EP1235482A1 - Nouveau modele animal de la maladie d'alzheimer presentant a la fois des plaques amyloides et des dysfonctionnements mitochondriaux - Google Patents

Nouveau modele animal de la maladie d'alzheimer presentant a la fois des plaques amyloides et des dysfonctionnements mitochondriaux

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EP1235482A1
EP1235482A1 EP00962636A EP00962636A EP1235482A1 EP 1235482 A1 EP1235482 A1 EP 1235482A1 EP 00962636 A EP00962636 A EP 00962636A EP 00962636 A EP00962636 A EP 00962636A EP 1235482 A1 EP1235482 A1 EP 1235482A1
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app
psi
transgenic
transgenic mice
deposits
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EP00962636A
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Saliha Moussaoui-Mrabet
Véronique Blanchard-Bregeon
Assunta Imperato
Bruno Bonici
Gunter Tremp
Christian Czech
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Aventis Pharma SA
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Aventis Pharma SA
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Definitions

  • the present invention relates to the field of transgenic animal models and more particularly, animal models of Alzheimer's disease.
  • the invention relates to a new animal model of Alzheimer's disease having both amyloid plaques and mitochondrial dysfunctions.
  • Azheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease that affects a large proportion of the elderly population. This disease is characterized on the clinical level by a loss of memory and a decline in cognitive functions, on the neuropathological level by the presence in the brain of intracellular neurofibrillary deposits and of extracellular deposits of the ⁇ -amyloid peptide (A- ⁇ ) forming amyloid plaques (Yanker et al., 1996). To these signs are added a significant number of other abnormal changes including a deterioration of the immune and inflammatory systems as well as a deterioration of the mitochondrial function which can lead to an increase in oxidative stress, an activation of the mechanisms of apoptosis and ultimate way to cell death.
  • A- ⁇ ⁇ -amyloid peptide
  • amyloid plaques are mainly composed of the A- ⁇ peptides with 40 or 42 residues which are generated during the proteolytic process of the protein precursor of the ⁇ -amyloid peptide (APP).
  • Extracellular deposits of A- ⁇ are very specific for AD and associated disorders. They represent the early and unchanging characteristic of all forms of AD, including familial forms (FAD).
  • FADs appear relatively early (between 40 and 60 years of age) and are due to mutations in the APP gene in 5% of FAD cases (19 families) with six single or double missense mutations; in the presenilin 1 gene (PS 1) in 50 to 70% of ADF cases (> 50 families) with more than 40 different mutations identified so far; and in the presenilin 2 gene (PS 2) in fewer cases of FAD with 2 missense mutations described in 8 families (for review see Price and Sisodia, 1998). Mutations in these three genes have been shown to induce changes in the proteolysis of APP, which lead to an overproduction of A- ⁇ and the early onset of pathology and symptoms that are similar to those of sporadic forms. of the AD.
  • Bax is concentrated both in the neuritic elements surrounding the senile plaques (the localization of bax is correlated with that of the deposits of A- ⁇ on adjacent sections of the same brain at the level of the hippocampus of the affected subject. by AD), and in neurons carrying early neurofibrillary degeneration, indicating that Bax plays a role in the formation of neurofibrillary degeneration in patients with AD (MacGibbon et al., 1997; Tortosa et al., 1998 ; Nagy et al., 1997).
  • a first object of the invention therefore relates to a transgenic animal model of Alzheimer's disease having both amyloid plaques and mitochondrial dysfunction.
  • it co-expresses the precursor of the amyloid ⁇ peptide (APP) and a presenilin, preferably PS
  • the term “transgenic animal” is understood to mean any non-human animal exhibiting a modification of its genome.
  • the modification of the genome can result from an alteration or modification of one or more genes by "knock-in” or by "knock-out”. This modification may be due to the action of conventional altering or mutagenic agents or else effected by site-directed mutagenesis, as described in Materials and Methods.
  • the modification of the genome can also result from an insertion of gene (s) or replacement of gene (s) in its wild or mutated form (s).
  • the genome modifications are advantageously carried out on reproductive stem cells and advantageously on the pronuclei.
  • the animal model is advantageously a mammal.
  • it may be a mouse, a rat or a rabbit obtained according to conventional transgenesis techniques.
  • transgenesis processes mention may be made of the method of microinjection of an expression cassette comprising the genes modified in the two fertilized pronuclei, as described in Materials and Methods.
  • the animal model of the invention is obtained by injection of an expression cassette comprising a nucleic acid.
  • this acid nucleic acid is DNA which can be genomic DNA (gDNA) or complementary DNA (cDNA).
  • DNA codes for any gene which can intervene in the process of establishment of AD.
  • the gene encoded by DNA is involved in the production mechanism of the A- ⁇ peptide in its amyloidogenic form.
  • DNA codes for mutated forms of APP and / or presenilins and in particular for PSI so that the cells of the animal model coexpress the two mutated proteins.
  • Mutations in the APP gene can be one of the different mutations described so far in the literature.
  • the mutations in the APP gene are chosen from the “Swedish” (S), “London” (L) and “Dutch” (D) mutations alone or in combination.
  • the APP usable in the context of the invention can be in different isoforms and in particular in forms 695, 751 and 770 or in a truncated form such as for example the isoform APP99.
  • Mutations in the PSI gene can be one of the 40 mutations described so far in the literature.
  • the mutations in the PSI gene are chosen from mutations M146L, A246E, C410Y, H163R, L286V, L235P, etc., alone or in combination.
  • the M146L mutation is preferred.
  • DNA is placed under the control of sequences allowing its expression and in particular of sequences promoting transcription.
  • promoter sequences there may be mentioned very particularly the HMG promoter (Gautier et al., 1989), as well as the PDGF promoter (Sasahan et al., 1991), the Thy-1 promoter (L ⁇ thi et al.,) And the promoter of the Prion gene (Scott et al., 1992).
  • the animal model comprises the APP gene having the S, D and L mutations, placed under the control of the PDGF promoter and the PSI gene having the M 146 L mutation placed under the control of the HMG promoter.
  • the animal model according to the invention is very advantageous because it corresponds to a model very representative of AD.
  • this model develops amyloid plaques from the age of 6 months, which allows a very short breeding time for animals and co-expresses APP and mutated PSI at levels much higher than endogenous levels; at least 3 to 5 times and 2 to 3 times the endogenous levels of APP and PSI respectively.
  • the results described in the examples demonstrate that the transgenic mouse coexpressing the mutated APP and the mutated PSI, develops neuropathology of the Alzheimer's disease type; that is to say, it presents A- ⁇ deposits with a fibrillar conformation, neurodegenerative changes of the type of abnormal neuritic elements and activation of the central cells of the inflammatory type such as the astrocytes.
  • this model presents, in addition to the amyloid plaques, a mitochondrial dysfunction also highlighted in subjects affected by AD.
  • mitochondrial dysfunction corresponds to an alteration, a modification, an overexpression or an inhibition of the expression of mitochondrial proteins.
  • These proteins preferably having an intramitochondrial localization include the pro-apoptotic proteins of the Bcl-2 family, such as Bax, Bak, Bad and the anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family, such as Bcl-2 and Bcl-xL, or any other mitochondrial protein which does not belong to the Bcl-2 family and which plays a role in apoptosis, as for example cytochrome C and AIF, or proteins recently described as being located in the mitochondria and which may play a role in apoptosis such as Aralar or BMCPl.
  • the mitochondrial proteins whose expression is modified there may be mentioned in particular the Bax and / or cytochrome C proteins.
  • the present invention also relates to the use of the animal model, as described above, for the detection of compounds intended for the treatment of neurodegenerative diseases, preferably Alzheimer's disease.
  • this model allows, in comparison with known models, the identification of compounds particularly suitable for the treatment of AD, in particular, as described in 'man.
  • These compounds can be chemical molecules, peptide or protein molecules, antibodies, chimeric molecules as well as antisense DNAs or ribozymes.
  • the highlighted compounds can be used as a medicament, as such or in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle in order to obtain a pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle in order to obtain a pharmaceutical composition.
  • They may in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the injections can be performed by stereotaxic, topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc.
  • the demonstration of the compounds described above is based on bringing the model into contact, in particular by an administration such as for example an injection.
  • animal of the invention with a compound or a mixture of compounds supposed to have an action and then to measure the effect (s) of the compounds in particular in the cerebral level of the model on various biochemical and / or histological changes, for example those described in the Methods and Results sections, including the rate of production of A- ⁇ deposits, changes linked to neurodegeneration, alteration of the expression of mitochondrial molecules, etc.
  • Another object of the invention relates to a cell extracted from the animal model as described above as well as its use for the detection of compounds intended for the treatment of neurodegenerative diseases, preferably Alzheimer's disease.
  • the detection of the compounds described above is based on bringing cells extracted from the animal model of the invention into contact with a compound or a mixture of compounds supposed to have an action and then measuring the effect (s) compounds at the level of whole cells, in cell homogens or on a subcellular fraction, on various parameters such as cell death, production of the A- ⁇ peptide, mitochondrial activity (production of free radicals, respiratory chain, potential mitochondrial, etc.).
  • APP mutant a single (APP mutant)
  • cl a double mutation
  • APP / PS1 mutant a double mutation
  • PSI mutant el, e2
  • APP / PSI mutant APP / PSI mutant
  • A- ⁇ immunomarker deposits with the anti-A ⁇ 4G8 antibody in transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant).
  • APP / PSI mutant the density of A- ⁇ deposits much higher at 12 months of age (Cl, C2, C3) compared to 9 and 6 months of age (Bl, B2, B3 and Al, A2, A3, respectively).
  • the A- ⁇ deposits are essentially localized in a restricted cerebral region, mainly the subiculum in young mice (A1-A2), while they are present throughout the hippocampal formation and regions cortical in 12 month old mouse (Cl -C2).
  • Figures A2, B2, C2 and A3, B3, C3 represent a higher magnification of the regions delimited by a black frame in Figures A1, Bl, Cl and Figures A2, B2, C2, respectively.
  • A- ⁇ deposits as a function of age (6, 9 and 12 months) immunolabelled with anti-A ⁇ 4G8 antibody and quantified, on hemicerveau sections 6 ⁇ m thick (rostrocaudal Bregma -3 level , 4 of the Stereotaxic Atlas of Franklin and Paxinos), via the use of an image analysis system coupled with a color camera and a microscope (Q600, LEICA) in the double transgenic mouse APP 6 5 SDL X PS1 M146 L.
  • Dorsal cortex including in particular the primary visual cortex and the auditory cortex
  • Ventral cortex including in particular the ectorhinal cortex and the entorhinal cortex
  • FIG. 11A illustrates the presence of APP-immunoreactive neuritic elements (arrow heads at 4) in the hippocampus of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant) (4) and their absence in the hippocampus non-transgenic control mice (1) and transgenic mice carrying a simple APP (mutant APP) (2) or PSI (PSI mutant) mutation (3).
  • the immunoreactive APP-neuritic elements are also present in all cortical regions as shown in FIG. 1 IB, including the entorhinal cortex (a) and the cingulate cortex (d), in the dentate gyrus and in the hippocampal regions CA1 and CA3 (b, c).
  • FIGS. B, bl and b3 The regions delimited by a black frame in FIGS. B, bl and b3 are displayed at higher magnification in bl, in b2 and b3, and in b4, respectively. Note also the very high level of expression of the human APP protein in certain neuronal cell bodies (arrows in b2). The arrow in 1, 2, 3 and 4 indicates the orientation of the head of the dentate gyrus.
  • FIG. 12A illustrates the presence of PSI -immunoreactive neuritic elements (arrow heads in 4) in the hippocampus of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant) (4) and their absence in the hippocampus non-transgenic control mice (1) and transgenic mice carrying a simple APP mutation (APP mutant) (2) or PSI mutation (PSI mutant) (3).
  • the PSI -immunoreactive neuritic elements are also present in all cortical regions as shown in FIG.
  • This figure illustrates the presence of neuritic delta catenin-immunoreactive elements in the hippocampus (Hi) and the cortex (Ctx) of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant) (bl, b2) and their absence. in the same brain structures in non-transgenic control mice (al, a2).
  • the regions delimited by a black frame in the figures bl and b2 are displayed at higher magnification in bla, blb and in b2a, b2b, respectively.
  • the neuritic elements delta catenin-immunoreactive appear grouped in plaques of variable size, small, medium or large.
  • FIG. 15 SMI-immunoreactive phosphorylated neurofilaments in transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant) and in humans suffering from AD. It should be noted that, in both cases, on doubly immunostained brain sections, the phosphorylated SMI-immunoreactive neurofilaments (brown staining) strongly surround the A- ⁇ deposits (blue staining).
  • Tau-1 immunoreactivity (brown immunostaining) concentrated in neuritic elements including dystrophic neurites localized around or inside the A- ⁇ deposits (blue immunostaining) and neuronal cell bodies (arrowheads) in the brains of transgenic carrier mice a double mutation (APP / PSI mutant). Neither dystrophic neurites, nor cell bodies immunoreactive for the tau-1 protein are present in non-transgenic control mice.
  • GFAP-immunoreactive activated astrocytes present in transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant) ( Figure 17A) and in humans with AD ( Figure 17B). Note that, in both cases, on doubly immunostained brain sections, activated astrocytes surround certain A- ⁇ deposits (blue immunostaining).
  • Figures 18A to 18H illustrate the expression Bax in the neurons of the dentate gyrus (Figure 18 A, Figure 18E), the hippocampal regions CAl (Figure 18C, Figure 18G) and CA3 ( Figure 18B, Figure 18F) and the entorhinal cortex ( Figure 18D, Figure 18H) of a non-transgenic control mouse ( Figure 18A to Figure 18D) and a transgenic mouse carrying a double mutation (APP / PSI mutant) ( Figure 18E at 18H).
