DE19924965A1 - Essentielle Gene und Genprodukte zur Identifizierung, Entwicklung und Optimierung von immunologischen und pharmakologischen Wirkstoffen zur Behandlung mikrobieller Infektionen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von therapeutischen, präventiven und/oder diagnostischen Mitteln gegen mikrobielle Infektion und zur Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene aus Helicobacter pylori. Weiterhin betrifft sie die identifizierten Nukleinsäuren, welche für die essentiellen Genprodukte kodieren, und die davon kodierten Polypeptide.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene von pathogenen Mikroorganismen, deren Verwendung zum Auffinden neuer immunologischer und pharmakologischer Wirkstoffe zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose bakterieller Infektionen, sowie die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Wirkstoffe. Von der Erfindung eingeschlossen sind die entsprechenden Nukleinsäuren, welche für die essentiellen Genprodukte kodieren, und die davon kodierten Polypeptide. Außerdem betrifft die Erfindung Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, mit diesen Vektoren transformierte Zellen und für die Polypeptide spezifische Antikörper. Diese Nukleinsäuren und Polypeptide können zur Diagnose, Prävention und Behandlung von mikrobiellen Infektionen eingesetzt werden, insbesondere können sie zur Entwicklung von Antikörpern, Impfstoffen und Inhibitoren verwendet werden.

Die vollständige molekulare Erschließung des Genoms des Menschen und klinisch relevanter Pathogene öffnet neue Wege in der Entwicklung von Therapeutika bzw. Prophylaktika gegen die Krankheiten des Menschen. So ist die Entschlüsselung des menschlichen Genoms für die nächsten Jahren angekündigt. Die Anzahl molekular vollständig charakterisierter pathogener Keime nimmt ständig zu. Das erklärte Ziel ist es nun, aus dem umfangreichen Datenmaterial solche Gene zu identifizieren, deren Produkte als potentielles Ziel für einen Wirkstoff in Frage kommen und somit für die Entwicklung eines spezifischen Wirkstoffs benutzt werden können. Dieses Potential läßt sich aus der Primärstruktur eines Gens nicht ableiten, sondern muß experimentell bestimmt werden.

Liegt die komplette genomische Sequenz eines Organismus vor, steht man vor dem Problem, die enorme Datenmenge für weiterführende biologische Analysen zugänglich zu machen. Der erste Schritt ist die Identifizierung aller auf dem Genom liegenden Gene. Dies geschieht in der Regel mit Hilfe computergestützter Suchprogramme, die mit einer gewissen Sicherheit potentielle Gene vorhersagen können. Auf diese Weise können Genkarten erstellt werden, die allerdings noch mit einer großen Ungenauigkeit behaftet sind. Können die vom Suchprogramm ausgewiesenen Gene keinem bekannten Gen zugeordnet werden, muß die Funktionalität dieser hypothetischen Gene durch den physikalischen Nachweis der Genprodukte in der ursprünglichen Zelle nachgewiesen werden.

Eine andere Strategie, die ebenfalls auf der Anwendung spezieller Suchprogramme beruht, ist auf die Identifizierung möglicher Genfamilien ausgerichtet, die mit speziellen biologischen Eigenschaften verknüpft sind, die wiederum aufgrund weiterer Annahmen als Wirkstoffziel in Betracht kommen. Die Suchkriterien sind auf charakteristische Strukturmerkmale ausgerichtet, die in der Regel von schon bekannten Genen abgeleitet wurden. Das Ergebnis einer solchen Suche kann, in Abhängigkeit von der Annäherung der Vorgaben zum wirklichen Zustand, eine hohe Trefferquote liefern. In der Regel ist die Ungenauigkeit dieser Verfahren jedoch relativ hoch, und die wirkliche biologische Eigenschaft des Gens bzw. dessen Genprodukts muß auf jeden Fall experimentell bestätigt werden.

Eine weitere Strategie erfaßt die Expressionsprodukte einer Zelle, wodurch die zum jeweiligen Entwicklungszustand aktiven Gene identifiziert werden können. Vergleicht man verschiedene Entwicklungszustände miteinander, kann auf diese Weise das Zusammenwirken der Gene abgeleitet werden und in einigen Fällen kann die biologische Funktion unbekannter Gene teilweise entschlüsselt werden. Führt man entsprechende Vergleichsuntersuchungen mit Zellen durch, die ein pathologisches Erscheinungsbild haben, ist es sogar möglich auch krankheitsverursachende Gene zu identifizieren und diese als potentielle Wirkstoffziele für die Wirkstoffentwicklung einzusetzen.

Alle beschriebenen Verfahren dienen insbesondere dazu, bislang unbekannte Gene zu identifizieren und diesen mit Hilfe Computer-gestützter Datenvergleiche eine biologische Funktion zuzuordnen. Eine eindeutige Bewertung eines Gens bzw. Genprodukts hinsichtlich seines Potentials als Wirkstoffziel zu dienen und somit für die Entwicklung von Wirkstoffen herangezogen werden zu können, erfüllt jedoch keines der bekannten Verfahren.

Einige der wichtigsten Voraussetzungen für einen pathogenen Organismus, in einem Wirt zu überleben und sich zu vermehren, sind einerseits die Fähigkeit, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen, und andererseits die Fähigkeit zur Anpassung an einen ganz speziellen Lebensraum oder Nische. Die dafür verantwortlichen Faktoren und Proteine sind somit in der Regel essentiell für den pathogenen Keim.

Es wäre von großem Vorteil, diese essentiellen Gene von Mikroorganismen zu identifizieren, um auf diese Weise die Möglichkeit zur Herstellung von therapeutischen, präventiven oder/und diagnostischen Mitteln, z. B. Antikörpern, Impfstoffen oder Inhibitoren der entsprechenden Polypeptide zu bekommen.

Ein Pathogen von besonderem medizinischen Interesse ist Helicobacter pylori. Dieser Keim ist ein Gram-negatives, spiralförmiges Bakterium mit hohem pathogenen Potential, das in den letzten Jahren verstärkt Resistenzen gegen eine Reihe therapeutisch relevanter Antibiotika entwickelt hat und somit von großer klinischer Bedeutung ist. Es zeichnet sich durch extrem hohe Beweglichkeit aufgrund seiner Flagellen und der ungewöhnlichen Fähigkeit, im stark sauren Milieu (bis pH 1,5) des Magens überleben zu können, aus (Goodwin et al., 1989).

Obgleich das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen Magenschleimhaut seit langem bekannt ist, weiß man erst seit der erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums (Warren and Marshall 1983; Marshall et al., 1984) aus der Magenschleimhaut eines Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi), daß es sich hierbei um pathogene Keime handelt. Die H.pylori-Infektion zählt zu den häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen. Sie tritt weltweit auf, wobei ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert sind.

Eine Infektion führt zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis (Typ-B Gastritis) beim Menschen. Ferner geht man davon aus, daß H.pylori auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) sowie bei einigen Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom) spielt (Lee et al., 1993; Solnick und Tompkins, 1993). In zwei Studien von 1991 wurde eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der H.pylori-Infektion und dem Auftreten des Magenkarzinoms (intestinaler Typ) gezeigt, wobei beide Studien zu dem Schluß kamen, daß ca. 60% aller auftretenden Magenkarzinome wahrscheinlich auf eine H.pylori-Infektion zurückzuführen sind (Parsonnet et al., 1991; Nomura et al., 1991). Auch die seltener auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des Magens, die als Vorstufen von B-Zell-Tumoren des Immunsystems angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der H.pylori-Infektion. Eine Folge der Langzeitinfektion mit H.pylori ist die atrophische Gastritis, eine Degeneration der Schleim, Säure oder Pepsin produzierenden Zellen des Magenepithels, die als eine präkanzeröse Läsion angesehen werden muß.

Nach der oralen Aufnahme gelangen die Bakterien zunächst in das extrem saure Magenlumen (pH 1 bis 2). Dort wird durch die Produktion des Enzyms Urease, das zur Spaltung des vorhandenen Harnstoffs und damit zur lokalen Neutralisierung des sauren pH-Wertes im Magen führt, was das Überleben der Bakterien ermöglicht. Mittels chemotaktischer Orientierung und flagellenabhängiger Motilität bewegen sich die Keime dann in die Bicarbonat-gepufferte Schleimschicht der Antrum-Region des Magens, ihren eigentlichen natürlichen Habitat. Dort befinden sie sich in einer einzigartigen ökologischen Nische, die aufgrund der Säurebarriere nur für wenige konkurrierende Bakterienarten zugänglich ist. Vermutlich orientieren sich die Bakterien an den pH-Gradienten zwischen Lumen (pH 1-2) und Epithelzelloberfläche (pH 6-7), um zum Epithel zu gelangen. Durch ihre spiralige Form, ihre Beweglichkeit im viskosen Schleim, die Produktion von Mukus-modifizierenden Enzymen und schließlich durch eine mikroaerophile Lebensweise sind diese Keime optimal an die Lebensbedingungen in diesem Habitat angepaßt. Sie halten sich meist in den tiefen Krypten der Antrum- Region auf, wo sie vor äußeren Einflüssen wie z. B. Säure, Pepsin aber auch vor Medikamenten zu ihrer Eradikation, wie z. B. Antibiotika, geschützt sind. Ein Teil der Bakterienpopulation (ca. 20%) ist eng mit Epithelzellen assoziiert, vor allem mit Schleim produzierenden Zellen. Unter der Voraussetzung einer gastralen Metaplasie, d. h. der säureinduzierten Ausbildung von gastralem Epithel im Duodenum, kommt es auch zur Kolonisierung metaplastischer Areale im Zwölffingerdarm, wodurch die Voraussetzungen zur Entstehung des Zwölffingerdarmgeschwürs (Ulcus duodeni) geschaffen sind. Durch ihre Fähigkeit zur Adhärenz wird vermutlich eine komplette Ausscheidung der Helicobacter mit dem abgestoßenen Schleim verhindert, so daß die Bakterien für Jahre, Jahrzehnte oder gar lebenslang persistieren können (chronische Infektion).

Bevor die Existenz und die Bedeutung des H.pylori für die Ulkuserkrankungen bekannt waren, wurden diese durch sog. Antazida, oder H₂-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen, welche die Säuresekretion der Magenparietalzelle inhibieren. Unter dem Einfluß dieser Arzneimittel kommt es zwar zumeist zur Abheilung von Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die H.pylori-Infektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv).

Eine weitere, häufig bei Ulzerationen angewandte Therapie ist die Wismut- Behandlung. Verschiedene Wismut-Salze (CBS, BSS) haben einen bakteriziden Effekt auf H.pylori. Ein bedeutender Nachteil dieser Therapieform ist jedoch, daß eine totale Eradikation des Keims nur in einem sehr geringen Prozentsatz der Fälle erreicht wird (8 bis 32%). Wie bei der Behandlung mit Antazida kommt es nur zu einer vorübergehenden Suppression des Keims, und nach Absetzen der Behandlung erfolgt in den meisten Fällen wieder ein Aufflackern der Infektion. Ein weiterer Nachteil der Wismut-Behandlung ist, daß eine länger dauernde Therapie mit hohen Dosen zu einer Akkumulation dieser Substanz in der Leber, Niere und dem Nervensystem führt und beträchtliche neurologische Nebenwirkungen hat (Malfertheiner, 1994).

Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, werden zur Behandlung nun auch Antibiotika eingesetzt. Die Monotherapie mit verschiedenen Antibiotika (Amoxicillin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin und dergleichen) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es auch hier nur bei 0 bis 15% der Zellen zur kompletten Eradikation der Keime kommt. Die bisher erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine Kombination eines Säureblockers (Ompeprazol) mit einem Antibiotikum (Amoxicillin) erreicht, die zu Eradikationsraten bis zu 80% führen kann (Malfertheiner, 1994). Auf die Dauer ist eine Antibiotikabehandlung zur Eliminierung von H.pylori jedoch nicht erfolgversprechend, da aufgrund der unvollständigen Eradikation des Keims mit einer raschen Resistenz­ entwicklung der Bakterien gegen Antibiotika gerechnet werden muß.

Das zunehmende Auftreten von Antibiotika-Resistenzen und die eingeschränkten Behandlungsoptionen, die in der Regel beträchtliche unerwünschte Nebenwirkungen haben, macht das Auffinden neuer Therapieformen und dabei insbesondere die Identifizierung neuer Wirkstoffe notwendig, vor allem Impfstoffe, die sowohl zur prophylaktischen, als auch therapeutischen Behandlung von Helicobacter-Infektionen verwendet werden können. Von besonderem Interesse ist auch die Darreichungsform, da der Wirkstoff im Magen, d. h. in einem extrem sauren Milieu wirksam sein muß. Verbindungen mit Protonenblockern, die z. B. vor der Verabreichung des prophylaktischen oder therapeutischen Wirkstoffs gegeben werden, können hierbei von großem Nutzen sein.

Die molekulare Grundlage für persistierende, chronische Helicobacter- Infektionen ist bislang noch nicht geklärt. Es konnte gezeigt werden, daß die Faktoren Urease, Beweglichkeit und Adhärenz essentielle Eigenschaften des Bakteriums sind, die gastrische Mukosa kolonisieren zu können. Obgleich der Wirtsorganismus unter normalen Bedingungen nicht in der Lage ist, mit einer H.pylori-Infektion fertig zu werden, zeigte sich im Tiermodell, daß die Urease, ein essentieller Virulenzfaktor von H.pylori, ein hohes Potential als Vakzin besitzt (US-Patentanmeldung US-SN-07/970,006 "Urease-based Vaccine Against Helicobacter Infection").

Diejenigen Komponenten jedoch, die dafür verantwortlich sind, daß das Pathogen das Immunsystem des Wirtes umgehen kann, sind bisher noch unbekannt.

Pathogene Organismen im Allgemeinen haben eine Vielzahl von Strategien entwickelt, im Wirt über einen langen Zeitraum vom Immunsystem unbehelligt persistieren zu können (Haas und Göbel, 1992; Finlay und Falkow, 1997). Ein Mechanismus, der zum Überleben in lebensfeindlichem Milieu dient, ist die Ausbildung einer Überdauerungsform.

Im Falle von H.pylori sind in der Literatur kokkoide Formen als potentielle Überdauerungsformen mehrfach beschrieben, ihre klinische Bedeutung ist allerdings umstritten. Kokkoide Formen könnten für eine ex vivo Überdauerung eine große Rolle spielen. Hinsichtlich der in vivo Überdauerung wurde gezeigt, daß kokkoide Formen bevorzugt durch ein ungünstiges Milieu wie z. B. einen hohen O₂-Partialdruck oder subletale Gaben von Antibiotika (Wismut-Subcitrat, Erythromycin, Amoxicillin, Metronidazol) induziert werden (Donelli et al., 1998; Bode et al., 1993; Sorberg et al., 1996; Berry et al., 1995).

