JPH09511398A

JPH09511398A - ミトコンドリアの欠陥に関連する病気の診断、治療、並びに細胞および動物モデル

Info

Publication number: JPH09511398A
Application number: JP7525887A
Authority: JP
Inventors: ヘレンスタッド，コリーナ; デイビスパーカー，ウィリアム; イー．デイビス，ロバート; ウィリアムミラー，スコット
Original assignee: ミトコアー
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1997-11-18
Also published as: AU2204295A; US20010021526A1; MX9604400A; NZ283660A; NO964073D0; BR9507241A; CA2186636A1; EP0751951A1; FI963884A0; NO964073L; AU705230B2; WO1995026973A1; CN1150433A; EP0751951A4; FI963884A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病（AD）、真性糖尿病、パーキンソン氏病及びミトコンドリア起原の他の疾病を引き起こす、ミトコンドリアｃオキシダーゼ遺伝子における遺伝子突然変異に関する。本発明は、臨床学的な徴候の開始の前又は後でそれらの突然変異を検出するための方法を提供する。本発明はさらに、シトクロムｃオキシダーゼが機能不全の処置も提供する。ミトコンドリア欠陥に関連する障害の研究のためのモデル系として利用されるサイブリッド細胞系もまた記載される。サイブリッドは、ミトコンドリア電子輸送を不可逆的に無能にする剤により不滅細胞系を処理し、そして次に、前記細胞を疾病組織サンプルから単離されたミトコンドリアによりトランスフェクトすることによって構成される。１つのそのようなサイブリッドは、神経芽腫細胞及びアルツハイマー病の患者からのミトコンドリアを用いて構成される。薬物をスクリーニングするためへのそのようなサイブリッドの使用法及びそのような疾病の処理への使用法がまた、提供される。さらに、サイブリッド動物、それらを生成するための方法、及び薬物及びスクリーニング療法へのそれらの使用法かまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ミトコンドリアの欠陥に関連する病気の診断、治療、並びに細胞および動物モデル発明の分野本発明は、ミトコンドリアに原因がある病気の診断と治療に関する。より詳しくは、本発明は、アルツハイマー病および真性糖尿病（以下、糖尿病）を診断するための手段としてミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子中の遺伝的変異を検出し、そしてアルツハイマー病や糖尿病の治療においてそれらの変異をまたはそれらの変異の作用を抑制することに関する。本発明は一般的に、ミトコンドリアの機能の欠陥に関係する病気のためのモデル系にも関し、ここで前記欠陥はそれらのミトコンドリアの遺伝子中の欠陥から生じるものである。本発明はまた、薬剤をスクリーニングするためとそれらの病気の治療の効果を評価するためのモデル系の使用にも関する。本発明はそのような病気の診断のためのそれらのモデル系の使用にも関する。発明の背景アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の別々の領域中のニューロンの減少および／または萎縮により特徴付けられ、β−アミロイドの細胞外沈着と神経原繊維のもつれの細胞内蓄積を伴う、進行性神経変性疾患である。それは世界中で1300万人以上の人がかかっている唯一の病気である。それは唯一悲惨な病気でもある。正常で生産的な生活を送っていた多くの人が歳をとるにつれて次第にＡＤに冒され、その病気が彼らの記憶や他の精神機能を徐々に奪ってしまう。ついには、家族や親しい人を認識することさえもしなくなり、しばしば最後の死に至るまでずっと世話をしなければならない。アルツハイマー病は、症候面を除いて、不治であり且つ治療不可能である。アルツハイマー病にかかった人は、この病気の２つの型：「家族性」ＡＤと「散在性」ＡＤのうちの一方を有するかもしれない。家族性アルツハイマー病は、全アルツハイマー症例のわずか約５〜10％を占め、異常に早発性で、一般に50才より前に発病する。家族性ＡＤは遺伝し、メンデル遺伝の通常パターンに従う。この型のＡＤは核の染色体異常に関連づけられている。対比して、アルツハイマー病の第二の型である散在性ＡＤは、遺伝しないし核の染色体異常によって引き起こされるのでもない晩発性の病気である。該病気の晩発型は、アルツハイマー病のずっと一般的な型であり、全アルツハイマー病の約90〜95％を占めると思われる。現在まで、可能なアルツハイマー病の診断は臨床所見によるだけであり、排除の診断である。不運にも、限定的な診断は検死時の病理検査によってのみ行うことができる。プロテアーゼネキシンIIやアポリポタンパクＥ対立遺伝子をはじめとする或る種の生物学的マーカーの相違を識別することによってアルツハイマー病を診断する試みは行われているが、このアプローチは成功しなかった。ＡＤ患者における不完全な浸透度、または正常集団もしくは他の病気集団中への交差が、生物学的マーカーの同定を信頼できない診断方法にしてしまった。更に、臨床検査での現在の療法は、病気の症状を治療するために考案されるのであって根本となるＡＤの病因に影響を与えるためではない。それらの治療法としてはCognex ，E2020 および当業界で知られる他の同様な薬剤が挙げられる。しかしながら、ＡＤの病因の原発性現象はいまだ解明されておらず、合理的な治療法も考案されていない。パーキンソン病（ＰＤ）は、脳の黒質の緻密部におけるドーパミン含有ニューロンの減少および／または萎縮により特徴づけられる。ＡＤと同じく、ＰＤも老人を苦しめる。この病気は運動緩徐（遅い動き）、硬直および静止時振せんにより特徴づけられる。Ｌ−ドーパ治療はしばらくの間は大部分の患者の振せんを減らすが、結局はますます振せんが抑えられなくなり、患者は一人で食べたり、自身の基本衛生の要求を満たしたりすることさえも困難または不可能になる。糖尿病は先進国の人口の５〜10％を冒している一般的な変性疾患である。それは強い遺伝成分を有する異質性疾患であり、母性遺伝が重要な要因である。一卵性双生児は高度に一致しており、発病した個体の第一級親類の中のこの病気の発生率は高い。伝えられるところによれば、母性遺伝は糖尿病を発病する傾向に貢献する。 Alcolado，J.C.およびAlcolado，R.，Br．Med．J．302: 1178-1180(1991)；Reny ，S.L.，International J．Epidem. 23: 886-890(1994)。糖尿病は幾つかの関連疾患が先行するかまたはそれと関連づけられ得ることが研究により示されている。例えば、米国の4000万人が晩発性欠陥グルコース耐性（ＩＧＴ）にかかっていると推定される。ＩＧＴ患者はグルコースに応答することができず、増加したインスリン分泌を有する。ＩＧＴ患者の数パーセント（５〜10％）はインスリン欠損性インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）に進行する。それらの個体のうちのある者はインスリン依存性糖尿病（IDDM）に更に進行する。この型のNIDDM またはIDDMは、膵臓β細胞によるインスリンの放出の減少および／またはインスリンに対する終末器応答の減少と関連づけられる。糖尿病の他の症状および糖尿病に先行するかまたはそれと関連づけられる状態としては、脈管異常、末梢神経障害および感覚神経障害、失明並びに難聴が挙げられる。核ゲノムは糖尿病、ＡＤおよびＰＤの原因となる遺伝子変異の探索の主な焦点であった。しかしながら、懸命な努力にもかかわらず、糖尿病、ＡＤ、ＰＤと共に分離する核遺伝子は稀であり、例えばインスリン遺伝子、インスリン受容体遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子中の変異である。 Leber の遺伝性視覚神経障害、ミオクローヌス、癲癇、乳酸アシドーシスおよび発作（MELAS）並びにミオクローヌス性癲癇の不揃い赤筋繊維症候群のような幾つかの変性病は、ミトコンドリアＤＮＡ変異を通して遺伝することが知られている。ミトコンドリアＤＮＡ変異は、パーキンソン病やアルツハイマー病のような或る種の神経学的変性障害の見かけ上「散在性の」（非メンデル式の）発生を説明する際にも関係づけられている。実際、ＰＤの大部分は集団中に散在的に現れ、双生児であっても、一人が病気でありもう一人はそうでないことがある。これは、核の染色体異常がこの病気の原因でないことを暗示する。更に、神経毒である１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（MPTP ）が動物やヒトにおいてパーキンソン病を誘発することが示されている。MPTPはドーパミンニューロン中でそれの活性代謝産物MPP+に変換され、次いでそれがミトコンドリア中に濃縮されるようになる。MPP+は次いで酵素NADH：ユビキノンオキシドレダクターゼ（「複合体Ｉ」）を選択的に阻害し、それが遊離基の生産の増加、アデノシン三リン酸の生産の低下、ついには冒されたドーパミンニューロンの死を引き起こす。加えて、糖尿病に関係する母性遺伝は、ミトコンドリアの遺伝が役割を果たしているかもしれないことを示唆する。実際、感音難聴に関連する晩発性NIDDM の稀な形態は、ミトコンドリアtRNA遺伝子中の点変異（tRNA^leu）と共に分離するようである。この変異を有する個体はしばしばグルコースに応答して欠陥性のインスリン分泌を提供し、通常はインスリン依存性糖尿病（IDDM）、緩進行性IDDMまたはインスリン欠損性インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）の診断を与えられる。この変異はNIDDM 症例の１％未満を占めるけれども、それはmt DNA 中の他の変異がNIDDM に関係するかもしれないという可能性を高める。ミトコンドリアゲノムによりコードされるタンパク質は電子伝達系の成分であるが、パーキンソン病やアルツハイマー病では電子伝達機能の欠損が報告されている。特に、真核細胞のミトコンドリア中に存在する電子伝達系の重要な末端成分であるチトクロームｃオキシダーゼの欠陥が、アルツハイマー病に係わっているかもしれないということが報告されている。ＡＤとチトクロームｃオキシダーゼとの関連を示唆する１つの報告は、アルツハイマー病患者が低下したチロクロームｃオキシダーゼ活性を有することを発見した、Parker他，Neurology 40: 1302-1303（1990）である。ミトコンドリア電子伝達系（ＥＴＣ）の一部を構成する酵素チトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）は、ＡＤ患者でも正常な量で存在する。しかしながら、ＡＤ患者と検死時のＡＤ患者の脳におけるこの酵素の触媒活性は異常に低いことが観察された。このことは、ＡＤ患者のＣＯＸ遺伝子に欠陥があり、それがある様式でＡＤに特徴的な症候群を引き起こすかまたはそれに貢献する減少した触媒活性となることを示唆する。Bennett 他，J. Geriatric Psychiatry and Neurology 5:93-101（1992 ）により、チトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）の特異的阻害剤であるアジ化ナトリウムをラットに注入すると、ラットが記憶と学習の障害（痴呆の一形態）を受けたことも示された。このラットはヒトのアルツハイマー病の結果を模倣した。加えて、アジ化ナトリウムで処理したラットは長期増強作用を示すことができず、これはニューロンの柔軟性の損失を証明する。チトクロームｃオキシダーゼ活性の減少が酸素遊離基の細胞内レベルの増加を引き起こし、そして遊離基により媒介される脂質酸化の蓄積効果が最終的にＡＤに特徴的な神経学的変性変化を引き起こすと仮定されている。Wallace，D.C.，Science 256:628-632（199 2）。それらの所見にもかかわらず、本発明より前には、アルツハイマー病、パーキンソン病、または晩発性糖尿病をはじめとする真性糖尿病の幾つかの形態について、電子伝達機能障害を生じる正確な機構は知られていなかった。それらの機能障害の遺伝的または構造的根拠も同定されていなかった。何がそれらの電子伝達機能障害を引き起こすか、特にその遺伝的または構造的根拠を知らずにして、それらの病気を診断することは難しい。従って明らかに、極初期段階でのＡＤ，ＰＤおよび糖尿病の合理的診断が、それらの病気の効率的且つ効果的な仲裁と治療に重要である。最も初期の症状の表れの時またはそれ以前での信頼できる診断アッセイが要望されている。症状と病気自体の両方を治療するための治療法または治療薬を開発することも要望されている。ミトコンドリアの欠陥に関連する障害の治療に有用である治療法または薬の同定および診断アッセイの同定は、歴史的には迅速且つ有益なスクリーニングに使用できる信頼できるモデル系が無いことにより妨害されてきた。ミトコンドリア遺伝子欠陥に関連する病気の多くはそれの動物モデルが存在しない。適当な細胞培養モデル系は利用可能でないか、または確立や維持が困難であるかのいずれかである。更に、細胞培養モデルが利用可能であっても、ミトコンドリアの機能はしばしば核遺伝子とミトコンドリア遺伝子の両方によりコードされるので、ミトコンドリアのゲノムか核のゲノムのいずれが与えられた表現型の原因であるかを見分けることはしばしば不可能である。従って、与えられた薬剤または治療の明らかな効果がミトコンドリアゲノムの段階で作用するのかどこか他の場所で作用するかを知ることはしばしば不可能である。いずれのゲノムが原因であるかを見分けるのに有用である１つのアプローチは、正常なミトコンドリア機能を有することが知られている培養細胞中のミトコンドリアＤＮＡを破壊し、次いで病的細胞からのミトコンドリアをそのような細胞に移すことである。しかしながら、ρ°細胞系と呼ばれる生成した細胞系は不安定で且つ培養しにくい傾向がある。十分に分化した細胞系が移植の標的として使われるが、それらの自然に限定された寿命のため特にスクリーニング目的には不適当である。その上、そのような形質転換は病気によって大部分が冒されている形態の細胞を使って行われておらず、そのため形質転換体において観察されるミトコンドリアの欠陥が研究中の病気状態に関連するかどうかは明らかでない。よって、ＰＤ，ＡＤおよび糖尿病の迅速且つ有益なスクリーニングにおいて使用できる信頼のあるモデル系が現在要望されている。本発明は、ＰＤ，ＡＤおよび糖尿病の有用な診断と有効な治療へのそれらの要望を満たし、その上、関連する利点を提供する。発明の要約本発明は、病的状態、例えばアルツハイマー病または糖尿病と共に分離する（ segregete）ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子中の遺伝子変異の同定に関する。本発明は、臨床的症状の発生の前または後のいずれかで、アルツハイマー病または糖尿病の診断法としてそのような変異を検出する方法を提供する。アルツハイマー病または糖尿病の存在を検出するための本発明の一態様によれば、被検者からミトコンドリアを含む生物学的試料を得、そしてアルツハイマー病または糖尿病の存在と関係するミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子配列中の１または複数の変異を調査する。そのような調査される変異は、好ましくはチトクロームｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン155 とコドン415 の間および／またはチトクロームｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20とコドン150 の間に位置する。より好ましくは、次の位置の１または複数のところの変異を調査する：チトクロームｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン155 、コドン167 、コドン 178 、コドン193 、コドン194 およびコドン415 ；並びにチトクロームｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン 95、コドン110 およびコドン146 。所望であれば、着目のコドンを調査前に増幅させることができる。上記変異を調査するための好ましい方法としては、(a)オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション、(b)標的核酸上で互いに隣接してアニールするオリゴヌクレオチド配列の連結に基づく方法、例えばリガーゼ連鎖反応、(c )プライマーのセットを使用することによるポリメラーゼ連鎖反応またはそれの変形、および(d)単一ヌクレオチドプライマー誘導型伸長アッセイが挙げられる。本発明は、上述の診断法に有用である核酸配列、即ちアルツハイマー病または糖尿病の存在と関係する遺伝子変異を含むミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の部分に相当するかまたはそれと相補的である核酸配列も包含する。一態様によれば、前記核酸配列は検出可能な剤により標識される。好ましい検出可能な剤としては、放射性同位体（例えば³²Ｐ）、ハプテン（例えばジゴキシゲニン）、ビオチン、酵素（例えばアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、蛍光団（例えばフルオレセインまたはテキサスレッド）または化学発光団（例えばアクリジン）が挙げられる。アルツハイマー病または糖尿病の存在を検出するための別の態様によれば、タンパク質生成物の存在について生物学的試料を調査する。特にアルツハイマー病または糖尿病の存在と関係する１または複数のチトクロームｃオキシダーゼ変異を有するミトコンドリアのタンパク質生成物を調査する。そのようなタンパク質の調査のための好ましい剤としてはモノクローナル抗体が挙げられる。本発明の別の態様によれば、アルツハイマー病または糖尿病を有することがわかっている患者からのミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の配列を決定し、そしてその配列を既知の野性型ミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の配列と比較することにより、アルツハイマー病または糖尿病を引き起こす遺伝子変異を検出する。本発明の他の態様は、前記変異の望ましくない生物活性の抑制に関する。これは、アルツハイマー病または糖尿病の治療処置を提供する。より詳しくは、本発明の一態様は、変異型配列に特異的であり且つ標的の変異型チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子またはそれから転写される伝令ＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンス配列と接触せしめることにより、変異型チトクロームｃオキシダーゼをコードする遺伝子の転写または翻訳を阻害する方法に関する。本発明の別の態様は、欠陥チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子を使ったミトコンドリア中への接合体分子の選択的導入に関する。この接合体は、リンカーを使って毒素またはイメージング（画像化）リガンドに結合されたターゲティング分子を含んで成る。ターゲティング分子は、例えば、親油性カチオン、例えばアクリジンオレンジ誘導体、ローダミン123 誘導体、またはJC-1（ヨウ化５，５′，６，６′−テトラクロロ−１，１′，３，３′−テトラエチルベンズイミダゾロカルボシアニド）誘導体であることができる。リンカーとしては、例えば、エステル、エーテル、チオエーテル、ホスホロジエステル、チオホスホロジエステル、カーボネート、カルバメート、ヒドラゾン、オキシム、アミノまたはアミド官能基が挙げられる。イメージングリガンドは、例えば、放射性同位体、ハプテン、ビオチン、酵素、蛍光団または化学発光団であることができる。そして毒素は、例えば、ホスフェート、チオホスフェート、ジニトロフェノール、マレイミドおよびアンチセンスオリゴ核酸であることができる。本発明は、ミトコンドリアの代謝の欠損に関連するかまたはそれにより引き起こされる病気のためのモデル系も提供する。加えて、そのような疾患のための薬剤および処置をスクリーニングしそして評価するためのそれらのモデル系の使用方法を提供する。更に、本発明はそのような疾患を診断するためのそれらのモデル系の使用方法を提供する。本発明は更に、未分化の生殖細胞または胚細胞へのミトコンドリアの移植に備え、かくして病的生物の細胞から完全にまたは部分的に誘導されたミトコンドリアを有する試験動物の成熟に備える。スクリーニングにおいてそれらの同培養物を使用することにより、幾つかの可能な薬剤または療法のどれが特定の患者に最適であるかを予測することも可能である。本発明は、未分化の生殖細胞または胚細胞にミトコンドリアを移植し、病的生物の細胞から完全にまたは部分的に誘導されたミトコンドリアを有する生物を与えることも包含する。本発明の幾つかの態様は、糖尿病に関連する欠陥ミトコンドリア遺伝子およびそれの変異を同定し、探査しそして特徴づけ、それらの細胞および代謝の表現型を決定し、そして様々な薬剤および治療方法の効果を評価する顕著な機会を与える。一態様では、糖尿病患者の細胞からのミトコンドリアを、不死化されたβ細胞に移植する。その細胞は晩発性糖尿病に特徴的な表現型の変化、例えばチトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）の活性の低下を受ける。そのような試料に外因性の剤または処置を使用して表現型の変化を予防、遅延または緩和することができれば、それらの剤または処置はヒトの晩発性糖尿病を予防、遅延または緩和する能力についての更なる研究を保証する。そういった細胞系はそれらが関連する病気に特徴的な表現型変化を受けることが観察されるので、それらは診断方法としても使われる。