EP1259639A2 - Essentielle gene und genprodukte zur identifizierung, entwicklung und optimierung von immunologischen und pharmakologischen wirkstoffen zur behandlung mikrobieller infektionen - Google Patents

Essentielle gene und genprodukte zur identifizierung, entwicklung und optimierung von immunologischen und pharmakologischen wirkstoffen zur behandlung mikrobieller infektionen

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EP1259639A2
EP1259639A2 EP00938725A EP00938725A EP1259639A2 EP 1259639 A2 EP1259639 A2 EP 1259639A2 EP 00938725 A EP00938725 A EP 00938725A EP 00938725 A EP00938725 A EP 00938725A EP 1259639 A2 EP1259639 A2 EP 1259639A2
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EP
European Patent Office
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gene
genes
microorganisms
essential
polypeptide
Prior art date
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Withdrawn
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EP00938725A
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Heiko Apfel
Thilo M. Fuchs
Carol P. Gibbs
Christoph J. Hueck
Thomas F. Meyer
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Creatogen AG
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Creatogen AG
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Priority claimed from DE19927740A external-priority patent/DE19927740A1/de
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying and characterizing essential genes of pathogenic microorganisms, their use for finding new immunological and pharmacological active substances for prophylaxis, therapy and diagnosis of bacterial infections, and the further development and optimization of these active substances.
  • Included in the invention are the corresponding nucleic acids, which code for the essential gene products, and the polypeptides coded thereby.
  • the invention relates to vectors which contain the nucleic acids according to the invention, cells transformed with these vectors and antibodies specific for the polypeptides. These nucleic acids and polypeptides can be used for the diagnosis, prevention and treatment of microbial infections, in particular they can be used for the development of antibodies, vaccines and inhibitors.
  • the first step is to identify all genes on the genome. This is usually done with the help of computer-assisted search programs that can predict potential genes with a certain degree of certainty. In this way, gene maps can be created which, however, are still very inaccurate. If the genes identified by the search program cannot be assigned to a known gene, the functionality of these hypothetical genes must be verified by physical detection of the gene products in the original cell.
  • Another strategy which is also based on the use of special search programs, is aimed at the identification of possible gene families which are linked to special biological properties, which in turn are considered as an active substance target based on further assumptions.
  • the search criteria are geared towards characteristic structural features, which are usually derived from known genes.
  • the result of such a search can, depending on the approximation of the specifications to the actual state, provide a high hit rate.
  • the inaccuracy of these methods is relatively high, and the real biological property of the gene or its gene product must in any case be confirmed experimentally.
  • Another strategy captures the expression products of a cell, whereby the genes active for the respective developmental state can be identified. If one compares different developmental states with each other, the interaction of the genes can be deduced and in some cases the biological function of unknown genes can partially be decrypted. If corresponding comparative studies are carried out with cells that have a pathological appearance, it is even possible to identify disease-causing genes and use them as potential drug targets for drug development.
  • Helicobacter pylori is a pathogen of particular medical interest. This germ is a gram-negative, spiral-shaped bacterium with a high pathogenic potential, which has become increasingly resistant to a number of therapeutically relevant antibiotics in recent years and is therefore of great clinical importance. It is characterized by extremely high mobility due to its flagella and the unusual ability to survive in the strongly acidic environment (up to pH 1.5) of the stomach (Goodwin et al., 1,989).
  • H. ylori also has a causal role in the development of gastric and duodenal ulcers (ulcer ventriculi and duodenal ulcer) as well as in some forms of gastric carcinoma (adenocarcinoma) (Lee et al., 1 993; Solnick and Tompkins, 1,993).
  • the bacteria After ingestion, the bacteria first enter the extremely acidic stomach lumen (pH 1 to 2). There is through the production of the enzyme Urease, which leads to the cleavage of the existing urea and thus to the local neutralization of the acidic pH in the stomach, which enables the survival of the bacteria.
  • Urease By means of chemotactic orientation and flagella-dependent motility, the germs then move into the bicarbonate-buffered mucus layer of the antrum region of the stomach, their actual natural habitat. There they are in a unique ecological niche, which due to the acid barrier is only accessible to a few competing types of bacteria.
  • the bacteria are probably based on the pH gradient between the lumen (pH 1 -2) and the epithelial cell surface (pH 6-7) in order to reach the epithelium.
  • pH 1 -2 the pH gradient between the lumen
  • epithelial cell surface pH 6-7
  • these germs are optimally adapted to the living conditions in this habitat. They mostly stay in the deep crypts of the antrum region, where they are protected against external influences such as acid, pepsin, but also against medication to eradicate them, such as antibiotics.
  • Part of the bacterial population (approx. 20%) is closely associated with epithelial cells, especially with mucus-producing cells.
  • Provided gastric metaplasia i.e.
  • duodenal ulcer due to their ability to be adherent, complete elimination of the Helicobacter with the rejected mucus is probably prevented, so that the bacteria can persist for years, decades or even for life (chronic infection).
  • H. ylori Before the existence and importance of H. ylori for ulcer diseases were known, they were treated by so-called antacids, or H 2 -receptor antagonists. These are substances that inhibit acid secretion of the gastric parietal cell. Under the influence of these medicinal products, it usually heals Ulcers, however, since one of the causes of these ulcers, namely the p / or infection, is not eliminated, in most cases the ulceration recurs after a short time (recurrence).
  • Another therapy that is often used for ulceration is bismuth treatment.
  • Different bismuth salts CBS, BSS
  • CBS, BSS bismuth salts
  • a significant disadvantage of this form of therapy is, however, that total eradication of the germ is only achieved in a very small percentage of cases (8 to 32%).
  • Another disadvantage of bismuth treatment is that prolonged therapy with high doses leads to an accumulation of this substance in the liver, kidney and nervous system and has considerable neurological side effects (Malfertheiner, 1 994).
  • the dosage form is also of particular interest since the active ingredient must be effective in the stomach, ie in an extremely acidic environment. Connections with proton blockers, e.g. B. before the administration of the prophylactic or therapeutic agent can be of great benefit.
  • antibiotics bismuth subcitrate, erythromycin, amoxicillin, metronidazole
  • erythromycin bismuth subcitrate, erythromycin, amoxicillin, metronidazole
  • a high O 2 partial pressure or sublethal administration of antibiotics can be induced (Donelli et al., 1 998; Bode et al., 1 993; Sorberg et al., 1 996 ; Berry et al., 1,995).
  • Binding to epithelial cells and the ability to signal transduction seem to be preserved in coccoid forms comparable to the vegetative forms (Khin et al., 1 996; Segal et al., 1 996).
  • H. heilmannii can colonize the stomach of humans, e.g. B. H. heilmannii and H. felis.
  • H. heilmannii can also be associated with pathological ulcer diseases. The causal transmission probably takes place from pets to humans.
  • H. ylori ⁇ n which occurs frequently in humans, has been suspected of playing a role in the development of gastric cancer.
  • H. ylori ⁇ n which occurs frequently in humans, has been suspected of playing a role in the development of gastric cancer.
  • These doubts are particularly supported by more recent data from Helicobacter heilmannii, which attribute greater carcinogenic potential to them and emphasize their importance in the development of gastric MALT lymphoma (Regimbeau et al., 1 988).
  • H. ylori or heilmannii The identification of essential genes of Helicobacter, in particular H. ylori or heilmannii and possible Helicobacter Persistence forms for the development and optimization of new therapeutic, preventive and / or diagnostic agents, such as. B. Vaccines and pharmacological agents is therefore an aim of the invention.
  • In the foreground is the discovery of essential microbial genes, and homologous proteins of various pathogenic germs can be identified. With the help of an active ingredient, several pathogenic germs could then be eliminated at the same time as with classic antibiotics.
  • Helicobacter focuses in particular on genes that fulfill vital functions in the infection process, as well as genes that are involved in the development and reactivation of coccoid forms.
  • Essential genes that code for secreted gene products since these can be reached particularly well for immunological and pharmacological active substances due to their exposed location and are therefore good candidates for active substance development.
  • Essential genes that code for gene products that are involved in the development and maintenance of forms of persistence are also of interest.
  • Another task is to find essential microbial genes, whereby homologous proteins of various pathogenic germs can also be identified. With the help of an active ingredient, several pathogenic germs could then be eliminated at the same time as with classic antibiotics.
  • A Identifying essential genes and the corresponding polypeptides by producing gene-deficient microorganisms by conditional antisense inhibition (CAI) or / and subtractive recombination mutagenesis (SRM) and determining the viability and survivability of the gene-deficient microorganisms in one
  • CAI conditional antisense inhibition
  • SRM subtractive recombination mutagenesis
  • Test system Identification of specific active substances which are directed against the essential polypeptides and which inactivate the microorganisms or the microorganisms used.
  • Another aspect of the present invention is thus also a method for identifying essential microbial genes, which comprises the following steps:
  • CAI is the abbreviation for "conditional antisense inhibition", i.e. conditional antisense inhibition. It is a process which is described in more detail below.
  • SRM stands for "subtractive recombination mutagenesis", which is also described below.
  • gene deficient means that the deficient organism is unable to produce or use one or more of its gene products.
  • the production of the corresponding gene product can be prevented on the one hand by mutagenesis of the corresponding gene, or it can be inhibited during expression, for example by means of antisense nucleic acids.
  • Mutagenesis can be used to mutate a gene in the genome of the microorganism, or to incorporate a mutated gene into the microorganism, and homologous recombination can also be used.
  • a protein-coding section of a nucleic acid sequence is, for example, a gene or part of a gene which allows the expression of a polypeptide.
  • essential gene means a gene which codes for a gene product without which an organism cannot survive or can only survive to a limited extent.
  • Essential genes can be divided into two classes: obligatory essential and facultative essential genes.
  • An obligatory essential gene codes for a protein that is essential for the survival or reproduction of an organism under all circumstances.
  • an optional essential gene codes for a protein that is only necessary under certain conditions for the survival or reproduction of the organism, such as the ability of the organism to survive within cultured mammalian cells or in animals. In both cases, the survival or reproduction of the organism is severely impaired or prevented by the inactivation of a gene essential for it or the inhibition of a gene product essential for it.
  • a bacterium is no longer viable after inactivation of a particular gene or is restricted in its reproduction, this can be taken as a first indication that essential properties are imparted by this gene.
  • the significance of such Findings must, however, be supported by accompanying control experiments, for example, such a lethal mutation should be able to be abolished in a second step by appropriate complementation of the gene or gene product.
  • Obligatory essential genes are therefore those whose non-expression or absence, for example by mutagenesis or deletion, means that the organism is neither viable in a natural environment nor on a full medium that is ideally matched to the needs of the microorganism. If a microorganism is deficient in an optionally essential gene, it is usually still capable of growth on such a full medium, depending on the organism, but can no longer survive in its natural environment, ie in its natural host or cells or tissue cultures of its natural host.
  • the new method enables essential genes of microorganisms to be identified regardless of their special function. This method is preferably used to identify essential genes from Helicobacter and related microorganisms.
  • a first step the entire genome of a bacterial pathogen is searched for essential genes using a molecular genetic approach.
  • This sub-step does not require any knowledge of the primary structure of the genome or individual genes, but takes place solely on the basis of biological criteria. If a gene is identified as an essential determinant, its identity is determined. The raw sequence data of the genomic sequencing can be used. Based on the gene sequence determined z. B. isogenic variants are determined or whether the gene found is located in an operon in which there may be other essential genes.
  • the identified genes are converted into special genetic systems which serve to deliver the genes or their gene products to a direct active substance screening and / or the genes or gene products are used to further optimize already identified active substances.
  • the main advantage of the overall method is based on the rapid successive execution of the gene and active substance screening in meaningful biological systems, so that the potential active substance targets are identified and produced from the complete gene set of a pathogenic microorganism in a relatively short time, and these are used directly for the active substance screening or Optimization can be used.
  • any gene bank can preferably be subjected to a preselection.
  • the preselection for genes which code for polypeptides with a specific function can preferably be carried out, for example with the aid of homology analyzes.
  • the preselection can also be carried out for genes which are only expressed in certain development stages.
  • a marked reduction in the genetic material to be examined can be achieved by selection steps. For example, through an enrichment step for genes that code for exported or secreted gene products.
  • the DNA sections of a gene bank are mutagenized by a pathogen, which can be done, for example, by cloning such a DNA section into a plasmid, transformation into a preferably heterologous host organism and subsequent mutagenesis.
  • the resulting expression product can then be detected.
  • the mutagenesis can be carried out, for example, by inserting a marker sequence which is at Expression of the mutagenized sequence in a host organism leads to a fusion polypeptide that can be selected for.
  • the insertion of the marker sequence is not limited to transposon insertion, but can also be carried out in other ways, for example by homologous recombination or infection and recombination using bacteriophages.
  • the marker sequence used for the purposes of the present invention is generally a gene which codes for a gene product which allows selection for those host organisms which express this sequence.
  • these marker sequences are resistance genes which confer resistance to certain antibiotics or which allow the host organism to survive and multiply in a selection medium.
  • the gene marker preferably does not have its own expression signals, but is directly dependent on an upstream promoter, e.g. the transcription promoter on the promoter segment or a promoter which lies on the cloned heterologous DNA fragment to be identified.
  • enzymes can also be used as gene markers. In these cases, the successful insertion is determined by a certain biochemical reaction, e.g. a color reaction, which allows the manual isolation of the corresponding bacterial clone.
  • DNA material can be isolated from the selected bacterial clones and the DNA sequence which codes for the fusion product can be determined by known methods become. This allows a reading frame to be assigned to the DNA fragment to be identified. It is then possible to conduct comparative studies with commonly available DNA sequence databases to verify the identity of the to clarify the identified gene and, if necessary, to obtain evidence of a biological function.
  • CAI and SRM a targeted reduction of the sample volume can be achieved.
  • upstream selection processes that target specific gene groups, e.g. the use of subtractive gene banks from pathogenic and non-pathogenic representatives.
  • pathogen-mediating gene areas are enriched.
  • subtraction methods can also be used to identify genes specific to certain organisms, for example by comparing and subtracting the genomes of H. ylori and H. heilmannii.
  • Gene groups are identified that are only expressed in a certain development step.
  • the array method for example, in which the individual gene samples of the pathogen are applied in a grid-like manner to a carrier is to be emphasized.
  • the individual application points are known, so that in the case of a positive hybridization reaction with the development-specific transcription products or cDNAs or subtractive cDNAs or fragments thereof, the respective genes can be identified and then cloned.
  • Other methods that capture development-specific gene groups are comparative proteome and differential display analyzes.
  • microorganisms are produced which are deficient in the sequences which correspond to the identified gene sequences.
  • the deficient microorganisms are then tested on various growth media or cell cultures or in an animal model or in the natural host, and the defective genes can then be used as required Growth ability can be assigned to a category of non-essential, obligatory essential or optional essential genes.
  • genes that control the development from the vital to the survival form and vice versa has already been mentioned at the beginning. It is therefore particularly preferred to carry out a preselection for such genes.
  • methods such as CAI or SRM can be used and the gene-deficient microorganisms can then be examined on certain nutrient media, which trigger the transition from one form to the other.
  • the Schivo medium is particularly preferred, which enables the coccoid form to be reactivated into the vital spiral form.
  • Deficient microorganisms can be generated in several ways.
  • a number of molecular genetic methods are available for mutagenizing the genome of a bacterial pathogen in such a way that a mutant is available for each gene.
  • the most common method of mutagenesis is based on the inactivation of genes, e.g. B. by randomly inserting transposons in the genome, which are selected using appropriate markers.
  • This method can be applied to different organisms. (Joyce and Grindley, 1 984; Akerley, et al., 1 998). With the help of the inserted transposons, the mutagenized gene can also be precisely located in the genome.
  • a gene mutant with a detectable biological effect has been generated, for example a reduced growth of the cells in a certain milieu, the clear coupling of the gene or the gene product with this property must be demonstrated in a second step. This is usually done through complementation experiments. In this case the original gene is introduced and expressed in the organism with the specific mutant gene. If the original property of the organism can be regenerated in this way, the necessary evidence has been provided. However, this method cannot be used for the characterization of lethal mutants, ie mutants of essential genes. One way out is to use conditional mutations for complementation.
  • chemical-sensitive mutagenesis of the gene under investigation can produce temperature-sensitive mutants that bring the gene product into an inactive state at the normally optimal growth temperature and produce a biologically active gene product at lower temperatures (Das, et al., 1 976; Harris, et al. , 1,992; Hou, et al, 1,994; Polissi and Georgopoulos, 1,996).
  • the wild-type complementations by exogenous substances so-called. Controlled inductors. These inducers activate the expression of the complementing gene which is introduced into the gene-specific mutant on an episome and which, after induction, replaces the missing gene product (Murphy, et al., 1995-. Chow and Berg, 1 988; Arigoni, et al. , 1 998).
  • CAI Conditional Antisense Inhibition
  • SRM Subtractive Recombination Mutagenesis
  • the CAI method is based on the conditional inhibition of the translation of one or more genes which are located on a cloned genome fragment (which then serves as a template or template) and are propagated via a plasmid in the germ to be examined.
  • asRNA specific antisense RNA
  • the antisense nucleic acid sequences can then be synthesized in large quantities in the microorganism and bind to the original mRNA, whereby this mRNA can no longer be translated and is therefore withdrawn from the expression apparatus.
  • the result is that either no gene product or only small amounts of it are formed.
  • the synthesis of the asRNA is subject to control by a promoter (asPromoter) whose activity is conditionally controlled by defined external signals. This conditional inhibition of the expression of a gene or operon thus takes place via the regulation of the synthesis of the asRNA by the inducible asPromoter.
  • the survival and reproduction rate of a clone in which the synthesis of the asRNA is induced with its survival - ⁇ / rate of increase compared to uninduced asRNA synthesis. If the clone's survival / reproduction rate is reduced when inducing asRNA synthesis, the inhibited gene or operon is an (obligatory or optional) essential gene.
  • These growth analyzes can be carried out automatically, so that a very large number of genes can be examined within a short time can be.
  • the plasmid is isolated from these clones and the DNA sequence of the cloned genome fragment, which serves as a template for the asRNA synthesis, is determined and the structure of the essential gene is subsequently determined.
  • a plasmid vector suitable for the CAI method is shown in Figure 1. It contains a genomic or subgenomic DNA fragment from the microorganism to be examined under the control of an inducible promoter (P,) and other conventional expression signals, and an mRNA-stabilizing element, so that the DNA fragment can be expressed in the form of antisense RNA (asRNA) and has a long biological activity.
  • a suitable promoter is e.g. the Tet promoter.
  • the CAI vector additionally encodes a gene for a regulatory protein which regulates the promoter, in this case, e.g. the Tet repressor, which is triggered by an exogenous or extracellular signal, e.g. Tetracycline, can be controlled.
  • the CAI vector of the particular embodiment of Figure 1 further contains one or more selectable marker genes and two origins of replication (ori), one for the microorganism to be examined (referred to here as a pathogen) and another for a conventional cloning host, e.g. E. coli.
  • ori origins of replication
  • a pathogen a conventional cloning host
  • antisense libraries can be created from entire microbial genomes.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a preferred CAI method.
  • AsRNA is synthesized from a CAI plasmid, which contains small fragments of a genomic library of the microorganism to be investigated, from an inducible promoter (P,) under the control of an extracellular signal (see FIG. 1).
  • the asRNA hybridizes in a sequence-specific manner to the mRNA of the gene which corresponds to the cloned DNA fragment on the CAI plasmid.
  • the translation of this mRNA is reduced or prevented by the formation of the asRNA-mRNA hybrid.
  • the result is a deficient microorganism that is unable to to form the gene product in question.
  • the viability of the corresponding clone is restricted or prevented.
  • the viability of the microorganism is determined below on the basis of its life or survival or reproduction rate in a defined biological system. If there is no induction of asRNA synthesis (B), or if the CAI plasmid contains the fragment of a non-essential gene (C), the clone of the microorganism is normally viable and capable of reproduction.
  • RNA plasmid banks are analyzed from genomic fragments of the microorganism to be examined (see Figure 3).
  • a genomic library with CAI plasmids (see Fig. 1) is transferred into the homologous microorganism to be examined under non-inducing conditions and the plasmid-bearing clones are selected using a plasmid-coded marker.
  • the viability of the individual clones, each of which receives a specific CAI plasmid from the gene bank is then examined in direct comparison on the basis of their multiplication rate under induced or non-induced conditions (+ and - in the figure), based on the asRNA synthesis.
  • CAI plasmids are isolated from these clones.
  • the essential genes are identified by sequencing the genomic fragments in the isolated CAI plasmids.
  • This approach can also preferably be combined with a subtractive method (SCAI), an embodiment of which is illustrated in FIG. 4 for illustration.
  • SCAI subtractive method
  • a genomic library with CAI plasmids (see Fig. 1 and 3) is transferred into the homologous microorganism to be examined and the resulting individual clones are called bacterial CAI-Bank combined in one pool. This pool is split into two identical groups (the driver and the tester pool) for selection.
  • driver is used here for the pool of bacterial clones which is treated in such a way that the inducible promoter is activated and expresses asRNA from the CAI vector.
  • the "tester” pool contains an identical set of clones with CAI plasmids, but which is kept under non-inducing conditions and thus has wild-type properties.
  • the "Driver” pool is used for selection (e.g. in animals), while the “Tester” pool is kept untreated.
  • both groups can also be subjected to a selection, with only the “driver” pool being induced by administration of the signal (e.g. tetracycline).
  • the signal e.g. tetracycline.
  • the cloned genomic fragments are then amplified by PCR, using oligonucleotide primers which hybridize with vector sequences to the side of the cloned genomic fragments. Those amplified DNA fragments that are parts of essential genes are enriched and isolated by subtractive hybridization (see Fig. 8).
  • a promoter suitable according to the invention for a CAI vector is, for example, the Tet promoter, the activity of which can be controlled via a regulatory protein (in this case the Tet repressor) and can be induced by an extracellular signal (tetracycline).
  • a regulatory protein in this case the Tet repressor
  • tetracycline extracellular signal
  • the high efficiency of the CAI method in the inactivation of single genes in an organism results from the overlapping cloning of small genomic fragments and the associated synthesis of different asRNA derivatives for a specific gene area. In this way, the probability of obtaining an asRNA which efficiently inhibits the translation of the target gene sought is greatly increased.
  • Such investigations can be aimed at the complete genome of a pathogen, which requires the examination of a very large number of individual genomic fragments.
  • equipment aids are advantageous in order to achieve a high sample throughput.
  • only certain conditions can be examined in these cases, e.g. B. the growth of cells in a particular medium.
  • SCAI subtractive conditional antisense inhibition
  • Subtractive recombination mutagenesis is preferred to identify facultative essential genes.
  • SRM Subtractive recombination mutagenesis
  • permanent gene mutations are generated, whereby the enrichment of essential genes is achieved via a subtractive step.
  • the SRM method can be carried out with complete or partial libraries of pathogenic microorganisms.
  • the SRM method is based on the inactivation of individual genes in the genome of a pathogen by complete insertion of a certain suicide plasmid, which is not or only in the organism to be examined can replicate under certain conditions, such as permissive temperature, which is part of a gene bank.
  • the plasmids are inserted into the genome by homologous recombination. Successful insertion is indicated by expression of a plasmid-encoded antibiotic resistance marker.
  • Figure 5 shows a suitable SRM vector which, like the CAI vector, contains a genomic or subgenomic DNA fragment of the microorganism to be examined, and an origin of replication (ori) for a cloning host (eg E. coli), one or more selectable ones Marker genes and another conditionally active origin of replication for the microorganism to be examined, for example a temperature-sensitive origin or an origin, the activity of which depends on a replication factor present in trans and which can also be introduced into the system.
  • an origin of replication eg E. coli
  • the SRM plasmid contains a genomic sequence of the microorganism to be examined, when this vector is transfected into this microorganism, there is a homologous recombination in which the entire SRM plasmid is inserted into the genomic gene of the microorganism and the corresponding gene, if it is one, inactivated. This leads to an insertion mutant.
  • Suitable inducible origins of replication are temperature-sensitive oris or those that can be controlled by a factor, such as e.g. the RGK factor pir or the pWV factor repA, which is fed into the system in trans.
  • An SRM plasmid (see FIG. 5) is inserted into the genome of the microorganism to be investigated via homologous recombination between the genomic fragment of the cloned in the plasmid
  • a bank of insertion plasmids can be transferred from genomic fragments of the microorganism to be examined into this microorganism and genomic insertion mutants can be formed.
  • This preferred embodiment of the SRM method is shown in Figure 7.
  • a bank of SRM plasmids, which contain individual genomic or subgenomic fragments, is transferred into the homologous microorganism to be examined.
  • genomic insertion mutants are selected with the aid of a plasmid-coded marker (see FIG. 5). Only insertion mutants that are mutated in a non- or optional essential gene can survive in this step, since mutants of an essential gene are not viable.
  • the individual insertion mutants are combined in a pool and this pool is then divided into two identical groups, the driver and the tester pool.
  • the driver pool is selected, for example, by infection of an animal.
  • the tester pool remains untreated.
  • those clones are lost from the driver pool that insert in an optionally essential gene (that for survival and reproduction among the Selection conditions is necessary).
  • the plasmids inserted into the genome of the microorganism are recircularized and recovered under permissive conditions.
  • Such plasmids are missing from the driver pool which contain fragments of facultatively essential genes.
  • the fragments cloned in the SRM plasmids are then amplified in both pools by PCR (see FIG. 4). Those amplified DNA fragments, which are parts of optional essential genes, are enriched and isolated by genetic subtraction (see Fig. 8).
  • FIG. 8 A special embodiment, which takes advantage of subtractive hybridization for enrichment in fragments of essential genes, is illustrated by way of example in FIG. 8.
  • A PCR-based genetic subtraction.
  • the tester DNA fragments (see Figs. 4 and 7) are ligated with an adapter oligonucleotide in such a way that the adapter is only covalently linked to one of the two DNA strands of a double-stranded tester DNA fragment, which e.g. by ligation of a double-stranded, non-phosphorylated adapter to the 3'-phosphorylated DNA fragments of the tester DNA.
  • These tester DNA fragments are then mixed with a molar excess of driver DNA fragments. The mixture is denatured and slowly rehybridized. Then overhanging
  • tester tester double strands are separated from the tester homoduplexes by extraction with carrier-coupled streptavidin. The latter are isolated by cloning.
  • the insertion mutants generated, for example, by SRM are examined in animal experiments or cell culture systems with regard to their changed biological properties.
  • special host cells e.g. cultured macrophages or host tissues, e.g. B. spleen
  • gene groups can be selected that determine essential properties of the pathogen, e.g. the colonization of certain host cells. If the surviving mutants are isolated from the cells, the mutants of essential genes are missing. If you subtract the surviving mutants from the complete gene bank, you get the mutants of the essential genes.
  • the CAI or the SRM method is a very efficient method for the unique identification and characterization of essential genes. Since essential genes are a natural target for inhibitory agents, the methods presented offer an ideal basis for the development of new agents.
  • the identified genes are used directly for active substance screening, in comparison to conventional methods, complex purification steps can be dispensed with. These procedures focus on bacterial carrier cells that can be used for screening for prophylactic and therapeutic agents.
  • the gene-deficient microorganisms produced are then tested for their ability to grow or to survive. Suitable test systems are / nv / fro systems, cell culture systems, tissue culture systems and animal models as a natural environment. If the method is applied to H. ylori, the organisms are grown on the one hand on a so-called full medium, the full medium providing the best possible conditions for growth for .py / or /. At the same time, the deficient H.
  • ylori organisms are cultivated in a culture which should correspond as closely as possible to the natural environment of H. pylori.
  • cell cultures based on primary cultures or cell lines from gastrointestinal tissue are used, or differentiated primary tissue (spheroids) in culture medium.
  • Another way to simulate the natural environment of H. pylori is to use stimulated macrophages, because H. pylori has the ability to not be absorbed and metabolized by them.
  • it can also be checked whether the deficient H. ylori organisms are able to establish themselves in immunodeficient mice over a certain period of time.
  • the gene deficient in this organism is referred to as an optional essential gene.
  • essential genes of microorganisms can be assigned to one of these categories. From these results, the sequences in mutated or / suppressed by asRNA can then be identified and each assigned to one of these two categories, or the category of non-essential genes if the gene-deficient organism shows no impairments in its ability to grow.
  • Another object of the present invention is to provide a genetic method for isolating and cloning the identified essential genes from various clinical Helicobacter isolates or from heterologous pathogenic germs of clinical importance.
  • the method according to the invention therefore further comprises the steps (v) producing primers for the amplification and detection of homologous gene sequences in heterologous microorganisms (VI) identifying the homologous gene sequences.
  • a preferred implementation of these further process steps consists in producing so-called megaprimers of the identified essential Helicobacter genes by means of PCR (polymerase chain reaction), the sequence of which can be derived directly from the corresponding plasmids of the mutagenized DNA sections. These primers can then be used to isolate the already identified essential genes from various e // co / -) ac-'er isolates. If these essential genes have counterparts in other microorganisms, the primers may also be used to isolate these genes from microorganisms other than Helicobacter. Furthermore, the exact DNA sequence of the isolated genes and the determination of the gene variance within the different He / icobacter- ⁇ so ⁇ ate or between the different microorganisms can then be determined. DNA fragments with variable 3 'ends are produced during the production of the megaprimer. Because of this property, it is possible to use the DNA fragments for the isolation of variable or related genes by means of the described PCR method. Identify specific active ingredients
  • Bacterial carriers are used very effectively to identify new immunological agents from the pool of identified essential genes of a pathogen or to further develop these agents, since the identified genes can be cloned directly into these carrier systems and expressed there.
  • the active ingredient screening is then carried out directly with the aid of these recombinant, bacterial carriers.
  • Attenuated bacteria such as e.g. Salmonella, used because they have a natural potential for immune stimulation. If these attenuated bacteria are used as carriers or producers for the identified essential genes of the pathogenic germs and if an immunization is carried out on a mammal with these vaccine strains, a sustainable immune response can be triggered.
  • the bacterial carrier systems can be equipped with efficient gene expression systems, which the production also allow problematic antigens (PCT / EP91 / 02478, EP981 1 6827.1). Due to the direct subcloning of the isolated essential genes and the simple handling of the bacterial carriers during the production and vaccination, a large number of antigens can be tested for their immunogenic and protective potential in a relatively short time. In conventional methods, on the other hand, the test antigens have to be subjected to time-consuming purification processes, difficulties often arising during the genetic engineering of the selected antigens in bacteria, which are linked to the toxic effect of these antigens on the producing bacterial strain.
  • the immunogenic polypeptides are used together with suitable additives for immunization in vivo.
  • suitable additives for immunization in vivo.
  • Various adjuvants, bacterial toxins, cytokines or a polypeptide according to the invention are used as the live vaccine.
  • the immune response is then tested to determine whether it has a protective effect against further homologous infections (e.g. infections with different H. pylori strains) after administration of a specific polypeptide of the invention in combination with corresponding additives after infection with the homologous germ.
  • a further possibility for testing the immunogenicity consists in an immune response against in the animal model (eg mouse, rabbit) To trigger Helicobacter or other microorganisms and to obtain antibodies from the immunized animals / which can then be used in a further Western blot analysis. At the same time, patient biopsies must be examined in situ immunologically using the same antibodies, since Helicobacter and other microorganisms in culture can lose or gain certain proteins.
  • the screening for prophylactically or therapeutically effective, immunological substances can proceed according to the following scheme, although compliance with the individual steps is not mandatory:
  • Hyperimmune serum the original gene product in the pathogenic germ should recognize. It may be possible that the original antigen is only produced by the pathogen in a certain development period. 3.
  • the protective effect of the individual antigens in the prophylactic or / and therapeutic use form is in the
  • antigen-presenting cells are isolated from different donors, for example dentritic progenitor cells, which are expanded in vitro and loaded with the antigens to be tested, the antigens preferably being expressed via corresponding vectors.
  • the identified genes can also be used individually or in defined, combinations in dendritic cells (DC) of uninfected Donors are expressed.
  • DC dendritic cells
  • DC is incubated with T cells from autologous donors, it is possible to determine whether this donor would react to the antigen used if it came into contact with it naturally, for example as part of a vaccination. Based on the immune response of the T cells, a possible immunogenicity of the corresponding antigen can be concluded.
  • Such an immune response consists, for example, of a proliferation of the T cells or a cytokine release, in particular of IL-2 and IL-4.
  • the cytokines can be evaluated, for example, using a commercially available assay kit (for example from Genzyme Cambridge MA).
  • antigens or epitopes identified and characterized in the manner described can be used to develop the first vaccine prototypes.
  • antibodies or antibody fragments with a protective or inhibitory effect are supplied to the vaccine from outside.
