EP1263981A2 - Matrix-reaktor und verfahren zur herstellung von produkten in diesem reaktor - Google Patents

Matrix-reaktor und verfahren zur herstellung von produkten in diesem reaktor

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Publication number
EP1263981A2
EP1263981A2 EP01911745A EP01911745A EP1263981A2 EP 1263981 A2 EP1263981 A2 EP 1263981A2 EP 01911745 A EP01911745 A EP 01911745A EP 01911745 A EP01911745 A EP 01911745A EP 1263981 A2 EP1263981 A2 EP 1263981A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reactor
matrix
reaction
volume
compartment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01911745A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Buchberger
Wolfgang Mutter
Albert Roeder
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG, Roche Diagnostics GmbH filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of EP1263981A2 publication Critical patent/EP1263981A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/005—Beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the present invention relates to a matrix reactor for reactions in which low-molecular and high-molecular reactants are involved, the reactor space V R containing a matrix and comprising both the reaction compartment and the supply compartment, the matrix consisting of a porous material which accommodate low-molecular reactants can and excludes high molecular weight reactants and where the exclusion volume V 0 of the matrix is available as reaction compartment and the matrix volume V of Mat ⁇ x is available as supply compartment.
  • the matrix reactor can be used for synthesis processes with the involvement of high molecular weight catalysts (eg en / vmkatalvsiere reactions), in particular for the coupled in vitro transcription / translation reaction for the production of proteins.
  • Some, important components of translation are currently being introduced into the system via cell extracts, eg E. coh S30 lysate, reticulocyte lvsat or wheat germ lvsat.
  • the yields of a coupled Transk ⁇ pt ⁇ on- / Translat ⁇ onsreakt ⁇ on are in the order of 1 mg / ml.
  • a prerequisite for this is a continuous supply of substrates and energy components and the simultaneous separation or dilution of the final reaction products. This enables the reaction to be maintained for many hours.
  • CECF continuous exchange cell-free
  • CFCF continuous flow cell-free
  • the rectors consist of membrane surfaces and several chambers and are therefore complex to manufacture.
  • Reaction solution and supply solution must be constantly mixed (e.g. by stirring or pumping) to counteract gradients and undersupply.
  • the problem with the reactors of the prior art arises that, in the case of a coupled in vitro transcript / translation reaction for the production of proteins, the lysates used are greatly diluted compared to the state in the E. coli cytosol.
  • the reasons for this are 1. the digestion and preparation processes for obtaining the lysates and 2. the dilution, which is accompanied by the addition of all the necessary components.
  • several ways have already been shown in the prior art with the aim of increasing the active concentration of lysates.
  • the object of the present invention was to provide a reactor which is suitable for the coupled intro transcription / translation reaction for the production of proteins and which overcomes the disadvantages of the reactors of the prior art. Furthermore, methods are to be provided which are suitable for the in vitro transcription / translation reaction for the production of proteins and which do not have the disadvantages of the prior art. Furthermore, the method according to the invention is intended to counteract a dilution of the macromolecular components. In particular, a reactor and a method are to be provided which enable the in vitro transcription / translation reaction for the production of proteins on a large scale
  • the invention relates to a reactor for reactions in which low-molecular and high-molecular reactants are involved and the reactor space contains a matrix and comprises both the reaction compartment and the supply compartment, wherein
  • the matrix consists of a porous material in which low-molecular reactants can diffuse largely freely,
  • the high molecular weight reactants cannot penetrate the matrix
  • the low molecular weight reactants are distributed throughout the reactor space V R ,
  • the exclusion volume V 0 of the matrix is available as a reaction compartment
  • the reaction compartment and supply compartment can be present in one reactor space due to the matrix structure of the reactor space. This variant is preferred. However, it would also be conceivable for the reaction compartment and supply compartment to be present in a reaction space and for an additional supply reservoir to exist which is connected to the reactor space directly or via a semipermeable membrane.
  • Porous materials are used as the matrix, which may be inorganic materials, such as aluminum oxide, and / or organic materials, such as gels.
  • the matrix must be wettable or swellable in aqueous solution and possess molecular sieve properties. According to the invention, solutions which contain only 50% by volume of water are also referred to as aqueous solutions.
  • the matrix consists of polymers, crosslinked polymers (eg dextran), copolymers (eg polyacrylamide) or inorganic "gels".
  • a matrix is preferred which consists of particles with a particle size in the range from 0.1 to 1000 ⁇ m.
  • the specific material density is generally less than 0.5 g / ml, but preferably less than 0.3 g / ml.
  • the surface area of the matrix particles (calculated as spherical surface area) is preferably in the range from 0.004 to 40 m 2 / ml bed volume.
  • the Mat ⁇ x is defined by an exclusion limit (exclusion molecular weight) for macromolecules.
  • the exclusion limit can be in the range from 0.5 to 300 kDa. An exclusion limit between 2 and 300 kDa is preferred, and an exclusion limit between 10 and 100 kDA is particularly preferred.
  • Appropriate materials are commercially available (eg Sephadex ", Pharmacia; Bio-Gel * ', BIO-RAD).
  • a material with uniform or different particle sizes can be used. Mixtures of different materials can also be used.
  • the matrix itself consists of one Inert material which itself does not participate in the reaction - not even as a catalyst - however, substances such as enzymes can be bound to this inert matrix if necessary.
  • the reactor space is completely or partially filled with this porous material.
  • a minimum filling of the reactor with the matrix is necessary.
  • the effect according to the invention is no longer to be expected below 20 vol% (bed volume).
  • the matrix fill is, for example, 19.9% vol.
  • the reactor according to the invention is preferably at least about 20 vol% and particularly preferably at least about 30 vol% with the porous matrix Material filled.
  • the variant in which the reactor is completely filled with porous matrix material is particularly preferred. A range of 80-100% vol is also extremely preferred.
  • the matrix divides the reactor volume into at least two compartments. A space that can only be occupied by low-molecular components and a space in which both low-molecular and all high-molecular components are located.
  • the resulting final concentrations for the reactants used are a first approximation of the size of the distribution spaces that they can reach.
  • the entire reactor volume V R is taken up by the components whose molecular weight is substantially below the exclusion limit of the matrix. This applies to substrates, buffer substances, salts and low molecular weight inhibitors, activators and stabilizers. This also applies in particular to low molecular weight end products which can potentially inhibit the reaction (eg product inhibition) or whose enrichment changes the general reaction conditions (eg pH value) and thereby slow the reaction.
  • the high molecular weight components cannot penetrate the matrix.
  • the reaction and supply compartments are connected to each other via short diffusion distances and an extremely large exchange area.
  • the volume ratio of reaction compartment V 0 to supply compartment V M depends on the nature, the size and the structural nature of the matrix and on the amount of matrix introduced.
  • the ratio V R / V can be varied within a wide range.
  • the reaction volume for a certain part of the macromolecules can be increased.
  • the volume for ribosomes, DNA template and mRNA was kept small (molecular weight> 200 kDa), whereas the loading of the tRNAs by aminoacyl-tRNA synthases (molecular weight ⁇ 100 kDa) take place in an extended reaction space.
  • conditions for partial reactions could be optimized.
  • the structure of the porous matrix also allows a specific modification of the surface or lumen.
  • Enzymatic functions such as modifying enzymes (restriction proteases) or an energy-regenerating enzyme system can be immobilized on separate particles in a certain ratio.
  • Chemical modification of the lumen made it possible to specifically adsorb inhibitory substances.
  • the construction principle of the matrix reactor allows simple high dimensioning from the laboratory to the production scale.
  • commercially available chromatography columns can be used as reactors, which are available in sizes between 10 ml and 1000 liters.
  • processes can be easily, quickly and inexpensively transferred to higher dimensions.
  • the effort involved in planning, building and testing reactors and production facilities is reduced considerably.
  • the reactor material can vary from stainless steel to plastic to glass. However, other materials can also be used.
  • the reactor according to the invention differs from the previously available reactors
  • the supply compartment corresponds to the matrix volume (V M ).
  • the reaction compartment corresponds to the exclusion volume V 0 of the matrix.
  • the exclusion limit of the matrix is in the range of 0.5-300 kDa, preferably 2 to 300 kDa.
  • the reactor has an inlet (top) and outlet (bottom) for solutions. By supplying solution, a uniform flow of the liquid column is created in the direction of the discharge.
  • the reactor can be thermostatted
  • a matrix reactor in which the matrix is a gel matrix is therefore particularly preferred.
  • a Mat ⁇ x reactor is preferred in which the reactor space has the shape of a cylinder.
  • a preferred embodiment is thus a reactor in which the reactor is a thermostattable chromatography column filled with a gel matrix.
  • the matrix have an exclusion limit in the range of 2-300 kDa.
  • the reactor principle according to the invention can also be advantageously combined with established reactor types (batch, CECF, CFCF).
  • an improvement in the yield can be achieved due to increased productivity.
  • the principle according to the invention can also contribute to a cost reduction.
  • the reactor consists of a closable reaction vessel.
  • the reactor has a sufficient volume to accommodate the reaction solution and a variable amount of gel matrix.
  • the reactor can be thermostatted (e.g. in a water bath) 3) CECF reactor with matrix
  • the reactor is a CECF reactor consisting of at least two chambers, which are connected to one another via one or more semipermeable membrane (s).
  • the reactor consists of at least one reaction chamber and at least one supply chamber
  • the reaction chamber is partially or completely filled with a gel matrix.
  • the reactor can be thermostatted (e.g. incubator).
  • the reactor can be stirred or shaken if necessary.
  • the CFCF reactor consists of at least one chamber with an inlet opening and at least one porous surface.
  • This chamber is the reaction chamber and is partially or completely filled with matrix.
  • Supply solution can be pumped into the reaction chamber via the opening.
  • the used supply solution is pressed out of the reaction chamber via an ultrafiltration membrane.
  • the reactor can be thermostatted (e.g. incubator).
  • reaction solution can be agitated by stirring, shaking or pumping.
  • the present invention furthermore relates to a process for the production of products in the reactor according to the invention, the starting materials being low and high molecular weight starting materials, characterized in that
  • the low-molecular components of the reaction mixture, in particular the substrates consumed by the reaction, are distributed largely homogeneously in the entire reactor space V R ,
  • the process according to the invention is preferably an enzymatic process, one or more substrates being used to convert one or more substrates to one or more products.
  • the reactor can be used in particular for processes for coupled in vitro transcription / translation reactions for the production of proteins.