Einige Forscher gehen davon aus, daß diese kokkoiden Bakterien lebensfähig, aber nicht kultivierbar sind (VNC, viable but non-culturable). Eaton und Mitarbeiter erhielten eine erfolgreiche Infektion von Mini- Schweinchen mit vegetativen (spiraligen) H.pylori, während kokkoide Formen in diesem Modell keine Infektion zeigten (Eaton et al., 1995). Der direkte Nachweis von kokkoiden Formen im menschlichen Magen wurde von Chan et al. anhand von Magengewebeschnitten aus Biopsiematerial erbracht. In 82.8% (53/64)der untersuchten Biopsieproben konnten die Autoren kokkoide Formen von H.pylori nachweisen (Chan et al. 1994). Von Cao et al. wurde ein monoklonaler Antikörper zum spezifischen Nachweis von kokkoiden H.pylori im Gewebeschnitt benutzt. Auch hier wurden neben den vegetativen Formen in 100% der Antrumbiopsien (9/9) H.pylori kokkoide Formen nachgewiesen (Cao et al., 1997).

Die Bindung an Epithelzellen und die Fähigkeit zur Signaltransduktion (IL-8- Induktion, Rearrangement des Zytoskeletts, Bindung von Plasminogen, Laktoferrin und Vitronectin auf der Bakterienoberfläche) scheint bei kokkoiden Formen vergleichbar zu den vegetativen Formen erhalten zu sein (Khin et al., 1996; Segal et al., 1996).

Die oben genannten Experimente deuten auf eine Bedeutung kokkoider Formen für die Überlebensfähigkeit von Helicobacter in ungünstigem Milieu hin. Daher ist die Identifizierung von Genen, die mit der Entstehung dieser Form und Reaktivierung in die vitale Form zusammenhängen, für die Entwicklung neuer Wirkstoffe von größtem Interesse.

Neben Helicobacter pylori können auch andere Helicobacter Spezies den Magen des Menschen kolonisieren wie z. B. H.heilmannii und H.felis. Diesbezüglich konnte gezeigt werden, daß auch H.heilmannii mit krankhaften Ulkuserkrankungen in Zusammenhang gebracht werden kann. Die ursächliche Übertragung findet wahrscheinlich von Haustieren auf den Menschen statt. Bislang wurde der im Menschen häufig vorkommende H.pylori in den Verdacht gebracht, bei der Entstehung von Magenkrebs eine Rolle zu spielen. Mittlerweile gibt es klinische Daten, die diesen Zusammenhang anzweifeln. Besonders werden diese Zweifel durch neuere Daten von Helicobacter heilmannii unterstützt, die diesem ein größeres kanzerogenes Potential beimessen und dessen Bedeutung bei der Entstehung des gastrischen MALT Lymphoms hervorheben (Regimbeau et al., 1988).

Wird das bisher Gesagte zusammenfassend betrachtet, ist es klar, daß ein Bedürfnis nach neuen Therapieformen für die Bekämpfung bakterieller Krankheitserreger, insbesondere nach Impfstoffen und Inhibitoren von essentiellen Genen bzw. deren Expressionsprodukten besteht. Die zunehmende Resistenzentwicklung gegen eine Vielzahl bewährter Medikaments erfordert eine kontinuierliche Versorgung mit neuen Wirkstoffen. Dieser steigende Bedarf an neuen Wirkstoffen kann nur gedeckt werden, wenn neue Wirkstoffziele identifiziert und diese zur Entwicklung neuer Wirkstoffe herangezogen werden. Essentielle Gene stellen für die Wirkstoffentwicklung ein ideales Ziel dar, da sie für das Überleben des Krankheitserregers notwendig sind.

Die Identifizierung essentieller Gene von Helicobacter, insbesondere von H.pylori bzw. heilmannii und von möglichen Helicobacter Überdauerungsformen zur Entwicklung und Optimierung neuer therapeutischer, präventiver und/oder diagnostischer Mittel, wie z. B. Impfstoffe und pharmakologischer Wirkstoffe stellt daher ein Ziel der Erfindung dar. Im Vordergrund steht das Auffinden essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert werden. Bei Helicobacter stehen insbesondere Gene im Vordergrund, die lebensnotwendige Funktionen im Infektionsprozeß erfüllen, sowie Gene, die an der Entwicklung und Reaktivierung von kokkoiden Formen beteiligt sind. Von besonderem Interesse sind hierbei essentielle Gene, die für sekretierte Genprodukte kodieren, da diese für immunologische und pharmakologische Wirkstoffe aufgrund ihrer exponierten Lokalisation besonders gut erreicht werden können und daher gute Kandidaten zur Wirkstoffentwicklung sind. Weiterhin von Interesse sind essentielle Gene, die für Genprodukte kodieren, die an der Entwicklung und der Aufrechterhaltung von Überdauerungsformen beteiligt sind. Eine weitere Aufgabe ist das Auffinden essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert werden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis, zur Therapie oder/und zur Prävention von mikrobiellen Infektionen, das die folgenden Schritte umfaßt:

• A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebens- und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen in einem Testsystem.
• B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktivierung der Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.
• C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln,
• D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.

Das hier dargestellte Verfahren befaßt sich mit der Identifizierung essentieller Gene und deren Verwendung zur Entwicklung neuer Wirkstoffe.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren zum Identifizieren von essentiellen mikrobiellen Genen, das die folgenden Schritte umfaßt:

• a) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen,
• b) Bestimmen der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i),
• c) Identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defiziert sind und
• d) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiell für die Überlebensfähigkeit sind.

CAI ist die Abkürzung für "conditional antisense inhibition", d. h. konditionale Antisensehemmung. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren, welches weiter unten näher beschrieben ist.

SRM steht für "subtractive recombination mutagenesis", d. h. subtraktive Rekombinationsmutagenese und ist ebenfalls unten beschrieben.

Der Ausdruck "gendefizient", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der defiziente Organismus nicht in der Lage ist, ein oder mehrere seiner Genprodukte herzustellen oder deren Funktion zu nutzen. Die Herstellung des entsprechenden Genprodukts kann einerseits durch Mutagenese des entsprechenden Gens verhindert werden, oder es kann eine Inhibition während der Expression stattfinden, z. B. durch Antisensenukleinsäuren. Eine Mutagenese kann dazu eingesetzt werden, ein Gen in dem Genom des Mikroorganismus zu mutieren, oder dazu, ein mutiertes Gen in den Mikroorganismus einzubringen, wobei man sich auch die homologe Rekombination zunutze machen kann.

Ein proteinkodierender Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz ist beispielweise ein Gen oder ein Teil eines Gens das/der die Expression eines Polypeptids erlaubt.

Der Begriff "essentielles Gen" bedeutet ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, ohne welches ein Organismus nicht überlebensfähig ist oder nur beschränkt überlebensfähig ist. Essentielle Gene können in zwei Klassen unterteilt werden: obligat essentielle und fakultativ essentielle Gene. Ein obligat essentielles Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder die Vermehrung eines Organismus unter allen Umständen unabdingbar ist. Demgegenüber kodiert ein fakultativ essentielles Gen für ein Protein, das lediglich unter bestimmten Bedingungen für das Überleben oder die Vermehrung des Organismus notwendig ist, wie z. B. die Fähigkeit des Organismus, innerhalb von kultivierten Säugerzellen oder im Tier zu überleben. In beiden Fällen wird das Überleben oder die Vermehrung des Organismus durch die Inaktivierung eines für ihn essentiellen Gens bzw. die Inhibierung eines für ihn essentiellen Genproduktes stark beeinträchtigt bzw. verhindert. Ist ein Bakterium nach der Inaktivierung eines bestimmten Gens nicht mehr überlebensfähig bzw. in der Vermehrung eingeschränkt, kann dies als erster Hinweis dafür gewertet werden, daß durch dieses Gen essentielle Eigenschaften vermittelt werden. Die Aussagekraft solcher Befunde muß jedoch durch begleitende Kontrollexperimente untermauert werden, z. B. sollte eine solche letale Mutation in einem zweiten Schritt durch eine entsprechende Komplementation des Gens bzw. Genprodukts aufgehoben werden können. Obligat essentielle Gene sind demnach solche, deren Nichtexpression oder Nichtvorhandensein, z. B. durch Mutagenese oder Deletion dazu führt, daß der Organismus weder in natürlicher Umgebung, noch auf einem ideal auf die Bedürfnisse des Mikroorganismus abgestimmten Vollmedium lebensfähig ist. Ist ein Mikroorganismus in einem fakultativ essentiellen Gen defizient, ist er in der Regel auf einem solchen je nach Organismus definierten Vollmedium noch wachstumsfähig, kann jedoch in natürlicher Umgebung, d. h. in seinem natürlichen Wirt oder Zellen oder Gewebekulturen seines natürlichen Wirtes nicht mehr überleben.

Identifizieren von essentiellen Genen

Durch das neue Verfahren können unabhängig von ihrer speziellen Funktion essentielle Gene von Mikroorganismen identifiziert werden. Bevorzugt wird dieses Verfahren zur Identifizierung von essentiellen Genen aus Helicobacter und verwandten Mikroorganismen eingesetzt.

In einem ersten Teilschritt wird das komplette Genom eines bakteriellen Krankheitserregers mit einem molekulargenetischen Ansatz nach essentiellen Genen durchsucht. Dieser Teilschritt erfordert keinerlei Kenntnisse über die Primärstruktur des Genoms bzw. individueller Gene, sondern erfolgt ausschließlich aufgrund biologischer Kriterien. Ist ein Gen als essentielle Determinante identifiziert, wird dessen Identität ermittelt. Hierbei kann auf die ermittelten Rohsequenzdaten der genomischen Sequenzierungen zurückgegriffen werden. Anhand der ermittelten Gensequenz können z. B. isogene Varianten ermittelt werden bzw. ob sich das ermittelte Gen in einem Operon befindet, in dem sich möglicherweise weitere essentielle Gene befinden.

In einem zweiten Teilschritt werden die identifizierten Gene in spezielle genetische Systeme überführt, die dazu dienen die Gene bzw. deren Genprodukte einem direkten Wirkstoff-Screening zuzuführen und/oder die Gene bzw. Genprodukte dazu verwendet, bereits identifizierte Wirkstoffe weiter zu optimieren. Der wesentliche Vorteil des Gesamtverfahrens beruht auf der rasch aufeinanderfolgenden Ausführung des Gen- und Wirkstoff- Screenings in aussagekräftigen biologischen Systemen, so daß in relativ kurzer Zeit aus dem kompletten Gensatz eines pathogenen Mikroorganismus die potentiellen Wirkstoffziele identifiziert, produziert und diese direkt zum Wirkstoff-Screening bzw. Optimierung eingesetzt werden können.

Falls ein Mirkoorganismus untersucht wird, dessen Genom bereits sequenziert ist, kann die Identifizierung eines Gens oder Genabschnitts mit Hilfe von Datenbankanalysen erfolgen, wobei einem Sequenzabschnitt ein Leserahmen zugeordnet wird. Bevorzugt kann jedoch unabhängig vom Vorhandensein einer vollständigen Genomerzeugung eine beliebige Genbank einer Vorselektion unterzogen werden. Dabei kann bevorzugt die Vorselektion auf Gene durchgeführt werden, die für Polypeptide mit einer bestimmten Funktion kodieren, zum Beispiel mit Hilfe von Homologieanalysen. Die Vorselektion kann auch auf Gene durchgeführt werden, die nur in bestimmten Entwicklungsstufen exprimiert werden.

Im Rahmen des ersten Teilschritts kann durch Selektionsschritte eine starke Reduktion des zu untersuchenden Genmaterials erzielt werden. Z. B. durch einen Anreicherungsschritt für Gene, die für exportierte oder sekretierte Genprodukte kodieren. In diesem speziellen Verfahren werden die DNA- Abschnitte einer Genbank von einem Pathogen mutagenisiert, was beispielsweise durch Klonieren eines solchen DNA-Abschnitts in ein Plasmid, Transformation in einen bevorzugt heterologen Wirtsorganismus und anschließende Mutagenese erfolgen kann. Das daraus entstandene Expressionsprodukt kann dann nachgewiesen werden. Die Mutagenese kann beispielsweise durch Insertion einer Markersequenz erfolgen, welche bei Expression der mutagenisierten Sequenz in einem Wirtsorganismus zu einem Fusionspolypeptid führt, auf das selektiert werden kann. Die Insertion der Markersequenz ist nicht auf Transposoninsertion beschränkt, sondern kann auch auf andere Art und Weise erfolgen, beispielsweise durch homologe Rekombination oder Infektion und Rekombination mit Hilfe von Bakteriophagen.

Die verwendete Markersequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist im allgemeinen ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, das eine Selektion auf diejenigen Wirtsorganismen erlaubt, welche diese Sequenz exprimieren. Im allgemeinen handelt es sich bei diesen Markersequenzen um Resistenzgene, die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika verleihen, oder welche es dem Wirtsorganismus erlauben, in einem Selektionsmedium zu überleben. Der Genmarker besitzt bevorzugt keine eigenen Expressionssignale, sondern ist direkt abhängig von einem vorgeschalteten Promoter, wie z. B. dem Transkriptionspromotor auf dem Promotersegment oder ein Promoter, der auf dem klonierten heterologen zu identifizierenden DNA-Fragment liegt. Alternativ zu Antibiotikaresistenz-Markersequenzen können auch Enzyme als Genmarker eingesetzt werden. In diesen Fällen wird die erfolgreiche Insertion durch eine bestimmte Farbreaktion angezeigt, welche die manuelle Isolierung des entsprechenden Bakterienklons erlaubt.

Wenn die Markersequenz als Fusionsprotein mit dem Expressionsprodukt des inserierten DNA-Fragments exprimiert wird und eine Selektion wie oben beschrieben durchgeführt wird, kann DNA-Material aus den selektierten Bakterienklonen isoliert werden und die DNA-Sequenz, die für das Fusionsprodukt kodiert, nach bekannten Verfahren bestimmt werden. Dies erlaubt die Zuweisung eines Leserahmens zu dem zu identifizierenden DNA- Fragment. Es ist dann möglich, Vergleichsstudien mit allgemein verfügbaren DNA-Sequenzdatenbanken durchzuführen, um die Identität des identifizierten Gens abzuklären und gegebenenfalls Hinweise auf eine biologische Funktion zu erlangen.

Durch technische und weitere Ergänzungen der beiden unten dargestellten Verfahren, CAI und SRM, kann eine zielgerichtete Reduktion des Probenvolumens erreicht werden. Dabei handelt es sich ebenfalls um vorgeschaltete Selektionsverfahren, die auf bestimmte Gengruppen abzielen, z. B. der Einsatz subtraktiver Genbanken von pathogenen und apathogener Vertretern. Hierbei werden pathogenitätsvermittelnde Genbereiche angereichert. Derartige Subtraktionsverfahren können auch angewendet werden, um für bestimmte Organismen spezifische Gene zu identifizieren, beispielsweise durch einen Vergleich und Subtraktion der Genomen von H.pylori und H.heilmannii.

