EP1250352A1 - Rezeptorähnliche proteinkinasen aus nicotiana tabacum - Google Patents

Rezeptorähnliche proteinkinasen aus nicotiana tabacum

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Publication number
EP1250352A1
EP1250352A1 EP00983273A EP00983273A EP1250352A1 EP 1250352 A1 EP1250352 A1 EP 1250352A1 EP 00983273 A EP00983273 A EP 00983273A EP 00983273 A EP00983273 A EP 00983273A EP 1250352 A1 EP1250352 A1 EP 1250352A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
sequences
nucleic acid
plant
receptor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00983273A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas SCHMÜLLING
Silke Schäfer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Bayer AG
Bayer CropScience AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG, Bayer CropScience AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1250352A1 publication Critical patent/EP1250352A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8293—Abscisic acid [ABA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8294—Auxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8295—Cytokinins

Definitions

  • the invention relates to nucleic acids which code for plant polypeptides with the biological activity of receptor-like protein kinases, and the corresponding polypeptides per se
  • Receptor-like kinases usually span the cell membrane and thus have an extracytoplasmic and a cytoplasmic part. They act in organisms as mediators of signals that are passed on from the outside into the cell interior (e.g. van der Geer at al, 1994) by binding a ligand the extracellular domain is activated and the cytoplasmic protein kinase domains are activated. This is done by autophosphoryeration of either the Senn and / or Threonm residues, the tyrosine or histidine residues (e.g. Fantl et al, 1993). Animal receptor kinases autophosphoryheres mainly tyrosine residues, in contrast, seem almost exclusively in plants Se ⁇ n- / Threomn-K ⁇ nasen occur (Becraft, 1998)
  • Se ⁇ n- / Threon ⁇ n-K ⁇ nases catalyze the reversible transfer of the ⁇ -phosphate residue from ATP to amino acids of a recipient protein.
  • the presence of 1 1 conserved domains essentially determines the enzymatic function of protemkinases (Hanks et al, 1988). These domains contain a total of 9 Amino acids that are invariable in all previously identified protein kinases. They are involved in ATP binding and presumably in the recognition of the amino acid to be phosphorylated, such as Senn Threonm or tyrosine
  • the subject of the present invention is nucleic acids which encode plant poh peptides with the biological activity of a protemkinhe protemkinase which encompasses the amino acid sequence according to SEQ I D ⁇ 0 2.
  • Threonm kinases are in particular single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA). Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, which may contain introns, and cDNAs.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably DNA fragments which correspond to genomic DNA from tobacco plants.
  • nucleic acids according to the invention particularly preferably comprise a sequence selected from
  • sequences which have at least 60%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% identity with the sequences defined under a) or b),
  • a very particularly preferred embodiment of the nucleic acids according to the invention is a cDNA molecule with the sequence according to SEQ ID NO 1
  • hybridize describes the process in which a single-stranded nucleic acid molecule with a complementary strand undergoes base pairing. In this way, starting from the sequence information disclosed herein, for example, DNA fragments from others
  • Plants are isolated as tobacco plants which code for receptor-like protein kinases which have the same or similar properties as the kinase with the amino acid sequence according to SEQ ID NO 2
  • c is the concentration and n the length of the hybridizing sequence section in base pairs and a sequence> 100 bp, the expression 500 / n is omitted.
  • maximum rigidity at a temperature case, 5-15 ° C below Tm and an ion peak of 15 mM Well (corresponds to 0 1 ⁇ SSC) if a RNA sample ends too early, the melting point is 10-1 ⁇ C higher Preferred hybridization conditions are given below
  • N-terminal receptor domains refers to a peptide region which functionally corresponds to the peptide region with an amino acid sequence from position 1 to position 394 of the sequence according to SEQ ID NO 2
  • the degree of identity of the nucleic acids is preferably determined with the aid of the NCBI BLASTN version 2 0 4 program (Altschul et al, 1997)
  • the present invention also relates to the regulatory regions which naturally control the transcription of the nucleic acids according to the invention in plant cells, in particular in tobacco plants
  • regulatory regions refers to untranslated regions of the gene in question, such as promoters, enhancers, repressor or activator binding sites or termination sequences that interact with cellular proteins, thereby controlling transcription
  • the present invention furthermore relates to DNA constructs which comprise a nucleic acid according to the invention and a heterologous promoter
  • heterologous promoters depend on whether pro- or eukaryotic cells or cell-free systems are used for expression.
  • heterologous promoters are the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus for plant cells, the promoter of alcohol dehydrogenase for yeast cells, the T3,
  • T7 or SP6 promoters for prokaryotic cells or cell-free systems are T7 or SP6 promoters for prokaryotic cells or cell-free systems
  • the present invention furthermore relates to vectors which contain a nucleic acid according to the invention, a regulatory region according to the invention or a DNA construct according to the invention.
  • vectors which contain a nucleic acid according to the invention, a regulatory region according to the invention or a DNA construct according to the invention.
  • All phages, plasmids, phagmids, phasmids, phasmids, cosmids, YACs used in molecular-biological laboratories can be used as vectors.
  • BACs, artificial chromosomes or particles that are suitable for particle bombardment can be used
  • Preferred vectors are pBIN (Bevan, 1984) and its derivatives for vegetable
  • the present invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention
  • host cell refers to cells which do not naturally contain the nucleic acids according to the invention
  • prokaryotic cells preferably E coh
  • E coh prokaryotic cells
  • eukaryotic cells ie cells from Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastons, insects, plants. Fioschooocytes and cell nuts from nipples
  • the present invention further relates to poly peptides with the biological activity of receptor-like protemkinases which are derived from the Measured nucleic acids are encoded in particular polypeptides that represent Se ⁇ n- / Threonm-K ⁇ nasen according to the invention
  • polypeptides refers to both short amino acid chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides, or oligomers, and longer amino acid chains, commonly referred to as proteins. It includes amino acid chains that are either natural Processes, such as post-translational processing, or can be modified by chemical processes which are state of the art.
  • Such modifications can occur at various locations and multiple times in a polypeptide, for example on the peptide backbone, on the amino acid side chain, on the amino and / or at the carboxy terminus They include, for example, acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, covalent linkage with flavins, ham moieties, nucleotides or nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives or phosphatyhnositol, cyclization, disulfide bridging,
  • polypeptides according to the invention can be in the form of "mature” proteins or as parts of larger proteins, for example as fusion proteins. Furthermore, they can secrete or "leader” sequences, pro-sequences, sequences which enable easy purification, such as multiple histidine Have residues or additional stabilizing amino acids
  • polypeptides according to the invention do not have to represent complete receptor-like protemkinases, but can also be nui fragments thereof as long as they still have at least one biological activity of the complete protemkinases exercise are still considered to be in accordance with the invention.
  • the polypeptides according to the invention need not be derivable from receptor-like protein kinases from tobacco.
  • Polypeptides which correspond to receptor-like protein kinases of the following plants, for example, or fragments thereof which can still exert the biological activity thereof are also considered to be according to the invention: corn, wheat, barley, oats, rice, rye, tomatoes, legumes, potato plants, Lactuca sativa, brassicaceae , Wood plants, Physcomitrella patens.
  • polypeptides according to the invention can have deletions or amino acid substitutions in comparison to the corresponding region of naturally occurring receptor-like protein kinases, as long as they still exert at least a biological activity of the complete receptors.
  • Conservative substitutions are preferred.
  • Such conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Trp.
  • the present invention thus also relates to polypeptides which exercise at least one biological activity of a receptor-like protein kinase and comprise an amino acid sequence which have an at least 60% identity, preferably an at least 80% identity, particularly preferably an at least 90% identity, very particularly preferably 97-99% identity, with the sequence according to SEQ ID NO 2 over its entire length
  • the degree of identity of the amino acid sequences is preferably determined with
  • a preferred embodiment of the polypeptides according to the invention is the cvto kinmregulieite receptor-like protein kinase (CRK 1) with the amino acid sequences / according to SEQ ID NO 2
  • CRK1 amino acid sequence the 1 1 kinase domains could be determined in which all amino acids defined according to Hanks et al., 1988 are present. It is therefore a serine / threonine kinase.
  • the CRKl protein has a transmembrane domain in the region of amino acids 390 and 410.
  • the first 28 amino acids with a positively charged amino acid residue and a hydrophobic one
  • a region of 15 amino acids at the N-terminus represents a signal sequence.
  • the cleavage site is probably located between amino acids 28 and 29. This signal sequence ensures translocation of the newly synthesized CRK1 protein through the membrane of the endoplasmic reticulum and further transport into it plasma membrane.
  • CRKl between amino acids 29 and 390 is located extracytoplasmic. This extracellular domain comprises four regions which have> 70% homology to ATP / GTP binding sites or to binding sites for cyclic nucleotides.