  • Bax-immunoreactive neuritic elements are present in the double transgenic mouse while they are absent in the non-transgenic control mouse.
  • Figures 181 to 18L represent a double immunostaining enabling the expression of Bax (in brown) and the A- ⁇ deposits (in blue) to be visualized on the same section of dentate gyrus ( Figures 18K and 18 L) and of the hippocampal region.
  • CA3 Figures 181 and 18 J of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant).
  • Bax immunoreactivity is concentrated in abnormal neuritic elements such as dystrophic neurites intimately associated with A- ⁇ deposits (arrows).
  • the Bax immunoreactivity is also concentrated in certain abnormal cell bodies which appear strongly immunomarked in their perinuclear cytoplasm and which resemble the so-called "dark" neurons (black arrow heads). It also appears in certain glial cells pronounced of activated astrocytes (white arrow heads).
  • Bax-immunoreactive neuritic elements in the frontal cortex of a control human subject ( Figure 19A) and of a subject with AD ( Figure 19B to 19F).
  • Figure 19A the frontal cortex of a control human subject
  • Figure 19B to 19F the presence of Bax- immunoreactive neuritic elements (brown immunostaining) such as dystrophic neurites (arrows), some of which appear intimately linked to A- ⁇ deposits (blue immunostaining) and abnormal cell bodies with very intense labeling areas in the cytoplasm and proximal extensions, thus resembling neurofibrillary degeneration (arrowheads).
  • Figures 20A and 20B Representative images of the expression of cytochrome C in the hippocampal region CA1 of non-transgenic control mice ( Figure 20A) and transgenic mice ( Figure 20B) carrying a double mutation (APP / PSI mutant). Note the presence of cytochrome C-immunoreactive neuritic elements (arrows) in the double transgenic mouse and their absence in the non-transgenic control mouse.
  • FIGS. 20A and 20B Representative images of the expression of cytochrome C in the hippocampal region CA1 of non-transgenic control mice ( Figure 20A) and transgenic mice ( Figure 20B) carrying a double mutation (APP / PSI mutant). Note the presence of cytochrome C-immunoreactive neuritic elements (arrows) in the double transgenic mouse and their absence in the non-transgenic control mouse.
  • 20C to 20H images representative of a double immunostaining making it possible to visualize the expression of cytochrome C (in brown) and the A- ⁇ deposits (in blue) on the same section of dentate gyrus, of the hippocampal regions CAl and CA3 and of the cingulate cortex of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant).
  • cytochrome C immunoreactivity is concentrated in abnormal neuritic elements such as dystrophic neurites intimately associated with A- ⁇ deposits (arrows in b, c, d, e, f).
  • Cytochrome C immunoreactivity is also concentrated in certain abnormal cell bodies which appear to be strongly immunolabelled in their perinuclear cytoplasm (arrow heads at c, d, f).
  • the high magnification images in g and h show the intimate association of the cytochrome C-immunoreactive cellular elements with the A- ⁇ deposits (arrows in g, h).
  • Cytochrome C-immunoreactive neuritic elements in the frontal cortex of a control human subject ( Figure 21A) and of a subject with AD ( Figures 21B to 21F).
  • Figure 21A Cytochrome C-immunoreactive neuritic elements in the frontal cortex of a control human subject
  • Figures 21B to 21F Note the presence, in the AD subject and not in the control, of cytochrome C-immunoreactive neuritic elements (brown immunostaining) such as dystrophic neurites (arrows), some of which appear to be intimately linked to A- ⁇ deposits (blue immunostaining) and abnormal cell bodies with very intense marking areas in the cytoplasm and in the proximal extensions, thus resembling neurofibrillary degeneration (arrowheads).
  • Double immunofluorescent labeling allowing to visualize the expression of Bax by rhodamine fluorescence in red ( Figures 22A to C) and the expression of APP, PSI or SMI by fluorescein fluorescence in green ( Figures 22D to F respectively) on the same section brain of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant).
  • APP / PSI mutant Double immunofluorescent labeling allowing to visualize the expression of Bax by rhodamine fluorescence in red ( Figures 22A to C) and the expression of APP, PSI or SMI by fluorescein fluorescence in green ( Figures 22D to F respectively) on the same section brain of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant).
  • APP / PSI mutant Double immunofluorescent labeling allowing to visualize the expression of Bax by rhodamine fluorescence in red ( Figures 22A to C) and the expression of APP, PSI or SMI by fluorescein fluorescence in green
  • the double immunofluorescent labeling ( Figures 22G to 22H) shows the co-localization of cytochrome C with the delta catenin in a significant number of neuronal elements (but not in all) in the brains of doubly transgenic mice.
  • FIGS. 221 and 22 J show the double immunofluorescent labeling of Bax and APP and their colocalization in the neuritic elements inside or around the plates in the brain tissue in humans suffering from AD.
  • Double immunofluorescent labeling allowing to visualize the expression of Bax by fluorescence CY3 in red ( Figures 23 A to 23C) and the expression of APP, PSI or cytochrome C by fluorescence fluorescence in green (respectively Figures 23D, 23E and 23F) on the same brain section of transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant). Confirmation of the co-location of Bax and APP, Bax and PSI and Bax and cytochrome C.
  • the cDNA coding for human mutated PSI was subcloned between the SmaI and BamHI restriction sites of the polylinker of the transgenic expression vector HMG (Czech et al., 1997).
  • the vector sequences were eliminated by restriction with the enzyme NotI and purification of the fragment containing the expression cassette by electrophoresis gel.
  • the purified fragment was diluted to the final concentration of 2.5 ng / ⁇ l in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 0.1 mM EDTA, and injected into one of the two pronuclei of the fertilized mouse embryos.
  • the surviving embryos were immediately transplanted into the oviduct of adoptive mothers (pseudopregnant).
  • the presence of the transgene in newborns was determined either by PCR or by Southern analysis.
  • the PCR was carried out with oligomers corresponding to human PSI (5'-TAA TTG GTC CAT AAA AGG C- 3 '; 5'-GCA CAG AAA GGG AGT CAC AAG-3') amplifying a fragment of 550 bp.
  • the plasmid containing the expression cassette of the PDGF promoter was linearized via the restriction endonuclease Sna B1 according to standard procedures (Ausubel et al.; Current Protocols in Mol. Biol.) To generate a blunt-end cut in order to sub - clones APP cDNA.
  • a plasmid preparation kit (Qiagen) was used to prepare supercoiled DNA.
  • the complete transgene was purified as described above by digestion via the restriction enzyme NotI and separation of the transgene fragment by electrophoresis.
  • the aliquots intended for microinjection were dialyzed against a TE buffer (10 mM Tris pH 7.4; 0.1 mM EDTA) on a floating filter (Millipore; type of membrane: VS; 0.025 ⁇ m) and then filtered (Spin-X ; Costar; polyacetate membrane; 0.22 ⁇ m).
  • the D ⁇ A was diluted to the final concentration of 1 - 2 ng / ⁇ l for microinjection.
  • mutagenesis of APP was previously described (Czech et al. 1997) and the mutated APP sequences were introduced into the cD ⁇ A APP 75 ⁇ by insertion of the APP Sma I / Bgl II fragment containing exon 8 into the Bluescript vector containing the mutations.
  • the cD ⁇ A APP from the Sma I site (-95) to the Cla I site (2699) was cloned into a modified pBluescript vector containing SalI sites from both other from the insertion site.
  • the vector was digested with Sal I and the insert cloned into the murine Thy-1 vector using the Xho I site (L ⁇ thi et al. J osceuroscience 17, 4688-4699). The correct orientation was verified by restriction analysis and the sequenced construction at the ligation sites. For microinjection, the cassette was linearized by restriction ⁇ ot I— Pvu I then purification of the fragment containing the transgene.
  • APP 75 ⁇ Kozak SL The mutagenesis of APP was previously described (Czech et al. 1997) and the mutated APP sequences were introduced into cDNA APP 75 ⁇ by insertion of the APP Sma I / Bgl II fragment with exon 8 into the vector Bluescript containing the mutations.
  • an optimized Kozak consensus sequence was introduced by PCR directed mutagenesis.
  • the oligonucleotide combination was: sense oligo (initiation region): ccc ggg tcc ace atg ctg ccc ggt ttg g (Kozak sequence underlined), oligo antisense: ttc agg gta gac ttc ttg gc.
  • the PCR product was cloned into pCR2 (Invitrogen, France), sequence then subcloned into the Bluescript vector containing the cDNA APP 75 ⁇ SL using Sma I and Ace I, thus deleting the 5 'UTR of the APP and introducing the Kozak consensus sequence.
  • the above cDNA APP extended in 3 ′ to Cla I (2699) was subcloned into a modified Bluescript vector containing two Sal I sites on the one hand and d other of the insert.
  • the vector was digested with Sal I and the insert cloned into the murine Thy-1 vector using the Xho I site (L ⁇ thi et al. J Neuroscience 17, 4688-4699). The correct orientation was verified by restriction analysis and the sequenced construction at the ligation sites.
  • the cassette was linearized by Not I - Pvu I restriction then purification of the fragment containing the transgene.
  • Transgenic animals were obtained and identified according to standard procedures already described (e.g. "Manipulating the Mouse Embryo”; Hogan et al CSH Press; Cold Spring Harbor. N.Y.).
  • the brain tissue of transgenic mice and non-transgenic control mice was homogenized on ice in a 0.32 M sucrose solution containing protease inhibitors (CompleteTM, Boehringer-Mannheim, Germany). Cellular debris was removed by centrifugation at 4 ° C for 5 min at 1500g. The protein concentration in the supernatant was measured using the BCA protein test (Pierce, USA).
  • PSI protease inhibitors
  • 25 ⁇ g of protein extract were incubated at 56 ° C. for 20 min in Laemmli deposition buffer containing 8 mM urea and 50 mM dithiothreitol.
  • APP and A- ⁇ 25 ⁇ g of protein extract were denatured at 95 ° C.
  • the primary antibodies (Ab) that have been used are:
  • Anti-APP mouse monoclonal antibody (1: 100; 22C11, Boehringer)
  • Biotinylated monoclonal mAb of anti-A ⁇ ⁇ 7-24 mice (1: 200, clone 4G8, Senetek)
  • Biotinylated monoclonal mAb of anti-A ⁇ i- ⁇ mice (1: 200, clone 6E10, Senetek)
  • Anti-A ⁇ - ⁇ 7 mouse monoclonal Ab (1: 100, clone 6F / 3D, Dako)
  • Anti-GFAP rabbit polyclonal antibody (1: 3000, Dako)
  • Anti-synaptophysin rabbit polyclonal antibody (1: 100, Dako)
  • PNF Phosphorylated Anti-Neurofilament Mice
  • Anti-cytochrome C mouse monoclonal Ab (clone 7H8.2C12, 1: 200, Pharmingen)
  • the secondary antibodies (1: 400, Vector) which have been used are anti-mouse IgG Ab (H + L) for experiments involving the use of primary mouse Ab, and rabbit anti-IgG Ab or anti-rat IgG (H + L) for experiments involving the use of primary Rabbit or rat Ab, respectively.
  • the secondary Ac which was used is a rabbit anti-IgG conjugated to fluorochrome CY3 (1/400, Vector),
  • the animals were housed under controlled temperature and humidity conditions and subjected to a 12 hour day / 12 hour night cycle (light 7:00 am EST). The animals had free access to food and water. The experiments on these animals were carried out with the agreement of the Rhône Poulenc Rorer Ethics Committee on the care and use of animals, in accordance with the standards of the "Guide for the care and use of laboratory animais" (National Research Council ILAR) and in compliance with French regulations and the EEC directive. The animals used for neurohistopathological studies are listed in the following table:
  • mice were deeply anesthetized (Pentobarbital: 60 mg / ml / kg ip, Ketamine: 40 mg / ml / kg ip) and then perfused in transcardiac with physiological saline then paraformaldehyde (4% in PBS).
  • the brains were then removed and then postfixed in the same fixing solution for 24 hours at 4 ° C. After fixation, the brains were separated into right and left hemicerveaux and then subjected to the conventional paraffin coating protocol.
  • the sections were then incubated in 1 ⁇ 202 (1% in methanol) in order to block the endogenous peroxidasic activities, rinsed in ethanol and citrate buffer (10 Mm sodium citrate, pH 6) and finally placed in a micro -waves (650W, Whirlpool) for 2x 5 min in the citrate solution.
  • citrate buffer 10 Mm sodium citrate, pH 6
  • 650W, Whirlpool a micro -waves
  • the sections were stained with 1% thioflavin S (Sigma, France) after being incubated for 10 min in a Mayer's hematoxylin solution (Sigma, France) to block nuclear fluorescence. They were then observed under a microscope equipped with a fluorescence system (Axioscop Zeiss, France) via the use of an FITC filter.
  • the dewaxed brain sections were incubated in the solution of Primary ac (overnight at 4 ° C). After rinsing, the sections were placed in the presence of biotinylated secondary Ac (for 2 hours at room temperature) then in the presence of the avidin-biotin peroxidase complex according to the manufacturer's instructions (Kit ABC Vectastin, Laboratories Vector, Burlingame, CA). 3-3'-diaminobenzydine was used as a chromogen for the enzyme peroxidase.
  • the anti-Bax Ab (PI 9 antibody, Santa Cruz) was incubated with the synthetic peptide Bax (PI 9 peptide control, Santa Cruz) (concentrations of the peptide tested: 0.002, 0.02 and 0 , 2 mg / ml) for at least 12 h before being used according to the immunohistochemistry protocol described above.
  • the anti-cytochrome C Ab (7H8.2C12, Pharmingen) was incubated according to the same protocol with exogenous purified cytochrome C from horse or rat heart (Sigma) (concentrations of the purified proteins tested: 0.01 and 0, 1 mg / ml).