  • Antibodies are provided in the form of polyclonal, preferably monoclonal antibodies (MAKs) or recombinant antibodies. These include antibodies which react specifically with polypeptides of the invention or their subunits and fragments and can be used for prophylactic and / or therapeutic use, for example passive immunization. These anti-protein or anti-peptide antisera or monoclonal antibodies can be obtained using standard protocols, for example by immunizing animals such as mice, rats or goats with a purified polypeptide of the invention, a fusion protein or a subfragment of it. In addition, the animals can also be immunized with bacterial vaccine carriers which are equipped with corresponding genes of the invention and which express the encoded polypeptides.
  • MAKs monoclonal antibodies
  • the antibodies are preferably immunospecifically directed against antigenic determinants or epitopes of the He / Zco / jacter polypeptides described or a closely related polypeptide which has a homology of at least 90%. They are not cross-reactive with polypeptides which, for example, have a homology of less than 80%.
  • the coding gene of such an antibody can be used to create chimeric genes that determine antibodies, consisting of an antigen-binding domain from the mouse and the Fc part of a human antibody . These antibodies can be produced in cell lines or transgenic animals.
  • mini-antibodies can also be used, e.g. in a heterologous system like bacteria.
  • miniantibodies can be either monovalent or bivalent and consist of dimerized single chain molecules (Kujau et al., 1 998; Kalinke et al., 1 996; Pack et al., 1 993).
  • Antibodies to the immunogenic polypeptides of the invention can also be generated in plants. Examples of this are e.g. by Hiatt and Ma (1 993), van Engelen et al. (1,994) and Ma et al. (1,994). Depending on the plant used, they can e.g. can be used directly for consumption and thus as an oral vaccine.
  • Another very widely used way of producing antibodies is in animals immunized in milk and eggs. If you give pregnant cows, for example, Suitable antigens for sheep or horses, there are immunoglobulins in milk that can be used to develop a vaccine. The milk can then either be administered directly as a vaccine or a concentrated immunoglobulin extract can be prepared. Antibodies (hyperimmune antibodies) can also be produced in chicken eggs in the same way (Ling et al., 1 998; Sasse et al., 1 998). The described immunogenic polypeptides of the invention can therefore also be used to develop a milk product or chicken eggs which can be used as an oral vaccine.
  • the generated antibodies or their fragments are tested for their applicability.
  • they can be purified by known methods (precipitation, chromatographic methods) and, for example, examined to determine whether they can inhibit the infection process of H. pylori (adhesion assays) or activating for complement or ADCC ("antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity).
  • the antibodies generated using the polypeptides of the invention are administered either orally or intragastric.
  • the antibodies are mixed with a bicarbonate buffer.
  • they can also be administered systemically, without having to be buffered.
  • Antibodies are preferably used alone or in combination with other non-immunological agents, e.g. with antibiotics or proton blockers.
  • Active vaccination is based on an immune response that is triggered by the vaccinated organism itself. Dosage forms of vaccines are preferred as antigens, antigen fragments, subunit vaccine, as DNA vaccine, as live vaccine or as food vaccine. Antigens are those polypeptides or their fragments that can elicit an immune response in vivo.
  • a polypeptide is to be provided as a subunit vaccine, it is first broken down into its subunits or structural domains according to its antigenicity pattern (e.g. T and B cell epitopes).
  • This antigenicity pattern can be created with the aid of a computer program, whereby immunogenic regions consisting of a short polypeptide sequence of approximately 8 to 10 amino acids can be recognized (Hughes et al., 1 992).
  • the individual polypeptide pieces can then subsequently be tested for their immunogenicity in the mouse or in primates or in humans.
  • polypeptides can either be administered as purified polypeptides, which have been produced synthetically, in combination with appropriate additives such as an adjuvant, toxin or cytokine, or as a fusion protein to a known immunogenic protein or protein subunit, e.g. the cholera toxin B subunit (Liljeqvist et al., 1 997).
  • immunogenic peptides can be incorporated into outer membrane proteins such as e.g. the OmpS maltoporin from E. coli and heterologously expressed in a vaccine carrier strain. (Lang and Korhonen, 1 997).
  • the polynucleic acid molecules characterized in the invention can be administered “naked” in fusion with a eukaryotic tissue-specific promoter or in the form of a plasmid.
  • the "naked” DNA or the corresponding plasmid is combined with an additive such as a reagent that changes the cellular permeability such as, for example, bupivacaine (WO94 / 1 6737), cationic lipids such as, for example, DOTMA (N- [1 - (2,3- dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl-ammonium chloride, DOTAP (1, 2-bis (oleyloxy) -3-trimethyl-ammonio) propane), DDAB (dimethyl-dioctadecyl-ammonium bromide), DOGS (dioctadecyl-amidolglycyl- spermidine) or cholesterol derivatives, silica, gold or
  • Attenuated Salmonella can also be used to apply the polynucleotide molecules.
  • the bacteria are transformed with eukaryotic expression vectors which contain a polynucleotide molecule of the invention and then administered orally.
  • the plasmid DNA is then transferred from the bacterium to the host (Darji et al., 1 997).
  • filamentous phages can also be used to transform attenuated carrier bacteria. The advantage of these is that they can transmit an extremely high number of plasmids.
  • a live vaccine includes, among others, viral ones, e.g. adenoviral or chickenpox virus vectors, or bacterial vectors such as Salmonella, Shigella or Lactobaci / Ius are available.
  • viral ones e.g. adenoviral or chickenpox virus vectors
  • bacterial vectors such as Salmonella, Shigella or Lactobaci / Ius are available.
  • Attenuated, non-virulent Salmonella typhimurium strains which can be used for the recombinant expression of heterologous antigens and are administered orally, have been characterized many times (Mekalanos, 1 994, WO92 / 1 1361, Cirillo et al., 1 995 and Dorner (1 995).
  • bacterial vectors that can be used as vaccine vectors have been described by Cirillo et al., (1 995) and Dorner (1 995), using a polynucleotide molecule of the invention encoding a therapeutically or prophylactically active polypeptide either stably integrated into the bacterial genome and subjected to a transport system which enables presentation on the bacterial surface (PCT / EP94 / 04286; WO97 / 35022) .
  • the corresponding polynucleotide molecule can also be present in the bacterium in the free state as a plasmid.
  • Vaccines are usually administered with suitable additives such as adjuvants, bacterial toxins, cytokines, etc., which support the protective or therapeutic effect of the immunogenic polypeptide.
  • Adjuvants with minor side effects for use In humans which are suitable for subunit vaccines and live vaccines, but also in part for DNA vaccines, are, for example, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, calcium phosphate, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine, N-acetyl -normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanine-2- (1 '-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) ethylamine , Liposomes, monophosphoryl lipid A, trehalose dimicoloate, fungal polysacc
  • Cholera toxin or its subunits or the heat-labile toxin from E. coli can be used as the bacterial toxin. Although they are highly potent as adjuvants, their toxicity means that they can only be used to a limited extent on humans. However, certain mutagenesis techniques can be used to develop molecules that are active but non-toxic (O'Hagan, 1 998).
  • Another way of optimizing the immune response to the prophylactically and / or therapeutically active substances of the invention is to express the corresponding polypeptide as a fusion protein with an immunogenic protein domain.
  • One possibility is e.g. in using the Pilin DSL domain from Pseudomonas aeruginosa as a fusion partner.
  • fusion proteins which have been fused to glutathione S-transferase or thioredoxin (Hill et al., 1 997; Gabelsberger et al., 1 997).
  • the corresponding fusion protein can be produced and administered as a subunit or live vaccine.
  • the immune response of the identified immunologically active substances can also be modulated in that they are administered in combination with certain cytokines.
  • Co-expression of the polynucleotide sequences of the invention with a specific cytokine in Salmonella or another host bacterium is suitable for simultaneous administration.
  • the corresponding cytokine can either do this a separate plasmid, in series, or as a fusion protein encoded with the desired polynucleotide sequence of the invention and then transformed into the host bacterium.
  • Cytokines which stimulate the immune system such as interleukin-6 (IL-6), interleukin-1 0 (IL-10) or interleukin-1 2 (IL-1 2), are suitable.
  • individual immunogenically active substances of the invention can be used together or in combination with known immunogenic substances such as e.g. VacA or its individual subunits can be combined.
  • the corresponding polypeptide can therefore be used together with at least one further Helicobacter antigen, such as e.g. the native urease or its subunits, fragments, homologs, mutants or derivatives thereof are expressed.
  • Helicobacter antigen such as e.g. the native urease or its subunits, fragments, homologs, mutants or derivatives thereof are expressed.
  • different subunit vaccines can be administered individually or as a fusion protein as described above together.
  • purified polypeptide molecules can be used in combination with a suitable adjuvant, bacterial toxin or cytokine.
  • a vaccine vector of the invention can thus contain one or more polypeptides of the invention, derivatives or fragments of the like.
  • a DNA vaccine with one or more purified subunit vaccines in a suitable carrier, as has already been described above.
  • Bacterial carriers can also be used very effectively to identify new pharmacological agents from the pool of the identified essential genes of a pathogen or to further develop these agents, since the identified genes can be cloned directly into these carrier systems and expressed there. The active ingredient Screening is then carried out directly with the aid of these recombinant, bacterial carriers.
  • Display systems are used to present an expressed polypeptide of the invention on the cell surface of bacteria.
  • a signal peptide at the amino end enables the transport of polypeptides through the inner membrane, while other parts take on the storage and anchoring in the outer membrane.
  • Various outer membrane proteins from E. coli have been described as carrier components, such as PhoE (Agterberg et al., (1,990) or OmpA (Francisco et al., 1,999).
  • fusions with the transport domain of the IgA protease precursor IgAß can also be carried out (Klauser et al., 1 990)
  • Examples of display systems are, for example, the DsbA system (PCT / EP 94/02486) or the car transporter system (AIDA; WO97 / 35022).
  • the polypeptides presented on the surface can then be used for binding studies with peptide or combinatorial chemical substance libraries.
  • the binding studies can be carried out with the aid of a "high through put" system, which enables high test rates, in liquid or bound form.
  • the presented polypeptides are applied, for example, to a chromatophore coupled, which in combination with another chromatophore, which is coupled to the active ingredient peptide or the chemical substance, enables a color reaction.
  • the corresponding active ingredient component can also be labeled, for example, with a fluorescent dye or coupled to a solid carrier matrix. If a “solid phase system” is used, either the polypeptide of the invention used or, conversely, the peptide or combinatorial active substance bank is coupled to the carrier matrix. The respective dye-labeled component then binds to the immobilized component, which in turn enables a color reaction. After the binding reaction, several washing processes must then be carried out before the corresponding substance is isolated.
  • Advantage of the "Solid Phase System" over the binding in Liquid is that the active substance can be isolated more quickly since the unbound substances are washed away.
  • An alternative embodiment of the method according to the invention is to find specific binding partners of the polypeptides encoded by the identified genes.
  • Homology studies can preferably be carried out with Helicobacter and other organisms, e.g. with the aid of computer alignments, Southern blots, PCR and the like and subsequent assignment of the sequences. Based on homologies, it can then be concluded that the proteins are binding partners.
  • Target-directed screening methods with the aid of substance libraries can also be carried out with preference.
  • the potential binding substances are presented bound in a special arrangement, for example in microtiter plates or other carrier materials.
  • the "target” usually purified, optionally recombinant added in soluble form, which enables the detection of an interaction between the target and certain substances.
  • Indirect detection can be provided by labeled antibodies directed against the substance or by introducing additional elements ("tags") into the target.
  • Another variant of the binding studies is the expression of in recombinant bacteria (e.g. those that do produce fluorescent protein GFP or certain enzymes), which present the proteins on the surface, and then testing a substance library.
  • recombinant bacteria e.g. those that do produce fluorescent protein GFP or certain enzymes
  • the three-dimensional structure of the polypeptides encoded by the genes identified according to the invention or their fragments can also be determined by crystallographic analysis. If the resolution is sufficient, any "pockets" or other binding points can be exactly characterized in their three-dimensional structure. Based on this data, the structure of potential binding partners can be calculated.
  • polypeptides can be identified which bind to the Helicobacter polypeptides of the invention or their fragments, or to other polypeptides identified according to the invention. If a corresponding peptide is found in this way, it can be chemically modified further until the optimal possible binding is achieved.
  • the identified polypeptide can be used, for example, as an inhibitor, for example by coupling it to a toxin and an internalization signal which destroys the pathogenic germ or else as a peptide mimetic to prevent the germ from binding to the cellular surface (EP-41 2,762A and EP-B31, 080A).
  • the identified peptides that bind to the Helicobacter polypeptides of the invention can be coupled to certain ligands, for example for the T cell receptor. If an animal or human infected with pathogens is given these peptides equipped in this way, the body's immune system is specifically attracted and activated. Compliance with the individual steps is not mandatory here, but can be supplemented or replaced by further steps.
  • a vaccine can be further developed by combining several antigenic gene products or parts thereof in one active ingredient and / or by administering them with different carriers or additives.
  • Different attenuated bacterial or viral organisms act as carriers and adjuvants and / or cytokines as additives.
  • a lead structure characterized as being effective is chemically modified further so that the identified gene product is optimally bound and inhibited. Furthermore, the drug should be well tolerated by the patient and have few side effects.
  • a polynucleotide of the invention can e.g. are pre-coupled to a carrier matrix or vice versa, the active substances of the polypeptide or combinatorial substance bank.
  • the following scheme used is the same as that already described for the polypeptides.
  • inhibitory substances can be polypeptides, peptides, but also chemical substances, such as antibiotics.
  • the inhibitory effect can intervene in different stages of replication of the microorganisms to be controlled. Examples are expression inhibitors or enzyme inhibitors or other inhibitors which can influence the natural function of the polypeptides of Helicobacter and related microorganisms.
  • Such inhibitory substances are also the subject of the invention.
  • Another way to find an optimal active ingredient against Helicobacter and other bacterial infections is with the help of special computer programs. Based on crystallographic data obtained from the polypeptides described in the invention, a model can be created that combines steric, electronic, hydrophobic and so-called "resulting binding moments" (RBMs) (Ray et al., 1 998). Using this model, substances can be modeled on the computer that may contain the lead structures that have already been identified, but that have better binding properties. However, completely new active ingredients can also be designed.
  • RBMs resulting binding moments
  • Another aspect of the present invention is a nucleic acid which codes for an essential secretory gene from Helicobacter pylori, which was identified by the inventive method described above.
  • Essential He / icobacter genes were identified with the present method, whose nucleic acid sequences are shown in SEQ ID NO. 1 to 245 (odd numbers) are given.
  • a nucleic acid according to the invention is, for example, characterized in that it (a) one of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: n, where n is an odd integer from 1 to 245 inclusive, or a protein-coding section thereof, (b) one of the sequences from (a) nucleotide sequence corresponding to the degeneration of the genetic code or (c) a nucleotide sequence hybridizing with one of the sequences from (a) and / or (b) under stringent conditions.
  • the present invention also includes nucleotide sequences which hybridize with one of the aforementioned sequences.
  • hybridization according to The present invention is in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1 989), 1 .1 01 - 1 .1 04).
  • nucleotide sequence hybridizing under such washing conditions with one or more of the nucleotide sequences according to the invention or with a nucleotide sequence corresponding to these sequences in the context of the degeneration of the genetic code is a nucleotide sequence according to the invention.
  • the nucleotide sequence according to the invention is preferably a DNA. However, it can also comprise an RNA or a nucleic acid analog, such as a peptide nucleic acid.
  • the nucleic acid according to the invention particularly preferably comprises a protein-coding section of the nucleotide sequences shown in the sequence listing or a sequence which has a homology of more than 80%, preferably more than 90% and particularly preferably more than 95% to the nucleotide sequences shown or preferably at least 20 Has nucleotides (nt) and particularly preferably at least 50 nt long section thereof.
  • a nucleic acid according to the invention can code for a secreted polypeptide with signal peptide or for a secreted polypeptide without signal peptide.
  • a nucleic acid according to the invention comprises both the sequence of the coding strand and the sequence complementary thereto.
  • the latter can be used, for example, in the production of antisense nucleic acids.
  • the invention also of course also relates to a gene bank which contains at least 2, preferably at least 20, more preferably at least 100 of the nucleic acids mentioned in clones in vectors.
  • genes that are specified in the sequence listing in their nucleic acid and amino acid sequence are bacterial genes.
  • prokaryotes also use other (alternative) start codons. These are AUU (usually codes for isoleucine, Ile), UUG (usually codes for leucine, Leu) and GUG (usually codes for valine, Val).
  • AUU usually codes for isoleucine, Ile
  • UUG usually codes for leucine, Leu
  • GUG usually codes for valine, Val
  • the amino acid sequences were translated according to the translation code normally used. It is pointed out that the prokaryotic use of alternative start codons must be taken into account when reading the sequence listing, and that the nucleic acid sequences according to SEQ ID NO.
  • SEQ ID NO 247 shows the sequence of the vector pSRM4 ( Figure 13).
  • sequences SEQ ID NO. 1 to 114 are shown in the enclosed sequence listing.
  • the sequences SEQ ID NO. 115 to 246 are shown in Figures 14 and 15.
  • Tables A and B below list the nucleic acid sequences identified as Helicobacter genes (Ge ⁇ -ID), the nucleic acid sequences of which could not be determined in full.
  • the shown e ⁇ era ⁇ t ⁇ r of the determined Helicobacter Ge ⁇ s ⁇ quenze ⁇ is ensured due to the selection for functional fusions with the used indicator, the ⁇ -lactamase (see examples 3 and 4).
  • Table A lists the Helicobacter genes that contain an incomplete S 'end and or 3' end.
  • Table B lists such Helicobacter genes that one or more amino acids cannot be assigned due to the lack of sequence data. In all cases, St ⁇ p codons can be excluded.
  • Another aspect of the present invention is a vector which contains a nucleic acid according to the invention or a section thereof.
  • the nucleic acid or the nucleic acid section can be cloned into the vector in such a way that it can be expressed in either sense or antisense direction.
  • the nucleic acid section preferably has a minimum length of 15 nucleotides, more preferably 20 nucleotides, more preferably 50 nucleotides.
  • This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which the DNA sequence according to the invention is preferably located in connection with expression signals, such as e.g. Promoters, operators, enhancers etc. Examples of prokaryotic vectors are chromosomal vectors such as bacteriophages (e.g.
  • the vector according to the invention can also be a eukaryotic vector, e.g. a yeast vector or a vector suitable for higher cells (e.g. a plasmid vector, viral vector, plant vector).
  • a eukaryotic vector e.g. a yeast vector
  • a vector suitable for higher cells e.g. a plasmid vector, viral vector, plant vector.
  • CAI and SRM vectors as described above are also the subject of the invention.
  • Another object of the present invention is a cell which is transformed with a vector or a nucleic acid according to the invention.
  • this cell is a prokaryotic cell, preferably a gram-negative bacterium, for example E. coli.
  • the cell according to the invention can also be a eukaryotic cell, such as a fungal cell, a yeast cell, an animal or a plant cell.
  • the cell is particularly preferably a microorganism, for example Helicobacter or Salmonella.
  • Microorganisms transformed with CAI or SRM vectors have already been described above. These are, as with the above Mutant banks which can be prepared, also a subject of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to an essential and preferably secreted polypeptide of H. ylori.
  • this is a polypeptide that
  • (b) comprises a sequence which is immunologically cross-reactive with one of the sequences according to (a).
  • Immunological cross-reacting sequences thus also include muteins, variants and fragments of those shown in SEQ ID NO. 2 to 246 sequences shown. These are to be understood as sequences which differ from the above sequences by substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments.
  • the identified polypeptides Based on homology analyzes with the help of the FASTA protein program, the identified polypeptides, the sequence of which could be found with the nucleic acid sequence, could be assigned certain features or a putative localization in the bacterium.
  • Some of the polypeptides encoded by the nucleic acids of the invention have a signal peptide and are exported to their destination by the sea-dependent transport mechanism, while others have no signal peptide and are therefore likely to be via a sea-independent transport mechanism, e.g. can be secreted by the ABC transporter system (see Tables I and II).
  • polypeptides according to the invention are preferably prepared by: transforms a cell with a DNA molecule or vector according to the invention, cultivates the transformed cell under conditions in which expression of the polypeptide takes place, and isolates the polypeptide from the cell and / or from the culture supernatant.
  • the polypeptide according to the invention can be obtained both as a fusion polypeptide and as a non-fusion polypeptide.
  • the polypeptide according to the invention can be used as an immunogen for the production of antibodies.
  • the present invention thus also relates to an antibody which is directed against a polypeptide according to the invention.
  • the invention also relates to fragments of such antibodies, e.g. Fab fragments or Fc fragments.
  • Yet another aspect of the invention is an inhibitor of the polypeptides according to the invention, their fragments, or their expression, presentation or / and natural function.
  • This is preferably a molecule which is able to bind specifically to a polypeptide or fragment thereof and / or to influence its expression, presentation or / and natural function.
  • Particularly suitable as inhibitors are proteins or peptides which inhibit a polypeptide according to the invention in its natural function, e.g. enzymes can be inhibited by blocking the active site.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition which, as an active ingredient, a DNA molecule according to the invention, a vector according to the invention, a cell according to the invention, a polypeptide according to the invention, an antibody or fragment thereof or / and an inhibitory molecule capable of is specific to one bind inventive polypeptide, optionally together with conventional pharmaceutical auxiliaries, diluents, additives and carriers.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be used in various ways and using individual components thereof as effective substances for inhibiting the reproduction of Helicobacter organisms in a host, especially in humans.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be used on the one hand for the diagnosis of a Helicobacter infection.
  • the diagnosis at the nucleic acid level is preferably carried out by using hybridization probes or primers which have a specific DNA sequence which relates to at least a section of one of the sequences shown in SEQ ID NO. 1 to 245 (odd numbers) sequences is complementary, so that they allow an amplification of the sequences according to the invention.
  • these amplification primers or probes can also be used for the amplification and thus for the detection of related microorganisms if they have gene sequences which code for the same essential gene. Diagnostics at the protein level are preferably carried out with the aid of the antibodies according to the invention.
  • the pharmaceutical composition is suitable for the prophylaxis and control of / e // co-_> acter infections and infections with related microorganisms.
  • Another important aspect of the present invention is the use of the identified essential genes of Helicobacter pylori ' for the prevention or control of an infection with Helicobacter or related microorganisms.
  • these identified essential genes can be used for the production of vaccines (vaccines) (see above).
  • Another use of the polypeptides of the invention is to purify the antibodies against H. ylori polypeptides and against corresponding polypeptides from related and other microorganisms.
  • Figure 1 shows a schematic representation of a CAI vector.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a conditional antisense inhibition (CAI) method.
  • Figure 3 shows a schematic representation of the investigation of the viability of deficient microorganisms based on their survival rates using the CIA method.
  • Figure 4 shows a schematic representation of the subtractive
  • CAI procedure CAI
  • Figure 5 shows a schematic representation of an SRM vector.
  • Figure 6 shows a schematic representation of the reversible
  • Figure 7 shows a schematic representation of an SRM process.
  • Figure 8 shows a schematic representation of the enrichment of fragments of essential genes by subtractive hybridization.
  • Figure 9 shows an overview map of pSRM4.
  • the "origin of replication" (ori) is shown as a bar, coding regions (for further explanations see below) are shown as arrows. Singular restriction sites are given.
  • Figure 10 shows a schematic representation of the integration
  • Dashed lines indicate the DNA area in which homologous recombination takes place.
  • Figure 11 shows a schematic overview of the steps for constructing a random fragment bank.
  • Figure 12 shows the complete nucleotide
  • Figure 13 shows the nucleotide sequence of the SRM vector pRSM4.
  • Figures 14 and 15 show the nucleotide and amino acid sequences of other essential Helicobacter genes. Examples
  • the SRM method is carried out with the vector pSRM4, which was specially developed for this method (see Figure 9, sequence see SEQ ID No .: 247
  • the plasmid has the following properties:
  • pSRM4 carries a temperature-sensitive replication function (repA Xs , ori +) from the Streptococcus plasmid pWV01 (Kok, et al., 1984; Maguin, et al., 1 992) and replicates at a permissive temperature (30 ° C) in Gram-negative bacteria (E. co / i, Salmonella, etc.) and in Gram-positive bacteria (Bacillus, Lactococcus, Streptococcus, etc.).
  • repA Xs , ori + replicates at a permissive temperature (30 ° C) in Gram-negative bacteria (E. co / i, Salmonella, etc.) and in Gram-positive bacteria (Bacillus, Lactococcus, Streptococcus, etc.).
  • pSRM4 does not replicate either in Salmonella or in E. coli.
  • the experiment is carried out as under (1), with the difference that the incubation takes place at 37 ° C. (without Tet). After 80 to 180 minutes after tO, the number of Tet sensitive clones begins to increase logarithmically, while the number of Tet resistant (plasmid-containing) clones remains the same.
  • pSRM4 codes for a tetracycline resistance that mediates resistance to 1 7.5 pg tetracycline / ml.
  • the tetracycline resistance gene can be exchanged for other resistance genes.
  • several restriction interfaces are available within the vector (see Fig. 9).
  • pSRM4 contains a so-called “multiple cloning site” (mcs) with different, unique recognition sequences for restriction enzymes.
  • mcs multiple cloning site
  • the mcs is located in a part of the lacZ gene which can be used for alpha complementation in E. coli strains such as DH5 ⁇ , XL1-Blue, or EC101 (Law, et al., 1 995).
  • E. coli strains such as DH5 ⁇ , XL1-Blue, or EC101 (Law, et al., 1 995).
  • plasmids which carry cloned DNA fragments in the mcs can be identified by blue / white differentiation on solid medium with X-Gal (80 pg / ml) and IPTG (420 pM IPTG).
  • Clones of EC101 that carry plasmids with inserts form white colonies, while colonies of clones that contain plasmids without an insert are blue.
  • pSRM4 can be transformed with an efficiency of 2x10 7 to 2x10 8 per pg DNA in E. coli DH5 ⁇ or EC101, and with an efficiency of 5x10 6 / pg in S. typhimurium ATCC 14028.
  • the transformation takes place via electroporation according to standard protocols.
  • pSRM4 does not recombine with the S. typhimurium genome.
  • pSRM4 was transformed into S. typhimurium ATCC 14028; the transformants were cultivated for 48 h at 30 ° C. on FeMed with Tet and separated. A single colony (approx.
  • pSRM4 with short genomic inserts is suitable for inactivating genomic genes via homologous recombination (examples: phoP gene and phoN gene from S. typhimurium).
  • phoP-specific primer that leads to a chromosomal p ⁇ o / V or p ⁇ E sequence, but not to the cloned p /? oN or p ⁇ oE fragment is homologous, carried out (primer pairs phoNfor [GCTGTCGACTTTCTACCACTGATCGTAGC] / lacZ2 [CATGCCATGGCTGCGCGTAACCACC] or phoP3 [CCCCAAAGCACCATAATCAACGC] / lacZl [CATGCCCCGGATAG]].
  • DNA is amplified from the plasmid along with a piece of chromosomal DNA that is adjacent to the insertion site.
  • genomically integrated large amounts of PCR fragment are obtained.
  • a PCR with the primers lacZl / SRMgb2 [ATACCGTCGACCTCGAG] is used to check the loss of free plasmid DNA. Both primers hybridize only against sequences of the plasmid that are located laterally to the cloned insert; in the case of a genomically integrated plasmid, this amplification results in only a very small amount of product.
  • Genomically integrated pSRM4 excises at permissive temperature. Cloned genomic inserts can be easily prepared via PCR with different primer pairs (SRMgb2 / SRMgb4 [AACAAAAGCTGGGTACC]; lacZl / SRMgb2).
  • Integrant strains (S. typhimurium ATCC14028 derivatives with integration of pSRM-phoN) are incubated on FeMed with Tet at 30 ° C and at 37 ° C and then plated on FeMed with or without Tet, using different dilutions at both temperatures, in order to Quantify frequency of excision.
  • the quotient of the number of colonies on FeMed without Tet and that on FeMed with Tet indicates in how many cells in a colony the plasmid is free compared to cells with genomically integrated plasmid. The quotient is a measure of the excision rate. Depending on the starting colony, excision rates of 3.2 to 1 7, 1 result.
  • Excised plasmid is again detected in a PCR using the primers SRMgb2 and SRMgb4 or the primers lacZl and SRMgb2. There are large amounts of PCR product.
  • the insertion and excision of pSRM4- / ira ⁇ 7 / 77et7f via homologous recombination is an equilibrium reaction (see Fig. 10).
  • the equilibrium is shifted to the side of the freely replicating plasmid in the cell; Both at 30 ° C and at 37 ° C free and integrated plasmid can be detected via PCR.
  • the respective proportions are shifted according to the temperature sensitivity of the plasmid.
  • a mutant that contains pSRM4-phoP in the phoP gene is stable and attenuated in a cell culture system.
  • the intracellular multiplication of this mutant in murine J774A.1 macrophages is compared with the multiplication of pSRM4-p /? ON, with the wild type S. typhimurium ATCC14028, and with stable phoP and phoN mutants.
  • 4x10 5 macrophages of the cell line J774A.1 are infected with 8x1 0 6 bacteria from a clone at 37 ° C., 5% CO 2 . After 30 min, the extracellular bacteria are removed by washing with PBS and by adding 10 pg / ml gentamicin to the medium.
  • the macrophages are lysed with 0.5% sodium deoxycholate and suitable dilution levels of the cell lysate are plated on FeMed. After incubation, the colony numbers are determined and the number of bacteria per ml culture is calculated. While the wild-type strain lasts for a period of 7 to 24 hours significantly increased in the macrophages, a stable phoP mutant is strongly attenuated. A stable phoN mutant and a pSRM4-p / 7 ⁇ / V insertion mutant behave like the wild type. A pSRM4-p /? ⁇ P insertion mutant behaves like the stable phoP mutant. The propagation rates are summarized in the table below
  • pSRM4 is suitable for the construction of SRM rPCR fragment banks.
  • the rPCR (random PCR) fragment banks are produced in the following way: 1.) Amplification of randomly generated - 500 bp fragments
  • SRM fragment banks are used to construct SRM mutant banks.
  • SRM fragment banks that were cloned in E.coli EC101 are transformed into S. typhimurium ATCC 14028.
  • the transformants are selected at 30 ° C. on FeMed with Tet.
  • the colonies obtained are washed away from the plates in FIMed with Tet.
  • the bacterial suspension is incubated for 3 hours at 37 ° C., and then plated on FeMed with Tet.
  • thousands of genomic insertion mutants are obtained, which in their entirety represent the SRM mutant bank.
  • To reduce the redundancy of the SRM mutant bank several independent designs of the SRM fragment bank are assumed, from which independent mutant banks are generated.
  • 96 SRM mutants are pooled in a pool. These 96 mutants of an SRM pool can also be preserved as individual clones by freezing.
  • SRM mutant banks are selected negatively.
  • the S. typhimurium SRM mutant library is selected in J774A.1 macrophages or in BALB / c mice (other cell lines and other mouse strains can also be used). 1 pool (96 mutants) is selected. After the selection, the bacteria are first cultivated on FeMed with Tet at 37 ° C. This step only multiplies those clones that contain genomically integrated pSRM plasmid.
  • the integrated SRM plasmids are excised from the genome by incubation in FIMed with Tet at 30 ° C. Plasmids obtained from a selected pool of SRM mutants are called "drivers”. Plasmids that come from the identical but not selected pool result in the "tester”. The plasmid DNA is for testers and drivers obtained from the bacteria by plasmid preparation.
  • DNA fragments cloned in pSRM4 can be identified by genetic subtraction after amplification of the tester and driver fragment banks via PCR.
  • the SRM fragments of the selected clones from a pool of 96 are amplified for the tester group by PCR with the primer pair SRMgb2 / SRMgb4.
  • these fragments are amplified with the same primers, the primers for amplifying the driver DNA on
  • Edge sequences of the tester DNA fragments can be eliminated by a subsequent restriction with Kpn ⁇ , so that
  • biotinylated driver DNA and tester DNA are mixed in a ratio of 10: 1 to 1000: 1.
  • the DNA of these batches is precipitated, dissolved in 1 0 FI hybridization buffer (0.05 M HEPES pH7.5, 1 mM EDTA, different NaCl concentration), first incubated for 3 minutes at 95 ° C, followed by an 18-hour incubation at 65 ° C.
  • the biotinylated homo- and heterodimers formed during this hybridization are extracted from the mixture via streptavidin-coupled magnetic particles.
  • the subtraction is repeated two to three times.
  • SRM fragments For the isolation and subsequent identification of the enriched tester DNA fragments, these are cloned into the pSRM4 vector via the p / 71 interface. Identification of SRM fragments by Southern (Dot) blot. As an alternative to genetic subtraction, a blotting procedure can be used to identify SRM fragments of essential genes. For this purpose, the SRM fragments from 96 SRM mutants each with free pSRM plasmids are amplified via PCR (primer SRMgb2 / SRMgb4) and fixed individually on a membrane filter. (1) PCR-amplified SRM fragments from the driver and (2) PCR-amplified SRM fragments from the tester are used as the probe for hybridization. DNA fragments which give a signal with the probe from the driver but not with the probe from the tester are the fragments of essential genes sought.
