JP2002534115A - 植物細胞から単離された組成物及び植物細胞シグナル伝達の改変におけるその利用 - Google Patents
植物細胞から単離された組成物及び植物細胞シグナル伝達の改変におけるその利用Info
- Publication number
- JP2002534115A JP2002534115A JP2000593728A JP2000593728A JP2002534115A JP 2002534115 A JP2002534115 A JP 2002534115A JP 2000593728 A JP2000593728 A JP 2000593728A JP 2000593728 A JP2000593728 A JP 2000593728A JP 2002534115 A JP2002534115 A JP 2002534115A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- plant
- dna
- sequences
- eucalyptus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
植物細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードする新規な単離ポリヌクレオチドが、かかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡコントラストとともに提供される。かかるコントラストを植物における細胞シグナル伝達の改変に用いる方法も、かかるコントラストを含むトランスジェニック植物とともに開示される。
Description
【０００１】 本発明の技術分野 本発明は、環境の変化のような外界からの信号及び発生過程での合図に対する
植物細胞の応答を改変することに関する。より具体的には本発明は、植物細胞膜
に内在し細胞のシグナル伝達の過程を媒介するポリペプチドをエンコードする、
単離されたポリヌクレオチドを提供する。
植物細胞の応答を改変することに関する。より具体的には本発明は、植物細胞膜
に内在し細胞のシグナル伝達の過程を媒介するポリペプチドをエンコードする、
単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００２】 本発明の背景 植物はその生涯にわたり所定の発生プログラムを経て成長する。この点は特に
胚発生と花の発生において顕著である。植物の特定の細胞によって産生され、他
の細胞、特に分裂組織領域での細胞が応答準備を整えている、さまざまなシグナ
ル分子が存在する。これらのシグナル分子は、他と全く別な、例えば花や子葉の
形成につながる発生プログラムを、特定の時に開始する引き金となる。前記のプ
ログラム化された発生経路に加えて植物は、温度変化、日照量、水分補給の可能
性、機械的な損傷による創傷及び病原体による攻撃のような、さまざまな環境的
な刺激に曝されている。光、熱、寒冷、乾燥等への曝露のような環境的因子は、
環境シグナルへの適切な応答及びこれを通じての植物の健全な発生に必須な、遺
伝子の発現及びタンパク質その他の化合物の合成を活性化する。これらの応答は
、発生経路と同様にシグナル分子により媒介される。
胚発生と花の発生において顕著である。植物の特定の細胞によって産生され、他
の細胞、特に分裂組織領域での細胞が応答準備を整えている、さまざまなシグナ
ル分子が存在する。これらのシグナル分子は、他と全く別な、例えば花や子葉の
形成につながる発生プログラムを、特定の時に開始する引き金となる。前記のプ
ログラム化された発生経路に加えて植物は、温度変化、日照量、水分補給の可能
性、機械的な損傷による創傷及び病原体による攻撃のような、さまざまな環境的
な刺激に曝されている。光、熱、寒冷、乾燥等への曝露のような環境的因子は、
環境シグナルへの適切な応答及びこれを通じての植物の健全な発生に必須な、遺
伝子の発現及びタンパク質その他の化合物の合成を活性化する。これらの応答は
、発生経路と同様にシグナル分子により媒介される。
【０００３】 これらのシグナル分子に応答するために植物細胞は細胞シグナルの検出器、調
節器及び／又は変換器としての役割を果たす表面受容体タンパク質を産生する。
シグナルの細胞内伝達は、正常発生のため又は環境からの挑戦に対抗するために
適切な細胞の応答を誘発する遺伝子の転写において頂点に達する、分子のリン酸
化カスケードを介してしばしば伝えられる。
節器及び／又は変換器としての役割を果たす表面受容体タンパク質を産生する。
シグナルの細胞内伝達は、正常発生のため又は環境からの挑戦に対抗するために
適切な細胞の応答を誘発する遺伝子の転写において頂点に達する、分子のリン酸
化カスケードを介してしばしば伝えられる。
【０００４】 受容体タンパク質の１つの大きなクラスは１回膜貫通型ファミリーで、これに
はいくつかのサブクラスがある。これらのタンパク質は、細胞外シグナル（又は
リガンド）の認識／結合ドメインと、細胞膜を１回貫通するドメインと、通常は
タンパク質キナーゼである細胞内のシグナル伝達ドメインとの３つのドメインが
特徴である。全てではないが多くの植物の１回膜貫通型タンパク質は受容体様キ
ナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ、ＲＬＫ）として知られる
サブクラスに属する。植物ＲＬＫの細胞内キナーゼドメインは全てセリン／スレ
オニンタンパク質キナーゼであるが、ＲＬＫの細胞外ドメインは異なるタイプで
ある。ＲＬＫの１つのタイプは、自家受粉を阻害する自家不和合性座位糖タンパ
ク質（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ−ｌｏｃｕｓ ｇｌｙｃｏｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）において最初に記載された細胞外Ｓドメインの存在が特徴であ
る。Ｓドメインは他の保存された残基と組み合わせられた１０個のシステイン残
基の配列（ａｒｒａｙ）により認識される。別のクラスのＲＬＫは、タンパク質
−タンパク質間相互作用に関与するロイシン含量の高い繰り返し配列（ｌｅｕｃ
ｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ、ＬＲＲ）により識別される細胞外ドメインを
有する。リガンドの細胞外ドメインへの結合に続いて受容体の２量体化、自己リ
ン酸化及びシグナルの核への伝達に役立つ一連の細胞内タンパク質の活性化が起
こる。植物のＲＬＫの構造は動物の細胞シグナル伝達経路に見られる受容体と非
常に類似している。
はいくつかのサブクラスがある。これらのタンパク質は、細胞外シグナル（又は
リガンド）の認識／結合ドメインと、細胞膜を１回貫通するドメインと、通常は
タンパク質キナーゼである細胞内のシグナル伝達ドメインとの３つのドメインが
特徴である。全てではないが多くの植物の１回膜貫通型タンパク質は受容体様キ
ナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ、ＲＬＫ）として知られる
サブクラスに属する。植物ＲＬＫの細胞内キナーゼドメインは全てセリン／スレ
オニンタンパク質キナーゼであるが、ＲＬＫの細胞外ドメインは異なるタイプで
ある。ＲＬＫの１つのタイプは、自家受粉を阻害する自家不和合性座位糖タンパ
ク質（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ−ｌｏｃｕｓ ｇｌｙｃｏｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）において最初に記載された細胞外Ｓドメインの存在が特徴であ
る。Ｓドメインは他の保存された残基と組み合わせられた１０個のシステイン残
基の配列（ａｒｒａｙ）により認識される。別のクラスのＲＬＫは、タンパク質
−タンパク質間相互作用に関与するロイシン含量の高い繰り返し配列（ｌｅｕｃ
ｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ、ＬＲＲ）により識別される細胞外ドメインを
有する。リガンドの細胞外ドメインへの結合に続いて受容体の２量体化、自己リ
ン酸化及びシグナルの核への伝達に役立つ一連の細胞内タンパク質の活性化が起
こる。植物のＲＬＫの構造は動物の細胞シグナル伝達経路に見られる受容体と非
常に類似している。
【０００５】 植物ＰＬＫの１つの例は、植物の病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａ
ｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ ｒａｃｅ ６に対する耐性を与えるＸａ２１遺伝子
である。この遺伝子はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌感受性と耐性のイネの系統を比
較する遺伝的な手段を用いてクローン化され（Ｓｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７０：１８０４−１８０６、１９９５）、その後シロイヌナズナにおいてもＸａ
ｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌への耐性を与えることが示された。１０２５個のアミノ酸
からなるこのタンパク質は、アミノ末端の２３個のアミノ酸残基のシグナルペプ
チドを含む既知タンパク質ドメインと類似する多数の特徴を示し、このタンパク
質は形質膜に局在することを表す。８１番目から６３４番目のアミノ酸は２４個
のアミノ酸のＬＲＲの２３回の不完全な繰り返し（ｃｏｐｙ）を含む。６５１番
目から６７６番目のアミノ酸は膜貫通ドメインを形成する可能性のある２６個の
アミノ酸の疎水性セグメントをエンコードする。Ｃ末端アミノ酸はタンパク質キ
ナーゼに典型的な１５個の不変の（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）アミノ酸からなる１１
個のサブドメインを含む細胞内セリンスレオニンキナーゼドメインと予測される
ものを含む。サブドメインＶＩ及びＶＩＩＩはセリンスレオニンリン酸化の特異
性を表す。Ｘａ２１はシロイヌナズナの受容体様キナーゼタンパク質ＲＬＫ５及
びＴＭＫ１のような、他のＲＬＫと類似性が高く、ＬＲＲ及びタンパク質キナー
ゼの両ドメインの保存が見られる。Ｘａ２１がその病原体認識シグナルをいかな
るタンパク質に伝達するかは不明である。
ｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ ｒａｃｅ ６に対する耐性を与えるＸａ２１遺伝子
である。この遺伝子はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌感受性と耐性のイネの系統を比
較する遺伝的な手段を用いてクローン化され（Ｓｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７０：１８０４−１８０６、１９９５）、その後シロイヌナズナにおいてもＸａ
ｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌への耐性を与えることが示された。１０２５個のアミノ酸
からなるこのタンパク質は、アミノ末端の２３個のアミノ酸残基のシグナルペプ
チドを含む既知タンパク質ドメインと類似する多数の特徴を示し、このタンパク
質は形質膜に局在することを表す。８１番目から６３４番目のアミノ酸は２４個
のアミノ酸のＬＲＲの２３回の不完全な繰り返し（ｃｏｐｙ）を含む。６５１番
目から６７６番目のアミノ酸は膜貫通ドメインを形成する可能性のある２６個の
アミノ酸の疎水性セグメントをエンコードする。Ｃ末端アミノ酸はタンパク質キ
ナーゼに典型的な１５個の不変の（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）アミノ酸からなる１１
個のサブドメインを含む細胞内セリンスレオニンキナーゼドメインと予測される
ものを含む。サブドメインＶＩ及びＶＩＩＩはセリンスレオニンリン酸化の特異
性を表す。Ｘａ２１はシロイヌナズナの受容体様キナーゼタンパク質ＲＬＫ５及
びＴＭＫ１のような、他のＲＬＫと類似性が高く、ＬＲＲ及びタンパク質キナー
ゼの両ドメインの保存が見られる。Ｘａ２１がその病原体認識シグナルをいかな
るタンパク質に伝達するかは不明である。
【０００６】 植物細胞で発現される膜受容体分子の別のファミリーは、ヒスチジンキナーゼ
（ＨＫ）である。ＨＫは、２要素（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）シグナルシス
テムの一方の片割れとなる、細菌のシグナル伝達系においてしばらく前から知ら
れてきた。細菌のＨＫは浸透圧調整物（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）、栄養素及び毒物
の変化のような細胞外シグナルに対する検出器分子として役立つ。ＨＫはリガン
ドの結合に反応してヒスチジン残基に自己リン酸化する。このホスホヒスチジン
は自らのリン酸基を応答調節体（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、ＲＲ
）として知られる２要素システムの第２の構成要素のアスパラギン酸基に供与す
る。リン酸化されたＲＲは配列特異的にＤＮＡに結合し、前記細胞外刺激に対す
る応答を媒介するタンパク質をコードする特異的な遺伝子を直的的に活性化する
役割を果たす。一定の場合にはＨＫは複合的な構造を有する。具体的には、これ
らのタンパク質はＲＲドメインをカルボキシル末端に含む。ＨＫのホスホヒスチ
ジンはそのリン酸基をこのＲＲドメインの活性部位のアスパラギン酸残基に転移
する。これらの場合においては、前記ＲＲドメインは膜に結合しているため、シ
グナルはＲＲがＤＮＡに結合することにより直接的に伝達されることはありえな
い。かわりに、ヒスチジンリン酸転移（ＨＰｔ）タンパク質がさらにシグナルを
伝達するのに役割を果たす。複合的なＨＫ／ＲＲタンパク質のホスホアスパラギ
ン酸はリン酸基をＨＰｔタンパク質の活性部位ヒスチジンに供与する。このＨＰ
ｔのホスホヒスチジンは今度はリン酸基を真のＲＲに供与し、その後ＲＲは外界
のシグナルに反応して遺伝子発現を活性化させる。
（ＨＫ）である。ＨＫは、２要素（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）シグナルシス
テムの一方の片割れとなる、細菌のシグナル伝達系においてしばらく前から知ら
れてきた。細菌のＨＫは浸透圧調整物（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）、栄養素及び毒物
の変化のような細胞外シグナルに対する検出器分子として役立つ。ＨＫはリガン
ドの結合に反応してヒスチジン残基に自己リン酸化する。このホスホヒスチジン
は自らのリン酸基を応答調節体（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、ＲＲ
）として知られる２要素システムの第２の構成要素のアスパラギン酸基に供与す
る。リン酸化されたＲＲは配列特異的にＤＮＡに結合し、前記細胞外刺激に対す
る応答を媒介するタンパク質をコードする特異的な遺伝子を直的的に活性化する
役割を果たす。一定の場合にはＨＫは複合的な構造を有する。具体的には、これ
らのタンパク質はＲＲドメインをカルボキシル末端に含む。ＨＫのホスホヒスチ
ジンはそのリン酸基をこのＲＲドメインの活性部位のアスパラギン酸残基に転移
する。これらの場合においては、前記ＲＲドメインは膜に結合しているため、シ
グナルはＲＲがＤＮＡに結合することにより直接的に伝達されることはありえな
い。かわりに、ヒスチジンリン酸転移（ＨＰｔ）タンパク質がさらにシグナルを
伝達するのに役割を果たす。複合的なＨＫ／ＲＲタンパク質のホスホアスパラギ
ン酸はリン酸基をＨＰｔタンパク質の活性部位ヒスチジンに供与する。このＨＰ
ｔのホスホヒスチジンは今度はリン酸基を真のＲＲに供与し、その後ＲＲは外界
のシグナルに反応して遺伝子発現を活性化させる。
【０００７】 細菌と同様に植物細胞は検出器の要素を持つＨＫとＲＲとからなる２要素シグ
ナル伝達システムを有する。さらに、カルボキシル末端にＲＲドメインを持つ複
合的なＨＫタンパク質（以下ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質という）は細菌
と植物の両方に見いだされる。ＨＫタンパク質は特異的な順序で生起する良く保
存されたアミノ酸モチーフにより識別される。アミノ末端から前記の保存された
領域はＨ、Ｎ、Ｇ１、Ｆ及びＧ２ボックスとして識別される。これらのモチーフ
は通常は前記タンパク質の２００ないし２５０個のアミノ酸の範囲に見いだされ
る。細菌におけるのと同様に、細胞外シグナルを受け取るとＨＫはＨボックスに
含まれるヒスチジン残基を自己リン酸化する。このリン酸基はその後前記ＲＲに
転移される。代替策として、一部のＨＫは自らのヒスチジン残基を構成的に自己
リン酸化し、この活性は細胞外シグナルの結合により抑制される。全てのＨＫは
シグナル伝達の絶対的な（ｏｂｌｉｇａｔｅ）一部としてＲＲをリン酸化すると
信じられている。ＲＲはＨＫのホスホヒスチジンによりリン酸化されるアスパラ
ギン酸とリジン残基との絶対的な保存が特徴である。細菌とは異なり、植物のＲ
ＲはＤＮＡと直接は結合しないことが示されている。むしろ、今日までに調べら
れた全ての植物のＲＲは、一見してシグナルをタンパク質キナーゼカスケードに
伝達するようであり、ついにはこのカスケードが転写因子をリン酸化して遺伝子
発現を活性化するか不活性化するかのいずれかをする。細菌と同様に、植物はタ
ンパク質のカルボキシル末端にＲＲドメインを含む複合的ＨＫをも含む。この観
察にもとづいて予測されるように、植物ゲノムはＨＰｔ遺伝子も有することも見
いだされている。しかし、いずれかの植物ＨＰｔタンパク質が複合的ＨＫあるい
は可溶性のＲＲとの間で相互作用していることは未だに直接示されてはいない。
ナル伝達システムを有する。さらに、カルボキシル末端にＲＲドメインを持つ複
合的なＨＫタンパク質（以下ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質という）は細菌
と植物の両方に見いだされる。ＨＫタンパク質は特異的な順序で生起する良く保
存されたアミノ酸モチーフにより識別される。アミノ末端から前記の保存された
領域はＨ、Ｎ、Ｇ１、Ｆ及びＧ２ボックスとして識別される。これらのモチーフ
は通常は前記タンパク質の２００ないし２５０個のアミノ酸の範囲に見いだされ
る。細菌におけるのと同様に、細胞外シグナルを受け取るとＨＫはＨボックスに
含まれるヒスチジン残基を自己リン酸化する。このリン酸基はその後前記ＲＲに
転移される。代替策として、一部のＨＫは自らのヒスチジン残基を構成的に自己
リン酸化し、この活性は細胞外シグナルの結合により抑制される。全てのＨＫは
シグナル伝達の絶対的な（ｏｂｌｉｇａｔｅ）一部としてＲＲをリン酸化すると
信じられている。ＲＲはＨＫのホスホヒスチジンによりリン酸化されるアスパラ
ギン酸とリジン残基との絶対的な保存が特徴である。細菌とは異なり、植物のＲ
ＲはＤＮＡと直接は結合しないことが示されている。むしろ、今日までに調べら
れた全ての植物のＲＲは、一見してシグナルをタンパク質キナーゼカスケードに
伝達するようであり、ついにはこのカスケードが転写因子をリン酸化して遺伝子
発現を活性化するか不活性化するかのいずれかをする。細菌と同様に、植物はタ
ンパク質のカルボキシル末端にＲＲドメインを含む複合的ＨＫをも含む。この観
察にもとづいて予測されるように、植物ゲノムはＨＰｔ遺伝子も有することも見
いだされている。しかし、いずれかの植物ＨＰｔタンパク質が複合的ＨＫあるい
は可溶性のＲＲとの間で相互作用していることは未だに直接示されてはいない。
【０００８】 エチレン受容体（ＥＴＲ１、Ｃｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：５３９
−５４４、１９９３）は最も周知の植物の２要素シグナル伝達システムである。
エチレンは受精の調整、老化、暗／光形態形成及び病原体と機械的な損傷に対す
る応答とともに植物の発生の調節に関与する周知のシグナル分子である。エチレ
ン受容体はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質である。前記シグナルはＲａｆ類
似タンパク質キナーゼであるＣＴＲ１タンパク質を介して伝達される。ＣＴＲ１
はシグナル伝達経路の下流のステップの負の調節因子である。この経路の詳細は
未だ明らかではないが、ＨＫはエチレン非存在下で構成的に活性があり、そして
常にＣＴＲ１をリン酸化し、ＣＴＲ１はエチレン応答経路の他の遺伝子を抑制す
る。エチレンのＥＴＲ１への結合は前記受容体のＨＫ機能を阻害し、エチレンシ
グナル伝達カスケードの下流のタンパク質の活性化を可能にする。これはエチレ
ン応答遺伝子の活性化で頂点に達する。
−５４４、１９９３）は最も周知の植物の２要素シグナル伝達システムである。
エチレンは受精の調整、老化、暗／光形態形成及び病原体と機械的な損傷に対す
る応答とともに植物の発生の調節に関与する周知のシグナル分子である。エチレ
ン受容体はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質である。前記シグナルはＲａｆ類
似タンパク質キナーゼであるＣＴＲ１タンパク質を介して伝達される。ＣＴＲ１
はシグナル伝達経路の下流のステップの負の調節因子である。この経路の詳細は
未だ明らかではないが、ＨＫはエチレン非存在下で構成的に活性があり、そして
常にＣＴＲ１をリン酸化し、ＣＴＲ１はエチレン応答経路の他の遺伝子を抑制す
る。エチレンのＥＴＲ１への結合は前記受容体のＨＫ機能を阻害し、エチレンシ
グナル伝達カスケードの下流のタンパク質の活性化を可能にする。これはエチレ
ン応答遺伝子の活性化で頂点に達する。
【０００９】 植物成長調節因子サイトカイニンに応答して誘導されるＩＢＣ６とＩＢＣ７と
いう２個のＲＲ遺伝子が、最近シロイヌナズナからクローン化され解析された（
ＢｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒとＫｉｅｂｅｒ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１０
０９−１０１９、１９９８）。ＩＢＣ６とＩＢＣ７は植物におけるサイトカイニ
ンシグナルの伝達に関与するらしい。ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＣＫＩ
１をエンコードする遺伝子（Ｋａｋｉｍｏｔｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９８
２−９８５、１９９６）がトランスジェニック植物で異所的に発現されたときに
サイトカイニン様の効果を生じる事実に照らしてこれは特に興味深い。したがっ
て２要素ＨＫ／ＲＲシステムはサイトカイニンシグナル伝達に関与することもあ
り得るようである。サイトカイニンは、栄養代謝、葉の伸長と老化及び側方分枝
のような生理学的な事象を含む植物の成長と発生を調節することが知られている
。
いう２個のＲＲ遺伝子が、最近シロイヌナズナからクローン化され解析された（
ＢｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒとＫｉｅｂｅｒ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１０
０９−１０１９、１９９８）。ＩＢＣ６とＩＢＣ７は植物におけるサイトカイニ
ンシグナルの伝達に関与するらしい。ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＣＫＩ
１をエンコードする遺伝子（Ｋａｋｉｍｏｔｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９８