In weiteren Verfahren können z. B. Gengruppen identifiziert werden, die nur in einem bestimmten Entwicklungsschritt exprimiert werden. Hervorzuheben ist beispielsweise das Array-Verfahren, bei dem die einzelnen Genproben des Pathogens rasterförmig auf einen Träger aufgebracht werden. Die einzelnen Auftragspunkte sind bekannt, so daß bei einer positiven Hybridisierungsreaktion mit den entwicklungsspezifischen Transkriptionsprodukten oder cDNAs oder subtraktiven cDNAs oder Fragmente davon, die jeweiligen Gene identifiziert und anschließend kloniert werden können. Andere Verfahren, die entwicklungsspezifische Gengruppen erfassen, sind vergleichende Proteom- und Differential-Display-Analysen.

Um herauszufinden, ob es sich bei den identifizierten Gensequenzen um essentielle Gene handelt, werden Mikroorganismen hergestellt, welche in den Sequenzen defizient sind, welche den identifizierten Gensequenzen entsprechen. Die defizienten Mikroorganismen werden dann auf verschiedenen Wachstumsmedien bzw. Zellkulturen oder im Tiermodell oder im natürlichen Wirt getestet, und die defizienten Gene können dann je nach Wachstumsfähigkeit einer Kategorie der nicht essentiellen, obligat essentiellen oder fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.

Auf die Bedeutung von Genen, welche die Entwicklung aus der vitalen in die Überdauerungsform und umgekehrt steuern, ist bereits eingangs hingewiesen worden. Es ist daher besonders bevorzugt, eine Vorselektion auf solche Gene durchzuführen. Im Weiteren können Verfahren wie etwa CAI oder SRM angewendet werden und die gendefizienten Mikroorganismen dann auf bestimmten Nährmedien untersucht werden, welche den Übergang von der einen in die andere Form auslösen. Bei Helicobacter ist insbesondere das Schivo-Medium bevorzugt, welches die Reaktivierung der kokkoiden Form in die vitale spiralige Form ermöglicht.

Die Erzeugung von defizienten Mikroorganismen kann auf mehrere Arten erfolgen.

Es stehen eine Reihe von molekulargenetischen Verfahren zur Verfügung, das Genom eines bakteriellen Pathogens so zu mutagenisieren, daß von jedem Gen eine Mutante zur Verfügung steht. Die gängigste Mutagenesemethode beruht auf der Inaktivierung von Genen, z. B. durch zufällig im Genom inserierende Transposons, die über entsprechende Marker selektioniert werden. Für dieses Verfahren bestehen zahlreiche Variationen, die auf verschiedene Organismen angewendet werden können. (Joyce und Grindley, 1984; Akerley, et al., 1998). Mit Hilfe der inserierten Transposons läßt sich auch das mutagenisierte Gen im Genom genau lokalisieren.

Hat man eine Genmutante mit einem nachweisbaren biologischen Effekt erzeugt, z. B. ein vermindertes Wachstum der Zellen in einem bestimmten Milieu, so muß in einem zweiten Schritt die eindeutige Kopplung des Gens bzw. des Genprodukts mit dieser Eigenschaft nachgewiesen werden. Dies geschieht in der Regel durch Komplementationsexperimente. In diesem Fall wird in den Organismus mit der spezifischen Genmutante das ursprüngliche Gen eingebracht und exprimiert. Kann über diesen Weg die ursprüngliche Eigenschaft des Organismus regeneriert werden, ist der notwendige Beweis erbracht. Allerdings läßt sich dieses Verfahren nicht bei der Charakterisierung von Letalmutanten anwenden, d. h. bei Mutanten obligat essentieller Gene. Einen Ausweg bietet die Verwendung konditionaler Mutationen zur Komplementation. Z. B. lassen sich durch chemische Mutagenese des untersuchten Gens temperatursensitive Mutanten erzeugen, die das Genprodukt bei der normalerweise optimalen Wachstumstemperatur in eine inaktive Zustandsform bringen und bei niedrigeren Temperaturen ein biologisch aktives Genprodukt hervorbringen (Das, et al., 1976; Harris, et al., 1992; Hou, et al. 1994; Polissi and Georgopoulos, 1996). In einem anderen praktizierten Ansatz werden die wildtypischen Komplementationen durch exogene Substanzen, sogen. Induktoren, gesteuert. Über diese Induktoren wird die Expression des komplementierenden Gens eingeschaltet, das auf einem Episom in die genspezifische Mutante eingebracht wird und nach Induktion das fehlende Genprodukt ersetzt (Murphy, et al., 1995. Chow and Berg, 1988; Arigoni, et al., 1998).

Die genannten Verfahren sind sehr zeitaufwendig und werden nur für die Untersuchung individueller Gene oder begrenzter genomischer Abschnitte eingesetzt. Verfahren, die eine durchgängige Charakterisierung einer vollständigen, mutagenisierten Genbank eines ausgewählten Pathogens nach dem beschriebenen Schema ermöglichen, sind bislang nicht bekannt.

Die nachfolgend beschriebenen neuen genetischen Verfahren, die Konditionale Antisense-Hemmung (CAI) und die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) erfüllen diese Anforderungen. Beide Verfahren können zur Identifizierung essentieller Gene eingesetzt werden, wobei sich das CAI-Verfahren besonders für die Identifizierung obligat essentieller Gene eignet und das SRM-Verfahren für fakultativ essentielle Gene.

Das CAI-Verfahren beruht auf der konditionalen Hemmung der Translation von einem oder mehreren Genen, die auf einem klonierten Genomfragment (welches dann als Matrize oder Template dient) liegen und über ein Plasmid im zu untersuchenden Keim propagiert werden. Im Vergleich zu konventionellen Verfahren bleibt die genomische Struktur des zu untersuchenden Keims unverändert, d. h. im Originalzustand. Im zu untersuchenden Keim wird die Hemmung der Translation durch die konditional induzierbare Synthese spezifischer Antisense-RNA (asRNA) ausgelöst, die das komplette klonierte Genomfragment umfaßt, inklusive der auf dem Genomfragment lokalisierten Gene. Die Antisense- Nukleinsäuresequenzen können dann im Mikroorganismus in großen Mengen synthetisiert werden und binden an die ursprüngliche mRNA, wobei diese mRNA nicht mehr translatiert werden kann und somit dem Expressionsapparat entzogen wird. Die Folge ist, daß entweder kein Genprodukt oder nur geringe Mengen davon gebildet werden. Die Synthese der asRNA unterliegt der Kontrolle durch einen Promoter (asPromoter), dessen Aktivität konditional, durch definierte, externe Signale gesteuert wird. Diese konditionale Inhibition der Expression eines Gens oder Operons erfolgt somit über die Regulation der Synthese der asRNA durch den induzierbaren asPromoter. Zum Nachweis, daß ein Gen bzw. Operon, wie im vorliegenden Fall, für das Überleben und die Vermehrung des Organismus unter bestimmten Bedingungen essentiell ist, wird die Überlebens- und Vermehrungsrate eines Klons, in dem die Synthese der asRNA induziert ist, mit seiner Überlebens-/Vermehrungsrate bei nicht induzierter asRNA Synthese verglichen. Ist die Überlebens-/Vermehrungsrate des Klons bei Induktion der asRNA Synthese vermindert, so handelt es sich bei dem inhibierten Gen bzw. Operon um ein (obligat oder fakultativ) essentielles Gen. Diese Wachstumsanalysen können automatisiert durchgeführt werden, so daß eine sehr große Anzahl von Genen innerhalb kurzer Zeit untersucht werden können. Aus diesen Klonen wird das Plasmid isoliert und die DNA- Sequenz des klonierten Genomfragments, das als Template für die asRNA Synthese dient, bestimmt und in Folge die Struktur des essentiellen Gens ermittelt.

Ein für das CAI-Verfahren geeigneter Plasmidvektor ist in Abb. 1 dargestellt. Er enthält ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters (P_i) und weiteren üblichen Expressionssignalen sowie ein mRNA-stabilisierendes Element, so daß das DNA-Fragment in Form von Antisense RNA (asRNA) exprimiert werden kann und eine lange biologische Aktivität hat. Ein geeigneter Promoter ist z. B. der Tet-Promoter. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert der CAI-Vektor zusätzlich ein Gen für ein regulatorisches Protein, welches den Promoter reguliert, in diesem Fall, z. B. den Tet-Repressor, welcher durch ein exogenes oder extrazelluläres Signal, wie z. B. Tetrazyklin, gesteuert werden kann. Der CAI-Vektor der besonderen Ausführungsform von Abb. 1 enthält weiterhin ein oder mehrere selektionierbare Markergene sowie zwei Replikationsursprünge (ori), einen für den zu untersuchenden Mikroorganismus (hier als Pathogen bezeichnet) und einen weiteren für einen üblichen Klonierwirt z. B. E.coli. Mit Hilfe solcher CAI-Vektoren können aus ganzen mikrobiellen Genomen Antisense-Bibliotheken erstellt werden.

Abb. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines bevorzugten CAI- Verfahrens. Von einem CAI-Plasmid, das kleine Fragmente einer genomischen Bank des zu untersuchenden Mikrooganismus enthält, wird asRNA von einem induzierbaren Promoter (P_i) aus, unter Kontrolle eines extrazellulären Signals synthetisiert (siehe Abb. 1). Die asRNA hybridisiert sequenzspezifisch mit der mRNA desjenigen Gens, das dem klonierten DNA Fragment auf dem CAI Plasmid entspricht. Durch die Bildung des asRNA- mRNA Hybrids wird die Translation dieser mRNA reduziert oder verhindert. In Folge entsteht ein defizienter Mikroorganismus, der nicht in der Lage ist, daß betreffende Genprodukt zu bilden. Handelt es sich um das Produkt eines essentiellen Gens, dessen Bildung inhibiert wird (A), ist die Lebensfähigkeit des entsprechenden Klons eingeschränkt oder verhindert. Die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus wird im folgenden anhand seiner Lebens- oder Überlebens- oder Vermehrungsrate in einem definierten biologischen System bestimmt. Bei nicht erfolgender Induktion der asRNA Synthese (B), oder wenn das CAI-Plasmid das Fragment eines nicht- essentiellen Gens enthält (C), ist der Klon des Mikroorganismus normal lebens- und vermehrungsfähig.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen des CAI-Verfahrens werden ganze Antisense-RNA-Plasmidbanken aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus analysiert (siehe Abb. 3). Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1) wird in den zu untersuchenden homologen Mikroorganismus unter nicht-induzierenden Bedingungen übertragen und die plasmidtragenden Klone über einen plasmidkodierten Marker selektioniert. Die Lebensfähigkeit der einzelnen Klone, die jeweils ein bestimmtes CAI Plasmid aus der Genbank erhalten, wird anschießend anhand ihrer Vermehrungsrate unter induzierten bzw. nicht induzierten Bedingungen (+ und - in der Abbildung), bezogen auf die asRNA Synthese, im direkten Vergleich untersucht. In Klonen, die sich unter asRNA induzierenden Bedingungen kaum oder nur langsam vermehren, wird die Translation von mindestens einem essentiellen Gen verhindert. Aus diesen Klonen werden die CAI-Plasmide isoliert. Die essentiellen Gene werden durch Sequenzierung der genomischen Fragmente in den isolierten CAI-Plasmiden identifiziert.

Dieser Ansatz läßt sich auch bevorzugt mit einem subtraktiven Verfahren kombinieren (SCAI), von dem eine Ausführungsform zur Veranschaulichung in Abb. 4 dargestellt ist. Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1 und 3) wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus übertragen und die entstehenden individuellen Klone werden als bakterielle CAI-Bank in einem Pool zusammengefaßt. Dieser Pool wird zur Selektion in zwei identische Gruppen (den Driver- und den Tester-Pool) aufgespalten.

Der Ausdruck "Driver" wird hierbei für denjenigen Pool von bakteriellen Klonen verwendet, der so behandelt wird, daß der induzierbare Promoter aktiviert wird und asRNA vom CAI-Vektor exprimiert. Der "Tester"-Pool enthält einen identischen Satz Klone mit CAI-Plasmiden, der jedoch unter nicht-induzierenden Bedingungen gehalten wird und somit Wildtyp- Eigenschaften besitzt.

In der Regel wird der "Driver"-Pool zur Selektion (z. B. im Tier) eingesetzt, während der "Tester"-Pool unbehandelt aufbewahrt wird. Es können aber auch beide Gruppen einer Selektion unterzogen werden, wobei lediglich der "Driver"-Pool durch Gabe des Signals (z. B. Tetrazyklin) induziert wird. Klone, in denen durch die Expression einer bestimmten asRNA die Translation eines essentiellen Gens gehemmt wird, gehen während der Selektion aus der Gruppe verloren. Nach angemessener Zeit werden die überlebenden Klone beider Gruppen wiedergewonnen und die CAI-Plasmide aus den Klonen beider Gruppen isoliert. Die klonierten genomischen Fragmente werden anschließend über PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die mit Vektorsequenzen seitlich der klonierten genomischen Fragmente hybridisieren. Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von essentiellen Genen darstellten, werden durch subtraktive Hybridisierung (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.

Ein erfindungsgemäß für einen CAI-Vektor geeigneter Promoter ist beispielsweise der Tet-Promoter, dessen Aktivität über ein regulatorischen Proten (in diesem Fall den Tet-Repressor) gesteuert werden kann und durch ein extrazelluläres Signal (Tetracyclin) induziert werden kann. Weitere induzierbare Promoteren sind im Stand der Technik bekannt.

Antisense-RNA stabilisierende Elemente sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.

Der hohe Wirkungsgrad des CAI Verfahrens bei der Inaktivierung von Einzelgenen in einem Organismus ergibt sich aus der überlappenden Klonierung kleiner genomischer Fragmente und der damit einhergehenden Synthese unterschiedlicher asRNA Abkömmlinge für einen bestimmten Genbereich. Auf diese Art wird die Wahrscheinlichkeit, eine asRNA zu erhalten, welche die Translation des gesuchten Zielgens effizient inhibiert, stark erhöht. Derartige Untersuchungen können auf das komplette Genom eines Pathogens ausgerichtet werden, was die Überprüfung einer sehr großen Anzahl individueller genomischer Fragmente erforderlich macht. Hier sind apparative Hilfsmittel (Roboter) von Vorteil, um einen hohen Probendurchsatz zu erzielen. Allerdings können in diesen Fällen nur bestimmte Zustände untersucht werden, z. B. das Wachstum der Zellen in einem bestimmten Medium.

Durch den zusätzlichen Einsatz substraktiver Verfahrensschritte (Subtractive Conditional Antisense Inhibition, SCAI), kann die Anzahl der zu untersuchenden individuellen Klone bevorzugt stark reduziert werden.

