EP1257672A2 - Method for detecting and quantifying adenovirus - Google Patents

Method for detecting and quantifying adenovirus

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Publication number
EP1257672A2
EP1257672A2 EP01907728A EP01907728A EP1257672A2 EP 1257672 A2 EP1257672 A2 EP 1257672A2 EP 01907728 A EP01907728 A EP 01907728A EP 01907728 A EP01907728 A EP 01907728A EP 1257672 A2 EP1257672 A2 EP 1257672A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
pcr
adenovirus
probe
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01907728A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Michel Vidaud
Eric Gautier
Patrick Saulnier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Institut Gustave Roussy (IGR)
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0001554A external-priority patent/FR2804692B1/en
Application filed by Institut Gustave Roussy (IGR), Aventis Pharma SA filed Critical Institut Gustave Roussy (IGR)
Publication of EP1257672A2 publication Critical patent/EP1257672A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method of detection and quantification in various biological media of adenovirus nucleic acids by the real-time measurement of polymerase chain reaction (PCR). It further relates to oligonucleotides for the implementation of this process.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Adenoviruses which are naturally responsible for generally mild infections, are among the vectors used because of their many advantages.
  • This method is therefore intended to identify subgroups and serotypes and not to detect and quantify all of the adenoviruses present in a sample.
  • the sensitivity of this method is low and therefore unsuitable for precise dosages, such as those required when monitoring patients treated by gene therapy.
  • Crawford-Miksza et al. Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp. 1107-1 1 12
  • nine separate primers are described.
  • the present invention therefore aims to solve these problems by providing a sensitive technique and making it possible to detect the majority of adenovirus serotypes.
  • the applicants have surprisingly shown that such advantages are obtained by amplifying in real time a determined sequence of DNA coding for hexon, using primers having a limited degeneration, and by highlighting the product. amplification using a non-degenerate probe.
  • the present invention relates first of all to a method for detecting and / or quantifying adenovirus nucleic acids in a biological sample in which:
  • an adenovirus nucleotide sequence is amplified by real-time PCR using a pair of degenerate sense and antisense primers, consisting of mixtures of oligonucleotides having at least 80% homology with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the sequence of the adenovirus type 5, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, and
  • the product of the amplification reaction is detected using a non-degenerate probe, consisting of one or more oligonucleotides having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the adenovirus type 5 sequence, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, during a sufficient number of cycles to allow obtaining a measurable amount of amplification product.
  • a non-degenerate probe consisting of one or more oligonucleotides having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the adenovirus type 5 sequence, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, during a sufficient number of cycles to allow obtaining a measurable amount of amplification product.
  • Real-time PCR is understood to mean any amplification technique making it possible to follow the progress of the amplification reaction in progress.
  • the sequences of the primers and / or of the probe have homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 540 and 780 of the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence.
  • the two primers are respectively chosen on the sense and antisense strands, and so as to allow the amplification of a DNA fragment.
  • the probe is chosen so as to hybridize with the DNA fragment resulting from the amplification.
  • the PCR primers in accordance with the present invention used to amplify the target adenovirus nucleic acid of a sample are located in a constant zone for the hexon gene of human adenoviruses and the site of hybridization of the probe in accordance with the present invention lies between the two primers.
  • the adenoviruses are human tropism.
  • said oligonucleotides comprise at least 15 nucleotides and the probe has a theoretical melting temperature Tm approximately 10 ° C. ⁇ 0.5 higher than the theoretical Tm of the primers.
  • Tm melting temperature
  • the amplification product is preferably hybrid to the HEX probe described below.
  • the subject of the present invention is in particular an oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1 below or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably of 90% and even more preferably 95%, with said sequence:
  • said oligonucleotide comprises between 15 and 30 nucleotides.
  • the present invention further relates to a sense primer HEX1 consisting of a mixture of oligonucleotides meeting this definition.
  • the primer HEX1 exhibits three degenerations in position 1, 10 and 19 making it possible to cover the majority of the serotypes.
  • the present invention also relates to a second oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 2 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably 90% and even more preferably 95%, with said sequence:
  • said oligonucleotide comprises between 15 and 30 nucleotides.
  • the present invention further relates to a HEX2 antisense primer consisting of a mixture of oligonucleotides meeting this definition.
  • the primer HEX2 has three degenerations in position 6, 9 and 21 making it possible to cover the majority of the serotypes sequenced.
  • said primers comprise at least two oligonucleotides, and even more preferably three or four oligonucleotides.
  • the positions of the sequences SEQ ID N ° 1 and 2, located in the 3 ′ part of the ORF coding for the protein Hexon, are, taking as reference the complete sequence of the adenovirus type 5 (deposit number M73260) , respectively 21565 (HEX1) and 21656 (HEX2). They correspond to positions 21048 and 21139 of the sequence Ad5CMVp53 (length 35308 bp).
  • the concentration of the primers is a critical parameter of real-time PCR. As a result, the degeneration of the primers HEX1 and HEX2 was limited.
  • the present invention further relates to a third oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 3 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably 90% and even more preferably 95%, with said sequence, or with a sequence complementary to said sequence:
  • said oligonucleotide comprises between 20 and 35 nucleotides.
  • the present invention further relates to a HEX probe comprising at least one oligonucleotide having this sequence.
  • the probe comprises a molecule or a revealing system of molecules.
  • Said revealing system preferably consists of a reporter dye and a fluorescence quenching dye, respectively attached to the 5 ′ and 3 ′ ends of the probe.
  • the revealing system is constituted by the pair "reporter / quencher ”represented by 6-carboxyfluorescein (FAM) and 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) fixed respectively 5 'and 3' of the probe.
  • FAM 6-carboxyfluorescein
  • TAMRA 6-carboxytetramethylrhodamine
  • a particularly preferred probe according to the invention consists of: 5 'FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
  • Such a revealing system can also be a so-called “tailing” revealing system.
  • "Tailing” consists of including at one end of the probe a tail (tail) which can self-pair. This auto-pairing is highlighted using a marker which is specifically fixed on the sequence in this configuration. If there is a target, there is a mismatch and a signal is emitted. In the absence of target the signal is not emitted.
  • Other revealing systems can also be used.
  • the sense and antisense primers may include a molecule or a developer molecule system.
  • the PCR product obtained by the method which is the subject of the present invention using the primers of sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 preferably has a size of 1 14 bp and has a% GC of approximately 58.8%.
  • the polymerase preferably used in the present invention is Taq polymerase, but it can be any other enzyme exhibiting polymerase activity and usable under the operating conditions of PCR.
  • the present invention also relates to a reagent kit for amplification reaction of the real-time PCR type for detection of adenovirus, characterized in that it comprises a pair of sense and antisense primers and a probe as described. above.
  • Said kit advantageously further comprises two negative controls and two positive controls.
  • the present invention further relates to a PCR method for the detection and / or quantification of adenovirus in a test sample capable of containing it, characterized in that it consists of a real-time PCR using a kit according to the invention.
  • said two positive controls are extracted in parallel with a series of samples to be assayed and consist of a standard consisting of a purified and titrated adenovirus solution and a calibrator adapted to the type of sample to be assayed.
  • the method according to the invention finds an advantageous application in the detection and / or in the quantification of adenoviruses present in samples of suspension or supernatant type from culture, plasma, urine, oropharyngeal washings, lymphocytes, seminal fluids, tumor biopsies or no, rectal swabs, faeces, ascites.
  • the present invention also relates to a method of selecting adenoviruses useful as vector candidates by evaluation of the replicative performance of adenoviruses by application of a detection and / or quantification method according to the invention to the monitoring of kinetics of adenoviral multiplication.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing the adenovirus serotype present in a test sample consisting in implementing a method of the invention and then in sequencing the PCR product obtained.
  • the nucleotide sequences of the various serotypes encoding the Hexon protein were obtained from databases or were sequenced.
  • the serotypes Ad3, Ad7, Ad 12, Ad 14, Ad 16 and Ad21 have an A residue at position 9 of the HEX probe.
  • the serotypes Ad5, Adl, Ad2, Ad6, Adl3, Ad40 and Ad48 have a residue at this same position G while the serotypes Ad4 and Ad41 have a residue C.
  • the type A sequence is more common than the type C sequence.
  • a / C mismatches (Ad5CMNp5i and serotypes 5, 1, 2, 6, 13, 40 and 48) or A / G (serotypes 4 and 41) result in a decrease in the Rn delta without significant modification of the Ct (Rn delta is the difference in fluorescence detected between the measured fluorescence of the background noise and the detected fluorescence of the test sample; Ct is defined as the number of fractional cycles in which the fluorescence generated by cleavage of the probe significantly exceeds - generally 10 times - background noise).
  • Serotypes Ad5, Ad4, Ad 12 and Ad 14 and Ad5CMV / 53 show additional differences in position o 5 for serotype Ad5 and Ad5CMV 75J o 24 for serotypes Ad4 and Adl2 o 3, 12 and 19 for Adl4 serotype
  • One of the advantages of the present method of detecting and / or quantifying human adenoviruses compared to the methods described in the prior art is a remarkable detection sensitivity with a detection threshold of 10 particles or 1 pfu ( range unit) by PCR reaction.
  • Another advantage lies in the universality of the method since 17 different serotypes of human adenoviruses, representative of all of the subgroups A to F, could be detected and quantified.
  • the analysis of the PCR products is carried out directly at the end of the PCR cycles by reading the fluorescence obtained during the cycles. It is therefore not necessary to work with PCR products which are at risk of contamination for subsequent analyzes.
  • the quantification of the number of targets initially used in the reaction is very reliable and reproducible.
  • the detection of the PCR product is done during PCR cycles using a fluorescent probe. This is necessary to detect the PCR product and takes place in the full exponential phase of PCR and not at the end point; this detection principle is therefore more sensitive and more specific.
  • Another advantage lies in the fact that non-specific amplifications are avoided, thanks to the “hot start” principle, real-time PCR being carried out in the presence of a thermostable DNA polymerase which activates at the first denaturation.
  • the present invention is illustrated by nonlimiting examples and with reference to the appended figure which represents a standard curve of a hexon PCR method according to the invention.
  • Ad2 and Ad5 Some titrated wild adenoviruses (Ad2 and Ad5) come from UMR No. 1592 (Emmanuelle Vigne, Vectorology and Gene Transfer Unit, Gustave-Roussy Institute).
  • the Ad5CMV /? 55 titrated comes from the Production Unit of RPR Gencell, Vitry (Didier Faucher). The titles are provided in number of pfu (“plaque forming unit”). This unit will remain the reference unit for quantification.
  • the cell line 293 comes from ATCC (CRL 1573).
  • the cell line A549 (ATCC: CCL 185) was kindly provided by E. Vigne and A. Fallourd, RPR Gencell.
  • the MRC5 cell line comes from bioMérieux (ref. 84002, France).
  • Clinical samples • The clinical samples (plasma, urine, oropharyngeal lavage, faeces) come either from healthy volunteers or from patients hospitalized at the Gustave-Roussy Institute.
  • Some plasmas come from the Transfusion Center, either by purchasing a bag from around 200 donors, or bags that can no longer be used for medical use.
  • Adenovirus collections and clinical samples are transported in dry ice and, upon receipt, stored at -80 ° C.
  • Cookies and switchboard There are two types of negative cookies:
  • a negative control PCR or NTC (non template control) which consists of the PCR buffer with distilled water (without target). The value of Ct must be 50 since 50 PCR cycles are performed.
  • the second type of negative control is the negative extraction control which is put in place from the extraction stage. In general, it consists of 200 ⁇ l of physiological water and it is extracted in parallel with a series of extracts (generally 1 in 10). The value of Ct must also be 50. There are two types of positive "controls":
  • the standard which consists of a purified and titrated adenovirus solution ( ⁇ 5.10 3 pfu), is extracted in parallel with a series of samples to be assayed.
  • the nucleic acid extract is diluted (generally 10 to 10) to constitute the different standard points for the construction of the standard curve (Figure).
  • the second type of positive control is the calibrator.
  • calibrators There are different types of calibrators depending on the type of samples to be diagnosed. It consists of 200 ⁇ l medium closest to the sample and a known amount of adenovirus lying in the middle of the standard range (in general 5.10 3 pfu).