  • A- ⁇ - immunolabelled hemicerveaux sections anti-A ⁇ biotinylated mouse monoclonal Ab ⁇ 7-24 , 4G8, Senetek
  • diaminobenzidine as chromogen and d '' an image analysis system coupled with a color camera and a microscope (Q600 system, LEICA).
  • Video images of each anatomical region of interest were captured and a threshold for automatic detection of the average gray level corresponding to the immunolabelling of the A- ⁇ deposits (and capable of discriminating the specific marking of the background noise) was defined. .
  • a manual control of each field was carried out by the experimenter in order to manually eliminate any artifact.
  • the load of A- ⁇ was measured at the rostrocaudal bregma -3.4 level of the stereotaxic atlas of mice (Franklin and Paxinos).
  • the load of A- ⁇ is defined as the percentage of the surface of the A- ⁇ immunostaining relative to the total surface of the cerebral region analyzed, i.e. the hippocampus, the cortex and the rest of the cut (sub-cortical regions).
  • the immunohistochemical double labeling experiments were carried out by incubation of the brain sections according to a two-step protocol. Briefly, the sections were immunostained in a first step via the use of an Ac primary (for example: anti-GFAP, anti-synaptophysin, anti-Bax or anti-cytochrome C) visualized by a brown marking via the use of diaminobenzidine (enzyme substrate of horseradish peroxidase) according to the protocol described above.
  • an Ac primary for example: anti-GFAP, anti-synaptophysin, anti-Bax or anti-cytochrome C
  • diaminobenzidine enzyme substrate of horseradish peroxidase
  • immunofluorescent double labeling was carried out in particular in order to demonstrate whether Bax colocalizes with APP, PSI, cytochrome C or SMI in neuritic elements associated with A- ⁇ deposits in transgenic mice carrying a double mutation (APP / PSI mutant).
  • the sections were first incubated in anti-Bax Ab and revealed either via the use of a biotinylated secondary anti-rabbit IgG Ab conjugated to CY3 (1: 400, Chemicon), or via use of a secondary anti-rabbit IgG Ab then a signal amplification kit (Streptavidin-peroxidase / tetramethyl-Rhodamide Tyramide complex) according to the manufacturer's instructions (New England Nuclear).
  • a signal amplification kit Streptavidin-peroxidase / tetramethyl-Rhodamide Tyramide complex
  • the sections were successively incubated with a primary anti-APP, anti-PSI, anti-cytochrome C or anti-SMI Ab then a secondary biotinylated anti-mouse or rat IgG Ab.
  • the sections were finally revealed via the use of a second signal amplification system (Streptavidin-peroxidase complex / Fluorescein Tyramide) according to the manufacturer's instructions (New England Nuclear).
  • the microscopic observations of the sections were carried out via the use of filters CY3 or rhodamine (excitation at 550 nm, emission at 570 nm) for the immunofluorescent marking Bax and the fluorescein filter (excitation at 495 nm, emission at 517nm) for the second immunofluorescent labeling.
  • the brain homogenates of different lines of transgenic mice were analyzed by Western blot for the expression of APP, using a monoclonal antibody WO-2. This antibody is specially indicated because it recognizes human APP and A- ⁇ but does not recognize endogenous mouse APP. No signal was indeed detected in the track corresponding to the non-transgenic mouse (Fig. 1, track 3). Lanes 1 and 2 of FIG. 1 correspond to the extracts of brains of transgenic mice previously shown expressing high levels of the APP transgene (Moechard et al. 1999a). The PDGF APP 695 SDL transgenic mice in lane 7 were used to produce lines of double transgenic mice with mice carrying the PSI M146L transgene.
  • the age of the transgenic mice does not influence the expression of the APP transgene or its metabolism at the beta cleavage site. Nevertheless, there is a strong accumulation of A- ⁇ at 9 months and starting at the age of 6 months. This increase in A- ⁇ is well correlated with the onset of the formation of amyloid plaques in the brains of transgenic mice (see below). This suggests that the increase in A- ⁇ detected by western blot may correspond to the A- ⁇ accumulated in the amyloid plaques.
  • Another Western blot analysis on brain homogenates was carried out in order to determine whether the human PSI protein is expressed in double transgenic mice and in non-transgenic control (littermate) mice. A monoclonal Ab directed against the amino-terminal part of PSI was used.
  • EXAMPLE 2 Localization and regional expression of transgenes in single (PDGF APP 695 SDL or HMG PS1M146L) or double (PDGF APP 695 SDLx HMG PS1M146L) mice.
  • cortical regions such as the entorhinal cortex and in the amygdala.
  • the subcortical regions show a lower level of expression of the transgene and the human APP protein is not detected either in the glial cells or at the vascular level.
  • EXAMPLE 3 Demonstration of an accelerated process of deposition of amyloid in the brains of double transgenic mice carrying both the mutant APP protein and the mutant PSI protein (PDGF APP 69S SDL x HMG PS1M146L)
  • PDGF APP 69S SDL x HMG PS1M146L mutant PSI protein
  • the number of A- ⁇ deposits is higher in mice at 12 months than in mice aged 6 and 9 months, as shown qualitatively and quantitatively. Figures 7 and 8, respectively.
  • the A- ⁇ deposits, at 6 and 9 months, are located in a restricted cerebral region corresponding to the subiculum and to the dorsal portion of the hippocampal region CAl (Fig. 7).
  • the most numerous A- ⁇ deposits are localized in the hippocampal and cortical regions all along the rostrocaudal axis of the brain (Fig. 7 and Fig. 9).
  • A- ⁇ deposits are present only occasionally in certain subcortical structures (for example, the internal capsule, the dorsolateral thalamus and the basal ganglia).
  • synaptophysin- and SMI-immunoreactive neuritic elements are present in the brains of double transgenic mice and they are intimately associated with A- ⁇ deposits.
  • our results show that the neuritic elements are very similar to those described in the human AD brain.
  • A- ⁇ deposits in AD brain tissue are associated with glial cells (inflammatory cells of the central nervous system), it has been investigated whether a glial reaction in the neuropil occurs in our transgenic mice which develop A- ⁇ deposits.
  • No GFAP-immunoreactive reactive astrocyte in the brain, nor non-transgenic control mice, nor transgenic mice which do not develop A- ⁇ deposits for example the single transgenic mice PDGF APP 695 SDL or HMG PS1M146L).
  • all double transgenic mice with A- ⁇ deposits in their brains have reactive GFAP-immunoreactive astrocytes intimately associated with A- ⁇ deposits (Fig. 17).
  • a single immunostaining was carried out to visualize the Bax protein alone and a double immunostaining to visualize, on the same brain section, the Bax protein and the A- ⁇ deposits; this in order to determine a relationship between the expression of Bax and the amyloid plaques.
  • these abnormal Bax-immunoreactive cellular elements are located exclusively in brain regions rich in A- ⁇ deposits, such as the dentate gyrus, the hippocampal regions CAl and CA3, the subiculum, and the cingulate and entorhinal cortex.
  • cytochrome C The results of simple immunochrome labeling of cytochrome C showed that the protein cytochrome C is expressed in the neuronal cell bodies in the 4 groups of animals examined (non-transgenic controls, single and double transgenic - Table I).
  • the immunoreactive cytochrome C-neuron distribution pattern is similar to that described for Bax.
  • the expression of cytochrome C is demonstrated in cellular elements such as neurites and abnormal neuronal cell bodies (Fig. 20) only in double transgenic mice. These cytochrome C-immunoreactive cellular elements are never observed in simple transgenic or non-transgenic control mice (Fig. 20).
  • the cytochrome C-immunoreactive neuritic elements are located in the brain structures in which the A- ⁇ deposits are present, mainly the dentate gyrus, the hippocampal regions CAl and CA3, the cingulate cortex (Fig. 20).
  • the double immunostaining of cytochrome C and of the A- ⁇ deposits shows that the cytochrome C-immunoreactive neuritic elements in these double transgenic animals are intimately associated with amyloid plaques (Fig. 20).
  • cytochrome C immunostaining is specific as demonstrated by the preabsorption experiments with purified cytochrome C proteins.
  • the double immunostaining Bax / A ⁇ and cytochrome C / A ⁇ were carried out on tissue of postmortem human brain of a control individual and an AD subject.
  • the results obtained show that, in the human AD brain, the Bax- or cytochrome C-immunoreactive neuritic elements such as dystrophic neurites and early neurofibrillary neurodegenerations are present inside or around amyloid plaques.
  • the abnormal neuronal, Bax- and cytochrome C-immunoreactive elements were not observed in the control human tissue.
  • Alzheimer's PS-1 mutation perturbs calcium homeostasis and sensitizes PC 12 cells to death induced by amyloid ⁇ -peptide.
  • Alzheimer's presenilin mutation sensitizes neural cells to apoptosis induced by trophic factor withdrawal and amyloid ⁇ -peptide: involvement of calcium and oxyradicals. J. Neurosci. 17: 4212-4222.
  • BAX-induced cell death may not require interleukin lb- converting enzyme-lke proteases.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine des modèles animaux transgéniques et plus particulièrement, les modèles animaux de la maladie d'Alzheimer. L'invention se rapporte à un nouveau modèle animal de la maladie d'Alzheimer présentant à la fois des plaques amyloïdes et des dysfonctionnements mitochondriaux.

Description

NOUVEAU MODELE ANIMAL DE LA MALADIE D'ALZHEIMER
PRESENTANT A LA FOIS DES PLAQUES AMYLOIDES ET DES
DYSFONCTIONNEMENTS MITOCHONDRIAUX
La présente invention concerne le domaine des modèles animaux transgéniques et plus particulièrement, les modèles animaux de la maladie d'Alzheimer. L'invention se rapporte à un nouveau modèle animal de la maladie d'Alzheimer présentant à la fois des plaques amyloïdes et des dysfonctionnements mitochondriaux.
La maladie d'Azheimer (AD) est une maladie neurodégénérative progressive qui affecte une large proportion de la population âgée. Cette maladie est caractérisée sur le plan clinique par une perte de la mémoire et un déclin des fonctions cognitives, sur le plan neuropathologique par la présence dans le cerveau de dépôts neurofibrillaires intracellulaires et de dépôts extracellulaires du peptide β-amyloïde (A-β) formant les plaques amyloïdes (Yanker et al., 1996). A ces signes s'ajoutent un nombre important d'autres changements anormaux incluant une altération des systèmes immunitaires et inflammatoires ainsi qu'une altération de la fonction mitochondriale pouvant conduire à une augmentation du stress oxydatif, une activation des mécanismes de l'apoptose et de manière ultime à la mort cellulaire.
Les plaques amyloïdes sont majoritairement composées des peptides A-β à 40 ou 42 résidus qui sont générés lors du processus protéolytique de la protéine précurseur du peptide β-amyloïde (APP). Les dépôts extracellulaires de A-β sont très spécifiques de l'AD et des désordres associés. Ils représentent la caractéristique précoce et invariable de toutes les formes de l'AD, incluant les formes familiales (FAD). Les FAD apparaissent de manière relativement précoce (entre 40 et 60 ans) et sont dues à des mutations dans le gène de l'APP dans 5 % des cas de FAD (19 familles) avec six mutations faux-sens simples ou doubles; dans le gène de la préséniline 1 (PS 1) dans 50 à 70 % des cas de FAD (> à 50 familles) avec plus de 40 mutations différentes identifiées jusqu'à présent; et dans le gène de la préséniline 2 (PS 2) dans moins de cas de FAD avec 2 mutations faux-sens décrites dans 8 familles (pour revue voir Price et Sisodia, 1998). Des mutations dans ces trois gènes ont été démontrées comme induisant des changements dans la protéolyse de l'APP, qui conduisent à une surproduction de A-β et à l'apparition précoce de la pathologie et des symptômes qui sont similaires à ceux des formes sporadiques de l'AD.
En plus des mutations dans les gènes de l'APP, PSI et PS2, d'autres facteurs contribuant à l'AD ont été mis en évidence chez l'homme, en particulier les dysfonctionnements de la mitochondrie (Beal, 1998). En effet, par différentes voies d'investigations chez des individus atteints par l'AD, il a été démontré que le dysfonctionnement mitochondrial était important dans l'apparition de la maladie.
En effet, selon une première approche, des déficiences de l'activité cytochrome C oxydase mitochondriale (COX ou complexe IV de la chaîne respiratoire mitochondriale) ont été montrées dans le cerveau de sujets humain atteints par l'AD (Parker et al., 1989; Parker et al., 1994; Mutisya et al., 1994; Kish et al., 1992). Des mutations des gènes COX mitochondriaux ont également été mises en évidence dans des formes tardives de l'AD. (Davis et al. 1996, 1997). Dans des cellules cybrides dans lesquelles les mitochondries des plaquettes de patients atteints par l'AD sont fusionnées à la lignée cellulaire SH-SY5Y caractérisée par une déplétion de son ADN mitochondrial, l'activité mitochondriale COX est diminuée de 52 %. Cette diminution de l'activité mitochondriale a pour conséquence une surproduction des radicaux libres et une augmentation de la concentration basale de Ca (Sheehan et al., 1997).