Die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) wird bevorzugt zur Identifizierung fakultativ essentieller Gene herangezogen. Im Unterschied zum CAI-Verfahren werden dauerhafte Genmutationen erzeugt, wobei die Anreicherung essentieller Gene über einen substraktiven Schritt erreicht wird. Die SRM Methode kann wie das CAI Verfahren mit Genbanken von pathogenen Mikroorganismen durchgeführt werden.

Das SRM Verfahren beruht auf der Inaktivierung einzelner Gene im Genom eines Pathogens durch vollständige Insertion eines bestimmten Suizidplasmids, wobei dieses ein Teil einer Genbank ist. Die Insertion der Plasmide in das Genom erfolgt, durch homologe Rekombination. Die erfolgreiche Insertion wird durch Expression eines plasmidkodierten Antibiotikum-Resistenzmarkers angezeigt.

Eine bevorzugte Ausführungsform der SRM-Methode wird anhand der Abb. 5 bis 8 veranschaulicht.

In Abb. 5 ist ein geeigneter SRM-Vektor dargestellt, der wie der CAI- Vektor ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält, sowie einen Replikationsursprung (ori) für einen Klonierwirt (z. B. E.coli), ein oder mehrere selektionierbare Markergene und einen weiteren konditional aktiven Replikationsursprung für den zu untersuchenden Mikroorganismus, z. B. einen temperatursensitiven Ursprung oder einen Ursprung, dessen Aktivität von einem in trans vorhandenen Replikationsfaktor abhängig ist und der zusätzlich in das System eingebracht werden kann. Dadurch daß das SRM-Plasmid eine genomische Sequenz des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält, kommt es bei Transfektion dieses Vektors in diesem Mikroorganismus zu einer homologen Rekombination, bei der das gesamte SRM-Plasmid in das genomische Gen des Mikroorganismus inseriert wird und das entsprechende Gen, fall es sich um ein solches handelt, inaktiviert. Dies führt zu einer Insertionsmutante. Geeignete induzierbare Replikationsursprünge sind, wie erwähnt, temperatursensitive oris oder solche, die durch einen Faktor gesteuert werden können, wie z. B. den RGK-Faktor pir oder den pWV Faktor repA, der in trans dem System zugeführt wird.

Die Insertion eines SRM-Plasmids (siehe Abb. 5) in das Genom des zu untersuchenden Mikroorganismus erfolgt über homologe Rekombination zwischen dem im Plasmid klonierten genomischen Fragment des Mikrooganismus und der komplementären, genomischen DNA Sequenz. Nachdem das Plasmid in den entsprechenden Mikroorganismus überführt worden ist, werden unter nicht permissiven Bedingungen, d. h. bei inaktivem ori, diejenigen Klone über Selektion auf den plasmidkodierten Marker isoliert, in welchen das SRM-Plasmid in das Genom inseriert ist. Die Exzision des SRM-Plasmids erfolgt ebenfalls über homologe Rekombination. Unter permissiven Bedingungen wird die Replikation des insertierten Plasmids eingeleitet, wodurch genügende Mengen an freiem Plasmid in den Zellen entstehen, so daß das Plasmid aus dem Klon wieder isoliert werden kann. Sofern die Insertion eines SRM-Plasmids in ein essentielles Gen stattgefunden hat, wird die Lebensfähigkeit des betreffenden Klons eingeschränkt (A), während Mutanten in nichtessentiellen Genen normal lebensfähig sind (B).

Ebenso wie beim CAI-Verfahren kann eine Bank von Insertionsplasmiden aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus in diesen Mikroorganismus übertragen werden und genomische Insertionsmutanten gebildet werden. Diese bevorzugte Ausführungsform des SRM-Verfahrens ist in Abb. 7 dargestellt. Eine Bank von SRM- Plasmiden, die einzelne genomische oder subgenomische Fragmente enthalten, wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus übertragen. Unter Bedingungen, welche die Plasmidreplikation nicht erlauben, werden genomische Insertionsmutanten mit Hilfe eines plasmidkodierten Markers (siehe Abb. 5) selektioniert. In diesem Schritt können nur Insertionsmutanten überleben, die in einem nicht- oder fakultativ essentiellen Gen mutiert sind, da Mutanten eines essentiellen Gens nicht lebensfähig sind. Die individuellen Insertionsmutanten werden in einem Pool zusammengefaßt und dieser Pool anschließend in zwei identische Gruppen, den Driver- und den Tester-Pool, aufgeteilt. Der Driver-Pool wird selektioniert, z. B. durch die Infektion eines Tiers. Der Tester-Pool bleibt unbehandelt. Durch die Selektion gehen solche Klone aus dem Driver-Pool verloren, die eine Insertion in einem fakultativ essentiellen Gen (das für das Überleben und die Vermehrung unter den Selektionsbedingungen notwendig ist) enthalten. Anschließend werden aus den überlebenden Klonen beider Pools, die in das Genom des Mikroorganismus inserierten Plasmide unter permissiven Bedingungen rezirkularisiert und zurückgewonnen. In dem Driver-Pool fehlen solchen Plasmide, die Fragmente von fakultativ essentiellen Genen enthalten. Die in den SRM Plasmiden klonierten Fragmente werden in beiden Pools anschließend über PCR amplifiziert (siehe Abb. 4). Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von fakultativ essentiellen Genen darstellen, werden durch genetische Subtrakion (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.

Eine besondere Ausführungsform, welche sich eine subtraktive Hybridisierung zur Anreicherung in Fragmenten essentieller Gene zunutze macht, ist in Abb. 8 beispielhaft veranschaulicht.

• 1. A: PCR-basierte genetische Subtraktion. Die Tester DNA-Fragmente (siehe Abb. 4 und 7) werden mit einem Adapteroligonukleotid in solcher Weise ligiert, daß der Adapter nur mit einem der beiden DNA Stränge eines doppelsträngigen Tester DNA Fragments kovalent verbunden ist, was z. B. durch die Ligation eines doppelsträngigen, nicht phosphorylierten Adapters an die 3'-phosphorylierten DNA Fragmente der Tester DNA erreicht wird. Diese Tester DNA Fragmente werden dann mit einem molaren Überschuss an Driver DNA Fragmenten gemischt. Die Mischung wird denaturiert und langsam rehybridisiert. Anschließend werden überhängende Einzelstrangenden mit DNA Polymerase zum Doppelstrang aufgefüllt. Die Produkte dieser Reaktion werden mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die den Adaptersequenzen entsprechen. Nur solche Tester DNA Fragmente, die nicht mit Driver DNA Fragmenten hybridisiert haben, werden exponentiell amplifiziert somit angereichert und anschließend durch Klonierung isoliert.
• 2. B: Genetische Subtraktion durch physikalische Abtrennung von biotinylierten DNA Fragmenten. Die Driver DNA Fragmente werden biotinyliert und anschließend im Überschuß mit Tester DNA Fragmenten gemischt, denaturiert und langsam rehybridisiert. Die biotinylierten Homo-Driver-Driver Doppelstränge und Heteroduplexe (Driver-Tester Doppelstränge) werden durch Extraktion mit Träger­ gekoppeltem Streptavidin von den Tester-Tester Homoduplexen abgetrennt. Letztere werden durch Klonierung isoliert.

Die beispielsweise durch SRM erzeugten Insertionsmutanten werden in Tierversuchen oder Zellkultursystemen hinsichtlich ihrer veränderten biologischen Eigenschaften untersucht. Durch die gezielte Verwendung spezieller Wirtszellen, z. B. kultivierte Makrophagen oder Wirtsgewebe, z. B. Milz, können Gengruppen selektiert werden, die essentielle Eigenschaften des Pathogens determinieren, z. B. die Besiedlung bestimmter Wirtszellen. Isoliert man die überlebenden Mutanten aus den Zellen, so fehlen die Mutanten essentieller Gene. Subtrahiert man aus der kompletten Genbank, die überlebenden Mutanten, so erhält man die Mutanten der essentiellen Gene. Dies geschieht über einen speziellen PCR-basierten Substraktionsschritt.

Das CAI- bzw. das SRM-Verfahren ist eine sehr effiziente Methode zur ein­ deutigen Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene. Da essen­ tielle Gene ein natürliches Ziel für inhibierende Wirkstoffe darstellen, bieten die dargestellten Verfahren eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe.

In den nachfolgend beschriebenen Verfahren werden die identifizierten Gene direkt zum Wirkstoff-Screening eingesetzt, wobei im Vergleich zu herkömm­ lichen Verfahren, auf aufwendige Aufreinigungsschritte verzichtet werden kann. Im Mittelpunkt dieser Verfahren stehen bakterielle Trägerzellen, die zum Screening nach prophylaktischen und therapeutischen Wirkstoffen eingesetzt werden können.

Die hergestellten gendefizienten Mikroorganismen werden dann auf ihre Wachstumsfähigkeit oder ihre Überlebensfähigkeit getestet. Geeignete Testsysteme sind z. B. In-vitro-Systeme, Zellkultursysteme, Gewebekultur­ systeme und Tiermodelle als natürliche Umgebung. Wird das Verfahren bei H.pylori angewandt, werden die Organismen einerseits auf einem sog. Vollmedium angezüchtet, wobei das Vollmedium die bestmöglichen Voraus­ setzungen für ein Wachstum für H.pylori ermöglicht. Gleichzeitig werden die defizienten H.pylori Organismen in einer Kultur gezüchtet, welche der natürlichen Umgebung von H.pylori möglichst genau entsprechen soll. Es werden hierzu einerseits Zellkulturen basierend auf Primärkulturen oder Zellinien aus gastrointestinalem Gewebe verwendet oder aber ausdifferen­ ziertes Primärgewebe (Sphäroide) in Kulturmedium. Weitere Möglichkeiten zur Simulation der natürlichen Umgebung von H.pylori bestehen in der Verwendung von stimulierten Makrophagen, denn H.pylori besitzt die Fähigkeit, von diesen nicht aufgenommen und metabolisiert zu werden. Außerdem kann auch überprüft werden, ob die defizienten H.pylori Organismen in der Lage sind, sich in immundefizienten Mäusen über einen bestimmten Zeitraum zu etablieren.

Ist ein defizientes H.pylori Bakterium zwar in der Lage, auf Vollmedium zu überleben, wächst aber nicht in einer natürlichen Umgebung, wie oben beschrieben, so wird das in diesem Organismus defiziente Gen als fakultativ essentielles Gen bezeichnet.

Wenn der defiziente H.pylori Organismus in keinem der beiden Testlebens­ räume überlebensfähig ist, so handelt es sich um ein obligat essentielles Gen.

Allgemein können Gene von Mikroorganismen einer dieser Kategorien zugeordnet werden.

Aus diesen Ergebnissen können dann die in mutierten oder/durch asRNA unterdrückten Sequenzen identifiziert und jeweils einer dieser beiden Kategorien zugeordnet werden, oder aber der Kategorie der nichtessentiellen Gene, wenn der gendefiziente Organismus keine Beeinträchtigungen in seiner Wachstumsfähigkeit zeigt.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genetisches Verfahren zur Isolierung und Klonierung der identifizierten essentiellen Gene aus verschiedenen klinischen Helicobacter Isolaten bzw. aus heterologen pathogenen Keimen von klinischer Bedeutung bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt daher weiterhin die Schritte

• a) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen
• b) Identifizieren der homologen Gensequenzen.

Eine bevorzugte Durchführung dieser weiteren Verfahrensschritte besteht darin, sogenannte Megaprimer von den identifizierten essentiellen Helicobacter-Genen mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) herzustellen, deren Sequenz direkt aus den entsprechenden Plasmiden der mutagenisierten DNA-Abschnitte abgeleitet werden kann. Diese Primer können dann verwendet werden, um die bereits identifizierten essentiellen Gene aus verschiedenen Helicobacter-Isolaten zu isolieren. Falls diese essentiellen Gene Entsprechungen in anderen Mikroorgansimen haben, können die Primer unter Umständen auch zur Isolierung dieser Gene aus von Helicobacter verschiedenen Mikroorgansimen verwendet werden. Weiterhin kann dann die genaue DNA-Sequenz der isolierten Gene und die Feststellung der Genvarianz innerhalb der verschiedenen Helicobacter-Isolate bzw. zwischen den verschiedenen Mikroorganismen bestimmt werden.

Bei der Herstellung der Megaprimer entstehen DNA-Fragmente mit variablen 3'-Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es möglich, die DNA-Fragmente zur Isolierung variabler, bzw. verwandter Gene mittels des beschriebenen PCR-Verfahrens einzusetzen.

Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen

Zur Identifizierung neuer immunologischer Wirkstoffe aus dem Pool der identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe werden bakterielle Träger insofern sehr wirksam eingesetzt, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff-Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger. Als Träger werden bevorzugt attenuierte Bakterien, wie z. B. Salmonellen, verwendet, da diese über ein natürliches Potential zur Immunstimulanz verfügen. Werden diese attenuierten Bakterien als Träger bzw. Produzenten für die identifizierten essentiellen Gene der pathogenen Keime verwendet und wird mit diesen Impfstämmen eine Immunisierung an einem Säugetier durchgeführt, so kann eine nachhaltige Immunantwort ausgelöst werden.

Mittlerweile sind die immunologischen Eigenschaften dieser bakteriellen Trägersysteme so weit verfeinert worden, daß eine gezielte Immunantwort ausgelöst werden kann (VanCott et al., 1998; Carrier-Patent EP 981 16 827.1). Diese Eigenschaft ist insofern bedeutsam, da die verschiedenen Krankheitserreger oftmals nur über einen bestimmten Zweig des Immunsystems wirksam bekämpft werden können. D. h. schutzvermittelnde Antigene lassen sich nur dann identifizieren, wenn sie dem Immunsystem in der richtigen Form präsentiert werden. Nur wenn der verwendete Träger mit einem wirksamen Antigen beladen wurde, kann es zu einer Schutzwirkung kommen. Aufgrund der vielfältigen immunologischen Eigenschaften bakterieller Trägersysteme und deren Überlegenheit gegenüber herkömmlichen synthetischen Adjuvantien sind diese zur Identifizierung immunologisch relevanter Antigene besonders geeignet.

Darüber hinaus können die bakteriellen Trägersysteme mit effizienten Genexpressionssystemen ausgestattet werden, welche die Herstellung auch problematischer Antigene erlauben (PCT/EP91/02478, EP 981 16 827.1). Aufgrund der direkten Subklonierung der isolierten essentiellen Gene und der einfachen Handhabung der bakteriellen Träger bei der Herstellung und Vakzinierung, können in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Antigenen hinsichtlich ihres immunogenen und protektiven Potentials durchgetestet werden. In herkömmlichen Verfahren müssen die Test-Antigene dagegen zeitaufwendigen Aufreinigungsverfahren unterworfen werden, wobei oftmals schon bei der gentechnischen Herstellung der ausgewählten Antigene in Bakterien Schwierigkeiten auftreten, die mit der toxischen Wirkung dieser Antigene auf den produzierenden Bakterienstamm verknüpft sind.

