DE19961519A1

DE19961519A1 - Rezeptorähnliche Proteinkinasen von Pflanzen

Info

Publication number: DE19961519A1
Application number: DE19961519A
Authority: DE
Inventors: Thomas Schmuelling; Silke Schaefer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2001-06-21
Also published as: WO2001046233A1; EP1250352A1; US20030041345A1; AU2007501A; JP2003529342A

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für pflanzliche Polypeptide mit der biologischen Aktivität von rezeptorähnlichen Proteinkinasen codieren, sowie die entsprechenden Polypeptide per se.

Description

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für pflanzliche Polypeptide mit der biolo gischen Aktivität von rezeptorähnlichen Proteinkinasen codieren, sowie die entspre chenden Polypeptide per se.

Rezeptorähnliche Kinasen durchspannen in der Regel die Zellmembran und besitzen somit einen extracytoplasmatischen und einen cytoplasmatischen Teil. Sie fungieren in Organismen als Vermittler von Signalen, die von außen in das Zellinnere weitergeleitet werden (z. B. von der Geer at al., 1994). Durch Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne wird die cytoplasmatische Proteinkinasedomäne aktiviert. Dies geschieht durch Autophosphorylierung entweder der Serin- und/oder Threoninreste, der Tyrosin- oder der Histidinreste (z. B. Fantl et al., 1993). Tierische Rezeptorkinasen autophosphorylieren hauptsächlich Tyrosinreste; im Gegensatz dazu scheinen in Pflanzen fast ausschließlich Serin-/Threonin-Kinasen vorzukommen (Becraft, 1998).

Serin-/Threonin-Kinasen katalysieren den reversiblen Transfer des γ-Phophat-Restes von ATP auf Aminosäuren eines Empfängerproteins. Das Vorhandensein von 11 konservierten Domänen bestimmt wesentlich die enzymatische Funktion von Proteinkinasen (Hanks et al., 1988). In diesen Domänen befinden sich insgesamt 9 Aminosäuren, die invariabel in allen bisher identifizierten Proteinkinasen sind. Sie sind an der ATP-Bindung und vermutlich an der Erkennung der zu phosphorylierenden Aminosäure, wie Serin, Threonin oder Tyrosin beteiligt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuren, die für pflanzliche Poly peptide mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Proteinkinase, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 umfasst, codieren. Insbesondere codieren die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren für rezeptorähnliche Serin-/ Threonin-Kinasen.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzel strängige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonuklein säuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.

Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA- Fragmente, die genomischer DNA von Tabakpflanzen entsprechen.

Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz ausgewählt aus

a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
b) Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, welches die Aminosäure sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter a) oder b) definierten Sequenzen,
d) Sequenzen, welche an die unter a) oder b) definierten Sequenzen hybridisieren,
e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige, bevorzugt eine zumindest 80%ige, besonders bevorzugt eine zumindest 90%ige Identität mit den unter a) oder b) definierten Sequenzen aufweisen,
f) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige, bevorzugt eine zumindest 80%ige, besonders bevorzugt eine zumindest 90%ige Identität mit der N-terminalen Rezeptordomäne der unter a) oder b) definierten Sequenzen aufweisen,
g) Sequenzen, welche zu den unter a) oder b) definierten Sequenzen komplementär sind, und
h) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz codieren wie die unter a) bis 0 definierten Sequenzen.

Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nuklein säuren stellt ein cDNA-Molekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 dar.

Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vor gang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplemen tären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Pflanzen als Tabakpflanzen isoliert werden, welche für rezeptorähnliche Protein kinasen codieren, welche dieselben oder ähnliche Eigenschaften wie die Kinase mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen.

Hybridisierungsbedingungen werden nach folgender Formel näherungsweise be rechnet:
Die Schmelztemperatur Tm = 81.5°C + 16.6 log[c(Na⁺)] + 0.41(%G + C)) - 500/n (Lottspeich und Zorbas, 1998).

Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenz abschnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz <100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionenstärke von 15 mM Na⁺ (entspricht 0.1 × SSC) gewaschen. Wird eine RNA- Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15°C höher.

Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben:
Hybridisierungslösung: 6X SSC/5X Denhardt's Lösung/50% Formamid;
Hybridisierungstemperatur: 36°C, bevorzugt 42°C;
1. Waschschritt: 2X SSC, 30 min bei Raumtemperatur;
2. Waschschritt: 1X SSC, 30 min bei 50°C; bevorzugt 0,5X SSC, 30 min bei 65°C;
besonders bevorzugt 0,2X SSC, 30 min bei 65°C.

Der Ausdruck "N-terminale Rezeptordomäne", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Peptidregion, die funktionell der Peptidregion mit einer Aminosäure sequenz von Position 1 bis Position 394 der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ent spricht.

Der Grad der Identität der Nukleinsäuren wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms NCBI BLASTN Version 2.0.4. (Altschul et al., 1997).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die regulatorischen Regionen, welche natürlicherweise in Pflanzenzellen, insbesondere in Tabakpflanzen, die Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kontrollieren.

