifugalfilter von Amicon filtriert, und danach wurde der Überstand mit 10,0 ml Wasser verdünnt und noch einmal filtriert. Die Überstandslösung wurde dann bis zu einem Volumen von 1,00 ml in Wasser verdünnt und unter Stickstoff aufbewahrt. Ein aliquoter Teil wurde mit Ellman-Reagenz (Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques; Academic: New York, S. 89 (1996)) titriert, wobei sich ein Thiolgehalt von 1,56 × 10–6 mol ergab, der einer Thiolfunktionalisierung von 31 % der Polymercyclodextrineinheiten entsprach.
  • Beispiel 24: Oxidation des thiolierten Cyclodextrin-(CD)-Polymers durch Luft
  • Fünf (5) aliquote Teile à 9 μl (insgesamt 45 μl) von 3 mM thioliertem CD-Polymer von Beispiel 23 wurden in 10-minütigen Zeitabständen zu 20 μl Plasmid-DNS (0,24 μg/μl) gegeben. Man ließ die so erhaltene Lösung über Nacht an der Luft oxidieren. Eine Elektronenmikroskopie zeigte, dass der so erhaltene supramolekulare Komplex eine einheitliche Größe aufwies.
  • Beispiel 25: Oxidation des thiolierten Cyclodextrin-(CD)-Polymers mit Aldrithiol
  • Fünf (5) aliquote Teile à 9 μl (insgesamt 45 μl) von 3 mM thioliertem CD-Polymer von Beispiel 23 wurden in 10-minütigen Zeitabständen zu 20 μl Plasmid-DNS (0,24 μg/μl) gegeben. Zwei Äquivalente des Oxidationsmittels ALDRITHIOL (von Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, im Handel erhältlich), bezogen auf das thiolierte CD-Polymer, wurden sofort zu der Lösung gegeben und durch Pipettieren schwach gemischt. Eine Elektronenmikroskopie zeigte, dass der so erhaltene supramolekulare Komplex eine einheitliche Größe aufwies. Beispiel 26: Synthese des β-Cyclodextrin(cystamin)-DMA-Copolymers, 16
    Figure 00440001
  • Bin 20 ml Szintillationsfläschchen, das mit einem Magnetrührstäbchen ausgestattet war, wurde mit 180 mg (0,131 mmol) von 13 und 32 mg Dimethyladipimidat (DMA, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) beschickt. 500 μl 0,5 M Na2CO3 wurden zugegeben. Die so erhaltene Lösung wurde mit Folie bedeckt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde mit 0,1 N HCl angesäuert und 2 Tage mit einer SpectraPor MWCO 3500-Membran dialysiert und lyophilisiert, wobei sich 41 mg eines weißen, amorphen Feststoffes mit einem durch Lichtstreuung bestimmten MG = 14 kD ergaben. Beispiel 27: Synthese des β-Cyclodextrin(cystamin)-DMP-Copolymers, 17
    Figure 00440002
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen, das mit einem Magnetrührstäbchen ausgestattet war, wurde mit 160 mg (0,116 mmol) von 13 und 30,1 mg Dimethylpimelimidat (DMP, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) beschickt. 500 μl 0,5 M Na2CO3 wurden zugegeben. Die so erhaltene Lösung wurde mit Folie bedeckt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde dann mit 0,1 N HCl angesäuert und 2 Tage mit einer SpectraPor MWCO 3500-Membran dialysiert und lyophilisiert, wobei sich 22 mg eines weißen, amorphen Feststoffes mit einem durch Lichtstreuung bestimmtem MG = 14 kD ergaben.