Eine wichtige Voraussetzung für das Entwickeln von Wirkstoffen besteht darin, das immunogene Potential der identifizierten Sequenzen festzustellen, um zu bestimmen, inwiefern die entsprechenden Genprodukte für die Herstellung von Antikörpern oder Impfstoffen geeignet sind.

Zur Identifizierung immunologischer Wirkstoffe gegen klinisch relevante Helicobacter-Organismen muß zunächst ermittelt werden, in wie weit das Genprodukt des identifizierten essentiellen Gens immunogene Eigenschaften besitzt. D. h. es muß experimentell ermittelt werden, ob mit dem Antigen eine humorale und zelluläre Immunantwort in einem Sägetier ausgelöst werden kann, die gegen das originale Genprodukt des Erregers gerichtet ist. Damit werden auf keinen Fall solche Antigene ausgeschlossen, die im Rahmen einer natürlichen Infektion vom Immunsystem nicht erkannt werden. Im Gegenteil, vielmehr könnte man erwarten, daß z. B. bei chronisch infizierten Menschen die Immunantwort gegen schutzvermittelnde Antigene unterdrückt ist oder von einer Qualität ist, die letztendlich keine Schutzwirkung vermittelt. Auszuschließen sind jedoch solche Antigene, die einer hohen genetischen Variation unterliegen und somit einer wirksamen Immunantwort kaum zugänglich sind.

Zum Nachweis der Identität des identifizierten Genprodukts bei einer natürlich vorkommenden Infektion, wird Antiserum von Patienten gewonnen, die entweder unter einer aktiven Gastritis mit Beschwerden leiden, oder aus Patienten, bei denen die Helicobacter-Infektion symptomlos verläuft. Mit diesen Seren wird das elektrophoretisch aufgetrennte rekombinante Protein in einem klassischen Western Blot Verfahren getestet. Findet eine Erkennungsreaktion mit einem rekombinanten Protein jeweils mit beiden Seren, also dem eines Patienten mit einer fulminanten und dem eines Patienten mit einer symptomlosen Helicobacter Infektion, statt, so spielt dieses Protein bei einer natürlichen Infektion eine Rolle. Wird das rekombinante Polypeptid dagegen nur von dem Serum des Patienten mit einer symptomlosen Infektion erkannt, kann das zusätzlich ein Hinweis auf ein protektives Potential des entsprechenden Proteins sein. Weiterhin können Antikörper, die gegen dieses Protein spezifisch gerichtet sind, möglicherweise zur passiven Immunisierung eingesetzt werden.

Von besonderem Interesse sind außerdem Antikörper von Individuen, die nachweislich keine Helicobacter-Träger sind, da diese auf ein protektives Potential eines entsprechenden rekombinanten Polypeptids schließen lassen.

Desweiteren werden die immunogenen Polypeptide zusammen mit geeigneten Zusatzstoffen zur Immunisierung in vivo eingesetzt. Verwendet werden dazu verschiedene Adjuvantien, bakterielle Toxine, Zytokine oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Lebendvakzin. Die Immunantwort wird daraufhin getestet, ob sie nach einer erfolgten Verabreichung eines bestimmten Polypeptids der Erfindung in Kombination mit entsprechenden Zusatzstoffen nach Infektion mit dem homologen Keim eine schützende Wirkung gegen weitere homologe Infektionen herbeiführt (z. B. Infektionen mit verschiedenen H.pylori Stämmen).

Noch eine weitere Möglichkeit zum Testen der Immunogenität besteht darin, im Tiermodell (z. B. Maus, Kaninchen) eine Immunantwort gegen Helicobacter oder andere Mikroorganismen auszulösen und aus den immunisierten Tieren Antikörper zu gewinnen, die dann in einer weiteren Western-Blot-Analyse verwendet werden können. Gleichzeitig müssen Patientenbiopsien in situ immunologisch mit den gleichen Antikörpern untersucht werden, da Helicobacter und andere Mikroorganismen in Kultur bestimmte Proteine verlieren oder hinzugewinnen können.

Parallel dazu ist es bevorzugt zu untersuchen, ob gegen eine Infektion mit heterologen Keimen (bevorzugt andere gram-negative Bakterien), welche das entsprechende Polypeptid exprimieren, eine schützende Wirkung erzielt werden kann.

Nachdem festgestellt wurde, ob die identifizierten Gene bzw. deren Expressionsprodukte in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen, kann gemäß dem Verfahren der Erfindung weiterhin untersucht werden, ob auch eine bereits bestehende Infektion mit derartigen Antigenen behandelt werden kann. Kann auf diese Weise ein Polypeptid identifiziert werden, das eine therapeutische Wirkung zeigt, wird es bevorzugt auch auf seine Aktivität bei Infektionen mit heterologen Keimen untersucht.

Das Screening nach prophylaktisch bzw. therapeutisch wirksamen, immunologischen Stoffen kann nach folgendem Schema verlaufen, wobei die Einhaltung der einzelnen Schritte nicht zwingend ist:

• 1. Klonierung des identifizierten Gens in einen geeigneten bakteriellen Trägerstamm und Nachweis sowie Quantifizierung des vollständigen Genprodukts durch SDS-PAGE.
• 2. Immunologische Charakterisierung des erzeugten Genprodukts mit Hilfe von (a) Seren infizierter oder/und natürlich geschützter Wirte, die das Genprodukt im Trägerstamm erkennen sollte; (b) Hyperimmunseren von Tieren, die mit dem rekombinanten Trägerstamm immunisiert wurden. Wobei das jeweilige Hyperimmunserum das originale Genprodukt im pathogenen Keim erkennen sollte. Hierbei kann es möglich sein, daß das originale Antigen nur in einem bestimmten Entwicklungszeitraum vom Pathogen produziert wird.
• 3. Die protektive Wirkung der individuellen Antigene in der prophylaktischen oder/und therapeutischen Anwendungsform wird im Tiermodell untersucht.

Alle protektiven Antigene, die mit den beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, können nunmehr in einem zweiten Schritt weiterentwickelt werden. Im Vordergrund dieser Weiterentwicklung steht u. a. die Evaluierung der genetischen Konstanz der identifizierten protektiven Antigene innerhalb des Pathogens bzw. verwandter pathogener Keime in seiner weltweiten Verbreitung. Weiterhin wird zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe, auf die genetischen Unterschiede im Immunsystem der Impflinge eingegangen. Ziel beider Verfahren ist die Identifizierung von Antigenen oder Epitopen, die möglichst breit angewendet werden können. Zur Erfassung der Genvariabilität innerhalb einer Spezies bzw. homologer Keime kann der sogenannte Mega-Primer-Ansatz eingesetzt werden. Aus dem Plasmid mit dem relevanten Gen werden direkt genspezifische Primer mit variablen 3'- Enden über PCR hergestellt, welche die Amplifikation homologer Gene ermöglichen. Anhand der ermittelten DNA-Sequenz der amplifizierten Gene kann deren Variabilität abgeleitet und z. B. genkonstante Bereiche bestimmt werden.

Die genetischen Unterschiede zwischen einzelnen Impflingen, auf ein definiertes Antigen zu reagieren, kann mit Hilfe einer In Vitro-Vakzinierung evaluiert werden. Aus unterschiedlichen Spendern werden hierzu antigenpräsentierende Zellen (APC) isoliert, z. B. dentritische Vorläuferzellen, welche in vitro expandiert und mit den zu testenden Antigenen beschickt werden, wobei die Antigene bevorzugt über entsprechende Vektoren exprimiert werden. Die identifizierten Gene können auch einzeln oder in definierten Kombinationen in dendritischen Zellen (DC) von nicht infizierten Spendern exprimiert werden. Dabei werden die Genprodukte von der Wirtszelle prozessiert und durch den MHC-Komplex präsentiert. DC sind besonders für die Antigenpräsentation gegenüber naiven oder "schlummernden" T-Zellen geeignet. Werden DC mit T-Zellen autologer Spender inkubiert, ist es möglich zu bestimmen, ob dieser Spender gegen das eingesetzte Antigen reagieren würde, wenn er auf natürliche Weise damit in Kontakt käme, z. B. im Rahmen einer Schutzimpfung. Anhand der Immunantwort der T-Zellen kann auf eine mögliche Immunogenität des entsprechenden Antigens geschlossen werden. Eine solche Immunantwort besteht beispielsweise aus einer Proliferation der T-Zellen, bzw. einer Zytokin-Ausschüttung insbesondere von IL-2 und IL-4. Die Zytokine können beispielsweise mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Assaykits (z. B. von Genzyme Cambridge M. A.) ausgewertet werden.

Schließlich können die in der beschriebenen Weise identifizierten und charakterisierten Antigene bzw. Epitope zur Entwicklung der ersten Impfstoff-Prototypen eingesetzt werden. Hierbei wird zwischen zwei Impfstofftypen unterschieden, der aktiven und der passiven Impfung.

Zur passiven Immunisierung, werden dem Impfling Antikörper oder Antikörperfragmente mit schützender bzw. inhibierender Wirkung von außen zugeführt.

Antikörper werden in Form von polyklonalen, bevorzugt monoklonalen Antikörpern (MAKs) oder rekombinanten Antikörpern bereitgestellt. Hierzu gehören Antikörper, die spezifisch mit Polypeptiden der Erfindung oder deren Untereinheiten und Fragmenten reagieren und für eine prophylaktische und/oder therapeutische Anwendung, z. B. einer passiven Immunisierung, verwendet werde können. Diese Anti-Protein- oder Anti-Peptid-Antiseren bzw. monoklonalen Antikörper können mit Hilfe von Standardprotokollen z. B. durch die Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten oder Ziegen mit einem gereinigten Polypeptid der Erfindung, einen Fusionsprotein oder einem Subfragment dessen hergestellt werden. Darüber hinaus können die Tiere auch mit bakteriellen Vakzineträgern immunisiert werden, die mit entsprechenden Genen der Erfindung ausgestattet sind und die kodierten Polypeptide exprimieren. Die Antikörper sind dabei bevorzugt immunspezifisch gegen antigene Determinanten oder Epitope hierzu der beschriebenen Helicobacter-Polypeptide oder einem eng verwandten Polypeptid, das eine Homologie von mindestens 90% besitzt, gerichtet. Sie sind nicht kreuzreaktiv mit Polypeptiden, die z. B. eine Homologie von weniger als 80% aufweisen.

Ausgehend von einer Zellinie, die einen Polypeptid-spezifischen monoklonalen Antikörper produziert, kann aus dem kodierenden Gen eines solchen Antikörpers, chimäre Gene geschaffen werden, die Antikörper determinieren, bestehend aus einer Antigen bindenden Domäne aus der Maus und dem Fc-Teil eines Antikörpers des Menschen. Diese Antikörper können in Zellinien oder transgenen Tieren produziert werden.

Anstelle von Antikörpern, die im Tier generiert wurden, können auch Antikörper-Fragmente, Miniantikörper, verwendet werden, die z. B. in einem heterologen System wie Bakterien hergestellt werden. Diese Miniantikörper können entweder monovalent oder bivalent sein und bestehen aus dimerisierten Einzelketten-Molekülen (Kujau et al., 1998; Kalinke et al., 1996; Pack et al., 1993).

Antikörper gegen die immunogenen Polypeptide der Erfindung können auch in Pflanzen generiert werden. Beispiele hierzu sind z. B. von Hiatt und Ma (1993), van Engelen et al. (1994) und Ma et al. (1994) beschrieben worden. Entsprechend der jeweilig verwendeten Pflanze können diese z. B. direkt zum Verzehr und damit als orales Vakzin verwendet werden.

Eine weitere, sehr breit anwendbare Weise, Antikörper herzustellen, ist in Milch und Eiern immunisierter Tiere. Verabreicht man z. B. trächtigen Kühen, Schafen oder Pferden geeignete Antigene, so finden sich in der Milch Immunoglobuline, die zur Entwicklung eines Vakzins verwendbar sind. Die Milch kann dann entweder direkt als Vakzin verabreicht werden, oder ein konzentriertes Immunglobulin-Extrakt hergestellt werden. Auf die gleiche Weise können auch Antikörper (Hyperimmunantikörper) in Hühnereiern produziert werden (Ling et al., 1998; Sasse et al., 1998). Die beschriebenen immunogenen Polypeptide der Erfindung können daher auch zur Entwicklung eines Milchprodukts oder Hühnereiern verwendet werden, die als orales Vakzin verwendet werden können.

Erfindungsgemäß werden die generierten Antikörper oder deren Fragmente auf ihre Anwendbarkeit getestet. Sie können dazu durch bekannte Verfahren aufgereinigt werden (Präzipitation, chromatographische Verfahren) und bei­ spielsweise darauf untersucht werden, ob sie den Infektionsvorgang von H.pylori inhibieren können (Adhäsionsassays) oder aktivierend auf Komple­ ment oder ADCC ("antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", anti­ körperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität) wirken.

Zur passiven Immunisierung werden die Antikörper, die mit Hilfe der Polypeptide der Erfindung generiert wurden, entweder oral oder intra­ gastrisch verabreicht. Hierfür werden die Antikörper mit einem Bicarbonat- Puffer gemischt. Sie können aber auch systemisch verabreicht werden, wobei sie nicht gepuffert werden müssen.

Antikörper werden bevorzugt allein oder auch in Kombination mit anderen nicht-immunologischen Wirkstoffen verwendet, z. B. mit Antibiotika oder Protonenblockern.

Aktive Vakzinierung beruht auf einer Immunreaktion, die vom geimpften Organismus selbst ausgelöst wird. Bevorzugt sind Darreichungsformen von Impfstoffen als Antigene, Antigenfragmente, Subunit-Vakzin, als DNA- Vakzin, als Lebend-Vakzin oder als Lebensmittel-Vakzin.

Antigene sind diejenigen Polypeptide oder deren Fragmente, die in vivo eine Immunreaktion hervorrufen können.

Wenn ein Polypeptid als Subunit-Vakzin bereitgestellt werden soll, wird es zunächst in seine Untereinheiten bzw. Strukturdomänen gemäß seines Antigenitätsmusters zerlegt (z. B. T- und B-Zell-Epitope). Dieses Antigenitätsmuster kann mit Hilfe eines Computerprogramms erstellt werden, wobei immunogene Regionen, die aus einer kurzen Polypeptid­ sequenz von ca. 8 bis 10 Aminosäuren bestehen, erkannt werden können (Hughes et al., 1992). Die einzelnen Polypeptidstücke können dann anschließend auf ihre Immunogenität in der Maus oder in Primaten bzw. den Menschen getestet werden. Sie können dazu entweder als gereinigte Polypeptide, die synthetisch hergestellt wurden, in Kombination mit entsprechenden Zusatzstoffen wie einem Adjuvans, Toxin oder Cytokin verabreicht werden, oder als Fusionsprotein an ein bekannt immunogenes Protein bzw. Proteinuntereinheit wie z. B. die Cholera Toxin B Untereinheit (Liljeqvist et al., 1997) gekoppelt. Weiterhin können die immunogenen Peptide in äußere Membranproteine wie z. B. dem OmpS Maltoporin von E.coli eingebaut und heterolog in einem Vakzin-Trägerstamm exprimiert werden (Lang und Korhonen, 1997).