  • the media used for the manufacture of the calibrators are physiological water for oropharyngeal washes, a "pool" of plasma from 200 healthy donors for plasmas, urine from healthy subjects for urine and fresh culture medium. for culture supernatants. These calibrators verify that the extraction technique is correct. The quantization value compared to the expected theoretical value will allow, by simple rule of three, to readjust the final quantification obtained with the samples to be tested.
  • a CDD camera collects fluorescence emissions approximately every 6 seconds for each well.
  • S.D.S. Sequence Detector System TM
  • the quantification is based on the principle of real-time PCR. Indeed, the PCR product is characterized by the moment of the PCR cycle when the amplification is detectable by the degradation of the probe linked to the accumulation of PCR products. The higher the number of target starting copies, the fewer PCR cycles it will take to detect a significant increase in fluorescence.
  • the number of target copies of a sample is quantified by measuring the Ct value and using a standard curve ( Figure).
  • Figure if the PCR works at 100%, it takes 3.22 PCR cycles (Ct) to multiply by 10 the number of targets. In general, a factor of 10 of the number of targets gives a difference in Ct values between 3.4 to 3.6.
  • the second parameter (Delta Rn) is important to check to confirm the positivity of the PCR signal.
  • the Rn delta is the difference in fluorescence detected between the measured fluorescence of the background noise (generally measured between cycle 3 and cycle 15 of the PCR on the entire plate) and the detected fluorescence of the sample to be analyzed.
  • RNA Isolation Kit All the reagents used for this preparation come from the kit called High Pure RNA Isolation Kit, and marketed by Boehringer / Roche. To prepare this sample proceed as follows:
  • washing buffer I Add 500 ⁇ l of washing buffer I and centrifuge for 1 min. at 8,000 rpm.
  • the nucleic acid extracts are stored at 4 ° C until the PCR step.
  • n ° 1 illustrating the extraction techniques optimized for the detection of adenovirus coming from different types of samples including that of the present example.
  • concentrations of all the reagents used in the amplification reactions in particular the concentrations of primers sense “HEX1”, antisense “HEX2”, probe “HEX”, and MgCl ; and other reagents of the TaqMan TM PCR Core Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) are given in table 2.
  • the standard curve of a PCR detection method according to the invention is shown in the figure.
  • One of the applications of the hexon PCR method according to the invention is the detection of adenovirus in culture supernatants.
  • the presence of an adenovirus in cell culture is conventionally visualized by a cytopathic effect in the cell layer.
  • a cytopathic effect is due to an adenovirus an antigen specific to the adenovirus is detected (by ELISA, eg Ref. K6021, Dako Diagnostic LTD, Denmark House, England).
  • Extracts of nucleic acids from the main cell lines (Hep2, MRC5, 293 and A549, described above in the “materials and methods” section) used for the cellular diagnosis of human adenoviruses were tested to verify the negativity in PCR hexon according to the present invention. All DNA extracts evaluated were negative demonstrating the specificity of detection.
  • Ad40 has a mismatch for the HEX2 antisense primer of the invention and a mismatch for the HEX probe of the invention.
  • the hexon gene sequence for serotype 18 is not available. It is likely that these results obtained with Adl ⁇ are also due to mismatches.
  • Example 3 Sensitivity of the Method According to the Invention 3.1. Estimation of the detection threshold in number of particles.
  • Table 3 presents the results of the 17 adenovirus serotypes with Ct values obtained as a function of the number of particles per ml measured by the HPLC technique.
  • the Ct values are in the range of 8.1 to 9.1 for a number of particles from 1.1 to 8.5.10'7ml .
  • the detection threshold can be estimated from 10 to 80 particles per PCR reaction.
  • 25 cm 2 culture flasks of cells were infected with adenovirus dilutions of between 10 3 and 1 pfu.
  • the culture medium (5 ml) was removed, the cells were infected with different concentrations of virus in a volume of 2 ml for 2 hours (at 37 ° C). After two hours, the medium was changed. After infection, every day (D0 to Dl 1), the culture flasks were removed: 250 ⁇ l for the ELISA test (detection of Hexon antigen) and 200 ⁇ l for the detection of PCR according to the invention. 450 ⁇ l of fresh medium were reintroduced into the culture flask.
  • the appearance of the CPE (cytopathic effect) (table 4) is between 4 days for the 10 'point and 8 days for the 10 pfu point. There is a relationship between the amount of virus inoculated in the culture flask and the time to positivity.
  • the positivity threshold is 10 pfu / culture flask.
  • the Ct values for the negative controls (T) are slightly positive (37.6-37.8). This result can be explained either by slight aerosol contamination at the time of inoculation of the culture flasks, or by slight contamination at the time of extraction. The first hypothesis seems to be more likely since on D10, the values of Ct increased to 31.2 (difference of 6.5 Ct) which represents an increase by a factor of 100 in the number of copies of adenovirus.
  • the hexon PCR method of the invention shows the existence of a viral multiplication (significant decrease in Ct) in the absence of PCE and detection of the Hexon antigen.
  • the hexon PCR method of the invention reveals, in a completely surprising manner, from 2 to 4 "waves" of viral multiplication.
  • the hexon PCR method of the invention is positive sooner than the ECP or the ELISA hexon. Also, the hexon PCR method conforms to the present invention is at least 10 times more sensitive than conventional cell culture tests (10-day culture + ELISA test).
  • the hexon PCR method according to the invention can advantageously contribute to the selection of vector candidates for biotechnological applications, in particular in gene expression and / or therapy.
  • Example 5 Repeatability and reproducibility of the method according to the invention.
  • the variation in Ct is also greater, rarely exceeding a value of 2 Ct between two different extracts except for urine No. 2403 which has a difference of 3 Ct (factor 8 in quantification).
  • some urines nos. 2029, 2626, 3736, 3763, 3765 and 5399
  • the standard curve is usually generated using 12 points of 1 to 10 5 pfu per PCR reaction tested in duplicate. For each repetition, the amplification curves and the PCR cycle values are very reproducible (see figure). On the other hand, as a final point, the fluorescence signals are very variable (up to a factor of 10), hence the advantage of analyzing the PCR products at the time of the appearance of the signal (PCR cycle: Ct) and not at the end point as in "classic" PCR.
  • the standard curve obtained with these standard points is shown in the figure.
  • the correlation coefficient of 0.999 indicates excellent linearity. In the vast majority of cases, this coefficient is between 0.98 and 1.
  • Manipulations using a wider standard range 0.5 to 10 6 pfu have shown similar correlation coefficients (not shown) thus confirming the supplier information describing a linearity of quantification on more than 6 logarithms.
  • Y-intercept represents the number of PCR cycles deduced by the standard curve to detect an Ad5CMVp5J pfu. According to standard curves, this Ct value is between 35 and 39.
  • the value of the slope is related to the yield of the PCR. It is recalled that for a PCR at 100% yield, this value must be - 3.22. For the hexon PCR method according to the invention, the value of the slope is between - 3.4 to - 3.9 representing an average yield of 90%.
  • Example 8 Quantification on clinical samples: The examples of quantification obtained with the hexon PCR on clinical samples (Table 7) were selected on two main criteria. The first criterion is that the sample was analyzed by two completely independent serial PCR extractions (see Table 6). The second criterion is that the PCR results have Ct values less than or equal to 36 corresponding well to a quantifiable status for the sample. Six clinical samples meet these two criteria (Table 7). The quantification results are very reproducible and the level of variation rarely exceeds a factor of 2 for the same sample (Table 7). It is particularly interesting to note for urine No.
  • Table n ° 1 Optimized extraction techniques for the detection of adenovirus from different types of samples.
  • Table 3 Time to onset of the PCE (day urs) - * OD value in Elisa, Ct value (PCR hexon) and fineness in HPLC after inoculation of A549 cells a supernatant of MRC5 cells harvested after infection with wild adenoviruses from the collection.
  • Table 5 Ct values obtained with 1 pfu of Ad5CMV 7J3 in the PCR reaction (101 tests).
  • a The average was calculated from the values of Ct indicated in table 6.
  • b The standard used is known in number of pfu of Ad5CMVp.53. This quantification is reported per milliliter of initial clinical samples.

Abstract

The invention concerns a method for detecting and quantifying adenovirus by polymerase chain reaction (PCR) amplification. The method enables to detect in a single reaction different serotypes of adenovirus and to quantify very small amounts.

Description

Procédé de détection et de quantification d'adénovirus. Method for detecting and quantifying adenovirus.
La présente invention est relative à un procédé de détection et de quantification dans divers milieux biologiques d'acides nucléiques d'adénovirus par la mesure en temps réel de l'amplification en chaîne par polymerase (PCR). Elle a en outre pour objet des oligonucléotides pour la mise en oeuvre de ce procédé.The present invention relates to a method of detection and quantification in various biological media of adenovirus nucleic acids by the real-time measurement of polymerase chain reaction (PCR). It further relates to oligonucleotides for the implementation of this process.
La thérapie génique connaît actuellement un développement important. Les adenovirus, qui sont naturellement responsables d'infection généralement bénignes, figurent parmi les vecteurs utilisés du fait de leurs nombreux avantages.Gene therapy is currently undergoing significant development. Adenoviruses, which are naturally responsible for generally mild infections, are among the vectors used because of their many advantages.
L'extension du développement clinique de ces vecteurs adénoviraux, à des phases tardives II et Lïï aux fins d'enregistrement et d'autorisation de mise sur le marché, rend nécessaire le développement, la validation et la mise en œuvre de techniques spécifiques et sensibles permettant la mesure de la biodistribution quantitative et qualitative des adénovecteurs dans les divers compartiments biologiques et la détection de l'émergence à faible charge virale d'infection par des contaminants de la production d'adénovecteurs (en particulier adénovecteurs recombinant compétents pour la réplication). Il est en outre nécessaire de détecter les infections intercurrentes adénovirales dues à des virus sauvages de différents serotypes, responsables de la vaste majorité de l'incidence de ces infections naturelles, que ces infections soient florides ou latentes cliniquement. et de déterminer la cinétique virologique de ces infections sauvages, et la signification clinique dans diverses situations, au sein de la population générale ou chez des patients à risques (patients souffrant de cancer, transplantés, immunosupprimés ou immunodéprimés, etc.).The extension of the clinical development of these adenoviral vectors, to late phases II and Lïï for the purposes of registration and marketing authorization, makes necessary the development, validation and implementation of specific and sensitive techniques allowing the measurement of the quantitative and qualitative biodistribution of adenovectors in the various biological compartments and the detection of the emergence at low viral load of infection by contaminants of the production of adenovectors (in particular recombinant adenovectors competent for replication). It is also necessary to detect intercurrent adenoviral infections due to wild viruses of different serotypes, responsible for the vast majority of the incidence of these natural infections, whether these infections are clinically florid or latent. and to determine the virological kinetics of these wild infections, and the clinical significance in various situations, within the general population or in patients at risk (cancer patients, transplant patients, immunosuppressed or immunosuppressed patients, etc.).
La présence d'un adenovirus en culture cellulaire permissive est visualisée, dans les techniques de détection utilisées jusqu'à présent en routine, par un effet cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un adenovirus, on détecte par méthode ELISA un antigène spécifique de l'adénovirus. Des techniques d'amplification d'acides nucléiques extraits d'adénovirus par PCR ont été en outre décrites. Ainsi la demande de brevet japonais JP 07327700 décrit une méthode de type PCR dans laquelle des parties de l'ADN codant pour l'hexon, une protéine de la capside des adenovirus, sont amplifiées. Les produits d'amplification sont mis en « dot blot » puis hybrides avec des sondes spécifiques de chaques serotypes. Cette méthode est donc destinée à identifier les sous groupes et les serotypes et non à détecter et à quantifier l'ensemble des adenovirus présents dans un échantillon. En outre la sensibilité de cette méthode est faible et donc peu adaptée à des dosages précis, tels que ceux requis lors du suivi de patients traités par thérapie génique.The presence of an adenovirus in permissive cell culture is visualized, in the detection techniques hitherto used routinely, by a cytopathic effect in the cell layer. To demonstrate that this cytopathic effect is indeed due to an adenovirus, an antigen specific to the adenovirus is detected by the ELISA method. Techniques for amplifying nucleic acids extracted from adenovirus by PCR have also been described. Thus, Japanese patent application JP 07327700 describes a PCR-type method in which parts of the DNA coding for hexon, a capsid protein of adenoviruses, are amplified. The amplification products are put into “dot blot” then hybridized with specific probes of each serotype. This method is therefore intended to identify subgroups and serotypes and not to detect and quantify all of the adenoviruses present in a sample. In addition, the sensitivity of this method is low and therefore unsuitable for precise dosages, such as those required when monitoring patients treated by gene therapy.