  • cytokinins are possible ligands.
  • cytokinins are structurally similar to purines.
  • Cytokinins belong to the group of plant hormones and have the ability to induce cell division. In the meantime, more than 40 naturally occurring cytokinins have been isolated, all of the known cytokinins being adenine derivatives. The activity is determined by the nature of the substituents, especially the N 6 group (overview in Shaw, 1994 and Kaminek, 1992).
  • cytokinins In addition to inducing cell division in combination with aux, cytokinins also influence differentiation processes. A high cytokinin to auxin ratio leads to shoot formation in vitro in callus, a high auxm to cytokinin ratio to root formation (Skoog and Miller, 1957). Cytokinins cause a reduction in apical dominance, which results in the budding of the side buds hat (Wickson and Thimann, 1958). The cytokinins also play an important role in delaying leaf senescence
  • Cytokinins cause inactivation of proteolytic enzymes, among others Lipases and Lipoxykmasen, which are responsible for the degradation processes. To further classic effects of the cytokinins the demanding influence on the chloroplast development and the inhibition of the root length growth pays
  • Cytokinins are necessary for normal plant development. An oversupply of this hormone leads to extremely compact, sterile plants
  • CRKl transcript Since the amount of CRKl transcript is regulated by cytokinins, it can be a component of the cytokinin signal transduction pathway. The amount of transcript in CRKl is transiently regulated by cytokinins.
  • the gene is then subject to early regulation, 30 minutes after the addition of 5 x 10 7 M BAP there is an almost complete reduction in the amount of transcript.
  • the CRK1 transcripts accumulate again after 9-24 h of cytokinin treatment, so that one can assume a transient regulation This regulation could represent negative feedback in order to ensure that a cell is competent for a signal, but this sensitivity can be changed by reducing the amount of protein in signal transduction components.
  • the CRK1 receptor it is postulated that the cell after the signal has been recorded is unable to respond to further cytokine signals for a period of time
  • biological activity of a receptor-like protein kinase means a change in cell activity and plant growth after ligand binding
  • the present invention furthermore relates to antibodies which bind specifically to the polypeptides according to the invention.
  • Such antibodies are produced in the customary manner. These antibodies can be used, for example, to identify expression clones, for example a gene bank, which carry the nucleic acids according to the invention
  • antibody as used herein also extends to parts of complete antibodies, such as Fa-, F (ab) 2 - or Fv fragments, which still have the ability to bind to the epitopes of the polypeptides according to the invention
  • the present invention furthermore also relates to processes for producing the nucleic acids according to the invention.
  • the nucleic acids according to the invention can be prepared in the customary manner.
  • the nucleic acid molecules can be synthesized completely chemically.
  • Short pieces of the nucleic acids according to the invention can also be synthesized chemically and such ohgonucleotides can be labeled radioactively or with a fluorescent dye
  • the labeled ohgonucleotides can also be used to search cDNA banks produced from plant mRNA. Clones to which the labeled ohogonucleotides hybridize are selected for the isolation of the relevant DNA fragments. After the characterization of the isolated DNA, the nucleic acids according to the invention
  • oligonucleotide (s) as used herein means DNA molecules consisting of 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides. They are chemically synthesized and can be used as probes.
  • the present invention furthermore relates to processes for producing the polypeptides according to the invention.
  • host cells which contain nucleic acids according to the invention can be cultivated under suitable conditions.
  • the desired polypeptides can then be isolated from the cells or the culture medium in a conventional manner.
  • the polypeptides can also be used in in vitro
  • a rapid method for isolating the polypeptides according to the invention begins with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be easily affinity-purified.
  • the fusion partner can be, for example, glutathione S-transferase.
  • the fusion protein can then be purified on a glutathione affinity column.
  • the fusion partner can be separated by partial proteolytic cleavage, for example on linkers between the fusion partner and the polypeptide according to the invention to be purified.
  • the linker can be designed to include target amino acids, such as arginine and lysine residues, which define sites for trypsin cleavage. Standard cloning methods using oligonucleotides can be used to generate such linkers.
  • FPLC FPLC
  • HPLC gel filtration, reverse phase or slightly hydrophobic columns
  • Gel filtration, differential precipitation, ion exchange chromatography and affinity chromatography Since receptor-like protein kinases are membrane proteins, detergent extractions are preferably carried out in the cleaning processes, for example using detergents which have little or no effect on the secondary and tertiary structures of the polypeptides, such as nonionic detergents
  • the purification of the polypeptides according to the invention can include the isolation of membranes from host cells which expand the nucleic acids according to the invention.
  • such cells expand the polypeptides according to the invention in a sufficient number of copies so that the amount of the polypeptides in a membrane fraction is at least 10 times higher than that which is found in comparable membranes of cells which naturally expand the CRK1 gene, the amount is particularly preferably at least 100 times, very particularly preferably at least 1000 times higher
  • compositions containing the polypeptides according to the invention are preferred in terms of protein content compared to a preparation from the Host cells enriched at least 10 times and particularly preferably at least 100 times
  • polypeptides according to the invention can also be affinity-purified without a fusion partner with the aid of antibodies which bind to the polypeptides
  • the present invention also relates to processes for finding chemical compounds which bind to the polypeptides according to the invention and change their properties. Due to the diverse functions of the receptor-like protein kinases according to the invention, modulators which influence the activity can represent new growth-regulating or herbicidal active compounds.
  • modulators which influence the activity can represent new growth-regulating or herbicidal active compounds.
  • agonist refers to a molecule which accelerates or amplifies the signal transduction of the receptor-like protein kinases according to the invention, ie the autophosphorylation of the serine and / or threonine residues.
  • antagonist refers to a molecule that mediates signal transduction of the receptor-like protein kinases of the invention, i.e. the autophosphorylation of the serine and / or threonine residues is slowed down or prevented.
  • modulator represents the generic term for agonist or antagonist.
  • Modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies that bind to the polypeptides according to the invention.
  • modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which in turn binds to the polypeptides according to the invention and thereby influences their biological activity.
  • Modulators can be natural substrates and ligands or structural or functional mimetics thereof. However, the term “modulator” does not include cytokinins.
  • the modulators are preferably small organic chemical compounds.
  • the binding of the modulators to the receptor-like protein kinases according to the invention can change the cellular processes in a way which leads to the death of the plants treated with them.
  • the present invention comprises methods for finding chemical compounds which change the expression of the polypeptides according to the invention.
  • expression modulators can also represent new growth-regulating or herbicidal active ingredients.
  • Expression modulators can small organic msch-chemical molecules, peptides or antibodies which bind to the regulatory regions of the nucleic acids coding for the polypeptides according to the invention.
  • expression modulators can be small organic-chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which in turn binds to regulatory regions of the encoding the polypeptides of the invention
  • Nucleic acids bind and their expression influences expression modulators can also be antisense molecules
  • the present invention therefore also extends to the use of modulators of the polypeptides according to the invention or of expression modulators as
  • the methods according to the invention include high throughput screening (HTS). Both host cells and cell-free preparations containing the nucleic acids according to the invention and / or the polypeptides according to the invention can be used for this
  • a synthetic reaction mix eg products of the in vz / ro transcription
  • a cellular component such as a membrane or any other preparation which contains the polypeptides according to the invention
  • a labeled substrate or ligand of the polypeptides in the presence and the absence of a candidate molecule, which may be an agonist or antagonist.
  • the ability of the candidate molecule to increase or to inhibit the activity of the polypeptides according to the invention is evident from an increased or decreased binding of the labeled ligand or from an increased or decreased conversion of the labeled
  • Substrate molecules that bind well and lead to increased activity of the polypeptides according to the invention are agonists.
  • Molecules that bind well but do not trigger the biological activity of the polypeptides according to the invention are probably good antagonists.
  • the detection of biological Activity of the polypeptides according to the invention can be improved by a so-called reporter system.
  • reporter system include, but are not limited to, colorimetrically labeled substrates that are converted to a product or a reporter gene that responds to changes in the activity or expression of the polypeptides of the invention, or other known binding assays.
  • Another example of a method with which modulators of the polypeptides according to the invention can be found is a displacement test in which, under suitable conditions, the polypeptides according to the invention and a potential modulator with a molecule which is known to bind to the polypeptides according to the invention, such as a natural substrate or ligand or a substrate or ligand mimetic.
  • the polypeptides of the invention themselves can be labeled, e.g. radioactive or colorimetric so that the number of polypeptides that are bound to a ligand or that have undergone a reaction can be determined exactly. In this way, the effectiveness of an agonist or antagonist can be measured.
  • the invention furthermore relates to the use of a nucleic acid according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention for producing transgenic plants, and the corresponding transgenic plants as such or their parts or propagation material.