  • the high molecular weight components are ribosomes, tRNA's, DNA matrix, RNA polymerase, mRNA and enzymes of the intermediate metabolism (eg aminoacyl tRNA synthetases, transformylase, pyrophosphatase, nucleotide kinases) and the energy regenerating system (eg acetate kinase, pyruvate kinase, glycine kinase, creatine kinase) Enzymes, enzymes of the citrate cycle) and regulatory proteins (eg initiation factors, elongation factors, termination factors) and factors that support protein folding and carry out protein modifications.
  • enzymes of the intermediate metabolism eg aminoacyl tRNA synthetases, transformylase, pyrophosphatase, nucleotide kinases
  • the energy regenerating system eg acetate kinase, pyruvate kinase, glycine kinase, creatine
  • the low-molecular components include substrates (the 20 naturally occurring amino acids, ATP, GTP, CTP, UTP, a secondary energy substrate, such as acetylphosphate) and effectors (buffer substance, salts, reducing compounds, foic acid, inhibitors, stabilizers) defines that they are smaller than the exclusion limit of the matrix. Accordingly, high molecular weight compounds are larger than the exclusion limit.
  • substrates the 20 naturally occurring amino acids, ATP, GTP, CTP, UTP
  • a secondary energy substrate such as acetylphosphate
  • effectors buffer substance, salts, reducing compounds, foic acid, inhibitors, stabilizers
  • reaction solution with the product is removed from the column
  • methods of the invention also include improvements in batch and continuous feed methods.
  • CECF and CFCF processes The presence of gel matrix in the reaction space leads overall to a lower dilution of the high molecular weight reactants, which leads to increased productivity in relation to the use of lysate.
  • the gel matrix equilibrated with the supply solution is installed in the reaction chamber of a CECF or CFCF reactor,
  • the supply chamber is filled with supply solution
  • the supply solution is continuously pumped into the reaction chamber
  • the present invention also includes formulations for carrying out a coupled in vitro transcription / translation reaction for the production of proteins.
  • These formulations are particularly suitable for the production of proteins in the matrix reactor according to the invention. All of the components required for the coupled in vitro transcript / translation reaction for the production of proteins are divided into two solutions, supply solution and reaction solution.
  • the supply solution contains only low-molecular components such as buffers, salts, substrates and effectors. Suitable buffers and salts are, for example, Hepes or Tris, potassium ions, magnesium ions, ammonium ions.
  • the required substrates are the 20 naturally occurring amino acids, the four ribonucleotides ATP, GTP, CTP, UTP and, respectively, corresponding metabolic precursors, e.g.
  • AMP phosphoenolpyruvate
  • creatine phosphate or acetyl phosphate or a corresponding one metabohic precursor of such substances.
  • Effectors are substances that influence the reaction in a positive sense or suppress negative influences.
  • reducing compounds include one or more reducing compounds, in particular compounds containing thiol groups, such as, for example, dithiothreitol, dithioerythrol, glutathione, mercaptoethanesulfonic acid, furthermore protein-stabilizing compounds, such as glycerol, sugar, diethylene glycol, polyethylene glycol, detergents, co-factors, and further activators such as co-enzymes and co-substrates of the intermediate metabolism such as foalic acid, NAD / NADH, NADP / NADPH or their precursors, further inhibitors for suppressing undesirable side reactions such as rifampicin, RNase inhibitors, protease inhibitors, azide.
  • thiol groups such as, for example, dithiothreitol, dithioerythrol, glutathione, mercaptoethanesulfonic acid
  • protein-stabilizing compounds such as glycerol, sugar, diethylene glycol, polyethylene glycol, detergents,
  • the reaction solution contains the required high molecular weight components and can also contain some or all of the low molecular weight components of the supply solution.
  • the basis of the reaction solution and source of many of the high molecular components is a cell lysate.
  • This lysate can be obtained from prokaryotic (e.g. E. coli) or from eukaryotic cells (e.g. yeast, reticulocytes, wheat embryos).
  • lysates are generally obtained by cell disruption and separation of the particulate fraction (e.g. by centrifugation). These processes are well known to the person skilled in the art from the literature. Lysates obtained in this way can be introduced directly into the reaction solution or initially further processed and / or fractionated (e.g. by dialysis, precipitates, differential centrifugation, chromatographic methods, concentration steps) and introduced in the form of several suitable fractions.
  • High molecular components that are introduced by the lysate are ribosomes, transfer RNAs, regulatory proteins and enzymes.
  • regulatory proteins initiation factors, elongation factors and termination factors of translation should be mentioned in particular.
  • Aminoacyl-tRNA synthetases that can be mentioned as enzyme components are Enzyme systems for energy supply and conversion (e.g. acetate kinase, pyruvate kinase, cretin kinase, nucleoside diphosphate kinases, nucleoside monophosphate kinases, enzymes of glycolysis and citric acid cycle) and enzymes of the intermediate metabolism such as pyrophosphatase, transformylase, transamine.
  • Enzyme systems for energy supply and conversion e.g. acetate kinase, pyruvate kinase, cretin kinase, nucleoside diphosphate kinases, nucleoside monophosphate kinases, enzymes of glyco
  • RNAs DNA-attaching RNA polymerase
  • a viral polymerase such as e.g. T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase.
  • enzymes for the regeneration of the energy components and enzymes of the intermediate metabolism which are not or only insufficiently contained in the lysate (such as e.g. creatine kinase, pyruvate kinase, pyrophosphatase).
  • high molecular inhibitors such as RNasin.
  • enzyme systems that are required for the efficient and correct folding of proteins (e.g.
  • chaperones protein disulfide isomerase, peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase). Furthermore, enzymes that are required for post-transcriptional changes to the protein. Furthermore, macromolecular components that stabilize proteins or keep them in solution.
  • a circular (e.g. plasmid) or linear nucleic acid (e.g. PCR product) is added to the reaction solution as a template for the protein to be transcribed and translated.
  • the code for the protein e.g. a cDNA sequence
  • additional regulatory sequences that are required for system-compatible transcription and translation are located on this template. These include e.g. Promoter sequence, ribosome binding site, start codon, stop codon, polymerase termination sequence, translation enhancer.
  • the template can also contain areas which are required for cloning, duplication or for mRNA stabilization.
  • the supply solution has the following composition: 150-300 mM potassium acetate, 4-20 mM magnesium acetate, 1-10% glycerol, 0.5-2.5 mM ATP, 0.5-2.5 mM CTP, 0.5-2.5 mM GTP, 0.5-2.5 mM UTP, 0.1-2 mM per amino acid (all 20 naturally occurring amino acids), 10.8 ⁇ g / ml folic acid, 0.5- 5 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7.6 / 30 ° C, 1 ⁇ g / ml rifampicin, 0.03% sodium azide, 10-100 mM acetyl phosphate, 1-10 mM dithiothreitol, 1-10 mM mercaptoethanesulfonic acid, 70 mM KOH.
  • the reaction solution has the following composition: 150-300 mM potassium acetate, 4-20 mM magnesium acetate, 1-10% glycerol, 0.5-2.5 mM ATP, 0.5-2.5 mM CTP, 0.5-2.5 mM GTP, 0.5-2.5 mM UTP, 0.1-2 mM per amino acid (all 20 naturally occurring amino acids), 10.8 ⁇ g / ml folic acid, 0.5- 5 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7.6 / 30 ° C, 1 ⁇ g / ml rifampicin, 0.03% sodium azide, 10-100 mM acetyl phosphate, 480 ⁇ g / ml tRNA from E.coli MRE600, 1 -10 mM dithiothreitol, 1-10 mM mercaptoethanesulfonic acid, 70 mM KOH, 0.1 U / ⁇ l RNase inhibitor
  • the present invention thus also relates to the use of the reactors according to the invention for enzymatic reactions, in particular for coupled in vitro transcription / translation reactions for the production of proteins.
  • V R reactor volume
  • V M matrix volume
  • V 0 exit volume
  • the reactor and the method according to the invention are tested on the basis of cell-free protein synthesis using the example of green fluorescent protein (GFP) and chloramphenicol acetyltransferase (CAT).
  • Cell-free protein synthesis is carried out in the form of a coupled transcription / translation reaction.
  • the GFP cDNA or CAT cDNA is encoded on an expression plasmid and is under the control of a T7 phage promoter. Accordingly, the transcription into mRNA takes place by means of the DNA-dependent T7-RNA polymerase.
  • the mRNA thus transcribed in vitro is translated into protein using the E. coli lysate in the coupled system.
  • Piasmide pIVEX 2.1 -GFP contain the sequence for the green fluorescent protein from Aequoria victori in the form of a mutant GFPcycle3 (27 kDa) (Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319); the coding region of the GFPcycle3 mutant was replaced in pTU58 Wild-type GFP sequence cloned (Science (1994) 263, 802) (see Fig. 7 / SEQ. ID. NO .: 1).
  • pIVEX 1.1-CAT contains the gene of chloramphenicol acetyltransferase from E. coli (see Fig. 8 / SEQ. ID. NO .: 2).
  • E. coli S30 lysate The lysate was prepared with an E. coli A19 strain by a modified method according to Zubay (Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267).
  • Modified lysate buffer 100 mM HEPES-KOH pH 7.6 / 30 ° C, 14 mM magnesium acetate, 60 mM potassium acetate, 0.5 mM dithiothreitol. Differences in the yield in different experiments are due to different lysate preparations.
  • 3rd reaction solution 185 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 4% glycerol, 2.06 mM ATP, 1.02 mM CTP, 1.64 mM GTP, 1.02 mM UTP, 257 ⁇ M per amino acid (all 20 naturally occurring amino acids), 10.8 ⁇ g / ml folic acid, 1.03 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7.6 / 30 ° C, 1 ⁇ g / ml rifampicin, 0.03% sodium azide, 40 mM Acetyl phosphate, 480 ⁇ g / ml tRNA from E.coli MRE600, 2 mM dithiothreitol, 10 mM mercaptoethanesulfonic acid, 70 mM KOH, 0.1 U / ⁇ l RNase inhibitor, 15 ⁇ g / ml plasmid, 220 ⁇ l / ml E
  • the gel materials e.g. Sephadex G25 fine
  • Empty columns were packed according to the usual procedures for chromatography columns.
  • the packed chromatography columns were equilibrated with 1-2 column volumes of supply solution.
  • the gel matrix was equilibrated by repeated suspension in a supply solution and sucked dry with a slight negative pressure. The matrix treated in this way was added to the batch mixture or built into the CECF reactor.
