EP1257672A2 - Procede de detection et de quantification d'adenovirus - Google Patents

Procede de detection et de quantification d'adenovirus

Info

Publication number
EP1257672A2
EP1257672A2 EP01907728A EP01907728A EP1257672A2 EP 1257672 A2 EP1257672 A2 EP 1257672A2 EP 01907728 A EP01907728 A EP 01907728A EP 01907728 A EP01907728 A EP 01907728A EP 1257672 A2 EP1257672 A2 EP 1257672A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
pcr
adenovirus
probe
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01907728A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Michel Vidaud
Eric Gautier
Patrick Saulnier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Institut Gustave Roussy (IGR)
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0001554A external-priority patent/FR2804692B1/fr
Application filed by Institut Gustave Roussy (IGR), Aventis Pharma SA filed Critical Institut Gustave Roussy (IGR)
Publication of EP1257672A2 publication Critical patent/EP1257672A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method of detection and quantification in various biological media of adenovirus nucleic acids by the real-time measurement of polymerase chain reaction (PCR). It further relates to oligonucleotides for the implementation of this process.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Adenoviruses which are naturally responsible for generally mild infections, are among the vectors used because of their many advantages.
  • This method is therefore intended to identify subgroups and serotypes and not to detect and quantify all of the adenoviruses present in a sample.
  • the sensitivity of this method is low and therefore unsuitable for precise dosages, such as those required when monitoring patients treated by gene therapy.
  • Crawford-Miksza et al. Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp. 1107-1 1 12
  • nine separate primers are described.
  • the present invention therefore aims to solve these problems by providing a sensitive technique and making it possible to detect the majority of adenovirus serotypes.
  • the applicants have surprisingly shown that such advantages are obtained by amplifying in real time a determined sequence of DNA coding for hexon, using primers having a limited degeneration, and by highlighting the product. amplification using a non-degenerate probe.
  • the present invention relates first of all to a method for detecting and / or quantifying adenovirus nucleic acids in a biological sample in which:
  • an adenovirus nucleotide sequence is amplified by real-time PCR using a pair of degenerate sense and antisense primers, consisting of mixtures of oligonucleotides having at least 80% homology with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the sequence of the adenovirus type 5, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, and
  • the product of the amplification reaction is detected using a non-degenerate probe, consisting of one or more oligonucleotides having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the adenovirus type 5 sequence, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, during a sufficient number of cycles to allow obtaining a measurable amount of amplification product.
  • a non-degenerate probe consisting of one or more oligonucleotides having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the adenovirus type 5 sequence, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, during a sufficient number of cycles to allow obtaining a measurable amount of amplification product.
  • Real-time PCR is understood to mean any amplification technique making it possible to follow the progress of the amplification reaction in progress.
  • the sequences of the primers and / or of the probe have homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 540 and 780 of the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence.
  • the two primers are respectively chosen on the sense and antisense strands, and so as to allow the amplification of a DNA fragment.
  • the probe is chosen so as to hybridize with the DNA fragment resulting from the amplification.
  • the PCR primers in accordance with the present invention used to amplify the target adenovirus nucleic acid of a sample are located in a constant zone for the hexon gene of human adenoviruses and the site of hybridization of the probe in accordance with the present invention lies between the two primers.
  • the adenoviruses are human tropism.
  • said oligonucleotides comprise at least 15 nucleotides and the probe has a theoretical melting temperature Tm approximately 10 ° C. ⁇ 0.5 higher than the theoretical Tm of the primers.
  • Tm melting temperature
  • the amplification product is preferably hybrid to the HEX probe described below.
  • the subject of the present invention is in particular an oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1 below or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably of 90% and even more preferably 95%, with said sequence:
  • said oligonucleotide comprises between 15 and 30 nucleotides.
  • the present invention further relates to a sense primer HEX1 consisting of a mixture of oligonucleotides meeting this definition.
  • the primer HEX1 exhibits three degenerations in position 1, 10 and 19 making it possible to cover the majority of the serotypes.
  • the present invention also relates to a second oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 2 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably 90% and even more preferably 95%, with said sequence:
  • said oligonucleotide comprises between 15 and 30 nucleotides.
  • the present invention further relates to a HEX2 antisense primer consisting of a mixture of oligonucleotides meeting this definition.
  • the primer HEX2 has three degenerations in position 6, 9 and 21 making it possible to cover the majority of the serotypes sequenced.
  • said primers comprise at least two oligonucleotides, and even more preferably three or four oligonucleotides.
  • the positions of the sequences SEQ ID N ° 1 and 2, located in the 3 ′ part of the ORF coding for the protein Hexon, are, taking as reference the complete sequence of the adenovirus type 5 (deposit number M73260) , respectively 21565 (HEX1) and 21656 (HEX2). They correspond to positions 21048 and 21139 of the sequence Ad5CMVp53 (length 35308 bp).
  • the concentration of the primers is a critical parameter of real-time PCR. As a result, the degeneration of the primers HEX1 and HEX2 was limited.
  • the present invention further relates to a third oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 3 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably 90% and even more preferably 95%, with said sequence, or with a sequence complementary to said sequence:
  • said oligonucleotide comprises between 20 and 35 nucleotides.
  • the present invention further relates to a HEX probe comprising at least one oligonucleotide having this sequence.
  • the probe comprises a molecule or a revealing system of molecules.
  • Said revealing system preferably consists of a reporter dye and a fluorescence quenching dye, respectively attached to the 5 ′ and 3 ′ ends of the probe.
  • the revealing system is constituted by the pair "reporter / quencher ”represented by 6-carboxyfluorescein (FAM) and 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) fixed respectively 5 'and 3' of the probe.
  • FAM 6-carboxyfluorescein
  • TAMRA 6-carboxytetramethylrhodamine
  • a particularly preferred probe according to the invention consists of: 5 'FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
  • Such a revealing system can also be a so-called “tailing” revealing system.
  • "Tailing” consists of including at one end of the probe a tail (tail) which can self-pair. This auto-pairing is highlighted using a marker which is specifically fixed on the sequence in this configuration. If there is a target, there is a mismatch and a signal is emitted. In the absence of target the signal is not emitted.
  • Other revealing systems can also be used.
  • the sense and antisense primers may include a molecule or a developer molecule system.
  • the PCR product obtained by the method which is the subject of the present invention using the primers of sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 preferably has a size of 1 14 bp and has a% GC of approximately 58.8%.
  • the polymerase preferably used in the present invention is Taq polymerase, but it can be any other enzyme exhibiting polymerase activity and usable under the operating conditions of PCR.
  • the present invention also relates to a reagent kit for amplification reaction of the real-time PCR type for detection of adenovirus, characterized in that it comprises a pair of sense and antisense primers and a probe as described. above.
  • Said kit advantageously further comprises two negative controls and two positive controls.
  • the present invention further relates to a PCR method for the detection and / or quantification of adenovirus in a test sample capable of containing it, characterized in that it consists of a real-time PCR using a kit according to the invention.
  • said two positive controls are extracted in parallel with a series of samples to be assayed and consist of a standard consisting of a purified and titrated adenovirus solution and a calibrator adapted to the type of sample to be assayed.
  • the method according to the invention finds an advantageous application in the detection and / or in the quantification of adenoviruses present in samples of suspension or supernatant type from culture, plasma, urine, oropharyngeal washings, lymphocytes, seminal fluids, tumor biopsies or no, rectal swabs, faeces, ascites.
  • the present invention also relates to a method of selecting adenoviruses useful as vector candidates by evaluation of the replicative performance of adenoviruses by application of a detection and / or quantification method according to the invention to the monitoring of kinetics of adenoviral multiplication.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing the adenovirus serotype present in a test sample consisting in implementing a method of the invention and then in sequencing the PCR product obtained.
  • the nucleotide sequences of the various serotypes encoding the Hexon protein were obtained from databases or were sequenced.
  • the serotypes Ad3, Ad7, Ad 12, Ad 14, Ad 16 and Ad21 have an A residue at position 9 of the HEX probe.
  • the serotypes Ad5, Adl, Ad2, Ad6, Adl3, Ad40 and Ad48 have a residue at this same position G while the serotypes Ad4 and Ad41 have a residue C.
  • the type A sequence is more common than the type C sequence.
  • a / C mismatches (Ad5CMNp5i and serotypes 5, 1, 2, 6, 13, 40 and 48) or A / G (serotypes 4 and 41) result in a decrease in the Rn delta without significant modification of the Ct (Rn delta is the difference in fluorescence detected between the measured fluorescence of the background noise and the detected fluorescence of the test sample; Ct is defined as the number of fractional cycles in which the fluorescence generated by cleavage of the probe significantly exceeds - generally 10 times - background noise).
  • Serotypes Ad5, Ad4, Ad 12 and Ad 14 and Ad5CMV / 53 show additional differences in position o 5 for serotype Ad5 and Ad5CMV 75J o 24 for serotypes Ad4 and Adl2 o 3, 12 and 19 for Adl4 serotype
  • One of the advantages of the present method of detecting and / or quantifying human adenoviruses compared to the methods described in the prior art is a remarkable detection sensitivity with a detection threshold of 10 particles or 1 pfu ( range unit) by PCR reaction.
  • Another advantage lies in the universality of the method since 17 different serotypes of human adenoviruses, representative of all of the subgroups A to F, could be detected and quantified.
  • the analysis of the PCR products is carried out directly at the end of the PCR cycles by reading the fluorescence obtained during the cycles. It is therefore not necessary to work with PCR products which are at risk of contamination for subsequent analyzes.
  • the quantification of the number of targets initially used in the reaction is very reliable and reproducible.
  • the detection of the PCR product is done during PCR cycles using a fluorescent probe. This is necessary to detect the PCR product and takes place in the full exponential phase of PCR and not at the end point; this detection principle is therefore more sensitive and more specific.