  • the SRM method can be used in all organisms in which pSRM4 shows temperature-sensitive replication.
  • the SRM method can be adapted for other organisms such as, for example, Helicobacter spp., Campylobacter spp., Or others, by constructing SRM vectors for these organisms.
  • SRM vectors for Helicobacter spp.
  • a plasmid is found in Helicobacter spp. replicated, e.g. pHel (Heuermann and Haas, 1 995; Heuermann and Haas, 1 998).
  • the plasmid replicates according to the "rolling circle” mechanism, and the RepA proteins of both proteins are homologous (del Solar, et al., 1 993; Kleanthous, et al., 1 991).
  • the plasmid is used according to the method described by Maguin et al. described method (Maguin, et al., 1 992) produced a temperature-sensitive variant.
  • the plasmid is mutagenized in vitro with hydroxylamine according to standard methods and transformed into H. pylori at a permissive temperature.
  • only the repA gene is mutagenized and the mutagenized DNA is then cloned into a rep-free plasmid.
  • Replica plating of H. pylori clones which contain mutagenized plasmid or repA and selection of the clones by means of a plasmid-encoded antibiotic resistance identify variants of the plasmid or repA gene which have a Allow replication at 30 ° C, but not at 37 ° C.
  • the mutation (s) that mediated temperature sensitivity are identified by sequencing the plasmid (or the repA gene).
  • the temperature sensitivity of the plasmid is further characterized as described above for pSRM4.
  • the plasmid is subsequently used as pSRM4 as a vector for the subtractive recombination mutagenesis in Helicobacter spp. used.
  • the CAI method can be carried out with different vectors which can replicate and be selected in the organism to be examined.
  • PCAl is used as the vector.
  • pCAl contains the replication and resistance functions of pWSK29 (Wang and Kushner, 1 991), or of pBluescript, or of pUC, or of other plasmids.
  • the respective vector contains an adjustable CAI promoter and its ice and -1 ra / 7S regulatory components. The transcription from this promoter is controlled by exogenous factors (inducers).
  • the regulated CAI promoter is the tet promoter, which is activated by the tef operator and the Tet repressor only in the presence of tetracycline in the growth medium (Hillen and Berens, 1 994).
  • the ara promoter is used, which is controlled via the ara operator and AraC, an activator protein, and is only activated in the presence of arabinose in the growth medium (Guzman, et al., 1 995).
  • any other promoter that can be regulated by exogenous signals can also be used.
  • RNA stabilizing elements (RSE) can be inserted (Carrier and Keasling, 1 997a; Carrier and Keasling, 1 997b; Carrier and Keasling, 1 999).
  • RSE RNA stabilizing elements
  • the RSE are cloned in such a way that after the insertion of CAI fragments at the 5 'and / or at the 3' end of the transcribed RNA fusions with the RSE result.
  • a Kpn ⁇ and other restriction sites (mcs) are inserted between the promoter and the 5'-RSE sequence on the one hand and the 3'-RSE sequence on the other hand, which are later used for the insertion of CAI fragments.
  • a bank with genomic fragments of the organism to be examined is constructed in the CAI vector. For this purpose, cloned into the mcs genomic DNA fragments, which were prepared according to the rPCR method described in Example 1.
  • the CAI gene bank obtained in this way is transformed into the organism to be examined and individual clones are selected using the plasmid-coded resistance marker,
  • the CAI method can be used with various selection and / or screening methods, which are described below.
  • Fragment banks of (1) the aroA gene, (2) the phoN gene, and (3) the phoP gene were constructed in pCAl. To construct these fragment banks, the genomic regions of these genes, including neighboring ones, are made
  • the PCR products thus obtained are used as templates for the generation of rPCR fragments according to the method described above.
  • the rPCR fragments are made without fractionation of different lengths of DNA
  • the clones of the aroA fragment bank are plated on plates with solid medium (M9 minimal medium with casaminoacids [CAA, amino acid mixture] without inductor).
  • the function of the aroA gene is necessary so that the bacteria can multiply on M9 without CAA.
  • the colonies obtained are transferred by replica plating to M9 with CAA and to M9 without CAA, each with an inductor.
  • the clones of the phoN fragment bank are transferred by replica plating to M9 medium with BCiP and with inductor, and to M9 with BCiP without inductor.
  • the activity of PhoN converts BCiP to a blue dye.
  • Clones in which the translation of the phoN gene is inhibited by asRNA remain whitish on M9 medium with BCiP with inducer, while they turn blue on M9 medium with BCiP without inducer.
  • the function of the phoP gene is necessary so that the bacteria can multiply in macrophages.
  • the clones of the p / .oP fragment bank are combined in a pool.
  • the pool is divided into two identical groups, which are passaged in J774A.1 macrophages.
  • the inducer becomes the culture medium during the infection Macrophages added.
  • the second group is passaged in J774A.1 macrophages without added inductor. (For a description of the infection experiment, see Example 1.)
  • the pCAl plasmids are prepared from both batches.
  • the CAI procedure is then used with a complete genomic fragment library in S. typhimurium.
  • the clones with the CAI fragment bank are tested according to the three methods (1-3) described above.
  • the H. pylori wild-type strain 69A serves as the starting strain.
  • the bacteria are grown on serum plates (see Westblom et al., 1 991) at a temperature of 37 ° C. in an atmosphere of 5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 .
  • the chromosomal DNA is isolated by the method of Leying et al. (1 992), the DNA finally being purified using a cesium chloride gradient.
  • chromosomal DNA 50 pg of the purified, chromosomal DNA is partially cleaved with the restriction endonucleases Sau3A and Hpall, the DNA fragments separated in an agarose gel and the fragments in a size of 3 to 6 kbp eluted from the gel using the Geneclean II kit (Bio1 01) .
  • the isolated DNA fragments are cloned into the BglII and Clal-cut pMin2 vector (Kahrs et al., 1 995) and transformed by electroporation into the E. coli strain E1 81, previously the Plasmid pTnMax9 was transferred. In total, approximately 4000 clones are generated using such an approach.
  • coli strain E1 81 is a derivative of the HB101 strain (Boyer and Roulland-Dussoix, 1 969) and contains the lysogenic ⁇ phage ⁇ CH61 6 for replication of the pTnMax9 plasmid.
  • Cysteine HC1 (C 3 H, NO.S x HCl x HO) 26 g Cocarboxylase 100 mg in 50 ml
  • L-Arginine HC1 150 mg (sterile filter, fill 13 mg portions in 10 ml p-aminobenzoic acid + freeze)
  • the transposon TnMaxS located on pTn axS is equipped with the genetic marker? -Lactamase. This marker is placed on the transposon in such a way that it enables the selection of successful transposon insertions if this is in the correct reading frame of genes whose products are secreted or exported by E. co // strain E145 nf .
  • the insertion of the transposon into such a gene leads to a gene fusion between the target gene and the marker, whereby an im
  • the fusion protein is ejected from the cell and the activity of the integral reporter gene is unfolded.
  • the clones can be directly via the
  • the gene bank transposon mutagenesis is carried out in pools of up to 20 individual clones.
  • the respective pools are plated on LB plates which are mixed with 100 pM IPTG, 15 pg / ml chloramphenicol and 15 pg / ml tetracycline.
  • the mutagenized pMin2 plasmids transferred via conjugation into the E. coli strain E1 45 r ⁇ f , since these are equipped with a corresponding mob signal (oril).
  • the pTn / WaxS plasmids are not transferred.
  • a specific duplication of the mutagenized pMin2 gene bank occurs in E. coli E 1 45 nf .
  • transconjugants are on LB medium with 1 5pg / ml chloramphenicol, 1 5pg / ml tetracycline and 100 pg / ml rifampicin selected.
  • a total of 500-1000 transconjugants are combined in 2 ml LB medium and grown in appropriate dilutions (10 ' 1-10 ⁇ 2 ) on LB plates which are mixed with 50 pg / ml ampicillin. After culturing the plates for 36 hours at 37 ° C., 200-300 ampicillin-resistant clones with transposon-inserted plasmids are obtained in the entire batch.
  • the TnMax3 mutated H. pylori genes coding for secreted / excreted polypeptides into an H. pylori wild-type strain
  • gene-specific mutants can be generated. Due to the cloned H. pylori gene sequences on the plasmids, in the event of a double homologous recombination event, the TnMaxS transposon is genomically inserted into the chromosomal target gene and thus inactivated. This process can be selected using the genetic marker on the transposon, since the pMin2 plasmid is not replicated in H. pylori.
  • the H. pylori wild-type strain 69A is transformed in individual batches with the individual plasmids obtained, taking advantage of the bacteria's natural competence to take up DNA (Haas et al., 1 993).
  • the bacteria are taken up in BHI medium and grown to an optical density at 550 nm of 0.1 at 37 ° C. under microaerophilic conditions.
  • the individual culture batches are each mixed with 100 to 500 ng of purified plasmid DNA and the culture is continued overnight. Characterization of the biological function of the gene-deficient H. pylori mutants in the growth test:
  • the individual batches are plated on serum plates which are mixed with 4pg / ml chloramphenicol.
  • three categories can be distinguished: (1) mutants that do not grow; (2) mutants that form smaller colonies; (3) mutants that develop normal colony size. These results can be reproducibly achieved for each starting plasmid.
  • the CAI method is used to clearly assess the biological importance of the genetically deficient mutants of category 1.
  • the gene-deficient mutants of category 2 and 3 are analyzed in the other biological test systems.
  • the respective starting plasmids from the E. coli strain are used to determine the primary structure of the identified H. pylori genes.
  • Plasmids are isolated from these strains and the nucleotide sequence of the
  • Target genes by sequencing the areas above and below the
  • Target gene can be determined directly since the transposon-encoded SS lactamase gene actively fuses with the gene product of the target gene
  • the Genebank database of the GCG program is used, for example for the identification of known, homologous genes of other microorganisms (FASTA), for identification potential signal peptide regions (SPSCAN) or for the identification of lipoproteins (MOTIFS).
  • FASTA homologous genes of other microorganisms
  • SPSCAN identification potential signal peptide regions
  • MOTIFS lipoproteins
  • the full gene sequence could not be determined for some of the identified clones, since the cloned DNA fragment did not contain the entire gene.
  • the available DNA fragment is used to isolate a DNA fragment with a complete gene from the original gene bank.
  • the missing gene sequences can then be amplified from these clones using a gene-specific primer and a vector-specific primer and then sequenced directly.
  • chromosomal DNA is isolated from the H. pylori strain 69A, 25-35 pg of which is partially digested with Bsp143l (Sau3AI-isoschizomer) and fragments of a size of 2 to 8 kbp are isolated.
  • the vector pACYCI 84 is cut with BamHI, dephosphorylated with shrimp alkaline phosphatase and then ligated with the isolated fragments. After transformation into E. coli strain 0466 and selection for 30 pg / ml chloramphenicol, 5560 individual colonies are isolated and analyzed using the polymerase chain reaction.
  • Primers for a product size of less than or equal to 700 bp are derived from the known gene fragments as closely as possible adjacent to the missing gene piece. These primers are used to produce amplification products which contain a clone which comprises both primer binding sites. The plasmids are then isolated from the positive clones and are verified either by sequencing or by dot blot analysis. Sequencing
  • the technique of primer walking is used to complete the DNA sequence of genes, which cannot be determined completely after the sequence reactions with the universal primers M 1 3F and M 1 3RP1.
  • an oligonucleotide binding approximately 50 to 200 bp upstream of the 3 'end of the known sequence section is derived and used as a primer for a further sequence reaction according to the dye terminator principle (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the dye terminator principle Amersham Pharmacia Biotech.
  • Mu052a 5'-AGGCTAAAGACGTGTTAG-3 '
  • Mu052b 5'-CTAGCGTGGAATTAGCC-3'
  • the gene sequences are heterologously expressed in attenuated Salmonella vaccine strains.
  • the polymerase promoter system of the bacteriophage T7 (Tabor & Richardson 1 985) is used for this.
  • the gene to be expressed is amplified by polymerase chain reaction (PCR) with specific oligonucleotide primers from chromosomal DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the selection of the gene-specific oligonucleotide primers depends on the presence of a signal peptide for the sea-dependent translocation of the gene product into the periplasm. If there is one, the oligonucleotide primer pair is chosen to amplify a fragment of the gene to be expressed which encodes the mature protein without signal peptide. If there is no signal sequence, the entire open reading frame is amplified.
  • the amplified gene fragments are inserted into a plasmid vector derived from pBR322.
  • the insertion takes place in such a way that the cloned
  • RGSHis 4 coding sequence section under the transcriptional control of the T7 bacteriophage promoter The expression of the gene products is investigated in the Salmonella typhimurium vaccine strain SL3261 :: pYZ84 (Yan & Meyer 1 996), which is transformed with the expression vectors prepared in the manner described above.
  • the RGSHis 4 fusion proteins are detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and then Western blot analysis with a monoclonal antibody (RGS.His) specific for the RGSHis 4 epitope. Expression cloning is used as an example using the gene sequence H PC001 with subsequent Western blot analysis.
  • the gene fragment of the hpcOOl gene which codes for the mature HPC001 protein (without signal peptide), using the oligonucleotide primers LAT50 (5'-GATCAGATCTACATATGTTTATCATTCCCTCTCGC-3 ') and LAT51 (5'- GATCGGTACCAAAACTCT) amplified by means of PCR.
  • LAT50 5'-GATCAGATCTACATATGTTTATCATTCCCTCTCTCGC-3 '
  • LAT51 5'- GATCGGTACCAAAACTCT
  • the 0.9 kb amplicon is hydrolyzed using Bgl ⁇ and Acc65 ⁇ and inserted into the vector pLAT289 hydrolyzed with Bam ⁇ ⁇ ⁇ and Acc65 ⁇ .
  • the resulting expression vector pMSC34 codes for a fusion protein which consists of the hpcOOl gene which lacks the signal sequence of HPC001 and the RGSHis epitope.
  • the expression product has a molecular mass of 34 kDa.
  • the experimental conversion of the spiral Helicobacter form into a coccoid form can be done in different ways.
  • the conversion can be observed under stress conditions, for example in the presence of sublethal doses of an effective antibiotic, in the absence of a substrate or in a normal air atmosphere.
  • the conversion process can thus be understood as a protective reaction of the bacteria.
  • these shapes can also be found in tissue watch infected people. It may be a form of persistence. Loss or the delayed or incomplete expression of this property, for example by dropping or inactivating a gene or gene product, can have fatal disadvantages for the bacterium in the struggle for survival.
  • the experimental conversion of the spiral Helicobacter into a coccoid form is usually started from a fresh plate culture that was grown under ideal conditions (serum plates, 37 ° C, microaerophilic atmosphere (5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 )) and therefore mainly contains spiral Helicobacter.
  • the harvested bacteria are transferred to a minimal medium that consists of water, eg sterilized tap water, and x% (v / v) of a complex protein solution, eg fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • the bacteria are cultivated in a defined number, for example with an OD 550 of 0.2, in 5 ml of minimal medium at 37 ° C. in a cell culture cabinet, the CO 2 content in the air being adjusted to 10%.
  • the progressive development process is documented microscopically and through growth determinations.
  • Microscopically, in phase contrast, the morphology (coccoid _ spiral) and the mobility (coccoid + immobile; spiral + movable; spiral + immobile) of the bacteria in the culture batch is determined in part, e.g. B. in a counting chamber.
  • specific staining is carried out in order to indirectly detect structural changes, for example in the bacterial shell, or to determine the proportion of dead germs. Since cocoidal forms do not grow on conventional media, for example serum plates, the proportion of vital or still reactivable state forms (colony forming units; CFU) can be determined at different times. Reactivation of coconut forms.
  • the coccoid bacteria are activated in a medium which is described in EP 0900839.
  • the bacteria are in a defined number, e.g. 500 - 1,000 bacteria, plated on this medium and incubated under microaerophilic conditions at 37 ° C for several days. In this approach too, the development process is documented microscopically (see above) and by determining the CFU.
  • the coccoid forms produced are administered in a defined number, for example 10 8 bacteria, to a mouse, for example Balb / c, orally in an aqueous solution, for example using a gastric tube.
  • a certain time for example after 2-4 weeks, the infected animals are sacrificed, the stomach is removed, the contents are removed and histologically and by growth tests (see above) are examined for colonization.
  • the proportion of coccoid and spiral bacteria can be determined in the histological examination.
  • the experiment should preferably be carried out with Type I Helicobacter strains because the Type II strains are less virulent.
  • the described biological systems can be used, for example, for the analysis of defined Helicobacter mutants which were produced using the described methods. The investigation is carried out in each case in comparison to the respective wild-type strain. If, for example, a mutant is not able to convert to the coccoid form, or if the coccoid form does not reactivate or if the conversions occur with great delays, one can do so for the mutated gene optional essential function can be derived. When reactivating coccoid forms in animal models, several mutants can be used at the same time per test batch, for example 10 strains. The prerequisite is that the recognition of these strains in the tissue is ensured by suitable methods, for example by appropriate PCR methods or by in situ hybridization.
  • Tn ⁇ tad a derivative of transposon Tn5 that generates conditional mutations.
  • mice with urease vaccine affords protection against Helicobacter pylori infection in the absence of antibodies and is mediated by MHC class ll-restricted responses. J. Exp. Med. 1 88 (2): 2277-2288.
  • McPC603scFvDhlx in cell-wall-less L-form strains-of Proteus mirabilis and Escherichia coli a comparison of the synthesis capacitites of L-form strains with an E. coli producer strain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 51-58.
  • Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell death. Infect Immun 65: 3672-3679.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von therapeutischen, präventiven oder/und diagnostischen Mitteln gegen mikrobielle Infektion und zur Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene aus <i>Helicobacter pylori</i>. Weiterhin betrifft sie die identifizierten Nukleinsäuren, welche für die essentiellen Genprodukte kodieren, und die davon kodierten Polypeptide.

Description

Essentielle Gene und Genprodukte zur Identifizierung, Entwicklung und Optimierung von immunologischen und pharmakologischen Wirkstoffen zur Behandlung mikrobieller Infektionen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene von pathogenen Mikroorganismen, deren Verwendung zum Auffinden neuer immunologischer und pharmakologischer Wirkstoffe zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose bakterieller Infektionen, sowie die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Wirkstoffe. Von der Erfindung eingeschlossen sind die entsprechenden Nukleinsäuren, welche für die essentiellen Genprodukte kodieren, und die davon kodierten Polypeptide. Außerdem betrifft die Erfindung Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, mit diesen Vektoren transformierte Zellen und für die Polypeptide spezifische Antikörper. Diese Nukleinsäuren und Polypeptide können zur Diagnose, Prävention und Behandlung von mikrobiellen Infektionen eingesetzt werden, insbesondere können sie zur Entwicklung von Antikörpern, Impfstoffen und Inhibitoren verwendet werden.
Die vollständige molekulare Erschließung des Genoms des Menschen und klinisch relevanter Pathogene öffnet neue Wege in der Entwicklung von Therapeutika bzw. Prophylaktika gegen die Krankheiten des Menschen. So ist die Entschlüsselung des menschlichen Genoms für die nächsten Jahren angekündigt. Die Anzahl molekular vollständig charakterisierter pathogener Keime nimmt ständig zu. Das erklärte Ziel ist es nun, aus dem umfangreichen Datenmaterial solche Gene zu identifizieren, deren Produkte als potentielles Ziel für einen Wirkstoff in Frage kommen und somit für die Entwicklung eines spezifischen Wirkstoffs benutzt werden können. Dieses Potential läßt sich aus der Primärstruktur eines Gens nicht ableiten, sondern muß experimentell bestimmt werden.
Liegt die komplette genomische Sequenz eines Organismus vor, steht man vor dem Problem, die enorme Datenmenge für weiterführende biologische Analysen zugänglich zu machen. Der erste Schritt ist die Identifizierung aller auf dem Genom liegenden Gene. Dies geschieht in der Regel mit Hilfe computergestützter Suchprogramme, die mit einer gewissen Sicherheit potentielle Gene vorhersagen können. Auf diese Weise können Genkarten erstellt werden, dieallerdings noch mit einer großen Ungenauigkeitbehaftet sind. Können die vom Suchprogramm ausgewiesenen Gene keinem bekannten Gen zugeordnet werden, muß die Funktionalität dieser hypothetischen Gene durch den physikalischen Nachweis der Genprodukte in der ursprünglichen Zelle nachgewiesen werden.
Eine andere Strategie, die ebenfalls auf der Anwendung spezieller Suchprogramrne beruht, ist auf die Identifizierung möglicher Genfamilien ausgerichtet, die mit speziellen biologischen Eigenschaften verknüpft sind, die wiederum aufgrund weiterer Annahmen als Wirkstoffziel in Betracht kommen. Die Suchkriterien sind auf charakteristische Strukturmerkmale ausgerichtet, die in der Regel von schon bekannten Genen abgeleitet wurden. Das Ergebnis einer solchen Suche kann, in Abhängigkeit von der Annäherung der Vorgaben zum wirklichen Zustand, eine hohe Trefferquote liefern. In der Regel ist die Ungenauigkeit dieser Verfahren jedoch relativ hoch, und die wirkliche biologische Eigenschaft des Gens bzw. dessen Genprodukts muß auf jeden Fall experimentell bestätigt werden.
Eine weitere Strategie erfaßt die Expressionsprodukte einer Zelle, wodurch die zum jeweiligen Entwicklungszustand aktiven Gene identifiziert werden können. Vergleicht man verschiedene Entwicklungszustände miteinander, kann auf diese Weise das Zusammenwirken der Gene abgeleitet werden und in einigen Fällen kann die biologische Funktion unbekannter Gene teilweise entschlüsselt werden. Führt man entsprechende Vergleichsuntersuchungen mit Zellen durch, die ein pathologisches Erscheinungsbild haben, ist es sogar möglich auch krankheitsverursachende Gene zu identifizieren und diese als potentielle Wirkstoffziele für die Wirkstoffentwicklung einzusetzen.
Alle beschriebenen Verfahren dienen insbesondere dazu, bislang unbekannte Gene zu identifizieren und diesen mit Hilfe Computer-gestützter Datenvergleiche eine biologische Funktion zuzuordnen. Eine eindeutige Bewertung eines Gens bzw. Genprodukts hinsichtlich seines Potentials als Wirkstoffziel zu dienen und somit für die Entwicklung von Wirkstoffen herangezogen werden zu können, erfüllt jedoch keines der bekannten Verfahren.
Einige der wichtigsten Voraussetzungen für einen pathogenen Organismus, in einem Wirt zu überleben und sich zu vermehren, sind einerseits die Fähigkeit, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen, und andererseits die Fähigkeit zur Anpassung an einen ganz speziellen Lebensraum oder Nische. Die dafür verantwortlichen Faktoren und Proteine sind somit in der Regel essentiell für den pathogenen Keim.
Es wäre von großem Vorteil, diese essentiellen Gene von Mikroorganismen zu identifizieren, um auf diese Weise die Möglichkeit zur Herstellung von therapeutischen, präventiven oder/und diagnostischen Mitteln, z.B. Antikörpern, Impfstoffen oder Inhibitoren der entsprechenden Polypeptide zu bekommen.
Ein Pathogen von besonderem medizinischen Interesse ist Helicobacter pylori. Dieser Keim ist ein Gram-negatives, spiralförmiges Bakterium mit hohem pathogenen Potential, das in den letzten Jahren verstärkt Resistenzen gegen eine Reihe therapeutisch relevanter Antibiotika entwickelt hat und somit von großer klinischer Bedeutung ist. Es zeichnet sich durch extrem hohe Beweglichkeit aufgrund seiner Flagellen und der ungewöhnlichen Fähigkeit, im stark sauren Milieu (bis pH 1 ,5) des Magens überleben zu können, aus (Goodwin et al., 1 989).
Obgleich das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen Magenschleimhaut seit langem bekannt ist, weiß man erst seit der erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums (Warren and Marshall 1 983; Marshall et al., 1 984) aus der Magenschleimhaut eines Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi), daß es sich hierbei um pathogene Keime handelt. Die H.py/or -lnfektion zählt zu den häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen. Sie tritt weltweit auf, wobei ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert sind.
Eine Infektion führt zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis (Typ-B Gastritis) beim Menschen. Ferner geht man davon aus, daß H. ylori auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) sowie bei einigen Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom) spielt (Lee et al., 1 993; Solnick und Tompkins, 1 993) . In zwei Studien von 1 991 wurde eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der r/.py/ort'-lnfektion und dem Auftreten des Magenkarzinoms (intestinaler Typ) gezeigt, wobei beide Studien zu dem Schluß kamen, daß ca. 60% aller auftretenden Magenkarzinome wahrscheinlich auf eine /-/.py/ort-lnfektion zurückzuführen sind (Parsonnet et al., 1 991 ; Nomura et al., 1 991 ). Auch die seltener auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des Magens, die als Vorstufen von B-Zell-Tumoren des Immunsystems angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der .py/or/-lnfektion. Eine Folge der Langzeitinfektion mit H. ylori ist die atrophische Gastritis, eine Degeneration der Schleim, Säure oder Pepsin produzierenden Zellen des Magenepithels, die als eine präkanzeröse Läsion angesehen werden muß.
Nach der oralen Aufnahme gelangen die Bakterien zunächst in das extrem saure Magenlumen (pH 1 bis 2). Dort wird durch die Produktion des Enzyms Urease, das zur Spaltung des vorhandenen Harnstoffs und damit zur lokalen Neutralisierung des sauren pH-Wertes im Magen führt, was das Überleben der Bakterien ermöglicht. Mittels chemotaktischer Orientierung und flagellenabhängiger Motilität bewegen sich die Keime dann in die Bicarbonat-gepufferte Schleimschichtder Antrum-Region des Magens, ihren eigentlichen natürlichen Habitat. Dort befinden sie sich in einer einzigartigen ökologischen Nische, die aufgrund der Säurebarriere nur für wenige konkurrierende Bakterienarten zugänglich ist. Vermutlich orientieren sich die Bakterien an den pH-Gradienten zwischen Lumen (pH 1 -2) und Epithelzelloberfläche (pH 6-7), um zum Epithel zu gelangen. Durch ihre spiralige Form, ihre Beweglichkeit im viskosen Schleim, die Produktion von Mukus-modifizierenden Enzymen und schließlich durch eine mikroaerophile Lebensweise sind diese Keime optimal an die Lebensbedingungen in diesem Habitat angepaßt. Sie halten sich meist in den tiefen Krypten der Antrum- Region auf, wo sie vor äußeren Einflüssen wie z.B. Säure, Pepsin aber auch vor Medikamenten zu ihrer Eradikation, wie z.B. Antibiotika, geschützt sind. Ein Teil der Bakterienpopulation (ca. 20%) ist eng mit Epithelzellen assoziiert, vor allem mit Schleim produzierenden Zellen. Unter der Voraussetzung einer gastralen Metaplasie, d.h. der säureinduzierten Ausbildung von gastralem Epithel im Duodenum, kommt es auch zur Kolonisierung metaplastischer Areale im Zwölffingerdarm, wodurch die Voraussetzungen zur Entstehung des Zwölffingerdarmgeschwürs (Ulcus duodeni) geschaffen sind. Durch ihre Fähigkeit zur Adhärenz wird vermutlich eine komplette Ausscheidung der Helicobacter mit dem abgestoßenen Schleim verhindert, so daß die Bakterien für Jahre, Jahrzehnte oder gar lebenslang persistieren können (chronische Infektion) .
Bevor die Existenz und die Bedeutung des H. ylori für die Ulkuserkrankungen bekannt waren, wurden diese durch sog. Antazida, oder H2-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen, welche die Säuresekretion der Magenparietalzelle inhibieren. Unter dem Einfluß dieser Arzneimittel kommt es zwar zumeist zur Abheilung von Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die p /or/-lnfektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv) .
Eine weitere, häufig bei Ulzerationen angewandte Therapie ist die Wismut- Behandlung. Verschiedene Wismut-Salze (CBS, BSS) haben einen bakteriziden Effekt auf H. pylori. Ein bedeutender Nachteil dieser Therapieform ist jedoch, daß eine totale Eradikation des Keims nur in einem sehr geringen Prozentsatz der Fälle erreicht wird (8 bis 32%) . Wie bei der Behandlung mit Antazida kommt es nur zu einer vorübergehenden Suppression des Keims, und nach Absetzen der Behandlung erfolgt in den meisten Fällen wieder ein Aufflackern der Infektion. Ein weiterer Nachteil der Wismut-Behandlung ist, daß eine länger dauerende Therapie mit hohen Dosen zu einer Akkumulation dieser Substanz in der Leber, Niere und dem Nervensystem führt und beträchtliche neurologische Nebenwirkungen hat (Malfertheiner, 1 994).
Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, werden zur Behandlung nun auch Antibiotika eingesetzt. Die Monotherapie mit verschiedenen Antibiotika (Amoxicillin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin und dergleichen) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es auch hier nur bei 0 bis 1 5 % der Zellen zur kompletten Eradikation der Keime kommt. Die bisher erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine Kombination eines Säureblockers (Ompeprazol) mit einem Antibiotikum (Amoxicillin) erreicht, die zu Eradikationsraten bis zu 80% führen kann (Malfertheiner, 1 994). Auf die Dauer ist eine Antibiotikabehandlung zur Eliminierung von H. ylori 'jedoch nicht erfolgversprechend, da aufgrund der unvollständigen Eradikation des Keims mit einer raschen Resistenz- entwicklung der Bakterien gegen Antibiotika gerechnet werden muß. Das zunehmende Auftreten von Antibiotika-Resistenzen und die eingeschränkten Behandlungsoptionen, die in der Regel beträchtliche unerwünschte Nebenwirkungen haben, macht das Auffinden neuer Therapieformen und dabei insbesondere die Identifizierung neuer Wirkstoffe notwendig, vor allem Impfstoffe, die sowohl zur prophylaktischen, als auch therapeutischen Behandlung von verwendet werden können. Von besonderem Interesse ist auch die Darreichungsform, da der Wirkstoff im Magen, d. h. in einem extrem sauren Milieu wirksam sein muß. Verbindungen mit Protonenblockern, die z. B. vor der Verabreichung des prophylaktischen oder therapeutischen Wirkstoffs gegeben werden, können hierbei von großem Nutzen sein.
Die molekulare Grundlage für persistierende, chronische Helicobacter- Infektionen ist bislang noch nicht geklärt. Es konnte gezeigt werden, daß die Faktoren Urease, Beweglichkeit und Adhärenz essentielle Eigenschaften des Bakteriums sind, die gastrische Mukosa kolonisieren zu können. Obgleich der Wirtsorganismus unter normalen Bedingungen nicht in der Lage ist, mit einer /- .py/or/'-Infektion fertig zu werden, zeigte sich im Tiermodell, daß die Urease, ein essentieller Virulenzfaktor von H. ylori, ein hohes Potential als Vakzin besitzt (US-Patentanmeldung US-SN-07/970,006 "Urease-based Vaccine Against Helicobacter Infection).
Diejenigen Komponenten jedoch, die dafür verantwortlich sind, daß das Pathogen das Immunsystem des Wirtes umgehen kann, sind bisher noch unbekannt.
Pathogene Organismen im Allgemeinen haben eine Vielzahl von Strategien entwickelt, im Wirt über einen langen Zeitraum vom Immunsystem unbehelligt persistieren zu können (Haas und Göbel, 1 992; Finlay und Falkow, 1 997). Ein Mechanismus, der zum Überleben in lebensfeindlichem Milieu dient, ist die Ausbildung einer Überdauerungsform. lm Falle von H. pylori sind in der Literatur kokkoide Formen als potentielle Überdauerungsformen mehrfach beschrieben, ihre klinische Bedeutung ist allerdings umstritten. Kokkoide Formen könnten für eine ex vivo Überdauerung eine große Rolle spielen. Hinsichtlich der in vivo Überdauerung wurde gezeigt, daß kokkoide Formen bevorzugt durch ein ungünstiges Milieu wie z. B. einen hohen O2-Partialdruck oder subletale Gaben von Antibiotika (Wismut-Subcitrat, Erythromycin, Amoxicillin, Metronidazol) induziert werden (Donelli et al., 1 998; Bode et al., 1 993; Sorberg et al., 1 996; Berry et al., 1 995) .
Einige Forscher gehen davon aus, daß diese kokkoiden Bakterien lebensfähig, aber nicht kultivierbar sind (VNC, viable but non-culturable) . Eaton und Mitarbeiter erhielten eine erfolgreiche Infektion von Mini- Schweinchen mit vegetativen (spiraligen) H. pylori, während kokkoide Formen in diesem Modell keine Infektion zeigten (Eaton et al., 1 995) . Der direkte Nachweis von kokkoiden Formen im menschlichen Magen wurde von Chan et al. anhand von Magengewebeschnitten aus Biopsiematerial erbracht. In 82.8 % (53/64)der untersuchten Biopsieproben konnten die Autoren kokkoide Formen von H. pylori nachweisen (Chan et al, 1 994) . Von Cao et al. wurde ein monoklonaler Antikörper zum spezifischen Nachweis von kokkoiden H. pylori im Gewebeschnitt benutzt. Auch hier wurden neben den vegetativen Formen in 100 % der Antrumbiopsien (9/9) H. pylori kokkoide Formen nachgewiesen (Cao et al., 1 997).