Zur Entwicklung eines DNA-Vakzins können die in der Erfindung charakterisierten Polynukleinsäure-Moleküle "nackt" in Fusion mit einem eukaryontischen gewebespezifischen Promoter oder in Form eines Plasmids verabreicht werden. Die "nackte" DNA oder das entsprechende Plasmid wird in Kombination mit einem Zusatzstoff wie einem Reagenz, das die zelluläre Permeabilität verändert wie z. B. Bupivacain (WO94/16737), kationischen Lipiden wie z. B. DOTMA [N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethyl-ammoniumchlorid, DOTAP (1,2-bis(oleyloxy)-3-trimethyl- ammoniolpropanl, DDAB (dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid), DOGS (dioctadecyl-amidolglycyl-spermidin) bzw. Cholesterinolderivaten, Silica, Gold oder Wolfram (Tang et al. 1992) bzw. in Liposomen (WO93/18759, WO93/19768, WO94/25608, WO95/2397) oder Mikropartikeln verpackt, verabreicht. Beispiele für brauchbare Promoteren und Genfähren sind von Hartikka et al. (1996) beschrieben worden. Zur Applikation der Polynukleotid-Moleküle können jedoch auch z. B. attenuierte Salmonellen verwendet werden. Die Bakterien werden hierfür mit eukaryontischen Expressionsvektoren, die ein Polynukleotid-Molekül der Erfindung beinhalten, transformiert und dann oral verabreicht. Die Plasmid-DNA wird anschließend vom Bakterium auf den Wirt übertragen (Darji et al., 1997). Zur Transformation attenuierter Trägerbakterien können jedoch auch filamentöse Phagen verwendet werden. Der Vorteil dieser liegt darin, daß sie eine extrem hohe Anzahl von Plasmiden übertragen können.

Für die Entwicklung eines Lebendvakzins stehen unter anderem virale, wie z. B. adenovirale oder Windpocken-Virus-Vektoren, bzw. bakterielle Vektoren wie etwa Salmonella, Shigella oder Lactobacillus zur Verfügung. Attenuierte, nichtvirulente Salmonella typhimurium-Stämme, die zur rekombinanten Expression heterologer Antigene benutzt werden können und oral verabreicht werden, wurden vielfach charakterisiert (Mekalanos, 1994, WO92/11361, Cirillo et al., 1995 und Dorner (1995). Weitere bakterielle Vektoren, die als Vakzinvektoren verwendet werden können, sind von Cirillo et al., (1995) und Dorner (1995) beschrieben worden. Ein Polynukleotid- Molekül der Erfindung, das für ein therapeutisch oder prophylaktisch wirksames Polypeptid kodiert, wird hierzu entweder in das bakterielle Genom stabil integriert und einem Transportsystem unterworfen, das die Darbietung an der bakteriellen Oberfläche ermöglicht (PCT/EP94/04286; WO97/35022). Das entsprechende Polynukleotid-Molekül kann im Bakterium aber auch als Plasmid in freiem Zustand vorliegen.

Impfstoffe werden in der Regel mit geeigneten Zusatzstoffen wie z. B. Adjuvantien, bakteriellen Toxinen, Zytokinen etc. verabreicht, die das immunogene Polypeptid in seiner protektiven oder therapeutischen Wirkung unterstützen. Adjuvantien mit geringen Nebenwirkungen zur Verwendung im Menschen, die für Subunit-Vakzine und Lebend-Vakzine, aber zum Teil auch für DNA-Vakzine in Frage kommen, sind z. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D- isoglutamin, N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetyl­ muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3- hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin, Liposomen, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalosedimicoloat, Pilz-Polysaccharide wie z. B. Schizophyllan, Muramyl- Dipeptid, Muramyl-Dipeptid-Derivate, sowie Phorbolester, Saponine und immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) (Gupta und Siber, 1995). Als bakterielles Toxin kann z. B. Cholera Toxin bzw. dessen Untereinheiten oder das hitzelabile Toxin aus E.coli verwendet werden. Obwohl diese hochpotent als Adjuvantien aktiv sind, können sie aufgrund ihrer Toxizität nur begrenzt auf den Menschen angewendet werden. Mit Hilfe bestimmter Mutagenesetechniken können jedoch Moleküle entwickelt werden, die aktiv, aber ungiftig sind (O'Hagan, 1998).

Eine weitere Möglichkeit, die Immunantwort auf die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksamen Substanzen der Erfindung zu optimieren, ist, das entsprechende Polypeptid als Fusionsprotein mit einer immunogenen Proteindomäne zu exprimieren. Eine Möglichkeit besteht z. B. darin, die Pilin DSL-Domäne aus Pseudomonas aeruginosa als Fusionspartner zu verwenden. Weiterhin beschrieben sind Fusionsproteine, die an Glutathion S-Transferase oder Thioredoxin fusioniert wurden (Hill et al., 1997; Gabelsberger et al., 1997). Das entsprechende Fusionsprotein kann jeweils als Subunit- oder Lebendvakzin hergestellt und verabreicht werden.

Die Immunantwort der identifizierten immunologisch wirksamen Substanzen kann auch insofern moduliert werden, indem diese in Kombination mit bestimmten Zytokinen verabreicht werden. Zur simultanen Verabreichung bietet sich eine Co-Expression der Polynukleotid-Sequenzen der Erfindung mit einem bestimmten Cytokin in Salmonella oder einem anderen Wirtsbakterium an. Das entsprechende Cytokin kann hierzu entweder auf einem separaten Plasmid, in Reihe oder als Fusionsprotein mit der gewünschten Polynukleotid-Sequenz der Erfindung kodiert sein und dann in das Wirtsbakterium transformiert werden. In Frage kommen Cytokine, die wie z. B. Interleukin-6(IL-6), Interleukin-10(IL-10) oder Interleukin-12(IL-12) das Immunsystem stimulieren.

Zur weiteren Optimierung können einzelne immunogen wirksame Substanzen der Erfindung miteinander oder in Kombination mit bekannten immunogenen Substanzen wie z. B. VacA bzw. dessen einzelne Untereinheiten kombiniert werden. Das entsprechende Polypeptid kann also gemeinsam mit mindestens einem weiteren Helicobacter Antigen, wie z. B. der nativen Urase oder deren Untereinheiten, Fragmenten Homologen, Mutanten oder Derivaten derselben exprimiert werden. Außerdem können z. B. verschiedene Subunit-Vakzine einzeln oder als Fusionsprotein wie weiter oben beschrieben gemeinsam verabreicht werden. Hierfür können wiederum z. B. gereinigte Polypeptid-Moleküle in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans, bakteriellen Toxin oder Cytokin verwendet werden. Weiterhin können diverse Kombinationen von Nukleotid-Sequenzen immunogener Untereinheiten der beschriebenen Polypeptid-Moleküle auf einem gemeinsamen Plasmid hergestellt und als Lebendvakzin verabreicht werden. Ein Vakzinvektor der Erfindung kann also ein oder mehrere Polypeptide der Erfindung, Derivate bzw. Fragmente dergleichen enthalten. Außerdem besteht die Möglichkeit der Kombination eines DNA-Vakzins mit ein oder mehreren gereinigten Subunit-Vakzinen in einer geeigneten Trägersubstanz, wie bereits weiter oben beschrieben wurde.

Zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe aus dem Pool der identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe können ebenfalls bakterielle Träger sehr wirksam eingesetzt werden, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff- Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger.

Display-Systeme dienen dazu, ein exprimiertes Polypeptid der Erfindung an der Zelloberfläche von Bakterien zu präsentieren. Den Transport von Polypeptiden durch die innere Membran ermöglicht ein Signalpeptid am Aminoende, während andere Anteile die Einlagerung und Verankerung in der äußeren Membran übernehmen. Als Trägeranteile sind verschiedene äußere Membranproteine von E.coli beschrieben worden wie z. B. PhoE (Agterberg et al., (1990) oder OmpA (Francisco et al., 1992). Es können jedoch auch Fusionen mit der Transportdomäne des IgA-Proteasevorläufers IgAß verwendet werden (Klauser et al., 1990). Beispiele für Display-Systeme sind z. B. das DsbA-System (PCT/EP 94/02486) oder das Autotransporter-System (AIDA; WO97/35022). Die an der Oberfläche präsentierten Polypeptide können dann für Bindungsstudien mit Peptid- oder kombinatorischen chemischen Substanzenbanken verwendet werden. Die Bindungsstudien können mit Hilfe eines "High Through Put" Systems, das hohe Testraten ermöglicht, in Flüssigkeit oder aber gebundener Form durchgeführt werden. Hierfür werden die präsentierten Polypeptide z. B. an ein Chromatophor gekoppelt, das in Kombination mit einem weiteren Chromatophor, das an das Wirkstoff-Peptid oder die chemische Substanz gekoppelt ist, eine Farbreaktion ermöglicht. Die entsprechende Wirkstoffkomponente kann jedoch auch z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert oder an eine feste Trägermatrix gekoppelt sein. Bei Verwendung eines "Solid Phase Systems" wird vorher entweder das verwendete Polypeptid der Erfindung oder aber umgekehrt die Peptid- bzw. kombinatorische Wirkstoffbank an die Trägermatrix gekoppelt. Die jeweilige farbstoffmarkierte Komponente bindet dann an die immobilisierte Komponente, wodurch wieder eine Farbreaktion ermöglicht wird. Nach der Bindungsreaktion müssen dann mehrere Waschvorgänge vollzogen werden, bevor die entsprechende Substanz isoliert wird. Vorteil des "Solid Phase Systems" gegenüber der Bindung in Flüssigkeit ist, daß die wirksame Substanz schneller isoliert werden kann, da die ungebundenen Substanzen weggewaschen sind.

Weitere Verfahren zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe basieren auf den Kenntnisse aus der Primärstruktur der identifizierten essentiellen Gene bzw. benutzen die aufgereinigten gentechnisch hergestellten Genprodukte.

Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, spezifische Bindepartner der von den identifizierten Genen kodierten Polypeptide zu finden.

Es können bevorzugt Homologiestudien mit Helicobacter und anderen Organismen durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von Computer-Alignments, Southern Blots, PCR und dgl. und anschließender Zuordnung der Sequenzen. Aufgrund von Homologien kann dann auf potentielle Bindepartner der Proteine geschlossen werden.

Ebenfalls bevorzugt können auch kombinatorische Bindungsstudien über Target-gerichtetes-Screening-Verfahren mit Hilfe von Substanzen- Bibliotheken durchgeführt werden. Die potentiellen bindenden Substanzen werden in einer speziellen Anordnung gebunden vorgelegt, z. B. in Mikrotiterplatten oder anderen Trägermaterialien. Anschließend wird das "Target", in der Regel aufgereinigte, gegebenenfalls rekombinante Helicobacter-Proteine, in löslicher Form hinzugegeben, was den Nachweis einer Wechselwirkung zwischen dem Target und bestimmten Substanzen ermöglicht. Ein indirekter Nachweis kann durch markierte Antikörper, die gegen die Substanz gerichtet sind, oder durch Einführen zusätzlicher Elemente ("Tags") in das Target erbracht werden.

Eine weitere Variante der Bindungsstudien besteht in der Expression von Helicobacter-Proteinen in rekombinanten Bakterien (z. B. solche, die das fluoreszierende Protein GFP oder bestimmte Enzyme herstellen), welche die Proteine auf der Oberfläche präsentieren, und anschließendes Testen einer Substanzen-Bibliothek.

Weiterhin kann die dreidimensionale Struktur der von den erfindungsgemäßen identifizierten Genen kodierten Polypeptide oder deren 29027 00070 552 001000280000000200012000285912891600040 0002019924965 00004 28908 Fragmente auch durch kristallographische Analyse ermittelt werden. Bei ausreichender Auflösung können eventuelle "Taschen" oder sonstige Bindestellen in ihrer dreidimensionalen Struktur exakt charakterisiert werden. Aufgrund dieser Daten kann die Struktur potentieller Bindepartner berechnet werden.

Mit Verfahren, wie etwa "Two-hybrid System", Display-Systemen, "High Throughput Screening" oder kombinatorischen Bindungsstudien können zufällig generierte Polypeptide identifiziert werden, die an die Helicobacter Polypeptide der Erfindung oder deren Fragmente, oder an weitere erfindungsgemäß identifizierte Polypeptide binden. Wird auf diese Weise ein entsprechendes Peptid gefunden, kann dieses chemisch weiter modifiziert werden, bis die optimale mögliche Bindung erreicht ist. Das identifizierte Polypeptid kann z. B. als Inhibitor verwendet werden, indem es z. B. an ein Toxin und ein Internalisierungssignal gekoppelt wird, das den pathogenen Keim zerstört oder aber als Peptidmimetikum, um das Binden des Keims an die zelluläre Oberfläche zu verhindern (EP-412,762A und EP-B31,080A). Mit Hilfe des "Two Hybrid Systems" können aber auch Aktivatoren des Immunsystems generiert werden. Die identifizierten Peptide, die an die Helicobacter Polypeptide der Erfindung binden, können hierzu an bestimmte Liganden z. B. für den T-Zell-Rezeptor gekoppelt werden. Werden also einem von Pathogenen befallenen Tier oder Menschen diese so ausgestatteten Peptide verabreicht, wird das körpereigene Immunsystem spezifisch angelockt und aktiviert.

Die Einhaltung der einzelnen Schritte ist hierbei nicht zwingend, sondern kann durch weitere Schritte ergänzt bzw. ersetzt werden.

Die jeweiligen Prototypen eines immunologischen bzw. pharmakologischen Wirkstoffs werden nachfolgend weiterentwickelt und verbessert.

Die Weiterentwicklung eines Impfstoffes kann dahingehend erfolgen, indem mehrere antigene Genprodukte oder Teile davon in einem Wirkstoff kombiniert werden und/oder mit verschiedenen Trägern bzw. Zusatzstoffen verabreicht werden. Als Träger fungieren verschieden attenuierte bakterielle oder virale Organismen und als Zusatzstoffe Adjuvantien und/oder Cytokine.

Zur Weiterentwicklung eines pharmakologischen Wirkstoffs wird eine als wirksam charakterisierte Leadstruktur chemisch weiter modifiziert, so daß eine optimale Bindung und Inhibierung des identifizierten Genprodukts erfolgt. Weiterhin sollte der Wirkstoff vom Patienten gut vertragen werden und geringe Nebenwirkungen besitzen.