  • Another advantage lies in the fact that non-specific amplifications are avoided, thanks to the “hot start” principle, real-time PCR being carried out in the presence of a thermostable DNA polymerase which activates at the first denaturation.
  • the present invention is illustrated by nonlimiting examples and with reference to the appended figure which represents a standard curve of a hexon PCR method according to the invention.
  • Ad2 and Ad5 Some titrated wild adenoviruses (Ad2 and Ad5) come from UMR No. 1592 (Emmanuelle Vigne, Vectorology and Gene Transfer Unit, Gustave-Roussy Institute).
  • the Ad5CMV /? 55 titrated comes from the Production Unit of RPR Gencell, Vitry (Didier Faucher). The titles are provided in number of pfu (“plaque forming unit”). This unit will remain the reference unit for quantification.
  • the cell line 293 comes from ATCC (CRL 1573).
  • the cell line A549 (ATCC: CCL 185) was kindly provided by E. Vigne and A. Fallourd, RPR Gencell.
  • the MRC5 cell line comes from bioMérieux (ref. 84002, France).
  • Clinical samples • The clinical samples (plasma, urine, oropharyngeal lavage, faeces) come either from healthy volunteers or from patients hospitalized at the Gustave-Roussy Institute.
  • Some plasmas come from the Transfusion Center, either by purchasing a bag from around 200 donors, or bags that can no longer be used for medical use.
  • Adenovirus collections and clinical samples are transported in dry ice and, upon receipt, stored at -80 ° C.
  • Cookies and switchboard There are two types of negative cookies:
  • a negative control PCR or NTC (non template control) which consists of the PCR buffer with distilled water (without target). The value of Ct must be 50 since 50 PCR cycles are performed.
  • the second type of negative control is the negative extraction control which is put in place from the extraction stage. In general, it consists of 200 ⁇ l of physiological water and it is extracted in parallel with a series of extracts (generally 1 in 10). The value of Ct must also be 50. There are two types of positive "controls":
  • the standard which consists of a purified and titrated adenovirus solution ( ⁇ 5.10 3 pfu), is extracted in parallel with a series of samples to be assayed.
  • the nucleic acid extract is diluted (generally 10 to 10) to constitute the different standard points for the construction of the standard curve (Figure).
  • the second type of positive control is the calibrator.
  • calibrators There are different types of calibrators depending on the type of samples to be diagnosed. It consists of 200 ⁇ l medium closest to the sample and a known amount of adenovirus lying in the middle of the standard range (in general 5.10 3 pfu).
  • the media used for the manufacture of the calibrators are physiological water for oropharyngeal washes, a "pool" of plasma from 200 healthy donors for plasmas, urine from healthy subjects for urine and fresh culture medium. for culture supernatants. These calibrators verify that the extraction technique is correct. The quantization value compared to the expected theoretical value will allow, by simple rule of three, to readjust the final quantification obtained with the samples to be tested.
  • a CDD camera collects fluorescence emissions approximately every 6 seconds for each well.
  • S.D.S. Sequence Detector System TM
  • the quantification is based on the principle of real-time PCR. Indeed, the PCR product is characterized by the moment of the PCR cycle when the amplification is detectable by the degradation of the probe linked to the accumulation of PCR products. The higher the number of target starting copies, the fewer PCR cycles it will take to detect a significant increase in fluorescence.
  • the number of target copies of a sample is quantified by measuring the Ct value and using a standard curve ( Figure).
  • Figure if the PCR works at 100%, it takes 3.22 PCR cycles (Ct) to multiply by 10 the number of targets. In general, a factor of 10 of the number of targets gives a difference in Ct values between 3.4 to 3.6.
  • the second parameter (Delta Rn) is important to check to confirm the positivity of the PCR signal.
  • the Rn delta is the difference in fluorescence detected between the measured fluorescence of the background noise (generally measured between cycle 3 and cycle 15 of the PCR on the entire plate) and the detected fluorescence of the sample to be analyzed.
  • RNA Isolation Kit All the reagents used for this preparation come from the kit called High Pure RNA Isolation Kit, and marketed by Boehringer / Roche. To prepare this sample proceed as follows:
  • washing buffer I Add 500 ⁇ l of washing buffer I and centrifuge for 1 min. at 8,000 rpm.
  • the nucleic acid extracts are stored at 4 ° C until the PCR step.
  • n ° 1 illustrating the extraction techniques optimized for the detection of adenovirus coming from different types of samples including that of the present example.
  • concentrations of all the reagents used in the amplification reactions in particular the concentrations of primers sense “HEX1”, antisense “HEX2”, probe “HEX”, and MgCl ; and other reagents of the TaqMan TM PCR Core Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) are given in table 2.
  • the standard curve of a PCR detection method according to the invention is shown in the figure.
  • One of the applications of the hexon PCR method according to the invention is the detection of adenovirus in culture supernatants.
  • the presence of an adenovirus in cell culture is conventionally visualized by a cytopathic effect in the cell layer.
  • a cytopathic effect is due to an adenovirus an antigen specific to the adenovirus is detected (by ELISA, eg Ref. K6021, Dako Diagnostic LTD, Denmark House, England).
  • Extracts of nucleic acids from the main cell lines (Hep2, MRC5, 293 and A549, described above in the “materials and methods” section) used for the cellular diagnosis of human adenoviruses were tested to verify the negativity in PCR hexon according to the present invention. All DNA extracts evaluated were negative demonstrating the specificity of detection.
  • Ad40 has a mismatch for the HEX2 antisense primer of the invention and a mismatch for the HEX probe of the invention.
  • the hexon gene sequence for serotype 18 is not available. It is likely that these results obtained with Adl ⁇ are also due to mismatches.
  • Example 3 Sensitivity of the Method According to the Invention 3.1. Estimation of the detection threshold in number of particles.
  • Table 3 presents the results of the 17 adenovirus serotypes with Ct values obtained as a function of the number of particles per ml measured by the HPLC technique.
  • the Ct values are in the range of 8.1 to 9.1 for a number of particles from 1.1 to 8.5.10'7ml .
  • the detection threshold can be estimated from 10 to 80 particles per PCR reaction.
  • 25 cm 2 culture flasks of cells were infected with adenovirus dilutions of between 10 3 and 1 pfu.
  • the culture medium (5 ml) was removed, the cells were infected with different concentrations of virus in a volume of 2 ml for 2 hours (at 37 ° C). After two hours, the medium was changed. After infection, every day (D0 to Dl 1), the culture flasks were removed: 250 ⁇ l for the ELISA test (detection of Hexon antigen) and 200 ⁇ l for the detection of PCR according to the invention. 450 ⁇ l of fresh medium were reintroduced into the culture flask.
  • the appearance of the CPE (cytopathic effect) (table 4) is between 4 days for the 10 'point and 8 days for the 10 pfu point. There is a relationship between the amount of virus inoculated in the culture flask and the time to positivity.
  • the positivity threshold is 10 pfu / culture flask.
  • the Ct values for the negative controls (T) are slightly positive (37.6-37.8). This result can be explained either by slight aerosol contamination at the time of inoculation of the culture flasks, or by slight contamination at the time of extraction. The first hypothesis seems to be more likely since on D10, the values of Ct increased to 31.2 (difference of 6.5 Ct) which represents an increase by a factor of 100 in the number of copies of adenovirus.
  • the hexon PCR method of the invention shows the existence of a viral multiplication (significant decrease in Ct) in the absence of PCE and detection of the Hexon antigen.
  • the hexon PCR method of the invention reveals, in a completely surprising manner, from 2 to 4 "waves" of viral multiplication.
  • the hexon PCR method of the invention is positive sooner than the ECP or the ELISA hexon. Also, the hexon PCR method conforms to the present invention is at least 10 times more sensitive than conventional cell culture tests (10-day culture + ELISA test).
  • the hexon PCR method according to the invention can advantageously contribute to the selection of vector candidates for biotechnological applications, in particular in gene expression and / or therapy.
  • Example 5 Repeatability and reproducibility of the method according to the invention.
  • the variation in Ct is also greater, rarely exceeding a value of 2 Ct between two different extracts except for urine No. 2403 which has a difference of 3 Ct (factor 8 in quantification).
  • some urines nos. 2029, 2626, 3736, 3763, 3765 and 5399
  • the standard curve is usually generated using 12 points of 1 to 10 5 pfu per PCR reaction tested in duplicate. For each repetition, the amplification curves and the PCR cycle values are very reproducible (see figure). On the other hand, as a final point, the fluorescence signals are very variable (up to a factor of 10), hence the advantage of analyzing the PCR products at the time of the appearance of the signal (PCR cycle: Ct) and not at the end point as in "classic" PCR.
  • the standard curve obtained with these standard points is shown in the figure.
  • the correlation coefficient of 0.999 indicates excellent linearity. In the vast majority of cases, this coefficient is between 0.98 and 1.
  • Manipulations using a wider standard range 0.5 to 10 6 pfu have shown similar correlation coefficients (not shown) thus confirming the supplier information describing a linearity of quantification on more than 6 logarithms.
  • Y-intercept represents the number of PCR cycles deduced by the standard curve to detect an Ad5CMVp5J pfu. According to standard curves, this Ct value is between 35 and 39.
  • the value of the slope is related to the yield of the PCR. It is recalled that for a PCR at 100% yield, this value must be - 3.22. For the hexon PCR method according to the invention, the value of the slope is between - 3.4 to - 3.9 representing an average yield of 90%.
  • Example 8 Quantification on clinical samples: The examples of quantification obtained with the hexon PCR on clinical samples (Table 7) were selected on two main criteria. The first criterion is that the sample was analyzed by two completely independent serial PCR extractions (see Table 6). The second criterion is that the PCR results have Ct values less than or equal to 36 corresponding well to a quantifiable status for the sample. Six clinical samples meet these two criteria (Table 7). The quantification results are very reproducible and the level of variation rarely exceeds a factor of 2 for the same sample (Table 7). It is particularly interesting to note for urine No.
  • Table n ° 1 Optimized extraction techniques for the detection of adenovirus from different types of samples.
  • Table 3 Time to onset of the PCE (day urs) - * OD value in Elisa, Ct value (PCR hexon) and fineness in HPLC after inoculation of A549 cells a supernatant of MRC5 cells harvested after infection with wild adenoviruses from the collection.
  • Table 5 Ct values obtained with 1 pfu of Ad5CMV 7J3 in the PCR reaction (101 tests).
  • a The average was calculated from the values of Ct indicated in table 6.
  • b The standard used is known in number of pfu of Ad5CMVp.53. This quantification is reported per milliliter of initial clinical samples.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procédé de détection et de quantification d'adénovirus par amplification en chaîne par polymérase (PCR). Le procédé permet de détecter dans une seule réaction les différents sérotypes d'adénovirus et de quantifier de très faibles quantités.