例えば、晩発性糖尿病の症状を示している個体から細胞を取り、そしてそれらの細胞からのミトコンドリアを不死化されたβ細胞に導入する。次いでそれらの培養物の試料を化学的に誘導して膵臓「β細胞様」性質（例えばインスリン分泌）を有する細胞に分化させる。患者のミトコンドリアを含む分化させた細胞が晩発性糖尿病に特徴的な変性表現型（例えば減少したインスリン分泌）を示し始めれば、これはミトコンドリアが１または複数の原因となるmtDNA 変異を有することを確証する。従って、それは晩発性糖尿病の診断を確証する。添付の請求の範囲は、好ましい態様の更なる列挙として参考により組み込まれる。本発明の目的は、ミトコンドリアの病気、例えばアルツハイマー病または糖尿病に伴うことが知られている電子伝達機能障害の構造的および遺伝的根拠を同定することである。本発明の別の目的は、アルツハイマー病または糖尿病の診断のための信頼でき且つ効率的な手段を提供することである。本発明の別の目的は、アルツハイマー病または糖尿病の治療のための効果的な療法を提供することである。本発明の更に別の目的は不死ρ°細胞系を提供することである。本発明の別の目的は、未分化であるが誘導して分化させることができる不死ρ °細胞系を提供することである。本発明の更に別の目的は、異なる生物学的起源のゲノムＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡを有する培養された不死細胞系を含んで成る、細胞質雑種（サイブリッド）細胞系を提供することである。本発明の目的は、神経芽細胞腫細胞系に起源を有するゲノムＤＮＡとミトコンドリアの欠陥と関係することがわかっている疾患を有する個体から誘導したヒト組織試料に起源を有するミトコンドリアＤＮＡとを有する培養された不死細胞を含んで成る、細胞質雑種細胞系を提供することである。ゲノムＤＮＡが正常な膵臓β細胞表現型を維持する細胞（例えば非限定的にβ TC6-F7，HIT，RINm5f およびTC-1細胞）から誘導されそしてミトコンドリアＤＮＡが晩発性糖尿病と共に分離するミトコンドリアの欠陥と関係することがわかっている疾患を有する個体から誘導したヒト組織試料に起源を有する細胞系を提供することも本発明の目的である。未分化であるが誘導して分化させることができる不死ρ°細胞系であって、不死化されたβ細胞（例えば非限定的にTC6-F7，HIT-T15,RINm5f，TC-1およびINS- 1 細胞）に起源を有するゲノムＤＮＡと，晩発性糖尿病と共に分離するミトコンドリアの欠陥と関係することがわかっている障害を有する個体から誘導したヒト組織試料に起源を有するミトコンドリアＤＮＡとを有する、培養された不死細胞を含んで成る不死ρ°細胞系を提供することも本発明の目的である。ミトコンドリアの欠陥と関係する疾患の研究のためのモデル系を提供することも本発明の目的である。本発明の別の目的は、ミトコンドリアの欠陥の関連する疾患を治療する上で効果的な薬剤のスクリーニングのためのモデル系を提供することである。本発明の別の目的は、晩発性糖尿病と共に分離するミトコンドリアの欠陥と関連する疾患を治療する上での治療の有効性の評価のためのモデル系を提供することである。本発明の別の目的は、晩発性糖尿病と共に分離するミトコンドリアの欠陥と関連する疾患を治療する上で効果的な薬剤のスクリーニングのためのモデル系を提供することである。本発明の更なる目的は、ミトコンドリアの欠陥と関連する疾患を治療する上での治療の有効性を評価するためのモデル系を提供することである。本発明の更なる目的は、ミトコンドリアの欠陥と関連する疾患の診断のためのモデル系を提供することである。上述のモデル系の作製方法を提供することも別の目的である。追加の目的は、薬剤スクリーニング、治療評価および診断へのそれらのモデル系の使用方法を提供することである。本発明の更なる目的は、ミトコンドリアの欠陥と関連する病気のための動物モデルを提供することである。それらの動物モデルは薬剤スクリーニング、治療評価および診断に有用である。本発明の更なる目的は、そのような動物モデルの作製方法を提供することである。本発明の１つの利点は、それがアルツハイマー病、特により広まっている形態の散在性ＡＤおよび糖尿病の効果的診断を提供することである。本発明の別の利点は、ＡＤまたは糖尿病の症状の最も早期の発生時またはそれ以前での信頼できる非侵害的な診断を提供することである。本発明の更に別の利点は、本発明がアルツハイマー病または糖尿病と共に分離する変異の望ましくない生物活性を抑制することにより、または欠陥のあるミトコンドリアを選択的に破壊することにより、ＡＤまたは糖尿病の主原因を処理する効果的な治療法を提供することである。本発明により提供される別の利点は、それが初めて別の細胞から移植されたミトコンドリアを有している細胞の安定な培養物を提供することである。発表された研究は完全に分化した（成熟）細胞中にミトコンドリアを移植することを報告しているが、それらの細胞は維持不可能であり、最終的にそれらの培養物は死んでしまう。対照的に、本発明は、ミトコンドリアを不死の分化性細胞系中に移植すると、移植された細胞も不死であることを教える。更に、本発明は不死培養物の亜集団の中での分化の誘導を教え、これは、他の方法で分化させた細胞に直接移植を行った時に可能であっただろうものと同じ実験の実施を考慮に入れる。本発明の更に別の利点は、それが研究中の疾患とより大きな関連性を有するモデル系を提供することである。発表された文献は移植されたミトコンドリアの受容細胞として骨肉腫細胞を使用した。しかしながら、骨細胞は、それらの形質転換体が提供された神経学的病気の最初の発病部位ではない。本発明は、研究中の病的状態において最初に冒される細胞型に分化することができるように、ミトコンドリア移植用の不死化標的細胞が選択されるだろうことを考慮する。例えば、本明細書中の例では、ＡＤ患者からのミトコンドリアを神経芽細胞腫細胞中に移植し、その継代培養物を誘導してニューロンに分化させることができる。かくして、このモデル系でのミトコンドリアの欠陥の表現型発現は、病気に最も冒されるまさにその細胞型において観察することができる。本発明の他の目的および利点並びに他の態様は、特に詳細な説明および後述の実施例を読んだ後、容易に当業者に明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、５′末端の上流非コード領域、ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＩをコードする完全な核酸配列、および３′末端の下流非コード領域を記載する（配列番号１）。図２は、５′末端の非コード領域、ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットIIをコードする完全な核酸配列、および３′末端の下流非コード領域を記載する（配列番号２）。図３は、５′末端の非コード領域、ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットIIIをコードする完全な核酸配列、および３′末端の下流非コード領域を記載する（配列番号３）。図４は、欠陥ミトコンドリアの検出および選択的破壊に有用な幾つかのアクリジンオレンジ誘導体の調製のための反応スキームを表す。図５〜８は、欠陥ミトコンドリアの検出および選択的破壊に有用な幾つかのJC -1誘導体の調製のための反応スキームを表す。図９は、シアニド感受性酸素消費量が臭化エチジウム処理で減少することを示すグラフであり、これは内在性ミトコンドリアの酸化的リン酸化が不能になったことを示す。図10は、臭化エチジウム処理が様々な電子伝達系阻害剤に対する細胞の酸素取り込みの感受性を減少させることを示すグラフであり、これは臭化エチジウムが内在性の電子伝達系を不能にしたことを確証する。図11は、本発明のρ°細胞の増殖がピルビン酸塩に依存するがウリジンには依存しないことを示すグラフである。図12は、増加する濃度の臭化エチジウムに64日間暴露した細胞が増加する量のミトコンドリア内膜を有することを示すグラフであり、これはそのような細胞がミトコンドリアＤＮＡを欠いている細胞に特徴的である大きく不規則なミトコンドリアを有することを示す。図13は、臭化エチジウムで64日間処理し次いでカチオン性色素JC-1で処理した細胞が増加した蛍光を示すことを表すグラフであり、これは拡大したミトコンドリアがミトコンドリアＤＮＡの不在下であっても増大した膜内外プロトン勾配を確立することを示唆する。発明の詳細な説明本発明は、糖尿病やアルツハイマー病のような病気と共に分離するミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子中の遺伝的変異に関する。本発明は、臨床的症状の発生の前または後のいずれかで、上記病気の診断として、そのような変異を検出する方法を提供する。更に本発明は、該変異の望ましくない生物学的活性の抑制に関し、従ってそれらの病気の治療処置を提供する。本発明はアルツハイマー病と糖尿病の最初の効果的な診断法を提供するだけでなく、更にそれらの衰弱性の病気の最初の効果的な治療法も提供する。本発明の十分且つ完全な理解を助けるために、本明細書中で使用する全ての用語が、異なって定義されない限り、分子遺伝学の分野の当業者によりそれらの用語が一般的に持っていると見なされるのと同じ意味を有するつもりであることを記載することは重要である。本明細書中で使用する技術もまた、特記されない限り、当業者に既知であるものである。本明細書中に引用する文献はそれらの内容が参考として組み込まれる。「核酸」、ＲＮＡ、ＤＮＡなどという語を使う時、特定の段階で使うことができる化学構造を限定する意味ではない。例えば、ＲＮＡは一般にＤＮＡと置換することができることは当業者の良く知るところであり、それ自体、「ＤＮＡ」という用語の使用はこの置換を含むと解すべきである。加えて、様々な核酸類似体および誘導体を作ることができ、それらは互いと並びにＤＮＡおよびＲＮＡとハイブリダイズするであろうことは知られている。従って、そのような類似体および誘導体の使用も本発明の範囲内である。用語「遺伝子」はｃＲＮＡ、ＲＮＡ、または遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドを包含する。用語「組織」は、様々な器官の固形物体から単離または懸濁された血液および／または細胞、並びに様々な器官の固形物体を包含する。加えて、遺伝子または核酸の「発現」は、細胞の遺伝子発現だけでなく、クローニング系および他の任意の状況での核酸の転写および翻訳も包含する。「不死」細胞系は、当業者によりそのように意味される細胞系を意味し、または有意な表現型の変化なしに、好ましくは不定回数、ただし少なくとも10回は継代させることができる細胞系を意味する。「ρ°細胞」は、この目的で有用な任意の方法により、機能的なミトコンドリアおよび／またはミトコンドリアＤＮＡを本質的に涸渇させた細胞である。特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件等、またはそれのサブクラスへの言及は、限定を意図するものではなく、その記述が与えられる特定の文脈において重要または大切であると当業者が認識するような関連材料の全てを包含すると解釈するべきである。例えば、異なるが既知である方法を使って、提案された方法、材料または組成物の使用が向けられるものと同じ目標を達成するように、ある緩衝液系または培地を別のものと置換することがしばしば可能である。本明細書の一態様において使われる細胞は神経芽細胞腫細胞であるけれども、本発明はそのような細胞の使用に限定されない。異なる種（ヒト、マウスなど）または異なる組織（胸上皮、結腸、ニューロン組織、リンパ球など）からの細胞も本発明において有用である。ミトコンドリア疾患と一緒のチトクロームｃオキシダーゼ変異の分離チトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）は真核細胞のミトコンドリア中に存在する電子伝達系の重要な末端成分である。チトクロームｃオキシダーゼは電子伝達系の複合体IVとしても知られ、少なくとも13個のサブユニットから構成される。それらのサブユニットのうちの少なくとも10個は核遺伝子によりコードされ；残りの３個のサブユニット（Ｉ，IIおよびIII）はミトコンドリア遺伝子によりコードされる。ミトコンドリアＤＮＡ（mtDNA）は、ヒトでは長さが約17 kB の小さい環状ＤＮＡ分子である。mtDNA は２つのリボソームＲＮＡ（rRNA）、伝令ＲＮＡ（tRNA）の完全な１セット、並びに３つのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＣＯＸＩ，ＣＯＸIIおよびＣＯＸIIIを含む13種のタンパク質をコードする。ある個体に存在するmtDNA の大部分は、その個体の受胎時に卵子内に含まれる mtDNA に由来する。ある個体中のmtDNA の全コピーに作用するmtDNA 配列中の変異は同種形質性（homoplasmic）として知られる。mtDNA の或るコピーのみに作用する変異は異種形質性（heteroplasmi c）として知られ、同一個体中の異なるミトコンドリア間で異なるだろう。大部分のミトコンドリアでコードされるタンパク質と全てのミトコンドリアでコードされるＣＯＸタンパク質は、mtDNA の重鎖から転写される。mtDNA はそれらの密度を基準にして重い一本鎖と軽い一本鎖に分けることができるので、他方の鎖は「軽鎖」と呼ばれる。本発明では、正常な個体、既知のアルツハイマー病患者、および既知の糖尿病患者からmtDNA を単離し、クローニングし、そして配列決定する。予想通り、幾つかの正常遺伝子と共に各遺伝子中に少数の非有害性のおよび見かけ上ランダムな変異が観察される。しかしながら、ＡＤおよび糖尿病患者では、共通の部位において少数の同種形質性または異種形質性変異が認められる。３つのミトコンドリアＣＯＸサブユニットについて、各個体で１または複数のサブユニットクローン中に変異が存在した。そのような変異は特にmtDNA のＣＯＸサブユニットＩおよびIIの発現領域中に観察される。本発明によれば、ＣＯＸ遺伝子中のそのような変異は、アルツハイマー病および糖尿病と共に分離し、且つ前記病気に見かけ上十分である。全ＡＤ患者の少なくとも90％を占める散在性ＡＤ、および糖尿病は、mtDNA によりコードされるＣＯＸサブユニット中の異種形質性変異と共に分離される。従って、それらの変異の検出は、アルツハイマー病や糖尿病の予測と診断になる。多数の臨床的に分類されたまたは検死で確かめられたＡＤ患者から、多数の同年齢の「正常者」（ＡＤの症歴がないかまたはＡＤの臨床的症状の徴候がない老人）から、および同年齢の神経変性病対照（ハンティングトン病、核上傍麻痺などを有する患者）から、血液および／または脳試料を収得しそしてＤＮＡを単離する。多数の糖尿病患者からも血液試料を得た。チトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）遺伝子断片のクローニングの後、各患者から複数のクローンの配列を得る。それらの配列の編集物を作り、整列させ、そして既知の正常なヒトＣＯＸ遺伝子についての発表されたCambridge とGenbank の配列〔Anderson他，Nature 290:457-465( 1981)〕と比較する。発表されたCambridge コード配列は次のように番号付けられている：ＣＯＸＩはヌクレオチド5964〜7505であり、ＣＯＸIIはヌクレオチド 7646〜8329であり、そしてＣＯＸIIIはヌクレオチド9267〜10052 である。Ander sonの方法によれば、対応する配列は次のように番号付けられる：ＣＯＸＩはヌクレオチド5904〜7445であり、ＣＯＸIIはヌクレオチド7586〜8269であり、そしてＣＯＸIIIはヌクレオチド9207〜9992である（同文献）。下記は全て、発表されたCambridge 配列のみを参照するが、Andersonのものをはじめとする異なる番号付け法に従って、対応する配列を本発明で使えることは当業者の認識するところであろう。発表された配列からのいずれかの変形（変異、挿入または欠失）は、複製と相補鎖配列決定により確認される。既知ＡＤ患者における変異分析は数個の変異を示した。観察された変異の幾つかは、発現されるタンパク質中にアミノ酸変化を引き起こさない「サイレント」変異である。しかしながら、存在する変異の多くは、対応するタンパク質中にアミノ酸変化を引き起こす。多くの場合、対応するアミノ酸変化はＣＯＸ酵素にコンホメーション変化も引き起こし得る。チトクロームｃオキシダーゼサブユニットIIでは、例えば、ＡＤ患者の配列は遺伝子あたり少なくとも１塩基が正常配列と異なっている。このデータは下記の表２に要約される。観察される再発性変異の幾つかはＣＯＸ酵素のコンホメーション変化を引き起こすと思われる。例えば、コドン22のところに観察される正常のＡＣＣからＡＴＣへの変異は、正常の親水性スレオニン（Thr）から疎水性イソロイシン（Ile）への変化を引き起こす。核酸構造におけるこの種の変化は、特に高度保存領域中で起こる時、酵素活性を破壊するかまたは変更することが知られている。下記により詳しく記載するように、配列決定したＣＯＸ遺伝子の各々は多数の特定部位で、または変異の「ホットスポット」で正常配列からの有意な変化を示す。更に、それらのホットスポットは一般にＣＯＸ遺伝子の特定領域内に含まれる。ＣＯＸＩの最初の1,530塩基（510 コドン）、特にコドン155 と415 の間では、コドン155,167，178，193，194および415 がＡＤ配列で高度の変異類似性を有する（表１参照）。ＣＯＸIIでは、ホットスポットは特にコドン20とコドン15 0 の間の領域、特にコドン20，22，68，71，74，90，95，110 および146 に存在する（表２参照）。ＣＯＸIIIでは、コドン64，76，92，121，131，148，241および247 が超可変性のホットスポットであると思われる。アルツハイマー患者のＣＯＸＩ遺伝子中に観察される変異下表１は、44人の各アルツハイマー病患者についてのミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＸＩ）遺伝子の10個のクローンにおける数個の変異の例および特定の変異が観察される回数である。ＡＤ患者について列挙された変異は、正常なヒトＣＯＸＩについて発表されたCambridge 配列に比較したものである。指摘したコドン番号は該遺伝子の５′末端の転写解読枠から通常の方法で決定される。表１により証明されるように、ＡＤ患者のＣＯＸＩの変異ホットスポットはコドン155，167，178，193，194 および415 である。アルツハイマー患者のＣＯＸII遺伝子中に観察される変異下表２は、44人の各アルツハイマー病患者についてのミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットII（ＣＯＸII）遺伝子の10個のクローンにおける数個の変異の例および特定の変異が観察される回数である。ＡＤ患者について列挙された変異は、正常なヒトＣＯＸIIについて発表されたCambridge 配列に比較したものである。指摘したコドン番号は該遺伝子の５′末端の転写解読枠から通常の方法で決定される。表２により証明されるように、ＡＤ患者のＣＯＸIIの変異のホットスポットはコドン20，22，68，71，74，90，95，110 および146 である。各変異ホットスポットでは、ＡＤ患者に観察される特異的変異は万人共通に見える。例えば、ＣＯＸＩ中のコドン415 では正常コドンはスレオニンである。ＣＯＸＩ中のコドン415 に観察される９つのＡＤ変異は各々アラニンをコードする。ＣＯＸＩ中の194 位では、芳香族フェニルアラニンコドンが正常の疎水性ロイシンに取って代わる。それらの特異的変異はランダムには起こらず、且つアルツハイマー病でない正常者または神経学的患者には観察されない。下表３は、アルツハイマー病の診断における上記の変異ホットスポットの使用を証明する。表３の各患者では、ＣＯＸＩのコドン155，167，178，193，194 および415 の各々、並びにＣＯＸIIのコドン20，22，68，71，74，95，110 および 146 の各々の変異の存在が黒く塗った部分により示される。臨床的に分類されたＡＤ患者（「血液／ＡＤ」）または文書で証明された同年齢の「正常者」（ＡＤの家族病歴を持たない老人またはＡＤの臨床的症状の徴候のない老人）（「血液／対照」）のいずれかである多数の生存被検者から血液試料を得、そしてＤＮＡを単離する。臨床的に分類されたＡＤ患者（「血液／ＡＤ）のうち、61％（36人のうち22人）が前記ホットスポットの１または複数箇所に変異を有する。36％（36人のうち13人）は変異を含まない。しかしながら、上述したように、可能なアルツハイマー病の診断は現在臨床的診察に限定され、決定的な分析は検死時の病理学的検査によってのみ達成される。更に、臨床的診察によりＡＤを有すると現在診断された生存患者のうち、わずか約70〜80％しか検死時にＡＤであったと確認されない。Tierney，M.C．他，Neurology 38:359-364 (1988)。残りの20〜30％はＡＤを有すると不正確に診断されるが、彼らは実際には別の状態、例えばLewy体変形の老人痴呆、Pick病、核上傍麻痺などを有する。よって、生存する臨床的に分類されたＡＤ患者から採取した血液試料のかなりの％が試験の結果ＡＤ陽性でないだろう。実際、逆の結果は心配の原因である。文書で証明された生存する同年齢の正常者（血液／対照）の14人のうち１人だけ（７％）が１つのホットスポット変異を有した。更に、この個体は65才であり、いつかはＡＤの症状を発生するかもしれないことが注目される。検死時の病理学的検査によりＡＤを有すると確認された多数の病気患者（「脳／ＡＤ」）または文書で証明された同年齢の「正常者」（ＡＤの家族病歴を持たない老人、生存中にＡＤの臨床的症状の徴候がなかった老人、および検死時の病理学的検査によりＡＤの徴候のなかった老人）（「脳／対照」）から脳試料を得、そしてＤＮＡを単離する。検死時にハンティングトン病（「脳／ＨＤ」）、非特異的変性病（「脳／ＮＳＤ」）、核上傍麻痺（「脳／ＰＳＰ」）、ピック病（「脳／Picks」）、ハレルフォルデン−シュパッツ病（「脳／ＨＳＰ」）、散在性Lewy体病（「脳／DLBD」）、非定型もつれ（「脳／ＡＴ」）、銀親和性粒子症（「脳／ＡＧ」）、Lewy体変形の老人痴呆（「脳／ＬＢＶ」）から選択された他の神経変性疾患を有すると診断された多数の病気患者からも、脳試料を採取しそしてＤＮＡを単離する。