  • Beispiel 28: Transfektionsuntersuchungen mit Luciferase-Reportergen-kodierenden Plasmiden
    Figure 00450001
  • BHK-21-Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Zelldichte von 60000 Zellen/Vertiefung in 1 ml Medium plattiert. Plasmide, die das Luciferasegen kodieren, wurden wie in Beispiel 16 unter Verwendung des Copolymers 14, 15, 16 oder 17 mit dem CD-Polymer gemischt. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt, und ein Transfektionsgemisch (200 μl Optimem mit 20 μl Polymer/DNS-Lösung) wurde in jede Vertiefung gegeben. Nach 5 Stunden wurden 800 μl Vollmedium (DMEM + 10 % BS, Gibco) in jede Vertiefung gegeben. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch 1 ml Vollmedium ersetzt. Nach weiteren 24 Stunden wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden mit 1 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 0,050 ml Zellkulturlysepuffer (Promega) durch einen Gefrier-Auftau-Zyklus lysiert. 4 μl Zelllysat wurden für den Luciferasetest verwendet, der in Form von erzeugten Lichteinheiten gemessen wurde, und 10 μl wurden für den Protein-DC-Test von Biorad verwendet. Die Ergebnisse der Transfektion und der Toxizität sind nachstehend veranschaulicht.
    Figure 00460001
    Luciferasetransfektion von BHK-21-Zellen (serumfrei) mit CD-DMS und CD-DTBP
    Figure 00470001
    Toxizität von CD-DMS und CD-DTBP auf BHK-21-Zellen (serumfrei)
    Figure 00470002
  • Beispiel 29: Wirkung von Heparansulfat auf PEI/DNS-Partikel
  • Verschiedene Konzentrationen von linearem Polyethylenimin (IPEI), 2 kD, wurden 30 Minuten mit DNS gemischt. Heparansulfat (75X aus DNS) wurde 30 Minuten zu der PEI/DNS-Lösung gegeben. Ein Agarosegel wurde zur Untersuchung der Ergebnisse angewendet. Bei niedrigen PEI/DNS-Verhältnissen war Heparansulfat in der Lage, PEI von
  • der DNS abzulösen. Bei einer höheren Konzentration von PEI blieb PEI jedoch sogar unter Zugabe von Heparansulfat mit der DNS assoziiert.
  • Beispiel 30: Vernetzungsexperiment unter Verwendung von verzweigtem Polyethylenimin (bPEI), 25 kDa, mit verschiedenen Konzentrationen von Heparansulfat
  • 10 μl (1 μg) DNS und 10 μl Polyethylenimin (PEI, 1,41 mM, Ladungsverhältnis 5+/-) wurden 30 Minuten miteinander vermischt. Dann wurde der Vernetzer Dithiobispropionimidat (DTBP) oder Dimethylsuperimidat (DMS) zu der DNS/PEI-Lösung gegeben. Nach 90 Minuten wurden verschiedene Konzentrationen von Heparansulfat (HS) zur kompetitiven Bindung an PEI zugegeben. Das Agarosegel wurde nach 20 Minuten zur Untersuchung der Wirkung des Vernetzers auf die Bindung von PEI an die DNS angewendet. Für 0,1 –/+ HS konnte HS nicht an PEI binden, um eine Ablösung des PEI von der DNS zu bewirken. Höhere Konzentrationen von HS konnten PEI nur in Abwesenheit von DTBP (oder DMS) von der DNS ablösen. Somit hat PEI in Gegenwart des Vernetzers auf PEI eine höhere Affinität zu der DNS. Bei 3 –/+ HS ist die Konzentration jedoch hoch genug, so dass sich HS sogar in Gegenwart des Vernetzers PEI von der DNS ablöste.
  • Beispiel 31: Vernetzungsexperiment mit Pentalysin unter Verwendung des Vernetzers DTBP und des Reduktionsmittels Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)
  • Pentalysin wurde 15 Minuten zu der DNS gegeben. Der Vernetzer DTBP wurde dann während 60 Minuten zu dem Lösungsgemisch gegeben. TCEP wurde zugegeben, und nach 30 Minuten wurde ein Agarosegel angewendet. Pentalysin selbst war nicht stark genug, um an die DNS zu binden. Unter Zugabe des Vernetzungsmittels DTBP band jedoch vernetztes Pentalysin an die DNS. Wenn das Reduktionsmittel TCEP zugegeben wurde, löste sich Pentalysin erneut von der DNS ab. Somit erhöhte die Vernetzung mit DTBP die Affinität von Pentalysin zu der DNS.