Description

Procédé de détection et de quantification d'adénovirus.
La présente invention est relative à un procédé de détection et de quantification dans divers milieux biologiques d'acides nucléiques d'adénovirus par la mesure en temps réel de l'amplification en chaîne par polymerase (PCR). Elle a en outre pour objet des oligonucléotides pour la mise en oeuvre de ce procédé.
La thérapie génique connaît actuellement un développement important. Les adenovirus, qui sont naturellement responsables d'infection généralement bénignes, figurent parmi les vecteurs utilisés du fait de leurs nombreux avantages.
L'extension du développement clinique de ces vecteurs adénoviraux, à des phases tardives II et Lïï aux fins d'enregistrement et d'autorisation de mise sur le marché, rend nécessaire le développement, la validation et la mise en œuvre de techniques spécifiques et sensibles permettant la mesure de la biodistribution quantitative et qualitative des adénovecteurs dans les divers compartiments biologiques et la détection de l'émergence à faible charge virale d'infection par des contaminants de la production d'adénovecteurs (en particulier adénovecteurs recombinant compétents pour la réplication). Il est en outre nécessaire de détecter les infections intercurrentes adénovirales dues à des virus sauvages de différents serotypes, responsables de la vaste majorité de l'incidence de ces infections naturelles, que ces infections soient florides ou latentes cliniquement. et de déterminer la cinétique virologique de ces infections sauvages, et la signification clinique dans diverses situations, au sein de la population générale ou chez des patients à risques (patients souffrant de cancer, transplantés, immunosupprimés ou immunodéprimés, etc.).
La présence d'un adenovirus en culture cellulaire permissive est visualisée, dans les techniques de détection utilisées jusqu'à présent en routine, par un effet cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un adenovirus, on détecte par méthode ELISA un antigène spécifique de l'adénovirus. Des techniques d'amplification d'acides nucléiques extraits d'adénovirus par PCR ont été en outre décrites. Ainsi la demande de brevet japonais JP 07327700 décrit une méthode de type PCR dans laquelle des parties de l'ADN codant pour l'hexon, une protéine de la capside des adenovirus, sont amplifiées. Les produits d'amplification sont mis en « dot blot » puis hybrides avec des sondes spécifiques de chaques serotypes. Cette méthode est donc destinée à identifier les sous groupes et les serotypes et non à détecter et à quantifier l'ensemble des adenovirus présents dans un échantillon. En outre la sensibilité de cette méthode est faible et donc peu adaptée à des dosages précis, tels que ceux requis lors du suivi de patients traités par thérapie génique.
Pring-Akerblom et al. (Journal of Médical Virology, 1999, Vol. 58 , pp. 87-92) ont également décrit une méthode mettant en oeuvre six couples d'amorces dans une même réaction PCR (PCR dite multiplex). L'identification du sous-groupe est faite en déposant les produits de PCR sur gel d'électrophorèse puis en déterminant la taille des produits de PCR.
Crawford-Miksza et al. (Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp. 1107-1 1 12) ont décrit une PCR hexon détectant spécifiquement les adenovirus de types 4, 7 et 21 utilisant des amorces consensus comprenant de l'inosine comme base nucléique en cas de mésappariement sur certaine position variable. Dans ce document neuf amorces distinctes sont décrites.
Ces techniques antérieures mettent en oeuvre une PCR standard et une méthode d'analyse classique généralement sur gel d'électrophorèse avec ou sans hybridation.
Aucune de ces techniques ne permet à la fois de détecter de façon large les adenovirus provenant de la majorité des serotypes connus et d'en quantifier les charges virales avec une sensibilité en adéquation avec les besoins de la thérapie génique notamment.
La présente invention a donc pour but de résoudre ces problèmes en fournissant une technique sensible et permettant de détecter la majorité des serotypes d'adénovirus. Les demandeurs ont montré de manière surprenante que de tels avantages sont obtenus en amplifiant en temps réel une séquence déterminée de l'ADN codant pour l'hexon, à l'aide d'amorces présentant une dégénérescence limitée, et en mettant en évidence le produit d'amplification à l'aide d'une sonde non dégénérée. La présente invention est tout d'abord relative à un procédé de détection et / ou de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon biologique dans lequel :
- une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifié par PCR en temps réel à l'aide d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire, et
- le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde non dégénérée, constituée d'un ou plusieurs oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire, durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification.
On entend par « PCR en temps réel » toute technique d'amplification permettant de suivre l'évolution de la réaction d'amplification en cours.
Avantageusement les séquences des amorces et/ou de la sonde présentent une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 540 et 780 de la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire. Les deux amorces sont respectivement choisies sur les brins sens et anti-sens, et de manière à permettre l'amplification d'un fragment d'ADN. La sonde est quant à elle choisie de manière à s'hybrider avec le fragment d'ADN résultant de l'amplification. Les amorces de PCR conformes à la présente invention utilisées pour amplifier l'acide nucléique d'adénovirus cible d'un échantillon se situent dans une zone constante pour le gène hexon des adenovirus humains et le site d'hybridation de la sonde conforme à la présente invention se situe entre les deux amorces. Préférentiellement les adenovirus sont à tropisme humain.
De manière avantageuse lesdits oligonucléotides comprennent au moins 15 nucleotides et la sonde présente une température de fusion Tm théorique supérieure d'environ 10°C ± 0,5 aux Tm théoriques des amorces. Un tel procédé est appelée méthode PCR hexon en abrégé dans la suite du texte. Il comprend en substance une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes :
- séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon,
- hybridation de la sonde,
- hybridation avec des amorces telles que défîmes ci-dessus, et
- élongation avec une polymerase.
Il est préférentiellement mis en oeuvre à l'aide des amorces sens et anti-sens HEX1 et HEX2 décrites ci -dessous et le produit d'amplification est préférentiellement hybride à la sonde HEX décrite ci -dessous.
La présente invention a notamment pour objet un oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence :
5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C. De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30 nucleotides.
La présente invention a en outre pour objet une amorce sens HEX1 constituée par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce HEX1 présente trois dégénérescences en position 1 , 10 et 19 permettant de couvrir la majorité des serotypes.
La présente invention a encore pour objet un deuxième oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence :
5' - GAGAAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30 nucleotides. La présente invention a en outre pour objet une amorce anti-sens HEX2 constituée par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce HEX2 présente trois dégénérescences en position 6, 9 et 21 permettant de couvrir la majorité des serotypes séquences.
Préférentiellement lesdites amorces comprennent au moins deux oligonucléotides, et encore plus préférentiellement trois ou quatre oligonucléotides.
Les positions des séquences SEQ ID N° 1 et 2, localisées dans la partie 3' de l'ORF codant la protéine Hexon, sont, en prenant comme référence la séquence complète de l'adénovirus de type 5 (n° de dépôt M73260), respectivement 21565 (HEX1) et 21656 (HEX2). Elles correspondent aux positions 21048 et 21 139 de la séquence Ad5CMVp53 (longueur 35308 pb).
Les demandeurs ont montré que la concentration des amorces est un paramètre critique de la PCR en temps réel. En conséquence, la dégénérescence des amorces HEX1 et HEX2 a été limitée.
La présente invention a en outre pour objet un troisième oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence, ou avec une séquence complémentaire de ladite séquence :
5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 20 et 35 nucleotides.
La présente invention a en outre pour objet une sonde HEX comprenant au moins un oligonucléotide présentant cette séquence.