脳試料から単離されたＤＮＡから得られた結果は、明らかに本発明の診断技術の特異性を証明する。病理学的に確認されたＡＤを有する個体から採取した脳試料の83％（12人のうち10人）が、１または複数のホットスポット変異を含んだ。残りの２人の個体（ＢＡとＤＥ）のうち、ＢＡはＣＯＸＩのコドン170 と276 並びにＣＯＸII のコドン26のところに変異を有し、ＤＥはＣＯＸＩのコドン221 およびＣＯＸII のコドン90のところに変異を有した。従って、ホットスポットのリストよりも広げることが望ましいかもしれない。対照的に、同年齢の「正常者」は一人もそのような変異を含まないことがわかった。加えて、他の神経学的障害を有する個体の18人のうち２人（11％）だけが１個の変異を含んだ。これは、本発明の診断がＡＤに特異的であることを証明する。更に、２人の個体のうちの１人（ＡＣ）の検死に係わった病理学者は、銀親和性粒子症を有する痴呆とＡＤとを明白に決定的に区別することができない。最後にもう１人の個体（ＫＩ）は、その個体が核上傍麻痺のために死ななかったら、ＡＤの症状を現したただろうという可能性を排除することはできない。本発明は、アルツハイマー病または糖尿病の存在と関係する遺伝子変異を含むミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の部分に相当するかまたはそれと相補的である単離されたヌクレオチド配列にも関する。遺伝子変異を含む単離されたヌクレオチド配列としては、ＣＯＸＩのヌクレオチド5964〜7505、ＣＯＸIIのヌクレオチド7646〜8329およびＣＯＸIIIのヌクレオチド9267〜10052 が挙げられる。ミトコンドリア起源の病気の診断検出：本発明によれば、ミトコンドリアのＣＯＸ遺伝子中の塩基変化を検出し、そしてアルツハイマー病や糖尿病といったミトコンドリア起源の病気の診断として用いることができる。ＤＮＡやＲＮＡを単離しそして単離されたミトコンドリアのＣＯＸ遺伝子中の変異を検出するには、様々な技術が利用可能である。患者の血液試料からＤＮＡおよびＲＮＡを単離するためには、多数の試料調製方法が利用可能である。例えば、血液試料からのＤＮＡはアルカリ処理後の細胞溶解によって得られる。しばしば、ＤＮＡあたり複数コピーのＲＮＡ情報が存在する。従って、両形態の核酸を単離する試料調製プロトコールを有することが、検出感度の観点から有用である。全核酸は、イソチオシアン酸グアニジン／フェノール−クロロホルム抽出により、またはプロテイナーゼＫ／フェノール−クロロホルム処理により単離することができる。商業的に利用可能な試料調製方法、例えばQiagen Inc．(Chatsworth，CA)からのものを使うこともできる。下記に更に詳しく記述するように、変異の相補物を含む１または複数の標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、変異を検出することができる。ミトコンドリアの病気は異種形質性（hetero- plasmic）であり得る（変異配列と正常配列の両方を有する）ので、変異型プローブからのシグナルの量を正常のまたは野性型のプローブからの量と比較することにより、そのような異種形質性の定量または半定量測定（検出方法によって）を得ることができる。下記に更に詳しく記述するように、ミトコンドリアＣＯＸ遺伝子中の特異的変異を検出するためには様々な技術が利用可能である。検出方法としては、例えば、クローニングと配列決定、オリゴヌクレオチドの連結、ポリメラーゼ連鎖反応およびその変形の使用、単一ヌクレオチドプライマー誘導伸長アッセイの使用、標的特異的オリゴヌクレオチドを使ったハイブリダイゼーション技術、並びにサンドイッチハイブリダイゼーション法が挙げられる。ＣＯＸ遺伝子のクローニングおよび配列決定は、患者の試料中の変異を検出するために役立つことができる。配列決定は蛍光標識されたプライマーを使って市販の自動配列決定装置（シークエンサー）を使って実施することができる。別の配列決定法は、シリコンチップ上の高密度のオリゴヌクレオチド配列を使った「ハイブリダイゼーションによる配列決定」法である〔Fodor 他，Nature 364:555 -556(1993)；Pease他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5022-5026(1994)〕。例えば、蛍光標識したプライマーを使って標的遺伝子のＰＣＲ増幅から作製された蛍光標識した標的核酸配列を、標的配列との相補性領域を探査する一組の短鎖オリゴヌクレオチドを含むチップとハイブリダイズさせる。得られたハイブリダイゼーションパターンは、元の標的ＤＮＡ配列を再構築するのに有用である。変異分析は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子上で互いのすぐ近くにアニールするオリゴヌクレオチド配列の連結に基づく方法により行うこともできる〔Wuおよび Wallace，Genomics 4:560-569（1989）；Landren他，Science 241:1077-1080（ 1988）；Nickerson 他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:8923-8927（1990）；B arany，F.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:189-193(1991)〕。オリゴヌクレオチドが正しく塩基対を形成した時にだけ、リガーゼにより媒介される共有結合的接着が起こる。標的の増幅に耐熱性Taq リガーゼを使用するリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、変異部位を調べるのに特に有用である。高められた反応温度が連結反応を高緊縮性で進行させる〔Barany，F.，PCR Methods and Applications 1:5-16(1991) 〕。ＤＮＡ中の点変異の分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその変形を使うことによって行うこともできる。ミスマッチ（不正対合）は、完全にマッチしたプライマーの結合に有利であるハイブリダイゼーション条件下での競合オリゴヌクレオチドプライミングにより検出することができる〔Gibbs他，Nuc l．Acids Res． 17:2437-2448(1989)〕。増幅不応性変異システム（ARMS）法では、内部かまたは３′残基のいずれかの標的配列と完全な対合または不正対合を有するようにプライマーをデザインする〔Newton他，Nucl．Acids Res. 17:2503-2 516(1989)〕。適当な条件下では、完全にアニールしたオリゴヌクレオチドだけがＰＣＲ反応のプライマーとして機能し、従って正常配列と変異配列を区別する方法を提供する。ＤＮＡポリメラーゼの高い忠実度により正しい塩基の特異的な取り込みが提供される単一ヌクレオチドプライマー誘導伸長アッセイを使って、ＣＯＸ遺伝子の遺伝子型決定分析を行うこともできる〔Syvanen他，Genomics 8:684-692（1990 ）；Kuppuswamy他，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:1143-1147(1991)〕。野性型ヌクレオチドと変異型ヌクレオチドの両方を同時に調査することにより異種形質性の定量に備える別のプライマー伸長アッセイが、“Multi-plexed Primer Extention Methods”という発明の名称を有しそして発明者としてEoin Fahy とS oumitra Ghoshの名が挙げられている、1995年３月24日に出願の同時係属米国特許出願第号に開示されている。この開示は参考として本明細書に組み込まれる。標的核酸中の１塩基変異の検出は、便利には標的特異的オリゴヌクレオチドを使った差別的ハイブリダイゼーション技術により達成することができる〔Suggs 他，Proc．Natl．Acad．Sci. 78:6613-6617（1981）；Conner他，Proc．Natl．A cad．Sci. 80:278-282(1983)；Saiki他，Proc．Natl．Acad．Sci. 86:6230-6234 (1989)〕。例えば、不正対合したプローブに比較して完全に対合したプローブの高い熱安定性に基づいて変異が診断される。ハイブリダイゼーション反応は、標的核酸をニトロセルロースまたはナイロン膜上に固定化しそしてオリゴヌクレオチドプローブを使って探査するというフィルター型方式において実施することができる。既知のハイブリダイゼーション方式のいずれを使ってもよく、例えば、サザンブロット、スロットブロット、「逆」ドットブロット、液相ハイブリダイゼーション、固体支持体ベースのサンドイッチハイブリダイゼーション、ビーズベースの、シリコンクリップベースの、およびマイクロタイタープレートベースのハイブリダイゼーション方式が挙げられる。別の方法はサンドイッチハイブリダイゼーション法によるＣＯＸ遺伝子の検出を伴う。この方法では、固体支持体上に固定化された共通の捕捉オリゴヌクレオチドを使って、変異型と野性型（正常）の標的核酸を非相同ＤＮＡ／ＲＮＡから分離し、そしてレポーター標識が取り付けられた特異的オリゴヌクレオチドプローブにより検出する。捕捉オリゴヌクレオチドはマイクロタイタープレートウエル上またはビーズ上に固定化することができる〔Gingeras他，J．Infect．Dis. 164:1066-1074（1991）；Richman 他，Proc．Natl．Acad．Sci. 88:11241-11245 (1991)〕。放射性同位体で標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブは高感度であるが、放射能の取扱いや廃棄についての懸念から、非同位体標識が好ましい。非同位体手段により標的核酸を検出するのに多数の方法が利用可能である〔Matthews他，Anal．Biochem.，169:1-25（1988）〕。非同位体検出方法は直接であっても間接であってもよい。間接検出方法は通常、オリゴヌクレオチドプローブがハプテンまたはリガンド、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）またはビオチンで共有結合的に標識される方法である。ハイブリダイゼーション段階の後、標的−プローブ二重型が抗体−またはストレプトアビジン−酵素複合体により検出される。ＤＮＡ診断に汎用される酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼである。１つの特定の間接法であるGenius^TM検出システム（Boehringer Mannheim）は、ミトコンドリアＣＯＸ遺伝子の変異分析に特に有用である。この間接法はオリゴヌクレオチドプローブの標識としてジゴキシゲニンを使用し、抗ジゴキシゲニン抗体− アルカリホスファターゼ接合体によって検出する。直接検出方法は、蛍光団標識オリゴヌクレオチド、ランタニドキレート標識オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−酵素接合体の使用を含む。蛍光団標識の例はフルオレセイン、ローダミンおよびフタロシアニン色素である。ランタニドキレートの例としては、Eu³⁺とTb³⁺の錯体が挙げられる。標的特異的オリゴヌクレオチドを使った時に点変異を検出するためには、非常に高い検出感度を提供することから、直接標識されたオリゴヌクレオチド−酵素接合体が好ましい。オリゴヌクレオチド−酵素接合体は多数の方法によって調製することができる〔Jablonski他，Nucl．Acids Res. 14:6115-6128(1986)；Li 他，Nucl．Acids R es. 15:5275-5287（1987）；Ghosh 他，Bioconjugate Chem. 1:71-76（1993）〕。高い検出感度を得るのにより抜きの酵素はアルカリホスファターゼである。それらの接合体を使った標的核酸の検出は、フィルターハイブリダイゼーション法によりまたはビーズ上でのサンドイッチハイブリダイゼーション法により行うことができる〔Ishii 他，Bioconjuga te Chemistry 4:34-41(1990)〕。プローブ標識の検出は次のアプローチによって達成することができる。放射性同位体の場合には、検出はオートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはリン光物質イメージングにより行われる。ハプテンまたはビオチン標識の場合には、検出は西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのようなレポーター酵素に結合された抗体またはストレプトアビジンを使って行われ、次いで酵素的手段により検出される。蛍光団またはランタニドキレート標識の場合には、時間割モードを使ったもしくは使わない分光蛍光計を使って、または自動マイクロタイタープレートリーダーを使って蛍光シグナルを測定することができる。酵素標識の場合には、検出は色もしくは色素沈着（アルカリホスファターゼにはｐ−ニトロフェニルホスフェートまたは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム、そして西洋ワサビペルオキシダーゼには３，３′−ジアミノベンジジン−NiCl₂）、蛍光（例えばアルカリホスファターゼには４−メチルウンベリフェリルホスフェート）または化学発光（Lumigen Inc.，Detroit MIからのアルカリホスファターゼジオキセタン基質LumiPhos 530、またはTropix Inc．からのAMPPD とCSPD）により行われる。化学発光検出は、Ｘ線もしくはポラロイドフィルムを使って、または単一光子カウンティング発光計を使うことにより行われる。これはアルカリホスファターゼ標識プローブに好ましい検出方式である。検出用オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくはサイズが10〜100 塩基の範囲であり、より好ましくは長さが15〜30塩基の範囲である。そのようなヌクレオチドプローブの例は下記の表４および５中に見つかる。表４と５は、ＣＯＸ遺伝子中のＡＤ変異を検出するためのプローブの代表的配列と代表的アンチセンス配列を提供する。検出用オリゴヌクレオチドプローブを使って必要な標的区別を得るために、ハイブリダイゼーション反応は好ましくは20℃〜60℃、より好ましくは30℃〜55℃で実施される。当業者に知られるように、完全な二重型と不正対合（ミスマッチ）のある二重型との最適な区別は、温度および／または塩濃度を操作することによるかまたは緊縮性洗浄にホルムアミドを含めることにより得ることができる。ＣＯＸ遺伝子に関連する核酸中の変異を検出することの代替法として、ＣＯＸ遺伝子のタンパク質産物を分析することも可能である。特に、チトクロームｃオキシダーゼサブユニット１および２の中の点変異は、それらの遺伝子がコードするタンパク質の構造を変えると予想される。それらの変形タンパク質（変異ポリペプチド）を単離し、変異型遺伝子の産物を特異的に検出し非変異型または野性型遺伝子の産物は検出しない抗血清とモノクローナル抗体を調製するのに用いることができる。変異型遺伝子産物はポリクローナル抗体の産生にむけて動物を免疫するのに使うこともできる。ポリクローナル抗体を産生させるのに組換えにより生産されたペプチドを使うこともできる。それらのペプチドは、点変異を含むミトコンドリアゲノムの領域を発現させることにより生産される遺伝子産物の小断片を表すことができる。より詳しくは、例えばPCT/US93/10072中に記載されるように、チトクロームｃオキシダーゼサブユニット１および２中の点変異からの変異ポリペプチドを使って、ポリクローナル抗体の産生のために動物を免疫することができる。例えば、免疫応答を生じさせるためにアジュバントと一緒に変異ポリペプチドの組換え生産断片をマウス中に注入することができる。少なくとも１×10⁷Ｍ^-1の結合親和力で前記組換え断片を結合するマウス免疫グロブリンを抗血清として免疫処置マウスから得ることができ、そしてアフィニティークロマトグラフィーまたは他の手段により更に精製することができる。その上、マウスから脾細胞を得、ミエローマ細胞と融合せしめて抗体分泌性ハイブリドーマ細胞のバンクを製造することができる。少なくとも１×10⁶Ｍ^-1の親和力で組換え生産断片を結合する免疫グロブリンを分泌するクローンについて前記ハイブリドーマのバンクをスクリーニングすることができる。より詳しくは、野性型タンパク質を使った予備吸収によるかまたは変異ポリペプチドを結合するが野性型ポリペプチドは結合しない特定のイディオタイプについてハイブリドーマ細胞系をスクリーニングすることにより、変異ポリペプチドに選択的に結合するが野性型ポリペプチドには全く結合しない免疫グロブリンが選択される。最終的に所望の変異ポリペプチドを発現することのできる核酸配列は、様々な異なるポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど）からそして様々な異なる技術により作製することができる。ＤＮＡ配列を発現調節配列に作用可能に連結させた（即ち、発現調節配列が作用するのを保証するように配置させた）後、宿主中で該配列を発現させることができる。それらの発現ベクターは、典型的にはエピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの必須部分としてのいずれかで宿主生物中で複製可能である。普通、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列により形質転換されたそれらの細胞の検出および／または選択を可能にするような選択マーカー（例えばテトラサイクリン耐性またはヒグロマイシン耐性に基づくマーカー）を含むことができる。更なる詳細は米国特許第4,704,362 号中に見つけることができる。変異ポリペプチドをコードするポリペプチドは、コードされるポリペプチド生成物が生産されるように、コード配列の転写（発現配列）と翻訳を容易にする配列を含むことができる。そのようなポリペプチドの作製は当業界で公知である。例えば、そのようなポリペプチドとしては、プロモーター、転写終結部位（真核発現宿主中のポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および所望により、真核発現宿主で使われるエンハンサー、および所望により、ベクターの複製に必要な配列が挙げられる。Ｅ．コリ（大腸菌）は本発明のＤＮＡ配列のクローニングに特に有用な原核宿主の１つである。使用に適する他の微生物宿主としては、杆菌、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilus）、および他の腸内細菌科、例えばサルモネラ属、セラチア属、並びに様々なシュードモナス種が挙げられる。それらの原核宿主では、典型的には宿主細胞と適合する発現調節配列（例えば複製開始点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。加えて、多種多様な既知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（trp）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージからのプロモーター系が存在するだろう。該プロモーターは典型的には、場合によりオペレーター配列と共に発現を調節し、そして例えば転写および翻訳を開始させそして完結させるためにリボソーム結合部位配列を有するだろう。酵母のような別の微生物を発現に使ってもよい。サッカロミセス（Saccharomy ces ）は適当な宿主であり、適当なベクターは所望により、発現調節配列、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼまたは別の解糖酵素をはじめとするプロモーター、および複製開始点、終結配列などを有する。微生物に加えて、本発明のポリペプチドを発現および生産させるのに哺乳類組織の細胞培養物を使うこともできる。無傷のヒトタンパク質を分泌することができる多数の適当な宿主細胞系が技術の現状において開発されているので、真核細胞が実際は好ましい。そのような真核細胞としては、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、HeLa細胞、ミエローマ細胞系、Jurkat細胞などが挙げられる。それらの細胞のための発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサー、必要な情報処理部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。着目のＤＮＡセグメント（例えば変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含有するベクターは、周知の方法によって細胞に導入することができる。その方法は細胞宿主の種類によって異なる。例えば、原核細胞には通常塩化カルシウムトランスフェクションが使われ、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使われる。当該方法はそれ自体すぐに、診断に用いることができる試験キットの製剤化に役立つ。そのようなキットは、厳重な密閉状態で１または複数の容器が入るように仕切られたキャリヤーを含んで成るだろう。ここで第一の容器は適当に標識されたＤＮＡプローブを含むことができ、他の容器は前記標識されたプローブの局在化に有用な試薬、例えば酵素基質を含むことができる。取扱い説明書と一緒に、更に別の容器が制限酵素、緩衝液などを含んでもよい。ミトコンドリア起源の病気の治療処置：アンチセンス技術を通して変異の効果を抑制することは、ミトコンドリア起源の病気、例えばＡＤや糖尿病の効果的治療法を提供する。伝令ＲＮＡ（mRNA）または核ＤＮＡをターゲティングする「アンチセンス」療法については多くのことが知られている。Helene他，Biochem．Biophys．Acta 1049:99-125（1990）。本発明の診断試験は、特定患者において特異的なＡＤまたは糖尿病変異のどれが存在するかを決定するのに有用である。