Der Ausdruck "regulatorische Regionen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf nicht-translatierte Regionen des betreffenden Gens, wie Promotoren, Enhancer, Repressor- oder Aktivator-Bindungsstellen oder Terminationssequenzen, die mit zellulären Proteinen interagieren, wodurch die Transkription gesteuert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine er findungsgemäße Nukleinsäure und einen heterologen Promotor umfassen.

Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig; ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7- oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungs gemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße regulatorische Region oder ein erfin dungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbio logischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.

Bevorzugte Vektoren sind pBIN (Bevan, 1984) und seine Derivate für pflanzliche Zellen, pFL61 (Minet et al., 1992) für Hefezellen, pBLUESCRIPT-Vektoren für bakterielle Zellen, lamdaZAP (Fa. Stratagene) für Phagen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungs gemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfin dungsgemäßen Vektor enthalten.

Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und Zelllinien von Säugern.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der biolo gischen Aktivität von rezeptorähnlichen Proteinkinasen, die von den erfindungsge mäßen Nukleinsäuren codiert werden. Insbesondere handelt es sich um Polypeptide, die erfindungsgemäße Serin-/Threonin-Kinasen darstellen.

Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natür liche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Ver fahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid- Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylie rungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine ein fache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabili sierende Aminosäuren aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide müssen nicht vollständige rezeptorähnliche Proteinkinasen darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Proteinkinasen aufweisen. Polypeptide, die eine gleichartige biologische Aktivität wie eine rezeptorähnliche Proteinkinase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet. Dabei müssen die erfin dungsgemäßen Polypeptide nicht von rezeptorähnlichen Proteinkinasen aus Tabak ableitbar sein. Als erfindungsgemäß werden auch Polypeptide betrachtet, die rezeptorähnlichen Proteinkinasen beispielsweise der folgenden Pflanzen entsprechen oder Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität dieser ausüben können: Mais, Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Roggen, Tomaten, Leguminosen, Kartoffel pflanzen, Lactuca sativa, Brassicaceen, Holzgewächse, Physcomitrella patens.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Vergleich zu der entsprechenden Region von natürlich vorkommenden rezeptorähnlichen Proteinkinasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biolo gische Aktivität der vollständigen Rezeptoren ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr; Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gln;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:

Ursprünglicher Rest
Substitution
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Polypeptide, welche zumin dest eine biologische Aktivität einer rezeptorähnlichen Proteinkinase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 60%ige Identität, vorzugs weise eine zumindest 80%ige Identität, besonders bevorzugt eine zumindest 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 97-99%ige Identität, mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über deren Gesamtlänge aufweist.

Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms BLASTP + BEAUTY Version 2.04. (Altschul et al., 1997).

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Polypeptide ist die cyto kininregulierte rezeptorähnliche Proteinkinase (CRK1) mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.

In der CRK1-Aminosäuresequenz konnten die 11 Kinasedomänen bestimmt werden, in denen alle nach Hanks et al., 1988 definierten Aminosäuren vorhanden sind. Es handelt sich somit um eine Serin-/Threonin-Kinase. Das CRK1-Protein besitzt im Bereich der Aminosäuren 390 und 410 eine Transmembrandomäne. Die ersten 28 Aminosäuren mit einem positiv geladenen Aminosäurerest und einem hydrophoben Bereich von 15 Aminosäuren am N-Terminus stellen eine Signalsequenz dar. Die Abspaltungsstelle befindet sich vermutlich zwischen den Aminosäuren 28 und 29. Diese Signalsequenz sorgt für eine Translokation des neu-synthetisierten CRK1- Proteins durch die Membran des endoplasmatischen Reticulums und einen weiterführenden Transport in die Plasmamembran. Die N-terminale Domäne von CRK1 zwischen den Aminosäuren 29 und 390 befindet sich extracytoplasmatisch. Diese extrazelluläre Domäne umfasst vier Bereiche, die zu ATP/GTP-Bindestellen bzw. zu Bindestellen für cyclische Nukleotide eine <70%-ige Homologie aufweisen. Im Fall von CRK1 stellen Cytokinine mögliche Liganden dar. Als Adenin-Derivate weisen Cytokinine eine strukturelle Ähnlichkeit zu Purinen auf.

Cytokinine gehören zur Gruppe der Pflanzenhormone und besitzen die Fähigkeit, die Zellteilung zu induzieren. Inzwischen sind mehr als 40 natürlich vorkommende Cytokinine isoliert worden, wobei alle bekannten Cytokinine Adenin-Derivate dar stellen. Die Aktivität wird von der Art der Substituenten, vor allem der N⁶-Gruppe bestimmt (Übersicht in Shaw, 1994 und Kaminek, 1992).