  • Transgenic plants, parts of plants, protoplasts, plant tissue or plant propagation materials in which, after introduction of a nucleic acid according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention, the intracellular concentration of the receptor-like protein kinases in the
  • the present invention also relates to an increase or decrease in comparison to the corresponding wild-type forms.
  • plant parts as used herein means all above-ground and underground parts and organs of the plants, such as shoot, leaf, flower and
  • propagation material means vegetative and generative propagation material such as cuttings, tubers, rhizomes, cuttings and seeds
  • the invention also relates to plants, parts of plants, protoplasts, plant tissue or plant propagation materials in which changes to the sequence coding for endogenous receptor kinases are made and selected, which lead to the production of a receptor kinase according to the invention or in which mutagenesis increases or decreases the endogenous receptor kinases. activity is achieved
  • endogenous receptor kinase genes already in the plant can be modified by mutagenesis, for example using ethyl methanosulfonate (EMS). After the mutagenesis, individuals can be specifically selected on the basis of the. Sequence analysis, ligand binding studies or analysis of a biochemical reaction caused by the ligand binding Mutagenesis according to the invention produce receptor kinases with increased or reduced activity. In the same way, the expression of a receptor kinase gene according to the invention which is already in the plant can be changed by mutagenesis of the regulatory sequences in such a way that plants with a reduced or increased ligand sensitivity are produced Plants can be identified by well-known methods of gene expression analysis such as Northern blot or Western blot
  • the receptor-like protein kinases according to the invention play a role in signal perception, one obtains in transgenic "sense" plants or in plants which are linked to an increased amount or activity of corresponding endogenous receptor kinases or in signaling induction Elements were specifically selected, increased ligand sensitivity
  • Transgenic "antisense" plants or plants with reduced receptor kinase activity have a reduced ligand sensitivity.
  • An increase or decrease in receptor kinase activity can lead to plants that have a changed development, changed physiology or a changed mophology.
  • Representational Difference Analysis is a method for isolating differentially exposed genes.
  • the two samples to be compared were formed by a tobacco cell culture, which was cultivated without cytokine addition, and a cell culture which after 5 days of subculturing for 45 min 10 7 M BAP (Benzylaminopu- ⁇ n) was added
  • the fragments obtained were clomerized into the vector pUC19.
  • the fragment of CRKl was further used as a probe for Northern and Southern blots and in a cDNA library screening to isolate the complete cDNA from
  • a cDNA library was produced by the company SCInet in the ⁇ -ZAP-Express Vector according to the manufacturer Stratagene. 400 ⁇ g total RNA of the tobacco suspension culture W 38 was added to the F ⁇ ma It was previously ensured that the searched mR ⁇ ⁇ is expressed in the culture after receipt of the finished cDNA library is called and it is called up in a five-step process Fig. Screen searched for the complete CRKl cDNA The titer of the cDNA library was 1 x 10 9 pfu / ml
  • the phage plates were cooled for 1 h at 4 ° C., nylon filters placed for 1 mm, with the DNA side up for 2 min on Whatman 3M filter paper soaked in denaturation solution and 5 min on Whatman 3M filter paper soaked in re-solution solution.
  • the filters were briefly incubated dipped in a 2 x SSC solution, dried and irradiated with UV light for DNA fixation (UV-Transil-
  • the 5'-RACE is based on the specific amplification of the 5 end of a gene from mRNA. With the aid of a sequence-specific polymer and the AMV reverse transceptase, the first strand of cDNA is synthesized. A poly (A) tail is attached to the product so that an ohgo dT anchor primer and a nested sequence-specific primer can be used in the subsequent PCR. In a second PCR, another nested primer can be used to ensure the specificity
  • the cDNA first strand synthesis takes place with an ohgo dT polymer and the subsequent PCR reactions with sequence-specific polymers.
  • the products were cloned with the "TA cloning kit" from Pharmacia
  • RNA from suspension cell cultures were briefly dried over a Nutsche which was connected to a vacuum pump
  • the material was frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until the start of RNA isolation
  • RNA is precipitated with 0.7 parts by volume of isopropanol and centrifugation at 4000 rpm for 10 mm.
  • the collected pellet is resuspended in 2 ml of 4 M lithium chloride for the purification of polysaccharides and again centrifuged for 10 min at 4000 rpm.
  • the pellet is dissolved in 2 ml of TES. Buffer resuspended and mixed with 2 ml chloroform for the purification of proteins and phenol residues and centrifuged for 10 min at 4000 rpm to separate the phases 0.3 M sodium acetate (pH 5.2) filled in.
  • a centrifugation is carried out for 30 min at 4000 rpm.
  • salts from the RN A pellet are washed with 70% alcohol Centrifuged at 4000 rpm for 10 min. After removing the alcohol, the pellet is dried in vacuo and dissolved in 17 ⁇ l TE.
  • the principle of purification is based on the separation of polyadenylated mRNA by o / z ' go-öT-coated Dynabeads according to the manufacturer's instructions.
  • the yield of mRNA was approximately 1-2% of the total amount of RNA used.
  • the agarose is with a final concentration of 1.5% agarose in H 2 O dest. Set on and boiled. After cooling to 60 ° C, 1/10 part by volume of 10 x MOPS buffer and 1/6 part by volume of formaldehyde (37%) are added. EtBr is added to determine identical quantities. After curing, the gel is set to 19 V for 10 min. 50 ⁇ g of the nucleic acid samples and 3 ⁇ l of the length standard (RNA: 0.24-9.5 kb RNA ladder from Gibco BRL Lifetechnologies) are mixed with 2 parts by volume of sample buffer and denatured for 10 min at 65 ° C. in the heating block. The RNA samples are electrophoresed at 45 V for about 5 h.
  • Nucleic acid samples are blotted on a nylon membrane.
  • 3M Whatman absorbent paper is impregnated with 10 x SSC buffer on a glass pane and attached over two containers so that there are no air bubbles so that its ends are immersed in the containers. These are also filled with 10 x SSC buffers. The gel is placed, topside down, on the 3M Whatman absorbent paper without air bubbles and with the
  • Nvlon membrane covered The membrane should not be larger than the gel and Lie on the gel without air bubbles.
  • Two layers of 3M Whatman absorbent paper are then placed on top of the nylon membrane.
  • the agarose gel is now sealed with film so that no liquid can be sucked past it.
  • About 3 cm of absorbent paper, a larger glass pane and then on top of the 3M Whatman absorbent paper a weight of about half a kilogram is placed. Blotting is carried out for at least 6 hours.
  • the RNA is fixed by ⁇ J / -c ⁇ os shnk ⁇ ng with a Fluo Link UV lamp. The dose is 0.12 J / cm
  • the fragment to be labeled must be clomerized in a vector which has a T3 and / or a T7 promoter, eg pBluesc ⁇ pt.
  • the plasmid is digested with a restriction enzyme which is downstream of the sequence to be transcribed to transcribe the entire plasmid prevent after one
  • the DNA is subjected to a phenol / chloroform extraction and precipitated
  • the sequence of the 15 clone was cut out of the pUC19 vector via Eco RI and Xba I sections and clomerized into the pBluesc ⁇ pt SK vector using the same restriction sections.
  • an antisense RNA can be used with the T3 polymerase Synthesized 1 ⁇ g DNA was used for labeling.
  • the Stratagene '7/7 vüi o transc ⁇ pt ⁇ on "-K ⁇ t was used and the manufacturer's instructions followed. After the" In viti o Transcnption ", a DNase digestion of 15 min was carried out The RNA was
  • Phenol / chloroform shaken out and precipitated. The incorporation rate averaged 5 10 cpnV ⁇ g DNA. After a denaturation, the tagged probe was added to ori-modified Membi Separation of the non-incorporated nucleotides
  • a Sephadex G50 column ("Nick Columns", Pharmacia) is washed with 10 ml of water. The labeling mixture and 350 ⁇ l of water are pipetted on, the eluate is discarded. 400 ⁇ l of water are added to the column. The eluate contains the marked sample of 1 ⁇ l of the Eluates are taken to determine the specific activity (cpm / ⁇ g DNA). This should be at least 10 8 cpm / ⁇ g of DNA used. The remaining eluate is denatured for 10 min at 95 ° C. and, after briefly cooling on ice, is added to the hybridization tubes
  • the nylon membrane with the fixed nucleic acid is placed in a hybridization tube.
  • a prehybination is carried out first with sperm semen.
  • 10 ml of hybridization solution per 10 cm 2 membrane are added to the hybridization tubes and with 1 ml of freshly denatured herring sperm solution ⁇ g / ml) each 10 ml hybridization solution added.
  • the pre-hybridization takes place, like the hybridization, at 68 ° C. in the hybridization oven.
  • the pre-hybridization should take at least half an hour, after which the labeled and freshly denatured DNA sample is added.