これは、検出された変異のためだけのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使った患者の「注文」療法を考慮に入れる。この患者特異的療法は新規であり、不必要なアンチセンス治療処置への患者の暴露を最少にする。本明細書中で使う時、「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対合により一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと塩基対合し、そしてHoogsteen 水素結合を介して二本鎖標的ＤＮＡと塩基対合するものである。特定の原理に縛られることなしに、チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子中の変異の破壊的作用は電子伝達系の欠陥による遊離基（ラジカル）の生成から生じると仮定した。そのような遊離基の作用は、特にミトコンドリア中の変異を抑制するメカニズムが無いことを鑑みれば、累積的であると予想される。チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子中のＡＤおよび糖尿病変異の破壊的作用は、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド剤を使って削減または排除される。そのようなアンチセンス剤は、二本鎖ＤＮＡとの三重型形成により、転写中の一本鎖ＤＮＡとの二重型形成により、またはその両方により、ミトコンドリアＤＮＡをターゲティングする。好ましい態様では、アンチセンス剤は変異型チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子をコードする伝令ＲＮＡをターゲティングする。該ＤＮＡとｍＲＮＡの配列は同じであるので、所望の作用の原因となる明確な標的を正確に決定する必要はない。細胞培養物中でおよび生体内で遺伝子発現を抑制する方法は、例えばC.F.Bennett他，J．Liposome Res.，3:85（1993）およびC． Wahlestedt他，Nature，363:260(1993)中に見つけることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬は高度の薬剤特異性を示す。これは、細胞毒性作用を増加させずに同時に２以上のアンチセンス療法の組合せを可能にする。よって、患者がＣＯＸ遺伝子中に２個以上の変異を有すると診断されたら、この療法は好ましくは複数の変異を同時に治療するように合わせて変えられる。本発明の診断試験と組み合わせれば、この「患者特異的療法」へのアプローチは、患者に検出された特定の変異に限定された治療となる。この患者特異的療法は、全ての考えられ得る変異を使った「広域スペクトル」アンチセンス治療の必要性を回避する。最終結果は低費用の治療となり、毒性副作用の機会も減る。タンパク質の合成を阻害する１つの方法は、アンチセンスもしくは三重型オリゴヌクレオチド、類似体または発現構成物の使用によるものである。それらの方法は、標的遺伝子にまたはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするような配列で十分に相補的な核酸を細胞中に導入することを伴う。遺伝子がターゲティングされる場合には、完全な阻害を達成するのに細胞あたり少数のコピーだけが要求されるので、これらの方法は非常に効率的である。アンチセンス方法論は標的情報の正常なプロセシング、翻訳または半減期を阻害する。そのような方法は当業者に周知である。アンチセンスまたは三重型方法は、一般に比較的短いオリゴヌクレオチドでの細胞または組織の処理を伴う。しかし阻害を達成するのに長い配列を使うこともできる。オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸でもリボ核酸でもよいが、生理的温度および塩濃度で標的ＲＮＡまたはＤＮＡと安定な二重型または三重型を形成するのに十分な長さのものでなければならない。更に、標的核酸に特異的にハイブリダイズするのに十分な位相補的であるかまたは配列特異的でなければならない。この特異性を達成するのに十分なオリゴヌクレオチド長さは、好ましくは長さ約10〜60ヌクレオチド、より好ましくは長さ約10〜20ヌクレオチドである。しかしながら、ハイブリダイゼーション特異性は長さと生理的条件にだけ影響されるのではなく、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量や一次配列のような要因によっても影響され得る。そのような原則は当業界で周知であり、当業者により日常的に決定することができる。一例として、表４および５のプローブと関連して使われるオリゴヌクレオチド配列の多くは、ミトコンドリアＤＮＡまたはそれから生じる伝令ＲＮＡのいずれかに向けられたアンチセンス剤として、ＡＤに使うことができる。特定の変異に対して広範囲のアンチセンス配列をデザインすることができる。例えば、変異型ミトコンドリアＣＯＸＩ遺伝子のコドン195 に対するＲＮＡおよびＤＮＡアンチセンス配列として機能するために次の一覧表から選択することができる。見ればわかるように、５′末端を切り取るか、３′末端を切り取るか、５′末端を延長するか、または３′末端を延長することにより、選択された変異型抗原の順列を作製することができる。軽鎖と重鎖mtDNA の両方をターゲティングすることができる。５′末端を切り取り且つ３′末端を切り取ったもの、５′末端を延長し且つ３′末端を延長したもの、５′末端を切り取り且つ３′末端を延長したもの、および５′末端を延長し且つ３′末端を切り取ったものといった他の変形も可能である。重鎖mtDNA に対する抗原、野生型配列：重鎖mtDNA に対する抗原、変異型配列：３′切り取り：５′切り取り：３′および５′切り取り：３′および５′伸長：長さを一定にした５′伸長、３′伸長、または両方伸長：軽鎖mtDN 野生型配列に対する抗原：軽鎖mtDNA 変異型配列に対する抗原：５′切り取り：３′切り取り：３′および５′切り取り：３′および５′伸長：長さを一定にした５′伸長、３′伸長、または両方伸長：アンチセンス又は三重オリゴヌクレオチドの組成はまた、阻害の効能に影響を及ぼす。たとえば、内因性ヌクレアーゼの作用による分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。ヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼに対して長いインビボ半減期を付与し、従って、その効能を高め、そして必要とされる用量を低める。より高い効能はまた、細胞膜に対してより浸透性になるようにオリゴヌクレオチドを変性することによっても得られる。そのような変性は当業界において良く知られており、そして挿入剤及び架橋剤、等による、負に荷電されたホスフェート主鎖塩基の変更、又は５′もしくは３′末端での配列の変更を包含する。そのような変性の特定の例は、メチルホスホネート（Miller， P.S.，Biotechnology ，２：358-362(1991)）。ホスホロチオネート（Stain，Sc ience 261：1004-1011(1993)）及びホスホロジチオネート連鎖(Brill，W．K-D. ，J.Am.Chem.Soc.，111：2322(1989))を含むオリゴヌクレオチド類似体を包含する。他のタイプの連鎖及び変性、たとえばペプチド核酸におけるポリアミド主鎖 (Nielson et al.，Science 254:1497(1991))、ホルマセタール(Matteucci，M. ，Tetrahedron Lett．31：2385-2388(1990))、カルバメート及びモルホリン連鎖、並びに当業者に知られている他のものもまた存在する。アンチセンス剤により提供される特異性の他に、標的 RNA又は遺伝子は、標的配列を共有結合するそれらの分子に反応性官能基を組込むことにより、たとえばアルキル化により不可逆的に変性され得る。当業界に知られている組換え法もまた、標的核酸のアンチセンス又は三重阻害を達成するために使用され得る。たとえば、アンチセンス核酸を含むベクターが、標的核酸の発現及び従ってその活性を減じるタンパク質又はアンチセンス情報を発現するために使用され得る。そのようなベクターは知られており、又は当業者により構成され得、そしてアンチセンス又は三重配列の所望の転写を達成するために必要なすべての発現要素を含むべきである。他の有益な特徴もまた、そのベクター、たとえば異なった形での核酸の再生のための機構内に含まれ得る。ファージミド（phagemid）は、それらがプラスミド又はバクテリオファージベクターとして使用され得るので、そのような有益なベクターの特定の例である。他のベクターの例は、ウィルス、たとえばバクテリオファージ、バキュロウィルス及びレトロウィルス、コスミド、プラスミド、リポソーム及び他の組換えベクターを包含する。ベクターはまた、原核又は真核宿主系のいづれかへの使用のための要素も含むことができる。当業者は、主宿系が特定のベクターと適合できることを知るであろう。ベクターは、当業界において知られている種々の方法のいづれか１つの方法により細胞又は組織中に導入され得る。そのような方法は、たとえば、Sambrook e t al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Labor atory，New York(1992)、及びAusubel et al.，Current Protocols in Molecula r Biology ，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1989)(これらの文献は引用により本明細書に組込まれる)に記載されている。それらの方法は、たとえば組換えウィルスベクターによる、安定した又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び感染を包含する。感染による核酸の導入は、インビトロ及びインビボ設定の両者でのそれらの使用を包含する他の列挙される方法よりもいくつかの利点を提供する。より高い効能がまた、それらの感染性質により得られる。さらに、ウィルスはひじょうに特異化され、そして典型的には、特定の細胞型で感染し、そして増殖する。従って、それらの生来の特異性が、インビボで又は組織内又は細胞の混合された培養物内で特定細胞型にアンチセンスベクターを標的化するために使用され得る。ウィルスベクターはまた、受容体介在された出来事を通して標的特異性を変えるために特定の受容体又はリガンドにより変性され得る。アンチセンス核酸を導入し、そして発現するためのウィルスベクターの特定の例は、アデノウィルス由来のベクターAdenop53TXである。このベクターは、正又は負の選択のためのヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（TX）遺伝子及び所望する組換え配列、たとえばアンチセンス配列のための発現カセットを発現する。このベクターは、上皮起源、グリア細胞及び他の細胞タイプのほとんどの癌を包含する細胞を感染するために使用される。このベクター並びに、類似する所望の機能を示す他のものが、対象のアンチセンス配列を選択的に発現するよう混合された細胞集団を処理するために使用され得る。混合された細胞集団とは、たとえば、細胞、組織又はヒト対象のインビトロ又はエキソビボ培養物を包含する。さらなる特徴は、その安全性を確保し、そして／又はその治療効能を高めるためにベクターに付加され得る。そのような特徴は、たとえば組換えウィルスにより感染された細胞に対して負に選択するために使用され得るマーカーを包含する。そのような負の選択マーカーの例は、抗生物質性ガンシクロピルに対しての選択性を付与する上記TK遺伝子である。従って、負の選択は、感染が抗生物質の添加を通して誘発性自殺を付与するので、その感染が制御され得る手段である。そのような保護は、たとえばウィルスベクター又はアンチセンス配列の変異形を生成する突然変異誘発が生じる場合、細胞性形質転換が生じないであろうことを確証する。さらに、特定の細胞タイプへの発現を制限する特徴がまた包含され得る。そのような特徴は、たとえば所望する細胞タイプに対して特異的である、プロモーター及び発現要素を包含する。本発明はまた、欠陥ミトコンドリアの選択的破壊のための方法も提供する。ミトコンドリアのゲノムはヘチロプラスマ性（すなわち、それは、突然変異誘発された及び正常な DNAを含む）であるので、これは正常な又は野生型 DNAを担持する損なわれていないミトコンドリアを生ぜしめ、そしてそれらの正常なミトコンドリアは、ミトコンドリアの機能を正常化する標的化された組織を再集団化するであろう。これは突然変異誘発された DNAを担持するミトコンドリアのユニークな特徴を同定し、１又は複数のそれらのユニークな特徴で指図される小分子を企画し、そしてこの小分子にミトコンドリア毒素を接合することによって達成され得る。従って、“標的分子”は、欠陥性チトクロームｃオキシダーゼ活性を有するミトコンドリアに選択的に蓄積するいづれかの分子であり、そして下記に論ぜられるようなアクリジンオレンジ誘導体及びJC-1誘導体を含む。“ミトコンドリア毒素”は、選択されたミトコンドリアを破壊し、又は無能にする分子であり、そしてホスフェート、トリホスフェート、ジニトロフェノール、マレイミド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、たとえば上記のものを包含する。毒素は、標的分子により欠陥ミトコンドリア内に濃縮され、そして欠陥ミトコンドリアを選択的に無能にし、又は破壊するであろう。前記分子は、その接合された形で活性ミトコンドリア毒素であり得る。しかしながら、その接合された形で不活性であるような分子を企画することが好ましい。標的分子と毒素との間の化学的連鎖は、ミトコンドリア特異的酵素のための基質であり、又はレドックス分解に対して敏感な基質であり得る。その連鎖の選択は、標的分子及び毒素の化学的性質、及び分解工程の必要条件に依存する。接合体が欠陥ミトコンドリアにおいて濃縮されるとすぐに、毒素が標的分子から分解され、毒素を活性化する。欠陥チトクロームｃオキシダーゼ活性を有するミトコンドリアは、アデノシン三リン酸の低められた合成及び一般的な生物エネルギー不良を導びく、そこなわれた電子輸送を示す。結果として、変異誘発された DNAを担持するミトコンドリアが拡大されるようになり、そしてミトコンドリア内膜の電気差が高まる。拡大されたミトコンドリアは、カルジオリピン及び他の負に荷電されたリン脂質のレベルを高めた。アクリジンオレンジ誘導体10Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ(NAO)は、カルジオリピンに比較的特異的に結合し、そして機能不全ミトコンドリアに蓄積する。NAO及びアクリジンオレンジの他の化学的誘導体、たとえばアクリジンオレンジの窒素環に結合される種々の長さの脂肪族鎖を有するもの（〔３，６−ビス（ジメチル−アミノ）アクリジン〕）、たとえば10Ｎ−ペンチルアクリジンオレンジ、10Ｎ−オクチルアクリジンオレンジ、及びドデシルアクリジンオレンジ（但し、これだけには限定されない）の蓄積は、ミトコンドリアのトランスメンブラン電位差に無関係である(Maftah et al.，Biochemical and Bi ophysical Research Communications 164(1)：185-190(1989))。１μＭまでの濃度で、NAO及びその誘導体は、内部ミトコンドリアマトリックスに他の分子を標的化するために使用され得る。NAOがミトコンドリア毒素、たとえばホスフェート、トリホスフェート、ジニトロフェノール、マレイミド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドに化学的に連結される場合、NAO−ミトコンドリア毒素接合体を蓄積するミトコンドリアが選択的に無能化され又は破壊され得る。他方、高い濃度（３〜10μＭ）で、NAO及びその誘導体は電子輸送、ATP加水分解及びPi−輸送を阻止し、そして呼吸を崩壊する(Maftah et al.，FEBS Letters 260(2)：236-240(1990))。それらの濃度で、N AOはミトコンドリア毒素である。本発明の態様によれば、アクリジンオレンジの窒素環に結合されるいづれかの脂肪族又は他のタイプの鎖（たとえばポリエチレングリコール）の末端は、カルボン酸、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アミノ又は類似する基によりいづれかのミトコンドリア毒素を受け入れるように化学的に誘導体化される。他の態様においては、アクリジンオレンジ及びアクリジンオレンジ誘導体へのミトコンドリア毒素の結合の追加の部位が選択される。たとえば、10−Ｎ−（10−ヒドロキシ −１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩が調製され得、そして10−Ｎ−（10−ホスホリル−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンクロリド塩又は10−Ｎ−（10−チオホスホリル−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンクロリド塩にさらに誘導体化され得る。他方、10−Ｎ−（11−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩が調製され得、そして10−Ｎ−（11−ウンデカン− １−酸−２，４−ジニトロフェニルエステル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩にさらに誘導体化される。分解に基づいて、ホスフェート、トリホスフェート、又はジニトロフェノールレベルが、欠陥ミトコンドリア内で選択的に上昇し、そしてそれらを破壊する。毒素の官能化及び共有結合は、毒素上の結合点がミトコンドリア内の毒素の機能を妨害しない場合、毒素からの NAOの分解による毒素の続いての開放に依存する必要はない。アクリジンオレンジ誘導体の調製のいくつかの例が図４及び下記例IX（ａ）− IX（ｆ）に要約されている。当業者に知られているような他の変法も許容される。本発明のさらに他の態様は、欠陥性チトクロームｃオキシダーゼ活性により、ミトコンドリア内の膜の電位差の変化を標的とする。移行された親油性カチオンは、ミトコンドリア膜の電位差をモニターするために使用される。それらのカチオンの摂取は、プロトンポンプにより創造されるミトコンドリア内部の負の沈殿物の存在に関連する。ミトコンドリアがチトクロームｃオキシダーゼ欠陥によりサイズが上昇するにつれて、トランスメンブラン電位差は上昇し、そしてそれらの欠陥ミトコンドリアが親油性カチオンを蓄積するであろう。本発明の態様によれば、それらの親油性カチオンは、ミトコンドリア毒素に接合され、そして高められたトランスメンブラン電位差を有する欠陥ミトコンドリアを破壊するために使用される。下記式：で表わされる水和された形でのローダミン 123が、ミトコンドリア膜の電位差をモニターするために広範に使用されており、そしてミトコンドリア内で毒素を濃縮するためにミトコンドリア毒素に接合することができる。化合物５，５′，６，６′−テトラクロロ−１，１′，３，３′−テトラエチルベンズイミダゾロ− カルボシアニンヨージド（JC-1）はまた、トランスメンブラン電位差に依存してミトコンドリアに蓄積する。JC-1が臨界濃度を越える場合、Ｊ−凝集体がミトコンドリアマトリックスに形成し、そしてそれらのサイズが、それらのJC-1−凝集体のミトコンドリアからのゆっくりした拡散を引き起こす（Reers et al.，Bioche mistry 30(18)：4480-4486(1991)）。JC-1はミトコンドリア毒素に化学的に接合され、正常なミトコンドリアに比べて高められたトランスメンブラン電位差を示すミトコンドリアに長い生存性の毒性化合物を生成する。 NAOに関しては、JC-1構造体に官能基を付加することによって、JC-1サブユニットに他の化学的な存在物を共有結合できる。次に、細胞への供給は、ミトコンドリア中に選択的に輸送されるべき二元剤を引き起こし、ここで二元剤は共有結合で分解され、所望する効果を発揮するミトコンドリア内に毒素を開放する。他方、毒素への官能化及び共有結合は、活性種上での結合点がミトコンドリア内の毒素の機能を妨害しない場合、活性剤からのJC-1の分解による毒素の続く開放に依存する必要はない。図５，６及び７は、いくつかの異なった方法によるJC-1の官能化を概略している。下記例IX（ｇ）−IX（ｆ）は、酸素官能価を示すが、しかし前記例は窒素、硫黄又はカルボン酸官能価により完成され得る。 JC-1の準対称性質を利用することによって、“半”JC-1であり、そしてJC-1サブユニットへの他の化学的実在物の共有結合のための点として使用され得る官能基を含む新規の化学的実在物が合成され得る。JC-1サブユニットの存在は、所望には、酵素が毒素からのJC-1サブユニットの分解をもたらし、その所望する効果の発揮を可能にするミトコンドリアへの完全な分子の選択的な輸送を促進する。他方、毒素の官能化及び共有結合は、毒素上の結合点がミトコンドリア内の活性剤の機能を妨害しない場合、毒素からのJC-1サブユニットの分解による毒素の続く開放に依存する必要はない。図８は、官能化された“半”JC-1サブユニットのいくつかの異なった方法による合成を概略する。化学的な活性種の結合は、JC-1又は“半”JC-1構造体に組込まれるヘテロ原子を通してである。この結合はいづれかの数の結合手段により、たとえば活性分子（たとえば変更されたJC-1の酸素とエステルを形成するカルボン酸）上の官能価を利用することにより又はJC-1と毒素との間の空間にリンカーを用いることにより達成され得る。それらの手段は、生物学的研究のための診断用又はラベリング分子の調製に関与する化学者に良く知られており、そしてエステル、アミド、ウレタン、ウレア、スルホンアミド、及びスルホネートエステルを包含する(S.T.Smiley et al.，Proc.Nat'l Acad.Sci．USA，88：3671-3675(19 91))。上記のように、変異誘発されたチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子を担持するミトコンドリアは、カルジオリピン及び他の負に荷電されたリン脂質並びに高められたミトコンドリアの膜電位差のレベルを高めた。