  • Beispiel 32: Reversible Vernetzung von verzweigtem PEI (bPEI) (25 kDa) mit DTBP
  • 1 μg DNS-Plasmid (~5 kpb) wurde mit bPEI (25 kDa) mit einem Ladungsverhältnis von 5 +/– 30 Minuten komplexiert. Der Vernetzer DTBP (Dithiobispropionimidat, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) wurde dann zugegeben, und man ließ ihn 90 Minuten mit den primären
  • Aminen auf PEI reagieren. Nach der Reaktion wurden einige der Lösungen 25 Minuten mit einem Reduktionsmittel, TCEP (Tris-(2-carboxyethyl)phosphin), behandelt. Heparansulfat wurde dann mit einem Ladungsverhältnis von 2:1 bezüglich PEI zu dem Gemisch gegeben, um die Partikel abzulösen.
  • Heparansulfat war nicht in der Lage, vernetztes PEI von der DNS abzulösen. Nach der Reduktion des Vernetzungsmittels mit TCEP war Heparansulfat jedoch in der Lage, das PEI von der DNS abzulösen. Somit ist vernetzendes DTBP in der Lage, PEI/DNS-Verbunde zu stabilisieren. Diese Stabilisierung ist unter reduzierenden Bedingungen reversibel. Die Ergebnisse sind in dem Agarosegel von 1 veranschaulicht. Beispiel 33: β-Cyclodextrin(cystamin)-PEG600-Copolymer, 18
    Figure 00490001
  • Ein 100 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen, einem Schlenkadapter und einem Septum ausgestattet war, wurde mit 1,564 g (1,25 mmol) von 13 und 25 ml frisch destilliertem Dimethylacetamid (DMAc, Aldrich) beschickt. 0,7 ml (4 Äq.) Triethylamin (Aldrich) und eine Lösung von 10 in 5 ml DMAc wurden zu der Aufschlämmung gegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden auf 80°C erwärmt. Nach dieser Zeit ließ man das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur abkühlen, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde dann in 50 ml Wasser aufgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde in einer SpectraPor 7 MWCO 3500-Membran gegen Wasser dialysiert. Die so erhaltene Lösung wurde bis zur Trockene lyophilisiert, wobei sich 1,515 g (66 %) eines grauweißen, amorphen Feststoffes mit einem durch Lichtstreuung bestimmtem MG = 25000 ergaben. Beispiel 34: Synthese des β-Cyclodextrintosylats, 19 (Melton, L. D., und Slessor, K. N., Carbohydrate Research, 18, S. 29 (1971))
    Figure 00500001
  • Ein 500 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen, einem Vakuumadapter und einem Septum ausgestattet war, wurde mit einer Lösung von trockenem β-Cyclodextrin (8,530 g, 7,51 mmol) und 200 ml trockenem Pyridin beladen. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, bevor 1,29 g (6,76 mmol) Tosylchlorid zugegeben wurden. Man ließ die so erhaltene Lösung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Das Pyridin wurde so weit wie möglich im Vakuum entfernt. Der so erhaltene Rückstand wurde dann aus 40 ml warmer Wasser zweimal umkristallisiert, wobei sich 7,54 (88 %) eines weißen, kristallinen Feststoffes ergaben. Beispiel 35: Synthese des β-Cyclodextrinthiols, 20 (K. Fujita et al., Bioorg. Chem., Bd. 11, S. 72 (1982), und K. Fujita et al., Bioorg. Chem., Bd. 11, S. 108 (1982))
    Figure 00500002
  • Ein 50 ml Rundkolben mit einem Magnetrührstäbchen und einem Schlenkadapter wurde mit 1,00 g (0,776 mmol) von 19, 0,59 g (7,75 mmol) Thioharnstoff (Aldrich) und 7,8 ml 0,1 N NaOH Lösung beschickt. Das so erhaltene Gemisch wurde unter Stickstoff 6 Stunden auf 80°C erwärmt. Als nächstes wurden 0,62 g (15,5 mmol) Natriumhydroxid zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff eine weitere Stunde auf 80°C erwärmt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, bevor es mit 10 %iger HCl auf einen pH- Wert von 4,0 eingestellt wurde. Das Gesamtvolumen der Lösung wurde auf 20 ml eingestellt und dann wurde sie in einem Eisbad gekühlt, bevor 0,8 ml Tetrachlorethylen zugegeben wurden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C 0,5 h kräftig gerührt, bevor der gefällte Feststoff auf einer feinen Glasfritte aufgenommen wurde. Der Feststoff wurde über Nacht evakuiert, wobei sich 0,60 g (67 %) eines weißen, amorphen Feststoffes ergaben. Beispiel 36: Synthese des β-Cyclodextriniodids, 21