２−９８５、１９９６）がトランスジェニック植物で異所的に発現されたときに
サイトカイニン様の効果を生じる事実に照らしてこれは特に興味深い。したがっ
て２要素ＨＫ／ＲＲシステムはサイトカイニンシグナル伝達に関与することもあ
り得るようである。サイトカイニンは、栄養代謝、葉の伸長と老化及び側方分枝
のような生理学的な事象を含む植物の成長と発生を調節することが知られている
。
【００１０】 植物細胞シグナル伝達に関与するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチ
ドは一定の植物種については単離されてきたが、多くのかかるタンパク質をエン
コードする遺伝子は広範囲の植物種において未だ同定されていない。そこで、こ
の技術分野における細胞シグナル伝達の改変に有効に用いられる材料についての
必要性はまだある。
ドは一定の植物種については単離されてきたが、多くのかかるタンパク質をエン
コードする遺伝子は広範囲の植物種において未だ同定されていない。そこで、こ
の技術分野における細胞シグナル伝達の改変に有効に用いられる材料についての
必要性はまだある。
【００１１】 発明の概要 簡潔には本発明は、ユーカリとマツから単離され細胞シグナル伝達に関与する
ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを、かかるオリゴヌクレオチド
及びポリペプチドの利用方法とともに提供する。かかるポリペプチドは検出器−
調節器又は受容体キナーゼとして機能する。前記の単離されたポリヌクレオチド
とポリペプチドは、植物の成長及び発生のにおいてかあるいは病原体又は環境因
子を原因とするストレス条件下かのいずれかでの植物細胞応答の改変に有効に用
いられる。
ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを、かかるオリゴヌクレオチド
及びポリペプチドの利用方法とともに提供する。かかるポリペプチドは検出器−
調節器又は受容体キナーゼとして機能する。前記の単離されたポリヌクレオチド
とポリペプチドは、植物の成長及び発生のにおいてかあるいは病原体又は環境因
子を原因とするストレス条件下かのいずれかでの植物細胞応答の改変に有効に用
いられる。
【００１２】 第１の局面では本発明は、ＲＬＫ、ＨＫ、ＲＲ、ＨＰｔ又はハイブリッドＨＫ
／ＲＲタンパク質をエンコードする、ユーカリとマツから入手可能な単離精製さ
れたポリヌクレオチドを提供する。１の実施態様では、前記単離されたポリヌク
レオチドは、（ａ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８
８番に列挙された配列、（ｂ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８
３３−８８８番に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列識別番号第１−６７、１
３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆相補体、（ｄ）配列識
別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆
配列及び（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）の配列と以下に定義されるところにより４０
％、６０％、７５％又は９０％同一である配列を有する配列からなるグループか
ら選択されたＤＮＡ配列を含む。
／ＲＲタンパク質をエンコードする、ユーカリとマツから入手可能な単離精製さ
れたポリヌクレオチドを提供する。１の実施態様では、前記単離されたポリヌク
レオチドは、（ａ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８
８番に列挙された配列、（ｂ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８
３３−８８８番に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列識別番号第１−６７、１
３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆相補体、（ｄ）配列識
別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆
配列及び（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）の配列と以下に定義されるところにより４０
％、６０％、７５％又は９０％同一である配列を有する配列からなるグループか
ら選択されたＤＮＡ配列を含む。
【００１３】 さらなる局面では、本発明のＤＮＡ配列にエンコードされた単離されたポリペ
プチドが提供される。ある実施態様ではかかるポリペプチドは配列識別番号第６
８−１３０、４８２−８３２及び８８９−９４５番からなるグループから選択さ
れたアミノ酸配列を含む。
プチドが提供される。ある実施態様ではかかるポリペプチドは配列識別番号第６
８−１３０、４８２−８３２及び８８９−９４５番からなるグループから選択さ
れたアミノ酸配列を含む。
【００１４】 別の局面では本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコントラスト
を単独でか、ここで開示される１以上のポリヌクレオチドとの組合せあるいは１
以上の既知のＤＮＡ配列との組合せで、かかるコントラストを含むトランスジェ
ニック細胞とともに提供する。
を単独でか、ここで開示される１以上のポリヌクレオチドとの組合せあるいは１
以上の既知のＤＮＡ配列との組合せで、かかるコントラストを含むトランスジェ
ニック細胞とともに提供する。
【００１５】 関連した局面では本発明は、５’から３’の方向に、遺伝子プロモーター配列
、本発明のポリペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするオープン・リー
ディング・フレーム及び遺伝子ターミネーション配列を含むＤＮＡコントラスト
を提供する。前記オープン・リーディング・フレームはセンス方向又はアンチセ
ンス方向に配列されてもよい。上記のポリヌクレオチドにエンコードされた酵素
をコードする遺伝子の、ノンコーディング領域又はノンコーディング領域に相補
的なヌクレオチド配列を、遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーター配列
とともに含む遺伝子コンストラクトも提供される。遺伝子プロモーターとターミ
ネーション配列は宿主植物で機能するものであることが好ましい。遺伝子プロモ
ーターとターミネーション配列は本来の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）遺伝子のものが最
も好ましいが、その他のカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）プロモータ
ーのような本発明の技術分野で一般に用いられるものも、Ｋｏｚａｋ配列又はオ
メガエンハンサーのようなエンハンサー及びアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシ
ンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子のターミネーターととも
にあるいは単独で、本発明において有効に利用できる。組織特異的なプロモータ
ーは１以上の所望の組織を標的として発現させるための用いられる。ＤＮＡコン
トラストはさらに形質転換細胞の同定のためのマーカーを含むこともある。
、本発明のポリペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするオープン・リー
ディング・フレーム及び遺伝子ターミネーション配列を含むＤＮＡコントラスト
を提供する。前記オープン・リーディング・フレームはセンス方向又はアンチセ
ンス方向に配列されてもよい。上記のポリヌクレオチドにエンコードされた酵素
をコードする遺伝子の、ノンコーディング領域又はノンコーディング領域に相補
的なヌクレオチド配列を、遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーター配列
とともに含む遺伝子コンストラクトも提供される。遺伝子プロモーターとターミ
ネーション配列は宿主植物で機能するものであることが好ましい。遺伝子プロモ
ーターとターミネーション配列は本来の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）遺伝子のものが最
も好ましいが、その他のカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）プロモータ
ーのような本発明の技術分野で一般に用いられるものも、Ｋｏｚａｋ配列又はオ
メガエンハンサーのようなエンハンサー及びアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシ
ンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子のターミネーターととも
にあるいは単独で、本発明において有効に利用できる。組織特異的なプロモータ
ーは１以上の所望の組織を標的として発現させるための用いられる。ＤＮＡコン
トラストはさらに形質転換細胞の同定のためのマーカーを含むこともある。
【００１６】 さらなる局面では、本発明のＤＮＡコントラストを含むトランスジェニック細
胞、好ましくは植物細胞が、かかるトランスジェニック細胞を含む生物、好まし
くは植物と、かかる植物の果実、種子その他の生産物、由来物あるいは子孫とと
もに提供される。かかるトランスジェニック植物の零余子（むかご、ｐｒｏｐａ
ｇｕｌｅ）も本発明に含まれる。ここで用いられる「零余子」という語は挿し木
を含む有性的あるいは無性的な繁殖又は増殖に利用される植物のいかなる部分を
も意味する。
胞、好ましくは植物細胞が、かかるトランスジェニック細胞を含む生物、好まし
くは植物と、かかる植物の果実、種子その他の生産物、由来物あるいは子孫とと
もに提供される。かかるトランスジェニック植物の零余子（むかご、ｐｒｏｐａ
ｇｕｌｅ）も本発明に含まれる。ここで用いられる「零余子」という語は挿し木
を含む有性的あるいは無性的な繁殖又は増殖に利用される植物のいかなる部分を
も意味する。
【００１７】 さらに別の局面では、植物のような標的生物における細胞シグナル伝達を改変
するための方法であって、本発明のＤＮＡコントラストを該植物のゲノムに安定
的に取り込むことを含む方法が提供される。好ましい実施態様においては標的植
物は木本植物であり、ユーカリとマツの種からなるグループから選択されるもの
が好ましく、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉ
ａｔａからなるグループから選択されるものが最も好ましい。関連した局面では
、細胞シグナル伝達の改変された、植物のような標的生物を作出するための方法
であって、トランスジェニック細胞を提供するために本発明のＤＮＡコントラス
トで形質転換することと前記トランスジェニック細胞を再生及び成熟植物の成長
に導く条件下で培養することとを含む方法が提供される。
するための方法であって、本発明のＤＮＡコントラストを該植物のゲノムに安定
的に取り込むことを含む方法が提供される。好ましい実施態様においては標的植
物は木本植物であり、ユーカリとマツの種からなるグループから選択されるもの
が好ましく、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉ
ａｔａからなるグループから選択されるものが最も好ましい。関連した局面では
、細胞シグナル伝達の改変された、植物のような標的生物を作出するための方法
であって、トランスジェニック細胞を提供するために本発明のＤＮＡコントラス
トで形質転換することと前記トランスジェニック細胞を再生及び成熟植物の成長
に導く条件下で培養することとを含む方法が提供される。
【００１８】 又更なる局面では本発明は、本発明のＤＮＡコントラストを植物のゲノムに安
定的に取り込むことを含む、植物のような標的生物におけるポリペプチドの活性
を改変するための方法を提供する。好ましい実施態様においては、標的植物は木
本植物であり、ユーカリとマツの種からなるグループから選択されるものが好ま
しく、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ
からなるグループから選択されるものが最も好ましい。
定的に取り込むことを含む、植物のような標的生物におけるポリペプチドの活性
を改変するための方法を提供する。好ましい実施態様においては、標的植物は木
本植物であり、ユーカリとマツの種からなるグループから選択されるものが好ま
しく、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ
からなるグループから選択されるものが最も好ましい。
【００１９】 以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の上記の及びさらなる特徴及
びその入手法は明らかとなり、本発明は最も良く理解される。ここで開示された
全ての引用文献は、引用によりそれらの全体があたかも各々が個別に取り込まれ
たかのごとくに取り込まれる。
びその入手法は明らかとなり、本発明は最も良く理解される。ここで開示された
全ての引用文献は、引用によりそれらの全体があたかも各々が個別に取り込まれ
たかのごとくに取り込まれる。
【００２０】 詳細な説明 本発明は植物細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードする単離
精製されたポリヌクレオチドを提供する。上記の通り細胞シグナル伝達は、植物
の成長と発生及び環境因子と病原体のような外界刺激に対する細胞の応答に重大
な役割を果たすことが知られている。そこで、細胞シグナル伝達に関与するポリ
ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドで植物を形質転換することは、細胞
の増殖、分化、伸長及び生存、疾病抵抗性及び栄養代謝のような性質を改変する
ために利用される。
精製されたポリヌクレオチドを提供する。上記の通り細胞シグナル伝達は、植物
の成長と発生及び環境因子と病原体のような外界刺激に対する細胞の応答に重大
な役割を果たすことが知られている。そこで、細胞シグナル伝達に関与するポリ
ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドで植物を形質転換することは、細胞
の増殖、分化、伸長及び生存、疾病抵抗性及び栄養代謝のような性質を改変する
ために利用される。
【００２１】 例えばハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＥＴＲ１は、エチレンシグナル伝達
に関与することが知られている。したがってＥＴＲ１の発現の改変は、果実の熟
成のようなエチレンで調節される生理学的な性質及び葉と花の老化を改変するこ
とにつながる。そこでトランスジェニック植物におけるこのタンパク質の発現の
改変は、老化の遅延により切り花の有効期間（ｕｓｅｆｕｌ ｌｉｆｅ）を延長
するために用いられる。さらにＥＴＲ１の発現の改変は、生殖器官の老化を選択
的に促進するために用いられ、工学的な不稔植物の作出をもたらす。
に関与することが知られている。したがってＥＴＲ１の発現の改変は、果実の熟
成のようなエチレンで調節される生理学的な性質及び葉と花の老化を改変するこ
とにつながる。そこでトランスジェニック植物におけるこのタンパク質の発現の
改変は、老化の遅延により切り花の有効期間（ｕｓｅｆｕｌ ｌｉｆｅ）を延長
するために用いられる。さらにＥＴＲ１の発現の改変は、生殖器官の老化を選択
的に促進するために用いられ、工学的な不稔植物の作出をもたらす。
【００２２】 ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＣＫＩ１はサイトカイニンのシグナル伝達
に関与するとされてきた。このタンパク質の過剰発現は突然変異植物でサイトカ
イニン様の効果をもたらすことが知られている。サイトカイニンは、生理学的現
象の中でも側方分枝、発現の伸展（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、細胞分裂、栄養の分
配及び老化の遅延に重要な役割を果たすことが示されてきた。したがってＣＫＩ
１の発現の改変は、例えば選択された細胞タイプ又は器官での老化の遅延をもた
らす。これは収穫から消費までの果実と野菜の貯蔵期間を延長することにつなが
る。代替策としてＣＫＩ１の発現の改変は、林産木種での分枝頻度を減少させる
のに用いられて、堅い木の家具と合板用の節のない無傷の（ｃｌｅａｒ）長い材
木を得ることにつながる。
に関与するとされてきた。このタンパク質の過剰発現は突然変異植物でサイトカ
イニン様の効果をもたらすことが知られている。サイトカイニンは、生理学的現
象の中でも側方分枝、発現の伸展（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、細胞分裂、栄養の分
配及び老化の遅延に重要な役割を果たすことが示されてきた。したがってＣＫＩ
１の発現の改変は、例えば選択された細胞タイプ又は器官での老化の遅延をもた
らす。これは収穫から消費までの果実と野菜の貯蔵期間を延長することにつなが
る。代替策としてＣＫＩ１の発現の改変は、林産木種での分枝頻度を減少させる
のに用いられて、堅い木の家具と合板用の節のない無傷の（ｃｌｅａｒ）長い材
木を得ることにつながる。
【００２３】 本発明の方法と材料を用いて、ポリペプチドをエンコードする遺伝子の追加の
コピーを植物のような標的生物のゲノムに取り込むことにより、特定の植物細胞
ポリペプチドの量を増加又は減少させることができる。同様に、かかる遺伝子の
アンチセンスコピーで標的生物を形質転換することによりポリペプチドを増加又
は減少させることもできる。
コピーを植物のような標的生物のゲノムに取り込むことにより、特定の植物細胞
ポリペプチドの量を増加又は減少させることができる。同様に、かかる遺伝子の
アンチセンスコピーで標的生物を形質転換することによりポリペプチドを増加又
は減少させることもできる。
【００２４】 １の実施態様では本発明は、細胞シグナル伝達に関与する植物ポリペプチドを
エンコードし又は部分的にエンコードする単離されたポリヌクレオチドであって
、ユーカリとマツ由来のポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明はＥ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来（配列識別番号第２、８、９、１１、
１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４、３８、１３１−３０１、４４８−
４６３、８４８、８５８−８７４及び８８２−８８７番）及びＰｉｎｕｓ ｒａ
ｄｉａｔａ由来（配列識別番号第１、３−７、１０、１２−１４、１６、１７、
２０、２６−３２、３５−３７、３９−４１、３０２−４４７、８３３−８４７
、８７５−８８１及び８８８番）のＲＬＫをエンコードする単離ポリヌクレオチ
ドと、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来（配列識別番号第４２、４８
−５２、５５−５８、６７、４６４−４７１、４７４−４７８及び８５０−８５
７番）及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来（配列識別番号第４３−４７、５３
、５４、５９−６６、４７２、４７３、４７９−４８１及び８４９番）の２要素
シグナル伝達システムの少なくとも１つの構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッ
ドＨＫ／ＲＲタンパク質）をエンコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
かかる単離ポリヌクレオチドの相補体、かかる単離ポリヌクレオチドの逆相補体
及びかかる単離ポリヌクレオチドの逆配列も以下に定義するかかる配列の変異体
とともに提供される。
エンコードし又は部分的にエンコードする単離されたポリヌクレオチドであって
、ユーカリとマツ由来のポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明はＥ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来（配列識別番号第２、８、９、１１、
１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４、３８、１３１−３０１、４４８−
４６３、８４８、８５８−８７４及び８８２−８８７番）及びＰｉｎｕｓ ｒａ
ｄｉａｔａ由来（配列識別番号第１、３−７、１０、１２−１４、１６、１７、
２０、２６−３２、３５−３７、３９−４１、３０２−４４７、８３３−８４７
、８７５−８８１及び８８８番）のＲＬＫをエンコードする単離ポリヌクレオチ
ドと、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来（配列識別番号第４２、４８
−５２、５５−５８、６７、４６４−４７１、４７４−４７８及び８５０−８５
７番）及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来（配列識別番号第４３−４７、５３
、５４、５９−６６、４７２、４７３、４７９−４８１及び８４９番）の２要素
シグナル伝達システムの少なくとも１つの構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッ
ドＨＫ／ＲＲタンパク質）をエンコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
かかる単離ポリヌクレオチドの相補体、かかる単離ポリヌクレオチドの逆相補体
及びかかる単離ポリヌクレオチドの逆配列も以下に定義するかかる配列の変異体
とともに提供される。
【００２５】 別の実施態様では本発明は、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされた単
離されたポリペプチドを提供する。配列識別番号第１−５９、６３、６４、６６
、６７、１３１−４８１、８３３−８４８、８５１及び８５３−８８８番のＤＮ
Ａ配列にエンコードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列識別番号第６８−１３
０、４８２−８３２及び８８９−９４５番に提供される。そこで一定の実施態様
では本発明のポリペプチドは、第６８ないし１３０、４８２ないし８３２、８８
９ないし９４５番からなるグループから選択されたアミノ酸配列とその変異体を
含む。
離されたポリペプチドを提供する。配列識別番号第１−５９、６３、６４、６６
、６７、１３１−４８１、８３３−８４８、８５１及び８５３−８８８番のＤＮ
Ａ配列にエンコードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列識別番号第６８−１３
０、４８２−８３２及び８８９−９４５番に提供される。そこで一定の実施態様
では本発明のポリペプチドは、第６８ないし１３０、４８２ないし８３２、８８
９ないし９４５番からなるグループから選択されたアミノ酸配列とその変異体を
含む。
【００２６】 ここで開示されるポリペプチドは、林産植物資源、主にＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａに由来した。本発明のポリヌク