Elle est en outre relative à des oligonucléotides présentant une séquence complémentaire de celles des oligonucléotides mentionnés ci dessus.
Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de la présente invention la sonde comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. Ledit système révélateur est constitué de préférence par un colorant reporteur et un colorant extincteur de fluorescence, respectivement fixés aux extrémités 5' et 3 'de la sonde. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux le système révélateur est constitué par la paire « reporter / quencher » représentée par la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et la 6- carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement fixé en 5' et en 3' de la sonde. L'une des amorces peut être marquée de cette manière et avoir le rôle de sonde. Une sonde particulièrement préférée selon l'invention est constituée par : 5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
Un tel système révélateur peut aussi être un système révélateur dit de « tailing ». Le « tailing » consiste à inclure à une des extrémités de la sonde une queue (tail) qui peut s'autoapparier. Cet autoappariement est mis en évidence à l'aide d'un marqueur qui se fixe spécifiquement sur la séquence dans cette configuration. En présence de cible il y a désappariement et un signal est émis. En absence de cible le signal n'est pas émis. D'autres systèmes révélateur peuvent aussi être utilisés.
En variante, les amorces sens et anti-sens peuvent comporter une molécule ou un système de molécules révélateur.
Le produit de PCR obtenu par le procédé objet de la présente invention en utilisant les amorces de séquences SEQ ID N°l et SEQ ID N°2 a préférentiellement une taille de 1 14 pb et présente un %GC d'environ 58.8 %.
La polymerase préférentiellement utilisée dans la présente invention est la Taq polymerase, mais elle peut être toute autre enzyme présentant une activité polymerase et utilisable dans les conditions opératoires de la PCR.
La présente invention a encore pour objet un kit de réactifs pour réaction d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces sens et anti-sens et une sonde telles que décrites ci- dessus. Ledit kit comprend avantageusement en outre deux témoins négatifs et deux témoins positifs.
La présente invention a en outre pour objet une méthode PCR pour la détection et / ou la quantification d'adénovirus dans un échantillon à doser susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle consiste en une PCR en temps réel mettant en oeuvre un kit selon l'invention.
Selon un aspect particulièrement avantageux de la méthode selon l'invention, lesdits deux témoins positifs sont extraits en parallèle à une série d'échantillons à doser et consistent en un standard constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et titrée et un calibrateur adapté au type d'échantillon à doser.
La méthode conforme à l'invention trouve une application avantageuse à la détection et / ou à la quantification d'adénovirus présents dans les échantillons de type suspension ou surnageant de culture, plasma, urines, lavages oropharyngés, lymphocytes, liquides séminaux, biopsies tumorales ou non, écouvillons rectaux, fèces, ascites.
La présente invention a également trait à une méthode de sélection d'adénovirus utiles comme candidats vecteurs par évaluation des performances réplicatives des adenovirus par application d'une méthode de détection et / ou de quantification selon l'invention au suivi de cinétiques de multiplication adénovirale.
La présente invention a également trait à une méthode de diagnostic du sérotype d'adénovirus présents dans un échantillon à tester consistant à mettre en oeuvre une méthode de l'invention puis à séquencer le produit PCR obtenu.
Les séquences nucléotidiques des différents serotypes codant la protéine Hexon ont été obtenues à partir de banques de données ou ont été séquencées. Les serotypes Ad3, Ad7, Ad 12, Ad 14, Ad 16 et Ad21 présentent en position 9 de la sonde HEX un résidu A. Les serotypes Ad5, Adl, Ad2, Ad6, Adl3, Ad40 et Ad48 présentent à cette même position un résidu G alors que les serotypes Ad4 et Ad41 présentent un résidu C. La séquence présentant un résidu A a été choisie, car la séquence de type G, à l'opposé des séquences de type A ou de type C, présente une structure secondaire de très haute stabilité (DG = -7.1 kcal/mol) susceptible de perturber son hybridation et/ou son déplacement et/ou sa dégradation lors de la polymérisation. D'autre part, la séquence de type A est plus fréquente que la séquence de type C.
Les mésappariements A/C (Ad5CMNp5i et serotypes 5, 1, 2, 6, 13, 40 et 48) ou A/G (serotypes 4 et 41) se traduisent par une diminution du delta Rn sans modification significative du Ct (delta Rn est la différence de fluorescence détectée entre la fluorescence mesurée du bruit de fond et la fluorescence détectée de l'échantillon à tester ; Ct est défini comme le nombre de cycles fractionnels dans lequel la fluorescence générée par clivage de la sonde dépasse significativement - en général de 10 fois - le bruit de fond). Les serotypes Ad5, Ad4, Ad 12 et Ad 14 et l'Ad5CMV/ 53 présentent des différences supplémentaires en position o 5 pour le sérotype Ad5 et l'Ad5CMV 75J o 24 pour les serotypes Ad4 et Adl2 o 3, 12 et 19 pour le sérotype Adl4
Malgré ces différences il est possible, de manière surprenante, de détecter les séquences nucléotidiques codant pour les protéines hexons de ces serotypes.
L'un des avantages de la présente méthode de détection et / ou de quantification d'adénovirus humains par rapport aux méthodes décrites dans l'état de la technique est une sensibilité de détection remarquable avec un seuil de détection de 10 particules ou 1 pfu (unité formant plage) par réaction PCR.
Un autre avantage réside dans l'universalité de la méthode puisque 17 serotypes différents d'adénovirus humains, représentatifs de l'ensemble des sous-groupes A à F, ont pu être détectés et quantifiés.
En outre l'analyse des produits de PCR se fait directement à la fin des cycles de PCR par la lecture de la fluorescence obtenue au cours des cycles. Il n'est donc pas nécessaire de travailler avec les produits de PCR qui sont à risque de contamination pour les analyses ultérieures.
De plus la traçabilité des données brutes est totale. En effet, chaque analyse PCR est conservée dans des fichiers informatiques que l'on peut archiver sur une longue période sans altération. Les données brutes peuvent être à tout moment ré-analysées si les critères d'analyses évoluent. La conservation des données brutes est essentielle lorsqu'on doit travailler aux normes de Bonnes Pratiques de Laboratoire.
En outre la quantification du nombre de cibles mis au départ dans la réaction est très fiable et reproductible. La détection du produit de PCR se fait au cours des cycles PCR à l'aide d'une sonde fluorescente. Celle-ci est nécessaire pour détecter le produit de PCR et a lieu en pleine phase exponentielle de PCR et non en point final ; ce principe de détection est donc plus sensible et plus spécifique. Un autre avantage réside dans le fait que les amplifications non spécifiques sont évitées, grâce au principe du « hot start », la PCR en temps réel étant réalisée en présence d'une ADN polymerase thermostable s 'activant à la première dénaturation.
Pour mettre en oeuvre la présente invention on peut éventuellement se référer à une revue générale des techniques PCR, et en particulier à la notice explicative intitulée « Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Détection » publiée par Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) et au PCR Protocols (Académie Press New- York 1989).
La présente invention est illustrée par des exemples non limitatifs et en référence à la figure annexée qui représente une courbe standard d'une méthode PCR hexon conforme à l'invention.
Matériel et méthodes
Collection d'adénovirus, surnageants de culture et lignées cellulaires :
• La plupart des surnageants de culture de différents serotypes d'adénovirus humains proviennent du laboratoire du Pr. Freymuth (service de Virologie, CHU, Caen).
• Certains adenovirus sauvages titrés (Ad2 et Ad5) proviennent de l'UMR n° 1592 (Emmanuelle Vigne, Unité de Vectorologie et de Transfert de Gènes, Institut Gustave-Roussy).
• L'Ad5CMV/?55 titré provient de l'Unité de Production de RPR Gencell, Vitry (Didier Faucher). Les titres sont fournis en nombre de pfu (« plaque forming unit », unités formant plages). Cette unité restera l'unité de référence pour la quantification.
• La lignée cellulaire 293 provient de l'ATCC (CRL 1573).
• La lignée cellulaire A549 (ATCC: CCL 185) a aimablement été fournie par E. Vigne et A. Fallourd, RPR Gencell.