Die Bindung an Epithelzellen und die Fähigkeit zur Signaltransduktion (IL-8- Induktion, Rearrangement des Zytoskeletts, Bindung von Plasminogen, Laktoferrin und Vitronectin auf der Bakterienoberfläche) scheint bei kokkoiden Formen vergleichbar zu den vegetativen Formen erhalten zu sein (Khin et al., 1 996; Segal et al., 1 996).
Die oben genannten Experimente deuten auf eine Bedeutung kokkoider Formen für die Überlebensfähigkeit von Helicobacter \r\ ungünstigem Milieu hin. Daher ist die Identifizierung von Genen, die mit der Entstehung dieser Form und Reaktivierung in die vitale Form zusammenhängen, für die Entwicklung neuer Wirkstoffe von größtem Interesse.
Neben Helicobacter pylori können auch andere Helicobacter Spezies den Magen des Menschen kolonisieren wie z. B. H. heilmannii und H. felis. Diesbezüglich konnte gezeigt werden, daß auch H. heilmannii mit krankhaften Ulkuserkrankungen in Zusammenhang gebracht werden kann. Die ursächliche Übertragung findet wahrscheinlich von Haustieren auf den Menschen statt. Bislang wurde der im Menschen häufig vorkommende H. ylori \n den Verdacht gebracht, bei der Entstehung von Magenkrebs eine Rolle zu spielen. Mittlerweile gibt es klinische Daten, die diesen Zusammenhang anzweifeln. Besonders werden diese Zweifel durch neuere Daten von Helicobacter heilmannii unterstützt, die diesem ein größeres kanzerogenes Potential beimessen und dessen Bedeutung bei der Entstehung des gastrischen MALT Lymphoms hervorherben (Regimbeau et al., 1 988) .
Wird das bisher Gesagte zusammenfassend betrachtet, ist es klar, daß ein Bedürfnis nach neuen Therapieformen für die Bekämpfung bakterieller Krankheitserreger, insbesondere nach Impfstoffen und Inhibitoren von essentiellen Genen bzw. deren Expressionsprodukten besteht. Die zunehmende Resistenzentwickung gegen eine Vielzahl bewährter Medikamente erfordert eine kontinuierliche Versorgung mit neuen Wirkstoffen. Dieser steigende Bedarf an neuen Wirkstoffen kann nur gedeckt werden, wenn neue Wirkstoffziele identifiziert und diese zur Entwicklung neuer Wirkstoffe herangezogen werden. Essentielle Gene stellen für die Wirkstoffentwicklung ein ideales Ziel dar, da sie für das Überleben des Krankheitserregers notwendig sind.
Die Identifizierung essentieller Gene von Helicobacter, insbesondere von H. ylori bzw. heilmannii und von möglichen Helicobacter Überdauerungsformen zur Entwicklung und Optimierung neuer therapeutischer, präventiver und/oder diagnostischer Mittel, wie z. B. Impfstoffe und pharmakologischer Wirkstoffe stellt daher ein Ziel der Erfindung dar. Im Vordergrund steht das Auffinden essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert werden. Bei Helicobacter stehen insbesondere Gene im Vordergrund, die lebensnotwendige Funktionen im Infektionsprozeß erfüllen, sowie Gene, die an der Entwicklung und Reaktivierung von kokkoiden Formen beteiligt sind. Von besonderem Interesse sind hierbei essentielle Gene, die für sekretierte Genprodukte kodieren, da diese für immunologische und pharmakologische Wirkstoffe aufgrund ihrer exponierten Lokalisation besonders gut erreicht werden können und daher gute Kandidaten zur Wirkstoffentwicklung sind. Weiterhin von Interesse sind essentielle Gene, die für Genprodukte kodieren, die an der Entwicklung und der Aufrechterhaltung von Überdauerungsformen beteiligt sind. Eine weitere Aufgabe ist das Auffinden essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert werden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis, zur Therapie oder/und zur Prävention von mikrobiellen Infektionen, das die folgenden Schritte umfaßt:
(A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebens- und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen in einem
Testsystem. (B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktiviertung der Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.
(C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln,
(D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.
Das hier dargestellte Verfahren befaßt sich mit der Identifizierung essentieller Gene und deren Verwendung zur Entwicklung neuer Wirkstoffe.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren zum Identifizieren von essentiellen mikrobiellen Genen, das die folgenden Schritte umfaßt:
(i) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen,
(ii) Bestimmen der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i), (iii) Identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defiziert sind und (iv) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiell für die
Überlebensfähigkeit sind.
CAI ist die Abkürzung für „conditional antisense inhibition", d.h. konditionale Antisensehemmung . Es handelt sich hierbei um ein Verfahren, welches weiter unten näher beschrieben ist.
SRM steht für „subtractive recombination mutagenesis", d.h. subtraktive Rekombinationsmutagenese und ist ebenfalls unten beschrieben. Der Ausdruck "gendefizient", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der defiziente Organismus nicht in der Lage ist, ein oder mehrere seiner Genprodukte herzustellen oder deren Funktion zu nutzen. Die Herstellung des entsprechenden Genprodukts kann einerseits durch Mutagenese des entsprechenden Gens verhindert werden, oder es kann eine Inhibition während der Expression stattfinden, z.B. durch Antisensenukleinsäuren. Eine Mutagenese kann dazu eingesetzt werden, ein Gen in dem Genom des Mikroorganismus zu mutieren, oder dazu, ein mutiertes Gen in den Mikroorganismus einzubrigen, wobei man sich auch die homologe Rekombination zunutze machen kann.
Ein proteinkodierender Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz ist beispielweise ein Gen oder ein Teil eines Gens das/der die Expression eines Polypeptids erlaubt.
Der Begriff "essentielles Gen" bedeutet ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, ohne welches ein Organismus nicht überlebensfähig ist oder nur beschränkt überlebensfähig ist. Essentielle Gene können in zwei Klassen unterteilt werden: obligat essentielle und fakultativ essentielle Gene. Ein obligat essentielles Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder die Vermehrung eines Organismus unter allen Umständen unabdingbar ist. Demgegenüber kodiert ein fakultativ essentielles Gen für ein Protein, das lediglich unter bestimmten Bedingungen für das Überleben oder die Vermehrung des Organismus notwendig ist, wie z.B. die Fähigkeit des Organismus, innerhalb von kultivierten Säugerzellen oder im Tier zu überleben. In beiden Fällen wird das Überleben oder die Vermehrung des Organismus durch die Inaktivierung eines für ihn essentiellen Gens bzw. die Inhibierung eines für ihn essentiellen Genproduktes stark beeinträchtigt bzw. verhindert. Ist ein Bakterium nach der Inaktivierung eines bestimmten Gens nicht mehr überlebensfähig bzw. in der Vermehrung eingeschränkt, kann dies als erster Hinweis dafür gewertet werden, daß durch dieses Gen essentielle Eigenschaften vermittelt werden. Die Aussagekraft solcher Befunde muß jedoch durch begleitende Kontrollexperimente untermauert werden, z.B. sollte eine solche letale Mutation in einem zweiten Schritt durch eine entsprechende Komplementation des Gens bzw. Genprodukts aufgehoben werden können. Obligat essentielle Gene sind demnach solche, deren Nichtexpression oder NichtVorhandensein, z.B. durch Mutagenese oder Deletion dazu führt, daß der Organismus weder in natürlicher Umgebung, noch auf einem ideal auf die Bedürfnisse des Mikroorganismus abgestimmten Vollmedium lebensfähig ist. Ist ein Mikroorganismus in einem fakultativ essentiellen Gen defizient, ist er in der Regel auf einem solchen je nach Organismus definierten Vollmedium noch wachstumsfähig, kann jedoch in natürlicher Umgebung, d.h. in seinem natürlichen Wirt oder Zellen oder Gewebekulturen seines natürlichen Wirtes nicht mehr überleben.
Identifizieren von essentiellen Genen
Durch das neue Verfahren können unabhängig von ihrer speziellen Funktion essentielle Gene von Mikroorganismen identifiziert werden. Bevorzugt wird dieses Verfahren zur Identifizierung von essentiellen Genen aus Helicobacter und verwandten Mikroorganismen eingesetzt.
In einem ersten Teilschritt wird das komplette Genom eines bakteriellen Krankheitserregers mit einem molekulargenetischen Ansatz nach essentiellen Genen durchsucht. Dieser Teilschritt erfordert keinerlei Kenntnisse über die Primärstruktur des Genoms bzw. individueller Gene, sondern erfolgt ausschließlich aufgrund biologischer Kriterien. Ist ein Gen als essentielle Determinante identifiziert, wird dessen Identität ermittelt. Hierbei kann auf die ermittelten Rohsequenzdaten der genomischen Sequenzierungen zurückgegriffen werden. Anhand der ermittelten Gensequenz können z. B. isogene Varianten ermittelt werden bzw. ob sich das ermittelte Gen in einem Operon befindet, in dem sich möglicherweise weitere essentielle Gene befinden. In einem zweiten Teilschritt werden die identifizierten Gene in spezielle genetische Systeme überführt, die dazu dienen die Gene bzw. deren Genprodukte einem direkten Wirkstoff-Screening zuzuführen und/oder die Gene bzw. Genprodukte dazu verwendet, bereits identifizierte Wirkstoffe weiter zu optimieren. Der wesentliche Vorteil des Gesamtverfahrens beruht auf der rasch aufeinanderfolgenden Ausführung des Gen- und Wirkstoff- Screenings in aussagekräftigen biologischen Systemen, so daß in relativ kurzer Zeit aus dem kompletten Gensatz eines pathogenen Mikroorganismus die potentiellen Wirkstoffziele identifiziert, produziert und diese direkt zum Wirkstoff-Screening bzw. Optimierung eingesetzt werden können.
Falls ein Mirkoorganismus untersucht wird, dessen Genom bereits sequenziert ist, kann die Identifizierung eines Gens oder Genabschnitts mit Hilfe von Datenbankanalysen erfolgen, wobei einem Sequenzabschnitt ein Leserahmen zugeordnet wird. Bevorzugt kann jedoch unabhängig vom Vorhandensein einer vollständigen Genomerzeugung eine beliebige Genbank einer Vorselektion unterzogen werden. Dabei kann bevorzugt die Vorselektion auf Gene durchgeführt werden, die für Polypeptide mit einer bestimmten Funktion kodieren, zum Beispiel mit Hilfe von Homologieanalysen. Die Vorselektion kann auch auf Gene durchgeführt werden, die nur in bestimmten Entwicklungsstufen exprimiert werden.
Im Rahmen des ersten Teilschritts kann durch Selektionsschritte eine starke Reduktion des zu untersuchenden Genmaterials erzielt werden. Z.B. durch einen Anreicherungsschritt für Gene, die für exportierte oder sekretierte Genprodukte kodieren. In diesem speziellen Verfahren werden die DNA- Abschnitte einer Genbank von einem Pathogen mutagenisiert, was beispielsweise durch Klonieren eines solchen DNA-Abschnitts in ein Plasmid, Transformation in einen bevorzugt heterologen Wirtsorganismus und anschließende Mutagenese erfolgen kann. Das daraus entstandene Expressionsprodukt kann dann nachgewiesen werden. Die Mutagenese kann beispielsweise durch Insertion einer Markersequenz erfolgen, welche bei Expression der mutagenisierten Sequenz in einem Wirtsorganismus zu einem Fusionspolypeptid führt, auf das selektiert werden kann. Die Insertion der Markersequenz ist nicht auf Transposoninsertion beschränkt, sondern kann auch auf andere Art und Weise erfolgen, beispielsweise durch homologe Rekombination oder Infektion und Rekombination mit Hilfe von Bakteriophagen.
Die verwendete Markersequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist im allgemeinen ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, das eine Selektion auf diejenigen Wirtsorganismen erlaubt, welche diese Sequenz exprimieren. Im allgemeinen handelt es sich bei diesen Markersequenzen um Resistenzgene, die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika verleihen, oder welche es dem Wirtsorganismus erlauben, in einem Selektionsmedium zu überleben und sich zu vermehren. Der Genmarker besitzt bevorzugt keine eigenen Expressionssignale, sondern ist direkt abhängig von einem vorgeschalteten Promoter, wie z.B. dem Transkriptionspromotor auf dem Promotersegment oder ein Promoter, der auf dem klonierten heterologen zu identifizierenden DNA-Fragment liegt. Alternativ zu Antibiotikaresistenz-Markersequenzen können auch Enzyme als Genmarker eingesetzt werden. In diesen Fällen wird die erfolgreiche Insertion durch eine bestimmte biochemische Reaktion, wie z.B. eine Farbreaktion, angezeigt, welche die manuelle Isolierung des entsprechenden Bakterienklons erlaubt.
Wenn die Markersequenz als Fusionsprotein mit dem Expressionsprodukt des inserierten DNA-Fragments exprimiert wird und eine Selektion wie oben beschrieben durchgeführt wird, kann DNA-Material aus den selektierten Bakterienklonen isoliert werden und die DNA-Sequenz, die für das Fusionsprodukt kodiert, nach bekannten Verfahren bestimmt werden. Dies erlaubt die Zuweisung eines Leserahmens zu dem zu identifizierenden DNA- Fragment. Es ist dann möglich, Vergleichsstudien mit allgemein verfügbaren DNA-Sequenzdatenbanken durchzuführen, um die Identität des identifizierten Gens abzuklären und gegebenenfalls Hinweise auf eine biologische Funktion zu erlangen.
Durch technische und weitere Ergänzungen der beiden unten dargestellten Verfahren, CAI und SRM, kann eine zielgerichtete Reduktion des Probenvolumens erreicht werden. Dabei handelt es sich ebenfalls um vorgeschaltete Selektionsverfahren, die auf bestimmte Gengruppen abzielen, z.B. der Einsatz subtraktiver Genbanken von pathogenen und apathogener Vertretern. Hierbei werden pathogenitätsvermittelnde Genbereiche angereichert. Derartige Subtraktionsverfahren können auch angewendet werden, um für bestimmte Organismen spezifische Gene zu identifizieren, beispielsweise durch einen Vergleich und Subtraktion der Genomen von H. ylori und H. heilmannii.
In weiteren Verfahren können z.B. Gengruppen identifiziert werden, die nur in einem bestimmten Entwicklungsschritt exprimiert werden. Hervorzuheben ist beispielsweise das Array-Verfahren, bei dem die einzelnen Genproben des Pathogens rasterförmig auf einen Träger aufgebracht werden. Die einzelnen Auftragspunkte sind bekannt, so daß bei einer positiven Hybridisierungsreaktion mit den entwicklungsspezifischen Transkriptionsprodukten oder cDNAs oder subtraktiven cDNAs oder Fragmente davon, die jeweiligen Gene identifiziert und anschließend kloniert werden können. Andere Verfahren, die entwicklungsspezifische Gengruppen erfassen, sind vergleichende Proteom- und Differential-Display-Analysen.
Um herauszufinden, ob es sich bei den identifizierten Gensequenzen um essentielle Gene handelt, werden Mikroorganismen hergestellt, welche in den Sequenzen defizient sind, welche den identifizierten Gensequenzen entsprechen. Die defizienten Mikroorganismen werden dann auf verschiedenen Wachstumsmedien bzw. Zellkulturen oder im Tiermodell oder im natürlichen Wirt getestet, und die defizienten Gene können dann je nach Wachstumsfähigkeit einer Kategorie der nicht essentiellen, obligat essentiellen oder fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.
Auf die Bedeutung von Genen, welche die Entwicklung aus der vitalen in die Überdauerungsform und umgekehrt steuern, ist bereits eingangs hingewiesen worden. Es ist daher besonders bevorzugt, eine Vorselektion auf solche Gene durchzuführen. Im Weiteren können Verfahren wie CAI oder SRM angewendet werden und die gendefizienten Mikroorganismen dann auf bestimmten Nährmedien untersucht werden, welche den Übergang von der einen in die andere Form auslösen. Bei Helicobacter ist insbesondere das Schivo-Medium bevorzugt, welches die Reaktivierung der kokkoiden Form in die vitale spiralige Form ermöglicht.
Die Erzeugung von defizienten Mikroorganismen kann auf mehrere Arten erfolgen.
Es stehen eine Reihe von molekulargenetischen Verfahren zur Verfügung, das Genom eines bakteriellen Pathogens so zu mutagenisieren, daß von jedem Gen eine Mutante zur Verfügung steht. Die gängigste Mutagenesemethode beruht auf der Inaktivierung von Genen, z. B. durch zufällig im Genom inserierende Transposons, die über entsprechende Marker selektioniert werden. Für dieses Verfahren bestehen zahlreiche Variationen, die auf verschiedene Organismen angewendet werden können. (Joyce und Grindley, 1 984; Akerley, et al., 1 998) . Mit Hilfe der inserierten Transposons läßt sich auch das mutagenisierte Gen im Genom genau lokalisieren.
Hat man eine Genmutante mit einem nachweisbaren biologischen Effekt erzeugt, z.B. ein vermindertes Wachstum der Zellen in einem bestimmten Milieu, so muß in einem zweiten Schritt die eindeutige Kopplung des Gens bzw. des Genprodukts mit dieser Eigenschaft nachgewiesen werden. Dies geschieht in der Regel durch Komplementationsexperimente. In diesem Fall wird in den Organismus mit der spezifischen Genmutante das ursprüngliche Gen eingebracht und exprimiert. Kann über diesen Weg die ursprüngliche Eigenschaft des Organismus regeneriert werden, ist der notwendige Beweis erbracht. Allerdings läßt sich dieses Verfahren nicht bei der Charakterisierung von Letalmutanten anwenden, d.h. bei Mutanten obligat essentieller Gene. Einen Ausweg bietet die Verwendung konditionaler Mutationen zur Komplementation. Z. B. lassen sich durch chemische Mutagenese des untersuchten Gens temperatursensitive Mutanten erzeugen, die das Genprodukt bei der normalerweise optimalen Wachstumstemperatur in eine inaktive Zustandsform bringen und bei niedrigeren Temperaturen ein biologisch aktives Genprodukt hervorbringen (Das, et al., 1 976; Harris, et al., 1 992; Hou, et al, 1 994; Polissi and Georgopoulos, 1 996) . In einem anderen praktizierten Ansatz werden die wildtypischen Komplementationen durch exogene Substanzen, sogen. Induktoren, gesteuert. Über diese Induktoren wird die Expression des komplementierenden Gens eingeschaltet, das auf einem Episom in die genspezifische Mutante eingebracht wird und nach Induktion das fehlende Genprodukt ersetzt (Murphy, et al., 1995-. Chow and Berg, 1 988; Arigoni, et al., 1 998) .
Die genannten Verfahren sind sehr zeitaufwendig und werden nur für die Untersuchung individueller Gene oder begrenzter genomischer Abschnitte eingesetzt. Verfahren, die eine durchgängige Charakterisierung des vollständigen Genoms eines ausgewählten Pathogens nach dem beschriebenen Schema ermöglichen, sind bislang nicht bekannt.
Die nachfolgend beschriebenen neuen genetischen Verfahren, die Konditionale Antisense-Hemmung (CAI) und die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) erfüllen diese Anforderungen. Beide Verfahren können zur Identifizierung essentieller Gene eingesetzt werden, wobei sich das CAI-Verfahren besonders für die Identifizierung obligat essentieller Gene eignet und das SRM-Verfahren für fakultativ essentielle Gene.
Das CAI-Verfahren beruht auf der konditionalen Hemmung der Translation von einem oder mehreren Genen, die auf einem klonierten Genomfragment (welches dann als Matrize oder Template dient) liegen und über ein Plasmid im zu untersuchenden Keim propagiert werden. Im Vergleich zu konventionellen Verfahren bleibt die genomische Struktur des zu untersuchenden Keims unverändert, d.h. im Originalzustand. Im zu untersuchenden Keim wird die Hemmung der Translation durch die konditional induzierbare Synthese spezifischer Antisense-RNA (asRNA) ausgelöst, die das komplette klonierte Genomfragment umfaßt, inklusive der auf dem Genomfragment lokalisierten Gene. Die Antisense- Nukleinsäuresequenzen können dann im Mikroorganismus in großen Mengen synthetisiert werden und binden an die ursprüngliche mRNA, wobei diese mRNA nicht mehr translatiert werden kann und somit dem Expressionsapparat entzogen wird. Die Folge ist, daß entweder kein Genprodukt oder nur geringe Mengen davon gebildet werden. Die Synthese der asRNA unterliegt der Kontrolle durch einen Promoter (asPromoter), dessen Aktivität konditional, durch definierte, externe Signale gesteuert wird . Diese konditionale Inhibition der Expression eines Gens oder Operons erfolgt somit über die Regulation der Synthese der asRNA durch den induzierbaren asPromoter. Zum Nachweis, daß ein Gen bzw. Operon, wie im vorliegenden Fall, für das Überleben und die Vermehrung des Organismus unter bestimmten Bedingungen essentiell ist, wird die Überlebens- und Vermehrungsrate eines Klons, in dem die Synthese der asRNA induziert ist, mit seiner Überlebens-Λ/ermehrungsrate bei nicht induzierter asRNA Synthese verglichen. Ist die Überlebens-/Vermehrungsrate des Klons bei Induktion der asRNA Synthese vermindert, so handelt es sich bei dem inhibierten Gen bzw. Operon um ein (obligat oder fakultativ) essentielles Gen. Diese Wachstumsanalysen können automatisiertdurchgeführt werden, so daß eine sehr große Anzahl von Genen innerhalb kurzer Zeit untersucht werden können. Aus diesen Klonen wird das Plasmid isoliert und die DNA- Sequenz des klonierten Genomfragments, das als Template für die asRNA Synthese dient, bestimmt und in Folge die Struktur des essentiellen Gens ermittelt.
Ein für das CAI-Verfahren geeigneter Plasmidvektor ist in Abbildung 1 dargestellt. Er enthältein genomisches odersubgenomisches DNA-Fragment aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters (P,) und weiteren üblichen Expressionssignalen sowie ein mRNA-stabilisierendes Element, so daß das DNA-Fragment in Form von Antisense RNA (asRNA) exprimiert werden kann und eine lange biologische Aktivität hat. Ein geeigneter Promoter ist z.B. der Tet-Promoter. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert der CAI-Vektor zusätzlich ein Gen für ein regulatorisches Protein, welches den Promoter reguliert, in diesem Fall, z.B. den Tet-Repressor, welcher durch ein exogenes oder extrazelluläres Signal, wie z.B. Tetrazyklin, gesteuert werden kann. Der CAI-Vektor der besonderen Ausführungsform von Abbildung 1 enthält weiterhin ein oder mehrere selektionierbare Markergene sowie zwei Replikationsursprünge (ori), einen für den zu untersuchenden Mikroorganismus (hier als Pathogen bezeichnet) und einen weiteren für einen üblichen Klonierwirt z.B. E.coli. Mit Hilfe solcher CAI-Vektoren können aus ganzen mikrobiellen Genomen Antisense-Bibliotheken erstellt werden.
Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung eines bevorzugten CAI- Verfahrens. Von einem CAI-Plasmid, das kleine Fragmente einer genomischen Bank des zu untersuchenden Mikrooganismus enthält, wird asRNA von einem induzierbaren Promoter (P,) aus, unter Kontrolle eines extrazellulären Signals synthetisiert (siehe Abb. 1 ). Die asRNA hybridisiert sequenzspezifisch mit der mRNA desjenigen Gens, das dem klonierten DNA Fragment auf dem CAI Plasmid entspricht. Durch die Bildung des asRNA- mRNA Hybrids wird die Translation dieser mRNA reduziert oder verhindert. In Folge entsteht ein defizienter Mikroorganismus, der nicht in der Lage ist, das betreffende Genprodukt zu bilden. Handelt es sich um das Produkt eines essentiellen Gens, dessen Bildung inhibiert wird (A), ist die Lebensfähigkeit des entsprechenden Klons eingeschränkt oder verhindert. Die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus wird im folgenden anhand seiner Lebens- oder Überlebens- oder Vermehrungsrate in einem definierten biologischen System bestimmt. Bei nicht erfolgender Induktion der asRNA Synthese (B), oder wenn das CAI-Plasmid das Fragment eines nichtessentiellen Gens enthält (C), ist der Klon des Mikroorganismus normal lebens- und vermehrungsfähig.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des CAI-Verfahrens werden ganze Antisense-RNA-Plasmidbanken aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus analysiert (siehe Abbildung 3) . Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1 ) wird in den zu untersuchenden homologen Mikroorganismus unter nicht-induzierenden Bedingungen übertragen und die plasmidtragenden Klone über einen plasmidkodierten Marker selektioniert. Die Lebensfähigkeit der einzelnen Klone, die jeweils ein bestimmtes CAI Plasmid aus der Genbank erhalten, wird anschließend anhand ihrer Vermehrungsrate unter induzierten bzw. nicht induzierten Bedingungen ( + und - in der Abbildung), bezogen auf die asRNA Synthese, im direkten Vergleich untersucht. In Klonen, die sich unter asRNA induzierenden Bedingungen kaum oder nur langsam vermehren, wird die Translation von mindestens einem essentiellen Gen verhindert. Aus diesen Klonen werden die CAI-Plasmide isoliert. Die essentiellen Gene werden durch Sequenzierung der genomischen Fragmente in den isolierten CAI-Plasmiden identifiziert.
Dieser Ansatz läßt sich auch bevorzugt mit einem subtraktiven Verfahren kombinieren (SCAI), von dem eine Ausführungsform zur Veranschaulichung in Abb. 4 dargestellt ist. Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1 und 3) wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus übertragen und die entstehenden individuellen Klone werden als bakterielle CAI-Bank in einem Pool zusammengefaßt. Dieser Pool wird zur Selektion in zwei identische Gruppen (den Driver- und den Tester-Pool) aufgespalten.
Der Ausdruck "Driver" wird hierbei für denjenigen Pool von bakteriellen Klonen verwendet, der so behandelt wird, daß der induzierbare Promoter aktiviert wird und asRNA vom CAI-Vektor exprimiert. Der "Tester"-Pool enthält einen identischen Satz Klone mit CAI-Plasmiden, der jedoch unter nicht-induzierenden Bedingungen gehalten wird und somit Wildtyp- Eigenschaften besitzt.
In der Regel wird der "Driver"-Pool zur Selektion (z.B. im Tier) eingesetzt, während der "Tester"-Pool unbehandelt aufbewahrt wird. Es können aber auch beide Gruppen einer Selektion unterzugen werden, wobei lediglich der "Driver"-Pool durch Gabe des Signals (z.B. Tetrazyklin) induziert wird. Klone, in denen durch die Expression einer bestimmten asRNA die Translation eines essentiellen Gens gehemmt wird, gehen während der Selektion aus der Gruppe verloren. Nach angemessener Zeit werden die überlebenden Klone beider Gruppen wiedergewonnen und die CAI-Plasmide aus den Klonen beider Gruppen isoliert. Die klonierten genomischen Fragmente werden anschließend über PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die mit Vektorsequenzen seitlich der klonierten genomischen Fragmente hybridisieren. Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von essentiellen Genen darstellten, werden durch subtraktive Hybridisierung (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.
Ein erfindungsgemäß für einen CAI-Vektor geeigneter Promoter ist beispielsweise der Tet-Promoter, dessen Aktivität über ein regulatorischen Protein (in diesem Fall den Tet-Repressor) gesteuert werden kann und durch ein extrazelluläres Signal (Tetracyclin) induziert werden kann. Weitere induzierbare Promoteren sind im Stand der Technik bekannt. Antisense-RNA stabilisierende Elemente sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.
Der hohe Wirkungsgrad des CAI Verfahrens bei der Inaktivierung von Einzelgenen in einem Organismus ergibt sich aus der überlappenden Klonierung kleiner genomischer Fragmente und der damit einhergehenden Synthese unterschiedlicher asRNA Abkömmlinge für einen bestimmten Genbereich. Auf diese Art wird die Wahrscheinlichkeit, eine asRNA zu erhalten, welche die Translation des gesuchten Zielgens effizient inhibiert, stark erhöht. Derartige Untersuchungen können auf das komplette Genom eines Pathogens ausgerichtet werden, was die Überprüfung einer sehr großen Anzahl individueller genomischer Fragmente erforderlich macht. Hier sind apparative Hilfsmittel (Roboter) von Vorteil, um einen hohen Probendurchsatz zu erzielen. Allerdings können in diesen Fällen nur bestimmte Zustände untersucht werden, z. B. das Wachstum der Zellen in einem bestimmten Medium.
Durch den zusätzlichen Einsatzsubstraktiver Verfahrensschritte (Subtractive Conditional Antisense Inhibition, SCAI), kann die Anzahl der zu untersuchenden individuellen Klone bevorzugt stark reduziert werden.
Die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) wird bevorzugt zur Identifizierung fakultativ essentieller Gene herangezogen. Im Unterschied zum CAI-Verfahren werden dauerhafte Genmutationen erzeugt, wobei die Anreicherung essentieller Gene über einen substraktiven Schritt erreicht wird. Die SRM Methode kann wie das CAI Verfahren mit kompletten oder partiellen Genbanken von pathogenen Mikroorganismen durchgeführt werden.
Das SRM Verfahren beruht auf der Inaktivierung einzelner Gene im Genom eines Pathogens durch vollständige Insertion eines bestimmten Suizidplasmids, das in dem zu untersuchenden Organismus nicht oder nur unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. permissiver Temperatur, replizieren kann, wobei dieses ein Teil einer Genbank ist. Die Insertion der Plasmide in das Genom erfolgt, durch homologe Rekombination. Die erfolgreiche Insertion wird durch Expression eines plasmidkodierten Antibiotikum- Resistenzmarkers angezeigt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der SRM-Methode wird anhand der Abbildungen 5 bis 8 veranschaulicht.
In Abbildung 5 ist ein geeigneter SRM-Vektor dargestellt, der wie der CAI- Vektor ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält, sowie einen Replikationsursprung (ori) für einen Klonierwirt (z.B. E.coli), ein oder mehrere selektionierbare Markergene und einen weiteren konditional aktiven Replikationsursprung für den zu untersuchenden Mikroorganismus, z.B. einen temperatursensitiven Ursprung oder einen Ursprung, dessen Aktivität von einem in trans vorhandenen Replikationsfaktor abhängig ist und der zusätzlich in das System eingebracht werden kann. Dadurch, daß das SRM-Plasmid eine genomische Sequenz des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält, kommt es bei Transfektion dieses Vektors in diesen Mikroorganismus zu einer homologen Rekombination, bei der das gesamte SRM-Plasmid in das genomische Gen des Mikroorganismus inseriert wird und das entsprechende Gen, falls es sich um ein solches handelt, inaktiviert. Dies führt zu einer Insertionsmutante. Geeignete induzierbare Replikationsursprünge sind, wie erwähnt, temperatursensitive oris oder solche, die durch einen Faktor gesteuert werden können, wie z.B. den RGK-Faktor pir oder den pWV Faktor repA, der in trans dem System zugeführt wird.
Die Insertion eines SRM-Plasmids (siehe Abb. 5) in das Genom des zu untersuchenden Mikroorganismus erfolgt über homologe Rekombination zwischen dem im Plasmid klonierten genomischen Fragment des
Mikrooganismus und der komplementären, genomischen DNA Sequenz. Nachdem das Plasmid in den entsprechenden Mikroorganismus überführt worden ist, werden unter nicht permissiven Bedingungen, d.h. bei inaktiver Replikation, diejenigen Klone über Selektion auf den plasmidkodierten Marker isoliert, in welchen das SRM-Plasmid in das Genom inseriert ist. Die Exzision des SRM-Plasmids erfolgt ebenfalls über homologe Rekombination. Unter permissiven Bedingungen wird die Replikation des insertierten Plasmids eingeleitet, wodurch genügende Mengen an freiem Plasmid in den Zellen entstehen, so daß das Plasmid aus dem Klon wieder isoliert werden kann. Sofern die Insertion eines SRM-Plasmids in ein essentielles Gen stattgefunden hat, wird die Lebensfähigkeit des betreffenden Klons eingeschränkt (A), während Mutanten in nicht-essentiellen Genen normal lebensfähig sind (B) .