  • the CECF reactors used consist of 2 chambers, the reaction chamber with a volume of 1 ml and the supply chamber with a volume of approx. 10 ml.
  • the chambers are separated from each other by a 10 kDa dialysis membrane and can be fed through closable openings.
  • Each chamber contains a magnetic core.
  • Ready-to-use PDIO columns (Pharmacia) or thermostattable, commercially available chromatography columns (Pharmacia) packed with gel matrix are used as matrix column reactors. All reactor types were operated at 30 ° C. Batch batches were shaken, CECF reactions were stirred, matrix column reactors were loaded and eluted using pumps.
  • GFP requires the presence of sufficient amounts of oxygen to form the fluorophore.
  • the amount of oxygen dissolved in the reaction solution is small and is not sufficient for a complete conversion. Therefore, all samples were "matured" between 12 and 32 hours at 4 ° C.
  • the samples were measured with a spectral fluorimeter from Kontron, type Tegimenta SFM-25. The excitation was at a wavelength of 395 nm, the emission was determined at a wavelength of 510 nm.
  • Recombinant GFP from Röche Diagnostics, catalog number 1814 524 was used as standard. The calibration was carried out with standard solutions with a concentration of 1 ⁇ g / ml and 2 ⁇ g / ml.
  • the samples were diluted 1:50 to 1: 400 with 100 mM HEPES-KOH pH 7.6 / 30 ° C., 14 mM magnesium acetate, 60 mM potassium acetate, 0.5 mM dithiothreitol, depending on the content.
  • the CAT chloramphenicol acetyltransferase was determined enzymatically using the CAT FAST Green fluorescent substrate (Molecular Probes) according to the manufacturer's instructions.
  • the composition of the batch reaction batch is described above (identical to the reaction solution).
  • the template plasmid is finally added to the batch to start the reaction. 1 ml each of the reaction solution was placed in a closable reaction vessel. 2 g of equilibrated gel matrix (Sephadex G25, fine) were added to one of the batches. The batches were closed and incubated under rubble at 30 ° C. for four hours. The yield of GFP was determined according to the standard protocol (see above).
  • 0.5 ml of equilibrated gel matrix (Sephadex G-10) was installed in the reaction chamber of a CECF reactor (1 ml reaction chamber, 10 ml supply chamber). 0.5 ml of a reaction solution modified in the composition was introduced into the reaction chamber.
  • the concentration of the high molecular weight components of the reaction solution was 2-fold (960 ⁇ g / ml tRNA from E.coli MRE600, 0.2 U / ⁇ l RNase inhibitor, 30 ⁇ g / ml plasmid, 440 ⁇ l / ml E.coli A19 lysate, 4 U / ⁇ l T7-RNA polymerase), the concentration of the low-molecular components was 1-fold (ie as in the supply solution).
  • reaction solution After 1 ml of reaction solution had been applied (15 ⁇ g GFP plasmid / ml), the column was closed and incubated at 30 ° C. for 6 hours. At the end of the reaction time, the reaction solution was removed from the CECF reactor or the reaction solution was eluted from the PD-10 column. The yield of GFP synthesized was determined according to the standard protocol (see above).
  • the eluate was fractionated at 4 ° C.
  • a CECF reaction (1 ml dimension) and a batch reaction (0.1 ml dimension) were carried out using the same reaction mixture.
  • the yield of GFP synthesized in the fractions and the control batches was determined according to the standard protocol (see above).
  • the yield could be increased by up to 250% by adding an equilibrated matrix.
  • Different gel materials which differ in terms of the type of polymer, particle size and exclusion molecular weight, can be used in the matrix reactor.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Matrix-Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind, wobei der Reaktorraum VR eine Matrix enthält und sowohl Reaktionskompartiment als auch Versorgungskompartiment umfasst, die Matrix aus einem porösen Material besteht, welches niedermolekulare Reaktionsteilnehmer aufnehmen kann, und als Reaktionskompartiment das Ausschlussvolumen VO der Matrix und als Versorgungskompartiment das Matrixvolumen VM zur Verfügung stehen. Der Matrix-Reaktor kann für enzymatische Verfahren verwendet werden, insbesondere für die gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen.

Description

Matrix- Reaktor und Verfahren zur Herstellung von Produkten in diesem Reaktor
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Matrix- Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind, wobei der Reaktorraum VR eine Matπx enthalt und sowohl Reaktionskompartiment als auch Versorgungskompartiment umfaßt, wobei die Matrix aus einem porösen Mateπal besteht, welches niedermolekulare Reaktionsteilnehmer aufnehmen kann und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer ausschließt und wobei als Reaktionskompartiment das Ausschlußvolumen V0 der Matrix zur Verfugung steht und als Versorgungskompartiment das Matrixvolumen V der Matπx zur Verfugung steht. Der Matrix-Reaktor kann für Svntheseverfahren mit Beteiligung hochmolekularer Katalysatoren verwendet werden (z.B en/vmkatalvsierte Reaktionen), insbesondere zur gekoppelten in vitro Transkπptιon-/Translatιonsreaktιon zur Herstellung von Proteinen.
Exemplarisch für eine Reaktion an der niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind, ist die in vitro Transkπptιons-/Translatιonsreaktιon zur Herstellung von Proteinen anzuführen. Reaktorpnn/ipien, die nach dem Batch-Verfahren oder einem Verfahren mit kontinuierlicher Versorgung arbeiten und insbesondere geeignet sind zur gekoppelten in vitro Transkπptιons-/Translatιonsreaktιon /ur Herstellung von Proteinen, sind dem Fachmann bereits bekannt (Baranov & Spinn ( 1993 ) Meth Enzym. 217, 123- 142). Bei der Durchfuhrung von Verfahren zur gekoppelten π; vitro I ranskπptιon-/Translatιonsreatιon zur Herstellung von Proteinen wird in einem Ansät/ ausgehend von einer DNA-Matrize mittels einer DNA-abhangigen RNA-Polymerase die entsprechende mRNA synthetisiert, die dann durch die πbosomale Maschinerie in Protein translatiert wird. Die Zusammensetzung der Reaktionslosung ist sehr komplex. Sie enthalt niedermolekulare Komponenten (Substrate, Puffer, Salze; Aktivatoren, Inhibitoren, Stabilisatoren ) und hochmolekulare Komponenten (DNA-Matrize, RNA-Polymerase, Ribosomen, tRNAMs, Enzyme, regulatorische Proteine). Ein Teil der Komponenten wird in gereinigter Form zugegeben Ein Teil, wichtige Komponenten der Translation (Ribosomen, Enzyme, regulatorische Proteine), wird derzeit über Zeil- Extrakte, z.B. E.coh S30-Lysat, Reticulo- cytenlvsat oder Weizenkeimlvsat in das System eingebracht. Die Ausbeuten einer gekoppelten Transkπptιon-/Translatιonsreaktιon liegen in der Größenordnung von 1 mg/ml. Voraussetzung hierfür ist eine kontinuierliche Zufuhrung von Substraten und Energiekomponenten und die gleichzeitige Abtrennung oder Verdünnung der Reaktionsendprodukte. Hierdurch laßt sich die Reaktion über viele Stunden aufrecht erhalten. Eine derartige Versuchsanordnung ist in den Prinzipien der "continuous exchange cell-free" (CECF), bzw der "continuous flow cell-free" (CFCF) Proteinsynthese realisiert (US 5,478,730; EPA 0 593 757; EPA 0 312 612; Baranov & Spi- rin (1993) Meth. Enzym. 217, 123-142). CECF-Reaktoren bestehen aus mindestens zwei diskreten Kammern, welche durch poröse Membranen gegeneinander abgetrennt sind. Durch diese poröse Grenzflache werden die hochmolekularen Komponenten in der Reaktionskammer zurückgehalten, wahrend niedermolekulare Komponenten zwischen Reaktionskammer und Versorgungskammer ausgetauscht werden . Bei CFCF-Verfahren wird eine Versorgungslosung direkt in die Reaktionskammer gepumpt und die Reaktionsendprodukte werden durch eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen aus dem Reaktionskompartiment gepresst.
Alle diese Reaktoren und die dann ablaufenden Reaktionen haben jedoch generell Nachteile:
• Die Rektoren bestehen aus Membranoberflachen und mehreren Kammern und sind daher aufwendig in der Herstellung.
• Bei Veränderung der Ansatzdimension (z.B. vom Labor- in den Produktionsmaßstab) müssen neue Reaktoren konstruiert, gebaut und optimiert werden.
• Die Versorgung mit Substraten bzw. die Abreicherung der Endprodukte erfolgt über Membranen. Diese zur Verfugung stehende Austauschflache ist aus konstruktionstechnischen Gründen limitiert, da nicht beliebig große Flachen/Volumen-Verhaltnisse realisiert werden können.
• Die Membranen können leicht verstopfen, was die Versorgung der Reaktion beeinträchtigt.
• Reaktionslosung und Versorgungslosung müssen standig gemischt werden (z.B. durch Ruhren oder Umpumpen), um Gradienten und Unterversorgung entgegenzuwirken.