  • the hybridization is carried out overnight
  • the membrane is sealed in foil and an X-ray film is placed on the detection literature

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für pflanzliche Polypeptide mit der biologischen Aktivität von rezeptorähnlichen Proteinkinasen codieren, sowie die entsprechenden Polypeptide per se.

Description

REZEPTORAHNLICHE PROTEINKINASEN AUS NICOTIANA TABACUM
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für pflanzliche Polypeptide mit der biolo- gischen Aktivität von rezeptorahnhchen Protemkinasen codieren, sowie die entsprechenden Polypeptide per se
Rezeptorahnliche Kinasen durchspannen in der Regel die Zellmembran und besitzen somit einen extracytoplasmatischen und einen cytoplasmatischen Teil Sie fungieren in Organismen als Vermittler von Signalen, die von außen in das Zellinnere weitergeleitet werden (z B van der Geer at al , 1994) Durch Bindung eines Liganden an die extrazellulare Domäne wnd die cytoplasmatische Proteinkinasedomane aktiviert Dies geschieht durch Autophosphoryherung entweder der Senn- und/oder Threonmreste, der Tyrosin- oder der Histidinreste (z B Fantl et al , 1993) Tierische Rezeptorkinasen autophosphoryheren hauptsachlich Tyrosinreste, im Gegensatz dazu scheinen in Pflanzen fast ausschließlich Seπn-/Threomn-Kιnasen vorzukommen (Becraft, 1998)
Seπn-/Threonιn-Kιnasen katalysieren den reversiblen Transfer des γ-Phophat-Restes von ATP auf Aminosäuren eines Empfängerproteins Das Vorhandensein von 1 1 konservierten Domänen bestimmt wesentlich die enzymatische Funktion von Protemkinasen (Hanks et al , 1988) In diesen Domänen befinden sich insgesamt 9 Aminosäuren, die invariabel in allen bisher identifizierten Protemkinasen sind Sie sind an der ATP-Bindung und vermutlich an der Erkennung der zu phosphorylierenden Aminosäure w ie Senn Threonm oder Tyrosin beteiligt
Gegenstand dei vorhegenden Ei findung sind Nukleinsäuren, die für pflanzliche Poh - peptide mit der biologischen Aktiv ität einer tezeptorahnhehen Protemkinase w elche die Aminosauresequenz gemäß SEQ I D \0 2 umfasst codieren Insbesondr e codieren die erfindungsgemaßen für iczeptorahnlichc Seπn-
Threonm-Kinasen Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzel- strängige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.
Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA- Fragmente, die genomischer DNA von Tabakpflanzen entsprechen.
Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz ausgewählt aus
a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 ,
b) Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter a) oder b) definierten Sequenzen,
d) Sequenzen, welche an die unter a) oder b) definierten Sequenzen hybridisieren,
e) Sequenzen, welche eine zumindest 60 %ige, bevorzugt eine zumindest 80 %ige, besonders bevorzugt eine zumindest 90 %ige Identität mit den unter a) oder b) definierten Sequenzen aufweisen,
0 Sequenzen, welche eine zumindest 60 %ige, bevorzugt eine zumindest
80 %ige, besonders bevorzugt eine zumindest 90 %ige Identität mit der N-terminalen Rezeptordomäne der unter a) oder b) definierten
Sequenzen aufweisen, g) Sequenzen, welche zu den unter a) oder b) definierten Sequenzen komplementär sind, und
h) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneπertheit des genetischen
Codes für dieselbe Aminosauresequenz codieren wie die unter a) bis f) definierten Sequenzen
Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemaßen Nuklein- sauren stellt ein cDNA-Molekul mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO 1 dar
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wnd, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelstrangiges Nukleinsauremolekul mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen
Pflanzen als Tabakpflanzen isoliert werden, welche für rezeptorahnhche Protemkinasen codieren, welche dieselben oder ähnliche Eigenschaften wie die Kinase mit der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO 2 aufweisen
Hybπdisierungsbedingungen werden nach folgender Fonuel naherungsweise berechnet
Die Schmelztemperatur Tm = 81 5 °C + 16 6 log{c(Na+)] + 0 41 (%G + Q) - 500/n (Lottspeich und Zorbas, 1998)
Dabei ist c die Konzentration und n die Lange des hybridisierenden Sequenzabschnitts in Basenpaai en Fui eine Sequenz >100 bp entfallt der Ausdruck 500/n Mit höchster Stπngenz w ird bei einet Tempeiatui 5- 1 5°C unterhalb Tm und einer Ionenstaike \ on 15 mM Na (entspπcht 0 1 \ SSC ) gew aschen W nd eine RNA- Probe zui Fhbπdisieiung v erw endet so ist dei Schmelzpunkt um 10-1 ^ C hoher Bevorzugte Hybπdisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben
Hybπdisierungslosung 6X SSC / 5X Denhardt's Losung / 50 % Formamid, Hybπdisierungstemperatur 36°C, bevorzugt 42°C, 1 Waschschritt 2X SSC, 30 min bei Raumtemperatur,
2 Waschschritt IX SSC, 30 min bei 50°C, bevorzugt 0,5X SSC, 30 min bei 65°C, besonders bevorzugt 0,2X SSC, 30 min bei 65°C
Der Ausdruck "N-terminale Rezeptordomane", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Peptidregion, die funktioneil der Peptidregion mit einer Aminosauresequenz von Position 1 bis Position 394 der Sequenz gemäß SEQ ID NO 2 entspricht
Der Grad der Identität der Nukleinsäuren wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms NCBI BLASTN Version 2 0 4 (Altschul et al , 1997)
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die regulatorischen Regionen, welche natürlicherweise in Pflanzenzellen, insbesondere in Tabakpflanzen, die Transkription der erfindungsgemaßen Nukleinsäuren kontrollieren
Der Ausdruck "regulatorische Regionen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf nicht-translatierte Regionen des betreffenden Gens, wie Promotoren, Enhancer, Repressor- oder Aktivator-Bindungsstellen oder Terminationssequenzen, die mit zellularen Proteinen interagieren, wodurch die Transkription gesteuert wird
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine er- findungsgemaße Nukleinsaure und einen heterologen Promotor umfassen
Dei \usdi uck "heteiologci Promotoi " w ie ei hieπn v erw endet w nd. bezieht sich auf einen Piomotoi, der andeie Eigenschaften als deηenige Piomotoi au t weist, der im
Urspi ungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhangig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden Beispiele für heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-,
T7- oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungs- gemaße Nukleinsaure, eine erfmdungsgemaße regulatorische Region oder ein erfin- dungsgemaßes DNA-Konstrukt enthalten Als Vektoren können alle in molekularbio- logischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden
Bevorzugte Vektoren sind pBIN (Bevan, 1984) und seine Derivate für pflanzliche
Zellen, pFL61 (Minet et al , 1992) für Hefezellen, pBLUESCRIPT- Vektoren für bakterielle Zellen, lamdaZAP (Fa Stratagene) für Phagen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfϊndungs- gemäße Nukleinsaure, ein erfindungsgemaßes DNA-Konstrukt oder einen erfin- dungsgemaßen Vektor enthalten
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemaßen Nukleinsäuren nicht enthalten
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E coh. als auch eukaryotische Zellen, ie Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastons, Insekten, Pflanzen. Fioschoozyten und Zellhnien v on Saugern
Gegenstand der v orliegenden Erfindung sind w eiteih Poly peptide mit der biolo gischen Akti ität v on rezeptorahnhchen Protemkinasen, die von den erf dungsge- maßen Nukleinsäuren codiert werden Insbesondere handelt es sich um Polypeptide, die erfindungsgemaße Seπn-/Threonm-Kιnasen darstellen
Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosaureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosaureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden Er umfasst Aminosaureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Ruckgrat, an der Aminosaure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus Sie umfassen beispielsweise Acetyherungen, Acyherungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Ham-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Deπvaten, Lipiden oder Lipid- Derivaten oder Phophatidyhnositol, Cychsierungen, Disulfidbruckenbildungen,
Demethyherungen, Cystin-Bildungen, Formyherungen, gamma-Carboxyherungen, Glycosyherungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methyherungen, Myπstoyhe- rungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphoryherungen, Selenoyherungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren
Die erfindungsgemaßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z B als Fusionsproteine, vorliegen Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusatzliche stabih- sieiende Aminosäuren aufweisen
Die erfindungsgemaßen Polypeptide müssen nicht vollständige rezeptorahnliche Protemkinasen darstellen, sondern können auch nui Fragmente davon sein solange sie zumindest noch eine biologische Aktiv ität der vollständigen Protemkinasen aufweisen Polypeptide, die eine gleichartige biologische Aktivit t wie eine rezeptorahnliche Protemkmase mit einer Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO 2 ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet. Dabei müssen die erfindungsgemäßen Polypeptide nicht von rezeptorähnlichen Proteinkinasen aus Tabak ableitbar sein. Als erfindungsgemäß werden auch Polypeptide betrachtet, die rezeptorähnlichen Proteinkinasen beispielsweise der folgenden Pflanzen entsprechen oder Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität dieser ausüben können: Mais, Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Roggen, Tomaten, Leguminosen, Kartoffelpflanzen, Lactuca sativa, Brassicaceen, Holzgewächse, Physcomitrella patens.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Vergleich zu der entsprechenden Region von natürlich vorkommenden rezeptorähnlichen Proteinkinasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
Ursprünglicher Rest Substitution
Ala Gly, Ser
Arg Lys
Asn Gin, His
Asp Glu
Cys | Ser
Gegenstand der vorhegenden Erfindung sind somit auch Polypeptide, welche zumindest eine biologische Aktivität einer rezeptorahnhchen Proteinkinase ausüben und eine Aminosauresequenz umfassen, die eine zumindest 60 %ιge Identität, vorzugsweise eine zumindest 80 %ιge Identität, besonders bevorzugt eine zumindest 90 %ιge Identität, ganz besonders bevorzugt 97-99 %ιge Identität, mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO 2 über deren Gesamtlange aufweist
Der Grad der Identität der Aminosauresequenzen wird vorzugsw eise bestimmt mit
Hilfe des Programms BLASTP + BEAUTY Version 2 0 4 (Altschul et al 1997)
Eine be oizugte Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Polv peptide ist die cvto kinmregulieite rezeptorahnliche Proteinkinase (CRK 1 ) mit dei Aimnosauresequen/ gemäß SEQ ID NO 2 In der CRKl -Aminosäuresequenz konnten die 1 1 Kinasedomänen bestimmt werden, in denen alle nach Hanks et al., 1988 definierten Aminosäuren vorhanden sind. Es handelt sich somit um eine Serin-/Threonin-Kinase. Das CRKl -Protein besitzt im Bereich der Aminosäuren 390 und 410 eine Transmembrandomäne. Die ersten 28 Aminosäuren mit einem positiv geladenen Aminosäurerest und einem hydrophoben
Bereich von 15 Aminosäuren am N-Terminus stellen eine Signalsequenz dar. Die Abspaltungsstelle befindet sich vermutlich zwischen den Aminosäuren 28 und 29. Diese Signalsequenz sorgt für eine Translokation des neu-synthetisierten CRK1- Proteins durch die Membran des endoplasmatischen Reticulums und einen weiterführenden Transport in die Plasmamembran. Die N-terminale Domäne von
CRKl zwischen den Aminosäuren 29 und 390 befindet sich extracytoplasmatisch Diese extrazelluläre Domäne umfasst vier Bereiche, die zu ATP/GTP-Bindestellen bzw. zu Bindestellen für cyclische Nukleotide eine >70%-ige Homologie aufweisen. Im Fall von CRKl stellen Cytokinine mögliche Liganden dar. Als Adenin-Derivate weisen Cytokinine eine strukturelle Ähnlichkeit zu Purinen auf.
Cytokinine gehören zur Gruppe der Pflanzenhormone und besitzen die Fähigkeit, die Zellteilung zu induzieren. Inzwischen sind mehr als 40 natürlich vorkommende Cytokinine isoliert worden, wobei alle bekannten Cytokinine Adenin-Derivate dar- stellen. Die Aktivität wird von der Art der Substituenten, vor allem der N6-Gruppe bestimmt (Übersicht in Shaw, 1994 und Kaminek, 1992).
Es gibt ein vielfältiges Spektrum an Wirkungen, die mit Cytokininen im Zusammenhang gebracht werden. Neben der Induktion der Zellteilung in Kombination mit Aux , beeinflussen Cytokinine auch Differenzierungsprozesse. Ein hohes Cyto- kinin- zu Auxin-Verhältnis führt in vitro bei Kallus zur Sprossbildung, ein hohes Auxm- zu Cytokinin-Verhältnis zur Wurzelbildung (Skoog und Miller, 1957) Cytokinine verursachen eine Reduktion der apikalen Dominanz, was ein Austreiben der Seitenknospen zur Folge hat (Wickson und Thimann, 1958). Eine bedeutende Rolle kommt den Cytokininen auch bei der Verzögerung der Blattseneszenz zu
Cytokinine bewirken dabei u.a. eine Inaktivierung von proteolytischen Enzymen, von Lipasen und Lipoxykmasen, welche für Abbauprozesse verantwortlich sind Zu weiteren klassischen Wirkungen der Cytokininen zahlt der fordernde Emfluss auf die Chloroplastenentwicklung und die Inhibierung des Wurzellangenwachstums
Cytokinine sind notwendig für die normale Pflanzenentwicklung Ein Überangebot dieses Hormons führt zu äußerst gedrungenen, sterilen Pflanzen
Da die CRKl -Transkriptmenge durch Cytokinine reguliert wird, kann es eine Komponente des Cytokinin-Signaltransduktionsweges darstellen Die Transkπpt- menge von CRKl wird durch Cytokinine spezifisch, transient reguliert Das CRK1 -
Gen unterliegt danach einer frühen Regulation, 30 min nach Zugabe von 5 x 10 7 M BAP erfolgt eine nahezu vollständige Reduktion der Transkriptmenge Je nach Cytokininkonzentration akkumulieren nach 9 - 24 h Cytokininbehandlung die CRKl -Transkripte erneut, so dass man von einer transienten Regulation ausgehen kann Diese Regulation konnte eine negative Ruckkopplung darstellen, um zu gewährleisten, dass eine Zelle zwar kompetent für ein Signal ist, diese Sensitivitat aber durch eine Reduktion der Proteinmenge von Signaltransduktionskomponenten verändert werden kann Für den CRKl -Rezeptor wird postuliert, dass die Zelle nach Aufnahme des Signals für eine bestimmte Zeitdauer nicht in der Lage ist, auf weitere Cytokimnsignale zu reagieren
Bei der Ermittlung der Dosisabhangigkeit der Regulation erweist sich eine sehr ge¬
1 7 rriinnggee CCyyttookkiinniinnkkoonnzzeennttrraattiioonn vvoon 5 x 10 M BAP als ausreichend zur vollständigen Reduktion der Transkπptmenge
Andere Pflanzenhormone, wie Gibberelhnsaure, ACC, Brassinosteroide und Jasmon- saure, sowie das strukturelle Analog Adenin führen in vergleichbarer Konzentration nicht zu einer Veränderung der CRKl -Transkπptabundanz Auxin und Abscisinsaure fuhren erst in wesentlich höheren Konzentrationen als Cvtokinm zu einer Abnahme dei CRKl Transkπptabundanz Der Ausdruck "biologische Aktivität einer rezeptorahnhchen Proteinkinase", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Veränderung der Zellaktivitat und des Pflanzenwachstum nach Ligandenbindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Antikörper, die spezifisch an die erfindungsgemaßen Polypeptide binden Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt auf die übliche Weise Diese Antikörper können beispielsweise dazu genutzt werden, um Expressionsklone, z B einer Genbank, zu identifizieren, die die erfindungsgemaßen Nukleinsäuren tragen
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hierin verwendet wird, erstreckt sich auch auf Teile vollständiger Antikörper, wie Fa-, F(ab )2- oder Fv-Fragmente, welche noch die Fähigkeit besitzen, an die Epitope der erfindungsgemaßen Polypeptide zu binden
Weiterhin sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemaßen Nukleinsäuren Gegenstand der vorliegenden Erfindung Die erfindungsgemaßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden Beispielsweise können die Nukleinsauremolekule vollständig chemisch synthetisiert werden Man kann auch kurze Stucke der erfindungsgemaßen Nukleinsäuren chemisch synthetisieren und solche Ohgonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren
Die markierten Ohgonukleotide können auch verwendet werden, um ausgehend von Pflanzen-mRNA hergestellte cDNA-Banken zu durchsuchen Klone, an die die markierten Ohogonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA-Fragmente ausgewählt Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhalt man auf einfache Weise die erfindungsgemaßen Nukleinsäuren
Die erfmdungsgemaße Nukleinsäuren können auch mittels PCR-Verfahren unter X erw endung chemisch synthetisiertet Ohgonukleotide heigestellt werden Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in-vitro-
Systemen hergestellt werden.