レオチドの一部は、完全長ポリペプチドをエンコードする完全長遺伝子を意味し
ないという点で、「部分的な（ｐａｒｔｉａｌ）」配列である。ここで用いられ
る「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という用語は、本発明
の部分的な単離されたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列にエンコードされたポ
リペプチドを含む。かかる部分配列は、プライマー及び/又はプローブと周知の
雑種形成技術及び/又はＰＣＲ技術とを用いて様々なＤＮＡライブラリを分析し
配列決定することにより拡張できる。部分配列は、ポリペプチドをエンコードす
るオープン・リーディング・フレーム、完全長ポリヌクレオチド及び/又はポリ
ペプチドを発現可能な遺伝子あるいは別のゲノムの有用な部分が同定されるまで
拡張できる。完全長ポリヌクレオチド及び遺伝子を含むかかる拡張配列は、前記
拡張配列が同定された配列又はその変異体あるいはここで開示された配列の１つ
の連続した部分（ｘ−マー）又はその変異体を含むとき、ここで開示された配列
又はその変異体あるいはここで開示された配列の１つの部分又はその変異体に「
対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」と記載される。同様に、本発
明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列、アンチセンス
配列等は、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列
挙された配列として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて決まり切った手順で（ｒｏ
ｕｔｉｎｅｌｙ）確認し取得することができる。
ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａに由来した。本発明のポリヌク
レオチドの一部は、完全長ポリペプチドをエンコードする完全長遺伝子を意味し
ないという点で、「部分的な（ｐａｒｔｉａｌ）」配列である。ここで用いられ
る「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という用語は、本発明
の部分的な単離されたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列にエンコードされたポ
リペプチドを含む。かかる部分配列は、プライマー及び/又はプローブと周知の
雑種形成技術及び/又はＰＣＲ技術とを用いて様々なＤＮＡライブラリを分析し
配列決定することにより拡張できる。部分配列は、ポリペプチドをエンコードす
るオープン・リーディング・フレーム、完全長ポリヌクレオチド及び/又はポリ
ペプチドを発現可能な遺伝子あるいは別のゲノムの有用な部分が同定されるまで
拡張できる。完全長ポリヌクレオチド及び遺伝子を含むかかる拡張配列は、前記
拡張配列が同定された配列又はその変異体あるいはここで開示された配列の１つ
の連続した部分（ｘ−マー）又はその変異体を含むとき、ここで開示された配列
又はその変異体あるいはここで開示された配列の１つの部分又はその変異体に「
対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」と記載される。同様に、本発
明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列、アンチセンス
配列等は、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列
挙された配列として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて決まり切った手順で（ｒｏ
ｕｔｉｎｅｌｙ）確認し取得することができる。
【００２７】 上記の通りここに開示されたポリヌクレオチドは、オープン・リーディング・
フレーム（ＯＲＦ）又はポリペプチドをエンコードする部分的なオープン・リー
ディング・フレームを含む。さらにポリペプチドをエンコードするオープン・リ
ーディング・フレームは、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３
−８８８番として提示された配列に対応する拡張配列又は完全長配列の中に同定
できることもある。オープン・リーディング・フレームは当業者に周知の技術を
用いて同定できる。これらの技術は、例えば既知の開始及び終了コドンの位置の
解析、コドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定その他これらに類す
るものを含む。ＯＲＦ解析のために適当なツールとソフトウェアは、例えばイン
ターネット上ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏ
ｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌで入手可能である。オープン・リーディング・フレー
ム及びオープン・リーディング・フレームの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）は本発明の
ポリヌクレオチドの中に同定できる。ひとたび部分的なオープン・リーディング
・フレームが同定されると、ポリヌクレオチドは、完全なオープン・リーディン
グ・フレームのポリヌクレオチドが同定できるまで、当業者に周知の技術を用い
て部分オープン・リーディング・フレームの領域を拡張することができる。よっ
て、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは本発明
のポリヌクレオチドを用いて同定できる。
フレーム（ＯＲＦ）又はポリペプチドをエンコードする部分的なオープン・リー
ディング・フレームを含む。さらにポリペプチドをエンコードするオープン・リ
ーディング・フレームは、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３
−８８８番として提示された配列に対応する拡張配列又は完全長配列の中に同定
できることもある。オープン・リーディング・フレームは当業者に周知の技術を
用いて同定できる。これらの技術は、例えば既知の開始及び終了コドンの位置の
解析、コドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定その他これらに類す
るものを含む。ＯＲＦ解析のために適当なツールとソフトウェアは、例えばイン
ターネット上ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏ
ｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌで入手可能である。オープン・リーディング・フレー
ム及びオープン・リーディング・フレームの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）は本発明の
ポリヌクレオチドの中に同定できる。ひとたび部分的なオープン・リーディング
・フレームが同定されると、ポリヌクレオチドは、完全なオープン・リーディン
グ・フレームのポリヌクレオチドが同定できるまで、当業者に周知の技術を用い
て部分オープン・リーディング・フレームの領域を拡張することができる。よっ
て、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは本発明
のポリヌクレオチドを用いて同定できる。
【００２８】 ひとたびオープン・リーディング・フレームが本発明のポリヌクレオチドで同
定されると、該オープン・リーディング・フレームは単離及び/又は合成できる
。前記オープン・リーディング・フレームと、当業者に周知の適当なプロモータ
ー、イニシエーター、ターミネーター等とを含む、発現可能なＤＮＡコンストラ
クトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン・リーディン
グ・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿主細胞に導入
される。適当な宿主細胞は植物細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、藻類等を含む様々
な前核及び真核細胞を含む。
定されると、該オープン・リーディング・フレームは単離及び/又は合成できる
。前記オープン・リーディング・フレームと、当業者に周知の適当なプロモータ
ー、イニシエーター、ターミネーター等とを含む、発現可能なＤＮＡコンストラ
クトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン・リーディン
グ・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿主細胞に導入
される。適当な宿主細胞は植物細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、藻類等を含む様々
な前核及び真核細胞を含む。
【００２９】 本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドは、その生物活性
を決定するために発現され様々な分析法に使用される。かかるポリペプチドは抗
体作成に、相互作用する相手の蛋白質又はその他の化合物の単離に及び相互作用
する蛋白質又はその他の化合物のレベルの定量的な測定に用いることができる。
を決定するために発現され様々な分析法に使用される。かかるポリペプチドは抗
体作成に、相互作用する相手の蛋白質又はその他の化合物の単離に及び相互作用
する蛋白質又はその他の化合物のレベルの定量的な測定に用いることができる。
【００３０】 ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語はデオキシリボヌクレオチ
ド又はリボヌクレオチドの塩基の１本鎖又は２本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ
及び対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ分子でＨｎＲＮＡとｍＲ
ＮＡ分子を入れたＲＮＡ分子とを含み、全合成又は部分合成されたポリヌクレオ
チドとともにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び組み換えＤＮＡを含む。ＨｎＲＮＡは
イントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１に対応する。ｍＲＮＡはイント
ロンが切り出されたＨｎＲＮＡ及びＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは
遺伝子全体又はその部分を含む。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対
応するポリヌクレオチドの断片を含み、「ポリヌクレオチド」の定義は全てのか
かる操作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチド及びア
ンチセンスポリヌクレオチドが関与する技術は当業者に周知で例えば、Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５４
（２３）：３６３−３７５、１９９５及びＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ
．Ｏｒｇａｎｓ ２０（８）：８３６−８４８、１９９６に記載される。
ド又はリボヌクレオチドの塩基の１本鎖又は２本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ
及び対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ分子でＨｎＲＮＡとｍＲ
ＮＡ分子を入れたＲＮＡ分子とを含み、全合成又は部分合成されたポリヌクレオ
チドとともにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び組み換えＤＮＡを含む。ＨｎＲＮＡは
イントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１に対応する。ｍＲＮＡはイント
ロンが切り出されたＨｎＲＮＡ及びＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは
遺伝子全体又はその部分を含む。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対
応するポリヌクレオチドの断片を含み、「ポリヌクレオチド」の定義は全てのか
かる操作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチド及びア
ンチセンスポリヌクレオチドが関与する技術は当業者に周知で例えば、Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５４
（２３）：３６３−３７５、１９９５及びＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ
．Ｏｒｇａｎｓ ２０（８）：８３６−８４８、１９９６に記載される。
【００３１】 ここで使用されたところの「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共
有結合で連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。本発明
のポリペプチドは、精製された天然物であっても、組み換え技術又は合成技術を
用いて部分的にあるいは全面的に生産されてもよい。
有結合で連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。本発明
のポリペプチドは、精製された天然物であっても、組み換え技術又は合成技術を
用いて部分的にあるいは全面的に生産されてもよい。
【００３２】 ここで記載されたポリヌクレオチドとポリペプチドの全ては当業者に慣用され
る条件で単離精製される。
る条件で単離精製される。
【００３３】 ここで使用されたところの「相補体」、「逆相補体」、及び「逆配列」とい
う用語の定義は以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という
配列に対して、相補体、逆相補体及び逆配列は以下の通りである。 相補体 ３’ＴＣＣＴＧＧ５’ 逆相補体 ３’ＧＧＴＣＣＴ５’ 逆配列 ５’ＣＣＡＧＧＡ３’
う用語の定義は以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という
配列に対して、相補体、逆相補体及び逆配列は以下の通りである。 相補体 ３’ＴＣＣＴＧＧ５’ 逆相補体 ３’ＧＧＴＣＣＴ５’ 逆配列 ５’ＣＣＡＧＧＡ３’
【００３４】 ここで使用されるところの「変異体」という用語は、約４０％以上、より好ま
しくは約６０％以上、さらにより好ましくは約７５％以上、最も好ましくは約９
０％以上本発明の配列と同一性を示す（ヌクレオチド又はアミノ酸のいずれかの
）残基をいう。同一性の百分率は、以下に記載の通り比較する２つの配列のアラ
イメントをとり（ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた部分の同一残基の数を決
定し、該同一残基の数を本発明の又はクエリーの配列中の全長で除算し、その結
果を１００倍したものをいう。
しくは約６０％以上、さらにより好ましくは約７５％以上、最も好ましくは約９
０％以上本発明の配列と同一性を示す（ヌクレオチド又はアミノ酸のいずれかの
）残基をいう。同一性の百分率は、以下に記載の通り比較する２つの配列のアラ
イメントをとり（ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた部分の同一残基の数を決
定し、該同一残基の数を本発明の又はクエリーの配列中の全長で除算し、その結
果を１００倍したものをいう。
【００３５】 公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、ポリヌクレオチド配
列又はポリペプチド配列のアライメントをとることもでき、特定の領域の同一ヌ
クレオチドの百分率を別の配列に対して決定することもできる。ポリヌクレオチ
ド配列のアライメントと類似性同定とのための２つの代表的なアルゴリズムは、
ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列の同一性の
百分率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。前記ＢＬＡ
ＳＴＮとＢＬＡＳＴＰの両方のソフトウェアとも、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバ
ー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／ｅｘ
ｅｃｕｔａｂｌｅｓ／で入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリズム
とともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアル
ゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を、本発明による変異
体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳ
Ｔファミリーのアルゴリズムの使用法は、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅ
ｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）と、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７の刊行物とに記載されて
いる。コンピューターアルゴリズムのＦＡＳＴＡは、インターネット上のｆｔｐ
サイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／
で入手可能である。説明書に記載され、アルゴリズムとともに配布されたデフォ
ルトのパラメーター値に設定された、１９９８年８月のバージョン３．１ｔ１１
を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズム
の使用法は、Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲとＬｉｐｍａｎ ＤＪのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８、１９８８と、Ｐｅａ
ｒｓｏｎ ＷＲのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８
、１９９０とに記載される。
列又はポリペプチド配列のアライメントをとることもでき、特定の領域の同一ヌ
クレオチドの百分率を別の配列に対して決定することもできる。ポリヌクレオチ
ド配列のアライメントと類似性同定とのための２つの代表的なアルゴリズムは、
ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列の同一性の
百分率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。前記ＢＬＡ
ＳＴＮとＢＬＡＳＴＰの両方のソフトウェアとも、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバ
ー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／ｅｘ
ｅｃｕｔａｂｌｅｓ／で入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリズム
とともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアル
ゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を、本発明による変異
体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳ
Ｔファミリーのアルゴリズムの使用法は、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅ
ｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）と、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７の刊行物とに記載されて
いる。コンピューターアルゴリズムのＦＡＳＴＡは、インターネット上のｆｔｐ
サイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／
で入手可能である。説明書に記載され、アルゴリズムとともに配布されたデフォ
ルトのパラメーター値に設定された、１９９８年８月のバージョン３．１ｔ１１
を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズム
の使用法は、Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲとＬｉｐｍａｎ ＤＪのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８、１９８８と、Ｐｅａ
ｒｓｏｎ ＷＲのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８
、１９９０とに記載される。
【００３６】 以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチド配列の以下に説明するＥ
値（Ｅ ｖａｌｕｅｓ）及び同一性百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使うアラ
イメント及び類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）のラン
ニングコマンドは、「ｂｌａｓｔａｌｌ ｐ ｂｌａｓｔｎ ｄ ｅｍｂｌｄｂ
ｅ １０ Ｇ ０ Ｅ ０ ｒ １ ｖ ３０ｂ ３０ ｉ ｑｕｅｒｙ
ｓｅｑ ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ」、パラメーターは以下の通りである。 ｐ プログラムの名称 ［文字列］ ｄ データベース ［文字列］ ｅ 期待値 （Ｅ） ［実数］ Ｇ ギャップを空けるためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす
） ［整数］ Ｅ ギャップを拡張するためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こ
す） ［整数］ ｒ ヌクレオチドのマッチの報酬 （ｂｌａｓｔｎのみ） ［整数］ ｖ １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数 （Ｖ）
［整数］ ｂ 表示するアライメントの数 （Ｂ） ［整数］ ｉ クェリーファイル ［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］ ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル ［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］ 任
意 ＢＬＡＳＴＰについては「ｂｌａｓｔａｌｌ ｐ ｂｌａｓｔｐ ｄ ｓｗｉｓ