Pring-Akerblom et al. (Journal of Médical Virology, 1999, Vol. 58 , pp. 87-92) ont également décrit une méthode mettant en oeuvre six couples d'amorces dans une même réaction PCR (PCR dite multiplex). L'identification du sous-groupe est faite en déposant les produits de PCR sur gel d'électrophorèse puis en déterminant la taille des produits de PCR.Pring-Akerblom et al. (Journal of Medical Virology, 1999, Vol. 58, pp. 87-92) have also described a method using six pairs of primers in the same PCR reaction (so-called multiplex PCR). The identification of the subgroup is made by depositing the PCR products on electrophoresis gel and then determining the size of the PCR products.
Crawford-Miksza et al. (Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp. 1107-1 1 12) ont décrit une PCR hexon détectant spécifiquement les adenovirus de types 4, 7 et 21 utilisant des amorces consensus comprenant de l'inosine comme base nucléique en cas de mésappariement sur certaine position variable. Dans ce document neuf amorces distinctes sont décrites.Crawford-Miksza et al. (Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp. 1107-1 1 12) described a hexon PCR specifically detecting adenovirus types 4, 7 and 21 using consensus primers comprising inosine as the nucleic base in the event of mismatch on certain variable position. In this document, nine separate primers are described.
Ces techniques antérieures mettent en oeuvre une PCR standard et une méthode d'analyse classique généralement sur gel d'électrophorèse avec ou sans hybridation.These prior techniques use a standard PCR and a conventional analysis method generally on electrophoresis gel with or without hybridization.
Aucune de ces techniques ne permet à la fois de détecter de façon large les adenovirus provenant de la majorité des serotypes connus et d'en quantifier les charges virales avec une sensibilité en adéquation avec les besoins de la thérapie génique notamment.None of these techniques makes it possible both to detect broadly the adenoviruses coming from the majority of known serotypes and to quantify their viral loads with a sensitivity in adequacy with the needs of gene therapy in particular.
La présente invention a donc pour but de résoudre ces problèmes en fournissant une technique sensible et permettant de détecter la majorité des serotypes d'adénovirus. Les demandeurs ont montré de manière surprenante que de tels avantages sont obtenus en amplifiant en temps réel une séquence déterminée de l'ADN codant pour l'hexon, à l'aide d'amorces présentant une dégénérescence limitée, et en mettant en évidence le produit d'amplification à l'aide d'une sonde non dégénérée. La présente invention est tout d'abord relative à un procédé de détection et / ou de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon biologique dans lequel :The present invention therefore aims to solve these problems by providing a sensitive technique and making it possible to detect the majority of adenovirus serotypes. The applicants have surprisingly shown that such advantages are obtained by amplifying in real time a determined sequence of DNA coding for hexon, using primers having a limited degeneration, and by highlighting the product. amplification using a non-degenerate probe. The present invention relates first of all to a method for detecting and / or quantifying adenovirus nucleic acids in a biological sample in which:
- une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifié par PCR en temps réel à l'aide d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire, et- an adenovirus nucleotide sequence is amplified by real-time PCR using a pair of degenerate sense and antisense primers, consisting of mixtures of oligonucleotides having at least 80% homology with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the sequence of the adenovirus type 5, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, and
- le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde non dégénérée, constituée d'un ou plusieurs oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire, durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification.the product of the amplification reaction is detected using a non-degenerate probe, consisting of one or more oligonucleotides having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the adenovirus type 5 sequence, corresponding to the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence, during a sufficient number of cycles to allow obtaining a measurable amount of amplification product.
On entend par « PCR en temps réel » toute technique d'amplification permettant de suivre l'évolution de la réaction d'amplification en cours.“Real-time PCR” is understood to mean any amplification technique making it possible to follow the progress of the amplification reaction in progress.
Avantageusement les séquences des amorces et/ou de la sonde présentent une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 540 et 780 de la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire. Les deux amorces sont respectivement choisies sur les brins sens et anti-sens, et de manière à permettre l'amplification d'un fragment d'ADN. La sonde est quant à elle choisie de manière à s'hybrider avec le fragment d'ADN résultant de l'amplification. Les amorces de PCR conformes à la présente invention utilisées pour amplifier l'acide nucléique d'adénovirus cible d'un échantillon se situent dans une zone constante pour le gène hexon des adenovirus humains et le site d'hybridation de la sonde conforme à la présente invention se situe entre les deux amorces. Préférentiellement les adenovirus sont à tropisme humain.Advantageously, the sequences of the primers and / or of the probe have homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 540 and 780 of the sequence SEQ ID No. 4, or with its complementary sequence. The two primers are respectively chosen on the sense and antisense strands, and so as to allow the amplification of a DNA fragment. The probe is chosen so as to hybridize with the DNA fragment resulting from the amplification. The PCR primers in accordance with the present invention used to amplify the target adenovirus nucleic acid of a sample are located in a constant zone for the hexon gene of human adenoviruses and the site of hybridization of the probe in accordance with the present invention lies between the two primers. Preferably, the adenoviruses are human tropism.
De manière avantageuse lesdits oligonucléotides comprennent au moins 15 nucleotides et la sonde présente une température de fusion Tm théorique supérieure d'environ 10°C ± 0,5 aux Tm théoriques des amorces. Un tel procédé est appelée méthode PCR hexon en abrégé dans la suite du texte. Il comprend en substance une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes :Advantageously, said oligonucleotides comprise at least 15 nucleotides and the probe has a theoretical melting temperature Tm approximately 10 ° C. ± 0.5 higher than the theoretical Tm of the primers. Such a method is called the hexon PCR method for short in the rest of the text. It essentially includes a repetition of the cycle comprising the following stages:
- séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon,- separation of the strands to be amplified by heating the DNA extracted from the sample,
- hybridation de la sonde,- probe hybridization,
- hybridation avec des amorces telles que défîmes ci-dessus, et- hybridization with primers as defined above, and
- élongation avec une polymerase.- elongation with a polymerase.
Il est préférentiellement mis en oeuvre à l'aide des amorces sens et anti-sens HEX1 et HEX2 décrites ci -dessous et le produit d'amplification est préférentiellement hybride à la sonde HEX décrite ci -dessous.It is preferably implemented using the sense and antisense primers HEX1 and HEX2 described below and the amplification product is preferably hybrid to the HEX probe described below.
La présente invention a notamment pour objet un oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence :The subject of the present invention is in particular an oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1 below or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably of 90% and even more preferably 95%, with said sequence:
5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C. De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30 nucleotides.5 '- YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' in which Y represents C or T and M represents A or C. Preferably, said oligonucleotide comprises between 15 and 30 nucleotides.
La présente invention a en outre pour objet une amorce sens HEX1 constituée par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce HEX1 présente trois dégénérescences en position 1 , 10 et 19 permettant de couvrir la majorité des serotypes.The present invention further relates to a sense primer HEX1 consisting of a mixture of oligonucleotides meeting this definition. Thus the primer HEX1 exhibits three degenerations in position 1, 10 and 19 making it possible to cover the majority of the serotypes.
La présente invention a encore pour objet un deuxième oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence :The present invention also relates to a second oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 2 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably 90% and even more preferably 95%, with said sequence:
5' - GAGAAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T.5 '- GAGAAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' in which S represents G or C and B represents C, G or T.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30 nucleotides. La présente invention a en outre pour objet une amorce anti-sens HEX2 constituée par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce HEX2 présente trois dégénérescences en position 6, 9 et 21 permettant de couvrir la majorité des serotypes séquences.Preferably, said oligonucleotide comprises between 15 and 30 nucleotides. The present invention further relates to a HEX2 antisense primer consisting of a mixture of oligonucleotides meeting this definition. Thus the primer HEX2 has three degenerations in position 6, 9 and 21 making it possible to cover the majority of the serotypes sequenced.
Préférentiellement lesdites amorces comprennent au moins deux oligonucléotides, et encore plus préférentiellement trois ou quatre oligonucléotides.Preferably, said primers comprise at least two oligonucleotides, and even more preferably three or four oligonucleotides.
Les positions des séquences SEQ ID N° 1 et 2, localisées dans la partie 3' de l'ORF codant la protéine Hexon, sont, en prenant comme référence la séquence complète de l'adénovirus de type 5 (n° de dépôt M73260), respectivement 21565 (HEX1) et 21656 (HEX2). Elles correspondent aux positions 21048 et 21 139 de la séquence Ad5CMVp53 (longueur 35308 pb).The positions of the sequences SEQ ID N ° 1 and 2, located in the 3 ′ part of the ORF coding for the protein Hexon, are, taking as reference the complete sequence of the adenovirus type 5 (deposit number M73260) , respectively 21565 (HEX1) and 21656 (HEX2). They correspond to positions 21048 and 21139 of the sequence Ad5CMVp53 (length 35308 bp).
Les demandeurs ont montré que la concentration des amorces est un paramètre critique de la PCR en temps réel. En conséquence, la dégénérescence des amorces HEX1 et HEX2 a été limitée.The applicants have shown that the concentration of the primers is a critical parameter of real-time PCR. As a result, the degeneration of the primers HEX1 and HEX2 was limited.
La présente invention a en outre pour objet un troisième oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec ladite séquence, ou avec une séquence complémentaire de ladite séquence :The present invention further relates to a third oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 3 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, and preferably 90% and even more preferably 95%, with said sequence, or with a sequence complementary to said sequence:
5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.5 '- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 20 et 35 nucleotides.Preferably, said oligonucleotide comprises between 20 and 35 nucleotides.
La présente invention a en outre pour objet une sonde HEX comprenant au moins un oligonucléotide présentant cette séquence.The present invention further relates to a HEX probe comprising at least one oligonucleotide having this sequence.
Elle est en outre relative à des oligonucléotides présentant une séquence complémentaire de celles des oligonucléotides mentionnés ci dessus.It also relates to oligonucleotides having a sequence complementary to those of the oligonucleotides mentioned above.
Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de la présente invention la sonde comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. Ledit système révélateur est constitué de préférence par un colorant reporteur et un colorant extincteur de fluorescence, respectivement fixés aux extrémités 5' et 3 'de la sonde. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux le système révélateur est constitué par la paire « reporter / quencher » représentée par la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et la 6- carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement fixé en 5' et en 3' de la sonde. L'une des amorces peut être marquée de cette manière et avoir le rôle de sonde. Une sonde particulièrement préférée selon l'invention est constituée par : 5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.According to a preferred embodiment of the present invention, the probe comprises a molecule or a revealing system of molecules. Said revealing system preferably consists of a reporter dye and a fluorescence quenching dye, respectively attached to the 5 ′ and 3 ′ ends of the probe. According to an advantageous embodiment, the revealing system is constituted by the pair "reporter / quencher ”represented by 6-carboxyfluorescein (FAM) and 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) fixed respectively 5 'and 3' of the probe. One of the primers can be labeled in this way and have the role of probe. A particularly preferred probe according to the invention consists of: 5 'FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
Un tel système révélateur peut aussi être un système révélateur dit de « tailing ». Le « tailing » consiste à inclure à une des extrémités de la sonde une queue (tail) qui peut s'autoapparier. Cet autoappariement est mis en évidence à l'aide d'un marqueur qui se fixe spécifiquement sur la séquence dans cette configuration. En présence de cible il y a désappariement et un signal est émis. En absence de cible le signal n'est pas émis. D'autres systèmes révélateur peuvent aussi être utilisés.Such a revealing system can also be a so-called “tailing” revealing system. "Tailing" consists of including at one end of the probe a tail (tail) which can self-pair. This auto-pairing is highlighted using a marker which is specifically fixed on the sequence in this configuration. If there is a target, there is a mismatch and a signal is emitted. In the absence of target the signal is not emitted. Other revealing systems can also be used.