Es gibt ein vielfältiges Spektrum an Wirkungen, die mit Cytokininen im Zusammen hang gebracht werden. Neben der Induktion der Zellteilung in Kombination mit Auxin, beeinflussen Cytokinine auch Differenzierungsprozesse. Ein hohes Cyto kinin- zu Auxin-Verhältnis führt in vitro bei Kallus zur Sprossbildung, ein hohes Auxin- zu Cytokinin-Verhältnis zur Wurzelbildung (Skoog und Miller, 197). Cytokinine verursachen eine Reduktion der apikalen Dominanz, was ein Austreiben der Seitenknospen zur Folge hat (Wickson und Thimann, 1958). Eine bedeutende Rolle kommt den Cytokininen auch bei der Verzögerung der Blattseneszenz zu.

Cytokinine bewirken dabei u. a. eine Inaktivierung von proteolytischen Enzymen, von Lipasen und Lipoxykinasen, welche für Abbauprozesse verantwortlich sind. Zu weiteren klassischen Wirkungen der Cytokininen zählt der fördernde Einfluss auf die Chloroplastenentwicklung und die Inhibierung des Wurzellängenwachstums.

Cytokinine sind notwendig für die normale Pflanzenentwicklung. Ein Überangebot dieses Hormons führt zu äußerst gedrungenen, sterilen Pflanzen.

Da die CRK1-Transkriptmenge durch Cytokinine reguliert wird, kann es eine Komponente des Cytokinin-Signaltransduktionsweges darstellen. Die Transkript menge von CRK1 wird durch Cytokinine spezifisch, transient reguliert. Das CRK1- Gen unterliegt danach einer frühen Regulation; 30 min nach Zugabe von 5 × 10^-7 M BAP erfolgt eine nahezu vollständige Reduktion der Transkriptmenge. Je nach Cytokininkonzentration akkumulieren nach 9-24 h Cytokininbehandlung die CRK1-Transkripte erneut, so dass man von einer transienten Regulation ausgehen kann. Diese Regulation könnte eine negative Rückkopplung darstellen, um zu gewährleisten, dass eine Zelle zwar kompetent für ein Signal ist, diese Sensitivität aber durch eine Reduktion der Proteinmenge von Signaltransduktionskomponenten verändert werden kann. Für den CRK1-Rezeptor wird postuliert, dass die Zelle nach Aufnahme des Signals für eine bestimmte Zeitdauer nicht in der Lage ist, auf weitere Cytokininsignale zu reagieren.

Bei der Ermittlung der Dosisabhängigkeit der Regulation erweist sich eine sehr ge ringe Cytokininkonzentration von 5 × 10^-12 M BAP als ausreichend zur vollständigen Reduktion der Transkriptmenge.

Andere Pflanzenhormone, wie Gibberellinsäure, ACC, Brassinosteroide und Jasmon säure, sowie das strukturelle Analog Adenin führen in vergleichbarer Konzentration nicht zu einer Veränderung der CRK1-Transkriptabundanz. Auxin und Abscisinsäure führen erst in wesentlich höheren Konzentrationen als Cytokinin zu einer Abnahme der CRK1-Transkriptabundanz.

Der Ausdruck "biologische Aktivität einer rezeptorähnlichen Proteinkinase", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Veränderung der Zellaktivität und des Pflanzenwachstum nach Ligandenbindung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Antikörper, die spezifisch an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Die Herstellung solcher Antikörper er folgt auf die übliche Weise. Diese Antikörper können beispielsweise dazu genutzt werden, um Expressionsklone, z. B. einer Genbank, zu identifizieren, die die erfin dungsgemäßen Nukleinsäuren tragen.

Der Ausdruck "Antikörper", wie er hierin verwendet wird, erstreckt sich auch auf Teile vollständiger Antikörper, wie Fa-, F(ab')₂- oder Fv-Fragmente, welche noch die Fähigkeit besitzen, an die Epitope der erfindungsgemäßen Polypeptide zu binden.

Weiterhin sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Nuklein säuren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemäßen Nuklein säuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch kurze Stücke der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können auch verwendet werden, um ausgehend von Pflanzen-mRNA hergestellte cDNA-Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oliogonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA-Fragmente ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuren können auch mittels PCR-Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.

Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, be stehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den erfin dungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die erfindungs gemäße Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in-vitro- Systemen hergestellt werden.

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispiels weise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkem zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligo nukleotiden angewendet werden.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie.

Da rezeptorähnliche Proteinkinasen Membranproteine darstellen, werden in den Reinigungsverfahren vorzugsweise Detergensextraktionen durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung von Detergenzien, die die Sekundär- und Tertiärstrukturen der Polypeptide nicht oder nur wenig beeinflussen, wie nicht-ionische Detergenzien.

Die Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann die Isolierung von Mem branen ausgehend von Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren expri mieren, umfassen. Vorzugsweise exprimieren solche Zellen die erfindungsgemäßen Polypeptide in einer ausreichenden Kopienanzahl, so dass die Menge der Polypeptide in einer Membranfraktion mindestens 10-fach höher ist als diej enige, die in vergleich baren Membranen von Zellen gefunden wird, die das CRK1-Gen natürlicherweise exprimieren; besonders bevorzugt ist Menge mindestens 100-fach, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000-fach höher.

Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder ande ren Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsicht lich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10- fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden und deren Eigenschaften verändern. Aufgrund der vielfältigen Funktionen der erfindungs gemäßen rezeptorähnlichen Proteinkinasen, können Modulatoren, die die Aktivität beeinflussen, neue wuchsregulierende oder herbizide Wirkstoffe darstellen.

Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Signaltransduktion der erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteinkinasen, d. h. die Autophosphorylierung der Serin- und/oder Threonin-Reste, beschleunigt oder verstärkt.

Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Signaltransduktion der erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteinkinasen, d. h. die Autophosphorylierung der Serin- und/oder Threonin-Reste, verlangsamt oder verhindert.

Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle Mimetika davon. Der Ausdruck "Modulator" umfasst jedoch nicht Cytokinine.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.

Die Bindung der Modulatoren an die erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Protein kinasen kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben der damit behandelten Pflanzen führt.

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Auffinden von chemi schen Verbindungen, welche die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verändern. Auch solche "Expressionsmodulatoren" können neue wuchsregulierende oder herbizide Wirkstoffe darstellen. Expressionsmodulatoren können kleine orga nisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die regulatorischen Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide codierenden Nukleinsäuren binden. Weiterhin können Expressionsmodulatoren kleine organisch-chemische Mo leküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an regulatorische Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide codierenden Nukleinsäuren bindet, und dadurch deren Expression beeinflusst. Expressionsmodu latoren können auch Antisense-Moleküle sein.

Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Mo dulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide oder von Expressionsmodulatoren als Pflanzenwuchsregulatoren oder Herbizide.

Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screening (high throughput screening; HTS) ein. Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Präparationen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.

Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z. B. Produkte der in vitro-Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran oder irgendeine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zu sammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls die Aktivität der er findungsgemäßen Polypeptide zu erhöhen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder verringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder verringerten Umsetzung des markierten Substrates. Moleküle, die gut binden und zu einer erhöhten Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide führen, sind Agonisten. Moleküle, die gut binden, aber nicht die biologische Aktivität der erfin dungsgemäßen Polypeptide auslösen, sind wahrscheinlich gute Antagonisten. Die Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch ein sog. Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme in dieser Hinsicht um fassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch markierte Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Ak tivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.

Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungs gemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potentiellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfin dungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Die erfindungs gemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z. B. radioaktiv oder colori metrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität eines Agonisten oder Antagonisten ermessen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts oder eines erfindungsge mäßen Vektors zum Herstellen von transgenen Pflanzen, sowie die entsprechenden transgenen Pflanzen als solche bzw. deren Teile oder Vermehrungsmaterial.

Transgene Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzenver mehrungsmaterialien, in denen nach Einbringen einer erfindungsgemäßen Nuklein säure, eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts oder eines erfindungsgemäßen Vektors die intrazelluläre Konzentration der rezeptorähnlichen Proteinkinasen im Vergleich zu den entsprechenden Wildtypformen erhöht oder vermindert ist, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Der Ausdruck "Pflanzenteile", wie er hierin verwendet wird, bedeutet alle oberirdi schen und unterirdischen Teile und Organe der Pflanzen, wie Sproß, Blatt, Blüte und Wurzel, sowie daraus hergestellte Protoplasten und Gewebekulturen.

Der Ausdruck "Vermehrungsmaterial", wie er hierin verwendet wird, bedeutet vege tatives und generatives Vermehrungsmaterial, wie Stecklinge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflan zengewebe oder Pflanzenvermehrungsmaterialien, in denen Veränderungen an der für endogene Rezeptorkinasen codierenden Sequenz vorgenommen und selektioniert werden, die zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Rezeptorkinase führen oder in denen durch Mutagenese eine Erhöhung oder Verminderung der endogenen Rezep torkinaseaktivität erreicht wird.

Beispielsweise können bereits in der Pflanze befindliche endogene Rezeptorkinase gene durch Mutagenese, beispielsweise mit Ethylmethanosulfonat (EMS), verändert werden. Nach der Mutagenese können durch Sequenzanalyse, Ligandenbindungsstu dien oder Analyse einer durch die Ligandenbindung hervorgerufenen biochemischen Reaktion gezielt Individuen selektioniert werden, die aufgrund der Mutagenese er findungsgemäße Rezeptorkinasen mit erhöhter oder verminderter Aktivität produzie ren. In gleicher Art und Weise kann durch Mutagenese der regulatorischen Sequen zen die Expression eines bereits in der Pflanze befindlichen erfindungsgemäßen Re zeptorkinasegens so verändert werden, dass Pflanzen mit einer verminderten oder erhöhten Ligandensensitivität entstehen. Solche Pflanzen können durch allgemein bekannte Methoden der Genexpressionsanalyse wie Northern blot oder Western blot identifziert werden.