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligo- nukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese. FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen). Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie. Da rezeptorahnliche Proteinkinasen Membranproteine darstellen, werden in den Reinigungsverfahren vorzugsweise Detergensextraktionen durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung von Detergenzien, die die Sekundär- und Tertiarstrukturen der Polypeptide nicht oder nur wenig beeinflussen, wie nicht-ionische Detergenzien
Die Reinigung der erfindungsgemaßen Polypeptide kann die Isolierung von Membranen ausgehend von Wirtszellen, die die erfindungsgemaßen Nukleinsäuren expπ- mieren, umfassen Vorzugsweise expπmieren solche Zellen die erfindungsgemaßen Polypeptide in einer ausreichenden Kopienanzahl, so dass die Menge der Polypeptide m einer Membranfraktion mindestens 10-fach hoher ist als diejenige, die in vergleichbaren Membranen von Zellen gefunden w ird, die das CRKl -Gen natürlicherweise expπmieren, besonders bevorzugt ist Menge mindestens 100-fach, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000-fach hoher
Die Ausdrucke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemaßen Polypeptide von anderen Proteinen oder ande ren Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemaßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Praparation aus den Wirtszellen mindestens 10- fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert
Die erfindungsgemaßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitatsgereinigt werden
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, die an die erfindungsgemaßen Polypeptide binden und deren Eigenschaften v erändern Aufgrund der v ielfaltigen Funktionen der erfindungsgemaßen rezeptorahnhchen Proteinkinasen können Modulatoren, die die Aktiv ität beeinflussen neue w uchsreguherende oder herbizide Wirkstoffe darstellen Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Signaltransduktion der erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteinkinasen, d.h. die Autophosphorylierung der Serin- und/oder Threonin-Reste, beschleunigt oder verstärkt.
Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Signaltransduktion der erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteinkinasen, d.h. die Autophosphorylierung der Serin- und/oder Threonin-Reste, verlangsamt oder verhindert.
Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktioneile Mimetika davon. Der Ausdruck "Modulator" umfasst jedoch nicht Cytokinine.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.
Die Bindung der Modulatoren an die erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Protein- kinasen kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben der damit behandelten Pflanzen führt.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, welche die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verändern. Auch solche "Expressionsmodulatoren" können neue wuchsregulierende oder herbizide Wirkstoffe darstellen. Expressionsmodulatoren können kleine orga- msch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikoφer sein, die an die regulatonschen Regionen der für die erfindungsgemaßen Polypeptide codierenden Nukleinsäuren binden Weiterhin können Expressionsmodulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikoφer sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an regulatorische Regionen der für die erfindungsgemaßen Polypeptide codierenden
Nukleinsäuren bindet, und dadurch deren Expression beeinflusst Expressionsmodulatoren können auch Antisense-Molekule sein
Daher erstreckt sich die vorhegende Erfindung auch auf die Verwendung von Mo- dulatoren der erfindungsgemaßen Polypeptide oder von Expressionsmodulatoren als
Pflanzenwuchsregulatoren oder Herbizide
Die erfindungsgemaßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screenmg (high throughput screening, HTS) ein Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Praparationen verwendet werden, die die erfindungsgemaßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemaßen Polypeptide enthalten
Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z B Produkte der in vz/ro-Transkπption) oder ein zellularer Bestandteil, wie eine Membran oder irgendeine andere Praparation, die die erfindungsgemaßen Polypeptide enthalt, zusammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmolekuls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden Die Fähigkeit des Kandidatenmolekuls die Aktivität der erfindungsgemaßen Polypeptide zu erhohen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder verringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder vernngerten Umsetzung des markierten Substrates Moleküle, die gut binden und zu einer erhöhten Aktiv ität der erfindungsgemaßen Polypeptide fuhren, sind Agonisten Moleküle, die gut binden, aber nicht die biologische Aktiv ität der erfin dungsgemaßen Polypeptide auslosen, sind w ahrscheinlich gute Antagonisten Die Detektion der biologischen Aktiv itat der erfindungsgemaßen Polypeptide kann durch ein sog Reportersystem verbessert werden Reportersysteme dieser Hinsicht um- fassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch markierte Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Aktivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.
Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfin- dungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z.B. radioaktiv oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität eines Agonisten oder Antagonisten ermessen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure, eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts oder eines erfindungsgemäßen Vektors zum Herstellen von transgenen Pflanzen, sowie die entsprechenden transgenen Pflanzen als solche bzw. deren Teile oder Vermehrungsmaterial.
Transgene Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzenvermehrungsmaterialien, in denen nach Einbringen einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure, eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts oder eines erfindungsgemäßen Vektors die intrazelluläre Konzentration der rezeptorähnlichen Proteinkinasen im
Vergleich zu den entsprechenden Wildtypformen erhöht oder vermindert ist, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Der Ausdruck "Pflanzenteile", wie er hierin verwendet wird, bedeutet alle oberirdi- sehen und unterirdischen Teile und Organe der Pflanzen, wie Sproß, Blatt, Blüte und
Wurzel, sowie daraus hergestellte Protoplasten und Gewebekulturen. Der Ausdruck "Vermehrungsmatenal", wie er hierin verwendet wird, bedeutet vegetatives und generatives Vermehrungsmatenal, wie Steckimge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen
Gegenstand der Erfindung sind auch Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzenvermehrungsmateπalien, in denen Veränderungen an der für endogene Rezeptorkinasen codierenden Sequenz vorgenommen und selektioniert werden, die zur Herstellung einer erfindungsgemaßen Rezeptorkinase fuhren oder in denen durch Mutagenese eine Erhöhung oder Verminderung der endogenen Rezep- torkinaseaktivitat erreicht wird
Beispielsweise können bereits in der Pflanze befindliche endogene Rezeptorkinase- gene durch Mutagenese, beispielsweise mit Ethylmethanosulfonat (EMS), verändert werden Nach der Mutagenese können durch Sequenzanalyse, Ligandenbindungsstu- dien oder Analyse einer durch die Ligandenbindung hervorgerufenen biochemischen Reaktion gezielt Individuen selektioniert werden, die aufgrund der Mutagenese er- findungsgemaße Rezeptorkinasen mit erhöhter oder verminderter Aktivität produzieren In gleicher Art und Weise kann durch Mutagenese der regulatorischen Sequen- zen die Expression eines bereits in der Pflanze befindlichen erfindungsgemaßen Re- zeptorkinasegens so verändert werden, dass Pflanzen mit einer verminderten oder erhöhten Ligandensensitivitat entstehen Solche Pflanzen können durch allgemein bekannte Methoden der Genexpressionsanalyse wie Northern blot oder Western blot identifiziert werden
Da die erfindungsgemaßen rezeptorahnhchen Proteinkinasen, insbesondere der CRKl -Rezeptor, eine Rolle in der Signalperzeption spielt, erhalt man in transgenen "sense" Pflanzen odei in Pflanzen, die auf eine erhöhte Menge oder Aktivität ent sprechender endogener Rezeptorkinasen oder in der Signaltiansduktion damit v er knupftei Elemente gezielt selektioniert wurden, eine erhöhte Ligandensensitivitat
Zum einen können durch solche Veränderungen schon geringere Liganden Konzentrationen erfasst und als Signal weitergeleitet werden. Es kann auch durch Anschalten des Signalübertragungsweges Ligandenwirkung in der Abwesenheit eines Liganden erzielt werden. Andererseits kann bei einer konstitutiven Expression keine negative Rückkopplung eintreten, so dass die Zellen eine ständige Kompetenz für das Signal aufweisen. Eine Reaktion auf diese Situation sind verstärkte Liganden-
Effekte. Transgene "antisense" Pflanzen oder Pflanzen mit einer verminderten Re- zeptorkinaseaktivität haben eine verminderte Liganden-Sensitivität. Eine Erhöhung oder Verminderung der Rezeptorkinaseaktivität kann zu Pflanzen führen, die eine veränderte Entwicklung, veränderte Physiologie oder eine veränderte Moφhologie aufweisen.