En variante, les amorces sens et anti-sens peuvent comporter une molécule ou un système de molécules révélateur.Alternatively, the sense and antisense primers may include a molecule or a developer molecule system.
Le produit de PCR obtenu par le procédé objet de la présente invention en utilisant les amorces de séquences SEQ ID N°l et SEQ ID N°2 a préférentiellement une taille de 1 14 pb et présente un %GC d'environ 58.8 %.The PCR product obtained by the method which is the subject of the present invention using the primers of sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 preferably has a size of 1 14 bp and has a% GC of approximately 58.8%.
La polymerase préférentiellement utilisée dans la présente invention est la Taq polymerase, mais elle peut être toute autre enzyme présentant une activité polymerase et utilisable dans les conditions opératoires de la PCR.The polymerase preferably used in the present invention is Taq polymerase, but it can be any other enzyme exhibiting polymerase activity and usable under the operating conditions of PCR.
La présente invention a encore pour objet un kit de réactifs pour réaction d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces sens et anti-sens et une sonde telles que décrites ci- dessus. Ledit kit comprend avantageusement en outre deux témoins négatifs et deux témoins positifs.The present invention also relates to a reagent kit for amplification reaction of the real-time PCR type for detection of adenovirus, characterized in that it comprises a pair of sense and antisense primers and a probe as described. above. Said kit advantageously further comprises two negative controls and two positive controls.
La présente invention a en outre pour objet une méthode PCR pour la détection et / ou la quantification d'adénovirus dans un échantillon à doser susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle consiste en une PCR en temps réel mettant en oeuvre un kit selon l'invention.The present invention further relates to a PCR method for the detection and / or quantification of adenovirus in a test sample capable of containing it, characterized in that it consists of a real-time PCR using a kit according to the invention.
Selon un aspect particulièrement avantageux de la méthode selon l'invention, lesdits deux témoins positifs sont extraits en parallèle à une série d'échantillons à doser et consistent en un standard constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et titrée et un calibrateur adapté au type d'échantillon à doser.According to a particularly advantageous aspect of the method according to the invention, said two positive controls are extracted in parallel with a series of samples to be assayed and consist of a standard consisting of a purified and titrated adenovirus solution and a calibrator adapted to the type of sample to be assayed.
La méthode conforme à l'invention trouve une application avantageuse à la détection et / ou à la quantification d'adénovirus présents dans les échantillons de type suspension ou surnageant de culture, plasma, urines, lavages oropharyngés, lymphocytes, liquides séminaux, biopsies tumorales ou non, écouvillons rectaux, fèces, ascites.The method according to the invention finds an advantageous application in the detection and / or in the quantification of adenoviruses present in samples of suspension or supernatant type from culture, plasma, urine, oropharyngeal washings, lymphocytes, seminal fluids, tumor biopsies or no, rectal swabs, faeces, ascites.
La présente invention a également trait à une méthode de sélection d'adénovirus utiles comme candidats vecteurs par évaluation des performances réplicatives des adenovirus par application d'une méthode de détection et / ou de quantification selon l'invention au suivi de cinétiques de multiplication adénovirale.The present invention also relates to a method of selecting adenoviruses useful as vector candidates by evaluation of the replicative performance of adenoviruses by application of a detection and / or quantification method according to the invention to the monitoring of kinetics of adenoviral multiplication.
La présente invention a également trait à une méthode de diagnostic du sérotype d'adénovirus présents dans un échantillon à tester consistant à mettre en oeuvre une méthode de l'invention puis à séquencer le produit PCR obtenu.The present invention also relates to a method for diagnosing the adenovirus serotype present in a test sample consisting in implementing a method of the invention and then in sequencing the PCR product obtained.
Les séquences nucléotidiques des différents serotypes codant la protéine Hexon ont été obtenues à partir de banques de données ou ont été séquencées. Les serotypes Ad3, Ad7, Ad 12, Ad 14, Ad 16 et Ad21 présentent en position 9 de la sonde HEX un résidu A. Les serotypes Ad5, Adl, Ad2, Ad6, Adl3, Ad40 et Ad48 présentent à cette même position un résidu G alors que les serotypes Ad4 et Ad41 présentent un résidu C. La séquence présentant un résidu A a été choisie, car la séquence de type G, à l'opposé des séquences de type A ou de type C, présente une structure secondaire de très haute stabilité (DG = -7.1 kcal/mol) susceptible de perturber son hybridation et/ou son déplacement et/ou sa dégradation lors de la polymérisation. D'autre part, la séquence de type A est plus fréquente que la séquence de type C.The nucleotide sequences of the various serotypes encoding the Hexon protein were obtained from databases or were sequenced. The serotypes Ad3, Ad7, Ad 12, Ad 14, Ad 16 and Ad21 have an A residue at position 9 of the HEX probe. The serotypes Ad5, Adl, Ad2, Ad6, Adl3, Ad40 and Ad48 have a residue at this same position G while the serotypes Ad4 and Ad41 have a residue C. The sequence presenting a residue A was chosen, because the sequence of type G, in contrast to the sequences of type A or of type C, has a secondary structure of very high stability (DG = -7.1 kcal / mol) capable of disturbing its hybridization and / or its displacement and / or its degradation during polymerization. On the other hand, the type A sequence is more common than the type C sequence.
Les mésappariements A/C (Ad5CMNp5i et serotypes 5, 1, 2, 6, 13, 40 et 48) ou A/G (serotypes 4 et 41) se traduisent par une diminution du delta Rn sans modification significative du Ct (delta Rn est la différence de fluorescence détectée entre la fluorescence mesurée du bruit de fond et la fluorescence détectée de l'échantillon à tester ; Ct est défini comme le nombre de cycles fractionnels dans lequel la fluorescence générée par clivage de la sonde dépasse significativement - en général de 10 fois - le bruit de fond). Les serotypes Ad5, Ad4, Ad 12 et Ad 14 et l'Ad5CMV/ 53 présentent des différences supplémentaires en position o 5 pour le sérotype Ad5 et l'Ad5CMV 75J o 24 pour les serotypes Ad4 et Adl2 o 3, 12 et 19 pour le sérotype Adl4A / C mismatches (Ad5CMNp5i and serotypes 5, 1, 2, 6, 13, 40 and 48) or A / G (serotypes 4 and 41) result in a decrease in the Rn delta without significant modification of the Ct (Rn delta is the difference in fluorescence detected between the measured fluorescence of the background noise and the detected fluorescence of the test sample; Ct is defined as the number of fractional cycles in which the fluorescence generated by cleavage of the probe significantly exceeds - generally 10 times - background noise). Serotypes Ad5, Ad4, Ad 12 and Ad 14 and Ad5CMV / 53 show additional differences in position o 5 for serotype Ad5 and Ad5CMV 75J o 24 for serotypes Ad4 and Adl2 o 3, 12 and 19 for Adl4 serotype
Malgré ces différences il est possible, de manière surprenante, de détecter les séquences nucléotidiques codant pour les protéines hexons de ces serotypes.Despite these differences, it is surprisingly possible to detect the nucleotide sequences coding for the hexon proteins of these serotypes.
L'un des avantages de la présente méthode de détection et / ou de quantification d'adénovirus humains par rapport aux méthodes décrites dans l'état de la technique est une sensibilité de détection remarquable avec un seuil de détection de 10 particules ou 1 pfu (unité formant plage) par réaction PCR.One of the advantages of the present method of detecting and / or quantifying human adenoviruses compared to the methods described in the prior art is a remarkable detection sensitivity with a detection threshold of 10 particles or 1 pfu ( range unit) by PCR reaction.
Un autre avantage réside dans l'universalité de la méthode puisque 17 serotypes différents d'adénovirus humains, représentatifs de l'ensemble des sous-groupes A à F, ont pu être détectés et quantifiés.Another advantage lies in the universality of the method since 17 different serotypes of human adenoviruses, representative of all of the subgroups A to F, could be detected and quantified.
En outre l'analyse des produits de PCR se fait directement à la fin des cycles de PCR par la lecture de la fluorescence obtenue au cours des cycles. Il n'est donc pas nécessaire de travailler avec les produits de PCR qui sont à risque de contamination pour les analyses ultérieures.In addition, the analysis of the PCR products is carried out directly at the end of the PCR cycles by reading the fluorescence obtained during the cycles. It is therefore not necessary to work with PCR products which are at risk of contamination for subsequent analyzes.
De plus la traçabilité des données brutes est totale. En effet, chaque analyse PCR est conservée dans des fichiers informatiques que l'on peut archiver sur une longue période sans altération. Les données brutes peuvent être à tout moment ré-analysées si les critères d'analyses évoluent. La conservation des données brutes est essentielle lorsqu'on doit travailler aux normes de Bonnes Pratiques de Laboratoire.In addition, the traceability of raw data is total. In fact, each PCR analysis is kept in computer files which can be archived over a long period without alteration. Raw data can be re-analyzed at any time if the analysis criteria change. The conservation of raw data is essential when working to the standards of Good Laboratory Practices.
En outre la quantification du nombre de cibles mis au départ dans la réaction est très fiable et reproductible. La détection du produit de PCR se fait au cours des cycles PCR à l'aide d'une sonde fluorescente. Celle-ci est nécessaire pour détecter le produit de PCR et a lieu en pleine phase exponentielle de PCR et non en point final ; ce principe de détection est donc plus sensible et plus spécifique. Un autre avantage réside dans le fait que les amplifications non spécifiques sont évitées, grâce au principe du « hot start », la PCR en temps réel étant réalisée en présence d'une ADN polymerase thermostable s 'activant à la première dénaturation.In addition, the quantification of the number of targets initially used in the reaction is very reliable and reproducible. The detection of the PCR product is done during PCR cycles using a fluorescent probe. This is necessary to detect the PCR product and takes place in the full exponential phase of PCR and not at the end point; this detection principle is therefore more sensitive and more specific. Another advantage lies in the fact that non-specific amplifications are avoided, thanks to the “hot start” principle, real-time PCR being carried out in the presence of a thermostable DNA polymerase which activates at the first denaturation.
Pour mettre en oeuvre la présente invention on peut éventuellement se référer à une revue générale des techniques PCR, et en particulier à la notice explicative intitulée « Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Détection » publiée par Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) et au PCR Protocols (Académie Press New- York 1989).To implement the present invention, it is possible to refer to a general review of PCR techniques, and in particular to the explanatory note entitled "Quantitation of DNA / RNA Using Real-Time PCR Detection" published by Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) and the PCR Protocols (Académie Press New-York 1989).
La présente invention est illustrée par des exemples non limitatifs et en référence à la figure annexée qui représente une courbe standard d'une méthode PCR hexon conforme à l'invention.The present invention is illustrated by nonlimiting examples and with reference to the appended figure which represents a standard curve of a hexon PCR method according to the invention.
Matériel et méthodesMaterial and methods
Collection d'adénovirus, surnageants de culture et lignées cellulaires :Collection of adenoviruses, culture supernatants and cell lines:
• La plupart des surnageants de culture de différents serotypes d'adénovirus humains proviennent du laboratoire du Pr. Freymuth (service de Virologie, CHU, Caen).• Most of the culture supernatants of different serotypes of human adenovirus come from the laboratory of Pr. Freymuth (Department of Virology, CHU, Caen).
• Certains adenovirus sauvages titrés (Ad2 et Ad5) proviennent de l'UMR n° 1592 (Emmanuelle Vigne, Unité de Vectorologie et de Transfert de Gènes, Institut Gustave-Roussy).• Some titrated wild adenoviruses (Ad2 and Ad5) come from UMR No. 1592 (Emmanuelle Vigne, Vectorology and Gene Transfer Unit, Gustave-Roussy Institute).
• L'Ad5CMV/?55 titré provient de l'Unité de Production de RPR Gencell, Vitry (Didier Faucher). Les titres sont fournis en nombre de pfu (« plaque forming unit », unités formant plages). Cette unité restera l'unité de référence pour la quantification.• The Ad5CMV /? 55 titrated comes from the Production Unit of RPR Gencell, Vitry (Didier Faucher). The titles are provided in number of pfu (“plaque forming unit”). This unit will remain the reference unit for quantification.
• La lignée cellulaire 293 provient de l'ATCC (CRL 1573).• The cell line 293 comes from ATCC (CRL 1573).