    Figure 00510001
  • Ein Rundkolben mit einem Magnetrührstäbchen und einem Schlenkadapter wird mit 19, 15 Äquivalenten Kaliumiodid und DMF beschickt. Das so erhaltene Gemisch wird 3 Stunden auf 80°C erwärmt, und danach lässt man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Das Gemisch wird dann filtriert, um den Niederschlag zu entfernen, und das Filtrat wird bis zur Tockene eingedampft und bei 0°C in Wasser erneut gelöst. Tetrachlorethylen wird zugegeben, und die so erhaltene Aufschlämmung wird bei 0°C 20 Minuten kräftig gerührt. Der Feststoff wird auf einer mittleren Glasfritte aufgenommen, mit Aceton verrieben und über P2O5 aufbewahrt. Beispiel 37: Synthese des mit einem Polymer verbundenen β-Cyclodtxtrinthiol-PEC, 22
    Figure 00520001
  • Ein 100 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührstäbchen und einem Rückflusskühler ausgestattet war, wurde mit 2,433 g (2,11 mmol) von 20 und 0,650 g funktionalisiertem PEG (PEG mit Olefinseitengruppen, von Yoshiyuki Koyama von Otsuma Women's University, Tokio, Japan, erhalten) beschickt. Das so erhaltene Gemisch wurde 12 Stunden unter Rückfluss erhitzt, währenddessen sich 20 löste. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, und der gefällte Feststoff wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde in einer SpectraPor 7 MWCO 1000-Membran gegen Wasser dialysiert. Die Lösung wurde lyophilisiert, wobei sich ein amorpher, weißer Feststoff ergab.
  • Beispiel 38: Synthese eines Polymers aus verzweigtem PEI und Cyclodextrin, 23
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen, das mit einem Magnetrührstäbchen ausgestattet war, wird mit verzweigtem PEI (25 kD, Aldrich) und 22 beschickt. Entgaster Natriumcarbonatpuffer wird zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird bei 80°C 4 Stunden gerührt. Das Gemisch wird mit 0,1 N HCl angesäuert und mit einer SpectraPor MWCO 3500-Membran 2 Tage dialysiert und lyophilisiert. Beispiel 39: Synthese des Hexamethylendiamin-DMS-Copolymers, 24
    Figure 00530001
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen, das mit einem Magnetrührstäbchen ausgestattet war, wurde mit 80 mg (0,690 mmol) Hexamethylendiamin (Aldrich) und 195 mg Dimethylsuberimidat (DMS, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) beschickt. 250 μl 0,5 M Na2CO3 wurden zugegeben. Die so erhaltene Lösung wurde mit Folie bedeckt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde dann mit 0,1 N HCl angesäuert und mit einer SpectraPor MWCO 3500-Membran 2 Tage dialysiert und lyophilisiert, wobei sich 30 mg eines weißen, amorphen Feststoffes ergaben. Beispiel 40: Synthese des 1‚9-Diaminononan-DMS-Copolymers, 25
    Figure 00530002
  • Ein 20 ml Szintillationsfläschchen, das mit einem Magnetrührstäbchen ausgestattet war, wurde mit 85 mg (0,537 mmol) 1,9-Diaminononan (Aldrich) und 146 mg Dimethylsuberimidat (DMS, Pierce Chemical Co. aus Rockford, Illinois) beschickt. 250 μl 0,5 M Na2CO3 wurden zugegeben. Die so erhaltene Lösung wurde mit Folie bedeckt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde dann mit 0,1 N HCl angesäuert und mit einer SpectraPor MWCO 3500-Membran 2 Tage dialysiert und lyophilisiert, wobei sich 41,7 mg eines weißen, amorphen Feststoffes ergaben.