• La lignée cellulaire MRC5 provient de chez bioMérieux (réf. 84002, France).
Echantillons cliniques : • Les échantillons cliniques (plasma, urines, lavages oropharyngés, fèces) proviennent soit de volontaires sains, soit de patients hospitalisés à l'Institut Gustave-Roussy.
• Certains plasmas proviennent du Centre de Transfusion, soit par l'achat d'une poche provenant d'environ 200 donneurs, soit des poches ne pouvant plus être utilisées pour un usage médical.
Conditions de stockage :
• Les collections d'adénovirus et les prélèvements cliniques sont transportés en carboglace et, dès réception, stockés à -80°C.
• Les différentes étapes de réception, d'aliquotage et d'analyse nécessitent un certain nombre de congélations et décongélations (adenovirus ou prélèvements cliniques). Pour être dans les mêmes conditions, les témoins (standard et calibrateurs) subissent le même nombre de congélations et décongélations que les prélèvements cliniques à diagnostiquer.
Témoins et standard : Il y a deux types de témoins négatifs :
Un témoin négatif PCR ou NTC ("non template control") qui est constitué du tampon PCR avec de l'eau distillée (sans cible). La valeur de Ct doit être de 50 puisque l'on fait 50 cycles PCR.
Le deuxième type de témoin négatif est le témoin négatif d'extraction qui est mis en place dès l'étape d'extraction. En général, il est constitué de 200 μl d'eau physiologique et il est extrait en parallèle avec une série d'extractions (en général 1 pour 10). La valeur de Ct doit également être de 50. Il y a deux types de "témoins" positifs :
Le standard qui est constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et titrée (≈ 5.103 pfu), est extrait en parallèle à une série d'échantillons à doser. L'extrait d'acides nucléiques est dilué (en général de 10 en 10) pour constituer les différents points de standard pour la construction de la courbe standard (Figure).
Le deuxième type de témoins positifs est le calibrateur. Il existe différents types de calibrateurs suivant le type d'échantillons à diagnostiquer. Il est constitué de 200 μl de milieu le plus proche de l'échantillon et d'une quantité connue d'adénovirus se situant au milieu de la gamme standard (en général 5.103 pfu). Les milieux utilisés pour la fabrication des calibrateurs sont de l'eau physiologique pour les lavages oropharyngés, d'un "pool" de plasma de 200 donneurs sains pour les plasmas, d'urines de sujets sains pour les urines et du milieu de culture frais pour les surnageants de culture. Ces calibrateurs vérifient que la technique d'extraction est correcte. La valeur de quantification par rapport à la valeur théorique attendue va permettre, par simple règle de trois, de réajuster la quantification finale obtenue avec les échantillons à tester.
Appareil et quantification
Toutes les réactions PCR sont faites à l'aide de l'appareil ABI Prism 7700 (Perkin- Elmer Applied Biosystem) lequel détecte le signal à l'aide d'une sonde fluorescente (Sonde TaqMan™) pendant les cycles PCR.
Le système 7700 est un thermocycleur où chaque puits (n = 96) est relié à une fibre optique laquelle est connectée à un laser. Une caméra CDD collecte les émissions de fluorescence à peu près toutes les 6 secondes pour chaque puits. Le logiciel S.D.S. (Séquence Detector System™) analyse les données de fluorescence et détermine le nombre de copies de cible dans un échantillon.
La quantification est basée sur le principe de la PCR en temps réel ("real-time PCR"). En effet, le produit de PCR est caractérisé par le moment de cycle PCR où l'amplification est détectable par la dégradation de la sonde liée à l'accumulation de produits de PCR. Plus le nombre de copies de départ de cible est élevé, moins il faudra de cycles PCR pour détecter une élévation significative de fluorescence.
Le nombre de copies de cible d'un échantillon est quantifié en mesurant la valeur de Ct et en utilisant une courbe standard (Figure ). En théorie, si la PCR fonctionne à 100%, il faut 3,22 cycles PCR (Ct) pour multiplier par 10 le nombre de cibles. En général, un facteur 10 du nombre de cibles donne une différence de valeurs de Ct entre 3,4 à 3,6.
Le deuxième paramètre (Delta Rn) est important à vérifier pour confirmer la positivité du signal PCR. Le delta de Rn est la différence de fluorescence détectée entre la fluorescence mesurée du bruit de fond (en général mesurée entre le cycle 3 et le cycle 15 de la PCR sur la totalité de la plaque) et la fluorescence détectée de l'échantillon à analyser.
EXEMPLES
Exemple 1 : Détection d'adénovirus provenant d'un échantillon d'urines
1.1. Préparation de l'échantillon d'urines à tester.
Tous les réactifs utilisés pour cette préparation proviennent de la trousse dénommée High Pure RNA Isolation Kit, et commercialisée par Boehringer / Roche. Pour préparer cet échantillon procéder comme suit :
A 200 μl d'urines préalablement chauffées 10 min. à 37 °C ainsi que sur chacun des témoins (d'un volume de 200 μl), ajouter 400 μl du tampon de lyse.
Vortexer immédiatement. Incuber 15 min. à température ambiante.
Placer chaque colonne sur un tube de 2,0 ml et déposer la totalité de la préparation au centre de la colonne. Centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à
20°C.
Placer la colonne sur un deuxième tube de 2,0 ml.
Ajouter 500 μl du tampon de lavage I et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min.
(Eppendorf 5417R) à 20°C.
Placer la colonne sur un troisième tube de 2,0 ml.
Ajouter 500 μl du tampon de lavage II et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20°C.
Placer la colonne sur un quatrième tube de 2,0 ml.
Ajouter 200 μl du tampon de lavage II et centrifuger 3 min. à 14.000 tours/min
(Eppendorf 5417R) à 20°C. Placer la colonne sur tube Eppendorf de 1,5 ml (cinquième tube) et identifier le tube
Eppendorf qui va collecter l'éluat final d'extraction d'acides nucléiques.
Ajouter 50 μl d'eau distillée préchauffée.
Incuber 3 min. à 70°C (bain sec).
Centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20°C.
Les extraits d'acide nucléique sont conservés à 4°C jusqu'à l'étape de PCR.
Les « témoins » et « standard » sont préparés comme décrit ci-dessus (section
« matériel et méthodes »).
Pour la préparation d'autres types d'échantillons, se reporter au tableau n° 1 illustrant les techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus provenant de différents types d'échantillons dont celui du présent exemple.
1.2. Conditions de détection selon la méthode PCR hexon conforme à l'invention
Les concentrations de l'ensemble des réactifs mis en oeuvre dans les réactions d'amplification notamment les concentrations d'amorces sens « HEX1 », anti-sens « HEX2 », de sonde « HEX », et de MgCl; et autres réactifs du TaqMan™ PCR Core Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sont données dans le tableau 2.
1.3 Résultats
La courbe standard d'une méthode de détection PCR conforme à l'invention est représentée sur la figure.
Exemple 2 : Spécificité de la méthode conforme à l'invention
Une des applications de la méthode PCR hexon selon l'invention est la détection d'adénovirus dans les surnageants de culture.
Selon les techniques de l'art antérieur, la présence d'un adenovirus en culture cellulaire (permissive) est classiquement visualisée par un effet cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un adenovirus on détecte un antigène spécifique de l'adénovirus (par ELISA, ex. Réf. K6021, Dako Diagnostic LTD, Denmark House, Angleterre).
Des extraits d'acides nucléiques provenant des principales lignées cellulaires (Hep2, MRC5, 293 et A549, décrites ci-dessus dans la section « matériel et méthodes ») utilisés pour le diagnostic cellulaire des adenovirus humains ont été testés pour vérifier la négativité en PCR hexon selon la présente invention. Tous les extraits d'ADN évalués ont été négatifs démontrant la spécificité de détection.
Pour la méthode PCR hexon de l'invention, il est très important de démontrer le caractère "universel" de la détection avec différents serotypes d'adénovirus humains.
17 serotypes différents ont été évalués (tableau n° 3), tous les sous groupes (A, Bl, B2, C, D, E, F) sont représentés.
La collection de 17 serotypes a été testée sur deux lignées cellulaires MRC5 (réf. 84002, bioMérieux, France) et A549 (ATCC: CCL 185) donnant des résultats similaires. Les résultats obtenus sur A549 sont présentés dans le tableau 3. On peut observer que les valeurs de Ct sont similaires excepté pour les serotypes 12, 18 et 40. Ces 3 serotypes correspondent aux adenovirus ayant les titres les plus faibles. Mais cette grande différence de Ct est surtout due au choix des amorces et de la sonde TaqMan™ conformes à la présente invention. En effet, l'Adl2 présente deux mésappariements pour l'amorce sens HEX1 de l'invention et un mésappariement pour la sonde HEX de l'invention. De même, l'Ad40 présente un désappariement pour l'amorce anti-sens HEX2 de l'invention et un désappariement pour la sonde HEX de l'invention. La séquence du gène hexon pour le sérotype 18 n'est pas disponible. Il est probable que ces résultats obtenus avec l'Adlδ sont dus également à des mésappariements.