Da die erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteinkinasen, insbesondere der CRK1-Rezeptor, eine Rolle in der Signalperzeption spielt, erhält man in transgenen "sense" Pflanzen oder in Pflanzen, die auf eine erhöhte Menge oder Aktivität ent sprechender endogener Rezeptorkinasen oder in der Signaltransduktion damit ver knüpfter Elemente gezielt selektioniert wurden, eine erhöhte Ligandensensitivität. Zum einen können durch solche Veränderungen schon geringere Liganden- Konzentrationen erfasst und als Signal weitergeleitet werden. Es kann auch durch Anschalten des Signalübertragungsweges Ligandenwirkung in der Abwesenheit eines Liganden erzielt werden. Andererseits kann bei einer konstitutiven Expression keine negative Rückkopplung eintreten, so dass die Zellen eine ständige Kompetenz für das Signal aufweisen. Eine Reaktion auf diese Situation sind verstärkte Liganden- Effekte. Transgene "antisense" Pflanzen oder Pflanzen mit einer verminderten Re zeptorkinaseaktivität haben eine verminderte Liganden-Sensitivität. Eine Erhöhung oder Verminderung der Rezeptorkinaseaktivität kann zu Pflanzen führen, die eine veränderte Entwicklung, veränderte Physiologie oder eine veränderte Morphologie aufweisen.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung der beschriebenen Nukleotidsequenz CRK1

Mit Hilfe der Methode der Representational Difference Analysis (RDA) (Hubank und Schatz, 1994) wurde ein 400 bp Fragment von CRK1 aus Zellsuspensionskultu ren von Nicotiana tabacum L. Kultivar Wisconsin 38 (Skoog und Miller, 1957) iso liert.

Representational Difference Analysis (RDA) stellt eine Methode zur Isolierung diffe rentiell exprimierter Gene dar. Die zwei zu vergleichenden Proben wurden durch eine Tabakzellkultur gebildet, die ohne Cytokininzugabe kultiviert wurde und einer Zell kultur, der nach 5 Tagen Subkultivierung für 45 min 10^-7 M BAP (Benzylaminopu rin) hinzugefügt wurde.

Die erhaltenen Fragmente wurden in den Vektor pUC19 kloniert. Das Fragment von CRK1 wurde weiterhin als Sonde für Northern und Southem Blots verwendet und in einem cDNA-Bibliothek-Screening zur Isolierung der vollständigen cDNA von CRK1 als Sonde eingesetzt.

Isolierung der vollständigen cDNA Sequenz von CRK1 (modifiziert nach Stratagene)

Es wurde von der Firma SCInet eine cDNA-Bibliothek im λ-ZAP-Express Vektor nach Angaben des Herstellers Stratagene hergestellt. Dafür wurden 400 µg Gesamt- RNA der Tabaksuspensionskultur W38 der Firma zur Verfügung gestellt. Es war vorher sichergestellt, dass die gesuchte mRNA in der Kultur exprimiert wird. Nach Erhalt der fertigen cDNA-Bibliothek wurde der Titer überprüft und in einem fünfstu figen Screen nach der vollständigen CRK1-cDNA gesucht. Der Titer der cDNA-Bib liothek betrug 1 × 10⁹ pfu/ml.

200 µl E. coli XL1-Blue MRF' Zellen wurden für 20 min bei RT mit 100.000 pfu der entsprechenden cDNA-Bank inkubiert, 7 ml Top-Agar zugegeben und auf vorge wärmte (37°C) NZY-Agarplatten (Durchmesser von 145 mm) ausgegossen. Nach Inkubation ÜN bei 37°C folgte die Identifizierung von Phagen, die eine Insertion homolog zur verwendeten Sonde tragen.

Primär-Screen

Die Phagenplatten wurden für 1 h bei 4°C abgekühlt, Nylonfilter für 1 min aufge legt, mit der DNA-Seite nach oben für 2 min auf in Denaturierungslösung getränktem Whatman 3M Filterpapier und 5 min auf in Neutralisierungslösung getränktem Whatman 3M Filterpapier inkubiert. Die Filter wurden kurz in eine 2 × SSC-Lösung getaucht, getrocknet und zur DNA-Fixierung mit UV-Licht bestrahlt (UV-Transil luminator, 0,12 J/cm²).

Nach der Identifizierung positiver Plaques wurden diese im Primär-Screen mit einem Skalpell großzügig (ca. 1 cm²) ausgeschnitten und mit 3-5 ml SM-Puffer mind. eine Stunde geschüttelt. Von der Suspension wurde für einen Sekundär-Screen 1 µl und 1 µl einer 1 : 10 Verdünnung verwendet. Positive Plaques im Sekundärscreen wurden mit sterilen Pasteurpipetten ausgestochen, in 500 µl SM-Puffer gelöst und davon 30 µl einer 10 Verdünnung für einen Tertiär-Screen verwendet. Für eine weitere Screening-Runde wurde die gleiche Verdünnung verwendet und es konnten zum Teil Einzelplaques erhalten werden. Mit diesen positiven Einzelplaques wurde eine fünfte Runde durchgeführt, in der alle auf der Platte erhaltenen Einzelplaques positiv sein mussten, damit der entsprechende Klon weiterbearbeitet wurde. Von diesen Einzel plaques wurden die cDNA-Inserts über eine Excisivnsreaktion in einem E. coli XLOLR Stamm in Plasmid-DNA überführt und isoliert. Dabei wurde nach Angaben des Herstellers Stratagene verfahren.