• La lignée cellulaire A549 (ATCC: CCL 185) a aimablement été fournie par E. Vigne et A. Fallourd, RPR Gencell.• The cell line A549 (ATCC: CCL 185) was kindly provided by E. Vigne and A. Fallourd, RPR Gencell.
• La lignée cellulaire MRC5 provient de chez bioMérieux (réf. 84002, France).• The MRC5 cell line comes from bioMérieux (ref. 84002, France).
Echantillons cliniques : • Les échantillons cliniques (plasma, urines, lavages oropharyngés, fèces) proviennent soit de volontaires sains, soit de patients hospitalisés à l'Institut Gustave-Roussy.Clinical samples: • The clinical samples (plasma, urine, oropharyngeal lavage, faeces) come either from healthy volunteers or from patients hospitalized at the Gustave-Roussy Institute.
• Certains plasmas proviennent du Centre de Transfusion, soit par l'achat d'une poche provenant d'environ 200 donneurs, soit des poches ne pouvant plus être utilisées pour un usage médical.• Some plasmas come from the Transfusion Center, either by purchasing a bag from around 200 donors, or bags that can no longer be used for medical use.
Conditions de stockage :Storage conditions :
• Les collections d'adénovirus et les prélèvements cliniques sont transportés en carboglace et, dès réception, stockés à -80°C.• Adenovirus collections and clinical samples are transported in dry ice and, upon receipt, stored at -80 ° C.
• Les différentes étapes de réception, d'aliquotage et d'analyse nécessitent un certain nombre de congélations et décongélations (adenovirus ou prélèvements cliniques). Pour être dans les mêmes conditions, les témoins (standard et calibrateurs) subissent le même nombre de congélations et décongélations que les prélèvements cliniques à diagnostiquer.• The different stages of reception, aliquoting and analysis require a certain number of freezes and thawings (adenovirus or clinical samples). To be under the same conditions, the controls (standard and calibrators) undergo the same number of freezings and thawings as the clinical samples to be diagnosed.
Témoins et standard : Il y a deux types de témoins négatifs :Cookies and switchboard: There are two types of negative cookies:
Un témoin négatif PCR ou NTC ("non template control") qui est constitué du tampon PCR avec de l'eau distillée (sans cible). La valeur de Ct doit être de 50 puisque l'on fait 50 cycles PCR.A negative control PCR or NTC ("non template control") which consists of the PCR buffer with distilled water (without target). The value of Ct must be 50 since 50 PCR cycles are performed.
Le deuxième type de témoin négatif est le témoin négatif d'extraction qui est mis en place dès l'étape d'extraction. En général, il est constitué de 200 μl d'eau physiologique et il est extrait en parallèle avec une série d'extractions (en général 1 pour 10). La valeur de Ct doit également être de 50. Il y a deux types de "témoins" positifs :The second type of negative control is the negative extraction control which is put in place from the extraction stage. In general, it consists of 200 μl of physiological water and it is extracted in parallel with a series of extracts (generally 1 in 10). The value of Ct must also be 50. There are two types of positive "controls":
Le standard qui est constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et titrée (≈ 5.103 pfu), est extrait en parallèle à une série d'échantillons à doser. L'extrait d'acides nucléiques est dilué (en général de 10 en 10) pour constituer les différents points de standard pour la construction de la courbe standard (Figure).The standard, which consists of a purified and titrated adenovirus solution (≈ 5.10 3 pfu), is extracted in parallel with a series of samples to be assayed. The nucleic acid extract is diluted (generally 10 to 10) to constitute the different standard points for the construction of the standard curve (Figure).
Le deuxième type de témoins positifs est le calibrateur. Il existe différents types de calibrateurs suivant le type d'échantillons à diagnostiquer. Il est constitué de 200 μl de milieu le plus proche de l'échantillon et d'une quantité connue d'adénovirus se situant au milieu de la gamme standard (en général 5.103 pfu). Les milieux utilisés pour la fabrication des calibrateurs sont de l'eau physiologique pour les lavages oropharyngés, d'un "pool" de plasma de 200 donneurs sains pour les plasmas, d'urines de sujets sains pour les urines et du milieu de culture frais pour les surnageants de culture. Ces calibrateurs vérifient que la technique d'extraction est correcte. La valeur de quantification par rapport à la valeur théorique attendue va permettre, par simple règle de trois, de réajuster la quantification finale obtenue avec les échantillons à tester.The second type of positive control is the calibrator. There are different types of calibrators depending on the type of samples to be diagnosed. It consists of 200 μl medium closest to the sample and a known amount of adenovirus lying in the middle of the standard range (in general 5.10 3 pfu). The media used for the manufacture of the calibrators are physiological water for oropharyngeal washes, a "pool" of plasma from 200 healthy donors for plasmas, urine from healthy subjects for urine and fresh culture medium. for culture supernatants. These calibrators verify that the extraction technique is correct. The quantization value compared to the expected theoretical value will allow, by simple rule of three, to readjust the final quantification obtained with the samples to be tested.
Appareil et quantificationApparatus and quantification
Toutes les réactions PCR sont faites à l'aide de l'appareil ABI Prism 7700 (Perkin- Elmer Applied Biosystem) lequel détecte le signal à l'aide d'une sonde fluorescente (Sonde TaqMan™) pendant les cycles PCR.All PCR reactions are carried out using the ABI Prism 7700 device (Perkin-Elmer Applied Biosystem) which detects the signal using a fluorescent probe (TaqMan ™ probe) during the PCR cycles.
Le système 7700 est un thermocycleur où chaque puits (n = 96) est relié à une fibre optique laquelle est connectée à un laser. Une caméra CDD collecte les émissions de fluorescence à peu près toutes les 6 secondes pour chaque puits. Le logiciel S.D.S. (Séquence Detector System™) analyse les données de fluorescence et détermine le nombre de copies de cible dans un échantillon.The 7700 system is a thermal cycler where each well (n = 96) is connected to an optical fiber which is connected to a laser. A CDD camera collects fluorescence emissions approximately every 6 seconds for each well. S.D.S. (Sequence Detector System ™) analyzes the fluorescence data and determines the number of target copies in a sample.
La quantification est basée sur le principe de la PCR en temps réel ("real-time PCR"). En effet, le produit de PCR est caractérisé par le moment de cycle PCR où l'amplification est détectable par la dégradation de la sonde liée à l'accumulation de produits de PCR. Plus le nombre de copies de départ de cible est élevé, moins il faudra de cycles PCR pour détecter une élévation significative de fluorescence.The quantification is based on the principle of real-time PCR. Indeed, the PCR product is characterized by the moment of the PCR cycle when the amplification is detectable by the degradation of the probe linked to the accumulation of PCR products. The higher the number of target starting copies, the fewer PCR cycles it will take to detect a significant increase in fluorescence.
Le nombre de copies de cible d'un échantillon est quantifié en mesurant la valeur de Ct et en utilisant une courbe standard (Figure ). En théorie, si la PCR fonctionne à 100%, il faut 3,22 cycles PCR (Ct) pour multiplier par 10 le nombre de cibles. En général, un facteur 10 du nombre de cibles donne une différence de valeurs de Ct entre 3,4 à 3,6.The number of target copies of a sample is quantified by measuring the Ct value and using a standard curve (Figure). In theory, if the PCR works at 100%, it takes 3.22 PCR cycles (Ct) to multiply by 10 the number of targets. In general, a factor of 10 of the number of targets gives a difference in Ct values between 3.4 to 3.6.
Le deuxième paramètre (Delta Rn) est important à vérifier pour confirmer la positivité du signal PCR. Le delta de Rn est la différence de fluorescence détectée entre la fluorescence mesurée du bruit de fond (en général mesurée entre le cycle 3 et le cycle 15 de la PCR sur la totalité de la plaque) et la fluorescence détectée de l'échantillon à analyser.The second parameter (Delta Rn) is important to check to confirm the positivity of the PCR signal. The Rn delta is the difference in fluorescence detected between the measured fluorescence of the background noise (generally measured between cycle 3 and cycle 15 of the PCR on the entire plate) and the detected fluorescence of the sample to be analyzed.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple 1 : Détection d'adénovirus provenant d'un échantillon d'urinesExample 1 Detection of Adenovirus from a Urine Sample
1.1. Préparation de l'échantillon d'urines à tester.1.1. Preparation of the urine sample to be tested.
Tous les réactifs utilisés pour cette préparation proviennent de la trousse dénommée High Pure RNA Isolation Kit, et commercialisée par Boehringer / Roche. Pour préparer cet échantillon procéder comme suit :All the reagents used for this preparation come from the kit called High Pure RNA Isolation Kit, and marketed by Boehringer / Roche. To prepare this sample proceed as follows:
A 200 μl d'urines préalablement chauffées 10 min. à 37 °C ainsi que sur chacun des témoins (d'un volume de 200 μl), ajouter 400 μl du tampon de lyse.At 200 μl of urine previously heated 10 min. at 37 ° C as well as on each of the controls (with a volume of 200 μl), add 400 μl of the lysis buffer.
Vortexer immédiatement. Incuber 15 min. à température ambiante.Vortex immediately. Incubate 15 min. at room temperature.
Placer chaque colonne sur un tube de 2,0 ml et déposer la totalité de la préparation au centre de la colonne. Centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) àPlace each column on a 2.0 ml tube and place the entire preparation in the center of the column. Centrifuge 1 min. at 8,000 rpm. (Eppendorf 5417R) at
20°C.20 ° C.
Placer la colonne sur un deuxième tube de 2,0 ml.Place the column on a second 2.0 ml tube.
Ajouter 500 μl du tampon de lavage I et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min.Add 500 μl of washing buffer I and centrifuge for 1 min. at 8,000 rpm.
(Eppendorf 5417R) à 20°C.(Eppendorf 5417R) at 20 ° C.
Placer la colonne sur un troisième tube de 2,0 ml.Place the column on a third 2.0 ml tube.
Ajouter 500 μl du tampon de lavage II et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20°C.Add 500 μl of washing buffer II and centrifuge 1 min. at 8,000 rpm. (Eppendorf 5417R) at 20 ° C.
Placer la colonne sur un quatrième tube de 2,0 ml.Place the column on a fourth 2.0 ml tube.
Ajouter 200 μl du tampon de lavage II et centrifuger 3 min. à 14.000 tours/minAdd 200 μl of washing buffer II and centrifuge 3 min. at 14,000 rpm
(Eppendorf 5417R) à 20°C. Placer la colonne sur tube Eppendorf de 1,5 ml (cinquième tube) et identifier le tube(Eppendorf 5417R) at 20 ° C. Place the column on 1.5 ml Eppendorf tube (fifth tube) and identify the tube
Eppendorf qui va collecter l'éluat final d'extraction d'acides nucléiques.Eppendorf which will collect the final nucleic acid extraction eluate.
Ajouter 50 μl d'eau distillée préchauffée.Add 50 μl of preheated distilled water.
Incuber 3 min. à 70°C (bain sec).Incubate 3 min. at 70 ° C (dry bath).
Centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20°C.Centrifuge 1 min. at 8,000 rpm. (Eppendorf 5417R) at 20 ° C.
Les extraits d'acide nucléique sont conservés à 4°C jusqu'à l'étape de PCR.The nucleic acid extracts are stored at 4 ° C until the PCR step.
Les « témoins » et « standard » sont préparés comme décrit ci-dessus (sectionThe “controls” and “standard” are prepared as described above (section
« matériel et méthodes »)." material and methods ").
Pour la préparation d'autres types d'échantillons, se reporter au tableau n° 1 illustrant les techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus provenant de différents types d'échantillons dont celui du présent exemple.For the preparation of other types of samples, refer to table n ° 1 illustrating the extraction techniques optimized for the detection of adenovirus coming from different types of samples including that of the present example.
1.2. Conditions de détection selon la méthode PCR hexon conforme à l'invention1.2. Detection conditions according to the hexon PCR method according to the invention
Les concentrations de l'ensemble des réactifs mis en oeuvre dans les réactions d'amplification notamment les concentrations d'amorces sens « HEX1 », anti-sens « HEX2 », de sonde « HEX », et de MgCl; et autres réactifs du TaqMan™ PCR Core Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sont données dans le tableau 2.The concentrations of all the reagents used in the amplification reactions, in particular the concentrations of primers sense “HEX1”, antisense “HEX2”, probe “HEX”, and MgCl ; and other reagents of the TaqMan ™ PCR Core Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) are given in table 2.