Dans une seconde approche, tout aussi importante, il a été démontré le rôle important du dysfonctionnement mitochondrial dans la mort cellulaire induite par apoptose chez des patients atteints par l'AD (Su et al., 1997; Mac Gibbon et al., 1997; Tortosa et al., 1998; Nagy et al., 1997), et en particulier le rôle important de Bax qui a été identifié dans des lésions de patients AD (Bax étant une protéine mitochondriale de la famille de Bcl-2, connue pour induire la mort cellulaire par l'ouverture du "mégachannel" mitochondrial et la libération par la mitochondrie de molécules apoptotiques dans le cytosol incluant le cytochrome C , le substrat de COX, qui active les caspases, comme cela a été démontré dans des cellules en cultures). En fait, Bax se concentre à la fois dans les éléments neuritiques entourant les plaques séniles (la localisation de bax est corrélée à celle des dépôts de A-β sur des sections adjacentes d'un même cerveau au niveau de l'hippocampe de sujet atteint par l'AD), et dans des neurones portant des dégénérescences neurofibrillaires précoces, indiquant que Bax joue un rôle dans la formation des dégénérescences neurofibrillaires chez les patients atteints par l'AD (MacGibbon et al., 1997; Tortosa et al., 1998; Nagy et al., 1997).
En ce qui concerne le A-β, il est clairement démontré dans la littérature que ses propriétés neurotoxiques montrées in vitro sont associées à la production de radicaux libres oxygénés (Pappola et al., 1998). Cette donnée semble cependant ne pas résoudre la question de savoir si le stress oxydatif est dû à un dysfonctionnement mitochondrial ou si le stress oxydatif apparaîtrait in vivo dans le cerveau en association avec les' dépôts de A-β. En effet, les données, disponibles en grand nombre dans la littérature, montrant et/ou suggérant que la neurotoxicité de A-β est médiée par le stress oxydatif ne sont en fait que des données in vitro (et non in vivo). De plus, la toxicité de A-β in vivo a été mise en question dans de nombreux rapports (Papolla et al., 1998).
Tandis que dans le tissu cérébral humain, il est connu que les dépôts de A-β sont associés à un dysfonctionnement mitochondrial, aucune donnée n'a été rapportée à ce jour démontrant une association entre le dysfonctionnement mitochondrial et les dépôts de A-β dans un modèle animal transgénique de l'AD. Deux récentes publications sur les animaux transgéniques exprimant l'APP muté (animaux développés par Hsiao et al. 1996) rapportaient une augmentation de la superoxide dismutase (SOD) et de l'hème-oxygénase-1 (HO-1) et une augmentation de la peroxydation lipidique et de hydroxynonénal (HNE) en association avec des dépôts de A-β (Smith et al., 1998; Papolla et al., 1998). Cependant, tous ces marqueurs sont des marqueurs du stress oxydatif situés en aval du dysfonctionnement mitochondrial et ne sont pas spécifiques de ce dysfonctionnement. De plus, certains de ces marqueurs utilisés dans les études précédemment décrites, c'est-à-dire SOD et HO- 1 , ne sont pas des oxydants induisant une mort neuronale mais sont par contre connus comme anti oxydants impliqués dans les mécanismes de défense mis en jeu dans la réduction des dommages oxydatifs et de la mort cellulaire.
En ce qui concerne les présénilines, les mutations de PSI ont été décrites comme induisant l'apoptose dans des cellules en culture et in vivo dans le cerveau de souris transgéniques exprimant PSI mutée (Chiu et al., 1999). Cependant, cela ne démontre pas que l'apoptose induite par les mutations de PSI est médiée par un dysfonctionnement mitochondrial. En effet, l'apoptose peut être soit la conséquence d'un dysfonctionnement mitochondrial, soit la conséquence d'autres mécanismes de mort cellulaire non nécessairement impliqués dans le dysfonctionnement mitochondrial: par exemple, il a été démontré que l'inhibition de l'activité protéasique de l'enzyme de conversion de l'interleukine 1-β (ICE) prévient seulement des changements induits par Bax qui sont en aval de la mitochondrie (dégradation de l'ADN par exemple) mais n'a aucun effet sur les changements mitochondriaux tels que la perte du potentiel de membrane de la mitochondrie et la production de radicaux libres (Xiang et al., 1996). De récentes études in vitro ont montré que les mutations de PSI sont impliquées dans la surproduction de radicaux libres, dans l'altération de l'homéostase du calcium, et dans la perte du potentiel de membrane de la mitochondrie (Begley et al., 1999; Guo et al., 1996, 1997, 1998). Cependant, ces études ne montrent aucune association du dysfonctionnement mitochondrial avec les dépôts A-β chez des souris transgéniques exprimant PSI mutée puisque les souris transgéniques utilisées dans ces études pour la préparation des synaptosomes ne développent pas de dépôts A-β. Il existe donc dans la littérature aucune évidence démontrant une association d'un dysfonctionnement mitochondrial et des dépôts A-β in vivo, dans le cerveau de souris transgéniques exprimant PSI mutée (Chui et al., 1999) ou l'APP muté (Hsiao et al., 1996; Irizarry et al. 1997a, 1997b; Johson-Wood et al. 1997) ou encore coexprimant l'APP muté et PSI mutée (Borchelt et al., 1997; Holcomb et al., 1998). La présente invention résulte donc de la mise en évidence pour la première fois que les dépôts amyloïdes sont associés à des dysfonctionnements mitochondriaux in vivo dans le cerveau d'animaux transgéniques. En outre, l'invention résulte également de la recherche d'un nouveau modèle animal de l'AD plus représentatif et reproduisant la neuropathologie rencontrée chez l'homme.
Un premier objet de l'invention concerne donc un modèle animal transgénique de la maladie d'Alzheimer présentant à la fois des plaques amyloïdes et un dysfonctionnement mitochondrial. Avantageusement il coexprime le précurseur du peptide β amyloïde (APP) et une préséniline, de prérérence la PS|. On entend par animal transgénique tout animal non-humain présentant une modification de son génome. La modification du génome peut résulter d'une altération ou une modification de un ou plusieurs gènes par "knock-in" ou par "knock-out". Cette modification peut être due à l'action d'agents altérants ou mutagènes classiques ou bien effectuée par mutagénèse dirigée, comme cela est décrit dans Matériels et Méthodes.
La modification du génome peut également résulter d'une insertion de gène(s) ou de remplacement de gène(s) dans sa (leur) forme sauvage ou mutée.
Les modifications du génome sont avantageusement effectuées sur des cellules souches reproductrices et avantageusement sur les pronucléi.
Dans le cadre de la présente invention, le modèle animal est avantageusement un mammifère. En particulier il peut s'agir d'une souris, d'un rat ou d'un lapin obtenu selon les techniques classiques de transgénèse. A titre d'exemple illustant l'un des procédés de transgénèse, on peut citer la méthode de microinjection d'une cassette d'expression comprenant les gènes modifiés dans les deux pronucléi fécondés, tel que cela est décit dans Matériels et Méthodes.
A cet égard, le modèle animal de l'invention est obtenu par injection d'une cassette d'expression comprenant un acide nucléique. De manière préférentielle, cet acide nucléique est un ADN qui peut être un ADN génomique (ADNg) ou un ADN complémentaire (ADNc).
Dans le cadre du modèle de l'invention, l'ADN code pour tout gène pouvant intervenir dans le processus de mise en place de l'AD. A titre avantageux, le gène codé par l'ADN intervient dans le mécanisme de production du peptide A-β dans sa forme amyloïdogénique.
En particulier, l'ADN code pour des formes mutées de l'APP et/ou des présénilines et notamment pour la PSI de sorte que les cellules du modèle animal coexpriment les deux protéines mutées.
Les mutations dans le gène de l'APP peuvent être l'une des différentes mutations décrites jusqu'à présent dans la littérature. De manière préférentielle, les mutations dans le gène de l'APP sont choisies parmi les mutations "Swedish" (S), "London" (L) et "Dutch" (D) seules ou en combinaison.
Ces mutations sont bien décrites dans la littérature et sont caractérisées d'une manière générale par les modifications suivantes :
Sont également comprises par mutation London toutes les substitutions autres que par l'isoleucine qui sont situées en position 717 par référence à 1ΑPP770, telles que par exemple les mutations V 717 G et V 717 F.
Il est entendu que l'APP utilisable dans le cadre de l'invention, peut être sous différentes isoformes et en particulier dans les formes 695, 751 et 770 ou dans une forme tronquée telle que par exemple l'isoforme APP99.
Les mutations dans le gène de PSI peuvent être l'une des 40 mutations décrites jusqu'à présent dans la littérature. De manière préférentielle, les mutations dans le gène de PSI sont choisies parmi les mutations M146L, A246E, C410Y, H163R, L286V, L235P, etc., seules ou en combinaison.
Pour la réalisation d'un modèle selon l'invention, la mutation M146L est préférée.
Dans le cadre du modèle de l'invention, l'ADN est placé sous le contrôle de séquences permettant son expression et en particulier de séquences promotrices de la transcription.
A titre de séquences promotrices, on peut citer tout particulièrement le promoteur HMG (Gautier et al., 1989), ainsi que le promoteur PDGF (Sasahan et al., 1991), le promoteur Thy-1 (Lϋthi et al.,) et le promoteur du gène du Prion (Scott et al., 1992).
Selon une mise en œuvre particulièrement intéressante de l'invention, le modèle animal comprend le gène de l'APP ayant les mutations S, D et L, placé sous le contrôle du promoteur PDGF et le gène de la PSI ayant la mutation M 146 L placé sous le contrôle du promoteur HMG.
Le modèle animal selon l'invention est très avantageux car il correspond à un modèle très représentatif de l'AD. En effet, ce modèle développe des plaques amyloïdes dès l'âge de 6 mois ce qui permet un temps d'élevage des animaux très court et coexprime l'APP et PSI mutées à des niveaux bien supérieurs au niveaux endogènes; au moins de 3 à 5 fois et de 2 à 3 fois les niveaux endogènes respectivement de l'APP et de PSI.
Ainsi, les résultats décrits dans les exemples démontrent que la souris transgénique coexprimant l'APP muté et la PSI mutée, développe une neuropathologie de type maladie d'Alzheimer; c'est-à-dire qu'elle présente des dépôts A-β avec une conformation fibrillaire, des changements neurodégénératifs de type éléments neuritiques anormaux et une activation des cellules centrales de type inflammatoire tels que les astrocytes.
De manière particulièrement intéressante, ce modèle présente, en plus des plaques amyloïdes, un dysfonctionnement mitochondrial également mis en évidence chez des sujets atteints par l'AD.
Les résultats décrits dans les exemples démontrent l'implication d'un dysfonctionnement mitochondrial dans la neuropathologie de ces souris transgéniques AD. Comparativement aux données publiées jusqu'à maintenant dans les domaines de la mitochondrie et de la maladie d'Alzheimer, ces résultats représentent la première démonstration, à travers l'étude de deux marqueurs importants de la mitochondrie, Bax et cytochrome C, qu'un dysfonctionnement mitochondrial se produit dans le cerveau des souris transgéniques AD de l'invention. Enfin, ces résultats montrent que de la même manière que dans le cerveau de patients AD, dans le cerveau de souris transgénique AD, une expression de Bax et cytochrome C est produite dans des éléments neuritiques intimement associés aux dépôts A-β.
Dans la présente invention, le dysfonctionnement mitochondrial correspond à une altération, une modification, une surexpression ou une inhibition de l'expression des protéines mitochondriales. Ces protéines ayant préférentiellement une localisation subcellulaire intramitochondriale incluent les protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2, comme Bax, Bak, Bad et les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, comme Bcl-2 et Bcl-xL, ou tout autre protéine mitochondriale n'appartenant pas à la famille Bcl-2 et qui joue un rôle dans l'apoptose, comme à titre d'exemple cytochrome C et AIF, ou encore des protéines récemment décrites comme étant localisées dans la mitochondrie et pouvant jouer un rôle dans l'apoptose comme Aralar ou BMCPl.
Préférentiellement, parmi les protéines mitochondriales dont l'expresssion est modifiée on peut citer notamment les protéines Bax et/ou cytochrome C.
La présente invention est également relative à l'utilisation du modèle animal, tel que décrit précédemment, pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives, de préférence la maladie d'Alzheimer.
En effet, par les propriétés avantageuses qui reproduisent très fidèlement les caractéristiques de l'AD, ce modèle permet, en comparaison des modèles connus, la mise en évidence de composés particulièrement adaptés au traitement de l'AD, notamment, telle que décrite chez l'homme.
Ces composés peuvent être des molécules chimiques, des molécules peptidiques ou protéiques, des anticorps, des molécules chimériques ainsi que des ADNs antisens ou des ribozymes.
Les composés mis en évidence peuvent être utilisés comme médicament, tels quels ou en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable afin d'obtenir une composition pharmaceutique. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les injections pouvant être réalisée par voie stéréotaxique, topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
La mise en évidence des composés décrits précédement repose sur la mise en contact, notamment par une administration telle que par exemple une injection, du modèle animal de l'invention avec un composé ou un mélange de composés supposé(s) avoir une action et de mesurer ensuite le ou les effet(s) des composés notamment au niveau cérébral du modèle sur différents changements biochimiques et/ou histologiques comme par exemple ceux décrits dans les parties Méthodes et Résultats dont le taux de production des dépôts de A-β, les changements liés à la neurodégéneréscence, l'altération de l'expression des molécules mitochondriales....
Un autre objet de l'invention concerne une cellule extraite du modèle animal tel que décrit précédemment ainsi que son utilisation pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives, de préférence la maladie d'Alzheimer.
La mise en évidence de composés décrits précédemment repose sur la mise en contact de cellules extraites du modèle animal de l'invention avec un composé ou un mélange de composés supposé(s) avoir une action et de mesurer ensuite le ou les effet(s) des composés au niveau des cellules entières, dans des homogènâts de cellules ou sur une fraction subcellulaire, sur différents paramètres tels que la mort cellulaire, la production du peptide A-β, l'activité mitochondriale (production de radicaux libres, chaîne respiratoire, potentiel mitochondrial, etc.).