結果として、ミトコンドリアは、標的分子、たとえばアクリジンオレンジ誘導体及び親油性カチオン、たとえばローダミン−123 及びJC-1誘導体を選択的に蓄積する。ミトコンドリア中への毒素の選択的な導入の他に、そのような分子はまた、効果的なインビボ及びインビトロ診断手段の基礎を形成できるイメージングリガンドを選択的に導入することができる。そのような手段は、磁気共鳴画像法(MRI)、単一光子発光の計算された局所解剖学(SPECT)及び陽電子放出性断層撮影法(PET)を含有する。本発明の実施のための好ましいイメージングリガンドは、放射性同位体（たとえば、¹² ³ I，¹²⁵I，¹⁸F，¹³F，¹⁵O，¹¹C，⁹⁹mTc，⁶⁷Ga及び同様のもの）、ヘプテン（たとえばジゴキシゲニン）、ビオチン、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ又はホースラディシュペルオキシダーゼ）、螢光団（たとえば、フルオレセインランタニドキレート又は Texas aha et al.，Seminars in Nucleur Medicine，４：324-349(1994)）。インビトロ診断の例としては、標的分子、たとえばアクリジンオレンジ又はJC -1誘導体がイメージングリガンドとしてフルオレセインによりラベルされる。そのラベルされた標的分子がヒト組織細胞培養物、たとえば一次線維芽細胞培養物中に導入される。数時間後、欠陥チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子を含むミトコンドリアを有する細胞がそのようなミトコンドリアを有さない細胞よりも高い量で、ラベルされた標的分子を選択的に吸収する。次に、その細胞を洗浄し、そして螢光活性化細胞ソーター（FACS）、たとえばBecton Dickinsonにより売られているソーターで分類する。限界は野生型ミトコンドリアを有する細胞を用いて FACSに対して確立され得る。同様に、インビボ診断においては、標的分子、たとえばアクリジンオレンジ又はJC-1誘導体を、イメージングリガンドとして⁹⁹mTc ，¹⁸F 又は¹²³Iによりラベルする。このラベルされた標的分子を、患者の血流中に導入する。数時間後、そのラベルされた標的分子は、チトクローム−オキシダーゼ−欠陥遺伝子を含むミトコンドリアを有する組織に蓄積する。そのような組織を、陽電子−感受性イメージング装置を用いて直接的にイメージングすることができる。欠陥ミトコンドリアの選択的な破壊をまた、リボザイムを用いることによって達成する。リボザイムは、細胞タンパク質とは無関係に RNA分子の鎖分割を触媒する RNA分子の種類である。特に、リボザイムは、標的のミトコンドリアmRNA分子をハイブリダイズし、そして分解するために指図され得る。分解された標的 R NAは翻訳されることができず、それによりミトコンドリアの機能のために臨界である必須タンパク質の合成を阻止する。従って、治療のためへの適用は、機能するために必要な触媒性中心ヌクレオチドを組込むリボザイムを企画し、そして機能不全な COXサブユニットをコードするmRNA分子に前記リボザイムを標的化することを包含する。リボザイムは化学的に合成され、そして細胞に供給され得、又はそれらは永久的な又は過渡的なトランスフェクションに続いて発現ベクターから発現され得る。従って、治療は、欠陥ミトコンドリアにおける変異mRNAの選択的除去により提供される。ミトコンドリア欠陥に関連する疾患のための細胞及び動物モデル細胞からミトコンドリアDNA（“mtDNA”）を消耗し、そして次に、他の細胞からのミトコンドリアにより前記細胞を形質転換するための方法が、文献に報告されている。King and Attardi，Science ，246：500-503(1989)は、mtDNAを欠くヒト細胞（ρ°206-143Bヒト骨肉腫細胞）を創造し、そして次に、外来性細胞からのミトコンドリアを有するそれらの細胞を再集団化した。種々のミトコンドリアドナーを有する形質転換体は、宿主及び受容体細胞とは異なる呼吸表現型を示し、これはミトコンドリアの遺伝子型及び核ゲノム、又はそれらの相互作用が細胞の呼吸能力に役割を演じていることを示唆する。Chomyn et al.(Chomyn，A.， et al.，Mol.Cell Biol.，11：2236-2244(1991))は、tRNA^Leuのためのミトコンドリア遺伝子に MELASが引き起こす変異誘発を担持する患者の線維芽細胞に由来するミトコンドリアを有するρ°206 細胞を再集団化した。その形質転換された細胞は、タンパク質合成及び呼吸において欠陥があり、MELAS患者からの筋肉− 生検細胞を模倣する。さらに、最近、Chomyn et al.(Chomyn，A.，et al.，Am.J .Hum.Genet．，54：966-974(1994))は、ρ°細胞の再集団化のためのミトコンドリアドナーの源として血液血小板の使用を報告している。しかしながら、上記ヒト細胞のミトコンドリア形質転換のための技法は、限定された短期間の研究のみを可能にする。野生型 mtDNAを含む、形質転換された未分化細胞は変異 mtDNAを含むそれらの細胞よりも健康であり、そして従って、培養における増殖利点を有するので、培養物を増殖することに注意を払うべきである。数世代にわたって、野生型 mtDNAを有する細胞が細胞集団で優位を占め（すなわち、変異 mtDNAが対抗選択され）、そして変異誘発された mtD NAを含む細胞は失なわれるであろう。さらに、これまでの細胞系の価値は、それらが、疾病の病因が発現される細胞と同じタイプではないので、さらに制限される。たとえば、Chomyn（Chomyn，A. ，et al.，Am.J.Hum.Genet.，54：966-974(1994)）は、MERRF患者の細胞からのミトコンドリアの受容体として骨肉腫細胞を使用した。さらに、患者に対する M ERRFの主な影響は、それが脳脊髄障害及び筋障害を引き起こす脳及び筋肉に影響を及ぼすことである。骨細胞における知られている病因は存在しない。本発明はそれらの２つの重大な制限を克服する。第１に、疾病の細胞からのミトコンドリアを未分化の不滅細胞系中に導入することによって、形質転換体を培養でほとんど無制限に維持することが可能である。未分化細胞自体を研究し、そして使用することが可能であるが、そのような細胞のサンプルを取り、そして次に、それらがなる予定になっている細胞型中へのそれらの分化を誘発することが好ましい。たとえば、神経変性疾病のためには、一次ニューロン又は神経芽腫細胞系の培養物が好ましい。なぜならば、それらは、ホルボールエステル、成長因子及びレチノイン酸による mtDNAのトランスファーの後、定期的に分化され得るからである。mtDNAのそれらの細胞中へのトランスファーは、変異ミトコンドリア mtDNAを担持し、そして神経又は神経様表現型を有する後−有糸分裂細胞に分化する細胞をもたらす。神経表現型を有する後−有糸分裂細胞は、他の細胞よりもいくつかの利点を有する。明らかに、それらの細胞は、神経変性疾病にもたらされる細胞の表現型に類似している。それらの細胞は活動的に分裂しないので、野生型 mtDNAを含む細胞の増殖性の利点は、試験期間の間、重大な問題ではない（すなわち、変異 mtD NAを含む細胞は組織培養において選択されない）。また、定期的に分化される場合、それらの細胞は培養において安定している。後−有糸分裂細胞は、培養物にそれらの生命期間にわたって変異 mtDNAを蓄積し、培養物に時間がたつにつれて、高められた生物エネルギー不良をもたらす。これは、ミトコンドリア障害の悪化、及び生物エネルギー不良と一致した生化学的出来事における変異を導びく。従って、一次ニューロン又は神経芽腫細胞系の培養物に由来するρ°細胞の使用は、ミトコンドリアゲノムにおける変化の分析を可能にし、そしてニューロン及び細胞におけるミトコンドリア障害の機能的な効果を密接に模倣する。本発明に従ってモデル系を構成するためにトランスファーされるべきミトコンドリアは、実質的にいづれの組織又は細胞源からでも単離され得る。いづれの組織からの細胞と同じように、すべてのタイプの細胞培養物が潜在的に使用され得る。しかしながら、線維芽細胞、脳組織、筋芽細胞及び血小板がドナーミトコンドリアの好ましい源である。血小板は、それらの豊富さ、及びそれらの核 DNAの欠乏のために、最とも好ましいものである。この選択は、ドナー源として使用され得る細胞タイプの範囲を限定するものではない。本発明に従ってモデルを構成するために有用な受容体細胞はいづれかのタイプの未分化細胞であるが、しかし不滅化された細胞系、特に癌細胞系が、それらの増殖特徴のために好ましい。多くのそのような細胞系は市販されており、そして新規細胞系は、当業界において良く知られている方法により単離され、そして不滅化され得る。培養された細胞系が好ましいけれども、他の個人、たとえば影響を受けていない接近した血族からの細胞もまた有用であり；これは非ミトコンドリア効果を除外する一定の利点を有する。いづれにせよ、特定の化学的（たとえば、ホルモン、成長因子、等）又は物理的（たとえば、温度、放射線、たとえば U.V光への暴露、等）誘発シグナルの添加により分化することを誘発され得る受容体細胞を用いることが最とも好ましい。受容体細胞は、それらが病気の個人において最とも表現型的に影響されるタイプのものである（又はなるように誘発され得る）ように選択されることが最とも好ましい。たとえば、ミトコンドリア欠陥に関連する神経学的な疾病のためのモデルを構成するためには、ニューロン又は神経芽腫細胞系が最とも好ましい。下記例においては、ミトコンドリアが、Chomyn（Chomyn，A.，et al.，Am.J.H um.Genet .，54：966-974(1994)）の方法の適応により単離された。しかしながらこの特定の方法を用いる必要はない。他の方法を容易に置換することができる。唯一の必要条件は、ミトコンドリアが細胞源から実質的に精製され、そしてその源の細胞が、ミトコンドリアが形質転換のために添加される培養容器において増殖し、そして成長する可能性がほとんどないように十分に破壊されることである。例においては、標的細胞のミトコンドリアDNA（mtDNA）を、臭化エチジウムによる処理により除去している。たぶん、これは、ミトコンドリアゲノムの転写又は複製を妨害することによって、及び／又はmRNA翻訳を妨害することによって作動する。従って、ミトコンドリアは、電子輸送のために必要とされるタンパク質の複製及び／又は生成を不可能にされ、そしてミトコンドリアは明らかに永久的に作動停止される。しかしながら、ミトコンドリア又はミトコンドリア DNAを除去するためにいづれか特定の方法を使用することは本発明の目的のためには必要ではないことを注目することが重要である。対象の疾病がミトコンドリア障害により引き起こされることを知られるかどうかに関係なく本発明に従って製造され、そして使用されるモデル系は、ミトコンドリア欠陥がその疾病の徴候である場合、その疾病素因に関連している場合、又は疾病に対して知られていない関係を有している場合、同じ程度に有用である。さらに、疾病が関連するミトコンドリア欠陥を有するかどうかを決定するためへの本発明のモデル系の使用は、本発明の範囲内である。さらに、本発明は、ミトコンドリアが代謝欠陥を有している疾症のためのモデル系に対して主に向けられているけれども、それはそれだけを限定するものではない。考えられるところでは、構造的又は形態学的欠陥又は異常が存在する疾患が存在し、そして本発明のモデル系は、たとえば疾病の特定の観点に注意を向ける薬物を見出すために価値があるものである。さらに、特別に効果的な又は効率的なミトコンドリア機能を有するか又は有すると思われる一定した個人が存在し、そして本発明のモデル系はそのようなミトコンドリアを研究する上で価値があるものである。さらに、ミトコンドリア欠陥が病因に寄与する可能性を除外するために、疾病特徴を有する細胞系中に既知の正常なミトコンドリアを導入することが所望される。それらの及び類似するすべての使用は本発明の範囲内であり、そして本明細書における用語“ミトコンドリア欠陥”の使用は、そのような態様を排除するためには構成されるべきではない。 IGTから NIDDMに個人を転換する分子転換の決定は、模大に医学的に重要なことであろう。IGTから真性糖尿病に転換する素因を有するそれらの個人を同定する能力を有することは、後期開始の真性糖尿病の診断において進歩的であろう。IGTの後期開始の真性糖尿病への転換を妨げることは、主な治療の進歩を表わすであろう。電子輸送鎖の成分をコードするミトコンドリア遺伝子における遺伝子欠陥は、 IGTから NIDDMへの転換に包含され得る。それらの遺伝子欠陥は、このタンパク質複合体の心配の原因及び究極的には、細胞性生化学反応のための燃料の主要源であるアデノシン三リン酸(ATP)の生成の低下を導びく。ミトコンドリアの細胞内 ATPレベルが低下する場合、細胞中へのグルコース輸送がそこなわれ、グルコースの代謝が遅められ、そしてインスリン分泌が低められ、すなわち IGTから真性糖尿病への転換におけるすべての重大な出来事が低められる。影響を及ぼされた組織は、横紋筋（主なインスリン感受性組織）及び膵臓β細胞（インスリン分泌細胞）である。それらの標的組織は、mtDNA変異誘発の蓄積に敏感である、非分割性の最終的に分化された細胞を含む。膵臓β細胞における mtDNAの変異誘発の限界レベルへの達成は、インスリン分泌の低下を促進し、IGTからの真性糖尿病への疾病表現型の転換のための分子機構を提供する。さらに、類似する機構が筋肉におけるインスリン応答性の損失を促進することができる。グルコースの代謝における一定の重要な酵素（ヘキソキナーゼ）及びインスリン分泌は、適切な機能のために ATPを必要とする。ヘキソキナーゼ及び特にグルコキナーゼは、外部ミトコンドリア膜内に位置するポーリン、すなわち電圧依存性アニオンチャンネルに結合される。ポーリンは、内部ミトコンドリア膜のアデニンヌクレオチドトランスロケーターに並置されている。それらのタンパク質複合体と一緒に、内部ミトコンドリアマトリックスからその外部膜に結合されるヘキソキナーゼへの ATPの供給のための及びそれらのキナーゼの触媒活性により生成される ADPの復帰のための導管を形成する。ヘキソキナーゼを結合するミトコンドリアにより使用される ATPは、ミトコンドリアマトリックスに由来し、細胞質に由来するものではない。ヘキソキナーゼは、活性化のためにミトコンドリア ATPを必要とする。本発明の前述及び続く記載及び種々の態様は本発明を制限するものではなく、むしろ例示的である。分子遺伝学者は、本発明の範囲内に包含されるさらなる態様を調製することができる。例略語の定義：１×SSC ＝ 150mMの塩化ナトリウム、15mMのクエン酸ナトリウム、pH 6.5〜８。 SDS ＝ドデシル硫酸ナトリウム。 BSA ＝ウシ血清アルブミン、画分IV。プローブ＝ラベルされた核酸、一般的には、膜上に固定される DNA標的に対して相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド。プローブは、放射性同位体（たとえば³²Ｐ）、ハプテン（たとえばジゴキシゲニン）、ビオチン、酵素（たとえばアルカリホスファターゼ又はホースラディシュペルオキシダーゼ）、螢光団（たとえばフルオレセイン又は Texas Red）又は化学発光団（たとえばアクリジン）によりラベルされ得る。 PCR ＝ Erlich et al.，Nature 331：461-462(1988)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようなポリメラーゼ鎖反応。材料及び方法試薬細胞培養培地は、Gibco BRL(Gaithersburg，MD)から購入された。５，５′，６，６′−テトラクロロ−１，１′，３，３′−テトラエチルベンズイミダゾーロ−カルボシアンヨージド（JC-1）及びノニルアクリジンオレンジは、Mo lecular Bioprobes(Engene，OR)から得られた。特にことわらない限り、すべての他の試薬はSigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri)からのものであった。細胞培養 SH-SYSY神経芽腫細胞（Biedler，J.L．et al.，Cancer Res． 38 ：3751-3757(1978)）を、10％の加熱不活性化されたウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100IU／ml)、ストレプトマイシン（50μｇ／ml）、グルコース（4500mg／m l）、25mMの HEPES及びグルタミン(584mg／ml)により補充されたダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）において37℃で５％ CO₂中で増殖した。FBSを熱不活性化するために、それを４℃で一晩、融解し、37℃で暖め、次に56℃で30分間、加熱した。DMEMを RPMI 1640培地上で選択した。なぜならば、RPMIは、消耗された（ ρ°）細胞系におけるミトコンドリアDNA（mtDNA）の生成を阻害することが知られているからである(Van Den Bogert，C．et al.，J．of Cellular Physiol.，1 52：632-638(1992))。酸素消費測定細胞を75cm²フラスコにおいてトリプシン処理し、HBSS（ハンクスの平衡塩類溶液、Gibco BRL）により１度洗浄し、2.0×10⁷個の細胞／mlでH BSSに再懸濁し、そして37℃で維持した。80μｌの細胞懸濁液サンプルを、HBSS 中、330μｌの最終体積でHaas撹拌ポーラログラフィーマイクロチャンバー(Haas ，R.H．et al.，Biochem.Med.，32：138-148(1984))中に導入した。酸素消費を、Yellow Springs Clark酸素電極No.5531及びモニターNo.5300（Yellow Springs ，OH）により37℃で測定した。酸素利用を、Estabrook（Methods of Enzymol．，10：41-47(1967)）により記載のようにして計算した。酵素アッセイ及びタンパク質決定クエン酸シンターゼ活性を、アッセイの前、0.04％ Triton X-100、0.1mMの５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）、100mMのトリス(pH 8.0)980μｌを含むキュベットにおいて30℃でインキュベートされた２×10⁵個の細胞のサンプルを用いて決定した。反応を開始するために、10μｌのアセチル CoA及びオキザロ酢酸を添加し、それぞれの最終濃度を50 μＭ及び 500μＭにした。キュベットをさかさまにすることによって混合し、そして 412nmでの吸光度の上昇を２〜３分間、記録した。反応はこの期間にわたって直線的である(Shepherd，D．et al.，Methods in Enzymol．，13：11-16(1969 ))。複合体IV（チトクロームｃオキシダーゼ）及び複合体II（コハク酸デヒドロゲナーゼ）を、Parker，W.D.，et al.，Neurology，40：1302=1303(1990)に実質的に記載のようにして決定した。但し、単離されたミトコンドリアよりもむしろ、COX活性のためには６×10⁵個の細胞及びコハク酸デヒドロゲナーゼのためには２×10⁵個の細胞をアッセイし、そして酵素速度の測定の前、ｎ−ドデシル−β −Ｄ−マルトシド(0.2mg／ml)と共に30℃で３分間のインキュベーションにより膜を溶解した。アッセイの反応を、キュベットに還元されたチトクロームｃを添加し、そして２度、逆さにすることによって開始せしめた。 550nmでの吸光度の変化を90秒間、連続して測定した。十分に酸化された吸光度値が、キュベットへの数粒のフェリシアニドの添加により決定された。アッセイが線状範囲であることを確認するために種々の細胞濃度での速度を得た。非酵素バックグラウンド活性を、速度定数の決定の前、１mMのシアン化カリウム(KCN )と共に細胞をプレインキュベートすることにより決定した。シアン化物感受性複合体IV活性を、バックグラウンド活性の引き算の後、一次速度定数として計算した。複合体II活性を、アッセイ緩衝液（10mMのスクシネート、35mMのリン酸カリウム、pH 7.2、 200μｇ／mlのｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、１mMの KC N、５mMの MgCl₂、１μＭのロテノン及び１μＭのアンチマイシンＡ）を含むキュベットに細胞を添加することによってアッセイした。アッセイ体積を、アッセイ緩衝液により 887の体積に調節した。30℃で10分間のインキュベーションの後、最終の電子受容体としての 0.6mMの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)100μｌを、温度平衡のために１分間にわたって添加した。合成ユビキノン類似体、すなわちＱ１（中間電子受容体）の20mM溶液３μｌを添加し、DC IPの還元を開始せしめた。30℃で１〜３分間にわたっての 600nmでの吸光度の変化を決定した。アッセイが線状範囲であることを確認するために種々の細胞濃度での速度を得た。バックグラウンドを、10mMのマロネート（競争インヒビター）の存在下での反復反応により決定した。特定の複合体II活性を、マロネート−阻害されたバックグラウンドを引き算することによって計算した。すべての酵素活性を、Lowryの方法（J.Biol.Chem.，193：265-275(1951)）により決定されるようにして、合計の細胞タンパク質に対して標準化した。複合体Ｉ（NADH：ユビキノンオキシドレダクターゼ）活性を、Parker，et al. ，Am.J.Neurol.，26：719-723(1969)に実質的に記載されるようにして決定した。但し、単離されたミトコンドリアよりもむしろ細胞をアッセイした。膜を、ハンクス緩衝溶液中、0.005％ジギトニン及び５mMのEDTA（HBSS／EDTA）と共に２ ×10⁶個の細胞／mlで23℃で20秒間インキュベートすることによって溶解した。その溶解を、50体積の冷HBSS／EDTAの添加により停止した。溶解された細胞を14 ,000ｇで10分間４℃で遠心分離した。ペレットを、１ μＭのロイペクチン、１μＭのペプタチン及び 100μＭのPMSFと共にHBSS／EDTA において約１mg／mlのタンパク質に希釈した。