Ebenso wie beim CAI-Verfahren kann eine Bank von Insertionsplasmiden aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus in diesen Mikroorganismus übertragen werden und genomische Insertionsmutanten gebildet werden. Diese bevorzugte Ausführungsform des SRM-Verfahrens ist in Abbildung 7 dargestellt. Eine Bank von SRM- Plasmiden, die einzelne genomische oder subgenomische Fragmente enthalten, wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus übertragen. Unter Bedingungen, welche die Plasmidreplikation nicht erlauben, wie z.B. bei nicht permissiver Temperatur, werden genomische Insertionsmutanten mit Hilfe eines plasmidkodierten Markers (siehe Abb. 5) selektioniert. In diesem Schritt können nur Insertionsmutanten überleben, die in einem nicht- oder fakultativ essentiellen Gen mutiert sind, da Mutanten eines essentiellen Gens nicht lebensfähig sind. Die individuellen Insertionsmutanten werden in einem Pool zusammengefaßt und dieser Pool anschließend in zwei identische Gruppen, den Driver- und den Tester-Pool, aufgeteilt. Der Driver-Pool wird selektioniert, z.B. durch die Infektion eines Tiers. Der Tester-Pool bleibt unbehandelt. Durch die Selektion gehen solche Klone aus dem Driver-Pool verloren, die eine Insertion in einem fakultativ essentiellen Gen (das für das Überleben und die Vermehrung unter den Selektionsbedingungen notwendig ist) enthalten. Anschließend werden aus den überlebenden Klonen beider Pools, die in das Genom des Mikroorganismus inserierten Plasmide unter permissiven Bedingungen rezirkularisiert und zurückgewonnen. In dem Driver-Pool fehlen solche Plasmide, die Fragmente von fakultativ essentiellen Genen enthalten. Die in den SRM Plasmiden klonierten Fragmente werden in beiden Pools anschließend über PCR amplifiziert (siehe Abb. 4) . Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von fakultativ essentiellen Genen darstellen, werden durch genetische Subtrakion (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.
Eine besondere Ausführungsform, welche sich eine subtraktive Hybridisierung zur Anreicherung in Fragmenten essentieler Gene zunutze macht, ist in Abbildung 8 beispielhaft veranschaulicht.
A: PCR-basierte genetische Subtraktion. Die Tester DNA-Fragmente (siehe Abb. 4 und 7) werden mit einem Adapteroligonukleotid in solcher Weise ligiert, daß der Adapter nur mit einem der beiden DNA Stränge eines doppelsträngigen Tester DNA Fragments kovalent verbunden ist, was z.B. durch die Ligation eines doppelsträngigen, nicht phosphorylierten Adapters an die 3'-phosphorylierten DNA Fragmente der Tester DNA erreicht wird. Diese Tester DNA Fragmente werden dann mit einem molaren Überschuss an Driver DNA Fragmenten gemischt. Die Mischung wird denaturiert und langsam rehybridisiert. Anschließend werden überhängende
Einzelstrangenden mit DNA Polymerase zum Doppelstrang aufgefüllt. Die Produkte dieser Reaktion werden mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die den Adaptersequenzen entsprechen. Nur solche Tester DNA Fragmente, die nicht mit Driver DNA Fragmenten hybridisert haben, werden exponentiell amplifiziert somit angereichert und anschließend durch Klonierung isoliert. B: Genetische Subtraktion durch physikalische Abtrennung von biotinylierten DNA Fragmenten. Die Driver DNA Fragmente werden biotinyliert und anschließend im Überschuß mit Tester DNA Fragmenten gemischt, denaturiert und langsam rehybridisiert. Die biotinylierten Homo- Driver-Driver Doppelstränge und Heteroduplexe
(Driver-Tester Doppelstränge) werden durch Extraktion mit Trägergekoppeltem Streptavidin von den Tester-Tester Homoduplexen abgetrennt. Letztere werden durch Klonierung isoliert.
Die beispielsweise durch SRM erzeugten Insertionsmutanten werden in Tierversuchen oder Zellkultursystemen hinsichtlich ihrer veränderten biologischen Eigenschaften untersucht. Durch die gezielte Verwendung spezieller Wirtszellen, z.B. kultivierte Makrophagen oder Wirtsgewebe, z. B. Milz, können Gengruppen selektiert werden, die essentielle Eigenschaften des Pathogens determinieren, z.B. die Besiedlung bestimmter Wirtszellen. Isoliert man die überlebenden Mutanten aus den Zellen, so fehlen die Mutanten essentieller Gene. Subtrahiert man aus der kompletten Genbank, die überlebenden Mutanten, so erhält man die Mutanten der essentiellen Gene.
Das CAI- bzw. das SRM-Verfahren ist eine sehr effiziente Methode zur eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene. Da essentielle Gene ein natürliches Ziel für inhibierende Wirkstoffe darstellen, bieten die dargestellten Verfahren eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe.
In den nachfolgend beschriebenen Verfahren werden die identifizierten Gene direkt zum Wirkstoff-Screening eingesetzt, wobei im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, auf aufwendige Aufreinigungsschritte verzichtet werden kann. Im Mittelpunkt dieser Verfahren stehen bakterielle Trägerzellen, die zum Screening nach prophylaktischen und therapeutischen Wirkstoffen eingesetzt werden können. Die hergestellten gendefizienten Mikroorganismen werden dann auf ihre Wachstumsfähigkeit oder ihre Überlebensfähigkeit getestet. Geeignete Testsysteme sind z.B. /n-v/fro-Systeme, Zellkultursysteme, Gewebekultursysteme und Tiermodelle als natürliche Umgebung. Wird das Verfahren bei H. ylori angewandt, werden die Organismen einerseits auf einem sog. Vollmedium angezüchtet, wobei das Vollmedium die bestmöglichen Voraussetzungen für ein Wachstum für .py/or/ermöglicht. Gleichzeitig werden die defizienten H. ylori Organismen in einer Kultur gezüchtet, welche der natürlichen Umgebung von H. pylori möglichst genau entsprechen soll. Es werden hierzu einerseits Zellkulturen basierend auf Primärkulturen oder Zellinien aus gastrointestinalem Gewebe verwendet oder aber ausdifferenziertes Primärgewebe (Sphäroide) in Kulturmedium. Weitere Möglichkeiten zur Simulation der natürlichen Umgebung von H. pylori bestehen in der Verwendung von stimulierten Makrophagen, denn H. pylori besitzt die Fähigkeit, von diesen nicht aufgenommen und metabolisiert zu werden. Außerdem kann auch überprüft werden, ob die defizienten H. ylori Organismen in der Lage sind, sich in immundefizienten Mäusen über einen bestimmten Zeitraum zu etablieren.
Ist ein defizientes H. ylori Bakterium zwar in der Lage, auf Vollmedium zu überleben, wächst aber nicht in einer natürlichen Umgebung, wie oben beschrieben, so wird das in diesem Organismus defiziente Gen als fakultativ essentielles Gen bezeichnet.
Wenn der defiziente H. pylori Organismus in keinem der beiden Testlebensräume überlebensfähig ist, so handelt es sich um ein obligat essentielles Gen.
Allgemein können essentielle Gene von Mikroorganismen einer dieser Kategorien zugeordnet werden. Aus diesen Ergebnissen können dann die in mutierten oder/durch asRNA unterdrückten Sequenzen identifiziert und jeweils einer dieser beiden Kategorien zugeordnet werden, oder aber der Kategorie der nichtessentiellen Gene, wenn der gendefiziente Organismus keine Beeinträchtigungen in seiner Wachstumsfähigkeit zeigt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genetisches Verfahren zur Isolierung und Klonierung der identifizierten essentiellen Gene aus verschiedenen klinischen Helicobacter Isolaten bzw. aus heterologen pathogenen Keimen von klinischer Bedeutung bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt daher weiterhin die Schritte (v) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen (VI) Identifizieren der homologen Gensequenzen.
Eine bevorzugte Durchführung dieser weiteren Verfahrensschritte besteht darin, sogenannte Megaprimer von den identifizierten essentiellen Helicobacter-Genen mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) herzustellen, deren Sequenz direkt aus den entsprechenden Plasmiden der mutagenisierten DNA-Abschnitte abgeleitet werden kann. Diese Primer können dann verwendet werden, um die bereits identifizierten essentiellen Gene aus verschiedenen e//co/-)ac-'er-lsolaten zu isolieren. Falls diese essentiellen Gene Entsprechungen in anderen Mikroorgansimen haben, können die Primer unter Umständen auch zur Isolierung dieser Gene aus von Helicobacter verschiedenen Mikroorgansimen verwendet werden . Weiterhin kann dann die genaue DNA-Sequenz der isolierten Gene und die Feststellung der Genvarianz innerhalb der verschiedenen He/icobacter-\so\ate bzw. zwischen den verschiedenen Mikroorganismen bestimmt werden. Bei der Herstellung der Megaprimer entstehen DNA-Fragmente mit variablen 3'-Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es möglich, die DNA-Fragmente zur Isolierung variabler, bzw. verwandter Gene mittels des beschriebenen PCR-Verfahrens einzusetzen. Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen
Zur Identifizierung neuer immunologischer Wirkstoffe aus dem Pool der identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe werden bakterielle Träger insofern sehr wirksam eingesetzt, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff-Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger. Als Träger werden bevorzugt attenuierte Bakterien, wie z.B. Salmonellen, verwendet, da diese über ein natürliches Potential zur Immunstimulanz verfügen. Werden diese attenuierten Bakterien als Träger bzw. Produzenten für die identifizierten essentiellen Gene der pathogenen Keime verwendet und wird mit diesen Impfstämmen eine Immunisierung an einem Säugetier durchgeführt, so kann eine nachhaltige Immunantwort ausgelöst werden.
Mittlerweile sind die immunologischen Eigenschaften dieser bakteriellen Trägersysteme so weit verfeinert worden, daß eine gezielte Immunantwort ausgelöst werden kann (VanCott et al., 1 998; Carrier-Patent EP981 1 6827. 1 ) . Diese Eigenschaft ist insofern bedeutsam, da die verschiedenen Krankheitserreger oftmals nur über einen bestimmten Zweig des Immunsystems wirksam bekämpft werden können. D.h. schutzvermittelnde Antigene lassen sich nur dann identifizieren, wenn sie dem Immunsystem in der richtigen Form präsentiert werden. Nur wenn der verwendete Träger mit einem wirksamen Antigen beladen wurde, kann es zu einer Schutzwirkung kommen. Aufgrund der vielfältigen immunologischen Eigenschaften bakterieller Trägersysteme und deren Überlegenheit gegenüber herkömmlichen synthetischen Adjuvantien sind diese zur Identifizierung immunologisch relevanter Antigene besonders geeignet.
Darüber hinaus können die bakteriellen Trägersysteme mit effizienten Genexpressionssystemen ausgestattet werden, welche die Herstellung auch problematischer Antigene erlauben (PCT/EP91 /02478, EP981 1 6827.1 ) . Aufgrund der direkten Subklonierung der isolierten essentiellen Gene und der einfachen Handhabung der bakteriellen Träger bei der Herstellung und Vakzinierung, können in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Antigenen hinsichtlich ihres immunogenen und protektiven Potentials durchgetestet werden. In herkömmlichen Verfahren müssen die Test-Antigene dagegen zeitaufwendigen Aufreinigungsverfahren unterworfen werden, wobei oftmals schon bei der gentechnischen Herstellung der ausgewählten Antigene in Bakterien Schwierigkeiten auftreten, die mit der toxischen Wirkung dieser Antigene auf den produzierenden Bakterienstamm verknüpft sind.
Eine wichtige Voraussetzung für das Entwickeln von Wirkstoffen besteht darin, das immunogene Potential der identifizierten Sequenzen festzustellen, um zu bestimmen, inwiefern die entsprechenden Genprodukte für die Herstellung von Antikörpern oder Impfstoffen geeignet sind.
Zur Identifizierung immunologischer Wirkstoffe gegen klinisch relevante A/e//coAacter-Organismen muß zunächst ermittelt werden, in wie weit das Genprodukt des identifizierten essentiellen Gens immunogene Eigenschaften besitzt. D.h. es muß experimentell ermittelt werden, ob mit dem Antigen eine humorale und zelluläre Immunantwort in einem Säugetier ausgelöst werden kann, die gegen das originale Genprodukt des Erregers gerichtet ist. Damit werden auf keinen Fall solche Antigene ausgeschlossen, die im Rahmen einer natürlichen Infektion vom Immunsystem nicht erkannt werden. Im Gegenteil, vielmehr könnte man erwarten, daß z.B. bei chronisch infizierten Menschen die Immunantwort gegen schutzvermittelnde Antigene unterdrückt ist oder von einer Qualität ist, die letztendlich keine Schutzwirkung vermittelt. Auszuschließen sind jedoch solche Antigene, die einer hohen genetischen Variation unterliegen und somit einer wirksamen Immunantwort kaum zugänglich sind. Zum Nachweis der Identität des identifizierten Genprodukts bei einer natürlich vorkommenden Infektion, wird Antiserum von Patienten gewonnen, die entweder unter einer aktiven Gastritis mit Beschwerden leiden, oder aus Patienten, bei denen die A/e//cθ(6acfer-lnfektion symptomlos verläuft. Mit diesen Seren wird das elektrophoretisch aufgetrennte rekombinante Protein in einem klassischen Western Blot Verfahren getestet. Findet eine Erkennungsreaktion mit einem rekombinanten Protein jeweils mit beiden Seren, also dem eines Patienten mit einer fulminanten und dem eines Patienten mit einer symptomlosen Helicobacter Infektion, statt, so spielt dieses Protein bei einer natürlichen Infektion eine Rolle. Wird das rekombinante Polypeptid dagegen nur von dem Serum des Patienten mit einer symptomlosen Infektion erkannt, kann das zusätzlich ein Hinweis auf ein protektives Potential des entsprechenden Proteins sein. Weiterhin können Antikörper, die gegen dieses Protein spezifisch gerichtet sind, möglicherweise zur passiven Immunisierung eingesetzt werden.
Von besonderem Interesse sind außerdem Antikörper von Individuen, die nachweislich keine Helicobacter-Träger sind, da diese auf ein protektives Potential eines entsprechenden rekombinanten Polypeptids schließen lassen.
Desweiteren werden die immunogenen Polypeptide zusammen mit geeigneten Zusatzstoffen zur Immunisierung in vivo eingesetzt. Verwendet werden dazu verschiedene Adjuvantien, bakterielle Toxine, Zytokine oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Lebendvakzin. Die Immunantwort wird daraufhin getestet, ob sie nach einer erfolgten Verabreichung eines bestimmten Polypeptids der Erfindung in Kombination mit entsprechenden Zusatzstoffen nach Infektion mit dem homologen Keim eine schützende Wirkung gegen weitere homologe Infektionen herbeiführt (z.B. Infektionen mit verschiedenen H. pylori Stämmen).
Noch eine weitere Möglichkeit zum Testen der Immunogenität besteht darin, im Tiermodell (z.B. Maus, Kaninchen) eine Immunantwort gegen Helicobacter oder andere Mikroorganismen auszulösen und aus den immunisierten Tieren Antikörper zu gewinnen/ die dann in einer weiteren Western-Blot-Analyse verwendet werden können. Gleichzeitig müssen Patientenbiopsien in situ immunologisch mit den gleichen Antikörpern untersucht werden, da Helicobacter und andere Mikroorganismen in Kultur bestimmte Proteine verlieren oder hinzugewinnen können.
Parallel dazu ist es bevorzugt zu untersuchen, ob gegen eine Infektion mit heterologen Keimen (bevorzugt andere gram-negative Bakterien), welche das entsprechende Polypeptid exprimieren, eine schützende Wirkung erzielt werden kann.
Nachdem festgestellt wurde, ob die identifizierten Gene bzw. deren Expressionsprodukte in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen, kann gemäß dem Verfahren der Erfindung weiterhin untersucht werden, ob auch eine bereits bestehende Infektion mit derartigen Antigenen behandelt werden kann. Kann auf diese Weise ein Polypeptid identifiziert werden, das eine therapeutische Wirkung zeigt, wird es bevorzugt auch auf seine Aktivität bei Infektionen mit heterologen Keimen untersucht.
Das Screening nach prophylaktisch bzw. therapeutisch wirksamen, immunologischen Stoffen kann nach folgendem Schema verlaufen, wobei die Einhaltung der einzelnen Schritte nicht zwingend ist:
1 . Klonierung des identifizierten Gens in einen geeigneten bakteriellen Trägerstamm und Nachweis sowie Quantifizierung des vollständigen
Genprodukts durch SDS-PAGE.
2. Immunologische Charakterisierung des erzeugten Genprodukts mit Hilfe von (a) Seren infizierter oder/und natürlich geschützter Wirte, die das Genprodukt im Trägerstamm erkennen sollte; (b) Hyperimmunseren von Tieren, die mit dem rekombinanten
Trägerstamm immunisiert wurden. Wobei das jeweilige
Hyperimmunserum das originale Genprodukt im pathogenen Keim erkennen sollte. Hierbei kann es möglich sein, daß das originale Antigen nur in einem bestimmten Entwicklungszeitraum vom Pathogen produziert wird. 3. Die protektive Wirkung der individuellen Antigene in der prophylaktischen oder/und therapeutischen Anwendungsform wird im
Tiermodell untersucht.
Alle protektiven Antigene, die mit den beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, können nunmehr in einem zweiten Schritt weiterentwickelt werden. Im Vordergrund dieser Weiterentwicklung steht u. a. die Evaluierung der genetischen Konstanz der identifizierten protektiven Antigene innerhalb des Pathogens bzw. verwandter pathogener Keime in seiner weltweiten Verbreitung. Weiterhin wird zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe, auf die genetischen Unterschiede im Immunsystem der Impflinge eingegangen. Ziel beider Verfahren ist die Identifizierung von Antigenen oder Epitopen, die möglichst breit angewendet werden können. Zur Erfassung der Genvariabilität innerhalb einer Spezies bzw. homologer Keime kann der sogenannte Mega-Primer-Ansatz eingesetzt werden. Aus dem Plasmid mit dem relevanten Gen werden direkt genspezifische Primer mit variablen 3'- Enden über PCR hergestellt, welche die Amplifikation homologer Gene ermöglichen. Anhand der ermittelten DNA-Sequenz der amplifizierten Gene kann deren Variabilität abgeleitet und z.B. genkonstante Bereiche bestimmt werden.
Die genetischen Unterschiede zwischen einzelnen Impflingen, auf ein definiertes Antigen zu reagieren, kann mit Hilfe einer In V/'-Vo-Vakzinierung evaluiert werden. Aus unterschiedlichen Spendern werden hierzu antigenpräsentierendeZellen (APC) isoliert, z.B. dentritische Vorläuferzellen, welche in vitro expandiert und mit den zu testenden Antigenen beschickt werden, wobei die Antigene bevorzugt über entsprechende Vektoren exprimiert werden. Die identifizierten Gene können auch einzeln oder in definierten, Kombinationen in dendritischen Zellen (DC) von nicht infizierten Spendern exprimiert werden. Dabei werden die Genprodukte von der Wirtszelle prozessiert und durch den MHC-Komplex präsentiert. DC sind besonders für die Antigenpräsentation gegenüber naiven oder "schlummernden" T-Zellen geeignet. Werden DC mit T-Zellen autologer Spender inkubiert, ist es möglich zu bestimmen, ob dieser Spender gegen das eingesetzte Antigen reagieren würde, wenn er auf natürliche Weise damit in Kontakt käme, z.B. im Rahmen einer Schutzimpfung. Anhand der Immunantwort der T-Zellen kann auf eine mögliche Immunogenität des entsprechenden Antigens geschlossen werden. Eine solche Immunantwort besteht beispielsweise aus einer Proliferation der T-Zellen, bzw. einer Zytokin-Ausschüttung insbesondere von IL-2 und IL-4. Die Zytokine können beispielsweise mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Assaykits (z.B. von Genzyme Cambridge M.A.) ausgewertet werden.
Schließlich können die in der beschriebenen Weise identifizierten und charakterisierten Antigene bzw. Epitope zur Entwicklung der ersten Impfstoff-Prototypen eingesetzt werden. Hierbei wird zwischen zwei Impfstofftypen unterschieden, der aktiven und der passiven Impfung.
Zur passiven Immunisierung, werden dem Impfling Antikörper oder Antikörperfragmente mit schützender bzw. inhibierender Wirkung von außen zugeführt.
Antikörper werden in Form von polyklonalen, bevorzugt monoklonalen Antikörpern (MAKs) oder rekombinanten Antikörpern bereitgestellt. Hierzu gehören Antikörper, die spezifisch mit Polypeptiden der Erfindung oder deren Untereinheiten und Fragmenten reagieren und für eine prophylaktische und/oder therapeutische Anwendung, z.B. einer passiven Immunisierung, verwendet werde können. Diese Anti-Protein- oder Anti-Peptid-Antiseren bzw. monoklonalen Antikörper können mit Hilfe von Standardprotokollen z.B. durch die Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten oder Ziegen mit einem gereinigten Polypeptid der Erfindung, einen Fusionsprotein oder einem Subfragment dessen hergestellt werden. Darüber hinaus können die Tiere auch mit bakteriellen Vakzineträgern immunisiert werden, die mit entsprechenden Genen der Erfindung ausgestattet sind und die kodierten Polypeptide exprimieren. Die Antikörper sind dabei bevorzugt immunspezifisch gegen antigene Determinanten oder Epitope hierzu der beschriebenen He/Zco/jacter-Polypeptide oder einem eng verwandten Polypeptid, das eine Homologie von mindestens 90% besitzt, gerichtet. Sie sind nicht kreuzreaktiv mit Polypeptiden, die z.B. eine Homologie von weniger als 80% aufweisen.
Ausgehend von einer Zellinie, die einen Polypeptid-spezifischen monoklonalen Antikörper produziert, kann aus dem kodierenden Gen eines solchen Antikörpers, chimäre Gene geschaffen werden, die Antikörper determinieren, bestehend aus einer Antigen bindenden Domäne aus der Maus und dem Fc-Teil eines Antikörpers des Menschen. Diese Antikörper können in Zellinien oder transgenen Tieren produziert werden.
Anstelle von Antikörpern, die im Tier generiert wurden, können auch Antikörper-Fragmente, Miniantikörper, verwendet werden, die z.B. in einem heterologen System wie Bakterien hergestellt werden. Diese Miniantikörper können entweder monovalent oder bivalent sein und bestehen aus dimerisierten Einzelketten-Molekülen (Kujau et al., 1 998; Kalinke et al., 1 996; Pack et al., 1 993) .
Antikörper gegen die immunogenen Polypeptide der Erfindung können auch in Pflanzen generiert werden. Beispiele hierzu sind z.B. von Hiatt und Ma (1 993), van Engelen et al. (1 994) und Ma et al. (1 994) beschrieben worden. Entsprechend der jeweilig verwendeten Pflanze können diese z.B. direkt zum Verzehr und damit als orales Vakzin verwendet werden.
Eine weitere, sehr breit anwendbare Weise, Antikörper herzustellen, ist in Milch und Eiern immunisierter Tiere. Verabreicht man z.B. trächtigen Kühen, Schafen oder Pferden geeignete Antigene, so finden sich in der Milch Immunoglobuline, die zur Entwicklung eines Vakzins verwendbar sind. Die Milch kann dann entweder direkt als Vakzin verabreicht werden, oder ein konzentriertes Immunglobulin-Extrakt hergestellt werden. Auf die gleiche Weise können auch Antikörper (Hyperimmunantikörper) in Hühnereiern produziert werden (Ling et al., 1 998; Sasse et al., 1 998) . Die beschriebenen immunogenen Polypeptide der Erfindung können daher auch zur Entwicklung eines Milchprodukts oder Hühnereiern verwendet werden, die als orales Vakzin verwendet werden können.
Erfindungsgemäß werden die generierten Antikörper oder deren Fragmente auf ihre Anwendbarkeit getestet. Sie können dazu durch bekannte Verfahren aufgereinigt werden (Präzipitation, chromatographische Verfahren) und beispielsweise darauf untersucht werden, ob sie den Infektionsvorgang von H. pylori inhibieren können (Adhäsionsassays) oder aktivierend auf Komplement oder ADCC ("antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität) wirken.
Zur passiven Immunisierung werden die Antikörper, die mit Hilfe der Polypeptide der Erfindung generiert wurden, entweder oral oder intragastrisch verabreicht. Hierfür werden die Antikörper mit einem Bicarbonat- Puffer gemischt. Sie können aber auch systemisch verabreicht werden, wobei sie nicht gepuffert werden müssen.
Antikörper werden bevorzugt allein oder auch in Kombination mit anderen nicht-immunologischen Wirkstoffen verwendet, z.B. mit Antibiotika oder Protonenblockern.
Aktive Vakzinierung beruht auf einer Immunreaktion, die vom geimpften Organismus selbst ausgelöst wird. Bevorzugt sind Darreichungsformen von Impfstoffen als Antigene, Antigenfragmente, Subunit-Vakzin, als DNA- Vakzin, als Lebend-Vakzin oder als Lebensmittel-Vakzin. Antigene sind diejenigen Polypeptide oder deren Fragmente, die in vivo eine Immunreaktion hervorrufen können.
Wenn ein Polypeptid als Subunit-Vakzin bereitgestellt werden soll, wird es zunächst in seine Untereinheiten bzw. Strukturdomänen gemäß seines Antigenitätsmusters zerlegt (z.B. T- und B-Zell-Epitope) . Dieses Antigenitätsmuster kann mit Hilfe eines Computerprogramms erstellt werden, wobei immunogene Regionen, die aus einer kurzen Polypeptid- sequenz von ca. 8 bis 10 Aminosäuren bestehen, erkannt werden können (Hughes et al., 1 992). Die einzelnen Polypeptidstücke können dann anschließend auf ihre Immunogenität in der Maus oder in Primaten bzw. den Menschen getestet werden. Sie können dazu entweder als gereinigte Polypeptide, die synthetisch hergestellt wurden, in Kombination mit entsprechenden Zusatzstoffen wie einem Adjuvans, Toxin oder Cytokin verabreicht werden, oder als Fusionsprotein an ein bekannt immunogenes Protein bzw. Proteinuntereinheit wie z.B. die Cholera Toxin B Untereinheit (Liljeqvist et al. , 1 997) gekoppelt. Weiterhin können die immunogenen Peptide in äußere Membranproteine wie z.B. dem OmpS Maltoporin von E. coli eingebaut und heterolog in einem Vakzin-Trägerstamm exprimiert. werden (Lang und Korhonen, 1 997) .
Zur Entwicklung eines DNA-Vakzins können die in der Erfindung charakterisierten Polynukleinsäure-Moleküle "nackt" in Fusion mit einem eukaryontischen gewebespezifischen Promoter oder in Form eines Plasmids verabreicht werden. Die "nackte" DNA oder das entsprechende Plasmid wird in Kombination mit einem Zusatzstoff wie einem Reagenz, das die zelluläre Permeabilität verändert wie z.B. Bupivacain (WO94/1 6737), kationischen Lipiden wie z.B. DOTMA (N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethyl-ammoniumchlorid, DOTAP ( 1 ,2-bis(oleyloxy)-3-trimethyl- ammonio)propan), DDAB (dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid), DOGS (dioctadecyl-amidolglycyl-spermidin) bzw. Cholesterinolderivaten, Silica, Gold oder Wolfram (Tang et al. 1 992) bzw. in Liposomen (WO93/1 8759, WO93/1 9768, WO94/25608, WO95/2397) oder Mikropartikeln verpackt, verabreicht. Beispiele für brauchbare Promoteren und Genfähren sind von Hartikka et al. (1 996) beschrieben worden. Zur Applikation der Polynukleotid-Moleküle können jedoch auch z.B. attenuierte Salmonellen verwendet werden. Die Bakterien werden hierfür mit eukaryontischen Expressionsvektoren, die ein Polynukleotid-Molekül der Erfindung beinhalten, transformiert und dann oral verabreicht. Die Plasmid-DNA wird anschließend vom Bakterium auf den Wirt übertragen (Darji et al., 1 997) . Zur Transformation attenuierter Trägerbakterien können jedoch auch filamentöse Phagen verwendet werden. Der Vorteil dieser liegt darin, daß sie eine extrem hohe Anzahl von Plasmiden übertragen können.
Für die Entwicklung eines Lebendvakzins stehen unter anderem virale, wie z.B. adenovirale oder Windpocken-Virus-Vektoren, bzw. bakterielle Vektoren wie etwa Salmonella, Shigella oder Lactobaci/Ius zur Verfügung. Attenuierte, nichtvirulente Salmonella typhimurium-Stämme, die zur rekombinanten Expression heterologer Antigene benutzt werden können und oral verabreicht werden, wurden vielfach charakterisiert (Mekalanos, 1 994, WO92/1 1361 , Cirillo et al., 1 995 und Dorner (1 995) . Weitere bakterielle Vektoren, die als Vakzinvektoren verwendet werden können, sind von Cirillo et al. , (1 995) und Dorner ( 1 995) beschrieben worden. Ein Polynukleotid- Molekül der Erfindung, das für ein therapeutisch oder prophylaktisch wirksames Polypeptid kodiert, wird hierzu entweder in das bakterielle Genom stabil integriert und einem Transportsystem unterworfen, das die Darbietung an der bakteriellen Oberfläche ermöglicht (PCT/EP94/04286; WO97/35022) . Das entsprechende Polynukleotid-Molekül kann im Bakterium aber auch als Plasmid in freiem Zustand vorliegen.
Impfstoffe werden in der Regel mit geeigneten Zusatzstoffen wie z.B. Adjuvantien, bakteriellen Toxinen, Zytokinen etc. verabreicht, die das immunogene Polypeptid in seiner protektiven oder therapeutischen Wirkung unterstützen. Adjuvantien mit geringen Nebenwirkungen zur Verwendung im Menschen, die für Subunit-Vakzine und Lebend-Vakzine, aber zum Teil auch für DNA-Vakzine in Frage kommen, sind z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D- isoglutamin, N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetyl- muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2-( 1 '-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3- hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin, Liposomen, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalosedimicoloat, Pilz-Polysaccharide wie z.B. Schizophyllan, Muramyl- Dipeptid, Muramyl-Dipeptid-Derivate, sowie Phorbolester, Saponine und immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) (Gupta und Siber, 1 995) . Als bakterielles Toxin kann z.B. Cholera Toxin bzw. dessen Untereinheiten oder das hitzelabile Toxin aus E.coli verwendet werden. Obwohl diese hochpotent als Adjuvantien aktiv sind, können sie aufgrund ihrer Toxizität nur begrenzt auf den Menschen angewendet werden. Mit Hilfe bestimmter Mutagenesetechniken können jedoch Moleküle entwickelt werden, die aktiv, aber ungiftig sind (O'Hagan, 1 998).
Eine weitere Möglichkeit, die Immunantwort auf die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksamen Substanzen der Erfindung zu optimieren, ist, das entsprechende Polypeptid als Fusionsprotein mit einer immunogenen Proteindomäne zu exprimieren. Eine Möglichkeit besteht z.B. darin, die Pilin DSL-Domäne aus Pseudomonas aeruginosa als Fusionspartner zu verwenden. Weiterhin beschrieben sind Fusionsproteine, die an Glutathion S-Transferase oder Thioredoxin fusioniert wurden (Hill et al., 1 997; Gabelsberger et al., 1 997) . Das entsprechende Fusionsprotein kann jeweils als Subunit- oder Lebendvakzin hergestellt und verabreicht werden.
Die Immunantwort der identifizierten immunologisch wirksamen Substanzen kann auch insofern moduliert werden, indem diese in Kombination mit bestimmten Zytokinen verabreicht werden. Zur simultanen Verabreichung bietet sich eine Co-Expression der Polynukleotid-Sequenzen der Erfindung mit einem bestimmten Cytokin in Salmonella oder einem anderen Wirtsbakterium an. Das entsprechende Cytokin kann hierzu entweder auf einem separaten Plasmid, in Reihe oder als Fusionsprotein mit der gewünschten Polynukleotid-Sequenz der Erfindung kodiert sein und dann in das Wirtsbakterium transformiert werden. In Frage kommen Cytokine, die wie z.B. lnterleukin-6 (IL-6), lnterleukin-1 0 (IL-10) oder lnterleukin-1 2 (IL-1 2) das Immunsystem stimulieren.
Zur weiteren Optimierung können einzelne immunogen wirksame Substanzen der Erfindung miteinander oder in Kombination mit bekannten immunogenen Substanzen wie z.B. VacA bzw. dessen einzelne Untereinheiten kombiniert werden. Das entsprechende Polypeptid kann also gemeinsam mit mindestens einem weiteren Helicobacter Antigen, wie z.B. der nativen Urease oder deren Untereinheiten, Fragmenten Homologen, Mutanten oder Derivaten derselben exprimiert werden. Außerdem können z.B. verschiedene Subunit-Vakzine einzeln oder als Fusionsprotein wie weiter oben beschrieben gemeinsam verabreicht werden. Hierfür können wiederum z.B. gereinigte Polypeptid-Moleküle in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans, bakteriellen Toxin oder Cytokin verwendet werden. Weiterhin können diverse Kombinationen von Nukleotid-Sequenzen immunogener Untereinheiten der beschriebenen Polypeptid-Moleküle auf einem gemeinsamen Plasmid hergestellt und als Lebendvakzin verabreicht werden. Ein Vakzinvektor der Erfindung kann also ein oder mehrere Polypeptide der Erfindung, Derivate bzw. Fragmente dergleichen enthalten. Außerdem besteht die Möglichkeit der Kombination eines DNA-Vakzins mit ein oder mehreren gereinigten Subunit-Vakzinen in einer geeigneten Trägersubstanz, wie bereits weiter oben beschrieben wurde.
Zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe aus dem Pool der identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe können ebenfalls bakterielle Träger sehr wirksam eingesetzt werden, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff- Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger.
Display-Systeme dienen dazu, ein exprimiertes Polypeptid der Erfindung an der Zelloberfläche von Bakterien zu präsentieren. Den Transport von Polypeptiden durch die innere Membran ermöglicht ein Signalpeptid am Aminoende, während andere Anteile die Einlagerung und Verankerung in der äußeren Membran übernehmen. Als Trägeranteile sind verschiedene äußere Membranproteine von E. coli beschrieben worden wie z.B. PhoE (Agterberg et al. , ( 1 990) oder OmpA (Francisco et al. , 1 992) . Es können jedoch auch Fusionen mit der Transportdomäne des IgA-Proteasevorläufers IgAß verwendet werden (Klauser et al. , 1 990) . Beispiele für Display-Systeme sind z.B. das DsbA-System (PCT/EP 94/02486) oder das Autotransporter-System (AIDA; WO97/35022) . Die an der Oberfläche präsentierten Polypeptide können dann für Bindungsstudien mit Peptid- oder kombinatorischen chemischen Substanzenbanken verwendet werden. Die Bindungsstudien können mit Hilfe eines "High Through Put" Systems, das hohe Testraten ermöglicht, in Flüssigkeit oder aber gebundener Form durchgeführt werden. Hierfür werden die präsentierten Polypeptide z.B. an ein Chromatophor gekoppelt, das in Kombination mit einem weiteren Chromatophor, das an das Wirkstoff-Peptid oder die chemische Substanz gekoppelt ist, eine Farbreaktion ermöglicht. Die entsprechende Wirkstoffkomponente kann jedoch auch z.B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert oder an eine feste Trägermatrix gekoppelt sein. Bei Verwendung eines "Solid Phase Systems" wird vorher entweder das verwendete Polypeptid der Erfindung oder aber umgekehrt die Peptid- bzw. kombinatorische Wirkstoffbank an die Trägermatrix gekoppelt. Diejeweilige farbstoffmarkierte Komponente bindet dann an die immobilisierte Komponente, wodurch wieder eine Farbreaktion ermöglicht wird. Nach der Bindungsreaktion müssen dann mehrere Waschvorgänge vollzogen werden, bevor die entsprechende Substanz isoliert wird. Vorteil des "Solid Phase Systems" gegenüber der Bindung in Flüssigkeit ist, daß die wirksame Substanz schneller isoliert werden kann, da die ungebundenen Substanzen weggewaschen sind.
Weitere Verfahren zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe basieren auf den Kenntnisse aus der Primärstruktur der identifizierten essentiellen Gene bzw. benutzen die aufgereinigten gentechnisch hergestellten Genprodukte.
Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, spezifische Bindepartner der von den identifizierten Genen kodierten Polypeptide zu finden.
Es können bevorzugt Homologiestudien mit Helicobacter und anderen Organismen durchgeführt werden, z.B. mit Hilfe von Computer-Alignments, Southern Blots, PCR und dgl. und anschließender Zuordnung der Sequenzen. Aufgrund von Homologien kann dann auf potentielle Bindepartner der Proteine geschlossen werden.
Ebenfalls bevorzugt können auch kombinatorische Bindungsstudien über Target-gerichtetes-Screening-Verfahren mit Hilfe von Substanzen- Bibliotheken durchgeführt werden. Die potentiellen bindenden Substanzen werden in einer speziellen Anordnung gebunden vorgelegt, z.B. in Mikrotiterplatten oder anderen Trägermaterialien. Anschließend wird das "Target", in der Regel aufgereinigte, gegebenenfalls rekombinante in löslicher Form hinzugegeben, was den Nachweis einer Wechselwirkung zwischen dem Target und bestimmten Substanzen ermöglicht. Ein indirekter Nachweis kann durch markierte Antikörper, die gegen die Substanz gerichtet sind, oder durch Einführen zusätzlicher Elemente ("Tags") in das Target erbracht werden.
Eine weitere Variante der Bindungsstudien besteht in der Expression von in rekombinanten Bakterien (z.B. solche, die das fluoreszierende Protein GFP oder bestimmte Enzyme herstellen), welche die Proteine auf der Oberfläche präsentieren, und anschließendes Testen einer Substanzen-Bibliothek.
Weiterhin kann die dreidimensionale Struktur der von den erfindungsgemäßen identifizierten Genen kodierten Polypeptide oder deren Fragmente auch durch kristallographische Analyse ermittelt werden. Bei ausreichender Auflösung können eventuelle "Taschen" oder sonstige Bindestellen in ihrer dreidimensionalen Struktur exakt charakterisiert werden. Aufgrund dieser Daten kann die Struktur potentieller Bindepartner berechnet werden.
Mit Verfahren, wie etwa "Two-hybrid System", Display-Systemen, "High Throughput Screening" oder kombinatorischen Bindungsstudien können zufällig generierte Polypeptide identifiziert werden, die an die Helicobacter Polypeptide der Erfindung oder deren Fragmente, oder an weitere erfindungsgemäß identifizierte Polypeptide binden. Wird auf diese Weise ein entsprechendes Peptid gefunden, kann dieses chemisch weiter modifiziert werden, bis die optimale mögliche Bindung erreicht ist. Das identifizierte Polypeptid kann z.B. als Inhibitor verwendet werden, indem es z.B. an ein Toxin und ein Internalisierungssignal gekoppelt wird, das den pathogenen Keim zerstört oder aber als Peptidmimetikum, um das Binden des Keims an die zelluläre Oberfläche zu verhindern (EP-41 2,762A und EP-B31 ,080A) . Mit Hilfe des "Two Hybrid Systems" können aber auch Aktivatoren des Immunsystems generiert werden. Die identifizierten Peptide, die an die Helicobacter Polypeptide der Erfindung binden, können hierzu an bestimmte Liganden z.B. für den T-Zell-Rezeptor gekoppelt werden. Werden also einem von Pathogenen befallenen Tier oder Menschen diese so ausgestatteten Peptide verabreicht, wird das körpereigene Immunsystem spezifisch angelockt und aktiviert. Die Einhaltung der einzelnen Schritte ist hierbei nicht zwingend, sondern kann durch weitere Schritte ergänzt bzw. ersetzt werden.
Die jeweiligen Prototypen eines immunologischen bzw. pharmakologischen Wirkstoffs werden nachfolgend weiterentwickelt und verbessert.
Die Weiterentwicklung eines Impfstoffes kann dahingehend erfolgen, indem mehrere antigene Genprodukte oder Teile davon in einem Wirkstoff kombiniert werden und/oder mit verschiedenen Trägern bzw. Zusatzstoffen verabreicht werden. Als Trägerfungieren verschieden attenuierte bakterielle oder virale Organismen und als Zusatzstoffe Adjuvantien und/oder Cytokine.
Zur Weiterentwicklung eines pharmakologischen Wirkstoffs wird eine als wirksam charakterisierte Leadstruktur chemisch weiter modifiziert, so daß eine optimale Bindung und Inhibierung des identifizierten Genprodukts erfolgt. Weiterhin sollte der Wirkstoff vom Patienten gut vertragen werden und geringe Nebenwirkungen besitzen.
Zur Identifizierung von Wirkstoffen, die an Polynukleotide binden, kann ein Polynukleotid der Erfindung z.B. an eine Trägermatrix vorgekoppelt werden bzw. umgekehrt, die Wirkstoffe der Polypeptide- bzw. kombinatorischen Substanzenbank. Das verwendete darauffolgende Schema ist das gleiche wie das, das für die Polypeptide schon beschrieben wurde.
Solche inhibitorischen Substanzen können Polypeptide, Peptide, aber auch chemische Substanzen sein, wie etwa Antibiotika. Die inhibitorische Wirkung kann dabei in verschieden Stadien der Replikation der zu bekämpfenden Mikroorganismen eingreifen . Beispiele sind Expressionsinhibitoren oder Enzyminhibitoren oder sonstige Inhibitoren, welche die natürliche Funktion der Polypeptide von Helicobacter und verwandten Mikroorganismen beeinflussen können. Solche inhibitorischen Substanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Eine weitere Möglichkeit, einen optimalen Wirkstoff gegen Helicobacter und andere bakterielle Infektionen zu finden, ist mit Hilfe von speziellen Computerprogrammen. Aufgrund von kristallographischen Daten, die von den in der Erfindung beschriebenen Polypeptiden gewonnen wurden kann ein Modell erstellt werden, das sterische, elektronische, hydrophobe und sogenannten "resultierende Bindungsmomente" (RBMs) miteinander verbindet (Ray et al., 1 998) . Anhand dieses Modells können im weiteren Substanzen am Computer modelliert werden, die zwar die bereits identifizierten Leadstrukturen enthalten können, aber mit besseren Bindungseigenschaften ausgestattet sind. Es können jedoch auch völlig neuartige Wirkstoffe entworfen werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein essentielles sekretorisches Gen aus Helicobacter pylori kodiert, das durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wurde. Es wurden essentielle He/icobactergene mit dem vorliegenden Verfahren identifiziert, deren Nukleinsäuresequenzen in den SEQ ID NO. 1 bis 245 (ungerade Zahlen) angegeben sind. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure ist beispielsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie (a) eine der in SEQ ID NO: n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 245 einschließlich ist, dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon, (b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.
Neben den im Sequenzprotokoll gezeigten erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1 989), 1 .1 01 - 1 .1 04) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 X SSC und 0, 1 % SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55 °C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h in 0,2 X SSC und 0, 1 % SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55 °C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder einer diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Nukleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, wie etwa eine peptidische Nukleinsäure, umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Protein-kodierenden Abschnitt der in Sequenzprotokoll dargestellten Nukleotidsequenzen oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 80 %, vorzugsweise mehr als 90 % und besonders bevorzugt mehr als 95 % zu den dargestellten Nukleotidsequenzen oder einen vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide (nt) und besonders bevorzugt mindestens 50 nt langen Abschnitt davon aufweist.
Die Homologie wird in Prozent identischer Positionen beim Vergleich zweier Nukleinsäuren (bzw. Peptidketten) angegeben, wobei 100% Homologie die völlige Identität der verglichenen Kettenmoleküle bedeutet (Herder: Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag 1 995). Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann für ein sekretiertes Polypeptid mit Signalpeptid kodieren oder für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt sowohl die Sequenz des kodierenden Strangs als auch die dazu komplementäre Sequenz. Letztere kann beispielsweise bei der Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren Anwendung finden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist natürlich auch eine Genbank, die mindestens 2, bevorzugt mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 1 00 der genannten Nukleinsäuren in Vektoren kloniert enthält.
Eine Auflistung der hierin und im Sequenzprotokoll angegebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren samt ihrer Genprodukte und deren Funktionen und putativen Funktionen ist in den Tabellen I und II angegeben.
Bei den Genen, die im Sequenzprotokoll in ihrer Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz angegeben sind, handelt es sich um bakterielle Gene. Prokaryoten verwenden außer dem AUG-Codon (mRNA) auch noch andere (alternative) Start-Codons. Diese sind AUU (codiert normalerweise für Isoleucin, lle), UUG (codiert normalerweise für Leucin, Leu) und GUG (kodiert normalerweise für Valin, Val) . Im Sequenzprotokoll wurden die Aminosäuresequenzen gemäß dem normalerweise verwendeten Translationscode translatiert. Es wird darauf hingewiesen, daß beim Lesen des Sequenzprotokolls die prokaryontische Verwendung alternativer Startcodons berücksichtigt werden muß, und daß somit hierin auch von den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 35, 49, 61 , 69, 75, 81 , 1 03 und 105 kodierte Aminosäuresequenzen offenbart sind, welche anstatt mit einem im Sequenzprotokoll dargestellten jeweiligen Leu-, Val- oder Ile-Rest, mit einem Methioninrest (Met) anfangen. Auch die folgenden Gen-Sequenzen starten mit alternativen Start-Codons: HPC1 52(UUG) ; HPC190(UUG); HPN048(GUG); HPN 132(GUG); HPC010(GUG); HPC036(UUG); HPC056(UUG); HPC16KGUG) . Diese Codons werden in der Regel als Met translatiert, wenn sie als Startcodons fungieren.
Tabelle I: Obligat essentielle Gene
Tabelle II: Fakultativ essentielle Gene
n.d. = nicht bestimmt
SEQ ID NO 247: zeigt die Sequenz des Vektors pSRM4 (Abbildung 13).
Die Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis 114 sind im beiliegenden Sequenzprotokoll dargestellt.
Die Sequenzen SEQ ID NO. 115 bis 246 sind in den Abbildungen 14 und 15 dargestellt. lπ den nachfolgenden Tabellen A und B sind die Nuklelnsäurβ-Sequenzeπ dar Identifizierten Helicobacter Gene (Geπ-ID) aufgeführt, deren Nuklelnβäure-Sβquenzen nicht vollständig ermittelt werden konnten. Das dargestellte eβeraβtβr der ermittelten Helicobacter Geπsβquenzeπ Ist aufgrund der Selektion nach funktionalen Fusionen mit dem verwendeten Indlkatoηgeπ, der ß-Lactamase sichergestellt (siehe Beispiel 3 und 4).
In Tabelle A sind die Helicobacter Gene aufgeführt, die ein unvollständiges S'-Ende und oder 3'-Ende enthalten. In Tabelle B sind solche Helicobacter Gene aufgeführt, dsnen aufgrund fehlender Sequenz- Daten eine oder mehrere Aminosäuren nicht zugeordnet werden können. In allen Fällen können Stαp- Codonβ ausgeschlossen werden.
Tabelle A Gβπ-Sβquβπzβn mit unvollständigem &'• und/oder 3'-Hnde. e orie; Obli at Bβacntlalla Qβπs
Tabelle B Unvollständige Aminosäuren-Sequenzen
Kata orla: Obli at essentielle Qβnβ
1 Position der fehlenden Aminosäure In der abgeleiteten Aminosäuren Sequenz Position In der Nukleinsäuren-Sequenz, erste Base vom kodierenden Basβn-Tripiett.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen Abschnitt davon enthält. Die Nukleinsäure oder der Nukleinsäureabschnitt kann so in den Vektor kloniert sein, daß sie entweder in Sense- oder Antisense Richtung exprimiert werden kann. Der Nukleinsäureabschnitt hat bevorzugt eine Mindestlänge von 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt 20 Nukleotiden, stärker bevorzugt 50 Nukleotiden. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA- Sequenz vorzugsweise in Verbindung mit Expressionssignalen befindet, wie z.B. Promoter, Operator, Enhancer etc. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen (z.B. Bakteriophage λ) und extrachromosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Vektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z.B. bei Sambrook etal., Molecular Cloning ( 1987), Kapitel 1 -4, beschrieben. Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z.B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor (z.B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor, Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kapitel 16 beschrieben. CAI- und SRM-Vektoren, wie oben beschrieben, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Zelle eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise ein gram-negatives Bakterium, z.B. E.coli. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle, eine Hefezelle, eine tierische oder eine pflanzliche Zelle. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Zelle um einen Mikroorganismus, z.B. Helicobacter oder Salmonellen. Mit CAI- oder SRM-Vektoren transformierte Mikroorganismen sind oben bereits beschrieben worden. Diese sind, wie auch mit den obigen Verfahren herstellbare Mutantenbanken, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein essentielles und bevorzugt sekretiertes Polypeptid von H. ylori. Insbesondere ist dies ein Polypeptid, das
(a) eine der in SEQ ID NO: m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 246 einschließlich ist, dargestellten Aminosäuresequenzen oder
(b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.
Unter immunologische kreuzreagierenden Sequenzen sind somit auch Muteine, Varianten und Fragmente der in den SEQ ID NO. 2 bis 246 dargestellten Sequenzen umfaßt. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von den obigen Sequenzen unterscheiden.
Aufgrund von Homologieanalysen mit Hilfe des FASTA Proteinprogramms konnten den identifizierten Polypeptiden, deren Sequenz mit der Nukleinsäuresequenz gefunden werden konnte, bestimmte Merkmale bzw. eine mutmaßliche Lokalisation im Bakterium zugewiesen werden. Einige der von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide besitzen ein Signalpeptid und werden durch den See-abhängigen Transport- mechanismus an ihre Zielstelle exportiert, während andere kein Signalpeptid besitzen und daher wahrscheinlich über einen See-unabhängigen Transportmechanismus, z.B. durch das ABC-Transporter-System, sekretiert werden (siehe Tabellen I und II).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide und -fragmente. Die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man eine Zelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nichtfusionspolypeptid gewonnen werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch einen Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Fragmente solcher Antikörper, wie z.B. Fab-Fragmente oder Fc-Fragmente.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Inhibitor der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Fragmente, bzw. deren Expression, Präsentation oder/und natürlichen Funktion. Dies ist bevorzugt ein Molekül, welches in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment davon zu binden oder/und dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche Funktion zu beeinflussen. Die Identifizierung von solchen spezifischen Bindepartnern wurde oben bereits beschrieben. Besonders geeignet als Inhibitoren sind Proteine oder Peptide, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in seinen natürlichen Funktion hemmen, z.B. können Enzyme durch Blockieren des aktiven Zentrums gehemmt werden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung , die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, einen erfindungsgemäßen Vektor, eine erfindungsgemäße Zelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragment davon oder/und ein inhibitorisches Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an ein erf indungsgemäßes Polypeptid zu binden, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln enthält.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedene Art und Weise und unter Verwendung einzelner ihrer Bestandteile als wirksame Substanzen zur Hemmung der Reproduktion von Helicobacter Organismen in einem Wirt, speziell im Menschen verwendet werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits zur Diagnostik einer Helicobacter- Infektion verwendet werden. Die Diagnostik auf Nukleinsäureebene erfolgt vorzugsweise durch Verwendung von Hybridisierungssonden, bzw. Primern, welche eine spezifische DNA- Sequenz aufweisen, die zu mindestens einen Abschnitt einer der in SEQ ID NO. 1 bis 245 (ungerade Zahlen) dargestellten Sequenzen komplementär ist, so daß sie eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Sequenzen erlauben. Wie bereits erwähnt, können diese Amplifikationsprimer oder Sonden auch zur Amplifikation und damit zur Detektion von verwandten Mikroorganismen verwendet werden, wenn diese Gensequenzen aufweisen, die für dasselbe essentielle Gen kodieren. Auf Proteinebene erfolgt die Diagnostik vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.
Des weiteren ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und Bekämpfung von / e//co-_>acter-lnfektionen und Infektionen mit verwandten Mikroorganismen geeignet.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der identifizierten essentiellen Gene von Helicobacter pylori 'zur Prävention oder Bekämpfung einer Infektion mit Helicobacter oder verwandten Mikroorganismen. Insbesondere können diese identifizierten essentiellen Gene zur Herstellung von Impfstoffen (Vakzinen) verwendet werden (siehe oben) . Eine weitere Verwendung der Polypeptide der Erfindung besteht in der Aufreinigung der Antikörper gegen H. ylori Polypeptide und gegen entsprechende Polypeptide aus verwandten und anderen Mikroorganismen.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele, Abbildungen und das Sequenzprötokoll näher erläutert. Im Sequenzprotokoll sind die in den Tabellen I und II aufgelisteten Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen dargestellt.
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung eines CAI-Vektors.
Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens der konditionalen Antisense-Hemmung (CAI).
Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der Untersuchung der Lebendfähigkeit von defizienten Mikroorganismen anhand ihrer Überlebensraten mit Hilfe des CIA- Verfahrens.
Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung des subtraktiven
CAI-Verfahrens (CAI).
Abbildung 5 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM-Vektors.
Abbildung 6 zeigt eine schematische Darstellung der reversiblen
Inaktivierung eines Gens durch die Insertion/Excision eines konditional replizierenden SRM-Plasmids.
Abbildung 7 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM- Verfahrens. Abbildung 8 zeigt eine schematische Darstellung der Anreicherung von Fragmenten essentieller Gene durch subtraktive Hybridisierung.
Abbildung 9 zeigt eine Übersichtskarte von pSRM4. Der "origin of replication" (ori) ist als Balken, kodierende Regionen (nähere Erläuterungen s. unten) sind als Pfeile dargestellt. Singuläre Restriktionsschnittstellen sind angegeben.
Abbildung 10 zeigt eine Schematische Darstellung der Integration und
Exzision eines pSRM Plasmids, das ein Insert mit
Homologie zu einem Gen des Empfängerorganismus trägt. Die Doppelpfeile zeigen die Gleichgewichtsreaktionen zwischen Integration und
Exzision. Gestrichelte Linien deuten auf den DNA- Bereich, in dem homologe Rekombination stattfindet.
Abbildung 11 zeigt eine schematische Übersicht über die Schritte zur Konstruktion einer zufälligen Fragmentbank.
Abbildung 12 zeigt die vollständige Nukleotid- und
Aminosäuresequenz der Genfusion des HPC001 - Proteins mit dem RGS - His4-Epitop. Die Vektorsequenzen sind schwarz unterlegt.
Abbildung 13 zeigt die Nukleotidsequenz des SRM-Vektors pRSM4.
Abbildungen 14 und 15 zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen weiterer essentieller Helicobacter-Gene. Beispiele
Beispiel 1
Identifizierung essentieller Gene durch Herstellung gendefizienter
Mikroorganismen durch subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM)
Die Anwendung des dargestellten Gesamtverfahrens ist exemplarisch am Beispiel des Pathogens Salmonella dargestellt, läßt sich jedoch auch mit anderen pathogenen Keimen, z.B. Helicobacter, durchführen.
Das SRM-Verfahren wird mit dem Vektor pSRM4 durchgeführt, der speziell für dieses Verfahren entwickelt wurde (siehe Abbildung 9, Sequenz siehe SEQ ID No.: 247
Das Plasmid weist folgende Eigenschaften auf:
pSRM4 trägt eine temperatursensitive Replikationsfunktion (repAXs, ori + ) aus dem Streptococcus Plasmid pWV01 (Kok, et al. , 1984; Maguin, et al. , 1 992) und repliziert bei permissiver Temperatur (30°C) in Gram-negativen Bakterien (E. co/i, Salmonella, u.a.) und in Gram-positiven Bakterien (Bacillus, Lactococcus, Streptococcus, u.a). Auf Grund des Replikationsmechanismus ("rolling circle" Mechanismus) ist es möglich, dass das Plasmid ebenso in Helicobacter pylori wie auch in Mycobakterien repliziert (del Solar, et al. , 1 993; Kleanthous, et al. , 1 991 ). Zum Test der Stabilität von pSRM4 bei 30°C in E. coli oder Salmonella werden die Bakterien über Nacht bei 30°C in Flüssigmedium (FIMed) mit Tetrazyklin (Tet) (1 7.5 μg/ml) angezogen, 1 : 100 in mit Tet verdünnt, nach 3 Stunden Inkubation bei 30°C nochmals 1 :103 in FIMed verdünnt (tO) und anschliessend bei 30°C ohne Tet inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots der Kultur entnommen und in geeigneten Verdünnungen auf Festmedium (FeMed) mit und ohne Tet ausplattiert. Nach Inkubation bei 30°C werden die Koloniezahlen auf beiden Medien bestimmt und die Anzahl an Klonen pro ml Kultur berechnet. Die Anzahl Tet resistenter und Tet sensitiver Klone ist bis zu 7 Stunden nach tO identisch, nach 1 9 Stunden sind noch ca. 1 0% der Klone resistent gegen Tet.
Bei 37 °C repliziert pSRM4 weder in Salmonella noch in E. coli.
Das Experiment wird wie unter (1 ) durchgeführt mit dem Unterschied, dass die Inkubation bei 37°C (ohne Tet) stattfindet. Nach 80 bis 1 80 Minuten nach tO beginnt die Zahl an Tet sensitiven Klonen logarithmisch anzusteigen, während die Anzahl an Tet resistenten (plasmidhaltigen) Klonen gleich bleibt.
pSRM4 codiert für eine Tetrazyklin Resistenz, die Resistenz gegen 1 7,5 pg Tetrazyklin/ml vermittelt. Das Tetrazyklin-Resistenzgen kann gegen andere Resistenzgene ausgetauscht werden. Dazu stehen innerhalb des Vektors mehrere Restriktionsschnittstellen zur Verfügung (s. Abb. 9).
pSRM4 enthält eine sog. "multiple cloning site" (mcs) mit verschiedenen, singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme.
Die mcs liegt in einem Teil des lacZ Gens, das zur alpha-Komplementation in E. coli- Stämmen wie DH5σ, XL1 -Blue, oder EC101 (Law, et al. , 1 995) verwendet werden kann. Dadurch können Plasmide, die klonierte DNA Fragmente in der mcs tragen, durch blau/weiss-Unterscheidung auf Festmedium mit X-Gal (80 pg/ml) und IPTG (420 pM IPTG) identifiziert werden. Klone von EC101 , die Plasmide mit Inserts tragen, bilden weisse Kolonien, während Kolonien von Klonen, die Plasmide ohne Insert enthalten, blau sind.
pSRM4 lässt sich mit einer Effizienz von 2x107 bis 2x108 pro pg DNA in E. coli DH5σ bzw. EC101 , und mit einer Effizienz von von 5x106/pg in S. typhimurium ATCC 14028 transformieren. Die Transformation erfolgt über Elektroporation nach Standardprotokollen. pSRM4 rekombiniert nicht mit dem Genom von S. typhimurium. pSRM4 wurde in S. typhimurium ATCC 14028 transformiert; die Transformanten wurden 48 h bei 30°C auf FeMed mit Tet kultiviert und vereinzelt. Eine Einzelkolonie (ca. 1 08 Zellen) wurde in einem ml FIMed resuspendiert und in entsprechenden Verdünnungen auf FeMed mit Tet bei 30°C zur Bestimmung der Gesamtzellzahl bzw. bei 37°C zur Bestimmung der Anzahl der Integranten inkubiert. Unter 1 x108 Zellen der Ausgangskolonie wurde kein Klon gefunden, der bei 37°C Kolonien bildet. Die Häufigkeit der nicht-homologen Rekombination des Plasmids mit dem Genom von S. typhimurium beträgt demnach weniger als 1 x1 0'8.
pSRM4 mit kurzen genomischen Inserts eignet sich zur Inaktivierung von genomischen Genen über homologe Rekombination (Beispiele: phoP Gen und phoN Gen aus S. typhimurium) .
Interne Fragmente der Gene phoP (561 bp) bzw. phoN (543 bp) wurden in pSRM4 kloniert. Die entsprechenden Plasmide (pSRM4-p ?σE bzw. pSRM4- phoN) wurden in S. typhimurium ATCC14028 transformiert und die erhaltenen Klone bei 30°C mit Tet selektioniert. Zwei Kolonien wurden in mehreren Verdünnungen auf BCiP-haltige Minimalmediumplatten ausplattiert und bei 30°C und bei 37°C inkubiert. Kolonien, die bei nicht-permissiver Temperatur (37°C) wachsen, bestehen aus Zellen mit genomisch integriertem Vektor. Diese Kolonien zeigen keine bzw. nur eine schwache Blaufärbung, da durch die Insertion des Vektors pSRM-pΛo/ bzw. pSRM4- phoP das für die saure Phosphatase PhoN codierende Gen phoN bzw. dessen Aktivatorgen phoP inaktiviert werden und damit keine Umsetzung des Farbstoffes BCiP erfolgen kann. Aus den erhaltenen Werten errechnen sich durchschnittliche Rekombinationsraten von ca. 3,6x1 0"4. Diese Rekombinationsraten wurden auch für kürzere genomische Fragmente von bis zu 1 00 bp Länge beobachtet. Bei 37 °C wachsende Klone werden auf homologe Rekombination und Integration des Plasmids in das Genom überprüft. Zum Nachweis der Integration werden PCR-Reaktionen mit einem PCR-Primer, der mit Sequenzen des Plasmids hybridisiert, und einem pΛo/V-bzw. phoP- spezifischen Primer, der zu einer chromosomalenpΛo/V-bzw.pΛσE-Sequenz, nicht aber zum klonierten p/?oN-bzw. pΛoE-Fragment homolog ist, durchgeführt (Primerpaare phoNfor [GCTGTCGACTTTCTACCACTGATCGTAGC] / lacZ2 [CATGCCATGGCTGCGCGTAACCACC] bzw. phoP3 [CCCCAAAGCACCATAATCAACGC] /lacZl [CATGCCATGGAAGAGCGCCCAATAC]). Amplifiziert wird DNA von dem Plasmid zusammen mit einem Stück chromosomaler DNA, die benachbart zur Insertionsstelle liegt. Bei genomischer Integration des Plasmids werden grosse Mengen an PCR Fragment erhalten. Zur Überprüfung des Verlusts an freier Plasmid-DNA dient eine PCR mit den Primern lacZl / SRMgb2 [ATACCGTCGACCTCGAG]. Beide Primer hybridisieren nur gegen Sequenzen des Plasmids, die sich seitlich zu dem klonierten Insert bedinden; bei genomisch integriertem Plasmid ergibt diese Amplifikation nur ein eine sehr geringe Menge an Produkt.
Genomisch integriertes pSRM4 exzisiert bei permissiver Temperatur. Klonierte genomische Inserts können über PCR mit verschiedenen Primerpaaren (SRMgb2/SRMgb4[AACAAAAGCTGGGTACC]; lacZl /SRMgb2) leicht präpariert werden.
Integrantenstämme (S. typhimurium ATCC14028-Derivate mit Integration von pSRM-phoN) werden auf FeMed mit Tet bei 30°C und bei 37 °C inkubiert und anschliessend kolonieweise unter Verwendung verschiedener Verdünnungen bei beiden Temperaturen auf FeMed mit oder ohne Tet ausplattiert, um die Häufigkeit der Exzision zu quantifizieren. Der Quotient aus der Kolonienzahl auf FeMed ohne Tet und derjenigen auf FeMed mit Tet gibt an, in wieviel Zellen einer Kolonie das Plasmid frei vorliegt im Vergleich zu Zellen mit genomisch integriertem Plasmid. Der Quotient ist ein Mass für die Exzisionsrate. Je nach Ausgangskolonie ergeben sich Exzisionsraten von 3,2 bis 1 7, 1 .
Exzisiertes Plasmid wird wiederum unter Verwendung der Primer SRMgb2 und SRMgb4 oder der Primer lacZl und SRMgb2 in einer PCR nachgewiesen. Es ergeben sich grosse Mengen an PCR Produkt.
Bei der Insertion und Exzision von pSRM4-/ira<7/77et7f über homologe Rekombination handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion (siehe Abb. 10) . Bei 30°C ist das Gleichgewicht zur Seite des frei in der Zelle replizierenden Plasmids verschoben, bei 37°C liegt vor allem genomisch integriertes Plasmid vor. Sowohl bei 30°C als auch bei 37°C kann freies und integriertes Plasmid über PCR nachgewiesen werden. Die jeweiligen Mengenverhältnisse sind aber entsprechend der Temperatursensitivität des Plasmids verschoben.
Eine Mutante, die pSRM4-phoP im phoP Gen enthält, ist in einem Zellkultursystem stabil und attenuiert.
Zur Überprüfung der Stabilität und Attenuierung einer pSRM4-pΛoEMutante wird die intrazelluläre Vermehrung dieser Mutante in murinen J774A.1 Makrophagen mit der Vermehrung von pSRM4-p/?oN, mit dem Wildtyp S. typhimurium ATCC14028, und mit stabilen phoP und phoN Mutanten verglichen. Dazu werden 4x105 Makrophagen der Zellinie J774A.1 mit 8x1 06 Bakterien eines Klons bei 37°C, 5% CO2 infiziert. Nach 30 min werden die extrazellulären Bakterien durch Waschen mit PBS sowie durch die Zugabe von 10 pg/ml Gentamicin zum Medium entfernt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion werden die Makrophagen mit 0,5% Natriumdesoxycholat lysiert und geeignete Verdünnungsstufen des Zelllysats auf FeMed ausplattiert. Nach Inkubation werden die Koloniezahlen bestimmt und die Anzahl an Bakterien pro ml Kultur berechnet. Während sich der wildtypische Stamm über einen Zeitraum von 7 bis 24 Stunden deutlich in den Makrophagen vermehrt, ist eine stabile phoP Mutante stark attenuiert. Eine stabile phoN Mutante und eine pSRM4-p/7θ/V Insertionsmutante verhalten sich wie der Wildtyp. Eine pSRM4-p/?σP Insertionsutante verhält sich wie die stabile phoP Mutante. Die Vermehrungsraten sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst
Tabelle III:
Stabilität und Attenuierung von pSRM-lnsertionsmutanten unter Selektion in Makrophagen.