Zur Identifizierung von Wirkstoffen, die an Polynukleotide binden, kann ein Polynukleotid der Erfindung z. B. an eine Trägermatrix vorgekoppelt werden bzw. umgekehrt, die Wirkstoffe der Polypeptide- bzw. kombinatorischen Substanzenbank. Das verwendete darauffolgende Schema ist das gleiche wie das, das für die Polypeptide schon beschrieben wurde.

Solche inhibitorischen Substanzen können Polypeptide, Peptide, aber auch chemische Substanzen sein, wie etwa Antibiotika. Die inhibitorische Wirkung kann dabei in verschieden Stadien der Replikation der zu bekämpfenden Mikroorganismen eingreifen. Beispiele sind Expressionsinhibitoren oder Enzyminhibitoren oder sonstige Inhibitoren, welche die natürliche Funktion der Polypeptide von Helicobacter und verwandten Mikroorganismen beeinflussen können. Solche inhibitorischen Substanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Eine weitere Möglichkeit, einen optimalen Wirkstoff gegen Helicobacter und andere bakterielle Infektionen zu finden, ist mit Hilfe von speziellen Computerprogrammen. Aufgrund von kristallographischen Daten, die von den in der Erfindung beschriebenen Polypeptiden gewonnen wurden kann ein Modell erstellt werden, das sterische, elektronische, hydrophobe und sogenannten "resultierende Bindungsmomente" (RBMs) miteinander verbindet (Ray et al., 1998). Anhand dieses Modells können im weiteren Substanzen am Computer modelliert werden, die zwar die bereits identifizierten Leadstrukturen enthalten können, aber mit besseren Bindungseigenschaften ausgestattet sind. Es können jedoch auch völlig neuartige Wirkstoffe entworfen werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein essentielles sekretorisches Gen aus Helicobacter pylori kodiert, das durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wurde. Es wurden essentielle Helicobactergene mit dem vorliegenden Verfahren identifiziert, deren Nukleinsäuresequenzen in den SEQ ID NO. 1 bis 113 (ungerade Zahlen) angegeben sind. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure ist beispielsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie

• a) eine der in SEQ ID NO: n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 113 einschließlich ist, dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon,
• b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
• c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

Neben den im Sequenzprotokoll gezeigten erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-­ 1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bis 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder einer diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Nukleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleotidse­ quenz.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, wie etwa eine peptidische Nukleinsäure, umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Protein-kodierenden Abschnitt der in Sequenzprotokoll dargestellten Nukleotidsequenzen oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90% und besonders bevorzugt mehr als 95% zu den dargestellten Nukleotidse­ quenzen oder einen vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide (nt) und besonders bevorzugt mindestens 50 nt langen Abschnitt davon aufweist.

Die Homologie wird in Prozent identischer Positionen beim Vergleich zweier Nukleinsäuren (bzw. Peptidketten) angegeben, wobei 100% Homologie die völlige Identität der verglichenen Kettenmoleküle bedeutet (Herder: Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag 1995).

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann für ein sekretiertes Polypeptid mit Signalpeptid kodieren oder für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid.

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt sowohl die Sequenz des kodierenden Strangs als auch die dazu komplementäre Sequenz. Letztere kann beispielsweise bei der Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren Anwendung finden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist natürlich auch eine Genbank, die mindestens 2, bevorzugt mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 100 der genannten Nukleinsäuren in Vektoren kloniert enthält.

Eine Auflistung der hierin und im Sequenzprotokoll angegebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren samt ihrer Genprodukte und deren Funktionen und putativen Funktionen ist in den Tabellen I und II angegeben.

Tabelle I

Obligat essentielle Gene

Tabelle II

Fakultativ essentielle Gene

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen Abschnitt davon enthält. Die Nukleinsäure oder der Nukleinsäureabschnitt kann so in den Vektor kloniert sein, daß sie entweder in Sense- oder Antisense Richtung exprimiert werden kann. Der Nukleinsäureabschnitt hat bevorzugt eine Mindestlänge von 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt 20 Nukleotiden, stärker bevorzugt 50 Nukleotiden. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA- Sequenz vorzugsweise in Verbindung mit Expressionssignalen befindet, wie z. B. Promoter, Operator, Enhancer etc. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen (z. B. Bakteriophage λ) und extrachromosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Vektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al., Molecular Cloning (1987), Kapitel 1-4, beschrieben. Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor (z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor, Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kapitel 16 beschrieben. CAI- und SRM-Vektoren, wie oben beschrieben, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Zelle eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise ein gram-negatives Bakterium, z. B. E.coli. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle, eine Hefezelle, eine tierische oder eine pflanzliche Zelle. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Zelle um einen Mikroorganismus, z. B. Helicobacter oder Salmonellen. Mit CAI- oder SRM-Vektoren transformierte Mikroorganismen sind oben bereits beschrieben worden. Diese sind, wie auch mit den obigen Verfahren herstellbare Mutantenbanken, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein essentielles und bevorzugt sekretiertes Polypeptid von H.pylori. Insbesondere ist dies ein Polypeptid, das

• a) eine der in SEQ ID NO: m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 114 einschließlich ist, dargestellten Aminosäuresequenzen oder
• b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.

Unter immunologische kreuzreagierenden Sequenzen sind somit auch Muteine, Varianten und Fragmente der in den SEQ ID NO. 2 bis 114 dargestellten Sequenzen umfaßt. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von den obigen Sequenzen unterscheiden.

Aufgrund von Homologieanalysen mit Hilfe des FASTA Proteinprogramms konnten den identifizierten Polypeptiden, deren Sequenz mit der Nukleinsäuresequenz gefunden werden konnte, bestimmte Merkmale bzw. eine mutmaßliche Lokalisation im Bakterium zugewiesen werden. Einige der von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide besitzen ein Signalpeptid und werden durch den Sec-abhängigen Transport­ mechanismus an ihre Zielstelle exportiert, während andere kein Signalpeptid besitzen und daher wahrscheinlich über einen Sec-unabhängigen Transportmechanismus, z. B. durch das ABC-Transporter-System, sekretiert werden (siehe Tabellen I und II).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide und -fragmente. Die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man eine Zelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nichtfusionspolypeptid gewonnen werden.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch einen Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Fragmente solcher Antikörper, wie z. B. Fab-Fragmente oder Fc-Fragmente.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Inhibitor der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Fragmente, bzw. deren Expression, Präsentation oder/und natürlichen Funktion. Dies ist bevorzugt ein Molekül, welches in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment davon zu binden oder/und dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche Funktion zu beeinflussen. Die Identifizierung von solchen spezifischen Bindepartnern wurde oben bereits beschrieben. Besonders geeignet als Inhibitoren sind Proteine oder Peptide, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in seinen natürlichen Funktion hemmen, z. B. können Enzyme durch Blockieren des aktiven Zentrums gehemmt werden.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, einen erfindungsgemäßen Vektor, eine erfindungsgemäße Zelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragment davon oder/und ein inhibitorisches Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu binden, gegebenenfalls zusammen mit üb­ lichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln enthält.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf ver­ schiedene Art und Weise und unter Verwendung einzelner ihrer Bestandteile als wirksame Substanzen zur Hemmung der Reproduktion von Helicobacter Organismen in einem Wirt, speziell im Menschen verwendet werden.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits zur Diagnostik einer Helicobacter-Infektion verwendet werden. Die Diagnostik auf Nukleinsäureebene erfolgt vorzugsweise durch Verwendung von Hybridisierungssonden, bzw. Primern, welche eine spezifische DNA- Sequenz aufweisen, die zu mindestens einen Abschnitt einer der in SEQ ID NO. 1 bis 113 (ungerade Zahlen) dargestellten Sequenzen komplementär ist, so daß sie eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Sequenzen erlauben. Wir bereits erwähnt, können diese Amplifikationsprimer oder Sonden auch zur Amplifikation und damit zur Detektion von verwandten Mikroorganismen verwendet werden, wenn diese Gensequenzen aufweisen, die für dasselbe essentielle Gen kodieren. Auf Proteinebene erfolgt die Diagnostik vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.

Des weiteren ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und Bekämpfung von Helicobacter-Infektionen und Infektionen mit verwandten Mikroorganismen geeignet.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der identifizierten essentiellen Gene von Helicobacter pylori zur Prävention oder Bekämpfung einer Infektion mit Helicobacter oder verwandten Mikroorganismen. Insbesondere können diese identifizierten essentiellen Gene zur Herstellung von Impfstoffen (Vakzinen) verwendet werden (siehe oben).

Eine weitere Verwendung der Polypeptide der Erfindung besteht in der Aufreinigung der Antikörper gegen H.pylori Polypeptide und gegen entsprechende Polypeptide aus verwandten und anderen Mikroorganismen.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele, Abbildungen und das Sequenzprotokoll näher erläutert. Im Sequenzprotokoll sind die folgenden Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen dargestellt.

Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines CAI-Vektors.

Abb. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens der konditionalen Antisense-Hemmung (CAI).

Abb. 3 zeigt eine schematische Darstellung der Untersuchung der Lebendfähigkeit von defizienten Mikroorganismen anhand ihrer Überlebensraten mit Hilfe des CIA-Verfahrens.

Abb. 4 zeigt eine schematische Darstellung des subtraktiven CAI- Verfahrens (CAI).

Abb. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM-Vektors.

Abb. 6 zeigt eine schematische Darstellung der reversiblen Inaktivierung eines Gens durch die Insertion/Excision eines konditional replizierenden SRM-Plasmids.

Abb. 7 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM-Verfahrens.

Abb. 8 zeigt eine schematische Darstellung der Anreicherung von Fragmenten essentieller Gene durch subtraktive Hybridisierung.

Beispiele

Die Anwendung des dargestellten Gesamtverfahrens ist exemplarisch am Beispiel des Pathogens Helicobacter dargestellt, läßt jedoch auch mit anderen pathogenen Keimen durchführen.

1. Identifizierung essentieller Gene pathogener Mikroorganismen Schritt 1 Anreicherung von H.pylori Genen kodierend für sekretorische/exkretorische Polypeptide

Herstellung einer H.pylori Genbank im Minimalvektor pMin2: Als Ausgangsstamm dient der H.pylori Wildtyp Stamm 69A. Die Bakterien werden auf Serumplatten oder einem anderen adäquaten Medium (Westblom et al., 1991) bei einer Temperatur von 37°C in einer Atmosphäre von 5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂ angezüchtet. Die Isolierung der chromosomalen DNA erfolgt nach der Methode von Leying et al., (1992), wobei die DNA anschließend über einen Cäsium-Chlorid-Gradienten aufgereinigt wird. 50 µg der gereinigten, chromosomalen DNA wird mit den Restriktionsendonukleasen Sau3A und HpaII partiell gespalten, die DNA Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente in einer Größe von 3 bis 6 kbp aus dem Gel mit Hilfe des Geneclean II Kits (Bio101) eluiert. Die isolierten DNA-Fragmente werden in den BglII und ClaI geschnittenen pMin2-Vektor (Kahrs et al., 1995) kloniert und über Elektroporation in den E.coli-Stamm E181 transformiert, dem zuvor das Plasmid pTnMax9 übertragen wurde. Insgesamt werden über einen solchen Ansatz ca. 4000 Klone generiert. Der E.coli-Stamm E181 ist ein Derivat des Stammes HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und enthält den Iysogenen-Phagen CH616 zur Replikation des pTnMax9-Plasmids.

Serumplattenrezeptur

36 g GC-Agar (Basis) in 910 ml Aqua dest. suspendieren und autoklavieren

• - auf ca. 45°C abkühlen lassen
• - Zugabe von 10 ml Vitaminmix
• - Zugabe von jeweils 1 ml der Antibiotikastammlösung:
  • - Vancomycin (10 mg/l in Aqua bidest)
  • - Nystatin (0,793 mg/l in DMF*)
  • - Trimethoprim (5 mg/l, in DMF*)
  • - Amphotericin (5 mg/l in DMF*)
    *DMF = Dimethylformamid
• - Zugabe von 90 ml Serum oder
• - Zugabe von 8% Pferdeblut = 80 ml
• - oder gleiche Menge Humanblut

Antibiotika Stammlösung

Vancomycin: 100 mg in 10 ml Aqua bidest
Nystatin: 7,93 mg in 10 ml DMF (je 1 ml pro Liter GC-Agar zusetzen)
Trimethoprim: 50 mg in 10 ml DMF
Amphotericin: 50 mg in 10 ml DMF
(Lagerung im Kühlschrank bis max. 8 Wochen)

Vitaminmix (Konzentrat)

Dextrose (D-Glucose): 100 g
L-Glutamin: 10 g
Cystein HCl (C₃

H₇

NO₂

S × HCl × H₂

O): 26 g
Cocarboxylase: 100 mg in 50 ml
Fe (NO₃

)₃

: 20 mg Aquabidest. lösen
Thiamin HCl: 3 mg
DPN NAD: 250 mg
Vitamin B₁₂

: 10 mg
L-Cystein (C₆

H₁₂

N₂

O₄

S₂

): 1,1 g
Adenin: 1,0 g in 15 ml HCl
Guanin Cl: 30 mg (32%ig) lösen
Uracil: 500 mg
L-Arginin HCl: 150 mg
p-Aminobenzoesäure: 13 mg
(sterilfiltrieren, in 10 ml Portionen abfüllen und einfrieren)

Genetische Anreicherung sekretorischer/exkretorischer H.pylori Genprodukte: Das auf pTnMax9 liegende Transposon TnMax9 ist mit dem genetischen Marker β-Lactamase ausgestattet. Dieser Marker ist auf dem Transposon so angelegt, daß damit die Selektion erfolgreicher Transposon- Insertionen ermöglicht wird, wenn dieses im korrekten Leserahmen solcher Gene vorliegt, deren Produkte von E.coli-Stamm E145^rif sekretiert bzw. exportiert werden. Die Insertion des Transposons in ein solches Gen führt zu einer Genfusion zwischen dem Zielgen und dem Marker, wobei durch ein im Zielgen determiniertes Sekretions- und/oder Exportsignal das Fusionsprotein aus der Zelle geschleust wird und die Aktivität des integralen Reportergens entfaltet wird. Im Fall der β-Lactamase können die Klone direkt über die Entwicklung einer Resistenz gegen Ampicillin nachgewiesen werden. Das TnMax9 Transposon auf pTnMax9 wird über IPTG aktiviert.