Des weiteren ergibt sich bei den Reaktoren des Standes der Technik das Problem, daß bei gekoppelter in vitro Transkriptιon-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen die verwendeten Lysate verglichen mit dem Zustand im E.coli Cytosol stark verdünnt sind. Die Ursachen hierfür sind 1. die Aufschluß- und Praparationsverfahren zur Gewinnung der Lysate und 2. die Verdünnung, die mit der Zugabe aller notwendigen Komponenten einhergeht. Hieraus resultiert eine verminderte Produktivität, da sich die Gleichgewichte der makromolekularen Komplexe auf die Seite der Dissoziation verschieben (Massenwirkungsgesetz). Um diesem negativen Effekt entgegenzuwirken wurden im Stand der Technik bereits mehrere Wege aufgezeigt, mit dem Ziel die Wirkkonzentration von Lysaten zu erhohen. Ein Weg ist, dem Reaktionsansatz hochmolekulares PEG (Polyethylenglycol) zuzusetzen, das die Bindung von Wasser bewirkt, so daß die Wechselwirkung der verbleibenden Makromoleküle begünstigt wird (US 5,593,856). Diese Methode hat den Nachteil, daß Reaktionskomponenten und das akkumulierende Produkt aggregieren und prazipitieren können Ein weiterer Weg, um Lysate zu konzentrieren, ist die Anwendung des Prinzips der Umkehrosmose. Hier wird dem Lysat durch Einwirkung einer konzentrierten hochmolekularen Losung von z.B. Polyethylenglycol über eine semi- permeable Oberflache (z B Dialyseschlauch) Wasser entzogen (Kigawa T. (1999) FEBS Lett. 442, 15-19). Diese Methode hat ledoch den Nachteil, daß sie zu aufwendig ist. Letzteres gilt auch für die Ultrafiltrationsmehtode (US 5,593,856), bei der das Lysat vor der Verwendung mittels Ultrafiltration konzentriert wird Auch hier ist ein extra Schritt bei der Herstellung des Lysates erforderlich
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Reaktors, der zur gekoppelten in ntro Transkπptιon-/Translatιonsreaktιon zur Herstellung von Proteinen geeignet ist und der die Nachteile der Reaktoren des Standes der Technik überwindet. Des weiteren sollen Verfahren bereit gestellt werden, die geeignet sind für die in vitro Transkπptιon-/Translatιonsreaktιon zur Herstellung von Proteinen und die nicht mit den Nachteilen des Standes der Technik behaftet sind. Weiterhin soll das erfindungsgemaße Verfahren einer Verdünnung der makromolekularen Komponenten entgegenwirken Insbesondere soll ein Reaktor und ein Verfahren bereitgestellt werden, das die in vitro Transkription /Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen in großem Maßstab ermöglicht
Gegenstand der Erfindung ist ein Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind und der Reaktorraum eine Matrix enthalt und sowohl Reaktionskompartiment als auch Versorgungskompartiment umfaßt, wobei
• die Matrix aus einem porösen Mateπal besteht, in welchem niedermolekulare Reaktionsteilnehmer weitgehend frei diffundieren können,
• die hochmolekularen Reaktionsteilnehmer nicht in die Matrix eindringen können,
• die niedermolekularen Reaktionsteilnehmer sich im gesamten Reaktorraum VR verteilen,
• das Matrixvolumen VM als Versorgungskompartiment zur Verfugung steht und
• das Ausschlußvolumen V0 der Matrix als Reaktionskompartiment zur Verfugung steht Bei dem erfindungsgemaßen Reaktor kann durch die Matrixstruktur des Reaktorraumes das Reaktionskompartiment und Versorgungskompartiment in einem Reaktorraum vorliegen. Diese Variante ist bevorzugt. Vorstellbar wäre jedoch auch, daß Reaktionskompartiment und Versorgungskompartiment in einem Reaktionsraum vorliegen und das ein zusatzliches Versorgungsreservoir existiert, welches direkt oder über eine semipermeable Membran mit dem Reaktorraum verbunden ist.
Als Matrix kommen poröse Materialien zur Anwendung, die anorganische Materialien, wie z.B. Aluminiumoxyd, und/oder organische Materialien, wie z.B. Gele, sein können. Die Matrix muß in wäßriger Losung benetzbar oder quellbar sein und Molekularsiebeigenschaften besitzen. Als wäßrige Losung werden erfindungsgemaß auch Losungen bezeichnet, die nur 50% Vol Wasser enthalten. Die Matrix besteht in einer bevorzugten Ausfuhrungsform aus Polymeren, vernetzten Polymeren (z.B. Dextran), Co-Polymeren (z.B. Polyacrylamid) oder anorganischen "Gelen". Insbesondere ist eine Matrix mit bevorzugt, die aus Partikeln besteht, mit einer Partikelgrόße im Bereich von 0,1 bis 1000 μm. Bevorzugt sind Matrizes, die bezogen auf die Gebrauchsform (d.h. hy- dratisiert) eine geringe spezifische Materialdichte aufweisen. Die spezifische Materialdichte ist in der Regel kleiner 0,5 g/ml, bevorzugt aber kleiner 0,3 g/ml. Die Oberflache der Matrixpartikel (berechnet als Kugeloberflache) liegt bevorzugt im Bereich von 0,004 bis 40 m2/ml Bettvolumen. Des weiteren ist die Matπx durch eine Ausschlußgrenze (Ausschlußmolekulargewicht) für Makromoleküle definiert. Die Ausschlußgrenze kann im Bereich von 0,5 bis 300 kDa liegen. Bevorzugt ist eine Ausschlußgren/e zwischen 2 und 300 kDa, besonders bevorzugt eine Ausschlußgrenze zwischen 10 und 100 kDA. Entsprechende Materialien sind kommerziell erhaltlich (z.B Sephadex" , Pharmacia; Bio-Gel*', BIO-RAD). Es kann ein Material mit einheitlichen oder unterschiedlichen Partikelgroßen eingesetzt werden. Es können auch Gemische verschiedener Materialien eingesetzt werden. Die Matrix selbst besteht aus einem inerten Material, das selbst nicht - auch nicht als Katalysator - an der Reaktion teilnimmt. An diese inerte Matrix können jedoch bei Bedarf Substanzen gebunden werden, z.B. Enzyme.
Mit diesem porösen Matπx-Mateπal wird der Reaktorraum vollständig oder teilweise gefüllt. Um den erfindungsgemaßen Effekt zu erzielen, ist eine Mindestfullung des Reaktors mit der Matrix notwendig. Unterhalb von 20 Vol % (Bettvolumen) ist der erfindunsgemaße Effekt nicht mehr zu erwarten. Naturlich soll in Einzelfallen nicht ausgeschlossen sein, daß die Matrixfullung beispielsweise 19,9% Vol betragt. Somit ist der erfindungsgemaße Reaktor bevorzugt zu mindestens ca. 20 Vol % und besonders bevorzugt zu mindestens ca. 30 Vol % mit dem porösen Matrix- Material gefüllt. Besonders bevorzugt ist die Variante, daß der Reaktor vollständig mit porösem Matrix-Material gefüllt ist. Als außerordentlich bevorzugt gilt auch ein Bereich von 80-100% Vol.
Die Matrix teilt das Reaktorvolumen in mindestens zwei Kompartimente. Einen Raum, der nur von niedermolekularen Komponenten eingenommen werden kann und einen Raum, in dem sich sowohl niedermolekulare als auch alle hochmolekularen Komponenten aufhalten. Die resultierenden Endkonzentrationen für die eingesetzten Reaktionsteilnehmer ergeben sich in erster Näherung aus der Größe der Verteilungsraume, die sie erreichen können.
Das gesamte Reaktorvolumen VR wird von den Komponenten eingenommen, deren Molekulargewicht wesentlich unterhalb der Ausschlußgrenze der Matrix liegt. Dies gilt für Substrate, Puffersubstanzen, Salze und niedermolekulare Inhibitoren, Aktivatoren bzw. Stabilisatoren. Dies gilt insbesondere auch für niedermolekulare Reaktionsendprodukte, die potentiell zur Hemmung der Reaktion fuhren können (z.B. Produkthemmung) oder deren Anreicherung die allgemeinen Reaktionsbedingungen verandern (z.B. pH-Wert) und dadurch die Reaktion verlangsamen.
Die hochmolekularen Komponenten können nicht in die Matrix eindringen. Ihnen steht als Verteilungsraum nur das Volumen zwischen den Partikeln der Matrix, das Ausschluß volumen V0, zur Verfugung. Dieser Raum berechnet sich aus dem gesamten Reaktorvolumen abzüglich des Matrixvolumens (V0 = VR - V ) und ist mit dem Reaktionskompartiment gleichzusetzen. Reak- tions- und Versorgungskompartiment stehen über kurze Dif usionsstrecken und über eine extrem große Austauschflache miteinander in Verbindung. Das Volumenverhaltnis von Reaktionskompartiment V0 zu Versorgungskompartiment VM hangt von der Natur, der Größe und der strukturellen Beschaffenheit der Matrix und von der eingebrachten Matrixmenge ab. Das Verhältnis VR/V kann in einem weiten Bereich variiert werden.
Durch Mischen von Gelmaterialien mit unterschiedlichen Ausschlußgrenzen (z.B. 10 kDa und 200 kDa) kann das Reaktionsvolumen für einen bestimmten Teil der Makromoleküle erhöht werden . So wurde bei diesem Beispiel das Volumen für Ribosomen, DNA-Matrize und mRNA klein gehalten werden (Molekulargewicht > 200 kDa), wogegen die Beladung der tRNA's durch Aminoacyl-tRNA-Synthasen (Molekulargewicht < 100 kDa) in einem erweiterten Reaktionsraum stattfinden. Hierdurch konnten Bedingungen für Teilreaktionen optimiert werden.
Die Struktur der porösen Matrix erlaubt auch eine spezifische Modifikation von Oberfläche bzw. Lumen. Enzymatische Funktionen wie z.B. modifizierende Enzyme (Restriktionsproteasen) oder ein energieregenerierendes Enzymsystem können immobilisiert auf gesonderte Partikel in einem bestimmten Verhältnis in das System eingebracht werden. Über chemische Modifikation des Lumens konnten inhibitorisch wirkende Substanzen spezifisch adsorbiert werden.
Das Bauprinzip des Matrix-Reaktors erlaubt einfache Hochdimensionierung vom Labor- bis in den Produktionsmaßstab. Als Reaktoren können im einfachsten Fall handelsübliche Chromatographiesaulen eingesetzt werden, die in Großen zwischen 10 ml und 1000 Litern erhaltlich sind. Einmal optimierte Prozesse lassen sich einfach, schnell und kostengünstig in höhere Dimensionen überfuhren. Der Aufwand bei Planung, Bau und Erprobung von Reaktoren und Produktionsanlagen reduziert sich erheblich. Das Reaktormaterial kann variieren von Edelstahl über Plastik bis Glas. Es sind jedoch auch andere Materialien verwendbar.
Der erfindungsgemaße Reaktor unterscheidet sich gegenüber den bisher verfügbaren Reaktoren
durch eine sehr große Austauschflache zwischen Versorgungskompartiment VM und Reaktionskompartiment V0 und weitgehend freie Diffusion der Substrate zwischen den beiden Kompartimenten, durch extrem kurze Diffusionswege zwischen Versorgungskompartiment VM und Reaktionskompartiment Vo, was eine effiziente Versorgung der Reaktion gewahrleistet und das Problem der Gradientenbildung eleminiert. Die Notwendigkeit des Ruhrens oder Mischens entfallt. durch einfache Bauart und gunstige Herstellung. durch einfache Übertragbarkeit der im Kleinmaßstab optimierten Bedingungen auf große Dimensionen.