Il est à noter que malgré ces désappariements (deux ou trois) de séquences nucléotidiques, les surnageants de culture restent largement positifs.
Ces résultats confirment bien le caractère "universel" de la PCR hexon si l'on considère que les 17 serotypes testés sont représentatifs de l'ensemble des 51 serotypes connus.
Exemple 3 : Sensibilité de la méthode conforme à l'invention 3.1. Estimation du seuil de détection en nombre de particules.
Le tableau 3 présente les résultats des 17 serotypes d'adénovirus avec des valeurs de Ct obtenues en fonction du nombre de particules par ml mesurées par la technique HPLC. A l'exception des 3 serotypes ayant des titres faibles (Adl2, Adl8 et Ad40), les valeurs de Ct sont dans une fourchette de 8,1 à 9,1 pour un nombre de particules de 1,1 à 8,5.10'7ml.
Si on considère que la valeur de Ct pour la limite de positivité est aux environs de 40 et que l'on prend une différence de 3,5 Ct pour un facteur 10 du nombre de cibles, cela représente un écart possible de la valeur de Ct de 31 unités. Cet écart représente environ 9 logarithmes de base 10. Par conséquent, suivant les serotypes, le seuil de détection peut être estimé de 10 à 80 particules par réaction PCR.
3.2 : Bilan de 101 gammes standard.
Sur une période de 18 mois, 101 gammes standards ont été testées à l'aide de 101 extractions indépendantes d'un standard contenant 5.105 pfu d'Ad5CMV 55 dans 200 μl. Le volume final d'élution est de 50 μl. 10 μl d'extrait de ce standard avec une gamme de dilution de 10 en 10 (pur, 10"', 10":, 10°, 10"4, 10°) sont analysés pour construire une gamme standard. La dernière dilution testée correspond en théorie à 1 pfu d'Ad5CMV/?53 dans le tube PCR. Tous les points de gamme sont testés en double en PCR (Ctl et Ct2, tableau 5).
Les valeurs Ct obtenues avec tous les points contenant 1 pfu d'Ad5CMV/?JJ sont présentées dans le tableau 5. Sur 202 réactions PCR, 8 réactions sont négatives (Ct = 50) ce qui ne représente que 4%. Dans la grande majorité des cas, la quantité de 1 pfu d'Ad5CMV/?53 est positive en PCR hexon.
Ces résultats confirment bien la bonne sensibilité de détection. Suivant les lots de fabrication d'Ad5CMV/?JJ, l'équivalent 1 pfu correspond à 10 à 40 particules virales (≈ cible) ce qui confirme le seuil de détection estimé à l'aide de la collection d'adénovirus sauvages. Exemple 4 : Cinétique de culture adénovirale
Deux expériences ont démontré qu'il était possible de suivre une cinétique de multiplication adénovirale à l'aide de la méthode PCR hexon de l'invention. Ces deux expériences ont utilisé soit de l'Ad5 sur la lignée MRC5, soit de l'Ad2 sur la lignée A549 (tableau n° 4). Les résultats obtenus pour les deux expériences étaient similaires.
Des flacons de culture de 25 cm2 de cellules ont été infectés avec des dilutions d'adénovirus comprises entre 103 et 1 pfu. Le milieu de culture (5 ml) a été retiré, les cellules ont été infectées avec différentes concentrations de virus sous un volume de 2 ml pendant 2 heures (à 37°C). Au bout des deux heures, le milieu a été changé. Après l'infection, tous les jours (J0 à Jl 1), les flacons de culture ont été prélevés : 250 μl pour le test ELISA (détection d'antigène Hexon) et 200 μl pour la détection PCR selon l'invention. 450 μl de milieu frais étaient réintroduits dans la flacon de culture.
L'apparition de l'ECP (effet cytopathique) (tableau n°4), est comprise entre 4 jours pour le point 10' et 8 jours pour le point 10 pfu. Il existe une relation entre la quantité de virus inoculée dans la flacon de culture et le délai de positivité. Le seuil de positivité est de 10 pfu/flacon de culture.
L'apparition de l'ECP est simultanée à celle de l'antigène Hexon (Test ELISA). Pour aucune des dilutions étudiées, la positivité de l'ELISA ne précède celle de l'ECP.
Pour la PCR hexon (tableau n° 4), les valeurs de Ct pour les témoins négatifs (T) sont légèrement positifs (37,6-37,8). Ce résultat peut s'expliquer, soit par une légère contamination par aérosols au moment de l'inoculation des flacons de culture, soit par une légère contamination au moment de l'extraction. La première hypothèse semble être plus probable puisque à J10, les valeurs de Ct sont passées à 31,2 (différence de 6,5 Ct) ce qui représente une augmentation d'un facteur 100 du nombre de copies d'adénovirus. La méthode PCR hexon de l'invention montre l'existence d'une multiplication virale (diminution significative du Ct) en l'absence d'ECP et de détection de l'antigène Hexon.
Suivant les dilutions testées, la méthode PCR hexon de l'invention met en évidence de manière tout à fait surprenante de 2 à 4 "vagues" de multiplication virale.
Clairement ces résultats démontrent que la méthode PCR hexon de l'invention se positive plus tôt que l'ECP ou l'ELISA hexon. Aussi, la méthode PCR hexon conforme à la présente invention est au minimum 10 fois plus sensible que les tests de culture cellulaire classiques (culture de 10 jours + test ELISA).
Ces résultats pour le moins inattendus obtenus avec la méthode PCR hexon de l'invention peuvent être mis à profit notamment pour connaître de manière aisée et rapide le temps d'un cycle viral et son niveau d'amplification. Ces deux derniers paramètres sont très importants pour évaluer les performances réplicatives d'un virus.
En conséquence, la méthode PCR hexon selon l'invention peut contribuer avantageusement à la sélection de candidats vecteurs en vue d'applications biotechnologiques, notamment dans l'expression et / ou la thérapie génique.
Exemple 5 : Répétabilité et reproductibilité de la méthode selon l'invention.
Les résultats des 101 standards évalués en PCR hexon (tableau n° 5) permet de déterminer à la fois la répétabilité (répétition intra-tests) et la reproductibilité (répétition inter-tests). La moyenne des valeurs Ct pour 1 pfu est de 37,2 ± 1,8. Ce niveau de variation est relativement faible surtout qu'il est le résultat de la variation de deux étapes : l'extraction et la PCR hexon.
Pour les valeurs de Ct pour 10 pfu (non montrées) la moyenne est de 33,7 ± 1,7. Le niveau de variation est très similaire puisque les écarts obtenus sont très proches. On peut noter que la différence de Ct entre les 2 moyennes obtenues avec 1 pfu et 10 pfu est de 3,5 Ct. Cette différence correspond effectivement à un écart d'un facteur 10 en nombre de cibles.
Exemple 6 : Prélèvements cliniques
Des prélèvements cliniques ont été testés, avec des extractions indépendantes et dans des séries de PCR hexon différentes. Les résultats de la PCR hexon (valeurs Ct) de 8 plasmas et 20 urines sont présentés dans le tableau n° 6.
En général lorsque les valeurs de Ct sont inférieures ou égales à 36, les variations de Ct pour un même extrait d'acides nucléiques (Ctl et Ct2) dépassent rarement la valeur de 1 Ct (facteur 2 pour la quantification). C'est pour cette raison que tous les prélèvements avec des valeurs de Ct < à 36 sont considérés comme quantifiables (statut « positif-quantifiable) et entre 36 et 43 les prélèvements sont considérés comme positifs mais non quantifiables (statut positif-détectable).
Pour les plasmas (tableau n° 6), au sein d'un même extrait d'acides nucléiques, il y a rarement un écart de plus de 1 Ct excepté pour l'extrait n° 1 du plasma n° 3289 et l'extrait n° 3 du plasma n° 3579. Dans ce dernier cas, la valeur de 44,6 pour le Ctl est aberrante. Bien entendu, au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est plus importante mais dépasse rarement une valeur de 2 Ct (facteur 4 pour la quantification).
Pour les urines (tableau n° 6), au sein d'un même extrait d'acides nucléiques, il n'y a pas plus de 1 Ct d'écart excepté lorsque les valeurs de Ct sont supérieures à 36. En effet, pour des valeurs de Ct supérieures à 36, le niveau de positivité est assez faible ce qui explique un niveau de variation plus élevé.
Au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est également plus importante ne dépassant que rarement une valeur de 2 Ct entre deux extraits différents excepté pour l'urine n° 2403 qui a une différence de 3 Ct (facteur 8 en quantification). Bien entendu, certaines urines (n° 2029, 2626, 3736, 3763, 3765 et 5399) ont des valeurs de Ct très élevées (en général > à 40) démontrant une très faible positivité. Dans ces derniers cas, on comprend qu'il est possible de passer facilement d'un signal positif à un signal négatif (Ct = 50).