5'/3'-RACE

Zur Isolierung der im identifizierten cDNA Klon fehlenden 5'- und 3'-Enden wurde das Verfahren des 5'/3'-RACE angewendet.

Das 5'-RACE beruht auf der spezifischen Amplifizierung des 5'-Endes eines Gens aus mRNA. Mit Hilfe eines sequenzspezifischen Primers und der AMV Reversen Transkriptase wird der cDNA-Erststrang synthetisiert. An das Produkt wird ein ein poly (A)-Schwanz angehängt, so dass in der nachfolgenden PCR ein oligo dT-Anker primer und ein nested sequenzspezifischer Primer eingesetzt werden kann. In einer zweiten PCR kann ein weiterer nested Primer verwendet werden, um die Spezifität zu gewährleisten.

Im 3'-RACE erfolgt die cDNA-Erststrangsynthese mit einem oligo dT-Primer und die nachfolgenden PCR Reaktionen mit sequenzspezifischen Primern. Die Produkte wurden mit dem "TA-Cloning Kit" von Pharmacia kloniert.

Beispiel 2

Zur Überprüfung einer differentiellen Expression von CRK1 in Reaktion auf Cytokinin wurden Northern Blot-Analysen durchgeführt.

Gesamt-RNA Isolierung aus Tabaksuspensionskulturen (Puissant und Houdebine, 1990)

Zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus Suspensionszellkulturen wurden die Zellen über eine Nutsche, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen war, kurz getrocknet. Das Material wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C bis zum Be ginn der RNA-Isolierung gelagert.

1 g Pflanzenmaterial wird bei 4°C mit 5 ml gekühlten RNA-Isolierungspuffer durch Mörsern homogenisiert. Das homogenisierte Pflanzenmaterial wird in Greiner-Röhr chen überführt. Es wird 0,5 ml 2 M Natriumacetat (pH 4.0) zugegeben und auf einem Vortex-Vibrationsmischer behandelt. Nach Zugabe von 5 ml Phenol wird die Lösung wiederum auf dem Vibrationsmischer durchmengt. Zur besseren Phasentrennung wird 1 ml Chloroform zugegeben und 10 min bei 4000 Upm zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen und in ein frisches Greiner-Röhrchen überführt. Die RNA wird mit 0,7 Volumenanteilen Isopropanol und Zentrifugation bei 4000 Upm für 10 min ausgefällt. Das gesammelte Pellet wird zur Reinigung von Polysacchariden in 2 ml 4 M Lithiumchlorid resuspendiert und nochmals für 10 min bei 4000 Upm zentrifugiert. Das Pellet wird in 2 ml TES-Puffer resuspendiert und zur Reinigung von Proteinen und Phenolrückständen mit 2 ml Chloroform vermengt und zur Phasentrennung 10 min bei 4000 Upm zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und die RNA mit 0,7 Volumenanteilen Isopropanol und einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat (pH 5,2) ausgefällt. Es erfolgt eine Zentrifugation von 30 min bei 4000 Upm. An schließend werden Salze aus dem RNA-Pellet mit 70% Alkohol gewaschen. Es wird 10 min bei 4000 Upm zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Alkohols wird das Pellet im Vakuum getrocknet und in 17 µl TE gelöst.

Isolierung von polyA-mRNA aus Gesamt-RNA Präparationen (nach Protokoll des Herstellers Dynal)

Das Prinzip der Reinigung basiert auf der Abtrennung polyadenylierter mRNA durch oligo-dT beschichteten Dynabeads nach den Angaben des Herstellers. Die Ausbeute an mRNA lag etwa bei 1-2% der eingesetzten Gesamt-RNA Ausgangsmenge.

Die Anwendung erfolgte nach Angaben des Herstellers.

Das Agarose wird mit einer Endkonzentration von 1,5% Agarose in H₂O dest. An gesetzt und aufgekocht. Nach Abkühlen auf 60°C werden 1/10 Volumenanteil 10 × MOPS-Puffer und 1/6 Volumenanteil Formaldehyd (37%) zugegeben. Zur Überprü fung identisch aufgetragender Mengen wird EtBr addiert. Nach dem Aushärten wird das Gel für 10 min auf 19 V eingestellt. 50 µg der Nukleinsäure-Proben und 3 µl des Längenstandards (RNA: 0,24-9,5 kb RNA-Ladder von Gibco BRL Lifetechnologies) werden mit 2 Volumenanteilen Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 65°C im Heizblock denaturiert. Die RNA-Proben werden bei 45 V ca. 5 h elektrophoretisch aufgetrennt.