Die besonderen Möglichkeiten der in vitro Proteinsynthese wie die Herstellung toxischer Proteine oder der Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine können erstmals in großen Dimensionen und zu wirtschaftlichen Konditionen erschlossen werden.
Im folgenden sollen mögliche Ausfuhrungsformen des erfindungsgemaßen Reaktors beschrieben werden (siehe Figure 1) 1) Matrix-Saulen-Reaktor
Der Reaktor besteht aus einer Kammer/Saule, die ganz mit Matπx gefüllt ist (Gesamtvolumen = VR).
Das Versorgungskompartiment entspricht dem Matrixvolumen (VM). Das Reaktionskompartiment entspricht dem Ausschlußvolumen V0 der Matrix. Die Ausschlußgrenze der Matrix liegt im Bereich von 0,5-300 kDa, bevorzugt 2 bis 300 kDa. Der Reaktor besitzt eine Zuleitung (oben) und Ableitung (unten) für Losungen. Durch zuleiten von Losung entsteht ein gleichmaßiger Strom der Flussigkeitssaule in Richtung der Ableitung. Der Reaktor ist thermostatisierbar
Als besonderes bevorzugt ist somit ein Matrix-Reaktor, bei dem die Matrix eine Gel-Matrix ist. Insbesondere ist ein Matπx-Reaktor bevorzugt, bei dem der Reaktorraum die Form eines Zylinders aufweist. Eine bevorzugte Ausfuhrungsform ist somit ein Reaktor, bei dem der Reaktor eine mit einer Gel-Matrix gefüllte, thermostatisierbare Chromatographiesaule ist. Insbesondere ist bevorzugt, daß die Matrix eine Ausschlußgrenze im Bereich von 2-300 kDa hat.
Das erfindungsgemaße Reaktor-Prinzip laßt sich auch mit etablierten Reaktor-Typen (Batch-, CECF-, CFCF-) vorteilhaft kombinieren. Hierbei kann aufgrund von gesteigerter Produktivität eine Verbesserung der Ausbeute erzielt werden. Da zur Erreichung der optimalen Konzentration geringere Mengen an Einsat/stoffen benotigt werden (z.B. DNA-Template, T7-Polymerase, tRNA's) kann das erfindungsgemaße Prinzip auch zu einer Kostenreduktion beitragen.
2) Matrix-Batch-Reaktor
• Der Reaktor besteht aus einem verschließbaren Reaktionsgefaß.
• Der Reaktor hat ein ausreichendes Volumen zur Aufnahme der Reaktionslosung und einer variablen Menge Gel-Matrix.
• Der Reaktor ist termostatisierbar (z.B. im Wasserbad) 3) CECF-Reaktor mit Matrix
• Der Reaktor ist ein CECF-Reaktor bestehend aus mindetens zwei Kammern, die über eine oder mehrere semipermeable Membrane(n) miteinander in Verbindung stehen.
• Der Reaktor besteht aus mindestens einer Reaktionskammer und mindestens einer Versorgungskammer
• Die Reaktionskammer ist teilweise oder vollständig mit Gel-Matrix gefüllt.
• Der Reaktor ist termostatisierbar (z.B. Inkubator).
• Der Reaktor kann gegebenenfalls gerührt bzw. geschüttelt werden.
4) CFCF-Reaktor mit Matπx
• Der CFCF-Reaktor besteht aus mindetens einer Kammer mit einer Zuflußöffnung und mindestens einer porösen Oberflache.
• Diese Kammer ist die Reaktionskammer und ist teilweise oder vollständig mit Matrix gefüllt.
• In die Reaktionskammer kann über die Öffnung Versorgungslösung gepumpt werden. Die verbrauchte Versorgungslosung wird über eine Ultrafiltrationsmembran aus der Reaktionskammer gepreßt.
• Der Reaktor ist termostatisierbar (z.B. Inkubator).
• Die Reaktionslosung kann gegebenenfalls durch Rühren, Schütteln oder Umpumpen bewegt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung von Produkten in dem erfindungsgemaßen Reaktor, wobei die Ausgangsstoffe nieder- und hochmolekulare Edukte sind, dadurch gekennzeichnet, daß
• sich die niedermolekularen Komponenten des Reaktionsansatzes, insbesondere die durch die Reaktion konsumierten Substrate, weitgehend homogen im gesamten Reaktorraum VR verteilen,
• den hochmolekularen Komponenten, insbesondere den katalytisch wirkenden Reaktionsteilnehmern, nur das Ausschlußvolumen der Matrix V0 im Reaktorraum zur Verfügung steht und • eine Umsetzung der Substrate (Reaktion) nur im Ausschlußvolumen der Matrix V0 möglich ist
Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemaßen Verfahren um ein enzymatisches Verfahren wobei durch ein oder mehrere Enzyme ein oder mehrere Substrate zu einem oder mehreren Produkten umgesetzt wird Der Reaktor kann insbesondere genutzt werden für Verfahren zur gekoppelten in vitro Transkπptιon-/Translatιonsreaktιon zur Herstellung von Proteinen.
Die hochmolekularen Komponenten sind Ribosomen, tRNA's, DNA-Matrize, RNA-Polymerase, mRNA sowie Enzyme des Intermediarstoffwechsels (z.B. Aminoacyl-tRNA-synthetasen, Trans- formylase, Pyrophosphatase, Nukleotidkinasen) und des energieregeneπerenden Systems (z.B. Acetatkinase, Pyruvatkinase, Kreatinkinase, glycolytische Enzyme, Enzyme des Citrat-Cyclus) und regulatorische Proteine (z B Initationsfaktoren, Elongationsfaktoren, Terminationsfakto- ren) und Faktoren, welche die Proteinfaltung unterstutzen und Proteinmodifikationen ausfuhren.
Zu den niedermolekularen Komponenten gehören Substrate (die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, ATP, GTP, CTP, UTP, ein sekundäres Energiesubstrat, wie z.B. Acetylphosphat) sowie Effektoren (Puffersubstanz, Salze, reduzierende Verbindungen, Fohnsaure, Inhibitoren, Stabilisatoren) Niedermolekulare Verbindungen werden erfindungsgemaß so definiert, daß sie kleiner sind als die Ausschlußgrenze der Matrix. Dementsprechend sind hochmolekulare Verbindungen großer als die Ausschlußgrenze Besonders bevorzugt sind Saulenverfahren, welche dadurch gekennzeichnet sind,
• daß die Gelmatπx in den Reaktorraum eingebaut wird,
• daß die Gelmatrix mit Versorgungslosung aquilibπert und auf die Reaktionstemperatur ther- mostatisiert wird (wobei die Aquilibπerung der Gelmatrix vor oder nach dem Einbau erfolgen kann),
• daß die Reaktionslosung auf die Säule aufgetragen wird,
• daß die Reaktionslosung für die Dauer der Reaktion in der Säule ruht (statisches Verfahren), bzw. langsam durch die Säule gepumpt wird (dynamisches Verfahren) und
• daß nach Beendigung der Reaktion die Reaktionslosung mit dem Produkt von der Säule elu- Zu den erfindungsgemaßen Verfahren gehören auch Verbesserungen bei Batch-Verfahren und Verfahren mit kontinuierlicher Zuführung.
Batch-Verfahren: Durch Zugabe von mit Versorgungslosung aquilibrierter Gel-Matrix zu einem Batch-Ansatz laßt sich die Reaktionsdauer aufgrund verbesserter Substratverfügbarkeit erhohen. Für die hochmolekularen Reaktionsteilnehmer resultiert aus der Aufstockung mit Gelmatrix in erster Näherung keine Volumenzunahme, so dass die Reaktion durch Verdunnungseffekte nicht negativ beeinträchtigt wird. Insgesamt führt die Zugabe von Matrix zu einer gesteigerten Produktivität bezogen auf den Lysateinsatz.
CECF- und CFCF-Verfahren: Die Anwesenheit von Gelmatrix im Reaktionsraum führt insgesamt zu einer geringeren Verdünnung der hochmolekularen Reaktionsteilnehmer, was zu einer gesteigerten Produktivität bezogen auf den Lysateinsatz fuhrt. Hierbei wird
• die mit Versorgungslosung aquilibrierte Gelmatrix in die Reaktionskammer eines CECF- bzw. CFCF-Reaktors eingebaut,
• die Reaktionslosung mit den hochmolekularen Reaktionsteilnehmern in die Reaktionskammer eingefüllt und somit die Reaktion zur in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Protein gestartet,
• beim CECF-Verfahren die Versorgungskammer mit Versorgungslosung gefüllt,
• beim CFCF-Verfahren die Versorgungslosung kontinuierlich in die Reaktionskammer gepumpt,
• der Reaktionsansatz bei festgelegter Temperatur für die Dauer der Reaktion gerührt bzw. geschüttelt und
• die Reaktionslosung mit dem Produkt am Ende der Reaktion aus der Reaktionskammer entnommen.
Zur vorliegenden Erfindung gehören auch Formulierungen zur Durchfuhrung einer gekoppelten in vitro Transkripüon-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen. Diese Formulierungen sind insbesondere geeignet zur Herstellung von Proteinen im erfindungsgemaßen Matrix- Reaktor. Alle für die gekoppelte in vitro Transkriptιon-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen erforderlichen Komponenten werden auf zwei Losungen verteilt, Versorgungslosung und Reaktionslosung. Die Versorgungslosung enthalt ausschließlich niedermolekulare Komponenten, wie Puffer, Salze, Substrate und Effektoren. Geeignete Puffer und Salze sind z.B. Hepes oder Tris, Kahumionen, Magnesiumionen, Ammoniumionen. Die erforderlichen Substrate sind die 20 naturlich vorkommenden Aminosäuren, die vier Ribonukleotide ATP, GTP, CTP, UTP bzw., entsprechende metabohsche Vorstufen, z.B. AMP, GMP, CMP, UMP sowie ein sekundäres Energiesubstrat wie z.B. Phosphoenolpyruvat, Kreatinphosphat oder Acetylphosphat bzw. eine entsprechende metabohsche Vorstufe derartiger Substanzen. Effektoren sind Substanzen, welche die Reaktion in positivem Sinne beeinflussen bzw. negative Einflüsse zurückdrängen. Hierzu gehören eine oder mehrere reduzierende Verbindungen, insbesondere Thiolgruppen-enthaltende Verbindungen wie z.B. Dithiothreitol, Dithioerythrol, Glutathion, Mercaptoethansulfonsaure, des weiteren proteinstabilisierende Verbindungen wie z.B. Glycerin, Zucker, Diethylenglycol, Polyethylenglycol, Detergentien, Co-Faktoren, des weiteren Aktivatoren wie Co-Enzyme und Co- Substrate des Intermediarstoffwechsels wie z.B. Fohnsaure, NAD/NADH, NADP/NADPH oder deren Vorstufen, des weiteren Inhibitoren zur Unterdrückung unerwünschter Nebenreaktionen wie z.B. Rifampicin, Rnase-Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, Azid.