Les résultats décrits dans les exemples démontrent les avantages du modèle de l'invention et supportent clairement l'utilisation de ce modèle transgénique pour le développement de stratégies thérapeutiques telles que notamment des agents mitochondriaux qui s'opposent au dysfonctionnement mitochondrial et à la mort neuronale induite par un dysfonctionnement mitochondrial.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent mais qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DU TABLEAU I : tableau récapitulatif des résultats obtenus dans le modèle de souris double transgénique mettant en évidence des dépôts A-β et des marqueurs de l'apoptose médiée par un dysfonctionnement mitochondrial dans des éléments neuritiques.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1
Comparaison des niveaux d'expression de l'APP, du fragment β-secrétase et de l'A-β chez différentes lignées de souris transgéniques : 1 (AA LD2 (B6)), 2 (APP LD2 (FVB)), 3 (NT), 4 (Thy-1 Kozak APP751 SL (28)), 5 (Thy-1 Kozak APP75ι SL (26)), 6 (Thy APP75ι SDL (1001)), 7 (PDGF APP695 SDL (46)), 8 (HMG APP SDL 20 (76)).
Figure 2A
Analyse de l'expression de l'APP, du fragment 12kDa de la β-secrétase et de l'A-β dans des homogénats de cerveaux de souris transgéniques à différents âges porteuses d'une simple ou double mutation, via l'utilisation de l'anticorps WO-2 dirigé spécifiquement contre la forme humaine de l'A-β. L'âge des souris transgéniques ne modifie pas le niveau d'expression de l'APP mais conduit à une forte accumulation de l'A-β.
Figure 2B
Analyse de l'expression de PSI M146L humaine.
Figure 3
Planche illustrative de l'expression de l'APP humaine dans l'hippocampe et le cortex de souris transgéniques porteuses d'une simple (mutant APP) (bl,b2) ou d'une double mutation (mutant APP/PS1) (cl,c2). A noter le niveau d'expression élevé de l'APP dans les neurones hippocampaux (bl, cl) et corticaux (b2,c2) de ces deux lignées de souris transgéniques et le niveau d'expression très faible voire indétectable de l'APP dans les régions cérébrales correspondantes des animaux contrôles non transgéniques (al,a2). De la même façon, l'expression de la PSI humaine au sein des mêmes régions cérébrales est présente chez les souris transgéniques porteuses d'une simple (mutant PSI) (el,e2) ou d'une double mutation (mutant APP/PSI) (fl, f2) et est indétectable chez les animaux contrôles non transgéniques (dl, d2).
Figures 4 et 5
Illustration des dépôts A-β dans le cerveau des souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) âgées de 6 mois (Fig. 4) et 12 mois (Fig. 5). Détection immunohistochimique avec plusieurs anticorps dirigés spécifiquement contre des épitopes différents du peptide A-β: anticorps 6E10 pour Aβ],ι7 (Figure 4A et 5A), Dako pour Aβ8-17 (Figure 4B et 5B), 4G8 pour Aβι7- 4 (Figure 4C et 5C), QCB pour Aβ i -42 (Figure 4D et 5D) et FCA 18 pour Aβtotal (Figure 4E et 5E).
Figure 6
Images représentatives des histologies Thioflavine S (Figure 6A) et Rouge Congo (Figure 6B) (colorations verte et rouge, respectivement) au niveau de la formation hippocampale chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) âgées de 12 mois. Démonstration de la conformation fibrillaire des dépôts A-β dans le cerveau de ces souris. A noter la morphologie variable des dépôts A-β; de forme sphérique (flèches) ou irrégulière (têtes de flèches) chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI).
Figure 7
Progression des dépôts A-β immunomarques avec l'anticorps anti-Aβ 4G8 chez la souris transgénique porteuse d'une double mutation (mutant APP/PSI). A noter la densité des dépôts A-β beaucoup plus forte à 12 mois d'âge (Cl, C2, C3) comparativement à 9 et 6 mois d'âge (Bl, B2, B3 et Al, A2, A3, respectivement). A noter également que les dépôts A-β sont essentiellement localisés dans une région cérébrale restreinte, principalement le subiculum chez la souris jeune (A1-A2), tandis qu'ils sont présents dans l'ensemble de la formation hippocampale et des régions corticales chez la souris âgée de 12 mois (Cl -C2). Les figures A2, B2, C2 et A3, B3, C3 représentent un plus fort grossissement des régions délimitées par un cadre noir dans les figures Al, Bl, Cl et des figures A2, B2, C2, respectivement. Hi: hippocampus, Ctx: cortex.
Figure 8
Nombre de dépôts A-β en fonction de l'âge (6, 9 et 12 mois) immunomarques avec l'anticorps anti-Aβ 4G8 et quantifiés, sur des coupes d'hémicerveau de 6 μm d'épaisseur (niveau rostrocaudal Bregma -3,4 de l'Atlas Stéréotaxique de Franklin et Paxinos), via l'utilisation d'un système d'analyse d'images couplé à une caméra couleur et un microscope (Q600, LEICA) chez la souris double transgénique APP6 5 SDL X PS1 M146 L.
Figure 9
Distribution régionale des dépôts A-β dans le cerveau d'une souris transgénique porteuse d'une double mutation (mutant APP/PSI) âgée de 12 mois. L'immunomarquage avec l'Ac anti-Aβ 4G8 a été réalisé sur des coupes de 25 μm correspondants à 6 niveaux représentatifs de l'axe rostrocaudal du cerveau de souris. A noter le nombre très élevé de dépôts A-β dans la formation hippocampale et l'ensemble des régions corticales.
Figure 10
Quantification chez toutes les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) âgées de 12 mois de la charge en A-β visualisée par immunohistochimie Aβ (Ac 4G8) sur coupes d'hémicerveau de 25 μm d'épaisseur (niveau rostrocaudal Bregma -3,4) (Figure 10 A). A noter la charge en A-β qui atteind plus de 3 et 1% de la surface totale de l'hippocampe et du cortex (Figure 10B), respectivement, et plus de 9 et 5% dans les régions les plus riches de ces deux structures cérébrales (Figure 10C). La charge en A-β est en revanche inférieure à 0,5% dans les régions sous-corticales.
1 : Cortex dorsal comprenant notamment le cortex primaire visuel et le cortex auditif
2 : Cortex ventral comprenant notamment le cortex ectorhinal et le cortex entorhinal
3 : Formation hippocampale
4 : Reste d'hémicerveau (structures subcorticales)
Figure 11
La figure 11A illustre la présence d'éléments neuritiques APP-immunoréactifs (têtes de flèches en 4) dans l'hippocampe des souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) (4) et de leur absence dans l'hippocampe des souris contrôles non transgéniques (1) et des souris transgéniques porteuses d'une simple mutation APP (mutant APP) (2) ou PSI (mutant PSI) (3). Chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI), les éléments neuritiques APP- immunoréactifs sont également présents dans toutes les régions corticales comme le montre la figure 1 IB, incluant le cortex entorhinal (a) et le cortex cingulaire (d), dans le gyrus denté et dans les régions hippocampales CA1 et CA3 (b,c). Les régions délimitées par un cadre noir sur les figures b, bl et b3 sont visualisées à plus fort grossissement en bl, en b2 et b3, et en b4, respectivement. A noter également le niveau d'expression très élevé de la protéine APP humaine dans certains corps cellulaires neuronaux (flèches en b2). La flèche en 1 , 2, 3 et 4 indique l'orientation de la tête du gyrus denté.
Figure 12
La figure 12A illustre la présence d'éléments neuritiques PSI -immunoréactifs (têtes de flèches en 4) dans l'hippocampe des souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) (4)et de leur absence dans l'hippocampe des souris contrôles non transgéniques (1) et des souris transgéniques porteuses d'une simple mutation APP (mutant APP) (2) ou PSI (mutant PSI) (3). Chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI), les éléments neuritiques PSI -immunoréactifs sont également présents dans toutes les régions corticales comme le montre la figure 12B, incluant le cortex entorhinal (a) et le cortex cingulaire (d), dans le gyrus denté et dans les régions hippocampales CAl et CA3 (b,c,e). Les régions délimitées par un cadre noir sur les figures c, d et e sont visualisées à plus fort grossissement en c', en d' et en e', respectivement. A noter également le niveau d'expression très élevé de la protéine PSI humaine dans certains corps cellulaires neuronaux en e' et d' (flèches).
Figure 13
Cette figure illustre la présence d'éléments neuritiques delta caténine-immunoréactifs dans l'hippocampe (Hi) et le cortex (Ctx) des souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) (bl, b2) et de leur absence dans les mêmes structures cérébrales chez les souris contrôles non transgéniques (al, a2). Les régions délimitées par un cadre noir sur les figures bl et b2 sont visualisées à plus fort grossissement en bla, blb et en b2a, b2b, respectivement. A noter que, de même que les éléments neuritiques APP- et PSI -immunoréactifs, les éléments neuritiques delta caténine-immunoréactifs apparaissent groupés en plaques de taille variable, petite, moyenne ou grande.
Figure 14
Eléments neuritiques synaptophysine-immunoréactifs chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) (Figure 14A) et chez l'homme atteint de AD (Figure 14B). A noter que, dans les deux cas, sur coupes de cerveau doublement immunomarquées, les éléments neuritiques synaptophysine- immunoréactifs (immunomarquage brun) entourent fortement les dépôts A-β (immunomarquage bleu).
Figure 15 Neurofilaments phosphorylés SMI-immunoréactifs chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) et chez l'homme atteint de AD. A noter que, dans les deux cas, sur coupes de cerveau doublement immunomarquées, les neurofilaments phosphorylés SMI-immunoréactifs (immunomarquage brun) entourent fortement les dépôts A-β (immunomarquage bleu).
Figure 16
Immunoréactivité tau-1 (immunomarquage brun) concentrée dans des éléments neuritiques incluant des neurites dystrophiques localisés autour ou à l'intérieur des dépôts A-β (immunomarquage bleu) et des corps cellulaires neuronaux (têtes de flèches) dans le cerveau des souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). Ni neurites dystrophiques, ni corps cellulaires immunoréactifs pour la protéine tau-1 ne sont présents chez les souris contrôles non transgéniques.
Figure 17
Astrocytes activés GFAP-immunoréactifs (immunomarquage brun) présents chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI) (Figure 17A) et chez l'homme atteint de AD (Figure 17B). A noter que, dans les deux cas, sur coupes de cerveau doublement immunomarquées, les astrocytes activés entourent certains dépôts A-β (immunomarquage bleu).
Figure 18
Les figures 18A à 18H illustrent l'expression Bax dans les neurones du gyrus denté (Figure 18 A, Figure 18E), des régions hippocampales CAl (Figure 18C, Figure 18G) et CA3 (Figure 18B, Figure 18F) et du cortex entorhinal (Figure 18D, Figure 18H) d'une souris contrôle non transgénique (Figure 18A à Figure 18D) et d'une souris transgénique porteuse d'une double mutation (mutant APP/PSI) (Figure 18E à 18H). A noter que des éléments neuritiques Bax-immunoréactifs (têtes de flèches) sont présents chez la souris double transgénique tandis qu'ils sont absents chez la souris contrôle non transgénique. Les figures 181 à 18L représentent un double immunomarquage permettant de visualiser l'expression de Bax (en brun) et les dépôts A-β (en bleu) sur une même coupe de gyrus denté (Figures 18K et 18 L) et de la région hippocampale CA3 (Figures 181 et 18 J) de souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). A noter que l'immunoréactivité Bax est concentrée dans des éléments neuritiques anormaux tels que des neurites dystrophiques intimement associés aux dépôts A-β (flèches). L'immunoréactivité Bax est également concentrée dans certains corps cellulaires anormaux qui apparaissent fortement immunomarques au niveau de leur cytoplasme périnucléaire et qui ressemblent aux neurones dits « sombres" (têtes de flèches noires). Elle apparaît également dans certaines cellules gliales qui rappellent les astrocytes activés (têtes de flèches blanches).
Figure 19
Eléments neuritiques Bax-immunoréactifs dans le cortex frontal d'un sujet humain contrôle (Figure 19A) et d'un sujet atteint de AD (Figure 19B à 19F). A noter, chez le sujet AD et non chez le contrôle, la présence d'éléments neuritiques Bax- immunoréactifs (immunomarquage brun) tels que des neurites dystrophiques (flèches) dont certains apparaissent intimement liés aux dépôts A-β (immunomarquage bleu) et des corps cellulaires anormaux présentant des zones de marquage très intenses dans le cytoplasme et les prolongements proximaux ressemblant ainsi à des dégénérescences neurofibrillaires (têtes de flèches).
Figure 20
Figures 20A et 20B : Images représentatives de l'expression du cytochrome C dans la région hippocampale CAl des souris contrôles non transgéniques (Figure 20A) et des souris transgéniques (Figure 20B) porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). A noter la présence d'éléments neuritiques cytochrome C-immunoréactifs (flèches) chez la souris double transgénique et leur absence chez la souris contrôle non transgénique. Figures 20C à 20H : images représentatives d'un double immunomarquage permettant de visualiser l'expression du cytochrome C (en brun) et les dépôts A-β (en bleu) sur une même coupe de gyrus denté, des régions hippocampales CAl et CA3 et du cortex cingulaire de souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). A noter que l'immunoréactivité cytochrome C est concentrée dans des éléments neuritiques anormaux tels que des neurites dystrophiques intimement associés aux dépôts A-β (flèches en b, c, d, e, f). L'immunoréactivité cytochrome C est également concentrée dans certains corps cellulaires anormaux qui apparaissent fortement immunomarques au niveaux de leur cytoplasme périnucléaire (têtes de flèches en c, d, f). Les images à fort grossissement en g et h montrent l'association intime des éléments cellulaires cytochrome C-immunoréactifs avec les dépôts A-β (flèches en g, h).