ｓｐｒｏｔｄｂ ｅ １０ Ｇ ０Ｅ ０ ｖ ３０ ｂ ３０ ｉ ｑｕｅｒ
ｙｓｅｑ ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ」というランニングパラメータが好ましい。 ｐ プログラムの名称 ［文字列］ ｄ データベース ［文字列］ ｅ 期待値 （Ｅ） ［実数］ Ｇ ギャップを空けるためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす
） ［整数］ Ｅ ギャップを拡張するためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こ
す） ［整数］ ｒ ヌクレオチドのマッチの報酬 （ｂｌａｓｔｎのみ） ［整数］ ｖ １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数 （Ｖ）
［整数］ ｂ 表示するアライメントの数 （Ｂ） ［整数］ ｉ クェリーファイル ［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］ ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル ［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］ 任
意
値（Ｅ ｖａｌｕｅｓ）及び同一性百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使うアラ
イメント及び類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）のラン
ニングコマンドは、「ｂｌａｓｔａｌｌ ｐ ｂｌａｓｔｎ ｄ ｅｍｂｌｄｂ
ｅ １０ Ｇ ０ Ｅ ０ ｒ １ ｖ ３０ｂ ３０ ｉ ｑｕｅｒｙ
ｓｅｑ ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ」、パラメーターは以下の通りである。 ｐ プログラムの名称 ［文字列］ ｄ データベース ［文字列］ ｅ 期待値 （Ｅ） ［実数］ Ｇ ギャップを空けるためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす
） ［整数］ Ｅ ギャップを拡張するためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こ
す） ［整数］ ｒ ヌクレオチドのマッチの報酬 （ｂｌａｓｔｎのみ） ［整数］ ｖ １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数 （Ｖ）
［整数］ ｂ 表示するアライメントの数 （Ｂ） ［整数］ ｉ クェリーファイル ［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］ ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル ［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］ 任
意 ＢＬＡＳＴＰについては「ｂｌａｓｔａｌｌ ｐ ｂｌａｓｔｐ ｄ ｓｗｉｓ
ｓｐｒｏｔｄｂ ｅ １０ Ｇ ０Ｅ ０ ｖ ３０ ｂ ３０ ｉ ｑｕｅｒ
ｙｓｅｑ ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ」というランニングパラメータが好ましい。 ｐ プログラムの名称 ［文字列］ ｄ データベース ［文字列］ ｅ 期待値 （Ｅ） ［実数］ Ｇ ギャップを空けるためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす
） ［整数］ Ｅ ギャップを拡張するためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こ
す） ［整数］ ｒ ヌクレオチドのマッチの報酬 （ｂｌａｓｔｎのみ） ［整数］ ｖ １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数 （Ｖ）
［整数］ ｂ 表示するアライメントの数 （Ｂ） ［整数］ ｉ クェリーファイル ［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］ ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル ［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］ 任
意
【００３７】 ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ又は同様のアルゴリズムにより作成
された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列
の類似部分のアライメントをとって同定する。前記のヒットは類似性の程度と重
複する配列の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、前記クエ
リー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列
の類似部分のアライメントをとって同定する。前記のヒットは類似性の程度と重
複する配列の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、前記クエ
リー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
【００３８】 ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムは、アライメントの「期待」（Ｅ）
値をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然一定
数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値は、
好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似性を
表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、ある
ポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値０．１は、ＥＭＢＬデータベースの
規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分
にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待できると解釈される。この判定
基準により、当該ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれてマッチした部分
は、９０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれてマッチ
した部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する配列については、ＢＬＡＳＴＮ
又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然マッチするも
のを見つける確率は１％未満である。
値をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然一定
数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値は、
好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似性を
表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、ある
ポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値０．１は、ＥＭＢＬデータベースの
規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分
にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待できると解釈される。この判定
基準により、当該ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれてマッチした部分
は、９０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれてマッチ
した部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する配列については、ＢＬＡＳＴＮ
又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然マッチするも
のを見つける確率は１％未満である。
【００３９】 １の実施態様によると、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれに関して「変異
体」のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれよりも核酸の
数が同じか少ない配列で、かつ本発明のポリヌクレオチドと比べて０．０１以下
のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチドは、
本発明のポリヌクレオチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のパラメー
ター設定でＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以
下となる、いかなる配列をもいう。
体」のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれよりも核酸の
数が同じか少ない配列で、かつ本発明のポリヌクレオチドと比べて０．０１以下
のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチドは、
本発明のポリヌクレオチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のパラメー
ター設定でＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以
下となる、いかなる配列をもいう。
【００４０】 変異体ポリヌクレオチドは、前記の列挙されたポリヌクレオチド配列と、スト
リンジェントな条件下で雑種形成するのが一般的である。ここで用いられるとこ
ろの「ストリンジェントな条件」とは、６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳの溶
液で前洗浄し、６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳ中で６５°Ｃ、終夜（ｏｖｅ
ｒｎｉｇｈｔ）雑種形成させ、その後１Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中で６
５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中で
６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄することを指す。
リンジェントな条件下で雑種形成するのが一般的である。ここで用いられるとこ
ろの「ストリンジェントな条件」とは、６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳの溶
液で前洗浄し、６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳ中で６５°Ｃ、終夜（ｏｖｅ
ｒｎｉｇｈｔ）雑種形成させ、その後１Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中で６
５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中で
６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄することを指す。
【００４１】 本発明は、開示された配列とは相違するが、ここに開示されるポリヌクレオチ
ドによりエンコードされるポリペプチドと遺伝暗号の縮退の結果同一のポリペプ
チドをエンコードするポリヌクレオチドとともに前記の開示された配列の対立変
異体遺伝子も含む。したがって、保存的置換の結果、配列識別番号第１−６７、
１３１−４８１及び８３３−８８８番として列挙されたポリヌクレオチド配列又
はこれらの配列の相補体、逆配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオ
チドは本発明により意図され本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０
％未満の欠失及び／又は挿入の結果として、配列識別番号第１−６７、１３１−
４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列、又はこれらの配列の相補体、逆
配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも本発明により意図され
、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換
、挿入及び／又は欠失の結果として、配列識別番号第６８−１３０、４８２−８
３２及び８８９−９４５番に列挙された配列と異なる配列を含むポリペプチドは
、当該変異体ポリペプチドがリグニン生合成経路で活性を有することを条件とし
て、本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。
ドによりエンコードされるポリペプチドと遺伝暗号の縮退の結果同一のポリペプ
チドをエンコードするポリヌクレオチドとともに前記の開示された配列の対立変
異体遺伝子も含む。したがって、保存的置換の結果、配列識別番号第１−６７、
１３１−４８１及び８３３−８８８番として列挙されたポリヌクレオチド配列又
はこれらの配列の相補体、逆配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオ
チドは本発明により意図され本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０
％未満の欠失及び／又は挿入の結果として、配列識別番号第１−６７、１３１−
４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列、又はこれらの配列の相補体、逆
配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも本発明により意図され
、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換
、挿入及び／又は欠失の結果として、配列識別番号第６８−１３０、４８２−８
３２及び８８９−９４５番に列挙された配列と異なる配列を含むポリペプチドは
、当該変異体ポリペプチドがリグニン生合成経路で活性を有することを条件とし
て、本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。
【００４２】 ここで用いられるところの「ｘ−マー」という用語は、「ｘ」の特定の値に関
して、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同
定されたポリヌクレオチドいずれかの少なくとも特定された数（「ｘ」）の連続
した残基を含むポリヌクレオチドを指す。ｘの値は、特定の配列に依存して、約
２０から約６００までである。
して、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同
定されたポリヌクレオチドいずれかの少なくとも特定された数（「ｘ」）の連続
した残基を含むポリヌクレオチドを指す。ｘの値は、特定の配列に依存して、約
２０から約６００までである。
【００４３】 本発明のポリヌクレオチドは、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び
８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチド又はそれらの変異体のいず
れかの少なくとも特定された数の連続した残基（ｘ−マー）を含むポリヌクレオ
チドを含む。好ましい実施態様によると、ｘの値は２０以上が好ましく、４０以
上がより好ましく、６０以上がさらに好ましく、８０以上が最も好ましい。よっ
て、本発明のポリヌクレオチドは配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び
８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチド及び配列識別番号第１−６
７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチドの
中の１つの変異体の２０マー、４０マー、６０マー、８０マー、１００マー、１
２０マー、１５０マー、１８０マー、２２０マー、２５０マー又は３００マー、
４００マー、５００マー又は６００マーを含むポリヌクレオチドを含む。
８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチド又はそれらの変異体のいず
れかの少なくとも特定された数の連続した残基（ｘ−マー）を含むポリヌクレオ
チドを含む。好ましい実施態様によると、ｘの値は２０以上が好ましく、４０以
上がより好ましく、６０以上がさらに好ましく、８０以上が最も好ましい。よっ
て、本発明のポリヌクレオチドは配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び
８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチド及び配列識別番号第１−６
７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチドの
中の１つの変異体の２０マー、４０マー、６０マー、８０マー、１００マー、１
２０マー、１５０マー、１８０マー、２２０マー、２５０マー又は３００マー、
４００マー、５００マー又は６００マーを含むポリヌクレオチドを含む。
【００４４】 本発明のポリヌクレオチドは、以下の実施例１及び２に記載される通り、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａから調製さ
れたｃＤＮＡライブラリのハイスループットシーケンシングにより単離されたも
のでもよい。代替策として、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３
３−８８８番に提供された配列にもとづくオリゴヌクレオチドプローブが合成さ
れ、雑種形成又はＰＣＲ技術を用いてＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及
びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａからのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリのど
ちらかの中で陽性クローンを同定するのに用いられる。プローブはここに提供さ
れた配列より短くてもよいが、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも約１５
個、最も好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長である。かかるオリゴヌ
クレオチドプローブで用いるのに適する雑種形成及びＰＣＲ技術は本発明の技術
分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ社（ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）刊、
１９８９年に教示するものを含む。陽性クローンは制限酵素消化、ＤＮＡ配列決
定等により解析される。
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａから調製さ
れたｃＤＮＡライブラリのハイスループットシーケンシングにより単離されたも
のでもよい。代替策として、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３
３−８８８番に提供された配列にもとづくオリゴヌクレオチドプローブが合成さ
れ、雑種形成又はＰＣＲ技術を用いてＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ及
びＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａからのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリのど
ちらかの中で陽性クローンを同定するのに用いられる。プローブはここに提供さ
れた配列より短くてもよいが、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも約１５
個、最も好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長である。かかるオリゴヌ
クレオチドプローブで用いるのに適する雑種形成及びＰＣＲ技術は本発明の技術
分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ社（ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）刊、
１９８９年に教示するものを含む。陽性クローンは制限酵素消化、ＤＮＡ配列決
定等により解析される。
【００４５】 さらに、本発明のＤＮＡ配列は本発明の技術分野で周知の技術を用いる合成手
段によって生成することができる。オリゴヌクレオチドの自動合成用の設備はＰ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓ
ｉｏｎ （カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）のような供給者から商
業的に入手可能であり、製造者の指示に従って運転するとよい。
段によって生成することができる。オリゴヌクレオチドの自動合成用の設備はＰ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓ
ｉｏｎ （カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）のような供給者から商
業的に入手可能であり、製造者の指示に従って運転するとよい。
【００４６】 １の実施態様では本発明のＤＮＡコントラストは、本発明のポリヌクレオチド
又はその変異体にエンコードされるポリペプチドの少なくとも機能性のある部分
をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。ここで使用されるとこ
ろのポリペプチドの「機能性のある部分」とは、該ポリペプチドの結合部位又は
触媒的なシグナル伝達部位を含む部分をいう。ポリペプチドの機能性のある部分
は、本発明の技術分野で周知のプロトコールを用いる標的突然変異解析と改変さ
れたポリペプチド産物のスクリーニングとにより決定することができる。正常で
は機能性のある部分は１０個ないし２０個のアミノ酸長であるが、より長くても