1.3 Résultats1.3 Results
La courbe standard d'une méthode de détection PCR conforme à l'invention est représentée sur la figure.The standard curve of a PCR detection method according to the invention is shown in the figure.
Exemple 2 : Spécificité de la méthode conforme à l'inventionExample 2: Specificity of the method according to the invention
Une des applications de la méthode PCR hexon selon l'invention est la détection d'adénovirus dans les surnageants de culture.One of the applications of the hexon PCR method according to the invention is the detection of adenovirus in culture supernatants.
Selon les techniques de l'art antérieur, la présence d'un adenovirus en culture cellulaire (permissive) est classiquement visualisée par un effet cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un adenovirus on détecte un antigène spécifique de l'adénovirus (par ELISA, ex. Réf. K6021, Dako Diagnostic LTD, Denmark House, Angleterre).According to the techniques of the prior art, the presence of an adenovirus in cell culture (permissive) is conventionally visualized by a cytopathic effect in the cell layer. To demonstrate that this cytopathic effect is due to an adenovirus an antigen specific to the adenovirus is detected (by ELISA, eg Ref. K6021, Dako Diagnostic LTD, Denmark House, England).
Des extraits d'acides nucléiques provenant des principales lignées cellulaires (Hep2, MRC5, 293 et A549, décrites ci-dessus dans la section « matériel et méthodes ») utilisés pour le diagnostic cellulaire des adenovirus humains ont été testés pour vérifier la négativité en PCR hexon selon la présente invention. Tous les extraits d'ADN évalués ont été négatifs démontrant la spécificité de détection.Extracts of nucleic acids from the main cell lines (Hep2, MRC5, 293 and A549, described above in the “materials and methods” section) used for the cellular diagnosis of human adenoviruses were tested to verify the negativity in PCR hexon according to the present invention. All DNA extracts evaluated were negative demonstrating the specificity of detection.
Pour la méthode PCR hexon de l'invention, il est très important de démontrer le caractère "universel" de la détection avec différents serotypes d'adénovirus humains.For the hexon PCR method of the invention, it is very important to demonstrate the "universal" nature of the detection with different serotypes of human adenoviruses.
17 serotypes différents ont été évalués (tableau n° 3), tous les sous groupes (A, Bl, B2, C, D, E, F) sont représentés.17 different serotypes were evaluated (table n ° 3), all the subgroups (A, Bl, B2, C, D, E, F) are represented.
La collection de 17 serotypes a été testée sur deux lignées cellulaires MRC5 (réf. 84002, bioMérieux, France) et A549 (ATCC: CCL 185) donnant des résultats similaires. Les résultats obtenus sur A549 sont présentés dans le tableau 3. On peut observer que les valeurs de Ct sont similaires excepté pour les serotypes 12, 18 et 40. Ces 3 serotypes correspondent aux adenovirus ayant les titres les plus faibles. Mais cette grande différence de Ct est surtout due au choix des amorces et de la sonde TaqMan™ conformes à la présente invention. En effet, l'Adl2 présente deux mésappariements pour l'amorce sens HEX1 de l'invention et un mésappariement pour la sonde HEX de l'invention. De même, l'Ad40 présente un désappariement pour l'amorce anti-sens HEX2 de l'invention et un désappariement pour la sonde HEX de l'invention. La séquence du gène hexon pour le sérotype 18 n'est pas disponible. Il est probable que ces résultats obtenus avec l'Adlδ sont dus également à des mésappariements.The collection of 17 serotypes was tested on two cell lines MRC5 (ref. 84002, bioMérieux, France) and A549 (ATCC: CCL 185) giving similar results. The results obtained on A549 are presented in Table 3. It can be observed that the Ct values are similar except for serotypes 12, 18 and 40. These 3 serotypes correspond to the adenoviruses having the lowest titers. However, this large difference in Ct is mainly due to the choice of primers and of the TaqMan ™ probe in accordance with the present invention. Indeed, Adl2 has two mismatches for the sense HEX1 primer of the invention and a mismatch for the HEX probe of the invention. Likewise, Ad40 has a mismatch for the HEX2 antisense primer of the invention and a mismatch for the HEX probe of the invention. The hexon gene sequence for serotype 18 is not available. It is likely that these results obtained with Adlδ are also due to mismatches.
Il est à noter que malgré ces désappariements (deux ou trois) de séquences nucléotidiques, les surnageants de culture restent largement positifs.It should be noted that despite these mismatches (two or three) of nucleotide sequences, the culture supernatants remain largely positive.
Ces résultats confirment bien le caractère "universel" de la PCR hexon si l'on considère que les 17 serotypes testés sont représentatifs de l'ensemble des 51 serotypes connus.These results confirm the "universal" nature of the hexon PCR if we consider that the 17 serotypes tested are representative of all 51 known serotypes.
Exemple 3 : Sensibilité de la méthode conforme à l'invention 3.1. Estimation du seuil de détection en nombre de particules.Example 3 Sensitivity of the Method According to the Invention 3.1. Estimation of the detection threshold in number of particles.
Le tableau 3 présente les résultats des 17 serotypes d'adénovirus avec des valeurs de Ct obtenues en fonction du nombre de particules par ml mesurées par la technique HPLC. A l'exception des 3 serotypes ayant des titres faibles (Adl2, Adl8 et Ad40), les valeurs de Ct sont dans une fourchette de 8,1 à 9,1 pour un nombre de particules de 1,1 à 8,5.10'7ml.Table 3 presents the results of the 17 adenovirus serotypes with Ct values obtained as a function of the number of particles per ml measured by the HPLC technique. With the exception of the 3 serotypes with low titers (Adl2, Adl8 and Ad40), the Ct values are in the range of 8.1 to 9.1 for a number of particles from 1.1 to 8.5.10'7ml .
Si on considère que la valeur de Ct pour la limite de positivité est aux environs de 40 et que l'on prend une différence de 3,5 Ct pour un facteur 10 du nombre de cibles, cela représente un écart possible de la valeur de Ct de 31 unités. Cet écart représente environ 9 logarithmes de base 10. Par conséquent, suivant les serotypes, le seuil de détection peut être estimé de 10 à 80 particules par réaction PCR.If we consider that the value of Ct for the positivity limit is around 40 and that we take a difference of 3.5 Ct for a factor 10 of the number of targets, this represents a possible deviation from the value of Ct of 31 units. This difference represents approximately 9 base 10 logarithms. Consequently, depending on the serotypes, the detection threshold can be estimated from 10 to 80 particles per PCR reaction.
3.2 : Bilan de 101 gammes standard.3.2: Assessment of 101 standard ranges.
Sur une période de 18 mois, 101 gammes standards ont été testées à l'aide de 101 extractions indépendantes d'un standard contenant 5.105 pfu d'Ad5CMV 55 dans 200 μl. Le volume final d'élution est de 50 μl. 10 μl d'extrait de ce standard avec une gamme de dilution de 10 en 10 (pur, 10"', 10":, 10°, 10"4, 10°) sont analysés pour construire une gamme standard. La dernière dilution testée correspond en théorie à 1 pfu d'Ad5CMV/?53 dans le tube PCR. Tous les points de gamme sont testés en double en PCR (Ctl et Ct2, tableau 5).Over a period of 18 months, 101 standard ranges were tested using 101 independent extractions of a standard containing 5.10 5 pfu of Ad5CMV 55 in 200 μl. The final elution volume is 50 μl. 10 μl of extract of this standard with a dilution range of 10 to 10 (pure, 10 " ', 10 ":, 10 °, 10 "4 , 10 °) are analyzed to construct a standard range. The last dilution tested corresponds in theory to 1 pfu of Ad5CMV /? 53 in the PCR tube All the range points are tested in duplicate by PCR (Ctl and Ct2, table 5).
Les valeurs Ct obtenues avec tous les points contenant 1 pfu d'Ad5CMV/?JJ sont présentées dans le tableau 5. Sur 202 réactions PCR, 8 réactions sont négatives (Ct = 50) ce qui ne représente que 4%. Dans la grande majorité des cas, la quantité de 1 pfu d'Ad5CMV/?53 est positive en PCR hexon.The Ct values obtained with all the points containing 1 pfu of Ad5CMV /? JJ are presented in table 5. Out of 202 PCR reactions, 8 reactions are negative (Ct = 50) which represents only 4%. In the vast majority of cases, the amount of 1 pfu of Ad5CMV /? 53 is positive in hexon PCR.
Ces résultats confirment bien la bonne sensibilité de détection. Suivant les lots de fabrication d'Ad5CMV/?JJ, l'équivalent 1 pfu correspond à 10 à 40 particules virales (≈ cible) ce qui confirme le seuil de détection estimé à l'aide de la collection d'adénovirus sauvages. Exemple 4 : Cinétique de culture adénoviraleThese results confirm the good detection sensitivity. Depending on the production batches of Ad5CMV /? JJ, the equivalent 1 pfu corresponds to 10 to 40 viral particles (≈ target) which confirms the detection threshold estimated using the collection of wild adenoviruses. EXAMPLE 4 Kinetics of Adenoviral Culture
Deux expériences ont démontré qu'il était possible de suivre une cinétique de multiplication adénovirale à l'aide de la méthode PCR hexon de l'invention. Ces deux expériences ont utilisé soit de l'Ad5 sur la lignée MRC5, soit de l'Ad2 sur la lignée A549 (tableau n° 4). Les résultats obtenus pour les deux expériences étaient similaires.Two experiments demonstrated that it was possible to follow an adenoviral multiplication kinetics using the hexon PCR method of the invention. These two experiments used either Ad5 on the MRC5 line or Ad2 on the A549 line (table 4). The results obtained for the two experiments were similar.
Des flacons de culture de 25 cm2 de cellules ont été infectés avec des dilutions d'adénovirus comprises entre 103 et 1 pfu. Le milieu de culture (5 ml) a été retiré, les cellules ont été infectées avec différentes concentrations de virus sous un volume de 2 ml pendant 2 heures (à 37°C). Au bout des deux heures, le milieu a été changé. Après l'infection, tous les jours (J0 à Jl 1), les flacons de culture ont été prélevés : 250 μl pour le test ELISA (détection d'antigène Hexon) et 200 μl pour la détection PCR selon l'invention. 450 μl de milieu frais étaient réintroduits dans la flacon de culture.25 cm 2 culture flasks of cells were infected with adenovirus dilutions of between 10 3 and 1 pfu. The culture medium (5 ml) was removed, the cells were infected with different concentrations of virus in a volume of 2 ml for 2 hours (at 37 ° C). After two hours, the medium was changed. After infection, every day (D0 to Dl 1), the culture flasks were removed: 250 μl for the ELISA test (detection of Hexon antigen) and 200 μl for the detection of PCR according to the invention. 450 μl of fresh medium were reintroduced into the culture flask.
L'apparition de l'ECP (effet cytopathique) (tableau n°4), est comprise entre 4 jours pour le point 10' et 8 jours pour le point 10 pfu. Il existe une relation entre la quantité de virus inoculée dans la flacon de culture et le délai de positivité. Le seuil de positivité est de 10 pfu/flacon de culture.The appearance of the CPE (cytopathic effect) (table 4) is between 4 days for the 10 'point and 8 days for the 10 pfu point. There is a relationship between the amount of virus inoculated in the culture flask and the time to positivity. The positivity threshold is 10 pfu / culture flask.
L'apparition de l'ECP est simultanée à celle de l'antigène Hexon (Test ELISA). Pour aucune des dilutions étudiées, la positivité de l'ELISA ne précède celle de l'ECP.The appearance of the ECP is simultaneous with that of the Hexon antigen (ELISA test). For none of the dilutions studied, the positivity of the ELISA does not precede that of the ECP.