Figure 21
Eléments neuritiques cytochrome C-immunoréactifs dans le cortex frontal d'un sujet humain contrôle (Figure 21A) et d'un sujet atteint de AD (Figures 21B à 21F). A noter la présence, chez le sujet AD et non chez le contrôle, d'éléments neuritiques cytochrome C-immunoréactifs (immunomarquage brun) tels que des neurites dystrophiques (flèches) dont certains apparaissent intimement liés aux dépôts A-β (immunomarquage bleu) et des corps cellulaires anormaux présentant des zones de marquage très intense dans le cytoplasme et dans les prolongements proximaux ressemblant ainsi à des dégénérescences neurofibrillaires (têtes de flèches).
Figure 22
Double marquage immunofluorescent permettant de visualiser l'expression de Bax par fluorescence rhodamine en rouge (Figures 22A à C) et l'expression de l'APP, PSI ou SMI par fluorescence fluorescéine en vert (Figures 22D à F respectivement) sur la même coupe de cerveau de souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). A noter la présence de Bax et APP, de Bax et PSI au sein des mêmes éléments neuronaux (colocalisation dans les mêmes neurones et plaques), et pour contrôle, la colocalisaion des immunofluorescences Bax et SMI à l'intérieur ou autour des plaques et non dans les corps cellulaires. Le double marquage immunofluorescent (Figures 22G à 22H) montre la colocalisation du cytochrome C avec la delta caténine dans un nombre important d'éléments neuronaux (mais pas dans tous) dans le cerveau des souris doublement transgéniques. Les figures 221 et 22 J montrent le double marquage immunofluorescent de Bax et APP et leur colocalisation dans les éléments neuritiques à l'intérieur ou autour des plaques dans le tissu cérébral chez l'homme atteint de AD.
Figure 23
Double marquage immunofluorescent permettant de visualiser l'expression de Bax par fluorescence CY3 en rouge (Figures 23 A à 23C) et l'expression de l'APP, PSI ou cytochrome C par fluorescence fluorescéine en vert (respectivement Figures 23D, 23E et 23F) sur la même coupe de cerveau de souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). Confirmation de la colocalisation de Bax et APP, de Bax et PSI et de Bax et cytochrome C.
AI Matériels et Méthodes
1. Mutagénèse de PSI
La mutagénèse de PSI humaine a été faite via l'utilisation d'un système de mutagénèse in vitro, le Sculptor™ (Amersham, France). La région codante de PSI, incluant un motif consensus Kozak, a été sous-clonée dans le vecteur Bluscript (Stratagène) et les mutations ont été introduites selon le protocole fourni par le fabricant via l'utilisation d'oligonucléotides contenant la mutation désirée. Les séquences mutées ont été vérifiées par analyse de séquence. 2 Génération et identification des souris transgéniques PSI M146L
Pour la construction du transgène, le cDNA codant pour la PSI mutée humaine a été sous-clonée entre les sites de restriction Smal et BamHI du polylinker du vecteur d'expression transgénique HMG (Czech et al., 1997). Pour la microinjection, les séquences du vecteur ont été éliminées par restriction avec l'enzyme Notl et purification du fragment contenant la cassette d'expression par gel d'électrophorèse. Le fragment purifié a été dilué à la concentration finale de 2.5 ng/μl dans du Tris-HCl 10 mM (pH 7.4) EDTA 0.1 mM, et injecté dans un des deux pronucléi des embryons fertilisés de souris. Les embryons survivants ont été immédiatement transplantés dans l'oviducte de mères adoptrices (pseudopregnant). La présence du transgène chez les nouveaux nés a été déterminée soit par PCR soit par une analyse en Southern. La PCR a été réalisée avec des oligomères correspondant à la PSI humaine ( 5'-TAA TTG GTC CAT AAA AGG C- 3'; 5'-GCA CAG AAA GGG AGT CAC AAG-3') amplifiant un fragment de 550 bp. Pour le Southern-blot, un fragment 1.2-kb PstI - Sali du premier intron de la cassette d'expression de HMG, radiomarqué avec FalphaP-32- dCTP, a servi de sonde pour la détection du transgène et du gène HMG endogène, comme contrôle interne. Par l'ensemble de ces analyses, tout réarrangement majeur ou délétions du transgène dans les fondateurs et leur descendance peuvent être exclus.
3 Construction des vecteurs d'expression du transgène pour l 'APP
3.1 PDGF APP695SDL
Le plasmide contenant la cassette d'expression du promoteur PDGF a été linéarisé via l'endonucléase de restriction Sna Bl selon les procédures standards (Ausubel et al. ; Current Protocols in Mol. Biol.) pour générer une coupure à bouts francs afin de sous- clone l'ADNc de APP.
La mutagénèse de l'APP a été décrite précédemment (Czech et al. 1997). L' ADNc codant pour l'APP69 SDL humaine a été excisé du plasmide de clonage à l'aide des endonucléases de restriction Smal and CM,. Les extrémités cohésives générées par Clal ont été rendues à bout franc en traitant à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase. L'identité et l'intégrité de la construction PDGF APP6 5SDL a été vérifiée par analyse du patron de restriction et les jonctions entre les fragments de DNA fusionnés ont été contrôlées par séquençage partiel.
Un kit de préparation de plasmide (Qiagen) a été utilisé pour préparer du DNA superenroulé. Le transgène complet a été purifié comme décrit ci-dessus par digestion via l'enzyme de restriction Notl et séparation du fragment transgène par électrophorèse. Les aliquots destinés à la microinjection ont été dialyses contre un tampon TE (10 mM Tris pH 7.4 ; 0 .1 mM EDTA) sur un filtre flottant (Millipore ; type de membrane : VS ; 0 .025 μm) puis filtrés (Spin-X ; Costar ; membrane poly- acétate ; 0.22 μm). Le DΝA a été dilué à la concentration finale de 1 - 2 ng/ μl pour la microinjection.
3.2 APP75ιSDL
La mutagénèse de l'APP a été décrite précédemment (Czech et al. 1997) et les séquences de l'APP mutées ont été introduites dans le cDΝA APP75ι par insertion du fragment APP Sma I/Bgl II contenant l'exon 8 dans le vecteur Bluescript contenant les mutations. Pour générer la construction d'expression transgénique APP75ιSDL Thy-1, le cDΝA APP, du site Sma I (-95) au site Cla I (2699) a été clone dans un vecteur pBluescript modifié contenant des sites Sali de part et d'autre du site d'insertion. Le vecteur a été digéré avec Sal I et l'insert clone dans le vecteur Thy-1 murin en utilisant le site Xho I (Lϋthi et al. J Νeuroscience 17, 4688-4699). L'orientation correcte a été vérifiée par analyse de restriction et la construction séquencée aux sites de ligation. Pour la microinjection, la cassette a été linéarisée par restriction Νot I— Pvu I puis purification du fragment contenant le transgène.
3.3 APP75ιKozak SL La mutagénèse de l'APP a été décrite précédemment (Czech et al. 1997) et les séquences APP mutées ont été introduites dans le cDNA APP75ι par insertion du fragment APP Sma I/Bgl II avec l'exon 8 dans le vecteur Bluescript contenant les mutations. Pour optimiser le site d'initiation de traduction de l'APP, une séquence concensus Kozak optimisée a été introduite par mutagénèse dirigée par PCR. Pour la PCR, la combinaison d'oligonucléotides était: oligo sensé (région d'initiation): ccc ggg tcc ace atg ctg ccc ggt ttg g (séquence Kozak sous-lignée), oligo antisense: ttc agg gta gac ttc ttg gc. Le produit de la PCR a été clone dans pCR2 (Invitrogen, France), séquence puis sous-cloné dans le vecteur Bluescript contenant le cDNA APP75ιSL utilisant Sma I and Ace I, délétant ainsi le 5' UTR de l'APP et introduisant la séquence consensus Kozak. Pour générer la construction transgénique APP7 ι Kozak SL Thy-1, le cDNA APP ci-dessus, étendu en 3 ' to Cla I (2699), a été sous-cloné en vecteur Bluescript modifié contenant deux sites Sal I de part et d'autre de l'insert. Le vecteur a été digéré avec Sal I et l'insert clone dans le vecteur Thy-1 murin en utilisant le site Xho I (Lϋthi et al. J Neuroscience 17, 4688-4699). L'orientation correcte a été vérifiée par analyse de restriction et la construction séquencée aux sites de ligation. Pour la microinjection, la cassette a été linéarisée par restriction Not I— Pvu I puis purification du fragment contenant le transgène.
3.4 Génération des animaux transgéniques
Les animaux transgéniques ont été obtenus et identifiés selon des procédures standard déjà décrites (e.g. « Manipulating the Mouse Embryo » ; Hogan et al CSH Press ; Cold Spring Harbor. N.Y.).
4 Analyse par Western blot
Le tissu cérébral de souris transgéniques et de souris contrôles non transgéniques (littermate) a été homogénisé sur de la glace dans une solution de sucrose 0.32 M contenant des inhibiteurs de protéase (CompleteTM, Boehringer-Mannheim, Allemagne). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation à 4°C pendant 5 min à 1500g. La concentration en protéine dans le surnageant a été mesuré à l'aide du test de protéine BCA (Pierce, USA). Pour la détection de PSI, 25 μg d'extrait protéique ont été incubés à 56°C pendant 20 min dans du tampon de dépôt Laemmli contenant de l'urée 8mM et du dithiothreitol 50 mM. Pour la détection de l'APP et de l'A-β, 25μg d'extrait protéique ont été dénaturés à 95°C pendant 10 min dans 30 μl du tampon standard de dépôt Laemmli. Les protéines ont été fractionnées par électrophorèse sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE). Après transfert des protéines sur filtre de nitrocellose (Amersham, France), le filtre a été chauffé dans du PBS pendant 5 min afin d'augmenter la sensibilité et immédiatement saturé avec 5% (w/V) de lait écrémé en poudre dans du TBST 850mM Tris-HCl pH 8.1, 150 mM NaCl, 0.05% (V/V) Tween 20 pendant lh et incubé la nuit à 4°C avec l'Ac primaire en tampon TBST seul. La liaison de l'Ac a été détecté avec un Ac-anti IgG conjugué à la peroxidase de Raifort (Amersham, France) suivi d'un système de détection par chemiluminescence (Amersham, France) selon les instructions du fabricant. Pour la détection de PSI, l'Ac primaire MAB1563 (Chemicon, USA) a été utilisé à la dilution 1/10000 ; pour la détection de l'APP et l'A-β, l'anticorps WO-2 a été utilisé à la concentration 0,lμg/ml.
5 Anticorps utilisés pour l'immunohistochimie
Les anticorps (Ac) primaires qui ont été utilisés sont les suivants :
Ac monoclonal de souris anti-APP (1 :100 ; 22C11, Boehringer)
Ac monoclonal biotinylé de souris anti-Aβ ι7-24 (1 :200, clone 4G8, Senetek)
Ac monoclonal biotinylé de souris anti-Aβi-π (1 :200, clone 6E10, Senetek)
Ac monoclonal de souris anti-Aβ -ι7 (1 :100, clone 6F/3D, Dako)
Ac polyclonal de lapin anti-Aβ \ I (1 :300, QCB)
Ac polyclonal de lapin anti-Aβt0.ai (1:1000, FCA18 de Checler) Ac monoclonal de rat anti-PSl (1 :50, Chemicon)
Ac polyclonal de lapin anti-delta caténine (1 :2000, RPR)
Ac polyclonal de lapin anti-GFAP (1:3000, Dako)
Ac polyclonal de lapin anti-synaptophysine (1 :100, Dako)
Ac monoclonal de souris anti-neurofilaments phosphorylés (PNF) (SMI 312, 1 : 100, Sternberger)
Ac monoclonal de souris anύ-Tau-I (Tau, protéine associée aux microtubules) (5μg/ml, Boehringer Mannheim)
Ac polyclonal de lapin anti-Bax (PI 9, 1:300, Santa Cruz)
Ac monoclonal de souris anti-cytochrome C (clone 7H8.2C12, 1 :200, Pharmingen)
Les anticorps secondaires (1 :400, Vector) qui ont été utilisés sont des Ac anti-IgG de souris (H + L) pour les expériences impliquant l'utilisation d'Ac primaires de souris, et des Ac anti-IgG de lapin ou des anti-IgG de rat (H + L) pour les expériences impliquant l'utilisation d'Ac primaires de lapin ou de rat, respectivement. Dans certaines expériences de marquage immunofluorescent, l'Ac secondaire qui a été utilisé est un anti-IgG de lapin conjugué au fluorochrome CY3 (1/400, Vector),
6 Manipulation des animaux
Les animaux ont été hébergés dans des conditions de température et humidité contrôlées et soumis à un cycle de 12h de jour/ 12 heures de nuit (lumière 7 :00 EST). Les animaux avaient libre accès à l'alimentation et à l'eau. Les expérimentations sur ces animaux ont été réalisées avec l'accord du Comité d'Ethique de Rhône Poulenc Rorer sur le soin et l'utilisation des animaux, en conformité avec les standards du « Guide for the care and use of laboratory animais » (National Research Council ILAR) et dans le respect des règlements françaises et de la directive CEE. Les animaux utilisés pour les études neurohistopathologiques sont listés dans le tableau suivant:
7 Neurohistopathologie
7.1 Préparation du tissu cérébral
Les souris ont été profondément anesthésiées (Pentobarbital: 60 mg/ml/kg i.p., Kétamine: 40 mg/ml/kg i.p.) puis perfusées en transcardiaque avec du sérum physiologique puis du paraformaldéhyde (4% dans du PBS). Les cerveaux ont été ensuite prélevés puis postfixés dans la même solution de fixation 24h à 4°C. Après la fixation, les cerveaux ont été séparés en hémicerveaux droit et gauche puis soumis au protocole classique d'enrobage dans la paraffine. Les hémicerveaux gauches enrobés dans la paraffine des souris transgéniques et non transgéniques, et également des blocs de tissu de cerveau humain postmortem (cortex frontal) d'un sujet atteint de AD et d'un sujet contrôle (fournis par Dr J.P, Brion, Belgique), ont été coupés à 6 μm d'épaisseur (coupes sériées), via l'utilisation d'un microtome (LEICA RM 2155, France). Les blocs de tissu correspondants aux hémicerveaux droits des souris transgéniques et non transgéniques ont été coupés à une épaisseur de 25 um. Pour chaque expérience d'immunohistochimie, les coupes de cerveaux ont d'abord été déparaffinées avec du xylène et déshydratées dans de l'éthanol 100 %. Les coupes ont ensuite été incubées dans de 1Η202 (1% dans du méthanol) afin de bloquer les activités peroxidasiques endogènes, rincées dans de l'éthanol et du tampon citrate (10 Mm citrate de sodium, pH 6) et finalement placées dans un micro-ondes (650W, Whirlpool) pendant 2x 5 min dans la solution de citrate. Pour les expériences d'immunomarquage de la protéine A-β, les coupes ont été soumises à une étape supplémentaire, une incubation de 3 min dans l'acide formique à 80%.