Die Reaktionslosung enthalt die erforderlichen hochmolekularen Komponenten und kann auch einen Teil oder alle niedermolekularen Komponenten der Versorgungslosung enthalten. Basis der Reaktionslosung und Quelle vieler der hochmolekularen Komponenten ist ein Zell-Lysat. Dieses Lysat kann aus prokaryontischen (z.B. E.coli) oder aus eukaryontischen Zellen (z.B. Hefe, Reticulozyten, Weizenembryos) gewonnen werden. Die Gewinnung derartiger Lysate erfolgt im allgemeinen durch Zellaufschluß und Abtrennung der partikularen Fraktion (z.B. durch Zen- tπfugation). Diese Verfahren sind dem Fachmann aus der Literatur hinlänglich bekannt. Derart gewonnene Lysate können direkt in die Reaktionslosung eingebracht werden oder zunächst weiter aufbereitet und/oder fraktioniert (z.B. durch Dialyse, Fallungen, differentielle Zentπfuga- tionen, chromatographische Verfahren, Konzentrierungsschritte) und in Form mehrerer geeigneter Fraktionen eingebracht werden.
Die gekoppelte in vitro Transkπptιon-/Translationsreaktιon zur Herstellung von Proteinen ist überaus komplex und erfordert eine große Zahl zellularer Komponenten. Man kann derzeit nicht davon ausgehen, daß die Gesamtheit aller dieser Komponenten bekannt ist, bzw. deren Funktionsweise schon voll verstanden ist.
Hochmolekulare Komponenten die durch das Lysat eingebracht werden sind Ribosomen, trans- fer RNA's, regulatorische Proteine und Enzyme. Unter den regulatorisch wirkenden Proteinen sind insbesondere Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren und Terminationsfaktoren der Translation zu nennen. Als Enzymkomponenten sind zu nennen die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Enzymsysteme der Energiebereitstellung und Konvertierung (z.B. Acetatkinase, Pyruvatkinase, Kretinkinase, Nukleosid-diphosphat-kinasen, Nukleosid-monophosphat-kinasen, Enzyme der Glycolyse und des Zitronensaurecyclus) und Enzyme des Intermediarstoffwechsels wie z.B. Pyro- phosphatase, Transformylase, Transaminasen. Darüber hinaus ist davon auszugehen, daß weitere Komponenten des Lysates für eine effiziente Transkription und Translation erforderlich sind.
Weitere hochmolekulare Substanzen werden der Reaktionslosung als einzelne Komponenten zugesetzt. Hierzu gehören transfer RNA's, DNA-anbhanginge RNA Polymerase, bevorzugt eine vi- rale Polymerase wie z.B. T7-RNA Polymerase, T3-RNA Polymerase, SP6 RNA Polymerase. Des weiteren Enzyme zur Regenerierung der Energiekomponenten und Enzyme des Intermediarstoffwechsels, die im Lysat nicht oder in nicht ausreichender Menge enthalten sind (wie z.B. Kreatm- kinase, Pyruvatkinase, Pyrophosphatase). Des weiteren hochmolekulare Inhibitoren (wie z.B. RNasin). Des weiteren Enzvmsysteme, die zur effizienten und richtigen Faltung von Proteinen erforderlich sind (z.B. Chaperone, Protein-disulfid-isomerase, Peptidyl-prolyl-cis-trans-iso- merase). Des weiteren Enzyme, die für post-transkriptionale Veränderungen am Protein erforderlich sind. Des weiteren makromolekulare Komponenten, die Proteine stabilisieren oder in Losung halten.
Als Matrize für das zu transkribierende und translatierende Protein wird der Reaktionslosung eine zirkuläre (z.B. Plasmid) oder lineare Nukleinsaure (z.B. PCR Produkt) zugesetzt. Auf dieser Matrize befindet sich der Code für das Protein (z.B. eine cDNA-Sequenz) und zusatzlich regulatorische Sequenzen, die für die systemgerechte Transkription und Translation erforderlich sind. Hierzu gehören z.B. Promotorsequenz, Ribosomenbindestelle, Startcodon, Stopcodon, Poly- merase-Terminationssequenz, Translationsenhancer. Des weiteren kann die Matrize auch Bereiche enthalten, die für das Klonieren, Vervielfältigen oder für eine mRNA-Stabilisierung erforderlich sind.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform hat die Versorgungslosung folgende Zusammensetzung: 150-300 mM Kahum-acetat, 4-20 mM Magnesium-acetat, 1-10% Glyzerin, 0,5-2,5 mM ATP, 0,5-2,5 mM CTP, 0,5-2,5 mM GTP, 0,5-2,5 mM UTP, 0,1-2 mM pro Aminosäure (alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 μg/ml Folinsaure, 0,5-5 mM EDTA, 100 mM HEPES- KOH pH 7,6/30°C, 1 μg/ml Rifampicin, 0,03 % Natrium-azid, 10-100 mM Acetylphosphat, 1-10 mM Dithiothreitol, 1-10 mM Mercaptoethansulfonsaure, 70 mM KOH. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform hat die Reaktionslosung folgende Zusammensetzung: 150-300 mM Kalium-acetat, 4-20 mM Magnesium-acetat, 1-10% Glyzerin, 0,5-2,5 mM ATP, 0,5-2,5 mM CTP, 0,5-2,5 mM GTP, 0,5-2,5 mM UTP, 0,1-2 mM pro Aminosäure (alle 20 naturlich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 μg/ml Folinsaure, 0,5-5 mM EDTA, 100 mM HEPES- KOH pH 7,6/30°C, 1 μg/ml Rifampicin, 0,03 % Natrium-azid, 10-100 mM Acetylphosphat, 480 μg/ml tRNA aus E.coli MRE600, 1-10 mM Dithiothreitol, 1-10 mM Mercaptoethansulfonsaure, 70 mM KOH, 0,1 U/μl Rnase-Inhibitor, 1-20 μg/ml Matrize, 100-500 μl/ml E.coli A19 Lysat, 1-10 U/μl T7-RNA Polymerase
Somit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfindungsgemaßen Reaktoren für enzymatische Reaktionen, insbesondere für gekoppelte in vitro Transkrip- tιon-/Translationsreaktιonen zur Herstellung von Proteinen.
Vorstellbar ist ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemaßen Reaktors für individuell ablaufende Reaktionen wie z.B. nur die Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen bzw. die in vitro Transkriptionsreaktion.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1:
Mögliche Ausführungsform des Matπx-Saulen-Reaktors sowie Beschreibung von VR (Reaktorvolumen), VM (Matrixvolumen) und V0 (Ausschlussvolumen).
Abbildung 2:
Synthese von GFP in einer Batch-Reaktion mit und ohne Zusatz von aquilibrierter Matrix
(Beispiel 1).
Abbildung 3:
Synthese von GFP in einem CECF-Reaktor und einem CECF-Reaktor mit Matrix in der Reaktionskammer. Beide Reaktionen wurden mit den gleichen Reagentien durchgeführt (Beispiel 2).
Abbildung 4:
Synthese von GFP in einem CECF-Reaktor und in einem Saulenreaktor vergleichbarer Dimension. Beide Reaktionen wurden mit den gleichen Reagentien durchgeführt (Beispiel 3). Abbildung 5:
Synthese von GFP in einem CECF-Reaktor und in Säulenreaktoren (statisches Verfahren). Die Saulenreaktoren wurden mit 1 ml und 3 ml Reaktionslosung beladen. Alle Reaktionen wurden mit den gleichen Reagentien durchgeführt (Beispiel 4).
Abbildung 6:
Synthese von GFP in einem 200 ml Saulenreaktoren (dynamisches Verfahren). Aufgetragen wurden 20 ml Reaktionslosung. Zur Kontrollen wurde mit den gleichen Reagentien eine 0,1 ml Batch-Reaktion und ein 1 ml CECF-Reaktion durchgeführt (Beispiel 5).
Abbildung 7:
Plasmid Karte und Sequenz (SEQ. ID. NO.: 1) des GFP Expressionsvektors pIVEX 2.1-GFP
Abbildung 8:
Plasmid Karte und Sequenz (SEQ. ID. NO.: 2) des CAT Expressionsvektors pIVEX 1.1-CAT
Beispiele
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Die aufgelistenten Reaktionskomponenten, Reaktoren, sowie die GFP-Bestimmung und CAT-Bestimmung gelten für alle aufgeführten Beispiele.
Der erfindungsgemaße Reaktor und das erfindungsgemaße Verfahren wird anhand der zellfreien Proteinsynthese am Beispiel des Green Fluorescent Proteins (GFP) und der Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) getestet. Die zellfreie Proteinsynthese wird in Form einer gekoppelten Transkription/Translationsreaktion durchgeführt. Die GFP-cDNA bzw. CAT-cDNA ist auf einem Expressionsplasmid kodiert und steht unter Kontrolle eines T7-Phagen-Promotors. Die Transkription in mRNA erfolgt dementsprechend mittels der DNA- abhangigen T7-RNA Polymerase. Die so in vitro transkribierte mRNA wird mit Hilfe des im gekoppelten System befindlichen E.coli Lysates in Protein translatiert.
A) Reaktionskomponenten
1. Piasmide: pIVEX 2.1 -GFP enthalten die Sequenz für das Green Fluorescent Protein aus Aequoria victori in Form einer Mutante GFPcycle3 (27 kDa) (Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319); die kodierende Region der GFPcycle3 Mutante wurde in pTU58 anstelle der Wild-Typ GFP-Sequenz kloniert (Science ( 1994) 263, 802) (siehe Abb. 7/SEQ. ID. NO.: 1). pIVEX 1.1-CAT enthalt das Gen der Chloramphenicol Acetyltransferase aus E.coli (siehe Abb. 8/SEQ. ID. NO.: 2).
2. E.coli S30 Lysat: Das Lysat wurde mit einem E.coli A19-Stamm nach einem modifizierten Verfahren nach Zubay (Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267) präpariert. Geänderter Lysatpuffer: 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 14 mM Magnesium-acetat, 60 mM Kalium-acetat, 0,5 mM Dithiothreitol. Unterschiede in der Ausbeute bei verschiedenen Experimenten sind auf unterschiedliche Lysatpraparationen zurückzuführen.