  • Beispiel 41: Transfektionen mit den Diamin-DMS-Copolymeren 24 und 25
  • Die Transfektionen wurden, wie in Beispiel 26 beschrieben, durchgeführt, außer dass die Copolymere 24 und 25 die Copolymere 14, 15, 16 und 17 ersetzten. Die Transfektions- und Toxizitätsergebnisse sind nachstehend veranschaulicht. Die Enfernung von Cyclodextrin aus dem Polymergerüst führt zu Polymeren mit hoher Zytotoxizität. Transfektion der C6- und C9-Diamin-DMS-Copolymere
    Figure 00540001
    Toxizität der C6- und C9-Diamin-DMS-Copolymere
    Figure 00540002
  • Beispiel 42: Solubilisierung von Taxol mit 18
  • Überschüssige Mengen von Paclitaxel wurden zu einer 18 %igen Lösung von 18 gegeben. Die Lösung wurde geschüttelt, mit einem Vortexmischer gemischt und dann durch ein Nylonfilter mit 2 μm filtriert, um eventuell vorhandenes ungelöstes Paclitaxel zu entfernen. Die filtierte Lösung wurde dann in eine HPLC, die mit einer Altima C8-Umkehrphasensäule ausgestattet war, injiziert. Paclitaxel wurde durch UV-Absorption bei 227 nm nachgewiesen, und die Konzentration von Paclitaxel wurde durch Peakintegration bestimmt. Kalibrationsdiagramme der Paclitaxelkonzentration vs. Peakfläche zeigten bis zu 25 μg/ml eine lineare Beziehung. Die Gegenwart einer 18 %igen Lösung von 18 verbesserte die Löslichkeit von Paclitaxel deutlich um mehr als das 30-fache.
  • Beispiel 43: Abgabe von Paclitaxel mit 18 oder 22
  • Die Zellen werden auf einem Hämocytometer gezählt und mit einer Dichte von 4000 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 96 Vertiefungen plattiert. Paclitaxel wird mit dem Polymer 18, das mit einem Liganden konjugiert ist, oder dem Polymer 22, das mit einem Liganden für die gezielte Abgabe konjugiert ist, gemischt. Man lässt die Lösungen mindestens 30 Minuten mischen, und danach werden die Arzneistoff/Polymer-Lösungen in einer Reihenverdünnung zu den Zellen gegeben. Die Kulturplatten werden bei 37°C inkubiert. Nach zwei Tagen wird die IC50 des Paclitaxels auf die Zellen durch einen MTT-Test bestimmt. Das Kulturmedium wird entfernt, und die Zellen werden mit PBS gewaschen. Als nächstes werden 50 μl MTT/Vertiefung, gefolgt von 150 pl Medium/Vertiefung zugegeben. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C wird die MTT-Lösung entfernt, und das Formazan wird durch die Zugabe von 200 μl DMSO/Vertiefung löslich gemacht. Die Extinktion des Formazans wird mit einem Mikrotiterplattenleser bei 562 nm abgelesen.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung eines supramolekularen Komplexes, umfassend die Schritte: Kombinieren mindestens eines therapeutischen Mittels und mindestens eines Polymers, um einen Verbund zu bilden, und Behandeln des Polymers des Verbunds unter vernetzenden Reaktionsbedingungen, um einen supramolekularen Komplex zu bilden, welcher das therapeutische Mittel und ein mehrdimensionales Polymernetzwerk umfasst, mit der Maßgabe, dass Verfahren, die die Schritte i) bis iv) verwenden, ausgeschlossen sind: i) Beladen eines mit einem Magnetrührer und einem Septum ausgerüsteten 25 ml Schlenk-Kolbens mit 0,91 ml (7,37 mMol), einer 0,81 M-Lösung von Natrium 2-Aminoethylthiolat in Ethanol; Verdampfen der Lösung zur Trockne und erneutes Lösen des Feststoffes in 5 ml wasserfreiem IMF; Zugeben von 6A,6D-Diiod-6A,6D-deoxy-β-cyclodextrin (100 mg, 7,38 × 10–5 Mol) und Rühren der erhaltenen Suspension bei 60°C unter Stickstoff für 2 Stunden; Kühlen auf Raumtemperatur; Konzentrieren der Lösung im Vakuum