7.2. Thioflavine S
Les coupes ont été colorées avec la thioflavine S 1% (Sigma, France) après avoir été incubées 10 min dans une solution d'hématoxyline de Mayer (Sigma, France) pour bloquer la fluorescence nucléaire. Elles ont ensuite été observées au microscope équipé d'un système de fluorescence (Axioscop Zeiss, France) via l'utilisation d'un filtre FITC.
7.3. Rouge Congo
Les coupes colorées au Rouge Congo (Kit de coloration de l'amyloïde, Accustain, Sigma, France) ont été analysées via un système de lumière polarisée. Seuls les dépôts rouges biréfringents (à la rotation du polariseur) ont été considérés comme des dépôts Congo rouge-positifs.
7.4. Marquage immunoenzymatique
Après une incubation de 30 min dans du tampon de blocage (sérum normal de chèvre (Chemicon) à 10% dans du PBS contenant 0,1% de triton (Sigma)), les coupes de cerveaux déparaffinées ont été incubées dans la solution d'Ac primaire (toute la nuit à 4°C). Après rinçages, les coupes ont été mises en présence de l'Ac secondaire biotinylé (pendant 2h à température ambiante) puis en présence du complexe avidin- biotin peroxidase selon les instructions du fabricant (Kit ABC Vectastin, Laboratoires Vector, Burlingame, CA). La 3-3'-diaminobenzydine a été utilisée comme chromogène pour l'enzyme peroxidase.
Pour les expériences de préabsorption, l'Ac anti-Bax (anticorps PI 9, Santa Cruz) a été incubé avec le peptide synthétique Bax (Contrôle peptide PI 9, Santa Cruz) (concentrations du peptide testées: 0,002, 0,02 et 0,2 mg/ml) pendant au moins 12 h avant d'être utilisé selon le protocole d'immunohistochimie décrit précédemment. L'Ac anti-cytochrome C (7H8.2C12, Pharmingen) a été incubé selon le même protocole avec du cytochrome C purifié exogène de coeur de cheval ou de rat (Sigma) (concentrations des protéines purifiées testées: 0,01 et 0,1 mg/ml).
7.5. Quantification de la charge en amyloïde
La déposition en A-β a été quantifiée sur des coupes d'hémicerveaux de 25 μm Aβ- immunomarquées (Ac monoclonal de souris biotinylé anti-Aβ ι7-24, 4G8, Senetek) via l'utilisation de la diaminobenzidine comme chromogène et d'un système d'analyse d'images couplé à une caméra couleur et à un microscope (Système Q600, LEICA). Des images vidéo de chaque région anatomique d'intérêt ont été capturées et un seuil de détection automatique du niveau de gris moyen correspondant à l'immunomarquage des dépôts A-β (et capable de discriminer le marquage spécifique du bruit de fond) a été défini. Un contrôle manuel de chaque champs a été effectué par l'expérimentateur afin d'éliminer manuellement tout artefact. Pour chaque souris, la charge en A-β a été mesurée au niveau rostrocaudal bregma -3,4 de l'atlas stéréotaxique de souris (Franklin et Paxinos). La charge en A-β est définie comme le pourcentage de la surface de l'immunomarquage A-β par rapport à la surface totale de la région cérébrale analysée, c'est-à-dire l'hippocampe, le cortex et le reste de la coupe (régions sous corticales).
7.6. Double marquage immunoenzymatique
Les expériences de double marquage immunohistochimique ont été réalisées par incubation des coupes de cerveau selon un protocole à deux étapes. Brièvement, les coupes ont été immunomarquées dans une première étape via l'utilisation d'un Ac primaire (par exemple: anti-GFAP, anti-synaptophysine, anti-Bax ou anti-cytochrome C) visualisé par un marquage brun via l'utilisation de la diaminobenzidine (substrat enzymatique de la peroxidase de Raifort) selon le protocole décrit précédemment. Les mêmes coupes ont été ensuite immunomarquées via l'utilisation de l'Ac primaire anti- Aβι7-24 (Ac monoclonal de souris, 4G8, Senetek) visualisé par un marquage bleu via l'utilisation du substrat SG de la peroxidase de Raifort (Kit Substrat SG de la peroxidase, Vector).
7.7. Double marquage immunofluorescent Dans certaines expériences, un double marquage immunofluorescent a été réalisé en particulier dans le but de démontrer si Bax colocalise avec APP, PSI, cytochrome C ou SMI dans des éléments neuritiques associés aux dépôts A-β chez les souris transgéniques porteuses d'une double mutation (mutant APP/PSI). Brièvement, les coupes ont d'abord été incubées dans l'Ac anti-Bax et révélées soit via l'utilisation d'un Ac secondaire biotinylé anti-IgG de lapin conjugué au CY3 (1 :400, Chemicon), soit via l'utilisation d'un Ac secondaire anti-IgG de lapin puis d'un kit d'amplification du signal (Complexe streptavidine-peroxidase /tétraméthyl-Rhodamide Tyramide) selon les instructions du fabricant (New England Nuclear). Pour le second marquage immunofluorescent, les coupes ont été incubées successivement avec un Ac primaire anti-APP, anti-PSI, anti-cytochrome C ou anti-SMI puis un Ac secondaire biotinylé anti-IgG de souris ou de rat. Les coupes ont été finalement révélées via l'utilisation d'un second système d'amplification du signal (Complexe streptavidine-peroxidase / Fluorescéine Tyramide) selon les instructions du fabricant (New England Nuclear). Les observations microscopiques des coupes ont été réalisées via l'utilisation des filtres CY3 ou rhodamine (excitation à 550 nm, émission à 570 nm) pour le marquage immunofluorescent Bax et du filtre fluorescéine (excitation à 495 nm, émission à 517nm) pour le deuxième marquage immunofluorescent. De la même manière, pour les expériences de double marquage immunofluorescent réalisées dans le but de démontrer si le cytochrome C colocalise avec la protéine delta caténine, les coupes ont été dans un premier temps incubées dans l'Ac anti-cytochrome C et révélées via le système de fluorescence Rhodamine. Dans une deuxième étape ces mêmes coupes ont été incubées dans l'Ac anti-delta caténine et révélées via le système de fluorescence Fluorescéine comme décrit ci-dessus.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Analyse des niveaux d'expression du transgène
1.1 Comparaison des niveaux d'expression du transgène dans différentes souris transgéniques exprimant l'APP mutée
Les homogénats de cerveau de différentes lignées de souris transgéniques (différentes constructions d'expression) ont été analysés par Western blot pour l'expression de l'APP, via l'utilisation d'un anticorps monoclonal WO-2. Cet anticorps est spécialement indiqué car il reconnaît l'APP et l'A-β humaines mais ne reconnaît pas l'APP endogène de souris. Aucun signal n'a été en effet détecté dans la piste correspondant à la souris non transgénique (Fig. 1, piste 3). Les pistes 1 et 2 de la figure 1 correspondent aux extraits de cerveaux de souris transgéniques précédemment montrées exprimant des niveaux élevés du transgène APP (Moechard et al.1999a). Les souris transgéniques PDGF APP695SDL dans la piste 7 ont été utilisées pour produire des lignées de souris doubles transgéniques avec les souris porteuses du transgène PSI M146L. Un niveau modéré de l'expression de l'APP est visible chez les souris avec le promoteur HMG dans la construction (Czech et al. 1997). A noter que chez les souris transgéniques pour la forme mutation suédoise de l'APP, le fragment béta-secrétase (12 KDa) est augmenté relativement à l'holoprotéine APP complète.
1.2 Analyse par Western blot de l'expression et du processing du transgène dans le cerveau de souris double transgéniques APP et Présénilines.
Afin de savoir si l'expression de chaque transgène individuel était modifié dans les souris portant les deux transgènes (obtenues par croisement), des homogénats de cerveaux de souris double transgéniques à différents âges ont été analysés par Western blot pour l'expression de l'APP et de l'A-β via l'utilisation de l'anticorps monoclonal WO-2 (décrit ci-dessus). Aucune différence d'intensité des bandes correspondant à la séquence complète de l'APP à HOkDa et au fragment amino terminal de 12 kDa n'est visible entre la souris PDGF- APP695 SDL (monotrangéniques) et les souris double transgéniques APP695SDL x PS1M146L (Fig 2 A, comparer aussi avec la piste7, Fig.l). De plus, l'âge des souris transgéniques n'influence pas l'expression du transgène APP ni son métabolisme au niveau du site de clivage béta. Néanmoins, il y a une forte accumulation de l'A-β à 9 mois et débutant à l'âge de 6 mois. Cette augmentation de l'A-β est bien corrélée avec le début de la formation des plaques amyloïdes dans le cerveau des souris transgéniques (voir ci-dessous). Ceci suggère que l'augmentation de l'A-β détectée par western blot peut correspondre à l'A-β accumulée dans les plaques amyloïdes. Une autre analyse par Western blot sur homogénats de cerveaux a été réalisée afin de déterminer si la protéine PSI humaine est exprimée chez les souris double transgéniques et chez les souris contrôles (littermate) non transgéniques. Un Ac monoclonal dirigé contre la partie amino-terminale de PSI a été utilisé. Cet Ac est spécifique pour la PSI humaine; aucun signal de la protéine PSI endogène n'est détecté dans l'homogénat cérébral de la souris APP simple mutante (Fig. 2B, pistes 1, 2). Le fragment PSI amino-terminal caractéristique est détecté dans le cerveau de la souris exprimant PS1M146L (Fig_2B, pistes 3-7) avec l'apparition de l'holoprotéine complète (approx. 51 kDa) PS1M146L vraisemblablement due à la saturation du processing des présénilines, comme cela a été décrit précédemment chez le rat et la souris transgéniques exprimant des quantités élevées de PSI (Czech et al., 1998; Thinakaran et al., 1996). L'expression et le processing de la PSI humaine chez la souris double transgénique ne varient pas avec l'âge de l'animal. En conclusion, les niveaux d'expresssion des transgène individuels (APP ou PSI) sont similaires dans les souris mono et double transgéniques.
EXEMPLE 2 : Localisation et expression régionale des transgènes chez les souris simple (PDGF APP695SDL ou HMG PS1M146L) ou double (PDGF APP695SDLx HMG PS1M146L).
Les expériences d'immunohistochimie de l'APP, utilisant l'Ac monoclonal de souris dirigé contre la protéine APP (Ac 22C11), ont montré que les souris simple (PDGF APP695SDL) et double (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L) transgéniques expriment plus fortement la protéine APP que les souris contrôles non transgéniques (Fig. 3). Ce résultat confirme que ces deux lignées de souris transgéniques expriment la protéine APP humaine codée par le transgène APP695SDL. L'APP humaine est localisée exclusivement dans les neurones. Son pattern d'expression est similaire dans les deux lignées de souris transgéniques et concerne de nombreuses structures cérébrales; le niveau d'expression le plus élevé étant observé dans les couches neuronales de la formation hippocampale (Fig. 3), suivi d'une expression homogène dans les régions corticales tel que le cortex entorhinal et dans l'amygdala. Les régions sous-corticales montrent un niveau d'expression plus faible du transgène et la protéine APP humaine n'est pas détectée ni dans les cellules gliales ni au niveau vasculaire.
De la même manière, les expériences d'immunohistochimie de PSI, utilisant l'Ac monoclonal de rat dirigé contre la protéine PSI humaine (Ac qui reconnaît spécifiquement la PSI humaine), ont montré que les souris simple (HMG PSI M146L) et double (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L) transgéniques expriment la protéine PSI humaine dans le cerveau avec une localisation spécifique dans les neurones (Fig. 3), bien que certaines cellules gliales immunomarquées soient occasionnellement observées. Le pattern d'expression de la protéine PSI humaine est similaire dans les deux lignées de souris transgéniques. Son niveau d'expression est élevé dans les structures corticales telles que la formation hippocampale (Fig. 3) et différentes régions du cortex et aussi dans les régions sous-corticales. Elle n'est pas exprimée dans la substance blanche. A la fois pour la protéine APP humaine et pour la protéine PSI humaine, ni le pattern ni le niveau d'expression ne changent avec l'âge (de 6 à 12 mois).
EXEMPLE 3 . Mise en évidence d'un processus accéléré de déposition de l'amyloïde dans le cerveau des souris double transgéniques porteuses à la fois de la protéine APP mutante et de la protéine PSI mutante (PDGF APP69SSDL x HMG PS1M146L) Afin de démontrer si les différents modèles de souris transgéniques générés développent des dépôts A-β dans le cerveau, nous avons utilisé à la fois différents Ac anti-Aβ (voir Matériel et Méthodes) et des marqueurs histologiques classiques (Thioflavine S et Rouge Congo) connus pour colorés les dépôts A-β dans le tissu humain de sujets atteints de AD.