3. Reaktionslosung: 185 mM Kahum-acetat, 15 mM Magnesium-acetat, 4% Glyzerin, 2,06 mM ATP, 1,02 mM CTP, 1,64 mM GTP, 1,02 mM UTP, 257 μM pro Aminosäure (alle 20 naturlich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 μg/ml Folinsaure, 1,03 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 1 μg/ml Rifampicin, 0,03 % Natrium-azid, 40 mM Acetylphosphat, 480 μg/ml tRNA aus E.coli MRE600, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM Mercaptoethansul- fonsaure, 70 mM KOH, 0,1 U/μl Rnase-Inhibitor, 15 μg/ml Plasmid, 220 μl/ml E.coli A19 Lysat, 2 U/μl T7-RNA Polymerase.
4. Versorgungslosung: 185 mM Kalium-acetat, 15 mM Magnesium-acetat, 4% Glyzerin, 2,06 mM ATP, 1,02 mM CTP, 1,64 mM GTP, 1,02 mM UTP, 257 μM pro Aminosäure (alle 20 naturlich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 μg/ml Folinsaure, 1,03 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 1 μg/ml Rifampicin, 0,03 % Natrium-azid, 40 mM Acetylphosphat, 2 mM Dithiothreitol, 10 M Mercaptoethansulfonsaure, 70 mM KOH.
5. Aquilibrierte Matπx: Die Gel-Matπces, wie z.B. Sephadex G25 fine, wurden gemäß den Angaben des Herstellers gequollen gewaschen. Leersaulen wurden nach den bei Chromatographiesaulen üblichen Verfahren gepackt. Die gepackten Chromatographiesaulen wurden mit 1-2 Saulenvolumen Versorgungslosung aquilibriert. Für Batch- und CECF-Reaktionen wurde die Gel-Matrix durch mehrmaliges suspendieren in Versorgungslosung aquilibriert, mit leichtem Unterdruck trockengesaugt. Die so behandelte Matrix wurde dem Batch- Ansatz zugesetzt bzw. in den CECF-Reaktor eingebaut.
B) Reaktoren
Für Batch-Reaktionen wurden verschließbare Reaküonsgefaße aus Plastik verwendet. Die verwendeten CECF-Reaktoren bestehen aus 2 Kammern, der Reaktionskammer mit einem Volumen von 1ml und der Versorgungskammer mit einem Volumen von ca. 10 ml. Die Kammern sind durch eine 10 kDa Dialyse-Membran gegeneinander separiert und können jeweils durch verschließbare Öffnungen beschickt werden. Jede Kammer enthalt einen Magnet-Ruhrkern. Als Matrix-Saulen-Reaktoren werden PDIO-Fertigsaulen (Pharmacia) verwendet, bzw. thermostatisierbare, kommerziell erhaltliche Chromatographie-Saulen (Pharmacia), die mit Gel-Matrix gepackt wurden. Alle Reaktor-Typen wurden bei 30°C betrieben. Batch-Ansatze wurden geschüttelt, CECF-Reaktionen wurden gerührt, Matrix-Säulen-Reaktoren wurden unter Verwendung von Pumpen beladen und eluiert.
C) GFP-Bestimmung
GFP benotigt zur Ausbildung des Fluorophors die Anwesenheit von ausreichenden Mengen Sauerstoffs. Die in der Reaktionslosung geloste Menge an Sauerstoff ist gering und reicht für eine vollständige Konvertierung nicht aus. Daher wurden alle Proben vor der Messung zwischen 12 und 32 Stunden bei 4°C „gereift". Die Messung der Proben erfolgte mit einem Spektral-Fluori- meter der Fa. Kontron, Typ Tegimenta SFM-25. Die Anregung erfolgte bei einer Wellenlange von 395 nm, die Emission wurde bei einer Wellenlange von 510 nm bestimmt.
Als Standard wurde rekombinantes GFP von Röche Diagnostics, Katalognummer 1814 524 verwendet. Die Kalibrierung erfolgte mit Standardlösungen der Konzentration 1 μg/ml und 2 μg/ml.
Zur Messung wurden die Proben mit 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 14 mM Magnesium- acetat, 60 mM Kalium-acetat, 0,5 mM Dithiothreitol, je nach Gehalt 1:50 bis 1:400 verdünnt.
D) CAT-Bestimmung
Die CAT (Chloramphenicol Acetyltransferase) -Bestimmung erfolgte enzymatisch mit dem CAT FAST Green Fluoreszenzsubstrat (Molecular Probes) gemäß den Angaben des Herstellers.
E) Durchführung
Beispiel 1
Matrix-Batch-Reaktor versus Batch-Reaktor
Die Zusammensetzung des Batch-Reaktionsansatzes ist weiter oben beschrieben (identisch mit Reaktionslosung). Das Template-Plasmid wird zum Schluß zum Ansatz zugegeben, um die Reaktion zu starten. Je 1 ml der Reaktionslosung wurde in ein verschließbares Reaktionsgefaß gegeben. Zu einem der Ansätze wurden 2g aquilibrierter Gel-Matrix (Sephadex G25, fine) zugesetzt. Die Ansätze wurden verschlossen und unter Schuttein bei 30°C vier Stunden inkubiert. Die Ausbeute an GFP wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).
Reifung nicht erforderlich da ausreichende Sauerstoffversorgung
Ergebnis: Durch Zugabe von Gel-Matrix konnte die Ausbeute an fluoreszenz-aktivem GFP im Vergleich zur StandardBatch-Reaktion um 61 % gesteigert werden.
Beispiel 2
CECF-Reaktor mit Matrix versus CECF-Reaktor
In die Reaktionskammer eines CECF-Reaktors ( 1 ml Reaktionskammer, 10 ml Versorgungskammer) wurden 0,5 ml aquilibrierte Gelmatrix (Sephadex G-10) eingebaut. Es wurden 0,5 ml einer in der Zusammensetzung modifizierten Reaktionslösung in die Reaktionskammer eingefüllt. Dabei war die Konzentration der hochmolekularen Komponenten der Reaktionslösung 2fach (960 μg/ml tRNA aus E.coli MRE600, 0,2 U/μl Rnase-Inhibitor, 30 μg/ml Plasmid, 440 μl/ml E.coli A19 Lysat, 4 U/μl T7-RNA Polymerase), die Konzentration der niedermolekularen Komponenten war lfach (d.h. wie in der Versorgungslösung). In die Versorgungskammer wurden 10 ml Versorgungslösung eingefüllt. Die Vergleichsreaktion im CECF-Reaktor wurde nach Standardbedingungen durchgeführt. D.h. in die Reaktionskammer wurde 1 ml Reaktionslösung mit 15 μg GFP-Plasmid, in die Versorgungskammer ca. 10 ml Versorgungslösung gefüllt. Beide Reaktoren wurde unter Rühren ( 150 rpm) bei 30°C für 20 Stunden inkubiert. Jeweils am Ende der Reaktionszeit wurde der Inhalt der Reaktionskammern entnommen und die Ausbeuten an synthetisiertem GFP wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).
36 h Reifung bei 4°C
Ergebnis: Durch den Einbau der Matrix in die Reaktionskammer des CECF-Reaktors konnte eine Steigerung der Produktivität bezogen auf Fluoreszenz-aktives GFP um 56 % erzielt werden. Beispiel 3
Vergleich Matrix-Saulen-Reaktor ( 1/10-Dimensιon) versus CECF-Reaktor Die CECF-Reaktion wurde nach Standardbedingungen durchgeführt. D.h. in die Reaktionskammer wurde 1 ml Reaktionslosung mit 15 μg GFP-Plasmid, in die Versorgungskammer ca. 10 ml Versorgungslosung gefüllt. Der Reaktor wurde unter Ruhren (150 rpm) bei 30°C für 20 Stunden inkubiert. Als Matrix-Saulen-Reaktor wurde eine handelsübliche PD-10-Saule, gefüllt mit Sephadex G25 (Pharmacia), verwendet. Die Reaktorparameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: VR = 8,3 ml, V0 = 2,5 ml, VM = 5,6 ml. Die Säule wurde mit 10 ml Versorgungslosung aquilibriert. Nach Aufgabe von 1 ml Reaktionslosung (15 μg GFP-Plasmid/ml) wurde die Säule verschlossen und 6 Stunden bei 30°C inkubiert. Jeweils am Ende der Reaktionszeit wurde die Reaktionslosung aus dem CECF-Reaktor entnommen, bzw. die Reaktionslosung von der PD-10-Saule eluiert. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).
Ergebnis:
* 20 h GFP-Reifüng bei 4°C
Der Ansatz, der in der PD-10 Säule durchgeführt wurde ergab eine Ausbeut an Fluoreszenz-aktivem GFP von 362 μg. Im Vergleich zum CECF-Ansatz mit der gleichen Dimension (1 ml) ergibt sich eine Produktivität von 76 %.
Beispiel 4
Matrix-Saulen-Reaktor (3/10 Dimension, statisches Verfahren)
In zwei Chromatographiesaulen wurden 10 ml Sephadex G25, fine, gepackt und anschließend jeweils mit einem Saulenvolumen Versorgungslosung aquilibriert. Die Reaktor-Parameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: VR = 10 ml, V0 = 3 ml, VM = 7 ml. Auf Säule 1 wurde 1 ml Reaktionslosung, auf Säule 2wurden 3 ml Reaktionslosung aufgetragen. Anschließend wurden die Säulen verschlossen und 20 Stunden bei 30 °C inkubiert. Als Kontrollen wurde eine 1 ml Batch-Reaktion und eine 1 ml Reaktion im CECF Reaktor durchgeführt (ebenfalls über 20 Stunden bei 30 °C). Nach Ablauf der Reaktionszeit wurden die Säulen eluiert. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP im jeweiligen wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).
* 20 h Reifung bei 4°C.
Ergebnis: Die Reaktionsausbeuten der beiden Säulenreaktor-Laufe sind bezogen auf die eingesetzte Menge an Reaktionslosung vergleichbar mit den Ausbeuten des CECF Reaktors. Bei Säule 2, die mit der dreifachen Menge an Reaktionslosung beschickt wurde, konnte eine um den Faktor 2,2 gesteigerte Gesamtausbeute erzielt werden.