Stamm Vermehrung (x-fach) nach Stunden
3 5 7 24
14028 Wildtyp 0,1 1,0 18,8 34,7
14028 p/?oN 0,1 1,3 3,9 39,9
14028 pSRM4- 1,6 4,2 11,3 20,8 phoN
14028 phoP 0,1 0,2 0,1 0,6
14028 pSRM4- 0,1 0,1 0,1 1,5 phoP
pSRM4 eignet sich zur Konstruktion von SRM rPCR Fragmentbanken.
Die rPCR (random PCR) Fragmentbanken werden auf folgende Art hergestellt: 1 .) Amplifikation von zufällig erzeugten - 500 bp Fragmenten
Nach dem "random Annealing" von Random-Primer OL-30N8 [AAGTCGACGGATCCGGJACCTNNNNNNNN; N = A, T, G, oder C; unterstrichen: Tpr7l-Restriktionsschnittstelle] an gescherte chromosomale DNA von S. typhimurium ATCC 14028 (400 ng) werden die Primer mittels Klenow- Polymerase verlängert (s. Abb. 1 1 ); die DNA wird aufgereinigt und einer PCR mit dem Primer OL-30 [AAGTCGACGGATCCGGTACCT] unterworfen. Fragmente von ca. 500 bp werden aus einem Agarose-Gel eluiert, aufgereinigt und zur erneuten Amplifikation mit dem Primer OL-30 eingesetzt. Dieser Schritt wird wiederholt. Das genaue Protokoll ist der Tab. IV zu entnehmen; das Prinzip des Verfahrens ist in Abb. 1 1 illustriert.
2.) Ligation und Erstellung der Fragmentbank
Spaltung der eluierten genomischen Fragmente mit Kpn\ und Ligation mit dephosphoryliertem, pt7l-restringiertem pSRM4. Transformation in E. coli EC1 01 oder S. typhimurium ATCC 14028. Selektion der Transformanten auf FeMed mit Tet bei 30°C.
3.) Test der Fragmentbank mittels PCR und blau/weiss-Selektion Bestimmung des Hintergrundes an religiertem Vektor mittels Kontroll- Ligationen und mittels blau/weiss-Selektion auf FeMinimalmedium mit BCiP (40 g/ml) . PCR von klonierten Inserts mit Primer lacZl und SRMgb4. Der Hintergrund an religiertem Vektor liegt nach PCR-Detektion und Auswertung der blau/weiss-Selektion bei etwa 10-25%
Tabelle IV:
Reaktionsbedingungen zur Konstruktion einer zufälligen Fragmentbank mittels rPCR. Tabelle IV: Reaktionsbedingungen zur Konstruktion einer zufälligen Fragmentbank mittels rPCR.
SRM Fragmentbanken werden zur Konstruktion von SRM Mutantenbanken verwendet.
SRM Fragmentbanken, die in E.coli EC101 kloniert wurden, werden in S. typhimurium ATCC 14028 transformiert. Die Transformanten werden bei 30°C auf FeMed mit Tet selektioniert. Die erhaltenen Kolonien werden von den Platten in FIMed mit Tet abgeschwemmt. Zur Reduktion der Menge an Zellen mit freiem Plasmid wird die Bakteriensuspension 3 Stunden bei 37°C inkubiert, und anschliessend auf FeMed mit Tet ausplattiert. Auf diese Art werden Tausende von genomischen Insertionsmutanten erhalten, die in ihrer Gesamtheit die SRM Mutantenbank darstellen. Um die Redundanz der SRM Mutantenbank zu verringern, wird von mehreren unabhängigen Konstruktionen der SRM Fragmentbank ausgegangen, von denen unabhängige Mutantenbanken erzeugt werden. Es werden jeweils 96 SRM Mutanten in einem Pool vereinigt. Diese 96 Mutanten eines SRM Pools können auch als einzelne Klone durch Tiefkühlung konserviert werden.
SRM Mutantenbanken werden negativ selektioniert. Die SRM Mutantenbank von S. typhimurium wird in J774A.1 Makrophagen oder in BALB/c Mäusen selektioniert (es können auch andere Zelllinien und andere Mausstämme verwendet werden). Dabei wird jeweils 1 Pool (96 Mutanten) selektioniert. Nach der Selektion werden die Bakterien zunächst auf FeMed mit Tet bei 37 °C kultiviert. Durch diesen Schritt vermehren sich nur diejenigen Klone, die genomisch integriertes pSRM Plasmid enthalten.
Wiedergewinnung von SRM Fragmenten aus genomisch integrierten SRM Mutantenbanken. Die Exzision der integrierten SRM Plasmide aus dem Genom erfolgt durch Inkubation in FIMed mit Tet bei 30°C. Plasmide, die aus einem selektionierten Pool von SRM Mutanten gewonnen wurden, werden als "Driver" bezeichnet. Plasmide, die aus dem identischen aber nicht selektionierten Pool stammen, ergeben den "Tester" . Die Plasmid DNA wird für Tester und Driver durch Plasmidpräparation aus den Bakterien gewonnen.
Einzelne DNA Fragmente, die in pSRM4 kloniert sind, können nach Amplifikation von Tester und Driver Fragmentbanken über PCR durch genetische Subtraktion identifiziert werden.
Die SRM Fragmente der selektionierten Klone aus einem 96er Pool werden für die Tester Gruppe durch PCR mit dem Primerpaar SRMgb2 / SRMgb4 amplifiziert. Für die Driver Gruppe werden diese Fragmente mit gleichen Primern amplifiziert, wobei die Primer zur Amplifikation der Driver DNA am
5'-Ende und am 2. Nukleotid nach dem 5'-Ende biotinyliert sind. Die
Randsequenzen der Tester-DNA-Fragmente können durch eine anschliessende Restriktion mit Kpn\ eliminiert werden, so dass
Hybridisierungen über die homologen Primersequenzen ausgeschlossen wird.
Für die Subtraktion werden biotinylierte Driver-DNA und Tester-DNA in Verhältnissen von 1 0: 1 bis 1 000: 1 gemischt. Die DNA dieser Ansätze wird präzipitiert, in 1 0 FI Hybridisierungspuffer (0,05 M HEPES pH7,5, 1 mM EDTA, unterschiedliche NaCI Konzentration) gelöst, zunächst für 3 Minuten bei 95°C inkubiert, gefolgt von einer 18 stündigen Inkubation bei 65°C. Die während dieser Hybridisierung gebildeten biotinylierten Homo- und Heterodimere werden über Streptavidin-gekoppelte magnetische Partikel aus dem Ansatz extrahiert. Um die Effizienz der Extraktion von homologen Driver-DNA-Fragmenten aus der Tester-DNA zu erhöhen (Anreicherung der zu identifizierenden Tester-DNA-Fragmente), wird die Subtraktion zwei bis dreimal wiederholt.
Für die Isolierung und anschliessende Identifizierung der angereicherten Tester-DNA-Fragmente werden diese über die p/7l-Schnittstelle in den pSRM4-Vektor kloniert. Identifizierung von SRM Fragmenten durch Southern (Dot) Blot. Als Alternative zur genetischen Subtraktion kann ein Blotting Verfahren angewendet werden, um SRM Fragmente von essentiellen Genen zu identifizieren. Dazu werden die SRM Fragmente aus jeweils 96 SRM Mutanten mit freien pSRM Plasmiden über PCR (Primer SRMgb2 / SRMgb4) amplifiziert und einzeln auf einem Membranfilter fixiert. Als Sonde zur Hybridisierung werden (1 ) PCR-amplifizierte SRM Fragmente aus dem Driver und (2) PCR-amplifizierte SRM Fragmente aus dem Tester verwendet. DNA Fragmente, die mit der Sonde aus dem Driver, aber nicht mit der Sonde aus dem Tester ein Signal ergeben, sind die gesuchten Fragmente essentieller Gene.
Subtraktive Rekombinations-Mutagenese in Helicobacter
Das SRM Verfahren kann in allen Organismen angewendet werden, in denen pSRM4 eine temperatursensitive Replikation zeigt. Darüberhinaus kann das SRM Verfahren für andere Organismen wie z.B. Helicobacter spp., Campylobacter spp., oder andere adaptiert werden, indem SRM Vektoren für diese Organismen konstruiert werden. Um den SRM Vektor z.B. für Helicobacter spp. zu adaptieren wird von einem Plasmid ausgegangen, dass in Helicobacter spp. repliziert, z.B. pHel (Heuermann und Haas, 1 995; Heuermann und Haas, 1 998) . Das Plasmid repliziert wie pSRM nach dem "rolling circle" Mechanismus, und die RepA Proteine beider Proteine sind homolog (del Solar, et al. , 1 993; Kleanthous, et al. , 1 991 ) . Von dem Plasmid wird entsprechend dem von Maguin et al. beschriebenen Verfahren (Maguin, et al. , 1 992) eine termperatursensitive Variante hergestellt. Dazu wird das Plasmid nach Standardmethoden in vitro mit Hydroxylamin mutagenisiert und bei permissiver Temperatur in H. pylori transformiert. Alternativ wird nur das repA Gen mutagenisiert und die mutagenisierte DNA anschliessend in ein rep -freies Plasmid kloniert. Durch Replika-Plattierung von H. pylori Klonen, die mutagenisiertes Plasmid bzw. repA enthalten, und Selektion der Klone mittels einer plasmid-kodierten Antibiotikaresistenz werden Varianten des Plasmids bzw. repA Gens identifiziert, die eine Replikation bei 30°C, aber nicht bei 37 °C erlauben. Die Mutation(en), die die Temperatursensitivität vermitten, werden durch Sequenzierung des Plasmids (bzw. des repA Gens) identifiziert. Die Temperatursensitivität des Plasmids wird weiterhin wie oben für pSRM4 beschrieben charakterisiert. Das Plasmid wird im Folgenden wie pSRM4 als Vektor für die Subtraktive Rekombinationsmutagenese in Helicobacter spp. eingesetzt.
Beispiel 2
Identifizierung essentieller Gene durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI)
Das CAI Verfahren kann mit verschiedenen Vektoren durchgeführt werden, die in dem zu untersuchenden Organismus replizieren und selektioniert werden können. Beispielhaft ist im Folgenden die Durchführung des Verfahrens in Salmonella typhimurium beschrieben. Als Vektor wird pCAl verwendet. pCAl enthält die Replikations- und Resistenzfunktionen von pWSK29 (Wang und Kushner, 1 991 ), oder von pBluescript, oder von pUC, oder von anderen Plasmiden. Der jeweilige Vektor enthält einen regulierbaren CAI Promoter sowie dessen eis- und -1ra/7S-reguIatorische Komponenten. Die Transkription von diesem Promoter wird durch exogene Faktoren (Induktoren) gesteuert. Bei dem regulierten CAI Promoter handelt es sich um den tet Promoter, der durch den tef-Operator und den Tet- Repressor nur in Anwesenheit von Tetrazyklin im Wuchsmedium aktiviert wird (Hillen und Berens, 1 994). Alternativ wird der ara Promoter verwendet, der über den ara-Operator und AraC, ein Aktivator Protein gesteuert wird und nur in Anwesenheit von Arabinose im Wuchsmedium aktiviert wird (Guzman, etal. , 1 995) . Grundsätzlich kann auch jeder andere durch exogene Signale regulierbare Promoter , verwendet werden. Stromaufwärts von der regulatorischen Sequenz des CAI Promoters werden mehrere Terminator Strukturen (Wilson und von Hippel, 1 995; Yarnell and Roberts, 1 999) eingefügt, die die transkriptionelle Aktivität von Sequenzen stromaufwärts des Promoters in Abwesenheit des Induktors unterdrücken. Stromabwärts von dem CAI Promoter können ein oder mehrere RNA- stabilisierende Elemente (RSE) eingefügt werden (Carrier und Keasling, 1 997a; Carrier und Keasling, 1 997b; Carrier und Keasling, 1 999) . Die RSE werden so kloniert, dass sich nach der Insertion von CAI Fragmenten am 5'- und/oder am 3'-Ende der transkribierten RNA Fusionen mit den RSE ergeben. Zwischen dem Promoter und der 5'-RSE Sequenz einerseits und der 3'-RSE Sequenz andererseits werden eine Kpn\ und andere Restriktionsschnittstellen (mcs) eingefügt, die später zur Insertion von CAI Fragmenten verwendet werden.
In dem CAI Vektor wird eine Bank mit genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Organimus konstruiert. Dazu werden in die mcs genomische DNA Fragmente kloniert, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen rPCR Verfahren präpariert wurden.
Die so erhaltene CAI Genbank wird in den zu untersuchenden Organismus transformiert und einzelne Klone werden über den Plasmid-kodierten Resistenzmarker selektioniert,
Das CAI Verfahren kann mit verschiedenen Selektions- und/oder Screening Verfahren angewendet werden, die nachfolgend beschrieben sind. Die
Funktionalität der einzelnen Screening Verfahren wird jeweils mit einem bestimmten Gen demonstriert. Dazu werden das aroA Gen, das phoP Gen, und das phoN Gen aus S. typhimurium verwendet. Zunächst werden
Fragmentbanken von ( 1 ) dem aroA Gen, (2) dem phoN Gen, und (3) dem phoP Gen in pCAl konstruiert. Zur Konstruktion dieser Fragmentbanken werden die genomischen Bereiche dieser Gene einschliesslich benachbarter
Sequenzen von ca. 500 bp auf jeder Seite des Gens durch PCR amplifiziert.
Die so erhaltenen PCR Produkte werden als Template für die Erzeugung von rPCR Fragmenten nach dem oben beschriebenen Verfahren verwendet. Die rPCR Fragmente werden ohne Fraktionierung verschieden langer DNA
Fragmente oder in verschiedenen Gruppen mit unterschiedlichen Längen
(durch Gelelution fraktioniert) in die Kpn\ Schnittstelle in der mcs von pCAl kloniert. Die so erhaltenen Fragmentbanken werden in S. typhimurium transformiert und auf den pCAI-kodierten Resistenzmarker selektioniert. Die drei Banken werden dann auf folgende Art getestet:
( 1 ) aroA Fragmentbank - Identifizierung von Klonen durch fehlendes Wachstum auf Nährmedium:
Die Klone der aroA Fragmentbank werden auf Platten mit Festmedium (M9 Minimalmedium mit Casaminoacids [CAA, Aminosäure Mischung] ohne Induktor) plattiert. Die Funktion des aroA Gens ist notwendig, damit sich die Bakterien auf M9 ohne CAA vermehren können. Die erhaltenen Kolonien werden durch Replika-Plattierung auf M9 mit CAA und auf M9 ohne CAA, jeweils mit Induktor, übertragen. Klone, bei denen Fragmente der aroA Fragmentbank in antisense Orientierung von dem CAI Promoter transkribiert werden und RNA synthetisieren, die das genomische aroA Gen translationell inhibieren, vermehren sich auf M9 mit CAA mit Induktor aber nicht auf M9 ohne CAA mit Induktor. Klone, die sich auf M9 ohne CAA nicht vermehren, werden isoliert und weiter analysiert.
(2) phoN Fragmentbank - Identifizierung von Klonen durch geänderte biochemische (Farb)-Reaktion auf Festmedium:
Die Klone der phoN Fragmentbank werden durch Replika-Plattierung auf M9 Medium mit BCiP und mit Induktor, und auf M9 mit BCiP ohne Induktor übertragen. Durch die Aktivität von PhoN wird BCiP zu einem blauen Farbstoff umgesetzt. Klone, in denen die Translation des phoN Gens durch asRNA inhibiert werden, bleiben auf M9 Medium mit BCiP mit Induktor weisslich, während sie sich auf M9 Medium mit BCiP ohne Induktor blau verfärben.
(3) phoP Fragmentbank - Identifizierung von Klonen aus negativ selektionierten Pools:
Die Funktion des phoP Gens ist notwendig, damit sich die Bakterien in Makrophagen vermehren können. Die Klone derp/.oP Fragmentbank werden in einem Pool zusammengefasst. Der Pool wird in zwei identische Gruppen geteilt, die in J774A.1 Makrophagen passagiert werden. Für die eine Gruppe wird während der Infektion Induktor zu dem Kulturmedium der Makrophagen zugesetzt. Die zweite Gruppe wird in J774A.1 Makrophagen ohne zugesetzten I ndu ktor passagiert. ( Beschreibung des Infektionsexperiments siehe Beispiel 1 .) Nach der Infektion (Dauer zwischen 7 und 24 Stunden) werden aus beiden Ansätzen die pCAl Plasmide präpariert. Die CAI Fragmente beider Ansätze werden durch PCR mit Primern, die benachbart zu den klonierten Fragmenten auf dem pCAl Vektor hybridisieren, amplifiziert und anschliessend durch genetische Subtraktion (siehe Beispiel 1 ) voneinander getrennt. Fragmente, die zur Inaktivierung von phoP führen, werden so isoliert. (4) Anwendung der Tests 1 -3 auf eine genomische Fragmentbank:
Das CAI Verfahren wird dann mit einer kompletten genomischen Fragmentbank in S. typhimurium angewendet. Die Klone mit der CAI Fragmentbank werden nach den oben beschriebenen drei Verfahren (1 -3) getestet.
Beispiel 3
Anreicherung von H. pylori Genen, kodierend für sekretierte/exkretierte
Polypeptide
Herstellung einer H. pylori Genbank im Minimalvektor pMin2:
Als Ausgangsstamm dient der H. pylori Wildtyp Stamm 69A. Die Bakterien werden auf Serumplatten (s. Westblom et al., 1 991 ) bei einer Temperatur von 37 °C in einer Atmosphäre von 5% O2, 1 0% CO2, 85% N2 angezüchtet. Die Isolierung der chromosomalen DNS erfolgt nach der Methode von Leying et al. ( 1 992), wobei die DNS abschließend über einen Cäsium-Chlorid- Gradienten aufgereinigt wird. 50 pg der gereinigten, chromosomalen DNS wird mit den Restriktionsendonukleasen Sau3A und Hpall partiell gespalten, die DNS-Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente in einer Grosse von 3 bis 6 kbp aus dem Gel mit Hilfe des Geneclean II Kits (Bio1 01 ) eluiert. Die isolierten DNS-Fragmente werden in den Bglll und Clal geschnittenen pMin2-Vektor (Kahrs et al., 1 995) kloniert und über Elektroporation in den E. coli-Stamm E1 81 transformiert, dem zuvor das Plasmid pTnMax9 übertragen wurde. Insgesamt werden über einen solchen Ansatz ca. 4000 Klone generiert. Der E. coli-Stamm E1 81 ist ein Derivat des Stammes HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1 969) und enthält den lysogenen Λ-Phagen ΛCH61 6 zur Replikation des pTnMax9-Plasmids.
Serumplattenrezeptur
36 g GC-Agar (Basis) in 910 ml Aqua dest. suspendieren und autoklavieren (-) auf ca. 45 °C abkühlen lassen (-) Zugabe von 10 ml Vitaminmix (-) Zugabe von jeweils 1 ml der Antibiotikastammlösung (-) Vancomycin ( 1 0 mg/l in Aqua bidest) (-) Nystatin (0,793 mg/l in DMF) (-) Trimethoprim (5 mg/l in DMF) (-) Amphotericin (5mg/l in DMF) *DMF = Dimethylformamid
(-) Zugabe von 90 ml Serum oder (-) Zugabe von 8 % Pferdeblut = 80 ml (-) oder gleiche Menge Humanblut
- Herstellung der Komponenten:
Antibiotika-Stammlösungen
Vancomycin 100 mg in 10 ml Aqua bidest Nystatin 7,93 mg in 10 ml DMF je 1 ml pro Liter GC-Agar
Trimethoprim 50 mg in 10 ml DMF zusetzen
Amphotericin 50 mg in 10 ml DMF
(Lagerung im Kühlschrank bis max. 8 Wochen)
Vitaminmix (Konzentrat)
Dextrose (D-Glucose) 100 g
L-Glutamin 10 g
Cystein HC1 (C3H,NO.S x HCl x H-O) 26 g Cocarboxylase 100 mg in 50 ml
Fe (N03)3 20 mg Aqua bidest lösen
Thiamin HC1 3 mg
DPN NAD 250 mg
Vitamin B12 10 mg -Cystein (C(HUN-04S,) 1-1 g
Adenin 1,0 g in 15 ml HC1
Guanin Cl 30 mg (32%ig) lösen
Uracil 500 mg
L-Arginin HC1 150 mg (sterilfiltrieren, in 10 ml p-Aminobenzoesäure 13 mg Portionen abfüllen + einfrieren)
Genetische Anreicherung sekretierter/exkretierter H. pylori Genprodukte:
Das auf pTn axS liegende Transposon TnMaxS ist mit dem genetischen Marker ?-Lactamase ausgestattet. Dieser Marker ist auf dem Transposon so angelegt, dass damit die Selektion erfolgreicher Transposon-Insertionen ermöglicht wird, wenn dieses im korrekten Leserahmen solcher Gene vorliegt, deren Produkte von E. co//-Stamm E145nf sekretiert bzw. exportiert werden. Die Insertion des Transposons in ein solches Gen führt zu einer Genfusion zwischen dem Zielgen und dem Marker, wobei durch ein im
Zielgen determiniertes Sekretions- und/oder Exportsignal das Fusionsprotein aus der Zelle geschleust wird und die Aktivität des integralen Reportergens entfaltet wird. Im Fall der ?-Lactamase können die Klone direkt über die
Entwicklung einer Resistenz gegen Ampicillin nachgewiesen werden. Das Transposon auf pTn axS wird über IPTG aktiviert.
Die Transposon-Mutagenese der Genbank wird in Pools von bis zu 20 Einzelklonen durchgeführt. Die jeweiligen Pools werden auf LB-Platten ausplattiert, die mit 100 pM IPTG, 1 5 pg/ml Chloramphenicol und 1 5 pg/ml Tetrazyklin versetzt sind. In einem zweiten Schritt werden die mutagenisierten pMin2-Plasmide über Konjugation in den E. coli Stamm E1 45rιf überführt, da diese mit einem entsprechenden mob-Signal (oril) ausgestattet sind. Die pTn/WaxS-Plasmide werden dagegen nicht übertragen. Folglich kommt es in E. coli E 1 45nf zu einer spezifischen Vervielfältigung der mutagenisierten pMin2 Genbank. Die entsprechenden Transkonjuganten werden auf LB-Medium mit 1 5pg/ml Chloramphenicol, 1 5pg/ml Tetrazyklin and 100 pg/ml Rifampicin selektioniert. Insgesamt werden 500 - 1 000 Transkonjuganten in 2 ml LB-Medium zusammengefasst und in entsprechenden Verdünnungen (10'1 - 10~2) auf LB-Platten angezüchtet, die mit 50 pg/ml Ampicillin versetzt sind. Nach einer Kultivierung der Platten über 36 Stunden bei 37°C erhält man im gesamten Ansatz 200 - 300 Ampicillin-resistente Klone mit Transposon inserierten Plasmiden.
Herstellung gendefizienter//. pylori, die in sekretierte/exkretierte Polypeptide kodierende Gene mutiert sind und die Identifizierung solcher Gene mit essentieller biologischer Funktion.
Herstellung gendefizienter H. pylori Mutanten:
Durch Einbringung der gewonnenen Plasmide mit den TnMax3-mutierten H. pylori Genen, kodierend für sekretierte/exkretierte Polypeptide in einen H. pylori Wildtyp Stamm können Gen-spezifische Mutanten erzeugt werden. Bedingt durch die klonierten H. pylori Gensequenzen auf den Plasmiden kommt es im Falle eines doppelten homologen Rekombinationsereignisses zu der genomischen Insertion des TnMaxS-Transposons in das chromosomale Zielgen und damit zu dessen Inaktivierung. Durch den genetischen Marker auf dem Transposon kann dieser Vorgang selektioniert werden, da das pMin2 Plasmid in H. pylori nicht repliziert wird.
In der Durchführung wird der H. pylori Wildtyp Stamm 69A in Einzelansätzen mit den gewonnenen individuellen Plasmiden transformiert, wobei die natürliche Kompetenz des Bakteriums, DNS aufzunehmen, ausgenutzt wird (Haas et al., 1 993). Ausgehend von einer Vorkultur auf Serumplatten entsprechend den Standard Kultivierungsbedingungen, werden die Bakterien in BHI-Medium aufgenommen und bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm von 0, 1 bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen angezüchtet. Die einzelnen Kulturansätze werden jeweils mit 1 00 bis 500 ng gereinigte Plasmid-DNS versetzt und die Kultur über Nacht fortgesetzt. Charakterisierung der biologischen Funktion der gendefizienten H. pylori Mutanten im Wachstumstest:
Die einzelnen Ansätze werden nach der Kultivierung auf Serumplatten ausplattiert, welche mit 4pg/ml Chloramphenicol versetzt sind. Hinsichtlich der Wachstumseigenschaften der einzelnen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp Stamm können 3 Kategorien unterschieden werden: ( 1 ) Mutanten, die nicht wachsen; (2) Mutanten, die kleinere Kolonien ausbilden; (3) Mutanten, die eine normale Koloniegrösse entwickeln. Diese Ergebnisse können für jedes Ausgangsplasmid reproduzierbar erzielt werden. Zur eindeutigen Beurteilung der biologischen Bedeutung der gendefizienten Mutanten der Kategorie 1 werden diese dem CAI-Verfahren zugeführt. Die gendefizienten Mutanten der Kategorie 2 und 3 werden in den anderen biologischen Testsystemen analysiert.
Beispiel 4
Ermittlung der Identität der H. pylori Gene kodierend für sekretierte/exportierte Polypeptide.
Zur Ermittlung der Primärstruktur der identifizierten H. pylori Gene, werden die jeweiligen Ausgangsplasmide aus dem E. coli Stamm verwendet. Die
Plasmide werden aus diesen Stämmen isoliert und die Nukleotidsequenz der
Zielgene durch Sequenzierung der Bereiche oberhalb und unterhalb der
Insertionsstelle des Transposons im Zielgen bestimmt. Das Leseraster des
Zielgens kann direkt ermittelt werden, da das Transposon-kodierte ss- Laktamase Gen eine aktive Fusion mit dem Genprodukt des Zielgens eingeht
(s.o.) . Die Sequenzierung wird mit Hilfe eines ABI-Sequenz-Automaten nach
Angaben des Herstellers mit folgenden Sequenzprimern durchgeführt: M 1 3-
F (GTAAAACGACGGCCAGT) und M13-RP1 (CAGGAAACAGCTATGACC
). Zur weiteren Charakterisierung der Gene wird die Datenbank Genebank des GCG-Programms herangezogen, z.B. zur Identifizierung bekannter, homologer Gene anderer Mikroorganismen (FASTA), zur Identifizierung potentieller Signalpeptidbereiche (SPSCAN) oder zur Identifizierung von Lipoproteinen (MOTIFS).
Bei einem Teil der identifizierten Klone konnte nicht die vollständige Gensequenz ermittelt werden, da das klonierte DNS-Fragment nicht das gesamte Gen enthielt. Das verfügbare DNS-Fragment wird dazu eingesetzt, um aus der Original-Genbank ein DNS-Fragment mit vollständigen Gen zu isolieren. Aus diesen Klonen können dann mit einem Gen-spezifischen Primer und einem Vektor-spezifischen Primer die fehlenden Gensequenzen amplifiziert und anschliessend direkt sequenziert werden. Hierzu wird chromosomale DNS aus dem H. pylori Stamm 69A isoliert, 25-35 pg davon partiell mit Bsp143l (Sau3AI-lsoschizomer) verdaut und entstehende Fragmente einer Grosse von 2 bis 8 kbp isoliert. Zur Klonierung wird der Vektor pACYCI 84 mit BamHI geschnitten, mit Shrimp Alkaline Phosphatase dephosphoryliert und anschließend mit den isolierten Fragmenten ligiert. Nach Transformation in den E. coli Stamm 0466 und Selektion auf 30 pg/ml Chloramphenicol werden 5560 Einzelkolonien isoliert und mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion analysiert.
Aus den bekannten Genfragmenten werden hierbei möglichst nahe benachbart zum fehlenden Genstück Primer für eine Produktgrösse von kleiner/gleich 700 bp abgeleitet. Mit diesen Primern werden Amplifikationsprodukte hergestellt, welche einen Klon enthalten, der beide Primer-Bindungsstellen umfasst. Aus den positiven Klonen werden anschliessend die Plasmide isoliert, welche entweder durch Sequenzierung oder durch Dot Blot Analyse verifiziert werden. Sequenzierung
Zur Vervollständigung der DNS-Sequenz von Genen, die nach den Sequenzreaktionen mit den Universalprimern M 1 3F und M 1 3RP1 nicht vollständig bestimmt werden kann, wird die Technik des Primer-Walkings verwendet. Dazu wird ein etwa 50 bis 200 bp stromaufwärts des 3'-Endes des bekannten Sequenzabschnitts bindendes Oligonukleotid abgeleitet und als Primer für eine weitere Sequenzreaktion nach dem Dye-Terminator- Prinzip (Amersham Pharmacia Biotech) eingesetzt. Am Beispiel der vollständig bestimmten DNS-Sequenz des Gens hpc052 von H. pylori 69Awird dies durch die Oligonukleotidprimer Mu052a (5'- AGGCTAAAGACGTGTTAG-3') und Mu052b (5'-CTAGCGTGGAATTAGCC- 3') erreicht.
Expressionsklonierung Zur Charakterisierung der Genprodukte der identifizierten Gensequenzen werden die Gensequenzen heterolog in attenuierten Salmonella- Vakzinstämmen exprimiert. Hierzu wird das Polymerase-Promotor-System des Bakteriophagen T7 (Tabor & Richardson 1 985) verwendet. Das auszuprägende Gen wird durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit spezifischen Oligonukleotidprimern aus chromosomaler DNS amplifiziert. Die Auswahl der genspezifischen Oligonukleotidprimer erfolgt abhängig von der Präsenz eines Signalpeptids zur See-abhängigen Translokation des Genprodukts ins Periplasma. Liegt ein solches vor, wird das Oligonuklotidprimerpaarso gewählt, dass ein Fragmentdes auszuprägenden Gens amplifiziert wird, das für das reife Protein ohne Signalpeptid kodiert. Liegt keine Signalsequenz vor, wird der gesamte offene Leserahmen amplifiziert.
Die amplifizierten Genfragmente werden in einen von pBR322 abgeleiteten Plasmidvektor inseriert. Die Insertion erfolgt so, dass sich die klonierten
Genfragmente jeweils als Fusion mit einem für das Detektionsepitop
RGSHis4 kodierenden Sequenzabschnitt unter der transkriptioneilen Kontrolle des Promotors des Bakteriophagen T7 befinden. Die Ausprägung der Genprodukte wird im Salmonella typhimurium Vakzinstamm SL3261 ::pYZ84 (Yan & Meyer 1 996) untersucht der mit den auf o. g. Weise hergestellten Expressionsvektoren transformiert wird. Die Detektion der RGSHis4- Fusionsproteine erfolgt durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS- PAGE) und anschliessender Western-Blot-Analyse mit einem für das RGSHis4-Epitop spezifischen monoklonalen Antikörper (RGS.His) Beispielhaft wird anhand der Gensequenz H PC001 eine Expressionsklonierung mit anschliessender Western Blot Analyse dargestellt. Hierfür wird das Genfragment des hpcOOl Gens, das für das reife HPC001 Protein kodiert (ohne Signalpeptid) mit Hilfe der Oligonukleotidprimer LAT50 (5'-GATCAGATCTACATATGTTTATCATTCCCTCTCGC-3') und LAT51 (5'- GATCGGTACCAAAACCTTAATGCGTTGCT-3') mittels PCR amplifiziert. Das 0,9 kb grosse Amplifikat wird mittels Bgl\\ und Acc65\ hydrolysiert und in den mit Bam\λ\ und Acc65\ hydrolysierten Vektor pLAT289 inseriert. Der resultierende Expressionsvektor pMSC34 kodiert für ein Fusionsprotein, das aus dem hpcOOl Gen besteht, dem die Signalsequenz von HPC001 fehlt und dem RGSHis -Epitop. Das Expressionsprodukt besitzt eine Molekülmasse von 34 kDa.
Beispiel 5
Biologisches Modell "kokkoide Helicobacter"
Herstellung kokkoider Formen.
Die experimentelle Überführung der spiralförmigen Helicobacter Form in eine kokkoide Form kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Insbesondere kann die Umwandlung unter Stressbedingungen beobachtet werden, z.B. in Gegenwart subletaler Dosen eines wirksamen Antibiotikums, bei Substratmangel oder in einer Normalluft-Atmosphäre. Der Umwandlungsprozess kann somit als Schutzreaktion der Bakterien verstanden werden. Tatsächlich kann man diese Formen auch im Gewebe infizierter Menschen beobachten . Möglicherweise handelt es sich hierbei um eine Überdauerungsform. Ein Wegfallen oder die verzögerte bzw. unvollständige Ausprägung dieser Eigenschaft, z.B. durch Wegfallen oder Inaktivierung eines Gens oder Genprodukts kann für das Bakterium im Überlebenskampf fatale Nachteile haben.