複合体Ｉのアッセイの前、1.5ml の Eppendorf管における 200μｌのアリコートのタンパク質懸濁液を、50％の使用サイクルで、氷充填のカップホーン音波処理機（Heat Systems-UltrasonicsモデルW225）において６分間、音波処理した。複合体Ｉのアッセイ反応を、30℃で３分間プレインキュベートされた１mlのキュベットにおいて、10mMの NADH 10μ ｌ（アッセイ緩衝液における）、及びアッセイ緩衝液（25mMのリン酸カリウム、 pH 8.0、0.25mMのEDTA及び 1.5mMのシアン化カリウム）の合計１mlの体積中、タンパク質30〜100 μｇに、エタノール中、20mMのエビキノン−１（３μｌ）を添加することによって開始せしめた。340nmでの吸光度の変化を 120秒間、測定し、その後、エタノール中、500μＭのロテノン５μｌを添加し、そして吸光度の変化をさらに 120秒間、測定し、ロテノン感受性複合体Ｉの活性を測定した。複合体Ｉの活性を、合計の速度（レテノンを含まない）−合計の速度（レテノンを含む）として定義した。それらの速度は、340nmでの組合された NADH-Q1吸光係数として6.81mM^-1を用いて曲線の最大の線状部分から計算された。染料の摂取細胞を、４〜50×10³個の細胞／ウエルで一晩、96ウエルのマイクロプレートにプレートした。培地をデカントし、そして細胞をHBSSにより一度、すすいだ。細胞を、５，５′，６，６′−テトラクロロ−１，１′，３，３′ −テトラエチルベンズイミダゾーロ−カルボシアニドヨージド（JC-1、16μＭ）又はノニルアクリジンオレンジ（１μｇ／ml）と共に37℃で60分間、HBSS 100nl 体積中で、CO₂を伴ってインキュベートした。培地をデカントし、そして細胞をH BSS 200μｌにより３度すすぎ、そしてHBSS 100μｌ中に放置した。染料の摂取を、Millipore Cytofluor No.2350螢光測定システム(Bedford，MA)を用いて測定した。JC-1及びノニルアクリジンオレンジのために使用されるフィルターセットは、それぞれ485nm(励起)及び530nm(発光) であった。細胞による染料の摂取を、インキュベーション時間、濃度及び細胞数のために最適化し、そして選択された条件（調製における操作）下で細胞数に関して直線であることを示した。ミトコンドリア膜電位差感受性染料（JC-1）の非特異的摂取を定義するために、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（CCCP、５μＭ）を、JC-1と同時に添加し、電子輸送を分離し、そしてミトコンドリア膜電位差を散逸した（Johnson，L.U．et al.，J．of Cell Biol.，88： 526-535(1981)）。いくつかの実験において、染料の摂取をまた、上記の染料濃度及びインキュベーション時間を用いて、螢光活性化された細胞分類(FACS-Scon，Becton-Dickins on)により定量化した。75cm²のフラスコからの増殖性細胞をトリプシン処理し、 PBS＋１mg／mlのグルコースにより１度すすぎ、同じ緩衝液に再懸濁し、別々の管に分離し、処理し、そして染料と共にインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を 200×ｇで10分間、遠心分離し、インキュベーション培地をデカントし、そして染色された細胞を２mlの PBS＋１mg／mlのグルコースに再懸濁し、そして細胞を、FACS分析の前、氷上に維持した。FACS分析を、485nmの励起フィルター及び 530nmの発光フィルター及び42nmのバンド幅を伴って、１×10⁴個の細胞に対して行なった。 mtDNAのスロットブロット分析 10⁷個の SH-SYSY親及びρ°細胞単離物からの合計 DNAを、Qiagenキット（Chatsworth，CA）により単離し、そして 260nmでの吸光度により及びアガロースゲル電気泳動により定量化した。種々の量の合計 D NAを、100μｌの体積の 0.2ＮのNaOHにより65℃で30分間、処理することにより変性した。サンプルを、２ＭのNH₃OAc 100μｌにより中和した。DNAを、Zetaプローブ膜(Bi o-Rad，Richmond，CA)上に真空ブロットし、そして10×SSC(1.89Ｍの塩化ナトリウム、188mMのクエン酸ナトリウム、pH 7.0)により湿潤せしめた。次に、膜をUV 光(254nm、125ｍジュール)に暴露し、そしてブロッキング緩衝液(0.2％の I-Blo ck、0.5×SSC、0.1％のTween-20)と共に周囲温度で30分間インキュベートした。膜を、開放した小さなプラスチック皿においてハイブリダイゼーション緩衝液（５×SSC、１％ SDS、0.5％ BSA）により洗浄した。アルカリホスファターゼーオリゴ接合体を、Ghosh(Bioconjugate Chem.，１： 71-76(1990))により記載されているようにして調製した。ヒトmtDNA（CGTTTGGTA TTGGGTTATGGC）に対して特異的な、COXＩサブユニットに対する２ｐモル／mlのA P−オリゴ接合体を含むハイブリダイゼーション緩衝液10mlを、膜上に積層し、そして42℃で60分間インキュベートした。膜を、緩衝液１（１×SSC、0.1％ SDS 、RTで５分）により３度、緩衝液２（0.5×SSC、0.1％ SDS、50℃で３分）により１度、緩衝液３（１×SSC、１％ Triton X-100、RTで３分）により１度、緩衝液４（１×SSC、RTで10分）により１度、及び最後に、展開緩衝液（50mMのNaHCO₃ 、１mMの MgCl₂、pH 9.5）によりすばやく１度、それぞれ洗浄した。膜を、製造業者の方法に従って、Lumi-phos（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）により展開した。mtDNAを定量化するために、COXＩ遺伝子を含む既知量のプラスミドの標準曲線を同時にプロットした。例Ｉチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の単離及びクローニング DNAをAD患者及び非アルツハイマー病（正常）の個人から得た。NINCDS基準(Mc Kann et al.，Neurology 34：939-944(1984))によりプローブできるADとして分類される、年齢相当の正常な個人及びAD患者を使用した。血液サンプルのために、６mlのサンプルを取り、18mlのデキストラン溶液（３％デキストラン、平均分子量＝ 250,000キロドルトン(kDa)、0.9％塩化ナトリウム、１mMのエチレンジニトリロ四酢酸）に添加し、混合し、そして撹拌しながら室温で40分間維持し、赤血球を沈降せしめた。血漿及び白血球画分を遠心管に移し、そして白血球を14,000×ｇでの５分間の遠心分離により集める。白血球ペレットを、水 3.8mlに再懸濁し、そして10秒間、振盪し、残存する赤血球を溶解した。0.6Ｍの塩化ナトリウム 1.2mlを添加し、そしてサンプルを14,000×ｇで５分間、再び遠心分離し、白血球のペレットをペレット化した。白血球細胞を、0.9％の塩化ナトリウム／１mMのエチレンジニトリロ四酢酸／１mMのエチレンジニトリロ四酢酸を含む溶液 0.4mlで再懸濁し、そして−80℃で貯蔵した。合計の細胞 DNAを、凍結白血球サンプル 0.2mlから単離する。凍結白血球を融解し、次に、14,000×ｇで５分間の遠心分離により集める。細胞ペレットを、ダルベッコリン酸緩衝溶液(PBS；Gibco Laboratories，Life Technologies，Inc. ，Grand Island，N.Y．；カタログ＃310-4040AJ）0.8mlにより３度洗浄し、そして水 0.3mlに再懸濁する。白血球を、その細胞懸濁液に10％ドデシル硫酸ナトリウム0.06mlを添加することによって溶解し、次に熱湯浴において10分間、前記サンプルをインキュベートする。サンプルが室温になった後、細胞残骸を、14,000 ×ｇでの５分間の遠心分離によりペレット化する。上清液を新しいマイクロ遠心管に移し、そして 0.5mlのフェノール：クロロホルム溶液（１：１）により２度及びクロロホルムにより２度抽出する。DNAを、そのサンプルに５Ｍの塩化ナトリウム0.03ml及び 100％エタノール 0.7mlを添加することによって沈殿せしめる。−80℃でのインキュベーションの後、沈殿された DNAを、14,000×ｇでの15分間の遠心分離により集める。DNAペレットを、80％エタノール 0.8mlにより洗浄し、すばやく乾燥し、次にTE緩衝液(10mMのトリス−HCl、pH 7.5、１mMのEDTA)0 .2〜0.4mlに再懸濁する。DNA濃度を、260nmでのUV吸収度により決定する。血液からの DNAの単離のためのもう１つの方法に関しては、血液サンプル５ml を採取し、そして製造業者の説明書に従って調製され、そしてHistopaque^TM分離媒体を含むAccuspin^TM（12ml又は50mlの容量、Sigma Diagnostics，St.Louis，M O）に添加する。管を1,000×ｇで10分間、遠心分離する。血漿及び白血球画分を、TE緩衝液１mlを含む遠心分離管に移し、そして白血球を、2,500rpmでの10分間の遠心分離により集める。白血球ペレットをTE緩衝液５mlに再懸濁し、そして20 ％SDS 0.2ml及び20mg／mlでのプロティナーゼＫ 0.1mlを添加する。振盪しながら37℃での１時間のインキュベーションの後、溶解物を、フェノールにより２度及びクロロホルム：イソアミルアルコール溶液（24：１）により２度抽出する。 DNAを、3.0Ｍの酢酸ナトリウム（pH 5.0）１／10体積及びエタノール２体積の添加により沈殿せしめる。−20℃での一晩のインキュベーションに続いて、沈殿された DNAを、遠心分離により集め、70％エタノールにより洗浄し、少々乾燥せしめ、そしてTE緩衝液 0.1〜0.2ml に再懸濁する。DNA濃度を、260nmでのUV吸光度により決定する。脳サンプルのためには、合計の細胞 DNAを、凍結脳組織 0.1〜0.2 ｇから単離する。凍結脳組織を、溶解緩衝液（50mMのトリス−HCl、pH 7.9、100mMのEDTA、 0.1ＭのNaCl、0.03Ｍのジチオトレイトール、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１m g／mlのプロティナーゼＫ）を含むガラスダンスホモナイザー（Pyrex，VWRカタログ #7726 -S）中に置き、そしてガラス棒で均質化する。脳均質物をインキュベーション管に移し、そして45〜50℃で30〜60分間放置する。滅菌水５mlの添加の後、均質物をフェノール／クロロホルムにより２〜３度、次にクロロホルムにより２度抽出する。DNAを、抽出されたサンプルと５ＭのNaCl １／20×体積及び 200プルーフエタノール 2.5×体積とを混合することによって沈殿せしめ、そして−20℃で配置する。DNAを 6,000×ｇでの５分間の遠心分離によりペレット化する。DNAペレットを80％エタノール10mlにより洗浄し、簡単に乾燥せしめ、そしてTE緩衝液 200〜400μｌに再懸濁する。DNA濃度を、260nmでのUV吸光度により決定する。標的のチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子配列を、ポリメラーゼ鎖反応(PCR )(Erlich et al.，Nature 331：461-462(1988))により増幅する。プライマーを、正常なヒト COX遺伝子についての公開された Cambridge配列を用いて企画する。プライマーは、サブユニットＩ，II、及びIIIをコードするミトコンドリア CO X遺伝子の上流及び下流の約 100個のヌクレオチドに位置する COX遺伝子配列に対して特異的である。プライマーは次の配列を有する： COXＩ−前方プライマー (５′−CAATATGAAAATCACCTCGGAGC−３′)(配列番号132)、COXＩ−後方プライマー(５′−TTAGCCTATAATTTAACTTTGAC−３′)(配列番号133)、COXII−前方プライマー(５′−CAAGCCAACCCCATGGCCTCC−３′)(配列番号134)、COXII−後方プライマー(５′−AGTATTTAGTTGGGGCATTTCAC−３′)(配列番号135)、COXIII−前方プライマー(５′−ACAATTCTAATTCTACTGACTATCC−３′)(配列番号136)、COXIII−後方プライマー（５′−TTAGTAGTAAGGCTAGGAGGGTG３′)(配列番号137)。プライマーは、β−シアノエチルホスホラミジット化学を利用するCyclone Pl us DNA Synthesizer（Millipore Corporation，Marlb orough，MA）又はGene Assembler DNA Synthesizer(Pharmacia)を用いて化学的に合成される。新しく合成されたプライマーを、水酸化アンモニウムを用いて保護解除し、凍結乾燥し、そしてNAP-10カラムクロマトグラフィー（Pharmacia LK B Biotechnology Inc.，Piscataway，NJ：カタログ #17-0854-01）により精製する。DNA濃度を、260nmでのUV吸光度により決定する。他方、プライマーを、標準のβ−シアノエチルホスホラミジット化学を利用するABL 394 DNA／RNA Synthesizer（Applied Biosystems，Inc.，Foster City，C A）を用いて化学的に合成する。トリチル基の分解を伴なわない場合、プライマーを水酸化アンモニウムにより保護解除し、そしてOlignonucleotide Purificat ion Cartridges(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)を用いて精製する。DNA濃度を 260nmでのUV吸光度により決定する。増幅を、10mMのトリス−HCl、pH 8.3〜9.5、50mMの塩化カリウム、１〜４mMの塩化マグネシウム、それぞれ200μＭのdATP，dCTP，dGTP、及びdTTP（“増幅カクテル”）、それぞれ 200ngの適切な COX前方及び後方プライマー及び５単位の AmpliTaq Polymesase（Perkin-Elmer Corporation；カタログ # N601-0060）を含む50〜100μｌの反応体積で 0.5〜1.0 μｇの DNAを用いて行なう。 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer Corporation)を用いての増幅は、95 ℃での10秒間の１回のサイクル、95℃で１分、60℃で１分、72℃で１分の25回のサイクル、72℃で４分の１回のサイクルでの進行を可能にし、この後、サンプルを４℃に冷却する。５つの別々の増幅反応を、個々の患者及び個々のチトクロームｃオキシダーゼサブユニットのために行なう。反応が完結した後、個々の患者及びサブユニットのためのサンプルを組合し、そして増幅された生成物を、５Ｍの塩化ナトリウム１／10体積及び 100％エタノール２体積の添加により−80℃で沈殿せしめる。 PCR増幅生成物を、遠心分離によりペレット化し、軽く乾燥せしめ、TE緩衝液4 0μｌに再懸濁し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製する(Sambrook et al.，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Labo ratory，1988)。DNAを臭化エチジウムにより染色し、そして長い波長のUV光下で可視化する。予測される長さのバンド(COXＩのためには約 1,700bp、COXIIのためには 900bp及び COXIIIのためには1,000bp)をゲルから切除する。 DNAを含むゲルを小片に切断し、そして遠心管に入れる。１Ｍの塩化ナトリウム 0.3mlをそのゲルフラグメントに添加し、そしてサンプルを−80℃で凍結し、次に融解し、そして50℃で15〜20分間インキュベートする。アガロースを、14,000×ｇでの５分間の遠心分離により沈降せしめ、DNAを含む上清液を新しいバイアルに移し、そして DNAフラグメントをエタノール沈殿により集める。増幅された DNAフラグメントを、プラスミド pCRII（Invitrogen Corp.，San Diego，CA）中にTA-Cloning Kit(Invitrogen Corp.，San Diego，CA；カタログ# K2000-01)を用いてクローン化する。連結を、１〜５μｌの PCR増幅生成物、２ μｌのプラスミド（50ng）、１μｌの10×連結緩衝液及び１μｌのT4 DNAリガーゼ（４単位）を含む11μｌの反応体積において行なう。連結反応物を10〜12℃で 15〜16時間インキュベートする。ベクター連結 PCRフラグメントを用いて、菌株XL1-Blue MRF′，XL2-Blue MRF ′及びSURE(Stratagene，San Diego，CA)のコンピテントＥ．コリ細胞を形質転換する。形質転換された細胞を、アンピシリン（50μｇ／ml）、カナマイシン（ 50μｇ／ml）、IPTG（イソプロピル−３−Ｄ−チオガラクトピラノシド、20μｇ／ml）及びX-Gal（100μｇ／ml）を含むLB−寒天プレート上に広げる。Ｅ．コリ細胞と組合して、クローニングベクターにより提供される青／白色分離機構は、白色である組換えクローンの容易な検出を可能にする。複数の白色コロニーを、個々の患者及び COXサブユニットのために選択し、そして公開された Cambridge配列に由来する一群のプライマーを用いて正しい挿入体の存在について PCRによりスクリーンする。プライマーは、サブユニットＩ， II及びIIIをコードする COX遺伝子の上流及び下流の約40〜60個のヌクレオチドに位置する配列に対して特異的である。プライマーの配列は次の通りである： C OX−Ｉ−前方プライマー(５′−AGGCCTAACCCCTGTC−３′)(配列番号138)、COXＩ −後方プライマー(５′−GGCCATGGGGTTGGC−３′)(配列番号139)、COXII−前方プライマー(５′−AGGTATTAGAAAAACCA−３′)(配列番号140)、COXII−後方プライマー(５′ATCTTTAACTTAAAAGG)(配列番号141)、COXIII−前方プライマー(５′ −GCCTTAATCCAAGCC−３′)(配列番号142)、COXIII後方プライマー(５′−GAATGT TGTCAAAACTAG−３′)(配列番号143)。溶解された細胞上清液からの DNAサンプルを、PCR増幅のための鋳型として使用する。個々のコロニーを選択し、そしてアンピシリン及びカナマイシンを含む LB−ブイヨン中で、振盪しながら（225rpm）、37℃で一晩インキュベートする。個々の培養物 100〜200 μｌを、14,000×ｇで２分間、遠心分離する。細胞ペレットを水５〜10μｌに再懸濁し、次に熱湯浴においての５分間のインキュベーションにより溶解する。細胞残骸を、14,000×ｇで２分間の遠心分離により除去する。クローンされた DNAサンプルの増幅を、増幅カクテル、それぞれ40ngの適切な COX-S前方及び後方プライマー及び0.25単位の AmpliTaq Polymeraseを含む10μ ｌの反応体積において行なう。増幅を、95℃で10秒の１回のサイクル、95℃で１分、44℃で１分、72℃で１分の25回のサイクルで行ない、そして GeneAmp PCR System 9600を用いて４℃に冷却する。PCR生成物を平行アカロースゲル電気泳動により分析する。例 II チトクロームｃオキシダーゼ(COX)遺伝子の配列決定 COX遺伝子挿入体を含むプラスミド DNAを例Ｉに記載のようにして得、そしてP lasmid Quik^TM Plasmid Purification Kit（Stratagene，San Diego，CA）又はP lasmid Kit(Qiagen，Chatsworth，CA、カタログ#12145）を用いて単離する。プラスミド DNAを50mlの細菌培養物から精製する。Stratagene方法の“Procedure for Midi Columns”に関しては、そのキット手段の段階10〜12を、−20℃での 1 00％エタノール２体積を用いての沈殿段階、6,000×ｇで15分間の遠心分離、80 ％エタノールを用いての洗浄段階及びTE緩衝液 100μｌへの DNAサンプルの再懸濁により置換する。DNA濃度を、水平アガロースゲル電気泳動又は 260nmでのUV 吸光度により決定する。二本鎖プラスミド DNAを用いての配列決定反応を、Sequenase Kit(United Sta tes Biochemical Corp.，Cleveland，OH；カタログ#70770)、Base Station T7 K it(Millipore Corp.,；カタログ# MBBLSEG01)、Vent Sequencing Kit(Millipore Corp.；カタログ# MBBLVEN01)、AmpliTaq Cycle Sequencing Kit(Perkin Elmer Corp.；カタログ # N808-0110)及びTaq DNA Sequencing Kit(Boehringer Mannh eim)を用いて行なう。DNA配列を、Base Station Automated DNA Sequencer(Mill ipore Corp.)を用いて螢光により検出する。遺伝子実験に関しては、螢光オリゴヌクレオチドプライマーを、β−シアノエチルホスホラミジット化学を用いてCy clone Plus DNA Synthesizer(Millipore Corp.)又はGene Assembler DNA Synthe sizer(Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.)上で合成する。次のプライマー配列を、サブユニットＩ，II及びIIIのための COX遺伝子の公開された Camb ridge配列から調製し、そしてフルオレセイン(F；Fluore Diteフルオレセインアミジット、Millipore Corp.；又はFluore Primeフルオレセインアミジット、Pha rmacia LKB Biotechnology，Inc.)