Beispiel 5
Synthese von GFP im Matrix-Saulen-Reaktor (20/200-Dimension, dynamisches Verfahren) In eine ummantelte Chromatographiesaule (Pharmacia) wurde Sephadex G25,fine, gepackt und anschließend mit einem Saulenvolumen Versorgungslosung aquilibriert. Die Reaktor- Parameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: VR = 200 ml, V0 = 60 ml, VM = 140 ml. Mittels eines Wasserbades wurde die Säule auf 30°C thermostatisiert. 20 ml Reaktionslosung, gestartet mit 15 μg/ml GFP-Plasmid, wurden auf die Säule gepumpt ( 120 ml/h). Danach wurde die Reaktionslosung mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/h durch die Matrix gepumpt. Das Eluat wurde bei 4°C fraktioniert. Als Kontrollen wurde mit dem gleichen Reaktionsansatz eine CECF-Reaktion ( 1 ml-Dimension) und eine Batch-Reaktion (0,1 ml Dimension) durchgeführt. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP in den Fraktionen und den Kontrollansatzen wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).
Ergebnis: In einer 20 ml Dimension konnten innerhalb von 10 Stunden im Matrix-Saulen- Reaktor 15,2 mg Fluoreszenz-aktives GFP produziert werden. Bezogen auf Ausbeute pro eingesetzter Reaktionslosung ergab sich ein Wert von 0,76 mg/ml. Die Ausbeute im CECF-Reaktor von 0,58 mg/ ml liegt im Rahmen dessen was routinemäßig in diesem Reaktor-Typ erzielt wird. Somit zeigt der Matrix-Saulen-Reaktor eine vergleichbare Produktivität wie der CECF-Reaktor ( 131 %). Weiterhin belegt dieses Experiment, daß ein Dimensionssprung um den Faktor 20 durchgeführt werden kann, ohne nennenswerte Ausbeuteeinbuße bezogen auf einen 1 ml CECF- Ansatz.
Beispiel 6
CAT-Synthese im Matrix-Saulen-Reaktor ( 12,5/125 Dimension, dynamisches Verfahren) In eine ummantelte Chromatographiesaule (Pharmacia) wurde Sephadex G25, Qualität fine, gepackt und anschließend mit einem Saulenvolumen Versorgungslosung aquilibriert (30 ml/h). Die Reaktorparameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: VR = 125 ml, VM = 87,5 ml, V0 = 37,5 ml. Mittels eines Wasserbades wurde die Säule auf 30°C thermostatisiert. 12,5 ml Reaktionslosung, gestartet mit 15 μg/ml pIVEX 1.1 -CAT, wurden auf die Säule gepumpt ( 18 ml/h). Danach wurde die Reaktionslosung mit einer Geschwindigkeit von 3,6 ml/h durch den Reaktor gepumpt. Das Eluat wurde bei 4°C fraktioniert. Die Ausbeute an fünktionell-aktivem CAT wurde mittels eines enzymatischen Fluoreszenztests bestimmt.
Ergebnis: In einem 12,5 ml Reaktionsansatz wurden im Matrix-Saulen-Reaktor 6,6 mg CAT- Enzym produziert.
Beispiel 7
CAT Synthese im Matrix- Batch- Reaktor
Zwei 50 μl Batch Reaktionen wurden mit 15 μg/ml pIVEX 1.1 -CAT gestartet. Die Reaktionen wurden zunächst bei 30°C inkubiert. Nach 30 Minuten wurde zu einem Ansatz 100 mg aquilibrierte Matrix (Sephadex G25, fine) gegeben. Nach 6 Stunden wurde die Ausbeute an funktio- nell-aktivem CAT Enzym mittels Fluoreszenztests bestimmt.
Ergebnis: Durch Zugabe aquilibπerter Matrix konnte die Ausbeute um 74 % gesteigert werden.
Beispiel 8
Variation der Matrixmenge im Matπx-Batch-Reaktor
50 μl Batch-Reaktionen wurden mit 15 μg/ml pIVEX 2.1-GFP gestartet. Die Reaktionen wurden bei 30°C inkubiert. Nach 30 Minuten wurde zu den Ansätzen verschiedene Mengen (0 mg, 50 mg, 100 mg und 150 mg) an aquilibπerter Matrix (Sephadex G25, fine) gegeben. Nach 5 Stunden
Reaktionszeit wurden die Ansätze zum Reifen des produzierten GFP's auf 4°C gestellt.
1 h GFP Reifung bei 4°C
Ergebnis: Durch Zugabe aquilibπerter Matrix konnte die Ausbeute um bis zu 250 % gesteigert werden.
Beispiel 9
Vergleich verschiedener Gelmateπahen im Matrix-Saulen-Reaktor (1/10 Dimension, dynamisches Verfahren)
Verschiedene Gelmateπahen (Sephadex, Bio-Gel) wurden gemäß Herstellerangaben gequollen, in 10 ml Säulen gepackt und mit 15 ml Versorgungslosung aquilibriert. Auf jede Säule wurde 1 ml Reaktionslösung ( 15 μg/ml pIVEX 2.1-GFP) aufgegeben. Direkt im Anschluß wurde die Reaktionslosung mit 200 μl Versorgungslosung eingewaschen. Im Abstand von zwei Stunden (Inkubator, 30°C) wurden jeweils 1 ml Versorgungslosung aufgegeben. Die Elutionsfraktionen wurden gesammelt und bei 4°C aufbewahrt. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP im jeweiligen wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).
20 h GFP Reifung bei 4°C
Ergebnis: Verschiedene Gelmaterialien, die sich in Bezug auf Art des Polymeren, Partikelgroße und Ausschlussmolekulargewicht unterscheiden, können im Matrix-Reaktor verwendet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind, wobei der Reaktorraum VR eine in wäßriger Losung quellbare Matrix enthalt, die aus einem porösen Material besteht, welches niedermolekulare Reaktionsteilnehmer aufnehmen kann und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer ausschließt und wobei der Reaktor zu mindestens 20 Vol% mit der Matrix gefüllt ist.
2. Reaktor gemäß Anspruch 1 bei dem durch die Matπxstruktur des Reaktorraumes, Reaktionskompartiment und Versorgungskompartiment in einem Reaktorraum vorliegen.
3. Reaktor gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktion im Ausschlußvolumen V0 der Matrix stattfindet.
4. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Matrixvolumen VM als Versorgungskompartiment für niedermolekulare Reaktionskomponenten, insbesondere Substrate, zur Verfügung steht.
5. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Reaktionskompartiment und Versorgungskompartiment nicht durch eine Membran getrennt sind.
6. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Reaktionskompartiment und Versorgungskompartiment nicht durch eine Membran getrennt sind, jedoch ein zusatzliches Versorgungsreservoir existiert, welches direkt oder über eine semipermeable Membran mit dem Reaktorraum verbunden ist.
7. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Matrix eine Gel-Matrix ist.
8. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der Reaktorraum die Form eines Zylinders aufweist.
9. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Reaktor eine mit einer Gtl- Matrix gefüllte Säule ist.
10. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Matrix eine Ausschlußgrenze im Bereich von 0,5 -300 kDa hat.
11. Rektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Matrix aus unvernetzten oder vernetzten organischen Polymeren bzw. Copolymeren und/oder einem anorganischen Material besteht.
12. Verfahren zur Herstellung von Produkten in einem Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Ausgangsstoffe nieder- und hochmolekulare Edukte sind, dadurch gekennzeichnet, daß sich die niedermolekularen Komponenten des Reaktionsansatzes, insbesondere die durch die Reaktion konsumierten Substrate, weitgehend homogen im gesamten Reaktorraum VR verteilen, den hochmolekularen Komponenten, insbesondere den katalytisch wirkenden Reaktionsteilnehmern, nur das Ausschlußvolumen der Matrix V0 im Reaktorraum zur Verfügung steht und eine Umsetzung der Substrate ausschließlich im Ausschlußvolumen der Matrix Vo möglich ist.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein enzymati- sches Verfahren handelt.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 zur gekoppelten in vitro Transkrip- tion-/Translatιonsreaktιon zur Herstellung von Proteinen, wobei zu den hochmolekularen Komponenten Ribosomen, tRNA's, DNA-Matrize, RNA-Polymerase, mRNA und Enzyme und regulatorische Proteine aus dem Lysat gehören und zu den niedermolekularen Komponenten Substrate sowie Effektoren, Puffersubstanzen und Salze gehören.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Gel-Matrix in den Reaktorraum eingebaut wird, daß die Gel-Matrix mit der Versorgungslosung aquilibriert, daß die aquilibrierte Gel-Matrix im Reaktorraum mit der Reaktionslosung in Verbindung gebracht wird und daß der Reaktor temperiert wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einer mit Matrix gefüllten Kammer/Saule durchgeführt wird, daß die Reaktionslosung auf die Säule aufgetragen wird und daß die Reaktionslosung für die Dauer der Reaktion in der Säule ruht.
17. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einer mit Matrix gefüllten Kammer/Saule durchgeführt wird, daß die Reaktionslosung auf die Säule aufgetragen wird und daß die Reaktionslosung für die Dauer der Reaktion kontinuierlich oder schrittweise durch die Säule gepumpt wird.
18. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem Batch-Reaktor durchgeführt wird und daß Reaktionslosung und aquilibrierte Gel-Matrix im Reaktorraum zusammengebracht werden, wobei das zugesetzte Matrixvolumen mindestens 20 Vol% des Volumens der Reaktionslosung betragt.
19. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem CECF-Reaktor durchgeführt wird, daß die Gelmatπx in das Reaktionskompartiment des CECF-Reaktors eingebaut wird und daß das Matrixvolumen mehr als 20 Vol% des Volumens des
Reaktionskompartiments betragt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem CFCF-Reaktor durchgeführt wird, daß die Gelmatπx in das Reaktionskompartiment des CFCF-Reaktors eingebaut wird und daß das Matrixvolumen mehr als 20 Vol% des Volumens des
Reaktionskompartiments betragt.
21. Verwendung eines Reaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 für enzymatische Reaktionen.
22. Verwendung eines Reaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 für gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktionen zur Herstellung von Proteinen.
23. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20 für enzymatische Reaktionen.
24. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 20 für gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktionen zur Herstellung von Proteinen.
25. Formulierungen zur Durchführung einer gekoppelten in vitro Transkription-/Transla- tionsreaktion zur Herstellung von Proteinen in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20.
26. Formulierungen gemäß Anspruch 25 bestehend aus einer Versorgungslösung und einer Reaktionslosung.
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