und erneutes Lösen des Rückstands in Wasser; Ansäuern der Lösung mit 0,1 N HCl; Aufbringen der Lösung auf eine Toyopearl SP-650M Ionenaustauscher-Säule (NH4 +-Form) und Eluieren des Produkts mit einem 0 bis 0,4 M Ammoniumhydrogencarbonatgradienten; Kombinieren geeigneter Fraktionen und Gefriertrocknen derselben zur Trockne, um 6A,6D-Bis-(2-aminoethylthio)-6A,6D-deoxy-β-cyclodextrin zu erhalten; und ii) a) Beladen einer 4 ml-Phiole mit einer Lösung von 19,6 mg (1,42 × 10–5 Mol) des in Schritt i) erhaltenen Bis(hydrogencarbonat)-Salzes von 6A,6D-Bis-(2-aminoethylthio)-6A,6D-deoxy-β-cyclodextrin in 0,5 ml 0,1 M NaHCO3; Kühlen in einem Eisbad vor dem Zugeben von 4,4 mg (1,4 × 10–5 Mol) von Dimethyl-3,3'-dithio-bispropionimidat-2 HCl (DTBP); Rühren der erhaltenen Lösung mit einem Vortexmischer und Stehenlassen bei 0°C für 1 Stunde; Quenchen der Reaktion mit 1 M Tris-HCl vor dem Ansäuern auf pH 4 mit 0,1 N HCl; Unterziehen der wässrigen Polymerlösung einer Gelpermeationschromatographie auf Toyopearl HW-40E-Harz; Analysieren der Fraktionen durch GPC und Gefriertrocknen geeigneter Fraktionen zur Trockne, um β-Cyclodextrin(cystamin)-DTBP-Copolymer zu erhalten; oder b) Beladen eines mit einem Magnetrührer und einem Septum ausgerüsteten 10 ml Schlenk-Kolbens mit 200 mg (160 × 10–4 Mol) 6A,6D-Bis-(2-aminoethylthio)-6A,6D-deoxy-β-cyclodextrin, 44 μl (3,2 × 104 Mol) Triethylamin, 43,6 mg (1,60 × 10–4 Mol) Dimethylsuberimidat·2 HCl (DMS) und 3 ml wasserfreiem DMF; Erwärmen der erhaltenen Aufschlämmung auf 80°C für 18 Stunden unter einem stetigen Stickstoffstrom währenddessen der größte Teil des Lösungsmittels verdampft; erneutes Lösen des verbleibenden Rückstands in 10 ml Wasser und Ansäuern der erhaltenen Lösung mit 10% HCl auf pH 4; Durchleiten der Lösung durch einen Amicon Centricon Plus-20 5000 NMWL-Zentrifugalfilter; Waschen mit 2 × 10 ml Portionen Wasser; und Gefriertrocknen der Polymerlösung zur Trockne, was β-Cyclodextrin(cystamin)-DMS-Copolymer ergibt; und iii) Lösen von β-Cyclodextrin(cystamin)-DMS-Copolymer oder β-Cyclodextrin(cystamin)-DTBP-Copolymer (7,3 × 10–5 Mol) in 1,0 ml Wasser und Kühlen in einem Eisbad vor dem Zugeben von 14,8 mg (7,3 × 10–5 Mol) Natriumperiodat; Rühren lassen in der Lösung in der Dunkelheit bei 0°C für 14 Stunden; Unterziehen der Lösung einer Gelpermeationschromatographie (GPC) auf Toyopearl HW-40-Harz unter Verwendung von Wasser als Eluens; Analysieren der Fraktionen durch GPC und Kombinieren und Gefriertrocknen geeigneter Fraktionen zur Trockne, um die oxidierte Form von β-Cyclodextrin(cystamin)-DMS-Copolymer bzw. β-Cyclodextrin(cystamin)-DTBP-Copolymer zu erhalten; und iv) a) Mischen gleicher Volumina von Lösungen des in Schritt iii) erhaltenen fixierten, geladenen CD-Polymers mit fester Ladung und von DNS-Plasmid in Wasser mit geeigneten Polymer/Plasmid-Beladungsverhältnissen; ins Gleichgewicht kommen lassen des Gemisches und Selbstorganisation bei Raumtemperatur über Nacht; Überwachen des Komplexierungserfolges durch Überführen eines kleinen Aliquots des Gemisches auf 0,6% Agarosegel und Prüfen der DNS-Mobilität; Zugeben eines Vernetzungsmittels, um die DNS einzukapseln, und Bestimmen des Einkapselungserfolges durch Lichtstreuung und Visualisieren durch Elektronenmikroskopie; oder b) Mischen gleicher Volumina des in Schritt iii) erhaltenen CD-Polymers und DNS-Plasmid- oder Antisens-Oligo-Lösung in Wasser in geeigneten Polymer/Plasmid- oder Antisens-Oligo-Beladungsverhältnissen; Einstellen des pH-Wertes des Gemisches, um ein geladenes CD-Polymer zu bilden; ins Gleichgewicht kommen lassen des Gemisches und Selbstorganisation bei Raumtemperatur für 30 Minuten; Zugeben eines Vernetzungsmittels, um die DNS oder Antisens-Oligo einzukapseln; Zugeben einer konzentrierten Pufferlösung, um den pH-Wert und dadurch das CD-Polymer zu neutralisieren, und Bestimmen des Einkapselungserfolges durch Lichtstreuung und Visualisieren durch Elektronenmikroskopie.