が自動 DNA合成の最後の段階で導入される： COXＩプライマー１(５′−FAGGCCTAACCCCTGTC−３′)(配列番号144)；COXＩプライマー２(５′−FGTCACAGCCCATG−３′)(配列番号145)；COXＩプライマー３（５ ′−FCCTGGAGCCTCCGTAG−３′)(配列番号146)；COXＩプライマー４(５′−CTTCT TCGACCCCG−３′)(配列番号147)；COXＩプライマー５(５′−FCATATTTCACCTCCG −３′)(配列番号148)；COXＩプライマー６(５′−FCCTATCAATAGGAGC−３′)(配列番号149)；COXIプライマー７(５′−FCATCCTATCATCTGTAGG−３′)(配列番号15 0)；COXIIプライマー１(５′−FAGGTATTAGAAAAACCA−３′)(配列番号151)；COXI Iプライマー２(５′−FTAACTAATACTAACATCT−３′)(配列番号152)；COXIIプライマー３(５′−FTGCGACTCCTTGAC−３′)(配列番号153)；COXIIIプライマー１(５ ′−FGCCTTAATCCAAGCC−３′)(配列番号154)；COXIIIプライマー２(５′−CAATG ATGGCGCGATG−３′)(配列番号155)；COXIIIプライマー３(５′−FCCGTATTACTCGC ATCAGG−３′)(配列番号156)；COXIIIプライマー４(５′−FCCGACGGCATCTACGGC −３′)(配列番号157)。プライマーを保護解除し、そして上記のようにして精製する。DNA濃度を 260nmでのUV吸光度により決定する。配列決定反応を、製造業者の説明書に従って行なうが、但し、次の変性を除く：１）サンプルをキャッピングしないで94℃に５分間、加熱することによって、反応を停止し、そして体積を減じ、この後、４μｇの停止染料（３mg／mlのデキストランブルー、95％〜99％のホルムアミド；Millipore Corp．により配合されるような）を添加し；２）AmpliTaq Cycle Sequencing Kit 反応、Vent Sequencingキット反応、及びTaq Sequence Kitのために行なわれる温度サイクルは、95℃で10秒の１回のサイクル、95℃で20秒、44℃で20秒及び72℃で20秒の30回のサイクルから成り、続いて、キャッピングしないで94℃に５分間、加熱することによって体積を減じ、この後、４μｌの停止染料を添加する。電気泳動及びゲル分析を、Base Station Automated DNA Sequencer(Millipore Corp.)のために製造業者により供給されるBio Image及び Base Station Softwa reを用いて行なう。配列決定ゲルを製造業者の規格に従って調製する。個々の個人からの平均10種の異なったクローンを配列決定する。得られる COX配列を整列し、そして公開されている Cambridge配列と比較する。得られた配列における変異誘発が注目され、そして変異領域を再配列決定することによって確認する。 COX遺伝子を配列決定するためのもう１つの方法に関しては、例Ｉに記載しているようにして得られた COX遺伝子挿入体を含むプラスミド DNAを、Midi Colum ns（Qiagen，Chatsworth，CA）を含むPlasmid Quik^TMプラスミド精製キットを用いて単離する。プラスミドDNAを35mlの細菌培養物から精製する。単離された DN AをTE緩衝液100μｌに再懸濁する。DNA濃度をOD(260)吸収により決定する。他の方法に関しては、二本鎖プラスミド DNAを用いての配列決定反応を、Pris m^TM Ready Reaction DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Bi osystems，Inc.，Foster City，CA)を用いて行なう。DNA配列を、ABI 373A自動 DNA配列決定機(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)を用いて螢光により検出する。遺伝子ウォーキング実験に関しては、オリゴヌクレオチドプライマーを、標準のβ−シアノエチルホスホラミジット化学を用いて ABI 394 DNA／RNA Synthesizer（Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA ）上で合成する。次のプライマー配列を、サブユニットＩ，II及びIIIのための COX遺伝子の公開された Cambridge配列から調製する：配列決定反応を、製造業者の説明書に従って行なう。電気泳動及び配列分析を、ABI 373A Data Collection and Analysis Software及びSequence Navigator Software(ABI，Foster City，CA)を用いて行なう。配列決定ゲルを、製造業者の規格に従って調製する。個々の個人からの平均10種の異なったクローンを配列決定する。得られる COX配列を整列し、そして公開された Cambridge 配列と比較する。得られる配列における変異誘発を注目し、そして相補的 DNA鎖の配列により確認する。個々の個人のための個々の COX遺伝子における変異誘発を編集する。正常な個人とAD患者との間の変異誘発の比較を行ない、そして表１及び２に要約する。例 III 前もっての増幅を伴わないでのハイブリダイゼーションによる COX変異誘発の検出この例は、試験サンプルの血液の採取、DNAのブロット及びドット−ブロット型式におけるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによる検出を例示する。この例は、アルツハイマー患者のミトコンドリア DNAにおける COXII遺伝子（表１を参照のこと）のコドン74での異常変異の存在を決定するために２つのプローブを用いる。この例は、ハイブリダイゼーションのためのドット−ブロット型式を利用するが、しかしながら、他の知られているハイブリダイゼーション型式、たとえばサザンブロット、スロットブロット、“逆”ドットブロット、溶液ハイブリダイゼーション、固体支持体基材のサンドイッチハイブリダイゼーション、ビーズ基材、珪素チップ−基材及びマイクロタイターウェル−基材のハイブリダイゼーション型式もまた使用され得る。サンプル調製抽出物及び膜上への DNAのブロット：完全な血液を患者から採取する。その血液を同体積の 0.5〜１ＮのNaOHと混合し、そして周囲温度で10〜20分間インキュベートし、細胞を溶解し、タンパク質を分解し、そして DNAを変性する。次に、その混合物を前もって洗浄されたナイロン膜上に複数のアリコートで直接的にブロットする。膜を10×SS C（1.5ＭのNaCl、0.15Ｍのクエン酸ナトリウム、pH 7.0）により５分間すすぎ、膜を中和し、次に、１×SSC により５分間すすぐ。貯蔵のためには、膜を空気乾燥せしめ、そして密封する。ハイブリダイゼーションの調製においては、膜を１ ×SSC、１％ SDSによりすすぐ。他方、完全な血液１〜10mlを標準方法により分別し、そして白色細胞層(“淡黄褐色の被膜”)を分離する。その白色細胞を溶解し、液化し、そして従来の方法により DNA抽出する（有機抽出、非有機抽出又は固相）。DNAをUV吸光度又は螢光色素技法により定量化する。標準化された量のDNA（0.1〜５μｇ）を塩基的に変性し、そして膜上にブロットする。次に膜をすすぐ。細胞又はミトコンドリア DNAを調製するための他の方法、たとえば温和な細胞溶解及び遠心分離によるミトコンドリアの単離法がまた使用され得る。ハイブリダイゼーション及び検出：オリゴヌクレオチドプローブの合成、ラベリング、使用及び検出の例のためには、“Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach”，F.Eckstein ，ed.，Oxford University Press(1992)；及び“Synthetic Chemistry of Oligo nucleotides and Analogs”，S.Agrawal，ed.，Hamana Press(1993)(これらは引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。この例においては、次の配列を有する２種の COXIIコドン74プローブが使用される：ATC ATC CTA GTC CTC ATC GCC(配列番号14)(野生型)及びATC ATC CTA ATC CTC ATC GCC(配列番号29)(変異体)。異常変異誘発の検出及び定量化のために、DNAの種類サンプルを膜を同時にハイブリダイズし；１つの膜は野生型プローブによりハイブリダイズされ、他の膜はADプローブによりハイブリダイズされる。他方、同じ膜を両プローブに連続的にハイブリダイズし、そしてその結果を比較する。たとえば、固定された DNAを有する膜を１×SSC、１％ SDS中で短期間（10〜6 0分）水和化し、次にハイブリダイズし、そして５×SSC、１％ SDS、0.5％カゼイン中において30〜60分間、ハイブリダイゼーション温度（35〜60℃、使用されるプローブに依存する）でブロックする。プローブ(0.1〜10nM、理想的には２〜３ nM)を含む新鮮なハイブリダイゼーション溶液を、膜に添加し、続いて適切な温度で15〜60分間ハイブリダイズせしめる。膜を１×SSC、１％ SDSにより１〜３度、45〜60℃の温度で、それぞれ５〜10分間（使用されるプローブに依存する）、次に、周囲温度て１×SSC により１〜２度、洗浄する。ハイブリダイズされたプローブを適切な手段により検出する。同じ患者における野生型遺伝に対するAD COX遺伝子の平均的割合を、正常なプローブに対するADプローブのシグナルの割合により決定することができる。これは、AD患者における％ヘテロプラスミィ(％ heteroplasmy)の半定量的測定であり、そして疾病の重症度に相互関係する。野生型及び変異 DNAサンプルの変更及び定量化のための上記及び他のプローブは、上記表４及び５に列挙されている。例 IV ハイブリダイゼーション（前もっての増幅を伴わないで）による COX突然変異の検出Ａ．³²Ｐプローブによる RNA／DNA のスロット−ブロット検出この例は、³²Ｐプローブによる DNAのスロット−ブロット検出による COX突然変異の検出を例示する。試薬を次の通りに調製する：4XBP：２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(BSA)、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン(PVP、分子量：40, 000)を滅菌した水に溶解し、そして0.22μの酢酸セルロース膜(Corning)を通して濾過し、そして50mlの円錐形の管に−20℃で貯蔵する。 DNAを、そのサンプルにTEを添加し、90μｌの最終体積にすることにより変性する。次に、２Ｎの NaOH 10μｌを添加し、そしてサンプルを振盪し、65℃で30 分間インキュベートし、そして次に、氷上に置く。サンプルを、２Ｍの酢酸アンモニウム 100μｌにより中和する。ニトロセルロース又はナイロンの湿潤片を、製造業者の説明書に従って、切断し、スロット−ブロット装置に固定し、そして変性されたサンプルを負荷する。核酸を、80℃で真空下で１時間ベーキングし又はUV光(254nm)に暴露することによってフィルターに固定する。フィルターを、１×BP、５×SSPE、１％ SDS溶液約５mlにおいてハイブリダイゼーションのインキュベーションのために使用されるべき温度で10〜30分間、プレハイブリダイズする。15〜30個の塩基のプローブのためには、ハイブリダイゼーション温度の範囲は35〜60℃である。より短いプローブ又は低いＧ−Ｃ含有率のプローブのためには、より低い温度が用いられる。ハイブリダイゼーション溶液１ml当たり少なくとも２×10⁶cpmの検出オリゴヌクレオチドが添加される。フィルターを Scotchpak^TMのヒートシール可能なパウチ(Kapak Corporation)により二重密封し、そして90℃でインキュベートする。フィルターを、プラットフォームシェーカー上で、20×SSPE：３ＭのNaCl、0.02 ＭのEDTA、0.2Ｍのリン酸ナトリウム、pH 7.4、１％ SDSでの５分間の洗浄により室温で３度洗浄する。より高い緊縮性のためには、フィルターを、１×SSPE、１％ SDSにより１分間、ハイブリダイゼーション温度で１度洗浄することができる。可視化は、増強スクリーンによる−70℃での Kodak XARフィルム上でのオートラジオグラフィー処理による。標的の量を見積るためには、肉眼での比較により検出される標的の量と既知濃度のハイブリダイゼーション基準とを比較する。Ｂ．アルカリホスファターゼ−オリゴヌクレオチド接合体プローブを伴ってのスロット−ブロット分析による RNA／DNA の検出この例は、着色試薬又は化学発光試薬のいづれかを使用して、アルカリホスファターゼ−オリゴヌクレオチド接合体プローブによる DNAのスロット−ブロット検出によっての COX突然変異の検出を例示する。試薬は次の通りに調製される：着色試薬：着色試薬のためには、次のものを一緒に混合する：新鮮な0.16mg／ mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（BCIP）、100mMのN aCl中、0.17mg／mlのニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、100mMのトリス−HCl、５mMのMgCl₂及び 0.1mMの ZnCl₂、pH 9.5。化学発光試薬：化学発光試薬のためには、次のものを一緒に混合する： 100mM のジエタノールアミン−HCl 中、250μＭの３−アダマンチル４−メトキシ４− （２−ホスホ）フェニルジオキセタン(AMPPD)(Tropix Inc.，Bedford，MA)、１m MのMgCl₂、pH 9.5又は予備配合されたジオキセタン基質Lumiphos^TM 530(Lumigen ，Inc.，Southfield，MI)。 DNA標的（0.01〜50ｆモル）を、上記のようにしてナイロン膜上に固定する。ナイロン膜を、ブロッキング緩衝液(0.2％のI-Block(Tropix，Inc.)、0.5×SSC 、0.1％のTween 20)において室温で30分間、振盪しながらインキュベートする。次に、フィルターを、ハイブリダイゼーション溶液(５×SSC、0.5％の BSA、１％のSDS)において30分間、ハイブリダイゼーション温度（37〜60℃）で、密封可能なバッグ中で、膜１ cm²当たりハイブリダイゼーション溶液50〜100 μｌを用いてプレハイブリダイズする。溶液を除去し、そして暖かなハイブリダイゼーション緩衝液により短時間、洗浄する。次に、接合体プローブを添加し、新鮮なハイブリダイゼーション溶液において２〜５nMの最終濃度及び膜１cm²当たり50〜100 μｌの最終体積を付与する。撹拌しながら、ハイブリダイゼーション温度での30分間のインキュベーションの後、膜を、膜１cm²当たり予備加熱された洗浄−１溶液(１×SSC、0.1 ％ SDS)1.5mlを含む洗浄トレーに移し、そして洗浄温度（通常、最適なハイブリダイゼーション温度−10℃）で10分間、撹拌する。洗浄−１溶液を除去し、そしてこの段階をもう１度、くり返す。次に、洗浄−２溶液(１×SSC)を添加し、そして次に、洗浄温度で10分間、撹拌する。洗浄−２溶液を除去し、そしてすぐに、検出を着色により行なう。着色による検出は、着色試薬中に十分に膜を含浸し、そして着色の進行が適切になるまで20〜37℃でインキュベートすることにより行なわれる。着色の進行が適切である場合、その進行は水での洗浄により停止される。化学発光検出のためには、次の洗浄段階を、ハイブリダイゼーション段階（上記を参照のこと）の後に行なう。従って、膜を、洗浄−１溶液により室温で10分間、続いて洗浄−３溶液(0.5×SSC、0.1％ SDS)により50〜60℃で３〜５分間、洗浄する。次に、膜を、洗浄−４溶液（１×SSC、１％ Triton X100）により室温で10分間、１度、続いて、洗浄−２溶液により室温で10分間、洗浄する。次に、膜を、洗浄−５溶液（50mMのNaHCO₃／１mMの MgCl₂、pH9.5）により短時間（約１分）すすぐ。化学発光による検出は、発光試薬中に膜を、膜当たり25〜50μｌの溶液を用いて含浸することにより行なわれる。Kodak XAR-5フィルム（又は同等物；最大の発光は 477nmで存在する）を、光を通さないカセットにおいて１〜24時間暴露し、そしてフィルムを現像する。例Ｖ増幅及びハイブリダイゼーションによる COX突然変異の検出この例は、血液の試験サンプルの採取、DNAの調製、ポリメラーゼ鎖反応(PCR) による特定の COX遺伝子の部分の増幅、及びドット−ブロット形式でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによる突然変異の検出を例示する。サンプル調製及び DNAの調製：完全な血液を患者から採取する。血液を溶解し、そして例Ｉに記載される方法を用いることにより、DNAを PCRのために調製する。ポリメラーゼ鎖反応による標的 COX遺伝子の増幅及び膜上へのブロット：試験サンプルからの処理された DNAを、例Ｉに記載される方法を用いて増幅する。増幅の後、DNAを変性し、そして予備洗浄されたナイロン膜上に直接的に複数のアリコートでブロットする。膜を10×SSC により５分間すすぎ、膜を中和し、次に１×SSC により５分間すすぐ。貯蔵のためには、膜を空気乾燥せしめ、そして密封する。ハイブリダイゼーションのための調製においては、膜は１×SSC 、１％ SDSによりすすがれる。ハイブリダイゼーション及び検出：増幅された遺伝子のハイブリダイゼーション及び検出は、例IIIに記載のようにして達成される。本発明は開示された態様を引用により記載して来たが、当業者は、本明細書に提供される特定の例が単に例示的であって、本発明を限定するものではないことを容易に理解するであろう。種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは理解されるべきである。例 VI アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成 ABI DNA合成機を用いての固相ホスホラミジット−基材の DNA又は RNA合成のための標準の製造業者の方法を用いて、アンチセンスオリゴマーを調製する。供給者、Applied Biosystems Division／Perkin Elmer，Foster City，CA から入手できるようなホスホラミジット試薬モノマー（Ｔ，Ｃ，Ａ，Ｇ、及びＵ）を用いる。通常のオリゴマー合成のためには、１μモル規模の合成反応は、ホスホラミジットの酸化のために THF／Ｉ₂／ルチジン、及びホスホロチオエートオリゴマーの調製のためにBeaucage試薬を用いて実施される。固体支持体からの分離及び保護解除は、標準の条件下で水酸化アンモニウムを用いて実施される。精製は、逆相HPLC及び定量化を通して実施され、そして同定は 260nmでのUV吸光度測定及び質量分析法により行なわれる。例 VII 細胞培養における変異ミトコンドリアの阻害コドン 193で COX遺伝子変異体に相補的であり、そして従って、野生型 COX遺伝子の変異 RNAに非相補的であるアンチセンスホスホロチオエートオリゴマーを、0.1，0.33，1，3.3、及び10mMの最終濃度にするために10μｇ／mlの濃度でリポフェクチン（Lipofectin それらを15分間インキュベートし、次に細胞培養物に適用する。その培養物を24 時間インキュベートし、そして細胞を収穫し、そして DNAを単離し、そして前の例におけるようにして配列決定する。定量分析の結果は、合計 COXの１％以下のレベルへの変異 COX DNAの低下を示す。コドン 193で COX遺伝子変異体に非相同的であり、そして野生型 COXに非相同的であるアンチセンスホスホロチオエートオリゴマーを、0.1，0.33，1，3.3及び10mMの最終濃度にするために10μｇ／mlの濃度でリポフェクチンを含む新鮮な培地に添加し、それらを15分間インキュベートし、次に細胞培養物に適用する。培養物を24時間インキュベートし、そして細胞を収穫し、そして DNAを単離し、そして前記例におけるようにして配列決定する。定量分析の結果は、変異 COX D NAの低下を示さなかった。例 VIII インビボでの変異ミトコンドリアの阻害マウスを、グループ当たり10匹の動物から成る６つのグループに分ける。動物を標準手段により飼育する。グループ１〜４に、変異 COX遺伝子 RNAに対して相補的な、例VIに記載されるようにして調製されたアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド５μｌ中、ICV 0.1，0.33，1.0及び 3.3ｎモルをそれぞれ投与する。グループ５に、変異 COX遺伝子 RNAに対して非相補的であり、そして野生型 COX遺伝子 RNAに対して非相補的であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド５μｌ中、ICV 1.0ｎモルを投与する。グループ６に、ICVビークルのみを投与する。投与は、１日１度、10日間にわたって行なわれる。動物を殺害し、そして脳組織のサンプルを集める。この組織を前記のようにして処理し、そして前記例におけるようにして定量分析する。結果は、アンチセンス処理されたグループに関して合計 COXの１％以下のレベルに変異 COX DNAの低下を示し、そして対照グループに関しては低下は存在しない。例 IX 欠陥ミトコンドリアの検出及び選択的破壊のための剤ａ．10−Ｎ−（10−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩の調製３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン(1.0ｍモル)を、1.1当量の第三アミン塩基を含むDMF（100ml）に溶解する。これに、10−ヒドロキシ−１−ブロモデカン(1.1ｍモル)を添加し、そしてその混合物を加熱還流する。