短くてもよい。活性部位は、１以上のポリペプチド鎖上に存在する離れた部分か
ら構成されることもあり、一般的には高い結合親和性を示す。
又はその変異体にエンコードされるポリペプチドの少なくとも機能性のある部分
をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。ここで使用されるとこ
ろのポリペプチドの「機能性のある部分」とは、該ポリペプチドの結合部位又は
触媒的なシグナル伝達部位を含む部分をいう。ポリペプチドの機能性のある部分
は、本発明の技術分野で周知のプロトコールを用いる標的突然変異解析と改変さ
れたポリペプチド産物のスクリーニングとにより決定することができる。正常で
は機能性のある部分は１０個ないし２０個のアミノ酸長であるが、より長くても
短くてもよい。活性部位は、１以上のポリペプチド鎖上に存在する離れた部分か
ら構成されることもあり、一般的には高い結合親和性を示す。
【００４７】 オープン・リーディング・フレームは、標的植物への該ＤＮＡコンストラクト
の形質転換が野生型植物に比較したポリペプチド量の変化をもたらすように、Ｄ
ＮＡコンストラクトにセンス又はアンチセンス方向に挿入される。オープン・リ
ーディング・フレームをセンス方向に含むＤＮＡコンストラクトでの形質転換は
、選択された遺伝子の発現の改変という結果をもたらすのが一般的であり、オー
プン・リーディング・フレームをアンチセンス方向に含む遺伝子コンストラクト
での形質転換は、選択された遺伝子の発現の減少をもたらすのが一般的である。
本発明のオープン・リーディング・フレームをセンス又はアンチセンス方向のど
ちらかに含むＤＮＡコンストラクトで形質転換された植物の集団は、当業者に周
知の技術を用いて、問題の遺伝子の発現が増大又は減少していることについてス
クリーニングされ、所望の表現型を有する植物が単離される。
の形質転換が野生型植物に比較したポリペプチド量の変化をもたらすように、Ｄ
ＮＡコンストラクトにセンス又はアンチセンス方向に挿入される。オープン・リ
ーディング・フレームをセンス方向に含むＤＮＡコンストラクトでの形質転換は
、選択された遺伝子の発現の改変という結果をもたらすのが一般的であり、オー
プン・リーディング・フレームをアンチセンス方向に含む遺伝子コンストラクト
での形質転換は、選択された遺伝子の発現の減少をもたらすのが一般的である。
本発明のオープン・リーディング・フレームをセンス又はアンチセンス方向のど
ちらかに含むＤＮＡコンストラクトで形質転換された植物の集団は、当業者に周
知の技術を用いて、問題の遺伝子の発現が増大又は減少していることについてス
クリーニングされ、所望の表現型を有する植物が単離される。
【００４８】 代替策として植物細胞のシグナル伝達に関与する遺伝子の発現は、本発明の
オープン・リーディング・フレームの部分をセンス又はアンチセンスのいずれか
の方向に挿入することにより阻害できる。かかる部分は完全長である必要はない
が、本発明のポリヌクレオチドの２５個の残基以上を含むことが好ましく、５０
個以上を含むことがより好ましい。しかし、より長い部分又は完全なオープン・
リーディング・フレームに対応する完全長ポリヌクレオチドも用いることができ
る。前記のオープン・リーディング・フレームの部分は、標的遺伝子の阻害を達
成するのに十分な配列類似性があることを条件として、内在配列と正確に同一で
ある必要はない。したがって、１つの種由来の配列が異なる種の遺伝子の発現を
阻害するのに用いられてもよい。
オープン・リーディング・フレームの部分をセンス又はアンチセンスのいずれか
の方向に挿入することにより阻害できる。かかる部分は完全長である必要はない
が、本発明のポリヌクレオチドの２５個の残基以上を含むことが好ましく、５０
個以上を含むことがより好ましい。しかし、より長い部分又は完全なオープン・
リーディング・フレームに対応する完全長ポリヌクレオチドも用いることができ
る。前記のオープン・リーディング・フレームの部分は、標的遺伝子の阻害を達
成するのに十分な配列類似性があることを条件として、内在配列と正確に同一で
ある必要はない。したがって、１つの種由来の配列が異なる種の遺伝子の発現を
阻害するのに用いられてもよい。
【００４９】 別の実施態様では本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のポリヌクレオチ
ドにエンコードされたポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング領域
を含むＤＮＡ配列又はかかるノンコーディング領域に相補的なＤＮＡ配列を含む
。かかるコンストラクトに有効に用いることができるノンコーディング領域の例
は、イントロン及び５’ノンコーディングリーダー配列を含む。かかるＤＮＡコ
ンストラクトによる標的植物の形質転換は、例えばＮａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ ２：２７９−２９０、１９９０及びｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｎｉ
ｅｂｅｌら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：３４７−３５８、１９９５によって論
じられたのと同様の手法の、コサプレッションのプロセスによる植物の合成する
イソプレノイド化合物の量の減少をもたらす。
ドにエンコードされたポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング領域
を含むＤＮＡ配列又はかかるノンコーディング領域に相補的なＤＮＡ配列を含む
。かかるコンストラクトに有効に用いることができるノンコーディング領域の例
は、イントロン及び５’ノンコーディングリーダー配列を含む。かかるＤＮＡコ
ンストラクトによる標的植物の形質転換は、例えばＮａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ ２：２７９−２９０、１９９０及びｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｎｉ
ｅｂｅｌら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：３４７−３５８、１９９５によって論
じられたのと同様の手法の、コサプレッションのプロセスによる植物の合成する
イソプレノイド化合物の量の減少をもたらす。
【００５０】 代替策としてポリペプチド発現の調節は、適当な配列又はサブ配列（例えばＤ
ＮＡ又はＲＮＡ）をリボザイムコンストラクトに挿入することにより達成できる
（ＭｃＩｎｔｙｒｅ ＣＬとＭａｎｎｅｒｓ ＪＭ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒ
ｅｓ． ５（４）：２５７−２６２、１９９６）。リボザイムは２つの領域に相
補的な雑種形成領域を含む合成ＲＮＡ分子である。各々の領域は、本発明のポリ
ヌクレオチドの１つにエンコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも５個以上の連
続したヌクレオチドを含むのが好ましい。リボザイムは非常に特異性の高いエン
ドヌクレアーゼ活性を有し、自己触媒的に前記ｍＲＮＡを切断する。
ＮＡ又はＲＮＡ）をリボザイムコンストラクトに挿入することにより達成できる
（ＭｃＩｎｔｙｒｅ ＣＬとＭａｎｎｅｒｓ ＪＭ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒ
ｅｓ． ５（４）：２５７−２６２、１９９６）。リボザイムは２つの領域に相
補的な雑種形成領域を含む合成ＲＮＡ分子である。各々の領域は、本発明のポリ
ヌクレオチドの１つにエンコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも５個以上の連
続したヌクレオチドを含むのが好ましい。リボザイムは非常に特異性の高いエン
ドヌクレアーゼ活性を有し、自己触媒的に前記ｍＲＮＡを切断する。
【００５１】 本発明の遺伝子コンストラクトは、さらに、転写されるべきＤＮＡ配列に操作
可能に結合させた遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列を含
み、遺伝子発現を制御する。遺伝子プロモーター配列は一般的には転写されるＤ
ＮＡ配列の５’末端に位置して、該ＤＮＡ配列の転写の開始に用いられる。遺伝
子プロモーター配列は一般的には遺伝子の５’ノンコーディング領域に見いださ
れるが、オープン・リーディング・フレームの下流又はイントロン内に存在する
こともあり（Ｌｕｅｈｒｓｅｎ ＫＲ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：
８１−９３、１９９１）、例えば植物防御遺伝子のようにコーディング領域内に
存在することもある（Ｄｏｕｇｌａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１７６７−１
７７５、１９９１）。
可能に結合させた遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列を含
み、遺伝子発現を制御する。遺伝子プロモーター配列は一般的には転写されるＤ
ＮＡ配列の５’末端に位置して、該ＤＮＡ配列の転写の開始に用いられる。遺伝
子プロモーター配列は一般的には遺伝子の５’ノンコーディング領域に見いださ
れるが、オープン・リーディング・フレームの下流又はイントロン内に存在する
こともあり（Ｌｕｅｈｒｓｅｎ ＫＲ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：
８１−９３、１９９１）、例えば植物防御遺伝子のようにコーディング領域内に
存在することもある（Ｄｏｕｇｌａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１７６７−１
７７５、１９９１）。
【００５２】 本発明のＤＮＡコンストラクトに有効に利用できる様々な遺伝子プロモーター
配列は本発明の技術分野で周知である。遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ター
ミネーション配列は、標的植物宿主に内在するものでもよく、該標的宿主内で機
能性を有するときは、外来のものでもよい。例えば、プロモーター及びターミネ
ーション配列は他の植物種、植物ウィルス、細菌プラスミドその他これらに類す
るもの由来のものでもよい。遺伝子プロモーター及びターミネーション配列は本
発明の配列自体由来であることが好ましい。
配列は本発明の技術分野で周知である。遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ター
ミネーション配列は、標的植物宿主に内在するものでもよく、該標的宿主内で機
能性を有するときは、外来のものでもよい。例えば、プロモーター及びターミネ
ーション配列は他の植物種、植物ウィルス、細菌プラスミドその他これらに類す
るもの由来のものでもよい。遺伝子プロモーター及びターミネーション配列は本
発明の配列自体由来であることが好ましい。
【００５３】 プロモーターの選択に影響を与える要因には、コンストラクトの所望の組織特
異性及び転写と翻訳のタイミングが含まれる。例えば、３５Ｓカリフラワーモザ
イクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターのような構成的なプロモーターは
、植物の全ての部分における酵素活性に影響を及ぼす。組織特異的なプロモータ
ーを使うことは、関心のある組織においてのみ所望のセンス又はアンチセンスＲ
ＮＡを産生することになる。誘導可能な遺伝子プロモーター配列を用いる遺伝子
コンストラクトでは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度は、光、熱、
嫌気性ストレス、栄養条件の変化等のような外界の刺激により変動させることが
できる。時間的に調節されたプロモーターは、形質転換細胞の発生の間の特定の
時にＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度の変動に影響を与えるために用
いられる。問題の酵素遺伝子由来の本来のプロモーターか、ユーカリ又はマツの
ような形質転換される生物の特定の組織にだけ発現する遺伝子由来のプロモータ
ーかを使うのが好ましい。本発明に有効に利用できる遺伝子プロモーターの他の
例には、マンノピンシンターゼ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｍａ
ｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｏｃｓ）
及びＣｈｕａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１７４１８１、１９８９により総説
されたものが含まれる。
異性及び転写と翻訳のタイミングが含まれる。例えば、３５Ｓカリフラワーモザ
イクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターのような構成的なプロモーターは
、植物の全ての部分における酵素活性に影響を及ぼす。組織特異的なプロモータ
ーを使うことは、関心のある組織においてのみ所望のセンス又はアンチセンスＲ
ＮＡを産生することになる。誘導可能な遺伝子プロモーター配列を用いる遺伝子
コンストラクトでは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度は、光、熱、
嫌気性ストレス、栄養条件の変化等のような外界の刺激により変動させることが
できる。時間的に調節されたプロモーターは、形質転換細胞の発生の間の特定の
時にＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度の変動に影響を与えるために用
いられる。問題の酵素遺伝子由来の本来のプロモーターか、ユーカリ又はマツの
ような形質転換される生物の特定の組織にだけ発現する遺伝子由来のプロモータ
ーかを使うのが好ましい。本発明に有効に利用できる遺伝子プロモーターの他の
例には、マンノピンシンターゼ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｍａ
ｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｏｃｓ）
及びＣｈｕａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１７４１８１、１９８９により総説
されたものが含まれる。
【００５４】 転写されるＤＮＡ配列の３’側に位置する遺伝子ターミネーション配列は、遺
伝子プロモーター配列と同じ遺伝子由来のものでもよく、異なる遺伝子由来のも
のでもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝
子の３’末端のように当業者に周知の多くの遺伝子ターミネーション配列が本発
明に有効に利用できる。１の実施態様では遺伝子ターミネーター配列は、本来の
酵素遺伝子又は形質転換される標的の種に由来するものである。
伝子プロモーター配列と同じ遺伝子由来のものでもよく、異なる遺伝子由来のも
のでもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝
子の３’末端のように当業者に周知の多くの遺伝子ターミネーション配列が本発
明に有効に利用できる。１の実施態様では遺伝子ターミネーター配列は、本来の
酵素遺伝子又は形質転換される標的の種に由来するものである。
【００５５】 本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のコンストラクトを含む形質転換細
胞の検出ができるように、植物細胞で有効な選択マーカーを含むこともある。本
発明の技術分野で周知のかかるマーカーは、１以上の毒素の耐性を有するのが典
型的である。かかるマーカーの１つの例は、その発現により中程度の濃度で植物
細胞に通常は毒性のあるカナマイシン又はハイグロマイシンの耐性をもたらすＮ
ＰＴＩＩ遺伝子である（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＡとＷｅｉｓｓ
ｂａｃｈ Ｈ編集、「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）刊、１９８８年）。形
質転換細胞は問題の抗生物質を含む培地中で増殖する能力により同定できる。代
替策として、形質転換細胞中に所望のコンストラクトが存在することは、サザン
及びウェスタンブロット法のような本発明の技術分野に周知の他の技術によって
決定することができる。
胞の検出ができるように、植物細胞で有効な選択マーカーを含むこともある。本
発明の技術分野で周知のかかるマーカーは、１以上の毒素の耐性を有するのが典
型的である。かかるマーカーの１つの例は、その発現により中程度の濃度で植物
細胞に通常は毒性のあるカナマイシン又はハイグロマイシンの耐性をもたらすＮ
ＰＴＩＩ遺伝子である（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＡとＷｅｉｓｓ
ｂａｃｈ Ｈ編集、「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）刊、１９８８年）。形
質転換細胞は問題の抗生物質を含む培地中で増殖する能力により同定できる。代
替策として、形質転換細胞中に所望のコンストラクトが存在することは、サザン
及びウェスタンブロット法のような本発明の技術分野に周知の他の技術によって
決定することができる。
【００５６】 本発明のＤＮＡコンストラクトの構成要素を操作可能に結合させるための技術
は本発明の技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社（ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）刊、１９８９年）に記載された、１以上の制限エンドヌクレ
アーゼ部位を含む合成リンカーの利用を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトは
、各操作毎の後に出来上がったコンストラクトがクローン化され配列決定されて
操作の正確さを決定することが可能な、例えば、大腸菌のような１以上の複製シ
ステムを有するベクターと連結されてもよい。
は本発明の技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社（ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）刊、１９８９年）に記載された、１以上の制限エンドヌクレ
アーゼ部位を含む合成リンカーの利用を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトは
、各操作毎の後に出来上がったコンストラクトがクローン化され配列決定されて
操作の正確さを決定することが可能な、例えば、大腸菌のような１以上の複製シ
ステムを有するベクターと連結されてもよい。
【００５７】 本発明の遺伝子コンストラクトは、単子葉類被子植物（例、牧草、トウモロコ
シ、穀類、カラスムギ、コムギ、オオムギ）と双子葉類被子植物（例、シロイヌ
ナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）及
び裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒ
ｅｓｔ Ｒｅｓ． Ｐａｐｅｒｓ、第５９５巻、１９９６）、ホワイトスプルー
ス（Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：８４−８９、１９９３
）、及びカラマツ（Ｈｕａｎｇら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ ２７：２０１
−２０７、１９９１）の両方を含むさまざまな植物の形質転換に使われる。好ま
しい実施態様においては、本発明のＤＮＡコンストラクトは、その茎が複数年生
存して木質組織の追加により毎年直径が増大するような樹木又は潅木とここでは
定義される、木本植物の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカ
リ及びマツの種を含むグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択
される。本発明のＤＮＡコンストラクトで有用に形質転換される他の種には、Ｐ
ｉｎｕｓ ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｂｒｕｔｉａ、Ｐｉｎｕｓ ｃａ
ｒｉｂａｅａ、Ｐｉｎｕｓ ｃｌａｕｓａ、Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｐ
ｉｎｕｓ ｃｏｕｌｔｅｒｉ、Ｐｉｎｕｓ ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｐｉｎｕｓ ｅ
ｌｄａｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉ、Ｐｉｎｕｓ ｊｅｆｆｒｅｙｉ
、Ｐｉｎｕｓ ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐ
ｉｎｕｓ ｎｉｇｒａ、Ｐｉｎｕｓ ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎ
ａｓｔｅｒ、Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ ｒｅｓｉｎｏｓａ
、Ｐｉｎｕｓ ｒｉｇｉｄａ、Ｐｉｎｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｓ
ｔｒｏｂｕｓ、Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ、
Ｐｉｎｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａのようなマツと、Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌ
ｉｓ、Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ、Ａｂｉｅｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ、Ａｂｉ
ｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｂｉｅｓ ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ａｂｉｅｓ ｍａ
ｇｎｉｆｉｃａ、Ａｂｉｅｓ ｐｒｏｃｅｒａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ
ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉ
ｓ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｔｈｙｏｉｄｅｓ、Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖ
ｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｌａｒｉｘ ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌａｒｉｘ ｌａｒｉｃｉ
ｎａ、Ｌａｒｉｘ ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ
ｉｓ、Ｌａｒｉｘ ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ ｄｅｃｕｒｒｅ
ｎｓ、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ、Ｐｉｃｅａ ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ、Ｐｉｃｅ
ａ ｇｌａｕｃａ、Ｐｉｃｅａ ｍａｒｉａｎａ、Ｐｉｃｅａ ｐｕｎｇｅｎｓ
、Ｐｉｃｅａ ｒｕｂｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ、Ｓｅｑｕｏｉａ ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｓｅ
ｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕ
ｍ、Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌ
ａ、Ｔｓｕｇａ ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ、Ｔｈｕｊａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ
ｉｓ、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａのような他の裸子植物と、Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ａｌｂａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅｕｃａｌｙ
ｐｔｕｓ ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｒｉｄｇｅｓｉａ
ｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｏｃ
ｃｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｉ
ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐ
ｔｕｓ ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕ
ｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｈｅｎｒｙｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｌａ
ｅｖｏｐｉｎｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｕｌ
ａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｍｅｇａｃａｒｐａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｌ
ｉｑｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｇｎａ
ｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｒｏｂｕｓｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｕｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｓａｌｉｇｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅｕｃａｌ
ｙｐｔｕｓ ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｅｒｅｔｉｃｏ
ｒｎｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｖｉｒｉｄｉｓ、
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｗａｎｄｏｏ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｙｏｕｍａｎｎ
ｉのようなユーカリと、上記の種のいずれかのハイブリッドとを含むが、これら
に限定されない。
シ、穀類、カラスムギ、コムギ、オオムギ）と双子葉類被子植物（例、シロイヌ
ナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）及
び裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒ
ｅｓｔ Ｒｅｓ． Ｐａｐｅｒｓ、第５９５巻、１９９６）、ホワイトスプルー
ス（Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：８４−８９、１９９３
）、及びカラマツ（Ｈｕａｎｇら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ ２７：２０１
−２０７、１９９１）の両方を含むさまざまな植物の形質転換に使われる。好ま
しい実施態様においては、本発明のＤＮＡコンストラクトは、その茎が複数年生
存して木質組織の追加により毎年直径が増大するような樹木又は潅木とここでは
定義される、木本植物の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカ
リ及びマツの種を含むグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択
される。本発明のＤＮＡコンストラクトで有用に形質転換される他の種には、Ｐ
ｉｎｕｓ ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｂｒｕｔｉａ、Ｐｉｎｕｓ ｃａ
ｒｉｂａｅａ、Ｐｉｎｕｓ ｃｌａｕｓａ、Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｐ
ｉｎｕｓ ｃｏｕｌｔｅｒｉ、Ｐｉｎｕｓ ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｐｉｎｕｓ ｅ
ｌｄａｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉ、Ｐｉｎｕｓ ｊｅｆｆｒｅｙｉ
、Ｐｉｎｕｓ ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐ
ｉｎｕｓ ｎｉｇｒａ、Ｐｉｎｕｓ ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎ
ａｓｔｅｒ、Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ ｒｅｓｉｎｏｓａ
、Ｐｉｎｕｓ ｒｉｇｉｄａ、Ｐｉｎｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｓ
ｔｒｏｂｕｓ、Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ、
Ｐｉｎｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａのようなマツと、Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌ
ｉｓ、Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ、Ａｂｉｅｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ、Ａｂｉ
ｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｂｉｅｓ ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ａｂｉｅｓ ｍａ
ｇｎｉｆｉｃａ、Ａｂｉｅｓ ｐｒｏｃｅｒａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ
ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉ
ｓ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｔｈｙｏｉｄｅｓ、Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖ
ｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｌａｒｉｘ ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌａｒｉｘ ｌａｒｉｃｉ
ｎａ、Ｌａｒｉｘ ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ
ｉｓ、Ｌａｒｉｘ ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ ｄｅｃｕｒｒｅ
ｎｓ、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ、Ｐｉｃｅａ ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ、Ｐｉｃｅ
ａ ｇｌａｕｃａ、Ｐｉｃｅａ ｍａｒｉａｎａ、Ｐｉｃｅａ ｐｕｎｇｅｎｓ
、Ｐｉｃｅａ ｒｕｂｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ、Ｓｅｑｕｏｉａ ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｓｅ
ｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕ
ｍ、Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌ
ａ、Ｔｓｕｇａ ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ、Ｔｈｕｊａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ
ｉｓ、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａのような他の裸子植物と、Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ａｌｂａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅｕｃａｌｙ
ｐｔｕｓ ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｒｉｄｇｅｓｉａ
ｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｏｃ
ｃｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｉ
ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐ
ｔｕｓ ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕ
ｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｈｅｎｒｙｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｌａ
ｅｖｏｐｉｎｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｕｌ
ａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｍｅｇａｃａｒｐａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｌ
ｉｑｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｇｎａ
ｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｒｏｂｕｓｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｕｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｓａｌｉｇｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅｕｃａｌ
ｙｐｔｕｓ ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｅｒｅｔｉｃｏ
ｒｎｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｖｉｒｉｄｉｓ、
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｗａｎｄｏｏ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｙｏｕｍａｎｎ
ｉのようなユーカリと、上記の種のいずれかのハイブリッドとを含むが、これら
に限定されない。
【００５８】 ＤＮＡコンストラクトを標的植物のゲノムに安定的に取り込むための技術は本
発明の技術分野で周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介し
た導入法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、生殖器官注入法
、未熟胚注入法、高速発射体導入法（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｐｒｏｊｅ
ｃｔｉｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、その他これらに類するものが含まれ
る。技術の選択は、形質転換される標的植物に依存する。例えば、双子葉類植物
及びある種の単子葉類及び裸子植物は、例えばＢｅｖａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１、１９８４）により記載されたよ
うに、アグロバクテリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換できる。本発明
の遺伝子コンストラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、散布された細
胞、プロトプラスト、種子、胚、分裂組織領域、子葉、胚軸およびこれらに類す
るものが含まれる。ユーカリ及びマツを形質転換する１つの方法は、花粉（例え
ば、Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ． Ｐａｐｅｒｓ、
Ｖｏｌ． ５９５：５３、１９９６を参照）又は容易に再生可能な胚組織を用い
るバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な方法である。
発明の技術分野で周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介し
た導入法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、生殖器官注入法
、未熟胚注入法、高速発射体導入法（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｐｒｏｊｅ
ｃｔｉｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、その他これらに類するものが含まれ
る。技術の選択は、形質転換される標的植物に依存する。例えば、双子葉類植物
及びある種の単子葉類及び裸子植物は、例えばＢｅｖａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１、１９８４）により記載されたよ
うに、アグロバクテリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換できる。本発明
の遺伝子コンストラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、散布された細
胞、プロトプラスト、種子、胚、分裂組織領域、子葉、胚軸およびこれらに類す
るものが含まれる。ユーカリ及びマツを形質転換する１つの方法は、花粉（例え
ば、Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ． Ｐａｐｅｒｓ、
Ｖｏｌ． ５９５：５３、１９９６を参照）又は容易に再生可能な胚組織を用い
るバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な方法である。
【００５９】 ひとたび細胞が形質転換されると、ゲノムに取り込まれた本発明のＤＮＡコン
ストラクトを有する細胞は、上記のカナマイシン耐性マーカーのようなマーカー
により選択できる。トランスジェニックな細胞は、本発明の技術分野で周知の技
術を用いて、植物全体を再生するための適当な培地中で培養される。プロトプラ
ストの場合は細胞壁は適当な浸透圧条件下で再生させられる。種子又は胚の場合
には、適当な発芽又はカルス誘導培地が用いられる。外植体については適当な再
生培地が用いられる。植物の再生は、多くの種について十分に確立している。林
木の再生の総説としては、Ｄｕｎｓｔａｎら、「木本植物における体細胞的胚形
成（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａ
ｎｔｓ）」、（Ｔｈｏｒｐｅ ＴＡ編集、植物の試験管内胚形成（Ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ２０（１２）：４７１−５４０、１９９５）を参照のこ
と。スプルースの再生についての具体的なプロトコールはＲｏｂｅｒｔｓの「ト
ウヒ（ｓｐｒｕｃｅ）の体細胞的胚形成（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐｒｕｃｅ）」（Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ Ｋ編集、「シンシ
ード：人工的な種子の収穫の改善への応用（Ｓｙｎｓｅｅｄ： ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｅｄ ｔｏ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒ
ｏｖｅｍｅｎｔ）」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社刊：第２３章、４２７−４４９頁，
１９９３年）に説明されている。得られた形質転換植物は、本発明の分野で周知
の技術を用いて、次世代以降のトランスジェニック植物を得るために、有性的又
は無性的な生殖で増やされることもある。
ストラクトを有する細胞は、上記のカナマイシン耐性マーカーのようなマーカー
により選択できる。トランスジェニックな細胞は、本発明の技術分野で周知の技
術を用いて、植物全体を再生するための適当な培地中で培養される。プロトプラ
ストの場合は細胞壁は適当な浸透圧条件下で再生させられる。種子又は胚の場合
には、適当な発芽又はカルス誘導培地が用いられる。外植体については適当な再
生培地が用いられる。植物の再生は、多くの種について十分に確立している。林
木の再生の総説としては、Ｄｕｎｓｔａｎら、「木本植物における体細胞的胚形
成（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａ
ｎｔｓ）」、（Ｔｈｏｒｐｅ ＴＡ編集、植物の試験管内胚形成（Ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ２０（１２）：４７１−５４０、１９９５）を参照のこ
と。スプルースの再生についての具体的なプロトコールはＲｏｂｅｒｔｓの「ト
ウヒ（ｓｐｒｕｃｅ）の体細胞的胚形成（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐｒｕｃｅ）」（Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ Ｋ編集、「シンシ
ード：人工的な種子の収穫の改善への応用（Ｓｙｎｓｅｅｄ： ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｅｄ ｔｏ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒ
ｏｖｅｍｅｎｔ）」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社刊：第２３章、４２７−４４９頁，
１９９３年）に説明されている。得られた形質転換植物は、本発明の分野で周知
の技術を用いて、次世代以降のトランスジェニック植物を得るために、有性的又
は無性的な生殖で増やされることもある。
【００６０】 前記の説明の通り、標的細胞中のＲＮＡ産生は、プロモーター配列の選択によ
り制御できる。標的植物は、２以上の本発明のコンストラクトで形質転換され、
２以上のポリペプチド活性を改変し、２以上の組織でのポリペプチド活性に影響
を与え、又は２以上の発現時でのポリペプチド活性に影響を与えることもある。
同様に遺伝子コンストラクトは、本発明のポリペプチドをコードする２以上のオ
ープン・リーディング・フレームを含むように、又はかかるポリペプチドをコー
ドする遺伝子の２以上のノンコーディング領域を含むように構築されてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、また、植物細胞シグナル伝達に関与するポリペプ
チドをエンコードする他の既知配列との組み合わせで用いてもよい。
り制御できる。標的植物は、２以上の本発明のコンストラクトで形質転換され、
２以上のポリペプチド活性を改変し、２以上の組織でのポリペプチド活性に影響
を与え、又は２以上の発現時でのポリペプチド活性に影響を与えることもある。
同様に遺伝子コンストラクトは、本発明のポリペプチドをコードする２以上のオ
ープン・リーディング・フレームを含むように、又はかかるポリペプチドをコー
ドする遺伝子の２以上のノンコーディング領域を含むように構築されてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、また、植物細胞シグナル伝達に関与するポリペプ
チドをエンコードする他の既知配列との組み合わせで用いてもよい。
【００６１】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ雑種形成及びＰＣＲ技術で決
まり切って用いられるような本発明の技術分野で周知の技術を用いて、他の植物
種由来の細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列
を単離するためのプローブとして用いることもできる。
まり切って用いられるような本発明の技術分野で周知の技術を用いて、他の植物
種由来の細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列
を単離するためのプローブとして用いることもできる。
【００６２】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及びかかるポリペプチドに対する抗
体はかかるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドと相互作用し、それにより
細胞シグナル伝達を改変する分子をスクリーニングするために用いられる。かか
る検定法を実施するための技術は本発明の技術分野で周知である。同様に、本発