Die experimentelle Umwandlung der spiralförmigen Helicobacter in eine kokkoide Form wird in der Regel von einer frischen Plattenkultur gestartet, die unter idealen Bedingungen angezogen wurde (Serumplatten, 37°C, mikroaerophile Atmosphäre (5% O2, 10% CO2, 85% N2)) und somit überwiegend spiralförmige Helicobacter enthält. Im nachfolgenden Beispiel werden die abgeernteten Bakterien in ein Minimalmedium überführt, das sich aus Wasser, z.B. sterilisiertem Leitungswasser, und x% (v/v) einer komplexen Protein-Lösung, z.B. foetalem Kälberserum (FCS) zusammensetzt. In Abhängigkeit von der FCS-Konzentration x bilden sich die Bakterien innerhalb weniger Stunden oder in mehreren Tagen vollständig in kokkoide Formen um. Gängige Konzentrationen sind 10 - 30% (v/v) FCS in Wasser. In der üblichen Anordnung werden die Bakterien in definierter Anzahl, z.B. bei einer OD550 von 0.2, in 5 ml Minimalmedium bei 37°C in einem Zellkulturschrank kultiviert, wobei der CO2 Anteil in der Luft auf 10% eingestellt wird. Der fortschreitende Entwicklungsprozess wird einerseits mikroskopisch und durch Wachstumsbestimmungen dokumentiert. Mikroskopisch wird im Phasenkontrast die Morphologie (kokkoid _ spiralförmig) und die Beweglichkeit (kokkoid + unbeweglich; spiralförmig + beweglich; spiralförmig + unbeweglich) der Bakterien im Kulturansatz anteilig bestimmt, z. B. in einer Zählkammer. Gegebenenfalls werden spezifische Färbungen durchgeführt um auch strukturelle Änderungen, z.B. in der Bakterienhülle, indirekt zu erfassen bzw. den Anteil toter Keime zu bestimmen. Da kokkoide Formen auf herkömmlichen Medien, z.B. Serum- Platten nicht wachsen, kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Anteil vitaler bzw. noch reaktivierbarer Zustandsformen (colony forming units; CFU) anteilig ermittelt werden. Reaktivierung kokkoider Formen.
Die Aktivierung der kokkoiden Bakterien erfolgt in einem Medium, das in EP 0900839 beschrieben ist. Die Bakterien werden in definierter Anzahl, z.B. 500 - 1 000 Bakterien, auf diesem Medium ausplattiert und unter mikroaerophilen Bedingungen bei 37°C für mehrere Tage bebrütet. Auch in diesem Ansatz wird der Entwicklungsprozess mikroskopisch (s.o.) und über die Bestimmung der CFU dokumentiert.
Schließlich können-diese Untersuchungen auch im Tiermodell durchgeführt werden. Es ist anzunehmen, dass im Tier andere Reaktivierungs- und Selektionsmechanismen wirken als im oben dargestellten Kultivierungsmodell. Z.B. können andere oder zusätzliche Gene oder Gengruppen am Prozeß beteiligt sein. Die hergestellten kokkoiden Formen werden in definierter Anzahl, z.B. 108 Bakterien, einer Maus, z.B. Balb/c, oral in einer wässrigen Lösung verabreicht, z.B. mit einer Magensonde. Nach einer bestimmten Zeit, z.B. nach 2 - 4 Wochen werden die infizierten Tiere getötet, der Magen entnommen, vom Inhalt befreit und histologisch und durch Wachstumstests (s.o.) auf Besiedlung untersucht. In der histologischen Untersuchung kann der Anteil kokkoider und spiralförmiger Bakterien bestimmt werden. Das Experiment sollte bevorzugt mit Helicobacter-Stämmen des Typus I durchgeführt werden, da die Stämme vom Typus II weniger virulent sind.
Identifizierung essentieller Helicobacter Gene.
Die beschriebenen biologischen Systeme (A + B) können z.B. zur Analyse definierter Helicobacter-Mutanten eingesetzt werden, welche über die beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Untersuchung erfolgt jeweils im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp-Stamm. Ist eine Mutante z.B. nicht in der Lage, sich zur kokkoiden Form umzuwandeln oder bleibt eine Reaktivierung der kokkoiden Form aus oder treten die Umwandlungen mit großen zeitlichen Verzögerungen auf, kann für das mutierte Gen eine fakultativ essentielle Funktion abgeleitet werden. Bei der Reaktivierung kokkoider Formen im Tiermodell können pro Versuchsansatz mehrere Mutanten gleichzeitig eingesetzt werden, z.B. 10 Stämme. Voraussetzung ist, dass die Wiedererkennung dieser Stämme im Gewebe durch geeignete Verfahren sichergestellt ist, z.B. durch entsprechende PCR-Verfahren oder durch in situ Hybridisierung.
Literatur
Agterberg, M., Adriaanse, H., van Bruggen, A., Karperien, M., Tammassen, J . ( 1 990) . Outer-membrane PhoE protein of Escheicia coli K-1 2 as an exposure vector: possibilities and limitations. Gene 88: 37-45.
Akerley, B.J., Rubin, E.J., Camilli, A., Lampe, D ., Robertson, H.M. and Mekalanos, J.J. ( 1 998). Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. Proc Natl Acad Sei U S A, 95:8927-32
Arigoni, F., Talabot, F., Peitsch, M., Edgerton, M.D., Meldrum, E., Allet, E., Fish, R., Jamotte, T., Curchod, M.L. and Loferer, H. ( 1 998) . A genome- based approach for the identification of essential bacterial genes. Nat Biotechnol, 1 6: 851 -856.
Barry, E.M., Gomez-Duarte, O., Chatfield, S., Rappuoli, R., Pizza, M., Losonsky, G., Galen, J., Levine, M.M. ( 1 996) . Expression and immunogenicity of pertussis toxin S1 subunit-tetanus toxin fragment C fusions in Salmonella typhi vaccine strain CVD908. Infect. Immun. 64: 41 72-81 .
Bergler, H., Fuchsbichler, S., Hogenauer, G., Turnowsky, F. (1 996) . The enoyHacyl-carrier-protein] reduetase (Fabl) of Escherichia coli, which catalyzes a key regulator step in fatty aeid biosynthesis, aeeeepts NADH and NADPH as cofactors and is inhibited by palmitoyl-CoA. Eur. J. Biochem. 242: 689-694.
Berry, V., Jennings, K. and Woodnutt, G. ( 1 995) Bactericidal and morphological effects of amoxicillin on Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 39: 1 859-1 861 . Bode, G., Mauch, F. and Malfertheiner, P. (1 993) The coccoid forms of Helicobacter pylori. Criteria for their viability. Epidemiol Infect 1 1 1 : 483- 490.
Cao, J ., Li, Z.Q., Borch, K., Petersson, F. and Mardh, S. ( 1 997) Detection of spiral and coccoid forms of Helicobacter pylori using a murine monoclonal antibody. Clin Chim Acta 267: 1 83-1 96.
Carrier, T.A. and Keasling, J.D. (1 997a) . Controlling messenger RNA stability in bacteria strategies for engineering gene expression. Biotechnol. Prog. 1 3: 699-708.
Carrier, T.A. and Keasling, J.D. ( 1 997b) . Engineering mRNA stability in E. coli by the addition of synthetic hairpins using a 5' cassette System. Biotechnol. Bioeng. 55: 577-580.
Carrier, T.A. and Keasling, J.D. (1 999) . Library of synthetic 5' secondary structures to manipulate mRNA stability in Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 1 5: 58-64.
Cellini, L., Allocati, N., Angelucci, D., lezzi, T., Di Campli, E., Marzio, L. and Dainelli, B. (1 994) Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice. Microbiol Immunol 38: 843-850.
Chan, W.Y., Hui, P.K., Leung, K.M., Chow, J., Kwok, F. and Ng, C.S. ( 1 994) Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach. Am J Clin Pathol 102: 503-507.
Chow, W.Y. and Berg, D.E. (1 988). Tnδtad , a derivative of transposon Tn5 that generates conditional mutations. Proc Natl Acad Sei U S A, 85:6468-72 Cirillo, J.D., Stover, C.K., Bloom, B.R., Jacobs, W.R. Jr., Barletta, R.G. (1995). Bacterial vaccine vectors and bacillus Calmette-Guerin. Clin. Infect. Dis.20: 1001-1009.
Dalbey, R.E (1991). Leader peptidase. Mol. Microbiol.5: 2855-2860.
Darji, A., Guzman, CA., Gerstel, B., Wachholz, P., Timmis, K.N., Wehland, J., Chakraborty, T., Weiss, S. (1997). Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell 91: 765-775.
Das, A., Court, D. and Adhya, S. (1976). Isolation and characterization of conditional lethal mutants of Escherichia coli defective in transcription termination factor rho. Proc Natl Acad Sei U SA, 73:1959-63
Davenport MP, Ho Shon IA, Hill AV (1995). An empirical method for the prediction of T-cell epitopes. Immunogenetics 1995;42(5):392-7
del Solar, G., Moscoso, M. and Espinosa, M. (1993). Rolling circle- replicating plasmids from gram-positive and gram-negative bacteria: a wall falls. Mol. Microbiol.8: 789-796.
Donelli, G., Matarrese, P., Fiorentini, C, Dainelli, B., Taraborelli, T., Di Campli, E., Di Bartolomeo, S. and Cellini, L. (1998) The effect of oxygen on the growth and cell morphology of Helicobacter pylori. FEMS Microbiol Lett 168: 9-15.
Dorner, F. (1995). An overview of vaccine vectors. Dev. Biol. Stand.84: 23-32.
Drlica K., Zhao, X. (1997). DNA gyrase, topoisomerase IV, and the 4- quinolones. Microbiol. Mol. Biol. Rev.61: 377-392. Eaton, K.A., Catrenich, C.E., Makin, K.M. and Krakowka, S. ( 1 995) . Virulence of coccoid and bacillary forms of Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. JID 1 71 : 459-462.
Ermak, T.H., Giannasca, P.J., Nichols, R., Myers, G.A., Nedrud, J., Weltzin, R., Lee, C.K., Kleanthous, H., Monath, T.P. ( 1 998). Immunization of mice with urease vaccine affords protection against Helicobacter pylori infection in the absence of antibodies and is mediated by MHC class ll-restricted responses. J. Exp. Med. 1 88(2) : 2277-2288.
Franciso, J.A., Earhart, C.F., Georgiou, G. (1 992) . Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 271 3-271 7.
Gabelsberger, J., Knapp, B., Bauersachs, S., Enz, U.I., von Specht, B.U., Domdey, H. (1 997). A hybrid outer membrane protein antigen for vaccination against Pseudomonas aeruginosa. Behring Inst. Mitt. 98: 302- 31 4.
Gonzalez, C.R., Noriega, F.R., Huerta, S., Santigao, A., Vega, M., Panagua, J., Ortiz-Navarrete, V., Isibasi, A., Levine, M.M. (1 998) . Immunogenicity of a Salmonella typhi CVD908 candidate vaccine strain expressing the major surface protein gp63 of Leishmania mexicana mexicana. Vaccine, 1 6: 1 043- 52.
Goodwin, C.S., Armstrong, J.A., Chilvers, T., Peters, M., Collins, M.D., Sly, L., McConnell, W., Harper, W.E.S. (1 989) . Transfer of Campylobacter pylori and Campylobacter mustelae to Helicobacter gen. nov. as Helicobacter pylori comb. nov and Helicobacter mustelae comb. nov., respectively. Int. J. Syst. Bact. 39: 397-405.
Gupta, R.K., Siber, G.R. ( 1 995) . Adjuvants for human vaccines - current Status, problems and future prospects. Vaccine 1 3: 1 263-1 276. Guzman, L.M., Belin, D., Carson, M.J. and Beckwith, J. (1 995) . Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose Promoter. J. Bacteriol. 177: 4121-4130.
Haq, T.A., Mason, H.S., Clements, J.D., Arntzen, C.J. ( 1 995) . Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science 268: 71 4-71 6.
Harris, S.D., Cheng, J., Pugh, T.A. and Pringle, J.R. ( 1 992) . Molecular analysis of Saccharomyces cerevisiae chromosome I. On the number of genes and the identification of essential genes using temperature-sensitive- lethal mutations. J Mol Biol, 225:53-65
Hartikka, J., Sawdey, M., Cornefert-Jensen, F., Margalith, M., Barnhart, K., Nolasco, M., Vahlsing, H.L., Meek, J., Marquet, M., Hobart, P., Norman, J., Manthorpe, M. ( 1 996) . An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum. Gene Ther. 7: 1 205-1 21 7.
Heuermann, D. and Haas, R. (1 995) . Genetic organization of a small cryptic plasmid of Helicobacter pylori. Gene 1 65: 1 7-24
Heuermann, D. and Haas, R. (1 998). A stable Shuttle vector System for efficient genetic complementation of Helicobacter pylori strains by transformation and conjugation. Mol. Gen. Genet. 257: 51 9-528
Hiatt, A., Ma, J.K. ( 1 993) . Characterization and applications of antibodies produced in plants. Int. Rev. Immunol. 10: 1 39-1 52.
Hill, J., Leary, S.E., Griffin, K.F., Williamson, E.D., Titball, R.W. (1 997) . Regions of Yersinia pestis V antigen that contribute to protection against plague identified by passive and active immunization. Infect. Immun. 65: 4476-4482. Hillen, W. and Berens, C. ( 1 994) . Mechanisms underlying expression of Tn 1 0 encoded tetracycline resistance. Annu. Rev. Microbiol. 48: 345-369.
Hou, Y., Lin, Y.P., Sharer, J.D. and March, P.E. ( 1 994). In vivo selection of conditional-lethal mutations in the gene encoding elongation factor G of Escherichia coli. J Bacteriol, 1 76: 1 23-9
Hughes, E.E., Gilleland, L.B., Gilleland, H.E. Jr. ( 1 992) . Synthetic peptides representing epitopes of outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa that elicit antibodies reactive with whole cells of heterologous immunotype strains of P. aeruginosa. Infect. Immun. 60: 3497-3503.
Joyce, CM. and Grindley, N.D. (1 984) . Method for determining whether a gene of Escherichia coli is essential: application to the polA gene. J Bacteriol, 1 58:636-43
Kalinke, U., Krebber, A., Krebber, C, Bucher, E., Plückthun, A., Zinkernagel, R.M., Hengartner, H. (1 996) . Monovalent single-chain Fv fragments and bivalent miniantibodies bound to vesicular stomatitis virus protect against lethal infection. Eur. J. Immunol. 26: 2801 -2806.
Khin, M.M., Ringner, M., Aleljung, P., Wadström, T. and Ho, B. (1 996) Binding of human plasminogen and lactoferrin by Helicobacter pylori coccoid forms. J Med Microbiol 45: 433-439.
Klauser, T., Pohlner, J., Meyer, T.F. (1 990) . Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA protease beta-domain: conformation-dependent outer membrane translocation. EMBO J. 9: 1 991 - 1 999.
Kleanthous, H., Clayton, C.L. and Tabaqchali, S. (1 991 ) . Characterization of a plasmid from Helicobacter pylori encoding a replication protein common to plasmids in Gram-positive bacteria. Mol. Microbiol. 5: 2377-2389. Kok, J., van der Vossen, J.M. and Venema, G. (1 984). Construction of plasmid cloning vectors for lactic streptococci which also replicate in Bacillus subtilis and Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 48: 726-731 .
Kraiss, A., Schlor, S., Reidl, J. ( 1 998). In vivo transposon mutagenesis in Haemophilus influenza. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4697-4702.
Kujau, M.J., Hoischen, C, Riesenberg, D., Gumpert, J. (1 998) . Expression and secretion of functional miniantibodies McPC603scFvDhlx in cell-wall- less L-form strains-of Proteus mirabilis and Escherichia coli: a comparison of the synthesis capacitites of L-form strains with an E. coli producer strain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 51 -58.
Küsters, J.G., Gerrits, M.M., Van Strijp, J.A. and Vandenbroucke-Grauls, CM. ( 1 997) Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell death. Infect Immun 65: 3672-3679.
Lang, H., Korhonen, T.K. (1 997) . The OmpS maltoporin of Vibrio cholerae as carrier of foreign epitopes. Berhring Inst. Mitt. 98: 400-409.
Law, J., Buist, G., Haandrikman, A., Kok, J., Venema, G. and Leenhouts, K. (1 995) . A system to generate chromosomal mutations in Lactococcus fact/'s which allows fast analysis of targeted genes. J. Bacteriol. 1 77: 701 1 - 701 8.
Lee, A., Fox, J,, Hazel, S. (1 993) . Is gastric lymphoma an infectious disease?. Hum. Pathol. 24: 569-70.
Liljeqvist, S., Stahl, S., Andreoni, C, Binz, H., Uhlen, M., Murby, M. ( 1 997) . Fusions to the cholera toxin B subunit: inf luence on pentamerization and GM 1 binding. J. Immunol. Methods 210: 125-135. Ling, Y.S., Guo, Y.J., Li, J.D., Yang, L.K., Luo, Y.X., Zhen, L.Q., Qiu, S.B., Zhu, G.F. (1998). Serum and egg yolk IgG antibody titers from laying chickens vaccinated with Pasteurella multocida. Avian Dis.42: 186-189.
Ma, J.K., Lehner, T., Stabila, P., Fux, C.I., Hiatt, A. (1994). Assembly of monoclonal antibodies with IgG 1 and IgA heavy chain domains in transgenic tobacco plants. Eur. J. Immunol.24: 131-138.
Maguin, E., Duwat, P., Hege, T., Ehrlich, D. and Gruss, A. (1992). New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. J. Bacteriol.1 4: 5633- 5638.
Malfertheiner, P. (1994). Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York; p. 1-104.
Manoil, C, Mekalanos, J.J., Beckwith J. (1990). Alkaline phosphatase fusions: sensors of subcellular location. J. Bacteriol. 172: 515-518.
Marshall, B.J., Royce, H., Annear, D.I., Goodwin, C.S., Pearman, J.W., Warren, J.R., Armstrond, J.A. (1984). Original isolation of Campylobacter pyloridis from human gastric mucosa. Microbios Lett.25: 82-88.
Mason H.S., Arntzen, C.J. (1995). Transgenic plants as vaccine production Systems. Trends Biotechnol. 13: 388-392.
Mekalanos, J.J. (1994). Live attenuated vaccine vectors. Int. J. Technol. Assess Health Care 1994 Winter 10: 131-142.
Murphy, C.K., Stewart, E.J. and Beckwith, J. (1995). A double counter- selection System for the study of null alleles of essential genes in Escherichia coli. Gene, 155:1-7 Narikawa, S., Kawai, S., Aoshima, H., Kawamata, O., Kawaguchi, R., Hikiji, K., Kato, M., lino, S. and Mizushima, Y. ( 1 997) Comparison of the nucleic acids of helical and coccoid forms of Helicobacter pylori. Clin Diagn Lab Immunol 4: 285-290.
Nomura, A., Stemmermann, G.N., Chyou, P.H., Kato, I., Perez-Perez, G.I., Blaser, M.J. ( 1 991 ) . Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among japanese americans in Hawaii. N. Engl. J. Med. 325: 1 1 32-1 1 36.
O'Hagan, D.T. (1 998) . Recent advances in vaccine adjuvants for systemic and mucosal administration. J. Pharm. Pharmacol. 50: 1 -10.
Pack, P., Kujau, M., Schroeckh, V., Knupfer, U., Wenderoth, R., Riesenberg, D., Plückthun, A. (1 993). Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole antibodies, produced by high cell density fermentatiόn of Escherichia coli. Biotechnology 1 1 : 1 271 -1 277.
Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vandersetten, D.P., Chang, Y., Vogelman, H.H., Orentreich, N., Sibley, R.K. (1 991 ). Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N. Engl. J. Med. 325: 1 227-1 131 .
Polissi, A. and Georgopoulos, C (1 996). Mutational analysis and properties of the msbA gene of Escherichia coli, coding for an essential ABC family transporter. Mol Microbiol, 20: 1 221 -33
Pugsley, A.P. (1 993). The complete general secretory pathway in gramnegative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108.
Ray, S.K., Parimoo, P., Nandi, I., Venkidesh, R., Murthy, M.V., Srisunder, S., Anand, V., Rajesh, K., Rangaraj, N. (1 998) . "Resultant bond moment" as a newly developed electronic parameter in the design of antibacterial, antiprotozoal nitroimidazole derivatives. Arzneimittelforschung, 48: 286- 290. Sasse, M., Kruger, M., Schade, R., Hlinak, A. (1 9989). Generation and characterization of avian vitelline antibodies against lipopolysaccharide and lipid A. 1 . Induction and preparation of specific egg yolk antibodies (IgY) against endotoxins. Berl. Munch Tierärztl. Wochenschrift 1 1 1 : 1 21 -1 26.
Segal, E.D., Falkow, S. and Tompkins, L.S. (1 996) Helicobacter pylori attachmentto gastric cells induces cytoskeletal rearrangements and tyrosine phosphorylation of host cell proteins. Proc Natl Acad Sei U S A 93: 1 259- 1 264.
Solnick, J.V., Tompkins, L.S. (1 993) . Helicobacter pylori and gastroduodenal disease: pathogenesis and host-parasite interaction. Infect.Ag. Dis. 1 : 294-309.
Sorberg, M., Nilsson, M., Hanberger, H. and Nilsson, L.E. (1 996) Morphologic conversion of Helicobacter pylori from bacillary to coccoid form. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1 5: 21 6-21 9.
Tacket, CO., Mason, H.S., Losonsky, G., Clements, J.D., Levine M.M., Arntzen, CJ. ( 1 998) . Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato. Nat. Med. 4: 607-609.
Tadayyon, M., Broome-Smith, J.K. (1992). TnblaM - atronsposon for directly tagging bacterial genes encoding cell envelope and secreted proteins. Gene 1 1 1 : 21 -26.
Tang, D.C, DeVit, M., Johnston, S.A. (1 992) . Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 1 52-1 54.
Van Engelen, F.A., Schouten, A., Molthoff, J.W., Roosien, J., Salinas, J., Dirkse, W.G., Schots, A., Bakker, J., Gommers, F.J., Jongsma, M.A. et al. ( 1 994) . Coordinate expression of antibody subunit genes yields high levels of functional antibodies in roots of transgenic tobacco. Plant Mol. Biol.26: 1701-1710.
Wang, R.F. and Kushner, S.R. (1991). Construction of versatile low- copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli. Gene 100: 195-199.
Wang, X., Sturegard, E., Rupar, R., Nilsson, H.O., Aleljung, P.A., Carlen, B., Willen, R. and Wadström, T. (1997) Infection of BALB/c A mice by spiral and coccoid forms^of Helicobacter pylori. J Med Microbiol 46: 657-663.
Warren, J.R., Marshall, B. (1983). Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet i: 1273-1275.
Wilson, K.S. and von Hippel, P.H. (1995). Transcription termination at intrinsic terminators: the role of the RNA hairpin. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 8793-8797.
Yarnell, W.S. and Roberts, J.W. (1999). Mechanism of intrinsic transcription termination and antitermination. Science 284: 611-615.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis, zur Prävention oder/und zur Therapie von mikrobiellen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt:
(A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive
Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebensoder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen in einem Testsystem.
(B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktiviertung der
Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.
(C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln, (D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß obligat essentielle Gene durch CAI identifiziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß fakultativ essentielle Gene durch SRM identifiziert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet. daß vor Schritt (A) eine Selektion auf Gene durchgeführt wird, die für Polypeptide mit einer bestimmten Funktionalität kodieren oder/und die für Polypeptide kodieren, die in einer bestimmten Entwicklungsstufe exprimiert werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion mit Hilfe von Hybridisierungsverfahren durchgeführt wird, ausgewählt aus Subtraktions- und Array- Verfahren.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion auf spezifische subtrahierte apathogene oder pathogene Gene durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion auf spezifische subtrahierte Gene von H. pylori oder H. heilmannii durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß für exportierte Polypeptide kodierende Gensequenzen selektiert werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß für sekretierte Polypeptide kodierende Gensequenzen selektiert werden.
1 0. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet. daß für Polypeptide kodierende Gene selektiert werden, welche zur Entwicklung der vitalen Form aus der Überdauerungsform notwendig sind.
1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für Polypeptide kodierende Gene selektiert werden, welche zur Entwicklung der Überdauerungsform aus der vitalen Form notwendig sind.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) zur Bestimmung der Lebens- und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen Te stsy ste m e , a u s g ewä h lt a u s //7- v/tYo -Sy Ste rn e n ,
Zellkultursystemen, Gewebekultursystemen und Tiermodellen als natürliche Umgebung verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu nicht kultivierbaren und in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen gendefizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der obligat essentiellen Gene zugeordnet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu kultivierbaren aber in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen defizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der fakultativ essentiellen
Gene zugeordnen werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die identifizierten Gene zur Herstellung von Primern verwendet werden, mit Hilfe derer entsprechende Gene aus verwandten Mikroorganismen, Subspezies oder/und Arten identifiziert werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (B) spezifische Wirkstoffe identifiziert werden, welche die Expression, Präsentation oder/und Funktion der essentiellen
Polypeptide beeinflussen, insbesondere immunologisch wirksame Substanzen, Bindepartner der Polypeptide oder deren Fragmente oder/und inhibitorische Substanzen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (B) eine Bestimmung des immunogenen Potentials der Polypeptide oder/und deren Fragmente umfaßt, wobei die identifzierten Gene exprimiert werden und anschließend eine Western-Blot-Analyse durchgeführt wird oder/und daß mit den identifzierten Polypeptiden oder Fragmenten davon eine Vakzinierung in Zellkultur oder im Tiermodell durchgeführt und die Auslösung einer spezifischen Immunreaktion beobachtet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (B) eine Bestimmung des Bindungspotentials der Polypeptide oder deren Fragmente durch Screening von Substanzenbibliotheken, Oberflächendisplayverfahren, kristallo- graphische Analyse oder/und Computer-Modelling umfaßt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet. daßdiediagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mittel in Form von passiven Impfstoffen oder aktiven Impfstoffen bereitgestellt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß die passiven Impfstoffe in Form von Antikörpern oder/und Antikörperfragmenten und die aktiven Impfstoffe in Form von heterologen Trägersystemen oder/und in Form von Antigenen, Antigenfragmenten, Subunit-Vakzinen, Lebendvakzinen, DNA-
Vakzinen oder/und Lebensmittelvakzinen bereitgestellt werden.
21 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, daßdie diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mittel inhibitorische Substanzen umfassen, insbesondere Expressionsinhibitoren oder/und Enzyminhibitoren.
22. Verfahren zur Identifizierung essentieller mikrobieller Gene, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt: (i) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen, (ii) Bestimmen der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i), (iii) Identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen
DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defizient sind, (iv) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiell für die
Überlebensfähigkeit sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet. daß die gendefizienten Mikroorganismen hergestellt werden, indem ein DNA-Abschnitt in einem mikrobiellen Genom mutagenisiert wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der DNA-Abschnitt durch Transposon-Mutagenese mutagenisiert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutagenisierung des DNA-Abschnitts auf dem mikrobiellen Genom durch homologe Rekombination erfolgt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das SRM-Verfahren angewendet wird.
27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die gendefizienten Mikroorganismen hergestellt werden, indem in Mikroorganismen ein DNA-Abschnitt oder eine Teilsequenz davon in Form von Antisense-RNA exprimiert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das CAI-Verfahren angewendet wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen Testsysteme ausgewählt aus In- vitro-Sy stemen, Zellkultursystemen, Gewebekultursystemen und Tiermodellen als natürliche Umgebung verwendet werden.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu nicht kultivierbaren und in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen gendefizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der obligat essentiellen Gene zugeordnet werden.
31 . Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu kultivierbaren aber in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen defizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, daß das Identifizieren des proteinkodierenden DNA-Abschnitts durch Expression in einem Wirtsorganismus und Nachweis des Vorhandenseins eines Expressionsproduktes erfolgt.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin umfaßt: (v) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen (vi) Identifizieren der homologen Gensequenzen.
34. Nukleinsäure, kodierend für ein essentielles sekretorisches Gen aus Helicobacter, identifiziert durch das Verfahren nach einem der
Ansprüche 22 bis 33.
35. Nukleinsäure nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein sekretiertes Polypeptid mit Signalpeptid kodiert.
36. Nukleinsäure nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid kodiert.
37. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie
(a) eine der in SEQ ID NO: n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 245 einschließlich darstellt, dargestellten Nukleinsäuresequenzen, oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon, (b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.
38. Genbank, umfassend mindestens zwei Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 34 bis 37.
39. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 oder einen Abschnitt davon enthält.
40. Vektor nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß er ein CAI-Vektor ist.
41. Vektor nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß er ein SRM-Vektor ist.
42. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 39 bis 41 transformiert ist.
43. Mutantenbank, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens zwei Mikroorganismen besteht, die mit einem Vektor nach Anspruch 40 oder einem Vektor nach Anspruch 41 transformiert sind.
44. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 kodiert ist.
45. Polypeptid nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es
(a) eine der in SEQ ID NO: m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 246 einschließlich darstellt, dargestellten Aminosäuresequenzen oder
(b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.
46. Polypeptid nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß es ein essentielles sekretiertes Polypeptid ist.
47. Polypeptidfragment, dadurch gekennzeichnet, daß es einen immunogenen Abschnitt einer der Sequenzen nach Anspruch 45 aufweist.
48. Inhibitorisches Molekül, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47 zu binden oder/und dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche Funktion zu beeinflussen.
49. Verfa h ren zu r Herstell ung eines Polypeptids od er Polypeptidfragments nach einem der Ansprüche 44 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 oder einem Vektor nach Anspruch 39 transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet und das
Polypeptid aus der Zelle oder/und dem Kulturüberstand isoliert.
50. Verwendung-eines Polypeptids oder eines Fragmentes davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47 davon als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern.
51 . Antikörper oder Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch ist für ein Polypeptid oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47.
52. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet. daß sie als Wirkstoff a) eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37, b) einen Vektor nach Anspruch 39, c) eine Zelle nach Anspruch 42, d) ein Polypeptid oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche
44 bis 47, e) einen Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 51 und/oder f) ein inhibitorisches Molekül nach Anspruch 48, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln, enthält.
53. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 52 zur Diagnostik, Prävention oder/und Therapie einer / e/Zco^acfer-Infektion.
54. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 52 zur Hemmung der Reproduktion von Helicobacter- Organismen und/oder anderen anthrogenen Mikroorganismen in einem Wirt.
55. Verwendung nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 als DNA-Vakzin formuliert wird.
56. Verwendung nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid oder Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 44 bis 47 als Subunit-Vakzin oder als Lebendvakzin formuliert wird.
57. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 52 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnostik, Prävention oder/und Therapie einer He/tcσÄacfeΛ-Infektion.
58. Vektor nach Anspruch 41 , dadurch gekennzeichnet, daß der SRM-Vektor der Vektor pSRM4 (SEQ ID No. 247) ist.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7390620B2 (en) 2001-04-06 2008-06-24 Creatogen Laboratories Gmbh Screening method for anti-microbial drug targets by genome-saturating mutagenesis (GSM)
US20040152099A1 (en) * 2001-05-17 2004-08-05 Elke Freissler Screening method for attenuating or virulence defective microbial cells

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0174096A3 (de) * 1984-08-02 1987-11-04 Biotechnica International, Inc. Vektoren für die Introduktion von DNS in bakterielle Chromosomen oder für deren Entfernung daraus, und für die Herstellung von Protein
US5639595A (en) * 1990-05-01 1997-06-17 Isis Phamaceuticals, Inc. Identification of novel drugs and reagents
US5217889A (en) * 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5434065A (en) * 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
US5527678A (en) * 1994-10-21 1996-06-18 Vanderbilt University CagB and CagC genes of helicobacter pylori and related compositions
WO1997019098A1 (en) * 1995-11-17 1997-05-29 Astra Aktiebolag Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
US5756305A (en) * 1996-05-06 1998-05-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential survival genes
EP0837142A1 (de) * 1996-10-15 1998-04-22 Smithkline Beecham Corporation Verfahren zum Nachweis essentieller Gene eines Erregers
DE69737327T2 (de) * 1996-11-06 2007-11-08 Smithkline Beecham Corp. Verfahren zur identifizierung von essentiellen genen für das wachstum eines organismus
WO1998021225A1 (en) * 1996-11-14 1998-05-22 Merieux Oravax Helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules
NZ338039A (en) * 1997-04-01 2001-04-27 Human Genome Sciences Inc Identification of polynucleotides encoding helicobacter polypeptides in the helicobacter genome

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0073502A2 *

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