Globalement, les résultats sur les prélèvements cliniques de la méthode de détection PCR hexon conforme à l'invention, montrent une très bonne reproductibilité (pour les valeurs de Ct) lorsque la positivité est assez élevée (Ct < à 36, statut « positif- quantifiable »). Pour les valeurs de Ct > à 36 et jusqu'à 43, on peut considérer que la cible est bien présente (positive) mais le niveau de variation est trop élevé pour donner une valeur de quantification fiable. Exemple 7 : Linéarité de la quantification
La courbe standard est générée habituellement à l'aide de 12 points de 1 à 105 pfu par réaction PCR testés en double. Pour chaque répétition, les courbes d'amplification et les valeurs de cycle PCR sont très reproductibles (voir figure). Par contre, en point final, les signaux de fluorescence sont très variables (jusqu'à un facteur 10), d'où l'intérêt d'analyser les produits de PCR au moment de l'apparition du signal (cycle PCR: Ct) et non en point final comme en PCR "classique".
La courbe standard obtenue avec ces points standards est présentée sur la figure. Le coefficient de corrélation de 0,999 indique une excellente linéarité. Dans l'immense majorité des cas, ce coefficient se situe entre 0,98 et 1. Des manipulations utilisant une gamme standard plus large (0,5 à 106 pfu) ont montré des coefficients de corrélation similaires (non montrés) confirmant ainsi les informations du fournisseur décrivant une linéarité de quantification sur plus de 6 logarithmes.
La valeur "Y-intercept" représente le nombre de cycles PCR déduit par la courbe standard pour détecter un pfu d'Ad5CMVp5J. Suivant les courbes standards, cette valeur Ct se trouve entre 35 et 39.
La valeur de la pente (Slope) est en liaison avec le rendement de la PCR. On rappelle que pour une PCR à 100% de rendement, cette valeur doit être de - 3,22. Pour la méthode PCR hexon conforme à l'invention, la valeur de la pente se situe entre - 3,4 à - 3,9 représentant un rendement moyen de 90%.
Exemple 8 : Quantification sur prélèvements cliniques : Les exemples de quantification obtenue avec la PCR hexon sur les prélèvements cliniques (tableau 7) ont été sélectionnés sur deux principaux critères. Le premier critère est que le prélèvement a été analysé par deux extractions en série de PCR totalement indépendantes (voir tableau 6). Le deuxième critère est que les résultats de PCR ont des valeurs de Ct inférieures ou égales à 36 correspondant bien à un statut quantifiable pour le prélèvement. Six prélèvements cliniques répondent à ces deux critères (tableau 7). Les résultats de quantification sont très reproductibles et le niveau de variation dépasse rarement un facteur 2 pour un même prélèvement (tableau 7). Il est particulièrement intéressant de noter pour l'urine n° 2403 qu'une différence de 3 Ct (en théorie cela représente un facteur 8 pour la quantification) entre les deux extractions ne se répercute pratiquement pas sur les valeurs de quantification déterminées par la PCR hexon. Cet exemple démontre l'intérêt des calibrateurs extraits en parallèle qui permettent de réajuster la quantification en fonction des petites fluctuations des PCR (seuil de détection légèrement différent, conditions d'extraction légèrement différentes...).
Tableau n° 1 : Techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus provenant de différents types d'échantillons.
Tableau 1 (suite)
Tableau 2 : Conditions de mise en oeuvre de la réaction
Tableau 3 : Délai d'apparition de l'ECP (j°urs)-* valeur de la DO en Elisa, valeur de Ct (PCR hexon) et du titre en HPLC après inoculation sur cellules A549 d'un surnageant de cellules MRC5 récolté après infection avec des adenovirus sauvages de la collection.
ECP : Effet cytopathique. Elisa + si DO > 0,171. Tableau 4 (suite)
lc,c ligne ECP : Effet cytopathique 2cmc ligne Elisa (Elisa+ si DO>0,171) 3"™ et 4α"c lignes Ctl et Ct2 PCR hexon ND : Not Done (non fait) ; T .témoin
Tableau 5 : Valeurs Ct obtenues avec 1 pfu d'Ad5CMV 7J3 dans la réaction PCR (101 tests).
Tableau 5 (suite)
Tableau 5 (suite)
a : NEG .Négatif, Ct = 50. b : ND :Not Done (non fait). Tableau 6 : Résultats de la PCR hexon avec deux collections de prélèvements cliniques lasma et urines) a ant eu deux ou trois extractions indé endantes.
a: Ext : Extraction. Le chiffre indique le nombre d'extractions faites sur le même prélèvement, b: NA : Non Applicable ; c: Ct = 50 : PCR négative, d: Chaque extrait est testé dans 2 réactions PCR, Ct 1 pour l'essai 1 PCR et Ct 2 pour l'essai
2 PCR. Tableau 7 : Quantification à l'aide de la PCR hexon avec des prélèvements cliniques quantifiables.
a: La moyenne a été calculée à partir des valeurs de Ct indiquées dans le tableau 6. b: Le standard utilisé est connu en nombre de pfu d'Ad5CMVp.53. Cette quantification est rapportée par millilitre de prélèvements cliniques de départ.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection et / ou de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon biologique dans lequel : - une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifiée par PCR en temps réel à l'aide d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, et - le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde non dégénérée, constituée d'au moins un oligonucléotide présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification.
2. Oligonucléotide présentant la séquence SEQ ID N°l suivante: 5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C.
3. Amorce HEXl caractérisé en ce qu'elle comprend au moins deux oligonucléotides d'au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, avec ladite séquence
5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C.
4. Oligonucléotide présentant la séquence SEQ ID N°2 suivante: 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T.
5. Amorce HEX2 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins deux oligonucléotides d'au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec ladite séquence : 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T.
6. Amorce selon l'une des revendications 3 et 5 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins trois oligonucléotides.
7. Oligonucléotide selon l'une des revendications 2 et 4 caractérisé en ce qu'il comprend entre 15 et 30 nucleotides.
8. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec ladite séquence :
5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.
9. Oligonucléotide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend 20 et 35 nucleotides.
10. Sonde HEX caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide selon l'une des revendications 8 et 9.
11. Sonde selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle comporte une molécule ou un système de molécules révélateur.
12. Sonde constituée par la molécule suivante :
5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
13. Oligonucléotides présentant une séquence complémentaire de celles des oligonucléotides selon l'une des revendications 2, 4 et 7.
14. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à l'aide d'amorces sens et anti-sens respectivement selon l'une des revendications 3, 5 et 6.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 et 14 caractérisé en ce qu'il comprend une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes :
- séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon,
- hybridation de la sonde,
- hybridation avec les amorces, et - élongation avec une polymerase.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 14 et 15 caractérisé en ce que la produit d'amplification est détecté par hybridation avec la sonde selon l'une des revendications 10 à 12.
17. Kit de réactifs pour réaction d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces selon l'une des revendications 3 et 5 et une sonde selon l'une quelconque des revendications 10 à
12.
18. Procédé de diagnostic du sérotype d'adénovirus présent dans un échantillon à tester consistant à mettre en oeuvre une procédé selon l'une des revendications 1, 14 et 15 puis à séquencer le produit PCR obtenu.
19. Procédé de sélection d'adénovirus utiles comme candidats vecteurs comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 14 et 15.
EP01907728A 2000-02-08 2001-02-07 Procede de detection et de quantification d'adenovirus Withdrawn EP1257672A2 (fr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0001554A FR2804692B1 (fr) 2000-02-08 2000-02-08 Procede de detection et de qualification d'adenovirus
FR0001554 2000-02-08
US22791200P 2000-08-28 2000-08-28
US227912P 2000-08-28
PCT/FR2001/000362 WO2001059163A2 (fr) 2000-02-08 2001-02-07 Procede de detection et de quantification d'adenovirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1257672A2 true EP1257672A2 (fr) 2002-11-20