明のポリヌクレオチドとポリペプチドは細胞シグナル伝達経路を解明するために
デザインされた研究に用いられることもある。
体はかかるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドと相互作用し、それにより
細胞シグナル伝達を改変する分子をスクリーニングするために用いられる。かか
る検定法を実施するための技術は本発明の技術分野で周知である。同様に、本発
明のポリヌクレオチドとポリペプチドは細胞シグナル伝達経路を解明するために
デザインされた研究に用いられることもある。
【００６３】 以下の実施例は例示として与えられ、限定として与えられるのではない。
【００６４】 実施例１ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来のｃＤＮＡクローンの単離とキャ
ラクタリゼーション Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓｃＤＮＡ発現ライブラリは、以下の通
り構築されスクリーニングされた。
ラクタリゼーション Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓｃＤＮＡ発現ライブラリは、以下の通
り構築されスクリーニングされた。
【００６５】 ｍＲＮＡは、Ｃｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １１：１１３−１１６、１９９３）のプロトコールに少
し修正を加えたものを用いて、幹の木部のような特定の植物組織から抽出された
。具体的にはサンプルは、ＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、
ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＣＴＡＢ、２％
ＰＶＰ及び０．０５％ スペルミジン３塩酸塩）に溶解し、クロロフォルム：
イソアミルアルコールが２４：１の混合液で抽出された。ｍＲＮＡはエタノール
で沈殿され、全ＲＮＡ調製物はポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡアイソレーションキ
ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を用いて
精製された。ｃＤＮＡ発現ライブラリは、前記精製ｍＲＮＡから製造者のプロト
コールに従ってＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）を用いて逆転写酵素合成した後、ｃＤＮＡクローンをラムダＺＡＰへ挿入して
構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスに１μｌの
サンプルＤＮＡを用いて、ギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングをした。ライブラリの大量切り出し（ｍａ
ｓｓ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞及びＸＬＯＬＲ
細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）とともに用いて行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹ
ブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で
希釈され、Ｘ−ｇａｌ及びイソプロピルチオ−ベータ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ
）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上に播かれた。
ｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １１：１１３−１１６、１９９３）のプロトコールに少
し修正を加えたものを用いて、幹の木部のような特定の植物組織から抽出された
。具体的にはサンプルは、ＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、
ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＣＴＡＢ、２％
ＰＶＰ及び０．０５％ スペルミジン３塩酸塩）に溶解し、クロロフォルム：
イソアミルアルコールが２４：１の混合液で抽出された。ｍＲＮＡはエタノール
で沈殿され、全ＲＮＡ調製物はポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡアイソレーションキ
ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を用いて
精製された。ｃＤＮＡ発現ライブラリは、前記精製ｍＲＮＡから製造者のプロト
コールに従ってＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）を用いて逆転写酵素合成した後、ｃＤＮＡクローンをラムダＺＡＰへ挿入して
構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスに１μｌの
サンプルＤＮＡを用いて、ギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングをした。ライブラリの大量切り出し（ｍａ
ｓｓ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞及びＸＬＯＬＲ
細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）とともに用いて行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹ
ブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で
希釈され、Ｘ−ｇａｌ及びイソプロピルチオ−ベータ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ
）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上に播かれた。
【００６６】 ＤＮＡミニプレップ用にプレートされ釣り上げられたコロニーのうち、９９％
は配列決定に適したインサートを含んでいた。陽性クローンはカナマイシン入り
のＮＺＹブロス中で培養され、ｃＤＮＡはアルカリ溶菌法とポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）沈殿法により精製された。１％のアガロースゲルがシーケンシン
グ用鋳型に染色体の混入があるかどうかをスクリーニングするために用いられた
。ダイプライマー配列はターボカタリスト８００マシン(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カリフォル
ニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ)を製造者のプロトコールに従って用いて調製
された。
は配列決定に適したインサートを含んでいた。陽性クローンはカナマイシン入り
のＮＺＹブロス中で培養され、ｃＤＮＡはアルカリ溶菌法とポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）沈殿法により精製された。１％のアガロースゲルがシーケンシン
グ用鋳型に染色体の混入があるかどうかをスクリーニングするために用いられた
。ダイプライマー配列はターボカタリスト８００マシン(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カリフォル
ニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ)を製造者のプロトコールに従って用いて調製
された。
【００６７】 陽性クローンのＤＮＡ配列は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｒｉｓｍ３７７シーケンサーを用
いて得られた。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によって
は３’末端側からも配列決定された。いくつかのクローンについては、既知配列
の末端と雑種形成するプライマーを設計し、これらを配列情報量を拡張するため
の配列決定用プライマーとして用いることにより、内部の配列が得られた。代替
策として内部配列は、公開された方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｇｅｎｅ ２８：３
５１−３５９、１９８４）を用いて、関心のある遺伝子の「入れ子になった（ｎ
ｅｓｔｅｄ）」欠失クローンを生成することにより得られた。
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｒｉｓｍ３７７シーケンサーを用
いて得られた。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によって
は３’末端側からも配列決定された。いくつかのクローンについては、既知配列
の末端と雑種形成するプライマーを設計し、これらを配列情報量を拡張するため
の配列決定用プライマーとして用いることにより、内部の配列が得られた。代替
策として内部配列は、公開された方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｇｅｎｅ ２８：３
５１−３５９、１９８４）を用いて、関心のある遺伝子の「入れ子になった（ｎ
ｅｓｔｅｄ）」欠失クローンを生成することにより得られた。
【００６８】 配列決定されたｃＤＮＡ配列は、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ及び／
又はＢＬＡＳＴＮを用いて、ＥＭＢＬデータベース（リリース５８，１９９９年
３月）の既知配列と比較された。冗長な配列のマルチプルアライメントが、信頼
できるコンセンサス配列を組み立てるために用いられた。他の植物種由来の既知
配列との類似性にもとづき、単離されたＤＮＡは、ＲＬＫ（配列識別番号第２、
８、９、１１、１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４、３８、１３１−３
０１、４４８−４６３、８４８、８５８−８７４及び８８２−８８７番）又は２
要素シグナル伝達システムの少なくとも１の構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリ
ッドＨＫ／ＲＲタンパク質、配列識別番号第４２、４８−５２、５５−５８、６
７、４６４−４７１、４７４−４７８及び８５０−８５７番）をエンコードする
ものとして同定された。配列識別番号第２、８、９、１１、１５、１８、１９、
２１−２５、３３、３４及び３８番は（上記の通りの決定法により）既知配列と
同一の残基が１０％未満しか見つからなかった。配列識別番号第８４８、８５４
、８５５、８５６、８５９、８６０、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６
、８６７、８６８、８６９、８７１、８７２、８７３、８７４、８８２、８８３
及び８８５番は、それぞれ配列識別番号第２３２、４６７、４６８、４８、２８
２、２８８、４８８、４５３、２８９、２６８、２９７、２７８、２９０、４４
９、２９９、３０１、２７０、２６９、２７６、４５４及び３００番の拡張配列
を表し、配列識別番号第８４８、８５４−８５６、８５９、８６０、８６２−８
６５、８６８、８６９及び８７１−８７４番は完全長配列である。
又はＢＬＡＳＴＮを用いて、ＥＭＢＬデータベース（リリース５８，１９９９年
３月）の既知配列と比較された。冗長な配列のマルチプルアライメントが、信頼
できるコンセンサス配列を組み立てるために用いられた。他の植物種由来の既知
配列との類似性にもとづき、単離されたＤＮＡは、ＲＬＫ（配列識別番号第２、
８、９、１１、１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４、３８、１３１−３
０１、４４８−４６３、８４８、８５８−８７４及び８８２−８８７番）又は２
要素シグナル伝達システムの少なくとも１の構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリ
ッドＨＫ／ＲＲタンパク質、配列識別番号第４２、４８−５２、５５−５８、６
７、４６４−４７１、４７４−４７８及び８５０−８５７番）をエンコードする
ものとして同定された。配列識別番号第２、８、９、１１、１５、１８、１９、
２１−２５、３３、３４及び３８番は（上記の通りの決定法により）既知配列と
同一の残基が１０％未満しか見つからなかった。配列識別番号第８４８、８５４
、８５５、８５６、８５９、８６０、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６
、８６７、８６８、８６９、８７１、８７２、８７３、８７４、８８２、８８３
及び８８５番は、それぞれ配列識別番号第２３２、４６７、４６８、４８、２８
２、２８８、４８８、４５３、２８９、２６８、２９７、２７８、２９０、４４
９、２９９、３０１、２７０、２６９、２７６、４５４及び３００番の拡張配列
を表し、配列識別番号第８４８、８５４−８５６、８５９、８６０、８６２−８
６５、８６８、８６９及び８７１−８７４番は完全長配列である。
【００６９】 実施例２ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来のｃＤＮＡクローンの単離とキャラクタリゼ
ーション Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａのｃＤＮＡ発現ライブラリが実施例１に記載の通
り木部のような特定の組織から構築され、スクリーニングされた。陽性クローン
のＤＮＡ配列はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｒｉｓｍ３７７シーケンサーで順方向及び逆方向プ
ライマーを用いて得られ、決定された配列は上記の通りデータベース中の既知配
列と比較された。
ーション Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａのｃＤＮＡ発現ライブラリが実施例１に記載の通
り木部のような特定の組織から構築され、スクリーニングされた。陽性クローン
のＤＮＡ配列はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｒｉｓｍ３７７シーケンサーで順方向及び逆方向プ
ライマーを用いて得られ、決定された配列は上記の通りデータベース中の既知配
列と比較された。
【００７０】 他の植物種由来の既知配列との類似性にもとづき単離されたＤＮＡ配列は、Ｒ
ＬＫ（配列識別番号第１、３−７、１０、１２−１４、１６、１７、２０、２６
−３２、３５−３７、３９−４１、３０２−４４７、８３３−８４７、８７５−
８８１及び８８８番）又は２要素シグナル伝達システムの少なくとも１の構成要
素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質、配列識別番号第４３−
４７、５３、５４、５９−６６、４７２、４７３、４７９−４８１及び８４９番
）をエンコードするものとして同定された。配列識別番号第３−７、１０、１２
−１４、１６、１７、２０、２６、２８−３２、３５−３７及び３９−４１番の
配列は（上記の通り決定された）既知配列と同一の残基が１０％未満であること
がわかった。配列識別番号第４８０番の配列はスプライシングされなかったイン
トロンと予測されるものを含むことがみつかり、翻訳は２つのオープン・リーデ
ィング・フレームに切り離される。これらの２つのオープン・リーディング・フ
レームにエンコードされたアミノ酸配列は配列識別番号第８３０及び８３１番に
提供される。配列識別番号第４１１、４１３、３１７、４２１、４１５、４３４
及び４１６番はそれぞれ配列識別番号第２６、１７、２８、３９、１６、３０及
び４１番の拡張配列を表す。配列識別番号第８３３、８３４、８３５、８３６、
８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８７５、
８７６、８７７、８７８、８７９、８８０及び８８８番はそれぞれ配列識別番号
第４１１、４１３、３１７、２９、４２１、４１５、４３４、４１６、３５、３
７、３６、４０、４３８、４２６、４４５、４１８、４３５、４１１及び４２７
番の拡張配列を表し、第８３３−８３７、８３９−８４１、８４４及び８７８−
８８１番は完全長配列である。
ＬＫ（配列識別番号第１、３−７、１０、１２−１４、１６、１７、２０、２６
−３２、３５−３７、３９−４１、３０２−４４７、８３３−８４７、８７５−
８８１及び８８８番）又は２要素シグナル伝達システムの少なくとも１の構成要
素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質、配列識別番号第４３−
４７、５３、５４、５９−６６、４７２、４７３、４７９−４８１及び８４９番
）をエンコードするものとして同定された。配列識別番号第３−７、１０、１２
−１４、１６、１７、２０、２６、２８−３２、３５−３７及び３９−４１番の
配列は（上記の通り決定された）既知配列と同一の残基が１０％未満であること
がわかった。配列識別番号第４８０番の配列はスプライシングされなかったイン
トロンと予測されるものを含むことがみつかり、翻訳は２つのオープン・リーデ
ィング・フレームに切り離される。これらの２つのオープン・リーディング・フ
レームにエンコードされたアミノ酸配列は配列識別番号第８３０及び８３１番に
提供される。配列識別番号第４１１、４１３、３１７、４２１、４１５、４３４
及び４１６番はそれぞれ配列識別番号第２６、１７、２８、３９、１６、３０及
び４１番の拡張配列を表す。配列識別番号第８３３、８３４、８３５、８３６、
８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８７５、
８７６、８７７、８７８、８７９、８８０及び８８８番はそれぞれ配列識別番号
第４１１、４１３、３１７、２９、４２１、４１５、４３４、４１６、３５、３
７、３６、４０、４３８、４２６、４４５、４１８、４３５、４１１及び４２７
番の拡張配列を表し、第８３３−８３７、８３９−８４１、８４４及び８７８−
８８１番は完全長配列である。
【００７１】 実施例３ 植物の成長を改変するためのエチレン受容体遺伝子の利用 タバコ植物体のＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａエチレン受容体遺伝子ホモログに
よる形質転換は以下の通りに行われる。Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来のエチ
レン受容体ホモログ（配列識別番号第４３番）のコーディング領域を含むＤＮＡ
配列を含むセンス及びアンチセンスコントラストを含むＤＮＡコントラストが構
築され、公開された方法（Ａｎ、バイナリーベクター（Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ．）、Ｇｅｌｖｉｎ ＳＢとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ編集、植物
分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍ
ａｎｕａｌ）、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社刊、
Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８年）を用いて直接形質転換法によりアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス菌に挿入する。センスＤＮＡのコントラストはＰＢＫ
−ＣＭＶプラスミドのｃＤＮＡ挿入配列をｐＡＲＴ７プラスミドにクローン化し
、次に該ｐＡＲＴ７ベクターからＮｏｔＩで消化した３５Ｓ−インサート−ＯＣ
Ｓ３’ＵＴＲ断片をｐＡＲＴ２７植物発現ベクターにクローン化することにより
作製される（Ｇｌｅａｖｅ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０： １２
０３−１２０７、１９９２）。トランスジェニックコントラストの存在と完全性
（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、制限酵素消化とＤＮＡ配列決定により確認される。
よる形質転換は以下の通りに行われる。Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来のエチ
レン受容体ホモログ（配列識別番号第４３番）のコーディング領域を含むＤＮＡ
配列を含むセンス及びアンチセンスコントラストを含むＤＮＡコントラストが構
築され、公開された方法（Ａｎ、バイナリーベクター（Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ．）、Ｇｅｌｖｉｎ ＳＢとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ編集、植物
分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍ
ａｎｕａｌ）、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社刊、
Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８年）を用いて直接形質転換法によりアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス菌に挿入する。センスＤＮＡのコントラストはＰＢＫ
−ＣＭＶプラスミドのｃＤＮＡ挿入配列をｐＡＲＴ７プラスミドにクローン化し
、次に該ｐＡＲＴ７ベクターからＮｏｔＩで消化した３５Ｓ−インサート−ＯＣ
Ｓ３’ＵＴＲ断片をｐＡＲＴ２７植物発現ベクターにクローン化することにより
作製される（Ｇｌｅａｖｅ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０： １２
０３−１２０７、１９９２）。トランスジェニックコントラストの存在と完全性
（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、制限酵素消化とＤＮＡ配列決定により確認される。
【００７２】 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎ）の葉
の切片はＨｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１、１９
８５の方法にもとづく方法を用いて前記のセンス及びアンチセンスのエチレン受
容体コントラストで形質転換される。適当なコントラストを含む形質転換植物は
サザンブロット実験を用いて確認される。前記Ｐｉｎｕｓ属のエチレン受容体ホ
モログの形質転換植物での発現はセンス及びアンチセンスコントラストを用いて
作出された独立の形質転換植物株のそれぞれから全ＲＮＡを単離することにより
確認される。該ＲＮＡサンプルはノザンブロット実験で分析されそれぞれの形質
転換株での外来遺伝子の発現レベルを決定する。センス及びアンチセンスコント
ラストで作出されたそれぞれの形質転換植物株について、Ｐｉｎｕｓ属のエチレ
ン受容体遺伝子と内在性のタバコのエチレン受容体遺伝子とによりエンコードさ
れたエチレン受容体ポリペプチドの発現レベルが、野生型対照実験の植物の発現
レベルと比較される。