Pour la PCR hexon (tableau n° 4), les valeurs de Ct pour les témoins négatifs (T) sont légèrement positifs (37,6-37,8). Ce résultat peut s'expliquer, soit par une légère contamination par aérosols au moment de l'inoculation des flacons de culture, soit par une légère contamination au moment de l'extraction. La première hypothèse semble être plus probable puisque à J10, les valeurs de Ct sont passées à 31,2 (différence de 6,5 Ct) ce qui représente une augmentation d'un facteur 100 du nombre de copies d'adénovirus. La méthode PCR hexon de l'invention montre l'existence d'une multiplication virale (diminution significative du Ct) en l'absence d'ECP et de détection de l'antigène Hexon.For the hexon PCR (table n ° 4), the Ct values for the negative controls (T) are slightly positive (37.6-37.8). This result can be explained either by slight aerosol contamination at the time of inoculation of the culture flasks, or by slight contamination at the time of extraction. The first hypothesis seems to be more likely since on D10, the values of Ct increased to 31.2 (difference of 6.5 Ct) which represents an increase by a factor of 100 in the number of copies of adenovirus. The hexon PCR method of the invention shows the existence of a viral multiplication (significant decrease in Ct) in the absence of PCE and detection of the Hexon antigen.
Suivant les dilutions testées, la méthode PCR hexon de l'invention met en évidence de manière tout à fait surprenante de 2 à 4 "vagues" de multiplication virale.Depending on the dilutions tested, the hexon PCR method of the invention reveals, in a completely surprising manner, from 2 to 4 "waves" of viral multiplication.
Clairement ces résultats démontrent que la méthode PCR hexon de l'invention se positive plus tôt que l'ECP ou l'ELISA hexon. Aussi, la méthode PCR hexon conforme à la présente invention est au minimum 10 fois plus sensible que les tests de culture cellulaire classiques (culture de 10 jours + test ELISA).Clearly these results demonstrate that the hexon PCR method of the invention is positive sooner than the ECP or the ELISA hexon. Also, the hexon PCR method conforms to the present invention is at least 10 times more sensitive than conventional cell culture tests (10-day culture + ELISA test).
Ces résultats pour le moins inattendus obtenus avec la méthode PCR hexon de l'invention peuvent être mis à profit notamment pour connaître de manière aisée et rapide le temps d'un cycle viral et son niveau d'amplification. Ces deux derniers paramètres sont très importants pour évaluer les performances réplicatives d'un virus.These at least unexpected results obtained with the hexon PCR method of the invention can be used in particular to quickly and easily find out the time of a viral cycle and its level of amplification. These last two parameters are very important for evaluating the replicative performance of a virus.
En conséquence, la méthode PCR hexon selon l'invention peut contribuer avantageusement à la sélection de candidats vecteurs en vue d'applications biotechnologiques, notamment dans l'expression et / ou la thérapie génique.Consequently, the hexon PCR method according to the invention can advantageously contribute to the selection of vector candidates for biotechnological applications, in particular in gene expression and / or therapy.
Exemple 5 : Répétabilité et reproductibilité de la méthode selon l'invention.Example 5: Repeatability and reproducibility of the method according to the invention.
Les résultats des 101 standards évalués en PCR hexon (tableau n° 5) permet de déterminer à la fois la répétabilité (répétition intra-tests) et la reproductibilité (répétition inter-tests). La moyenne des valeurs Ct pour 1 pfu est de 37,2 ± 1,8. Ce niveau de variation est relativement faible surtout qu'il est le résultat de la variation de deux étapes : l'extraction et la PCR hexon.The results of the 101 standards evaluated in hexon PCR (table 5) make it possible to determine both repeatability (intra-test repetition) and reproducibility (inter-test repetition). The mean of the Ct values for 1 pfu is 37.2 ± 1.8. This level of variation is relatively low, especially since it is the result of the variation of two stages: extraction and hexon PCR.
Pour les valeurs de Ct pour 10 pfu (non montrées) la moyenne est de 33,7 ± 1,7. Le niveau de variation est très similaire puisque les écarts obtenus sont très proches. On peut noter que la différence de Ct entre les 2 moyennes obtenues avec 1 pfu et 10 pfu est de 3,5 Ct. Cette différence correspond effectivement à un écart d'un facteur 10 en nombre de cibles.For the values of Ct for 10 pfu (not shown) the average is 33.7 ± 1.7. The level of variation is very similar since the differences obtained are very close. It can be noted that the difference in Ct between the 2 means obtained with 1 pfu and 10 pfu is 3.5 Ct. This difference effectively corresponds to a difference of a factor of 10 in number of targets.
Exemple 6 : Prélèvements cliniquesEXAMPLE 6 Clinical Samples
Des prélèvements cliniques ont été testés, avec des extractions indépendantes et dans des séries de PCR hexon différentes. Les résultats de la PCR hexon (valeurs Ct) de 8 plasmas et 20 urines sont présentés dans le tableau n° 6.Clinical samples were tested, with independent extractions and in different hexon PCR series. The results of the hexon PCR (Ct values) of 8 plasmas and 20 urines are presented in table n ° 6.
En général lorsque les valeurs de Ct sont inférieures ou égales à 36, les variations de Ct pour un même extrait d'acides nucléiques (Ctl et Ct2) dépassent rarement la valeur de 1 Ct (facteur 2 pour la quantification). C'est pour cette raison que tous les prélèvements avec des valeurs de Ct < à 36 sont considérés comme quantifiables (statut « positif-quantifiable) et entre 36 et 43 les prélèvements sont considérés comme positifs mais non quantifiables (statut positif-détectable).In general when the values of Ct are less than or equal to 36, the variations of Ct for the same extract of nucleic acids (Ctl and Ct2) rarely exceed the value 1 Ct (factor 2 for quantification). It is for this reason that all samples with Ct values <to 36 are considered to be quantifiable (“positive-quantifiable” status) and between 36 and 43 the samples are considered to be positive but not quantifiable (positive-detectable status).
Pour les plasmas (tableau n° 6), au sein d'un même extrait d'acides nucléiques, il y a rarement un écart de plus de 1 Ct excepté pour l'extrait n° 1 du plasma n° 3289 et l'extrait n° 3 du plasma n° 3579. Dans ce dernier cas, la valeur de 44,6 pour le Ctl est aberrante. Bien entendu, au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est plus importante mais dépasse rarement une valeur de 2 Ct (facteur 4 pour la quantification).For plasmas (table n ° 6), within the same nucleic acid extract, there is rarely a difference of more than 1 Ct except for extract n ° 1 from plasma n ° 3289 and the extract n ° 3 of plasma n ° 3579. In the latter case, the value of 44.6 for Ctl is aberrant. Of course, within the different nucleic acid extracts, the variation in Ct is greater but rarely exceeds a value of 2 Ct (factor 4 for quantification).
Pour les urines (tableau n° 6), au sein d'un même extrait d'acides nucléiques, il n'y a pas plus de 1 Ct d'écart excepté lorsque les valeurs de Ct sont supérieures à 36. En effet, pour des valeurs de Ct supérieures à 36, le niveau de positivité est assez faible ce qui explique un niveau de variation plus élevé.For urine (table n ° 6), within a single nucleic acid extract, there is no more than 1 Ct of difference except when the values of Ct are greater than 36. Indeed, for Ct values greater than 36, the level of positivity is quite low, which explains a higher level of variation.
Au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est également plus importante ne dépassant que rarement une valeur de 2 Ct entre deux extraits différents excepté pour l'urine n° 2403 qui a une différence de 3 Ct (facteur 8 en quantification). Bien entendu, certaines urines (n° 2029, 2626, 3736, 3763, 3765 et 5399) ont des valeurs de Ct très élevées (en général > à 40) démontrant une très faible positivité. Dans ces derniers cas, on comprend qu'il est possible de passer facilement d'un signal positif à un signal négatif (Ct = 50).Within the different nucleic acid extracts, the variation in Ct is also greater, rarely exceeding a value of 2 Ct between two different extracts except for urine No. 2403 which has a difference of 3 Ct (factor 8 in quantification). Of course, some urines (nos. 2029, 2626, 3736, 3763, 3765 and 5399) have very high Ct values (generally> 40) demonstrating very low positivity. In these latter cases, it is understood that it is possible to pass easily from a positive signal to a negative signal (Ct = 50).
Globalement, les résultats sur les prélèvements cliniques de la méthode de détection PCR hexon conforme à l'invention, montrent une très bonne reproductibilité (pour les valeurs de Ct) lorsque la positivité est assez élevée (Ct < à 36, statut « positif- quantifiable »). Pour les valeurs de Ct > à 36 et jusqu'à 43, on peut considérer que la cible est bien présente (positive) mais le niveau de variation est trop élevé pour donner une valeur de quantification fiable. Exemple 7 : Linéarité de la quantificationOverall, the results on clinical samples of the hexon PCR detection method in accordance with the invention show very good reproducibility (for Ct values) when the positivity is fairly high (Ct <to 36, status "positive - quantifiable "). For Ct values> 36 and up to 43, we can consider that the target is present (positive) but the level of variation is too high to give a reliable quantification value. Example 7: Linearity of the quantification
La courbe standard est générée habituellement à l'aide de 12 points de 1 à 105 pfu par réaction PCR testés en double. Pour chaque répétition, les courbes d'amplification et les valeurs de cycle PCR sont très reproductibles (voir figure). Par contre, en point final, les signaux de fluorescence sont très variables (jusqu'à un facteur 10), d'où l'intérêt d'analyser les produits de PCR au moment de l'apparition du signal (cycle PCR: Ct) et non en point final comme en PCR "classique".The standard curve is usually generated using 12 points of 1 to 10 5 pfu per PCR reaction tested in duplicate. For each repetition, the amplification curves and the PCR cycle values are very reproducible (see figure). On the other hand, as a final point, the fluorescence signals are very variable (up to a factor of 10), hence the advantage of analyzing the PCR products at the time of the appearance of the signal (PCR cycle: Ct) and not at the end point as in "classic" PCR.
La courbe standard obtenue avec ces points standards est présentée sur la figure. Le coefficient de corrélation de 0,999 indique une excellente linéarité. Dans l'immense majorité des cas, ce coefficient se situe entre 0,98 et 1. Des manipulations utilisant une gamme standard plus large (0,5 à 106 pfu) ont montré des coefficients de corrélation similaires (non montrés) confirmant ainsi les informations du fournisseur décrivant une linéarité de quantification sur plus de 6 logarithmes.The standard curve obtained with these standard points is shown in the figure. The correlation coefficient of 0.999 indicates excellent linearity. In the vast majority of cases, this coefficient is between 0.98 and 1. Manipulations using a wider standard range (0.5 to 10 6 pfu) have shown similar correlation coefficients (not shown) thus confirming the supplier information describing a linearity of quantification on more than 6 logarithms.
La valeur "Y-intercept" représente le nombre de cycles PCR déduit par la courbe standard pour détecter un pfu d'Ad5CMVp5J. Suivant les courbes standards, cette valeur Ct se trouve entre 35 et 39.The value "Y-intercept" represents the number of PCR cycles deduced by the standard curve to detect an Ad5CMVp5J pfu. According to standard curves, this Ct value is between 35 and 39.
La valeur de la pente (Slope) est en liaison avec le rendement de la PCR. On rappelle que pour une PCR à 100% de rendement, cette valeur doit être de - 3,22. Pour la méthode PCR hexon conforme à l'invention, la valeur de la pente se situe entre - 3,4 à - 3,9 représentant un rendement moyen de 90%.The value of the slope (Slope) is related to the yield of the PCR. It is recalled that for a PCR at 100% yield, this value must be - 3.22. For the hexon PCR method according to the invention, the value of the slope is between - 3.4 to - 3.9 representing an average yield of 90%.