Beispiele
Beispiel 1
Isolierung der beschriebenen Nukleotidsequenz CRKl:
Mit Hilfe der Methode der Representational Difference Analysis (RDA) (Hubank und Schatz, 1994) wurde ein 400 bp Fragment von CRKl aus Zellsuspensionskultu- ren von Nicotiana tabacum L Kultivar Wisconsin 38 (Skoog und Miller, 1957) ISO-
Representational Difference Analysis (RDA) stellt eine Methode zur Isolierung diffe- rentiell expnmierter Gene dar Die zwei zu vergleichenden Proben wurden durch eine Tabakzellkultur gebildet, die ohne Cytokininzugabe kultiviert wurde und einer Zell- kultur, der nach 5 Tagen Subkultivierung für 45 min 10 7 M BAP (Benzylaminopu- πn) hinzugefügt wurde
Die erhaltenen Fragmente wurden in den Vektor pUC19 klomert Das Fragment von CRKl wurde weiterhin als Sonde für Northern und Southern Blots verwendet und in einem cDNA-Bibhothek-Screening zur Isolierung der vollständigen cDNA von
CRKl als Sonde eingesetzt
Isolierung der vollständigen cDNA Sequenz von CRKl
(modifiziert nach Stratagene)
Es wurde v on der Firma SCInet eine cDNA-Bibhothek im λ-ZAP-Express Vektoi nach Angaben des Herstellers Stratagene hergestellt Dafür wurden 400 μg Gesa t- RNA dei Tabaksuspensionskultur W 38 der Fπ ma zui \ ei fugung gestellt Es wai v orher sichei gestellt dass die gesuchte mR\ \ in der Kultur expπmiert w ird Nach Erhalt der fertigen cDNA-Bibhothek w uide dei 1 iter ubeφruft und in einem fünfstu figen Screen nach der vollständigen CRKl-cDNA gesucht Der Titer der cDNA-Bib- hothek betrug 1 x 109 pfu /ml
200 μl E coh XLl-Blue MRF' Zellen wurden für 20 min bei RT mit 100 000 pfu der entsprechenden cDNA-Bank mkubiert, 7 ml Top-Agar zugegeben und auf vorgewärmte (37° C) NZY-Agaφlatten (Durchmesser von 145 mm) ausgegossen Nach Inkubation UN bei 37° C folgte die Identifizierung von Phagen, die eine Insertion homolog zur verwendeten Sonde tragen
Pπmar Screen
Die Phagenplatten wurden für 1 h bei 4 °C abgekühlt, Nylonfilter für 1 mm aufgelegt, mit der DNA-Seite nach oben für 2 min auf in Denatuπerungslosung getränktem Whatman 3M Filteφapier und 5 min auf in Neutrahsierungslosung getränktem Whatman 3M Filteφapier inkubiert Die Filter wurden kurz in eine 2 x SSC-Losung getaucht, getrocknet und zur DNA-Fixierung mit UV-Licht bestrahlt (UV-Transil-
2 luminator, 0, 12 J/cm )
Nach der Identifizierung positiver Plaques wurden diese im Pπmar-Screen mit einem Skalpell großzugig (ca 1 cm ) ausgeschnitten und mit 3-5 ml SM-Puffer mind eine Stunde geschüttelt Von der Suspension wurde für einen Sekundar-Screen 1 μl und
1 μl einer 1 10 Verdünnung verwendet Positive Plaques im Sekundarscreen wurden mit stenlen Pasteuφipetten ausgestochen, in 500 μl SM-Puffer gelost und davon 30 μl einer 10 2 Verdünnung für einen Tertiar-Screen verwendet Für eine weitere Screening-Runde wurde die gleiche Verdünnung verwendet und es konnten zum Teil Emzelplaques erhalten werden Mit diesen positiven Einzelplaques wurde eine fünfte
Runde durchgeführt, in der alle auf der Platte erhaltenen Einzelplaques positiv sein mussten, damit der entsprechende Klon weiterbearbeitet wurde Von diesen Einzel plaques w urden die cDNA-Inserts über eine Excisionsi eaktion in einem E coh XLOLR Stamm in Plasmid-DNA überfuhrt und isoliert Dabei w urde nach Angaben des Herstellers Stiatagene v erfahren 573 -RACE
Zur Isolierung der im identifizierten cDNA Klon fehlenden 5 '- und 3 '-Enden wurde das Verfahren des 573 '-RACE angewendet
Das 5'-RACE beruht auf der spezifischen Amplifizierung des 5 -Endes eines Gens aus mRNA Mit Hilfe eines sequenzspezifischen Pπmers und der AMV Reversen Transkπptase wird der cDNA-Erststrang synthetisiert An das Produkt wird ein ein poly (A)-Schwanz angehängt, so dass in der nachfolgenden PCR ein ohgo dT-Anker- primer und ein nested sequenzspezifischer Primer eingesetzt werden kann In einer zweiten PCR kann ein weiterer nested Primer verwendet werden, um die Spezifitat zu gewährleisten
Im 3 '-RACE erfolgt die cDNA-Erststrangsynthese mit einem ohgo dT-Pnmer und die nach-folgenden PCR Reaktionen mit sequenzspezifischen Pπmern Die Produkte wurden mit dem „TA-Cloning Kit" von Pharmacia kloniert
Beispiel 2
Zur Ubeφrufung einer differentiellen Expression von CRKl in Reaktion auf Cytokinin wurden Northern Blot- Analysen durchgeführt
Gesamt-RNA Isolierung aus Tabaksuspensionskulturen
(Puissant und Houdebine, 1990)
Zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus Suspensionszellkulturen wurden die Zellen über eine Nutsche, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen war, kurz getrocknet
Das Material wurde in flussigem Stickstoff eingefroren und bei -80° C bis zum Beginn der RNA-Isoherung gelagert
1 g Pflanzenmateπal wird bei 4° C mit 5 ml gekühlten RNA-Isoherungspuffer durch Mörsern homogenisiert Das homogenisierte Pflanzenmaterial wird in Greiner-Rohr- chen überführt Es wird 0,5 ml 2 M Natπumacetat (pH 4 0) zugegeben und auf einem Vortex-Vibrationsmischer behandelt Nach Zugabe von 5 ml Phenol wird die Losung wiederum auf dem Vibrationsmischer durchmengt Zur besseren Phasentrennung wird 1 ml Chloroform zugegeben und 10 min bei 4000 Upm zentπfugiert Die wassπge Phase wird abgenommen und in ein frisches Greiner-Rohrchen überfuhrt
Die RNA wird mit 0,7 Volumenanteilen Isopropanol und Zentπfugation bei 4000 Upm für 10 mm ausgefallt Das gesammelte Pellet wird zur Reinigung von Polysacchaπden in 2 ml 4 M Lithiumchloπd resuspendiert und nochmals für 10 min bei 4000 Upm zentπfugiert Das Pellet wird in 2 ml TES-Puffer resuspendiert und zur Reinigung von Proteinen und Phenolruckstanden mit 2 ml Chloroform vermengt und zur Phasentrennung 10 min bei 4000 Upm zentπfugiert Die wassπge Phase wird abgenommen, in Eppendoi f-Reaktionsgefaße überfuhrt und die RNA mit 0,7 \ olumenanteilen Isopropanol und einei Endkonzentration v on 0,3 M Natπumacetat (pH 5,2) ausgef llt Es erfolgt eine Zentnfugation v on 30 min bei 4000 Upm An schließend w eiden Salze aus dem RN A-Pellet mit 70% Alkohol gew aschen Es w nd 10 min bei 4000 Upm zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Alkohols wird das Pellet im Vakuum getrocknet und in 17 μl TE gelöst.
Isolierung von polyA-mRNA aus Gesamt-RNA Präparationen (nach Protokoll des Herstellers Dynal)
Das Prinzip der Reinigung basiert auf der Abtrennung polyadenylierter mRNA durch o/z'go-öT-beschichteten Dynabeads nach den Angaben des Herstellers. Die Ausbeute an mRNA lag etwa bei 1 -2% der eingesetzten Gesamt-RNA Ausgangsmenge.
Die Anwendung erfolgte nach Angaben des Herstellers.
Das Agarose wird mit einer Endkonzentration von 1 ,5% Agarose in H2O dest. Angesetzt und aufgekocht. Nach Abkühlen auf 60° C werden 1/10 Volumenanteil 10 x MOPS-Puffer und 1/6 Volumenanteil Formaldehyd (37%) zugegeben. Zur Übeφrii- fung identisch aufgetragender Mengen wird EtBr addiert. Nach dem Aushärten wird das Gel für 10 min auf 19 V eingestellt. 50 μg der Nukleinsäure-Proben und 3 μl des Längenstandards ( RNA: 0,24-9,5 kb RNA-Ladder von Gibco BRL Lifetechnologies) werden mit 2 Volumenanteilen Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 65° C im Heizblock denaturiert. Die RNA-Proben werden bei 45 V ca. 5 h elektrophoretisch aufgetrennt.