Die Transposon-Mutagenese der Genbank wird in Pools von bis zu 20 Einzelklonen durchgeführt. Die jeweiligen Pools werden auf LB-Platten ausplattiert, die mit 100 µM IPTG, 15 µg/ml Chloramphenicol und 15 µg/ml Tetrazyklin versetzt sind. In einem zweiten Schritt werden die TnMax9 mutagenisierten pMin2-Plasmide über Konjugation in den E.coli Stamm E145^rif überführt, da diese mit einem entsprechenden mob-Signal (oriT) ausgestattet sind. Die pTnMax9-Plasmide werden dagegen nicht übertragen. Folglich kommt es in E.coli E145^rif zu einer spezifischen Vervielfältigung der mutagenisierten pMin2 Genbank. Die entsprechenden Transkonjuganten werden auf LB-Medium mit 15 µg/ml Chloramphenicol, 15 µg/ml Tetrazyklin und 100 µg/ml Rifampicin selektioniert. Insgesamt werden 500 bis 1000 Transkonjuganten in 2 ml LB-Medium zusammengefaßt und in entsprechenden Verdünnungen (10^-1 bis 10^-2) auf LB-Platten angezüchtet, die mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt sind. Nach einer Kultivierung der Platten über 36 Stunden bei 37°C erhält man im gesamten Ansatz 200 bis 300 Ampicillin-resistente Klone mit Transposon inserierten Plasmiden.

Schritt 2 Herstellung Gen-defizienter H.pylori, die in sekretorische/exkretorische Polypeptide kodierende Gene mutiert sind und die Identifizierung solcher Gene mit essentieller biologischer Funktion

Herstellung Gen-defizienter H.pylori Mutanten: Durch Einbringung der gewonnenen Plasmide mit den TnMax9-mutierten H.pylori Genen, kodierend für sekretierte/exkretierte Polypeptide in einen H.pylori Wildtyp Stamm können Gen-spezifische Mutanten erzeugt werden. Bedingt durch die klonierten H.pylori Gensequenzen auf den Plasmiden kommt es im Falle eines doppelten homologen Rekombinationsereignisses zu der genomischen Insertion des TnMax9-Transposons in das chromosomale Zielgen und damit zu dessen Inaktivierung. Durch den genetischen Marker auf dem Transposon kann dieser Vorgang selektioniert werden, da das pMin2 Plasmid in H.pylori nicht repliziert wird.

In der Durchführung wird der H.pylori Wildtyp Stamm 69A in Einzelansätzen mit den gewonnenen individuellen Plasmiden transformiert, wobei die natürliche Kompetenz des Bakteriums, DNA aufzunehmen, ausgenutzt wird. Entsprechend den Standard Kultivierungsbedingungen werden die Bakterien in BHI-Medium aufgenommen und bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm von 0,1 bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen angezüchtet. Die einzelnen Kulturansätze werden jeweils mit 200 bis 599 ng gereinigte Plasmid-DNA versetzt und die Kultur über Nacht fortgesetzt.

Charakterisierung der biologischen Funktion der Gen-defizienten H.pylori Mutanten im Wachstumstest: Die einzelnen Ansätze werden nach der Kultivierung auf Serumplatten ausplattiert, welche mit 4 µg/ml Chloramphenicol versetzt sind. Hinsichtlich der Wachstumseigenschaften der einzelnen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp Stamm können 3 Kategorien unterschieden werden: (1) Mutanten, die nicht wachsen; (2) Mutanten, die kleinere Kolonien ausbilden; (3) Mutanten, die eine normale Koloniegröße entwickeln. Diese Ergebnisse können für jedes Ausgangsplasmid reproduzierbar erzielt werden. Zur eindeutigen Beurteilung der biologischen Bedeutung der Gen-defizienten Mutanten der Kategorie 1 werden diese dem CAI-Verfahren zugeführt. Die Gen-defizienten Mutanten der Kategorie 2 und 3 werden in den anderen biologischen Testsystemen analysiert.

Schritt 3 Ermittlung der Identität der H.pylori Gene kodierend für sekretorische/exportierte Polypeptide

Zur Ermittlung der Primärstruktur der identifizierten H.pylori Gene, werden die jeweiligen Ausgangsplasmide aus dem E.coli Stamm verwendet. Die Plasmide werden aus diesen Stämmen isoliert und die Nukleotidsequenz der Zielgene durch Sequenzierung der Bereiche oberhalb und unterhalb der Insertionsstelle des Transposons im Zielgen bestimmt. Das Leseraster des Zielgens kann direkt ermittelt werden, da das Transposon-kodierte β- Laktamase Gen eine aktive Fusion mit dem Genprodukt des Zielgens eingeht (s. o.). Die Sequenzierung wird mit Hilfe eines ABI-Sequenz-Automaten nach Angaben des Herstellers mit folgenden Sequenzprimern durchgeführt: M13- F(GTAAAACGACGGGCAGT) und M13-RP1 (CAGGAAACAGCTATGACC). Zur weiteren Charakterisierung der Gene wird die Datenbank Genebank des GCG-Programms herangezogen, z. B. zur Identifizierung bekannter, homologer Gene anderer Mikroorganismen (FASTA), zur Identifizierung potentieller Signalpeptidbereiche (SPSCAN) oder zur Identifizierung von Lipoproteinen (MOTIFS).

Bei einem Teil der charakterisierten Klone konnte nicht die vollständige Gensequenz ermittelt werden, da das klonierte DNA-Fragment nicht das gesamte Gen enthielt. Das verfügbare DNA-Fragment wird dazu eingesetzt, um aus der Original-Genbank ein DNA-Fragment mit vollständigen Gen zu isolieren. Aus diesen Klonen können dann mit einem Gen-spezifischen Primer und einem Vektor-spezifischen Primer die fehlenden Gensequenzen amplifiziert und anschließend direkt sequenziert werden.

Literatur

Goodwin, C. S., Armstrong, J. A., Chilvers, T., Peters, M., Collins, M. D., Sly, L., McConnell, W., Harper, W. E. S. (1989) Transfer of Campylobacter pylori and Campylobacter mustelae to Helicobacter gen. nov. as Helicobacter pylori comb. nov. and Helicobacter mustelae comb. nov., respectively. Int J Syst Bact 39 : 397-405.
Lee, A., Fox, J., Hazell, S. (1993) Pathogenicity of Helicobacter pylori: a perspective. Infect Immun 61 : 1601-1610.
Malfertheiner P. (1994) Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Bayerdörfer E, Birkholz S., Börsch G. et al., (eds.) Stuttgart, New York: Georg Thieme Verlag; p. 1-104.
Marshall, B. J., Royce, H., Annear, D. I., Goodwin, C. S., Pearman, J. W., Warren, J. R., Armstrong, J. A. (1984) Original Isolation of Campylobacter pyloridis from human gastric mucosa. Microbios Lett 25: 83-88.
Nomura, A., Stemmermann, G. N., Chyou, P. H., Kato, I., Perez-Perez, G. I., Blaser, M. J. (1991) Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among japanese americans in Hawaii. N Engl J Med 325: 1132-136.
Parsonnet, J., Friedman, G. D., Vandersteen, D. P., Chang, Y., Vogelman, J. H., Orentreich, N., Sibley, R. K. (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: 1227-1131.
Pugsley, A. P. (1993) The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev 57: 50-108.
Solnick, J. V., Tompkins, L. S. (1993) Helicobacter pylori and gastroduodenal disease: pathogenesis and host-parasite interaction. Infect Ag Dis 1: 294-309.
Tadayyon, M., Broome-Smith, J. K. (1992) TnblaM - a transposon for directly tagging bacterial genes encoding cell envelope and secreted proteins. Gene 111: 21-26.
Warren, J. R., Marshall, B. (1983) Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet i: 1273-1275.

Claims (57)

1. Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis, zur Prävention oder/und zur Therapie von mikrobiellen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt:

• A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen in einem Testsystem.
• B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktivierung der Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.
• C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln,
• D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß obligat essentielle Gene durch CAI identifiziert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß fakultativ essentielle Gene durch SRM identifiziert werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor Schritt (A) eine Selektion auf Gene durchgeführt wird, die für Polypeptide mit einer bestimmten Funktionalität kodieren oder/und die für Polypeptide kodieren, die in einer bestimmten Entwicklungsstufe exprimiert werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion mit Hilfe von Hybridisierungsverfahren durchgeführt wird, ausgewählt aus Subtraktions- und Array-Verfahren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion auf spezifische subtrahierte apathogene oder pathogene Gene durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion auf spezifische subtrahierte Gene von H.pylori oder H.heilmannii durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß für exportierte Polypeptide kodierende Gensequenzen selektiert werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß für sekretierte Polypeptide kodierende Gensequenzen selektiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für Polypeptide kodierende Gene selektiert werden, welche zur Entwicklung der vitalen Form aus der Überdauerungsform notwendig sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für Polypeptide kodierende Gene selektiert werden, welche zur Entwicklung der Überdauerungsform aus der vitalen Form notwendig sind.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) zur Bestimmung der Lebens- und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen Testsysteme, ausgewählt aus In-vitro-Systemen, Zellkultursystemen, Gewebekultursystemen und Tiermodellen als natürliche Umgebung verwendet werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu nicht kultivierbaren und in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen gendefizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der obligat essentiellen Gene zugeordnet werden.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu kultivierbaren aber in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen defizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die identifizierten Gene zur Herstellung von Primern verwendet werden, mit Hilfe derer entsprechende Gene aus verwandten Mikroorganismen, Subspezies oder/und Arten identifiziert werden.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (B) spezifische Wirkstoffe identifiziert werden, welche die Expression, Präsentation oder/und Funktion der essentiellen Polypeptide beeinflussen, insbesondere immunologisch wirksame Substanzen, Bindepartner der Polypeptide oder deren Fragmente oder/und inhibitorische Substanzen.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (B) eine Bestimmung des immunogenen Potentials der Polypeptide oder/und deren Fragmente umfaßt, wobei die identifizierten Gene exprimiert werden und anschließend eine Western-Blot-Analyse durchgeführt wird oder/und daß mit den identifzierten Polypeptiden oder Fragmenten davon eine Vakzinierung in Zellkultur oder im Tiermodell durchgeführt und die Auslösung einer spezifischen Immunreaktion beobachtet wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (B) eine Bestimmung des Bindungspotentials der Polypeptide oder deren Fragmente durch Screening von Substanzenbibliotheken, Oberflächendisplayverfahren, kristallo­ graphische Analyse oder/und Computer-Modelling umfaßt.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mittel in Form von passiven Impfstoffen oder aktiven Impfstoffen bereitgestellt werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die passiven Impfstoffe in Form von Antikörpern oder/und Antikörperfragmenten und die aktiven Impfstoffe in Form von heterologen Trägersystemen oder/und in Form von Antigenen, Antigenfragmenten, Subunit-Vakzinen, Lebendvakzinen, DNA- Vakzinen oder/und Lebensmittelvakzinen bereitgestellt werden.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mittel inhibitorische Substanzen umfassen, insbesondere Expressionsinhibi­ toren oder/und Enzyminhibitoren.

22. Verfahren zur Identifizierung essentieller mikrobieller Gene, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt:

• a) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen,
• b) Bestimmen der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i),
• c) identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defizient sind.
• d) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiell für die Überlebensfähigkeit sind.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die gendefizienten Mikroorganismen hergestellt werden, indem ein DNA-Abschnitt in einem mikrobiellen Genom mutagenisiert wird.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der DNA-Abschnitt durch Transposon-Mutagenese mutagenisiert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutagenisierung des DNA-Abschnitts auf dem mikrobiellen Genom durch homologe Rekombination erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das SRM-Verfahren angewendet wird.

27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die gendefizienten Mikroorganismen hergestellt werden, indem in Mikroorganismen ein DNA-Abschnitt oder eine Teilsequenz davon in Form von Antisense-RNA exprimiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das CAI-Verfahren angewendet wird.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen Testsysteme ausgewählt aus In- vitro-Systemen, Zellkultursystemen, Gewebekultursystemen und Tiermodellen als natürliche Umgebung verwendet werden.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu nicht kultivierbaren und in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen gendefizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der obligat essentiellen Gene zugeordnet werden.

31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu kultivierbaren aber in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen defizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Identifizieren des proteinkodierenden DNA-Abschnitts durch Expression in einem Wirtsorganismus und Nachweis des Vorhandenseins eines Expressionsproduktes erfolgt.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin umfaßt:

• a) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen
• b) Identifizieren der homologen Gensequenzen.

34. Nukleinsäure, kodierend für ein essentielles sekretorisches Gen aus Helicobacter, identifiziert durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 33.

35. Nukleinsäure nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein sekretiertes Polypeptid mit Signalpeptid kodiert.

36. Nukleinsäure nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid kodiert.

37. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie

• a) eine der in SEQ ID NO: n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 113 einschließlich darstellt, dargestellten Nukleinsäuresequenzen, oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon,
• b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
• c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

38. Genbank, umfassend mindestens zwei Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 34 bis 37.

39. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 oder einen Abschnitt davon enthält.

40. Vektor nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß er ein CAI-Vektor ist.

41. Vektor nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß er ein SRM-Vektor ist.

42. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 39 bis 41 transformiert ist.

43. Mutantenbank, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens zwei Mikroorganismen besteht, die mit einem Vektor nach Anspruch 40 oder einem Vektor nach Anspruch 41 transformiert sind.

44. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 kodiert ist.

45. Polypeptid nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es

• a) eine der in SEQ ID NO: m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 114 einschließlich darstellt, dargestellten Aminosäuresequenzen oder
• b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.

46. Polypeptid nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß es ein essentielles sekretiertes Polypeptid ist.

47. Polypeptidfragment, dadurch gekennzeichnet, daß es einen immunogenen Abschnitt einer der Sequenzen nach Anspruch 45 aufweist.

48. Inhibitorisches Molekül, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47 zu binden oder/und dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche Funktion zu beeinflussen.

49. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Polypeptidfragments nach einem der Ansprüche 44 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 oder einem Vektor nach Anspruch 39 transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet und das Polypeptid aus der Zelle oder/und dem Kulturüberstand isoliert.

50. Verwendung eines Polypeptids oder eines Fragmentes davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47 davon als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern.

51. Antikörper oder Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch ist für ein Polypeptid oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47.

52. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff

• a) eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37,
• b) einen Vektor nach Anspruch 39,
• c) eine Zelle nach Anspruch 42,
• d) ein Polypeptid oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47,
• e) einen Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 51 und/oder
• f) ein inhibitorisches Molekül nach Anspruch 48, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln, enthält.

53. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 52 zur Diagnostik, Prävention oder/und Therapie einer Helicobacter-Infektion.

54. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 52 zur Hemmung der Reproduktion von Helicobacter- Organismen und/oder anderen anthrogenen Mikroorganismen in einem Wirt.

55. Verwendung nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 als DNA- Vakzin formuliert wird.

56. Verwendung nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid oder Polypeptidfragment nach einem der Ansprüche 44 bis 47 als Subunit-Vakzin oder als Lebendvakzin formuliert wird.

57. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 52 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnostik, Prävention oder/und Therapie einer Helicobacter-Infektion.