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Behandeln des Polymers des Verbunds in der Assoziation des Polymers über interpolymere kovalente Bindungen, nicht-kovalente Bindungen oder nicht-kovalente Wechselwirkungen resultiert.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymer des Verbunds ein im Wesentlichen lineares Polymer, ein im Wesentlichen verzweigtes Polymer oder ein Gemisch davon ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das im Wesentlichen lineare Polymer ein lineares Polyethylenimin oder ein lineares Cyclodextrin enthaltendes Polymer ist und das im Wesentlichen verzweigte Polymer ein verzweigtes Polyethylenimin oder ein verzweigtes Cyclodextrin enthaltendes Polymer ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das lineare Cyclodextrin enthaltende Polymer ein lineares Cyclodextrin-Copolymer oder ein lineares oxidiertes Cyclodextrin-Copolymer ist und das verzweigte Cyclodextrin enthaltende Polymer ein verzweigtes Cyclodextrin-Copolymer oder ein verzweigtes oxidiertes Cyclodextrin-Copolymer ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel ausgewählt ist aus einem Antibiotikum, einem Steroid, einem Polynukleotid, einem Plasmid, einem Peptid, einem Peptidfragment, einem kleinen Molekül, einem Chelatbildner und einem biologisch aktiven Makromolekül.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das therapeutische Mittel ein Polynukleotid ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das therapeutische Mittel mit mindestens einem Liganden modifiziert ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Ligand aus Vitaminen, Proteinen und Polysacchariden ausgewählt ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Behandeln die Zugabe von mindestens einem Vernetzungsmittel umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Vernetzungsmittel aus Adipinsäuredihydrazid, Polyethylenglycol 600 Dihydrazid, Dimethyl-3,3'-dithiobispropion-imidat, Dithiobis(succinimidylpropionat), Disuccinimidylsuberat und Dimethylsuberimidat (DMS) ausgewählt ist.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend Kontaktieren des Verbunds mit mindestens einem Liganden, um einen Liganden enthaltenden Verbund zu bilden.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Ligand aus Vitaminen, Proteinen und Polysacchariden ausgewählt ist.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend Kontaktieten des supramolekularen Komplexes mit mindestens einem Liganden, um einen Ligand enthaltenden supramolekularen Komplex zu bilden.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der Ligand aus Vitaminen, Proteinen und Polysacchariden ausgewählt ist. Supramolekularer Komplex, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
  16. Verwendung eines supramolekularen Komplexes gemäß Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei der supramolekulare Komplex als ein Abgabevehikel für ein therapeutisches Mittel verwendet werden soll.
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