Transfer der RNA auf eine Nylonmembran

Die im denaturierenden Agarose-Formaldehyd-Gel elektrophoretisch aufgetrennten Nukleinsäure-Proben werden auf Nylonmembran geblottet. Dazu wird auf einer Glasscheibe 3M Whatman Saugpapier mit 10 × SSC-Puffer getränkt und über zwei Behältnissen luftblasenfrei so angebracht, dass seine Enden in die Behältnisse ein tauchten. Diese sind ebenfalls mit 10 × SSC-Puffer gefüllt. Das Gel wird, die Ober seite nach unten, luftblasenfrei auf das 3M Whatman Saugpapier gelegt und mit der Nylonmembran abgedeckt. Die Membran sollte nicht größer als das Gel sein und luftblasenfrei auf dem Gel liegen. Auf die Nylonmembran werden dann zwei Lagen 3M Whatman Saugpapier aufgelegt. Das Agarosegel wird nun so mit Folie abge dichtet, dass keine Flüssigkeit an ihm vorbei aufgesaugt werden kann. Auf das 3M Whatman Saugpapier wird etwa 5 cm Saugpapier, eine größere Glasscheibe und darauf ein etwa ein halbes Kilogramm schweres Gewicht plaziert. Es wird minde stens 6 h geblottet. Die RNA wird durch UV-crosslinking mit einer Fluo Link-UV- Lampe fixiert. Die Dosis beträgt 0,12 J/cm².

Radioaktive Markierung durch "In vitro Transcription"

Das zu markierende Fragment muss in einem Vektor kloniert sein, welcher einen T3- und/oder einen T7-Promotor besitzt, z. B. pBluescript. Das Plasmid wird mit einem Restriktionsenzym verdaut, welches stromabwärts der zu transkribierenden Sequenz liegt, um eine Transkription des gesamten Plasmids zu verhindern. Nach einem Proteinase K Verdau wird die DNA einer Phenol/Chloroform Ausschüttelung unter zogen und gefällt.

Die Sequenz des 1.5 Klons wurde aus dem pUC19-Vektor über Eco RI und Xba I Schnittstellen herausgeschnitten und über die gleichen Restriktionsschnittstellen in den pBluescript SK-Vektor kloniert. Unter Verwendung des T3-Promotors kann mit der T3-Polymerase eine antisense-RNA synthetisiert werden. Zur Markierung wurde 1 µg DNA eingesetzt. Es wurde mit dem "In vitro transcription"-Kit von Stratagene gearbeitet und nach den Angaben des Herstellers verfahren. Nach der "In vitro Transcription" wurde ein DNase-Verdau von 15 min durchgeführt. Die RNA wurde Phenol/Chloroform ausgeschüttelt und gefällt. Die Einbaurate betrug im Durch schnitt 5 × 10⁷ cpm/µg DNA. Die markierte Sonde wurde nach einer Denaturierung zur vorhybridisierten Membran gegeben.

Abtrennung der nicht eingebauten Nukleotide

Eine Sephadex G50 Säule ("Nick Columns", Fa. Pharmacia) wird mit 10 ml Wasser gewaschen. Der Markierungsansatz und 350 µl Wasser werden aufpipettiert, das Eluat verworfen. Es werden nochmals 400 µl Wasser auf die Säule gegeben. Das Eluat enthält die markierte Probe. 1 µl des Eluats werden zur Bestimmung der spezi fischen Aktivität (cpm/µg DNA) entnommen. Diese sollte mindestens 10⁸ cpm/µg eingesetzter DNA betragen. Das restliche Eluat wird 10 min bei 95°C denaturiert und nach kurzem Abkühlen auf Eis in die Hybridisierungsröhre gegeben.

Hybridisierung mit ³²P-markierten Nukleinsäure-Fragmenten

Die Nylonmembran mit der fixierten Nukleinsäure wird in eine Hybridisierungsröhre gegeben. Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran wird zuerst eine Vorhybridisierung mit Heringssperma durchgeführt. Zu diesem Zweck werden 10 ml Hybridisierungslösung je 10 cm² Membran in die Hybridisierungs röhre gegeben und mit 1 ml frisch denaturierter Heringsspermlösung (10 µg/ml) je 10 ml Hybridisierungslösung versetzt. Die Vorhybridisierung findet ebenso wie die Hybridisierung bei 68°C im Hybridisierungsofen statt. Die Vorhybridisierung sollte mindestens eine halbe Stunde dauern, anschließend wird die markierte und frisch denaturierte DNA-Probe zugesetzt. Die Hybridisierung wird über Nacht durchge führt.

Am nächsten Tag wird nicht hybridisierte DNA-Probe und unspezifische Bindungen von der Membran abgewaschen. Dazu wird zuerst zweimal für jeweils 15 min bei Raumtemperatur mit 2 × SSC; 0,1% SDS-Lösung und anschließend für 30 min bei Hybridisierungstemperatur mit 0,2 × SSC; 0,1% SDS-Lösung gewaschen.