Transfer der RNA auf eine Nylonmembran
Die im denaturierenden Agarose-Formaldehyd-Gel elektrophoretisch aufgetrennten
Nukleinsäure-Proben werden auf Nylonmembran geblottet. Dazu wird auf einer Glasscheibe 3M Whatman Saugpapier mit 10 x SSC-Puffer getränkt und über zwei Behältnissen luftblasenfrei so angebracht, dass seine Enden in die Behältnisse eintauchten. Diese sind ebenfalls mit 10 x SSC-Puffer gefüllt. Das Gel w ird, die Ober- seite nach unten, luftblasenfrei auf das 3M Whatman Saugpapier gelegt und mit der
Nvlonmembran abgedeckt. Die Membran sollte nicht größer als das Gel sein und luftblasenfrei auf dem Gel liegen Auf die Nylonmembran werden dann zwei Lagen 3M Whatman Saugpapier aufgelegt Das Agarosegel wird nun so mit Folie abgedichtet, dass keine Flüssigkeit an ihm vorbei aufgesaugt werden kann Auf das 3M Whatman Saugpapier wird etwa 5 cm Saugpapier, eine größere Glasscheibe und darauf ein etwa ein halbes Kilogramm schweres Gewicht plaziert Es wird mindestens 6 h geblottet Die RNA wird durch \J /-cι os shnkιng mit einer Fluo Link-UV- Lampe fixiert Die Dosis betragt 0,12 J/cm
Radioaktive Markierung durch "In vitro Transcription"
Das zu markierende Fragment muss in einem Vektor klomert sein, welcher einen T3- und/oder einen T7-Promotor besitzt, z B pBluescπpt Das Plasmid wird mit einem Restriktionsenzym verdaut, welches stromabwärts der zu transkπbierenden Sequenz hegt, um eine Transkription des gesamten Plasmids zu verhindern Nach einem
Proteinase K Verdau wird die DNA einer Phenol/Chloroform Ausschuttelung unterzogen und gefallt
Die Sequenz des 1 5 Klons wurde aus dem pUC19-Vektor über Eco RI und Xba I Schnitt-steilen herausgeschnitten und über die gleichen Restriktionsschnittsteilen in den pBluescπpt SK-Vektor klomert Unter Verwendung des T3-Promotors kann mit der T3-Polymerase eine antisense-RNA synthetisiert werden Zur Markierung wurde 1 μg DNA eingesetzt Es wurde mit dem '7/7 vüi o transcπptιon"-Kιt von Stratagene gearbeitet und nach den Angaben des Herstellers verfahren Nach der "In viti o Transcnption" wurde ein DNase-Verdau von 15 min durchgeführt Die RNA wurde
Phenol/Chloroform ausgeschüttelt und gefällt Die Einbaurate betrug im Durch schnitt 5 10 cpnVμg DNA Die maikierte Sonde w urde nach einer Denaturierung zui orhvbπdisierten Membi an gegeben Abtrennung der nicht eingebauten Nukleotide
Eine Sephadex G50 Saule ("Nick Columns", Fa Pharmacia) wird mit 10 ml Wasser gewaschen Der Markierungsansatz und 350 μl Wasser werden aufpipettiert, das Eluat verworfen Es werden nochmals 400 μl Wasser auf die Saule gegeben Das Eluat enthalt die markierte Probe 1 μl des Eluats werden zur Bestimmung der spezifischen Aktivität (cpm/μg DNA) entnommen Diese sollte mindestens 108 cpm/μg eingesetzter DNA betragen Das restliche Eluat wird 10 min bei 95 °C denatuπert und nach kurzem Abkühlen auf Eis in die Hybπdisierungsrohre gegeben
Hybridisierung mit "P-markierten Nukleinsäure-Fragmenten
Die Nylonmembran mit der fixierten Nukleinsaure wird in eine Hybπdisierungsrohre gegeben Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran wird zuerst eine Vorhybπdisierung mit Heπngssperma durchgeführt Zu diesem Zweck werden 10 ml Hybπdisierungslosung je 10 cm2 Membran in die Hybπdisierungsrohre gegeben und mit 1 ml frisch denaturierter Heringsspermlosung (10 μg/ml) je 10 ml Hybπdisierungslosung versetzt Die Vorhybπdisierung findet ebenso wie die Hybridisierung bei 68°C im Hybπdisierungsofen statt Die Vorhybπdisierung sollte mindestens eine halbe Stunde dauern, anschließend wird die markierte und frisch denaturierte DNA-Probe zugesetzt Die Hybridisierung wird über Nacht durchgeführt
Am nächsten Tag wird nicht hybridisierte DNA-Probe und unspezifische Bindungen von der Membran abgewaschen Dazu wird zuerst zweimal für jeweils 15 min bei
Raumtemperatur mit 2 x SSC, 0,1 % SDS-Losung und anschließend für 30 mm bei Hvbπdisierungstemperatur mit 0,2 x SSC , 0,1 % SDS-Losung gewaschen
Die Membi an w n d in Folie eingeschw eißt und ein Röntgenfilm zui Detektio auigelegt Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäuren, die für pflanzliche Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Proteinkinase, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, codieren.
2. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie für Polypeptide mit der Aktivität von Serin-/Threonin-Kinasen codieren.
3. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.
4. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.
5. Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Tabakpflanzen stammen.
6. Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus
(a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 ,
(b) Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, welches die Amino- säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
(c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter (a) oder (b) definierten Sequenzen,
(d ) Sequenzen, welche an die unter (a) oder (b) definierten Sequenzen hybridisieren, (e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ιge Identität mit den unter (a) oder (b) definierten Sequenzen aufweisen,
(f) Sequenzen, welche eine zumindest 60 %ιge Identität mit der N- terminalen Rezeptordomane der unter a) oder b) definierten Sequenzen aufweisen,
(g) Sequenzen, welche zu den unter a) oder b) definierten Sequenzen komplementär sind, und
(h) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneπertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosauresequenz kodieren wie die unter (a) bis (e) definierten Sequenzen
Regulatorische Region, welche natürlicherweise die Transkription einer
Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in Pflanzenzellen, insbesondere in Tabakpflanzen, kontrolliert
DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen heterologen Promotor
Vektor umfassend eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eine regulatorische Region gemäß Anspruch 7 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 8
Vektor gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsaure funktionell mit regulatorischen Sequenzen v erknüpft ist die die Expi ession dei ukleinsaui e in pi o odei eukarvotischen Zellen gew ährleisten
1 1. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 8 oder einen Vektor gemäß Anspruch 9 oder 10.
12. Wirtszelle gemäß Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle, insbesondere um E.coli, handelt.
13. Wirtszelle gemäß Anspruch 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere um eine Hefe-, Insekten-, Säugetier oder Pflanzenzelle, handelt.
14. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Kinase, welches von einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird.
15. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Kinase, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine zumindest 60%ige Identität mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.
16. Antiköφer, welcher spezifisch an ein Polypeptid gemäß Anspruch 14 oder 15 bindet.
17. Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Vollständige chemische Synthese auf an sich bekannte Weise oder
(b) chemische Synthese von Oligonukleotiden, Markieren der Ohgonukleotide, Hybridisieren der Ohgonukleotide an DNA einer genomischen oder cDNA-Bank, die ausgehend von genomischer DNA bzw. mRNA aus Pflanzenzellen hergestellt wurde, Selektieren von positiven Klonen und Isolieren der hybridisierenden DNA aus positiven Klonen oder
(c) chemische Synthese von Oligonukleotiden und Amplifizierung der Ziel-DNA mittels PCR.
18. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids gemäß Anspruch 14, umfassend
(a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 1 bis
13 unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 gewährleisten, oder
(b) das Exprimieren einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem in v tro-System, und
(b) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro- System.
19. Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die an ein Polypeptid gemäß Anspruch 14 oder 15 bindet, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 1 bis 13 oder eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder 15 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, und
(b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezi fisch an das Polypeptid bindet. Verfahren zum Auffinden einer Verbindung, welche die Expression von Polypeptiden gemäß Anspruch 14 verändert, umfassend die folgenden Schritte
(a) Inkontaktbπngen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 1 bis 13 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen,
(b) Bestimmen der Polypeptidkonzentration, und
(c) Bestimmen der Verbindung, welche die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst
Verwendung einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eines DNA-Konstrukts gemäß Anspruch 8, eines Vektors gemäß Anspruch 9 oder
10, einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 1 bis 13, eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder 15, oder eines Antikoφers gemäß Anspruch 16 zum
Auffinden neuer herbizider Wirkstoffe
Verwendung eines Modulators eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder 15 als Pflanzenwuchsregulator oder Herbizid
Verwendung einer Nukleinsaure gemäß einem der Anspr che 1 bis 6, eines DNA-Konstrukts gemäß Anspruch 8, eines Vektors gemäß Anspruch 9 zum Herstellen von transgenen Pflanzen
Transgene Pflanzen, Pflanzenteile Piotoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzern ermehrungsmateπahen, daduich gekennzeichnet, dass nach Einbi mgen einer Nukleinsauie gemäß einem dei Ansprüche 1 bis 6 eines D\ A- Konstrukts gem ß Anspruch 8 odei eines V ektors gemäß Anspruch 9 die intrazelluläre Konzentration eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen erhöht oder vermindert ist.
25. Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzenver- mehrungsmaterialien, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid gemäß
Anspruch 15 enthalten, dessen biologische Aktivität oder Expressionsmuster im Vergleich zu den entsprechenden endogenen Polypeptiden verändert ist.
26. Verfahren zum Herstellen von Pflanzen, Pflanzenteilen, Protoplasten, Pflan- zengeweben oder Pflanzenvermehrungsmaterialien gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eine regulatorische Region gemäß Anspruch 7 durch endogene Mutagenese verändert.
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