の切片はＨｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１、１９
８５の方法にもとづく方法を用いて前記のセンス及びアンチセンスのエチレン受
容体コントラストで形質転換される。適当なコントラストを含む形質転換植物は
サザンブロット実験を用いて確認される。前記Ｐｉｎｕｓ属のエチレン受容体ホ
モログの形質転換植物での発現はセンス及びアンチセンスコントラストを用いて
作出された独立の形質転換植物株のそれぞれから全ＲＮＡを単離することにより
確認される。該ＲＮＡサンプルはノザンブロット実験で分析されそれぞれの形質
転換株での外来遺伝子の発現レベルを決定する。センス及びアンチセンスコント
ラストで作出されたそれぞれの形質転換植物株について、Ｐｉｎｕｓ属のエチレ
ン受容体遺伝子と内在性のタバコのエチレン受容体遺伝子とによりエンコードさ
れたエチレン受容体ポリペプチドの発現レベルが、野生型対照実験の植物の発現
レベルと比較される。
【００７３】 本発明は明解にするため例示の目的である程度の詳細が説明されているが、請
求の範囲のみにより制限されることが意図されている本発明の範囲から逸脱する
ことなく、変更及び改変はなされうる。
求の範囲のみにより制限されることが意図されている本発明の範囲から逸脱する
ことなく、変更及び改変はなされうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/12 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA03 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 BA10 BA63 CA04 CA07 DA01 DA05 EA05 FA02 FA07 GA11 4B050 CC03 CC05 DD09 LL10 4B065 AA11X AA88X AA88Y AB01 BA02 CA24 CA29 CA53 4H045 AA10 AA30 CA30 CA33 DA50 DA89 EA05 FA74
Claims (31)
- 【請求項１】 （ａ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３
−８８８番に提供された配列と、（ｂ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８
１及び８３３−８８８番に列挙された配列の相補体と、（ｃ）配列識別番号第１
−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆相補体と、
（ｄ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙さ
れた配列の逆配列と、（ｅ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３
３−８８８番に提供された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ
Ｎを用いて、少なくとも４０％同一のヌクレオチドを有する配列と、（ｆ）配列
識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列に
対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なくとも６０％同
一のヌクレオチドを有する配列と、（ｇ）配列識別番号第１−６７、１３１−４
８１及び８３３−８８８番に提供された配列に対し、コンピューターアルゴリズ
ムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なくとも７５％同一のヌクレオチドを有する配列と
、（ｈ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供
された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なく
とも９０％同一のヌクレオチドを有する配列と、（ｉ）上記の（ａ）ないし（ｄ
）に列挙された配列の２００マーのヌクレオチド配列と、（ｊ）上記の（ａ）な
いし（ｄ）に列挙された配列の１００マーのヌクレオチド配列と、（ｋ）上記の
（ａ）ないし（ｄ）に列挙された配列の４０マーのヌクレオチド配列と、（ｌ）
上記の（ａ）ないし（ｄ）に列挙された配列の２０マーのヌクレオチド配列とか
らなるグループから選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載のポリヌクレオチドにエンコードされる、単
離されたポリペプチド。 - 【請求項３】 （ａ）配列識別番号第６８−１３０、４８２−８３２及び８
８９−９４５番の配列と、（ｂ）（ａ）の配列に対し少なくとも５０％同一の残
基を有する配列と、（ｃ）（ａ）の配列に対し少なくとも７０％同一の残基を有
する配列と、（ｄ）（ａ）の配列に対し少なくとも９０％同一の残基を有する配
列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプ
チド。 - 【請求項４】 請求項３に記載のポリペプチドをエンコードする、単離され
たポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡコントラ
スト。 - 【請求項６】 請求項５に記載のＤＮＡコントラストを含む、トランスジェ
ニック細胞。 - 【請求項７】 ５’から３’の方向に、（ａ）遺伝子プロモーター配列と、
（ｂ）請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドにエンコードされるポリペ
プチドの少なくとも機能性のある部分をコードするオープン・リーディング・フ
レームと、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを含む、ＤＮＡコントラスト。 - 【請求項８】 オープン・リーディング・フレームはセンス方向である、請
求項７に記載のＤＮＡコントラスト。 - 【請求項９】 オープン・リーディング・フレームはアンチセンス方向であ
る、請求項７に記載のＤＮＡコントラスト。 - 【請求項１０】 遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーション配列は
植物宿主で機能性がある、請求項７に記載のＤＮＡコントラスト。 - 【請求項１１】形質転換細胞の同定用のマーカーを含む、請求項７に記載の
ＤＮＡコントラスト。 - 【請求項１２】５’から３’への方向に、（ａ）遺伝子プロモーター配列と
、（ｂ）請求項１ないし６及び９のいずれか１つの単離されたポリヌクレオチド
のノンコーディング領域と、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを含む、ＤＮ
Ａコントラスト。 - 【請求項１３】 ノンコーディング領域はセンス方向である、請求項１２に
記載のＤＮＡコントラスト。 - 【請求項１４】 ノンコーディング領域はアンチセンス方向である、請求項
１２に記載のＤＮＡコントラスト。 - 【請求項１５】 遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーション配列は
植物宿主において機能性がある、請求項１２に記載のＤＮＡコントラスト。 - 【請求項１６】 請求項７ないし１５のいずれか１つのＤＮＡコントラスト
を含む、トランスジェニック植物細胞。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植
物あるいはその部分、零余子又は子孫。 - 【請求項１８】 植物は木本植物である、請求項１７に記載の植物。
- 【請求項１９】 植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム
、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項１８に記
載の植物。 - 【請求項２０】 請求項７ないし１５のいずれか１つに記載のＤＮＡコント
ラストを植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む、植物の細胞シグナル伝達を
改変するための方法。 - 【請求項２１】 植物は木本植物である、請求項２０に記載の方法。
- 【請求項２２】 植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム
、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項２１に記
載の方法。 - 【請求項２３】 （ａ）トランスジェニック細胞を提供するために請求項７
ないし１５のいずれか１つに記載のＤＮＡコントラストで植物細胞を形質転換す
ることと、（ｂ）再生及び成熟した植物の成長に導く条件下で前記トランスジェ
ニック細胞を培養することを含む、細胞シグナル伝達を改変された植物を作出す
る方法。 - 【請求項２４】 植物は木本植物である、請求項２３に記載の方法。
- 【請求項２５】 植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム
、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項２４に記
載の方法。 - 【請求項２６】 請求項７ないし１５のいずれか１つに記載のＤＮＡコント
ラストを植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む、植物のポリペプチドの活性
を改変するための方法。 - 【請求項２７】 植物は木本植物である、請求項２６に記載の方法。
- 【請求項２８】 植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム
、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項２７に記
載の方法。 - 【請求項２９】 請求項１に列挙されたヌクレオチド配列の１０個の連続し
た残基と相補的な少なくとも１０個の連続した残基を含む、単離されたオリゴヌ
クレオチドプローブ又はプライマー。 - 【請求項３０】 請求項２９に記載の複数のオリゴヌクレオチドプローブ又
はプライマーを含むキット。 - 【請求項３１】 複数のポリヌクレオチドを記録した記録媒体であって、少
なくとも１つのポリヌクレオチドは請求項１に列挙されたヌクレオチド配列を含
む、記録媒体。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/228,986 US6359198B1 (en) | 1999-01-12 | 1999-01-12 | Compositions isolated from plant cells and their use in the modification |
| US16286699P | 1999-11-01 | 1999-11-01 | |
| US09/228,986 | 1999-11-01 | ||
| US60/162,866 | 1999-11-01 | ||
| PCT/US2000/000724 WO2000042171A1 (en) | 1999-01-12 | 2000-01-11 | Compositions isolated from plant cells and their use in the modification of plant cell signaling |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002534115A true JP2002534115A (ja) | 2002-10-15 |
| JP2002534115A5 JP2002534115A5 (ja) | 2006-09-28 |
Family
ID=26859132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000593728A Pending JP2002534115A (ja) | 1999-01-12 | 2000-01-11 | 植物細胞から単離された組成物及び植物細胞シグナル伝達の改変におけるその利用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1144593A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002534115A (ja) |
| CN (1) | CN1352680A (ja) |
| AU (1) | AU2608300A (ja) |
| BR (1) | BR0008035A (ja) |
| CA (1) | CA2359843A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ512865A (ja) |
| WO (1) | WO2000042171A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7116200A (en) * | 1999-09-09 | 2001-04-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize polynucleotides and related polypeptides useful for enhancing disease resistance in crop plants |
| DE19961519A1 (de) * | 1999-12-20 | 2001-06-21 | Bayer Ag | Rezeptorähnliche Proteinkinasen von Pflanzen |
| AUPQ994600A0 (en) | 2000-09-06 | 2000-09-28 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Manipulation of plant senescene |
| HUP0102561A3 (en) * | 2001-06-20 | 2005-06-28 | Mta Szegedi Biolog Koezpont Ge | Identification and cloning the gene of symbiotic nitrogen fixation receptor |
| AR051833A1 (es) * | 2004-11-12 | 2007-02-14 | Pioneer Hi Bred Int | Histidina quinasas con actividad sensora de citoquinina y metodos de uso de las mismas en plantas y celulas vegetales |
| CN106868020B (zh) * | 2017-03-21 | 2020-09-29 | 浙江师范大学 | 大豆辅助分子伴侣蛋白编码基因GmHSP40在调控植物开花上的应用 |
| CN111621588A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-04 | 华中农业大学 | 光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应用 |
| CN116656702B (zh) * | 2023-03-30 | 2024-03-12 | 青岛大学 | 一种编码黑松富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶的cDNA序列及其氨基酸序列与应用 |
| CN117467680A (zh) * | 2023-11-28 | 2024-01-30 | 重庆文理学院 | 一种番茄凝集素受体样蛋白激酶基因LecRLK45的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998011205A2 (en) * | 1996-09-11 | 1998-03-19 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
-
2000
- 2000-01-11 JP JP2000593728A patent/JP2002534115A/ja active Pending
- 2000-01-11 CA CA002359843A patent/CA2359843A1/en not_active Abandoned
- 2000-01-11 AU AU26083/00A patent/AU2608300A/en not_active Abandoned
- 2000-01-11 CN CN 00804953 patent/CN1352680A/zh active Pending
- 2000-01-11 BR BR0008035-7A patent/BR0008035A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-01-11 WO PCT/US2000/000724 patent/WO2000042171A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-01-11 EP EP00904303A patent/EP1144593A1/en not_active Withdrawn
- 2000-01-11 NZ NZ512865A patent/NZ512865A/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998011205A2 (en) * | 1996-09-11 | 1998-03-19 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000042171A1 (en) | 2000-07-20 |
| CN1352680A (zh) | 2002-06-05 |
| EP1144593A1 (en) | 2001-10-17 |
| AU2608300A (en) | 2000-08-01 |
| NZ512865A (en) | 2003-01-31 |
| BR0008035A (pt) | 2002-03-26 |
| CA2359843A1 (en) | 2000-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7371927B2 (en) | Methods for modulating plant growth and biomass | |
| EP1177277B1 (en) | Compositions and methods for the modification of gene transcription | |
| BRPI0613141A2 (pt) | polinucleotìdios isolados, construção de dna, célula de planta, planta transgênica, madeira e polpa de madeira | |
| NZ548845A (en) | Genes for regulating plant polysaccharide synthesis and plant phenotype isolated from Eucalyptus and Pinus | |
| JP2002534115A (ja) | 植物細胞から単離された組成物及び植物細胞シグナル伝達の改変におけるその利用 | |
| JP2002534115A5 (ja) | ||
| EP1163340B1 (en) | Compositions and methods for the modification of gene expression | |
| JP2004511216A (ja) | 植物遺伝子発現の改変のための核酸配列および方法 | |
| US6768041B2 (en) | Compositions isolated from plant cells and their use in the modification of plant cell signaling | |
| ZA200601498B (en) | Plant cell cycle genes and methods of use | |
| AU2002252825B2 (en) | Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli | |
| ZA200105644B (en) | Compositions isolated from plant cells and their use in the modification of plant cell signaling. | |
| US20050050583A1 (en) | Compositions isolated from plant cells and their use in the modification of plant cell signaling | |
| AU2011211347B2 (en) | Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli (3) | |
| AU2012200697B2 (en) | Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli (4) | |
| AU2008201822B2 (en) | Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli (2) | |
| AU2002252825A1 (en) | Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli | |
| US20110047644A1 (en) | Compositions and methods for the modification of gene transcription | |
| WO2005054482A2 (en) | Nucleic acids having utility in seeds | |
| NZ550541A (en) | Compositions and methods for the modification of gene transcription comprising sequences 377, 396 and 2046 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060810 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070105 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070105 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20070105 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070105 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070105 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070205 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070205 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091116 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100407 |