Family

ID=26212158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP01907728A Withdrawn EP1257672A2 (fr) 2000-02-08 2001-02-07 Procede de detection et de quantification d'adenovirus

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6541246B2 (fr)
EP (1) EP1257672A2 (fr)
JP (1) JP2003522535A (fr)
KR (1) KR20020089343A (fr)
CN (1) CN1406285A (fr)
AU (2) AU2001235626B2 (fr)
CA (1) CA2399364A1 (fr)
HU (1) HUP0204549A3 (fr)
IL (1) IL151092A0 (fr)
MX (1) MXPA02007587A (fr)
NZ (1) NZ520661A (fr)
RU (1) RU2272845C2 (fr)
WO (1) WO2001059163A2 (fr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040161767A1 (en) * 2002-06-28 2004-08-19 Baldwin Brett R. Detection and quantification of aromatic oxygenase genes by real-time PCR
US20070099177A1 (en) * 2002-11-14 2007-05-03 Heim Albert R Agents and methods for detecting human adenoviruses
US7332280B2 (en) * 2003-10-14 2008-02-19 Ronald Levy Classification of patients having diffuse large B-cell lymphoma based upon gene expression
WO2006031859A2 (fr) 2004-09-14 2006-03-23 Ceres Inc. Modulation de la teneur des plantes en acides amines et sucres
WO2006063376A1 (fr) * 2004-12-17 2006-06-22 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung Methode de detection d'adenovirus
WO2007035814A2 (fr) * 2005-09-20 2007-03-29 Advandx, Inc. Reactifs, methodes et trousses destines a la classification de champignons et a l'application d'un traitement antifongique
US20080293610A1 (en) 2005-10-12 2008-11-27 Andrew Shaw Use and production of storage-stable neutral metalloprotease
WO2008048269A2 (fr) * 2005-10-20 2008-04-24 Combimatrix Corporation Microréseau pour identification d'agents pathogènes
US20090098126A1 (en) * 2006-06-15 2009-04-16 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method and kit for the detection of adenoviruses
WO2011103159A2 (fr) 2010-02-16 2011-08-25 Becton, Dickinson And Company Dosage pour la détection de sérotypes étroitement apparentés du papillomavirus humain (hpv)
RU2511043C2 (ru) * 2012-07-02 2014-04-10 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк аденовируса серотипов 3,4,7,14,21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции
CN103725800B (zh) * 2014-01-15 2015-03-11 湖南圣维尔医学检验所有限公司 一种人腺病毒检测试剂盒
CN105586439B (zh) * 2016-01-27 2020-12-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种检测b、e型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法
JP7751623B2 (ja) * 2023-11-16 2025-10-08 合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所 アデノウイルス定量用キット及びアデノウイルス定量方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997025432A2 (fr) * 1996-01-11 1997-07-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Mutants ameliores de (2,5 dkg) reductase

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3709211B2 (ja) * 1994-06-08 2005-10-26 株式会社三菱化学ビーシーエル アデノウイルスの検出及び鑑別方法並びにそれに用いるオリゴヌクレオチド及びｄｎａ断片
DE19716456C2 (de) * 1997-04-21 2002-05-08 Schmitt Heinz Josef Verwendung einer Kombination von Primern zum Nachweis von Erregern von Infektionskrankheiten
DE19816902A1 (de) * 1998-04-16 1999-10-28 Wilhelm Krone SREBP-1 und SREBP-2 in phosphorylierter Form

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997025432A2 (fr) * 1996-01-11 1997-07-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Mutants ameliores de (2,5 dkg) reductase

Also Published As

Publication number Publication date
CA2399364A1 (fr) 2001-08-16
CN1406285A (zh) 2003-03-26
RU2272845C2 (ru) 2006-03-27
HUP0204549A2 (hu) 2003-04-28
RU2002123871A (ru) 2004-03-10
NZ520661A (en) 2004-06-25
IL151092A0 (en) 2003-04-10
US20020061516A1 (en) 2002-05-23
KR20020089343A (ko) 2002-11-29
WO2001059163A2 (fr) 2001-08-16
HUP0204549A3 (en) 2005-09-28
JP2003522535A (ja) 2003-07-29
US6541246B2 (en) 2003-04-01
MXPA02007587A (es) 2003-01-28
WO2001059163A3 (fr) 2002-02-14
AU2001235626B2 (en) 2006-10-19
AU3562601A (en) 2001-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Reslova et al. xMAP technology: applications in detection of pathogens
Brechtbuehl et al. A rapid real-time quantitative polymerase chain reaction for hepatitis B virus
Herrmann et al. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA)
CA2059657C (fr) Procede de detection d&#39;une sequence nucleotidique selon la technique d&#39;hybridation sandwich
EP1257672A2 (fr) Procede de detection et de quantification d&#39;adenovirus
Xiang et al. Isothermal detection of multiple point mutations by a surface plasmon resonance biosensor with Au nanoparticles enhanced surface-anchored rolling circle amplification
Wang et al. Saltatory rolling circle amplification (SRCA): a novel nucleic acid isothermal amplification technique applied for rapid detection of Shigella spp. in vegetable salad
JP2004536282A (ja) 胃がん患者の血清中の、血中を循環するエプスタイン・バーウイルスｄｎａ
Watanabe et al. Detection of adenovirus DNA in clinical samples by SYBR Green real‐time polymerase chain reaction assay
Wu et al. Detection of five types of HPV genotypes causing anogenital warts (Condyloma Acuminatum) Using PCR-Tm analysis technology
CN111676272A (zh) 基于Cas12a/crRNA的食源致病菌检测方法
Chen et al. From lab to field: Innovative RPA‒CRISPR/Cas12a platform for early short-beak and dwarfism syndrome virus nucleic acids detection
JP2011078358A (ja) ノロウイルスの検出方法
CN113999901B (zh) 心肌特异性甲基化标记物
JP4851090B2 (ja) ヒト・パピローマウイルスを定量的且つ定性的に測定するための方法及びキット
Li et al. Rapid detection of grass carp reovirus type 1 using RPA-based test strips combined with CRISPR Cas13a system
Mu et al. Establishment of triple-RPA-LFS detection method for three common shrimp viruses
Zhang et al. Multiple thermocycles followed by LAMP with only two primers for ultrasensitive colorimetric viral RNA testing and tracking at single-base resolution
Wang et al. Application of 2D polymerase chain reaction for single-tube detection of high-risk human papillomaviruses
CN118147329A (zh) 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒及应用
Saulnier et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of p53 recombinant adenovirus in clinical samples from patients treated with Ad5CMV-p53 (INGN 201)
FR2804692A1 (fr) Procede de detection et de qualification d&#39;adenovirus
Ready et al. Development and validation of a quantitative PCR assay for detection of Sulawesi tortoise adenovirus
JP2022053961A (ja) ＴＲＥＣｓの改良測定方法およびそれを用いた重症複合免疫不全症のスクリーニング方法
KR20230097514A (ko) 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20020909

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI PAYMENT 20020909

17Q First examination report despatched

Effective date: 20040517

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

GRAS Grant fee paid

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20070105