Exemple 8 : Quantification sur prélèvements cliniques : Les exemples de quantification obtenue avec la PCR hexon sur les prélèvements cliniques (tableau 7) ont été sélectionnés sur deux principaux critères. Le premier critère est que le prélèvement a été analysé par deux extractions en série de PCR totalement indépendantes (voir tableau 6). Le deuxième critère est que les résultats de PCR ont des valeurs de Ct inférieures ou égales à 36 correspondant bien à un statut quantifiable pour le prélèvement. Six prélèvements cliniques répondent à ces deux critères (tableau 7). Les résultats de quantification sont très reproductibles et le niveau de variation dépasse rarement un facteur 2 pour un même prélèvement (tableau 7). Il est particulièrement intéressant de noter pour l'urine n° 2403 qu'une différence de 3 Ct (en théorie cela représente un facteur 8 pour la quantification) entre les deux extractions ne se répercute pratiquement pas sur les valeurs de quantification déterminées par la PCR hexon. Cet exemple démontre l'intérêt des calibrateurs extraits en parallèle qui permettent de réajuster la quantification en fonction des petites fluctuations des PCR (seuil de détection légèrement différent, conditions d'extraction légèrement différentes...). Example 8: Quantification on clinical samples: The examples of quantification obtained with the hexon PCR on clinical samples (Table 7) were selected on two main criteria. The first criterion is that the sample was analyzed by two completely independent serial PCR extractions (see Table 6). The second criterion is that the PCR results have Ct values less than or equal to 36 corresponding well to a quantifiable status for the sample. Six clinical samples meet these two criteria (Table 7). The quantification results are very reproducible and the level of variation rarely exceeds a factor of 2 for the same sample (Table 7). It is particularly interesting to note for urine No. 2403 that a difference of 3 Ct (in theory this represents a factor of 8 for quantification) between the two extractions has practically no effect on the quantification values determined by the PCR hexon. This example demonstrates the interest of calibrators extracted in parallel which allow the quantification to be readjusted according to small fluctuations in PCR (slightly different detection threshold, slightly different extraction conditions ...).
Tableau n° 1 : Techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus provenant de différents types d'échantillons.Table n ° 1: Optimized extraction techniques for the detection of adenovirus from different types of samples.
Tableau 1 (suite) Table 1 (continued)
Tableau 2 : Conditions de mise en oeuvre de la réactionTable 2: Conditions for carrying out the reaction
Tableau 3 : Délai d'apparition de l'ECP (j°urs)-* valeur de la DO en Elisa, valeur de Ct (PCR hexon) et du titre en HPLC après inoculation sur cellules A549 d'un surnageant de cellules MRC5 récolté après infection avec des adenovirus sauvages de la collection.Table 3: Time to onset of the PCE (day urs) - * OD value in Elisa, Ct value (PCR hexon) and fineness in HPLC after inoculation of A549 cells a supernatant of MRC5 cells harvested after infection with wild adenoviruses from the collection.
ECP : Effet cytopathique. Elisa + si DO > 0,171. Tableau 4 (suite)ECP: Cytopathic effect. Elisa + if OD> 0.171. Table 4 (continued)
lc,c ligne ECP : Effet cytopathique 2cmc ligne Elisa (Elisa+ si DO>0,171) 3"™ et 4α"c lignes Ctl et Ct2 PCR hexon ND : Not Done (non fait) ; T .témoin l c, c ECP line: Cytopathic effect 2 cmc Elisa line (Elisa + if OD> 0.171) 3 " ™ and 4 α " c Ctl and Ct2 lines hexon PCR ND: Not Done (not done); T. Witness
Tableau 5 : Valeurs Ct obtenues avec 1 pfu d'Ad5CMV 7J3 dans la réaction PCR (101 tests).Table 5: Ct values obtained with 1 pfu of Ad5CMV 7J3 in the PCR reaction (101 tests).
Tableau 5 (suite) Table 5 (continued)
Tableau 5 (suite)Table 5 (continued)
a : NEG .Négatif, Ct = 50. b : ND :Not Done (non fait). Tableau 6 : Résultats de la PCR hexon avec deux collections de prélèvements cliniques lasma et urines) a ant eu deux ou trois extractions indé endantes. a: NEG. Negative, Ct = 50. b: ND: Not Done (not done). Table 6: Results of the hexon PCR with two collections of clinical samples (plasma and urine) had two or three independent extractions.
a: Ext : Extraction. Le chiffre indique le nombre d'extractions faites sur le même prélèvement, b: NA : Non Applicable ; c: Ct = 50 : PCR négative, d: Chaque extrait est testé dans 2 réactions PCR, Ct 1 pour l'essai 1 PCR et Ct 2 pour l'essai a: Ext: Extraction. The figure indicates the number of extractions made on the same sample, b: NA: Not Applicable; c: Ct = 50: negative PCR, d: Each extract is tested in 2 PCR reactions, Ct 1 for the test 1 PCR and Ct 2 for the test
2 PCR. Tableau 7 : Quantification à l'aide de la PCR hexon avec des prélèvements cliniques quantifiables.2 PCR. Table 7: Quantification using hexon PCR with quantifiable clinical samples.
a: La moyenne a été calculée à partir des valeurs de Ct indiquées dans le tableau 6. b: Le standard utilisé est connu en nombre de pfu d'Ad5CMVp.53. Cette quantification est rapportée par millilitre de prélèvements cliniques de départ. a: The average was calculated from the values of Ct indicated in table 6. b: The standard used is known in number of pfu of Ad5CMVp.53. This quantification is reported per milliliter of initial clinical samples.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection et / ou de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon biologique dans lequel : - une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifiée par PCR en temps réel à l'aide d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, et - le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde non dégénérée, constituée d'au moins un oligonucléotide présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucleotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus de type 5, durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification.1. Method for detecting and/or quantifying adenovirus nucleic acids in a biological sample in which: - an adenovirus nucleotide sequence is amplified by real-time PCR using a pair of sense primers and degenerate antisense, consisting of mixtures of oligonucleotides having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the sequence of adenovirus type 5, and - the product of the reaction d the amplification is detected using a non-degenerate probe, consisting of at least one oligonucleotide having a homology of at least 80% with a sequence between nucleotides 21000 and 22000 of the sequence of the adenovirus type 5, for a sufficient number of cycles to allow a measurable quantity of amplification product to be obtained.
2. Oligonucléotide présentant la séquence SEQ ID N°l suivante: 5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C.2. Oligonucleotide having the following sequence SEQ ID No. 1: 5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' in which Y represents C or T and M represents A or C.
3. Amorce HEXl caractérisé en ce qu'elle comprend au moins deux oligonucléotides d'au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 %, avec ladite séquence3. HEXl primer characterized in that it comprises at least two oligonucleotides of at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 1 or of a sequence having a sequence homology of at least 80%, with said sequence
5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C.5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3' in which Y represents C or T and M represents A or C.
4. Oligonucléotide présentant la séquence SEQ ID N°2 suivante: 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T. 4. Oligonucleotide having the following sequence SEQ ID No. 2: 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' in which S represents G or C and B represents C, G or T.
5. Amorce HEX2 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins deux oligonucléotides d'au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec ladite séquence : 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T.5. HEX2 primer characterized in that it comprises at least two oligonucleotides of at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 2 or of a sequence having a sequence homology of at least 80% with said sequence : 5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3' in which S represents G or C and B represents C, G or T.
6. Amorce selon l'une des revendications 3 et 5 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins trois oligonucléotides.6. Primer according to one of claims 3 and 5 characterized in that it comprises at least three oligonucleotides.
7. Oligonucléotide selon l'une des revendications 2 et 4 caractérisé en ce qu'il comprend entre 15 et 30 nucleotides.7. Oligonucleotide according to one of claims 2 and 4 characterized in that it comprises between 15 and 30 nucleotides.
8. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucleotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec ladite séquence :8. Oligonucleotide characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides of the following sequence SEQ ID No. 3 or of a sequence having a sequence homology of at least 80% with said sequence:
5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.5' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.
9. Oligonucléotide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend 20 et 35 nucleotides.9. Oligonucleotide according to claim 8 characterized in that it comprises 20 and 35 nucleotides.
10. Sonde HEX caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide selon l'une des revendications 8 et 9.10. HEX probe characterized in that it comprises at least one oligonucleotide according to one of claims 8 and 9.
11. Sonde selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle comporte une molécule ou un système de molécules révélateur.11. Probe according to claim 10 characterized in that it comprises a revealing molecule or system of molecules.
12. Sonde constituée par la molécule suivante :12. Probe constituted by the following molecule:
5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
13. Oligonucléotides présentant une séquence complémentaire de celles des oligonucléotides selon l'une des revendications 2, 4 et 7. 13. Oligonucleotides having a sequence complementary to those of the oligonucleotides according to one of claims 2, 4 and 7.
14. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à l'aide d'amorces sens et anti-sens respectivement selon l'une des revendications 3, 5 et 6.14. Method according to claim 1 characterized in that it is implemented using sense and antisense primers respectively according to one of claims 3, 5 and 6.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 et 14 caractérisé en ce qu'il comprend une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes :15. Method according to one of claims 1 and 14 characterized in that it comprises a repetition of the cycle comprising the following steps:
- séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon,- separation of the strands to be amplified by heating the DNA extracted from the sample,
- hybridation de la sonde,- hybridization of the probe,
- hybridation avec les amorces, et - élongation avec une polymerase.- hybridization with the primers, and - elongation with a polymerase.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 14 et 15 caractérisé en ce que la produit d'amplification est détecté par hybridation avec la sonde selon l'une des revendications 10 à 12.16. Method according to any one of claims 1, 14 and 15 characterized in that the amplification product is detected by hybridization with the probe according to one of claims 10 to 12.
17. Kit de réactifs pour réaction d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces selon l'une des revendications 3 et 5 et une sonde selon l'une quelconque des revendications 10 à17. Kit of reagents for real-time PCR type amplification reaction for detection of adenovirus characterized in that it comprises a pair of primers according to one of claims 3 and 5 and a probe according to any one of claims 10 to
12.12.
18. Procédé de diagnostic du sérotype d'adénovirus présent dans un échantillon à tester consistant à mettre en oeuvre une procédé selon l'une des revendications 1, 14 et 15 puis à séquencer le produit PCR obtenu.18. Method for diagnosing the adenovirus serotype present in a sample to be tested consisting of implementing a method according to one of claims 1, 14 and 15 then sequencing the PCR product obtained.
19. Procédé de sélection d'adénovirus utiles comme candidats vecteurs comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 14 et 15. 19. Method for selecting adenoviruses useful as vector candidates comprising the implementation of a method according to any one of claims 1, 14 and 15.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040161767A1 (en) * 2002-06-28 2004-08-19 Baldwin Brett R. Detection and quantification of aromatic oxygenase genes by real-time PCR
US20070099177A1 (en) * 2002-11-14 2007-05-03 Heim Albert R Agents and methods for detecting human adenoviruses
US7332280B2 (en) * 2003-10-14 2008-02-19 Ronald Levy Classification of patients having diffuse large B-cell lymphoma based upon gene expression
US7595433B2 (en) 2004-09-14 2009-09-29 Ceres, Inc. Modulations of amino acid and sugar content in plants
WO2006063376A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung Method for the detection of adenoviruses
US20070082351A1 (en) * 2005-09-20 2007-04-12 Advandx, Inc. Reagents, methods and kits for classification of fungi and direction of anti-fungal therapy
AU2006299783B2 (en) 2005-10-12 2012-06-14 Danisco Us Inc. Use and production of storage-stable neutral metalloprotease
US20070092871A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Combimatrix Corporation Microarray for pathogen identification
US20090098126A1 (en) * 2006-06-15 2009-04-16 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method and kit for the detection of adenoviruses
CA2789456C (en) * 2010-02-16 2017-11-21 Becton, Dickinson And Company Assay for detecting closely-related serotypes of human papillomavirus (hpv)
RU2511043C2 (en) * 2012-07-02 2014-04-10 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labelled probe for identification of dna of adenoviruses of serotypes 3, 4, 7, 14, 21 by method of hybridisation-fluorescence polymerase chain reaction
CN103725800B (en) * 2014-01-15 2015-03-11 湖南圣维尔医学检验所有限公司 Human adenovirus detection kit
CN105586439B (en) * 2016-01-27 2020-12-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 Kit for detecting B, E type human adenovirus nucleic acid and detection method thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997025432A2 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Improved mutants of (2,5 dkg) reductase

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3709211B2 (en) * 1994-06-08 2005-10-26 株式会社三菱化学ビーシーエル Adenovirus detection and differentiation method and oligonucleotides and DNA fragments used therefor
DE19716456C2 (en) * 1997-04-21 2002-05-08 Schmitt Heinz Josef Use of a combination of primers for the detection of infectious agents
DE19816902A1 (en) * 1998-04-16 1999-10-28 Wilhelm Krone New phosphorylated forms of sterol regulatory element binding proteins useful for treating or preventing arteriosclerosis, stroke and diabetes mellitus

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997025432A2 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Improved mutants of (2,5 dkg) reductase

Also Published As

Publication number Publication date
CA2399364A1 (en) 2001-08-16
KR20020089343A (en) 2002-11-29
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