En utilisant l'ensemble de ces marqueurs des dépôts A-β, nous avons démontré qu'aucune des souris simple transgéniques, PDGF APP69 SDL ou HMG PS1M146L, ne présente de déposition d'amyloïde dans le cerveau aux âges 3, 6, 9, 12 et 15 mois. En revanche, les souris double transgéniques PDGF APP695SDL x HMGPS1M146L présentent des dépôts A-β dès l'âge de 6 mois. L'existence d'un tel processus de déposition de la protéine amyloïde est démontrée avec les différents Ac anti-Aβ utilisés (Fig. 4 et 5). Ces dépôts A-β sont également colorés par la Thioflavine S et le Rouge Congo, confirmant ainsi leur conformation fibrillaire (Fig.6).
EXEMPLE 4 : Progression et profil régional de la déposition de l'amyloïde chez les souris double transgéniques (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L)
Dans le but d'évaluer la progression et le profil de distribution régionale de la déposition de l'amyloïde résultant de l'expression du transgène chez les souris doubles transgéniques (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L), le nombre de dépôts A-β sur des coupes d'hémicerveau de 6 μm d'épaisseur à différents âges et la charge en amyloïde sur des coupes de 25 μm d'épaisseur à l'âge de 12 mois ont été quantifiés via l'utilisation de l'Ac anti-Aβ 4G8. Pour la quantification de la charge en amyloïde, nous nous sommes focalisés sur le cortex et l'hippocampe car ce sont deux structures cérébrales impliquées de manière précoce et prédominante dans la neuropathologie chez les souris transgéniques et chez l'homme atteint de AD.
Le nombre de dépôts A-β est plus élevé chez les souris à 12 mois que chez les souris âgées de 6 et 9 mois, comme le montre de manière qualitative et quantitative les figures 7 et 8, respectivement. Les dépôts A-β, à 6 et 9 mois, sont localisés dans une région cérébrale restreinte correspondant au subiculum et à la portion dorsale de la région hippocampale CAl (Fig.7). En revanche, à 12 mois, les dépôts A-β plus nombreux sont localisés dans l'ensemble les régions hippocampales et corticales tout le long de l'axe rostrocaudal du cerveau (Fig. 7 et Fig. 9). Chez les souris âgées de 12 mois, les dépôts A-β sont présents seulement occasionnellement dans certaines structures sous-corticales (par exemple, la capsule interne, le thalamus dorsolatéral et les ganglions de la base). Ils ne sont présents ni dans le cervelet, ni dans la moelle épinière. L'analyse quantitative de la charge en amyloïde chez les souris âgées de 12 mois (Fig. 10) montre que les pourcentages de la surface de l'immunomarquage Aβ par rapport à la surface totale de la région analysée atteignent des valeurs de 3,1; de 0,8 à 1,1 et <0,5 pour l'hippocampe, le cortex et le reste de l' hémicerveau, respectivement. La charge en amyloïde atteint plus de 9% et 5% dans les champs les plus riches de l'hippocampe et du cortex, respectivement. De telles charges en amyloïde sont situées dans un ordre de valeur similaire à celui décrits précédemment dans le cerveau humain AD (6-12%) (Hyman et al., 1993).
EXEMPLE 5 : Eléments neuritiques chez la souris double transgénique (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L)
Dans toutes les souris transgéniques qui développent des dépôts A-β, les dépôts de grande et moyenne tailles contiennent de nombreux éléments neuritiques, comme le montrent d'une part les images de simples immunomarquages avec différents marqueurs des neurites dystrophiques telles que l'APP (Fig. 11), la PSI (Fig. 12) et la delta caténine (Fig.13) et d'autre part les images de doubles immunomarquages, qui permettent de visualiser, sur une même coupe de cerveau, les dépôts A-β avec l'Ac anti-Aβ 4G8 et les éléments neuritiques avec l'Ac anti-synaptophysine ou anti-SMI (Fig. 14 et Fig. 15, respectivement). Comme illustré sur les figures 14 et 15, des éléments neuritiques synaptophysine- et SMI-immunoréactifs sont présents dans le cerveau des souris double transgéniques et ils sont intimement associés aux dépôts A- β. De plus, nos résultats montrent que les éléments neuritiques sont très similaires à ceux décrits dans le cerveau humain AD.
Afin de démontrer si des dégénérescences neurofibrillaires sont aussi présentes dans le cerveau des souris double transgéniques, un double immunomarquage a été réalisé pour visualiser, sur une même coupe de cerveau, les dépôts A-β avec l'Ac anti-Aβ 4G8 et les dégénérescences neurofibrillaires avec l'Ac anύ-Tau-I. Comme illustré sur la figure 16, l'Ac anύ-Tau-1 marque les éléments neuritiques tels que les neurites qui tapissent les dépôts A-β et les corps cellulaires anormaux. Ces deux types d'éléments immunomarques sont présents dans les régions cérébrales riches en dépôts A-β (formation hippocampale et cortex) tandis qu'ils sont absents dans les régions sous- corticales pauvres ou dépourvues de dépôts A-β.
L'ensemble de ces résultats démontre clairement que des processus dégénératifs, en plus du phénomène de déposition d'amyloïde, se produisent au sein des structures cognitives chez les souris double transgéniques et ceci de façon similaire à ceux présents dans le cerveau AD.
EXEMPLE 6 : Présence d'astrocytes activés à l'intérieur ou autour des dépôts amyloïdes chez la souris double transgénique (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L)
Dans la mesure où les dépôts A-β dans le tissu cérébral AD sont associés avec des cellules gliales (les cellules inflammatoires du système nerveux central), il a été examiné si une réaction gliale dans le neuropil se produit chez nos souris transgéniques qui développent des dépôts A-β. Aucun astrocyte réactif GFAP- immunoréactif dans le cerveau ni des souris contrôles non transgéniques, ni des souris transgéniques qui ne développent pas de dépôts A-β (par exemple les souris simple transgéniques PDGF APP695SDL ou HMG PS1M146L) n'a été observé. En revanche, toutes les souris double transgéniques avec des dépôts A-β dans leur cerveau ont des astrocytes réactifs GFAP-immunoréactifs intimement associés aux dépôts A-β (Fig. 17).
EXEMPLE 7 : Mise en évidence d'un dysfonctionnement mitochondrial chez la souris double transgénique (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L)
Un immunomarquage simple a été réalisé pour visualiser la protéine Bax seule et un immunomarquage double pour visualiser, sur une même coupe de cerveau, la protéine Bax et les dépôts A-β; ceci dans le but de déterminer une relation entre l'expression de Bax et les plaques amyloïdes.
Les résultats du simple marquage ont montré que, chez les souris contrôles non transgéniques et aussi chez les souris transgéniques, la protéine Bax est exprimée dans les neurones de nombreuses structures cérébrales, telles que les couches neuronales de la formation hippocampale et toutes les régions corticales (Fig. 18A à H). Néanmoins, seules les souris double transgéniques (PDGF APP695SDL x HMG PS1M146L), et non les souris simple transgéniques (PDGF APP695SDL or HMG PS1M146L) ou contrôles non transgéniques, montrent une immunoréactivité Bax dans des éléments cellulaires tels que des neurites dystrophiques (Fig.l8A à H), des corps cellulaires neuronaux semblables à des dégénérescences neurofibrillaires précoces, et occasionnellement des cellules gliales activées (voir ci-dessous). De façon intéressante, ces éléments cellulaires Bax-immunoréactifs anormaux sont localisés exclusivement dans des régions cérébrales riches en dépôts A-β, comme le gyrus denté, les régions hippocampales CAl et CA3, le subiculum, et les cortex cingulaire et entorhinal.
Le double immunomarquage avec les Ac anti-Bax et anti-Aβ a confirmé dans un deuxième temps que l'immunoréactivité Bax dans les éléments neuritiques et les cellules gliales activées sont intimement associés aux dépôts A-β chez les animaux double transgéniques (Fig.181 à L). De tels éléments cellulaires Bax-immunoréactifs n'ont jamais été détectés dans le cerveau des animaux non transgéniques ou simples transgéniques. Dans ces études, l'immunomarquage Bax est spécifique comme l'ont démontré les expériences de préabsorption avec un peptide bloquant.
Les résultats de simple immunomarquage du cytochrome C ont montré que la protéine cytochrome C est exprimée dans les corps cellulaires neuronaux chez les 4 groupes d'animaux examinés (contrôles non transgéniques, simple et double transgéniques- tableau I). Le pattern de distribution des neurones cytochrome C- immunoréactifs est similaire à celui décrit pour Bax. De façon intéressante, comme pour Bax, l'expression du cytochrome C est démontrée dans des éléments cellulaires tels que des neurites et des corps cellulaires neuronaux anormaux (Fig. 20) uniquement chez la souris double transgénique. Ces éléments cellulaires cytochrome C-immunoréactifs ne sont jamais observés chez les souris simple transgéniques ou contrôle non transgénique (Fig. 20). Chez les souris double transgéniques, les éléments neuritiques cytochrome C-immunoréactifs, comme les éléments neuritiques Bax-immunoréactifs, sont localisés dans les structures cérébrales dans lesquelles les dépôts A-β sont présents, principalement le gyrus denté, les régions hippocampales CAl et CA3, les cortex cingulaire (Fig. 20). Le double immunomarquage du cytochrome C et des dépôts A-β montre que les éléments neuritiques cytochrome C- immunoréactifs chez ces animaux double transgéniques sont intimement associés aux plaques amyloïdes (Fig.20). De la même manière que l'immunomarquage Bax, l'immunomarquage cytochrome C est spécifique comme l'ont démontré les expériences de préabsorption avec des protéines cytochrome C purifiées.
En parallèle aux expériences menées sur les souris transgéniques, les doubles immunomarquages Bax/Aβ et cytochrome C/Aβ ont été réalisés sur du tissu de cerveau humain postmortem d'un individu contrôle et d'un sujet AD. Les résultats obtenus (Fig. 19 et Fig.21) montrent que, dans le cerveau humain AD, les éléments neuritiques Bax- ou cytochrome C-immunoréactifs tels que des neurites dystrophiques et des neurodégénérescences neurofibrillaires précoces sont présents à l'intérieur ou autour des plaques amyloïdes. Les éléments neuronaux anormaux, Bax- et cytochrome C-immunoréactifs n'ont pas été observés dans le tissu humain contrôle.
Afin de confirmer la présence dans le cerveau de souris double transgéniques des protéines Bax et cytochrome C dans des éléments neuritiques anormaux, des doubles marquages immunofluorescents ont également été réalisés, lesquels ont permis de démontrer la colocalisation de Bax avec l'APP, la PSI et le cytochrome C dans les mêmes éléments neuritiques qui tapissent les dépôts A-β (Fig. 22et 23). Enfin la colocalisation du cytochrome C avec la delta caténine dans ces mêmes éléments neuritiques a été montrée (Fig. 22).
Le fait que, Bax et cytochrome C soient surexprimées dans les éléments neuritiques tels que des neurites et des corps cellulaires neuronaux anormaux aussi bien dans le cerveau humain AD que dans le cerveau des souris double transgéniques, démontre l'implication de ces protéines dans la régulation d'événements précoces associés à la mort neuronale chez l'homme AD et dans ce modèle de souris transgéniques.
Ces données chez la souris sont les premières à démontrer que l'expression de deux protéines mitochondriales différentes, Bax et cytochrome C connues pour induire la mort cellulaire en culture (voir introduction), est altérée dans le cerveau de souris transgéniques qui développent des dépôts A-β. Cette expression modifiée de Bax et cytochrome C consiste en l'accumulation des ces deux marqueurs mitochondriaux dans des éléments neuronaux anormaux qui sont intimement associés aux plaques amyloïdes. Un point important est que les éléments neuritiques Bax et cytochrome C- immunoréactifs chez la souris double transgénique sont semblables à ceux observés dans le cerveau humain AD, ceci indiquant que le même type de dysfonctionnement mitochondrial est trouvé chez l'homme AD.
Tableau I
o
REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Modèle animal transgénique non-humain de la maladie d'Alzheimer présentant à la fois des plaques amyloïdes et un dysfonctionnement mitochondrial.
2. Modèle animal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il coexprime le précurseur du peptide β-amyloïde (APP) et une préséniline, de préférence la préséniline 1 (PSI).
3. Modèle animal selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il coexprime des formes mutées de l'APP et/ou de PS 1.
4. Modèle animal selon la revendication 3, caractérisé en ce que la mutation dans le gène de l'APP est choisie parmi les mutations "Swedisch", "London" et "Dutch" seules ou en combinaison.
5. Modèle animal selon la revendication 3, caractérisé en ce que la mutation dans le gène de la PSI est choisie parmi les mutations M146L, A246E, C410Y, H163R, L286V, L235P, seule ou en combinaison.
6. Modèle animal la revendication 5, caractérisé en ce que la mutation est M146L.
7. Modèle animal selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dysfonctionnement mitochondrial correspond à une altération, une modification, une surexpression ou une inhibition de l'expression des protéines mitochondriales.
8. Modèle animal selon la revendication 7, caractérisé en ce que les protéines sont intramitochondriales.
9. Modèle selon la revendication 8, caractérisé en ceque les protéines sont les protéines BAX et/ou cytochrome C.
10. Utilisation du modèle animal tel que décrit selon les revendications 1 à 9 pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives, de préférence la maladie d'Alzheimer.
1 1. Cellule extraite d'un modèle animal tel que décrit selon les revendications 1 à 9.
12. Utilisation d'une cellule telle que décrite selon la revendication 11, pour la mise en évidence de composés destinés au traitement des maladies neurodégénératives, de préférence la maladie d'Alzheimer.
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