Die Membran wird in Folie eingeschweißt und ein Röntgenfilm zur Detektion aufgelegt.

Literatur

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Shaw, G. 1994. Chemistry of adenine cytokinins. In: Mok, D. und Mok, M. (Hrsg). Cytokinins, CRC Press, Boca Raton: 15-34.
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Wickson, M. und Thimann, K.V. 1958. The antagonism of auxin and kinetin in apical dominance. Physiol. Plant. 11: 62.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäuren, die für pflanzliche Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Proteinkinase, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, codieren.

2. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie für Polypeptide mit der Aktivität von Serin-/Threonin-Kinasen codieren.

3. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.

4. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.

5. Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Tabakpflanzen stammen.

6. Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus

a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
b) Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, welches die Amino säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter (a) oder (b) definierten Sequenzen,
d) Sequenzen, welche an die unter (a) oder (b) definierten Sequenzen hybridisieren,
e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige Identität zu den unter (a) oder (b) definierten Sequenzen aufweisen,
f) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige Identität mit der N- terminalen Rezeptordomäne der unter a) oder b) definierten Sequenzen aufweisen,
g) Sequenzen, welche zu den unter a) oder b) definierten Sequenzen komplementär sind, und
h) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie die unter a) bis
i) definierten Sequenzen.

7. Regulatorische Region, welche natürlicherweise die Transkription einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in Pflanzenzellen, insbesondere in Tabakpflanzen, kontrolliert.

8. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen heterologen Promotor.

9. Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eine regulatorische Region gemäß Anspruch 7 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 8.

10. Vektor gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.

11. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 8 oder einen Vektor gemäß Anspruch 9 oder 10.

12. Wirtszelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle, insbesondere um E. coli, handelt.

13. Wirtszelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere um eine Hefe-, Insekten-, Säugetier oder Pflanzenzelle, handelt.

14. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Kinase, welches von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird.

15. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer rezeptorähnlichen Kinase, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine zumindest 60%ige Identität mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

16. Antikörper, welcher spezifisch an ein Polypeptid gemäß Anspruch 14 oder 15 bindet.

17. Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die folgenden Schritte:

a) Vollständige chemische Synthese auf an sich bekannte Weise oder
b) chemische Synthese von Oligonukleotiden, Markieren der Oligo nukleotide, Hybridisieren der Oligonukleotide an DNA einer genomischen oder cDNA-Bank, die ausgehend von genomischer DNA bzw. mRNA aus Pflanzenzellen hergestellt wurde, Selektieren von positiven Klonen und Isolieren der hybridisierenden DNA aus positiv en Klonen oder
c) chemische Synthese von Oligonukleotiden und Amplifizierung der Ziel-DNA mittels PCR.

18. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids gemäß Anspruch 14, umfassend

a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 gewährleisten, oder
b) das Exprimieren einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem in vitro-System, und
c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro-System.

19. Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die an ein Poly peptid gemäß Anspruch 14 oder 15 bindet, umfassend die folgenden Schritte:

a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 oder eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder 15 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbin dungen unter Bedingungen, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, und
b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezifisch an das Polypeptid bindet.

20. Verfahren zum Auffinden einer Verbindung, welche die Expression von Polypeptiden gemäß Anspruch 14 verändert, umfassend die folgenden Schritte:

a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen,
b) Bestimmen der Polypeptidkonzentration, und
c) Bestimmen der Verbindung, welche die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst.

21. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eines DNA-Konstrukts gemäß Anspruch 8, eines Vektors gemäß Anspruch 9 oder 10, einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder 15, oder eines Antikörpers gemäß Anspruch 16 zum Auffinden neuer herbizider Wirkstoffe.

22. Verwendung eines Modulators eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 oder 15 als Pflanzenwuchsregulator oder Herbizid.

23. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eines DNA-Konstrukts gemäß Anspruch 8, eines Vektors gemäß Anspruch 9 zum Herstellen von transgenen Pflanzen.

24. Transgene Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflan zenvermehrungsmaterialien, dadurch gekennzeichnet, dass nach Einbringen einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eines DNA- Konstrukts gemäß Anspruch 8 oder eines Vektors gemäß Anspruch 9 die intrazelluläre Konzentration eines Polypeptids gemäß Anspruch 14 im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen erhöht oder vermindert ist.

25. Pflanzen, Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzenver mehrungsmaterialien, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid gemäß Anspruch 15 enthalten, dessen biologische Aktivität oder Expressionsmuster im Vergleich zu den entsprechenden endogenen Polypeptiden verändert ist.

26. Verfahren zum Herstellen von Pflanzen, Pflanzenteilen, Protoplasten, Pflan zengeweben oder Pflanzenvermehrungsmaterialien gemäß Anspruch 25, da durch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsäure gemäß einem der An sprüche 1 bis 6 oder eine regulatorische Region gemäß Anspruch 7 durch endogene Mutagenese verändert.