TLCによるモニターが残存する３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、その反応を冷却し、そして10−Ｎ−（10−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを単離する（0.75ｍモル）。ｂ．10−Ｎ−（10−ホスホリル−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンクロリド塩の調製 10−Ｎ−（10−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン(1.0ｍモル)をピリジン(100ml)に溶解する。これに、２−（Ｎ，Ｎ− ジメチルアミノ）−４−ニトロフェニルホスフェート（1.1ｍモル）を、Taguchi (Chem.Pharm.Bull.，23：1586(1975))の方法に従って添加し、そしてその混合物を窒素雰囲気下で撹拌する。TLCによるモニターが残存する10−Ｎ−（10−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、その反応を Taguchiの方法に従って処理し、そして10−Ｎ−（10−ホスホリル−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを単離する（ 0.75ｍモル）。ｃ．10−Ｎ−（10−チオホスホリル−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンクロリド塩の調製 10−Ｎ−（10−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン(1.0ｍモル)をDMF(100ml)に溶解する。これに、Eckstein(Journal of the American Chemical Society ，92： 4718(1970))の方法に従ってトリイミダゾリル−１−ホスフィンスルフィド（1.1 ｍモル）を添加し、そしてその混合物を窒素雰囲気下で撹拌する。TLCによるモニターが残存する10−Ｎ−（10−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、反応をEcksteinの方法に従って処理し、そして10−Ｎ−（10−チオホスホリル−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを単離する（0.75ｍモル）。ｄ．10−Ｎ−（11−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩の調製３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン(1.0ｍモル)をDMF(100ml)に溶解する。これに、11−ブロモウンデカン酸(1.1ｍモル)を添加し、そしてその混合物を加熱還流する。TLCによるモニターが残存する３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、その反応を冷却し、そして10−Ｎ−（11−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを単離する（0.75ｍモル）。ｅ．10−Ｎ−（11−ウンデシル−２，４−ジニトロフェニルウレタン）−３，６ −ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩の調製 10−Ｎ−（11−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン (1.0ｍモル)をTHF(100ml)に溶解する。これに、２，４−ジニトロフェノール(1. 1ｍモル)及びジフェニルホスホリルアジド(1.1ｍモル)を添加し、そしてその混合物を70℃に加熱しながら撹拌する。TLCによるモニターが残存する10−Ｎ−（1 1−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、反応を冷却し、そして10−Ｎ−（11−ウンデシル−２，４−ジニトロフェニルウレタン）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを単離する（0.75ｍモル）。ｆ．10−Ｎ−（11−ウンデカン−１−酸２，４−ジニトロフェニルエステル）− ３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンブロミド塩の調製 10−Ｎ−（11−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン (1.0ｍモル)をDMF（100ml）に溶解する。これに、２，４−ジニトロフェノール( 1.1ｍモル)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.1ｍモル)及びヒドロキシベンズトリアゾール(1.1ｍモル)を添加し、そしてその混合物を撹拌する。TLCによるモニターが残存する10−Ｎ−（11−ウンデカン酸）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、反応を冷却し、そして10−Ｎ−（11−ウンデカン−１−酸２，４−ジニトロフェニルエステル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを単離する（0.75ｍモル）。ｇ．Ｎ′−（２−ヒドロキシエチル）−JC−１の調製 Yamamoto et al.（Bulletin of the Chemical Society of Japan ，46：1509- 11(1973)）の方法に従って、２−メチル−５，６−ジクロロ−Ｎ−エチル−Ｎ′ −（２−ヒドロキシエチル）ベンズイミダゾールを、アニリン及びエチルホルトホルメートと共に 100℃で加熱する。これに、無水酢酸及び酢酸カリウムを添加し、そして加熱を 160℃で続ける。この反応を Yamamoto et al.に記載のようにして処理し、そして生成物を単離する。ｈ．ビスＮ′−（２−ホスホリル−１−エチル）−JC−１の調製Ｎ′−（２−ヒドロキシエチル）−JC−１（1.0ｍモル）をピリジン(100ml)に溶解する。これに、Taguchi(Chem.Pharm.Bull.，23,1586(1975))の方法に従って、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４−ニトロフェニルホスフェート（1.1ｍモル）を添加し、そしてその混合物を窒素雰囲気下で撹拌する。TLCによるモニターが残存する10−Ｎ−（1 0−ヒドロキシ−１−デシル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジンを示さない場合、反応を Taguchiの方法に従って処理し、そしてビスＮ′−（２− ホスホリル−１−エチル）−JC−１を単離する（0.75ｍモル）。例Ｘ不滅化されたρ°細胞系の調製未分化状態で増殖され、そして維持され得、そして最終分化を受け得る、ミトコンドリア−DNA 突然変異を発現する細胞系を生成するために、神経芽腫細胞のミトコンドリア DNAを消耗せしめ、そしてAD患者の血小板から単離されたミトコンドリアをそれらの細胞中に配置した。それらをρ°細胞に転換するために、SH-SY5Y神経芽腫細胞（Biedler，J.L．e t al.，Cancer Res.，38：3751-3757(1987)）を、臭化エチジウムの存在下で種々の期間（30〜70日）及び種々の濃度（0.01〜５μｇ／ml）で培養した。細胞を週ごとに、継代し、そして培地を３日ごとに交換した。それらよりも高い臭化エチジウム濃度は、２〜２週間後、細胞の死をもたらした。増殖速度における著しい低下が約33日で生じた。追加の研究のために選択された細胞系を、33又は64日間、種々の濃度に暴露した。33，45又は65日間 5.0μｇ／mlの臭化エチジウム（ EtBr）により処理された細胞系を、それぞれρ°33／５，ρ°45／５及びρ°64 ／５と命名した。呼吸欠陥変異体の生成を、シアニド阻害性Ｏ₂利用によりモニターした。酸素利用は時間及び臭化エチジウム濃度の上昇につれて低下し、そして図９（また、表６も参照のこと）に示されるように、5.0μｇ／mlの濃度の臭化エチジウムへの暴露の64日後、検出できなかったことが観察された。酸素利用を、33日（黒丸）又は64日（白丸）間、種々の濃度のEtBrにより処理された細胞においてポーラドグラフィーにより決定した。非特異的なＯ₂消費を１mMの KCNの存在下で決定し、そして測定された合計の速度から引き算した。データは、少なくとも２回の独立した実験のためにS.E.M.で示される。電子輸送の遮断における臭化エチジウムの有効性を、種々の濃度でEtBrにより64日間、細胞を処理し、そして複合体Ｉ（ロテノン）、複合体III（アンチマイシン）及び複合体IV（シアン化物）の特異的インヒビターの存在下で酸素消費を測定することによって確認した。図10に示されるように、５μｇ／mlでの臭化エチジウムによる処理は、複合体Ｉ阻害又は複合体III 阻害のいづれかに対して敏感である実質的にすべての酸素利用の抑制をもたらした（図10）。データは、少なくとも２回の独立した実験のためにS.E.M.で示される。複合体II酵素活性は、そのサブユニットのいづれもミトコンドリア DNAによりコードされておらず、そしてそのタンパク質が機能的な状態でρ°細胞の拡大されたミトコンドリア中に明らかに通常には輸送され、そして挿入されるので、ほとんど不安の原因をつくらなかった。同様に、ミトコンドリアマトリックス酵素のクエン酸シンターゼの活性は、親及びρ°SH-SY5Y 細胞において比較できるが、しかしρ°64／５細胞において約50％低下した。この酵素の感応性のおそさは、それが核遺伝子によりコードされ、そしてその発現が mtDNA消耗により影響されるべきでないので、驚くべきではない。明らかに、それはまた、通常には、 ρ°細胞の拡大されたミトコンドリア中に機能的な状態で輸送され、そして挿入される。それらの発見は、複合体IV、複合体III及びクエン酸シンターゼの活性の直接的な測定により確かめられ（表６）；ρ°64／５細胞及びρ°33／５細胞の両者についての複合体IV活性が実質的に検出できなかったことを注目すべきである。 ρ°細胞を、増殖を助けるためにウリジン（50μｇ／ml）及びピルベート（10 0μｇ／ml）により補充された SH-SY5Y培地において培養した(King，M.P．et al .，Science ，246：500-503(1989))。図11に示されるように、100μｇ／mlのピルベート（黒四角）又はピルベート及びウリジンの両者（白丸）の存在下で増殖されたρ°64日／５μｇ／ml臭化エチジウム(“ρ°64／５”)は増殖したが、しかし50μｇ／mlのウリジン（白四角）を含む培地又は添加なし（白三角）での培地に置かれたρ°65／５細胞は増殖しなかった。親SH-SYSY（黒丸）は、添加なしでの陽性対照として増殖され、そして最良に増殖したことは驚くべきではない。個々の点は、24ウェルプレートにおける三重ウェルのウェル当たりの平均細胞数を表わす。SH-SYSYのための世代時間は通常の培地において24時間であり；これはピルベートを含む培地におけるρ°64／５細胞に関して48時間に匹敵した。 ρ°64／５細胞は、親細胞系と同じ最終密度に達した。添加を受けなかった細胞のように、ウリジンは単独で、ρ°細胞の増殖を助けず、そしてプレーティングの３日後、細胞の死が示された。増殖を助ける単独のピルベートの能力は、ウリジンの新たな合成に必須である酵素ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼが本発明のρ°細胞においてまだ活性的であることを示す。mtDNAの消耗は、他のρ°細胞単離物においてウリジン栄養要求性を引き起こすことが示されている（King et al.，Science ，246：500- 503(1989)）。 ρ°表現型からの転換率を、75cm²のフラスコに２×10⁶個の細胞をプレートし、そしてウリジン／ピルベート欠陥選択培地において培養することによって決定した。ウリジン及びピルベートに対する生存性の依存性が、ほとんどの細胞が死滅した２〜３週間以内に出現した。次に、ひじょうに少数の生存細胞を継代培養し、そして転換体（revertants）として命名した。それらの条件下で生存体により測定されるような転換頻度は、３週で、ρ°33／５クローンに関して１×10^-5であり、そしてρ°64／５に関して１×10^-6であった（表６）。そのひじょうに少数の生存細胞を継代培養した。複合体II、複合体IV、クエン酸シンターゼ及びＯ₂利用の活性はそれらの継代培養において対照のレベルに戻っており、これは選択培地における生存体による転換の評価が ETC活性の戻りにより類似のものとして示されていることを示唆する。螢光染料ノニルアクリジンオレンジの結合は、図12に示されるように64日間の臭化エチジウム暴露の関数として SH-SY5Y細胞においてひじょうに高められた。アッセイを96ウェルマイクロプレートにおいて行ない；細胞を、１μｇ／mlのノニルアクリジンオレンジの添加の24時間前、ウェル当たり２×10⁴個の細胞でプレートした。測定を上記のようにして行なった。データは、８回の実験の平均± 標準偏差として示される。ノニルアクリジンオレンジはカルジオリピン、すなわち内部ミトコンドリア膜脂質に選択的に結合するので、その摂取はミトコンドリアの数及び大きさに相互関係する（Leprat， P.，et al.，Exp.Cell Res.，186：130-137(1990)）。図12に示されるデータは、臭化エチジウムにより処理された細胞は、ミトコンドリア DNAを欠く細胞は大きな不規則なミトコンドリアを有することが観察されているので（Morais，R.， et al.，In vitro Cell and Devel.Biol.，21：649-658(1988)）、予測される増量の内部ミトコンドリア膜を有することを示す。同様に、図13に示されるように、カチオン性染料JC-1の結合はまた、臭化エチジウム処理された細胞において高められた。測定は、16μＭのJC-1を用いて、記載されるような96ウェルマイクロプレートにおける螢光プレートリーダーにより行なわれ、そして非特異的な摂取が５μＭのCCCPの同時添加により測定された。細胞を、染料の添加の24時間前、２×10⁴個の細胞／プレートでプレートし、そして測定を上記のようにして行なった。データは、８回の実験の平均±SDとして示される。JC-1はトランスメンブラン電位差の関数としてミトコンドリア膜を通して平衡化することが知られているので（Ehrenberg，B.，et al.,Biophysical J. ，53：785-794(1988)）、図13に示されるデータは、mtDNAを欠いている細胞に予測される拡大されたミトコンドリアが、ミトコンドリア DNAの欠乏にもかかわらず及び複合体IV活性のその得られる欠乏にもかかわらず、高められたトランスメンブランプロトングラジエントを確立することができることを示唆する。これは、ノニルアクリジンオレンジ摂取の観察される上昇と調和する（上記を参照のこと）。 ρ°細胞が mtDNAを欠いている最後のさらなる確認として、全体の DNAを、５ μｇ／mlの濃度で64時間、臭化エチジウムに暴露された SH-SY5Y細胞又は未処理の SH-SY5Y細胞から抽出し、そして mtDNAをサザンブロットにより分析した。等量の DNAをアガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、そして³²Ｐ −ラベルされた mtDNA特異的プローブによりハイブリダイズせしめた。SH-SY5Yρ°細胞は、既知量の COXＩ遺伝子に基づく標準の曲線に比較される場合、細胞当たり１つよりも少ない mtDNAを有した（データは示されていない）。これは検出できる mtD NAの実質的な発見ではなく、すなわち結論的には、それらの細胞がρ°状態で存在したことを確証した。前記結果は、ρ°表現型を達成するために使用されるEtBrの濃度が細胞タイプ特異的であるように思われることを示唆する。親神経芽腫細胞系は、ρ°表現型を誘発するためには長期間、高い用量のEtBr（５μｇ／ml）を必要とし；必要とされる用量は、それぞれρ°線維芽細胞（Lepret，P.，et al.，Exp.Cell Res. ，186：130-137(1990)）及びρ°骨肉腫細胞(king et al.，Science ，246：500 -503(1989))を生成するのに必要とされる量よりも10〜100 倍高かった。SH-SYSY 細胞はEtBr−誘発の毒性に対して高い耐性を有することができる。もちろん、新タイプの細胞のために必要とされる時間及び臭化エチジウムの量の滴定は十分に当業者の範囲内である。神経芽腫細胞の場合、ρ°表現型が出現した後すぐに、連続した処理が許容できる低い転換率を得るために必要とされることを注目することは重要であり、ここで転換とは、ρ°細胞が補充されるピルベートなしに増殖される場合の野生型の表現型の再出現として定義される。ドナー血小板により融合されるρ°細胞の高い転換率は、サイブリッドのコロニーの選択の間、誤った陽性をもたらすであろう。10⁶の細胞当たり１以下の転換の許容できるレベルが、64日間のEtBr処理の後に達成された。再び、必要とされる処理の期間の決定は十分に当業者の範囲内である。例ＸＩ不滅ρ°細胞の分化 ρ°細胞の分化を、ホルボールエステル(12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート、TPA)又は成長因子を用いて誘発した。16μＭの TPA又は１ μＭのレチノイン酸による２週間の処理の後、ρ°細胞は、分化する神経芽腫細胞に典型的な分泌顆粒を有する長い軸索を発現した。従って、筋芽細胞に由来するρ°細胞の情況とは対照的に、ρ°細胞に由来するそれら神経芽腫は、形態学的な基準により判断される場合、明らかに分化する能力を保持する(Herzberg，N .H．et al.，Biochim.et Biophys.Acta ，1181：63-67(1993))。これは、トランスダクション及び分化を表示するために必須である、核遺伝子によりコードされるタンパク質が機能的であり、そしてEtBr処理により影響されないことを示唆する。例ＸII AD及びPDサイブリッドの調製 ρ°64／５神経芽腫細胞を、12人のアルツハイマー病、３人のパーキンソン氏病及び２人の年齢相当の対照の患者からの血小板により形質転換し、サイブリッド細胞（Ψ）と称するものを創造した。 ETCサブユニットをコードする mtDNAにおいて単一又は複数の突然変異を有するミトコンドリアを担持するAD及びPD患者、及び対照（正常）の患者からの血小板を、抗凝集剤（クエン酸デキストロース）を含むBecton Dickinson（Rutherfo rd，NJ）Vacutainer中に採取された完全な血液10mlから単離した。対照の SH-SY 5Y細胞のサンプルを同様に処理した。サンプルを、Histopaque(Sigma)の層上のA ccuspin管(Sigma)中に移し、そして1000×ｇで10分間、室温で遠心分離した。血小板及び単核リンパ球の両者を含む淡黄褐色の被膜を単離し、５体積の PBSに再懸濁し、そして1700×ｇで10分間遠心分離し、デカントし、そして５mMのEDTAを含むDMEM（融合培地）に再懸濁した。形質転換を、Chomyn et al.(Chomyn，A.，et al.，Am.J.Hum.Genet.，54：966 -974(1994))の変法により達成した。ｐ°細胞をトリプシンにより培養プレートから除去し、２度すすぎ、そして最終的に融合培地に再懸濁した。ρ°細胞(４ ×10⁵、クローンρ°64／5.0)を、２mlの融合培地中で、血小板（１×10⁷〜１× 10⁸個の血小板）と共に組合し、そして37℃で10分間インキュベートした。負の対照は、添加される血小板を有さないρ°細胞であった。その細胞混合物を 300 ×ｇで10分間、遠心分離し、57mlの融合培地に再懸濁した。融合培地におけるポリエチレングリコール（70％ｗ／ｖ PEG1000、J.T.Baker，McGraw Park，II）を細胞に添加し、200mlの最終体積を達成した（最終 PEG濃度、50％）。細胞を室温で 1.5分間インキュベートし、次に暖かな正常ρ°細胞培地により10mlの最終体積に希釈し、そして37℃で10分間、再生せしめた。融合細胞を75cm²フラスコにプレートした。培地を次の日に交換した。細胞を、ρ°培地において１週間、２日ごとに培地を交換しながら再生せしめた。外因性血小板ミトコンドリアにより再集団化された、形質転換された細胞（サイブリッド）を、残存するウリジンを除去する10％の透析された熱不活性化 F BSを含む、ピルベート及びウリジンを欠いている培地において培養することによって選択した。それらの条件は、再集団化された細胞のみが生存できるように企画された。形質転換の効能は、生存する細胞の数により判断される場合、１〜２％の間で変化した。約１×10³個の融合された細胞を、15cm組織培養皿上に散在してプレートした。単離されたコロニーは、初期融合の４〜６週間後に出現した。クローンρ°64 ／5.0(10^-6)のために観察される計算された転換率に基づけば、１以下の自発的に転換されたクローンがそれらの培養物に出現するべきであった。好気性表現型が、COX(疾病表現型)をコードする遺伝子に特定の突然変異を有する mtDNA又はその mtDNAを担持するミトコンドリアによる形質転換により一部、助けられる。異種生存細胞（多量相）及び単離された均質クローンの両者を増殖し、そして複合体Ｉ及びIV活性についてアッセイし、そして親 SH-SY5Y細胞からの複合体Ｉ及びIV活性と比較した（表７）。アルツハイマー病の脳及び血液に関連する複合体IV欠損（Parker，W.D.，et al.，Neurology ，40：1302-1303(1990)）は、ρ °64／５神経芽腫細胞に都合良く移行された。３人の患者、ΨAD#2330，ΨAD#2418 及びΨAD#2490 の多量相は、低い複合体I V特異的活性を有した。平均欠損率は27.8％であった。パーキンソン氏病の脳及び血液に関連する複合体Ｉ欠損はまた、ρ°64／５神経芽腫細胞に都合良く移行された。平均の欠損率は44.5％であった。年齢に相当した対照のサイブリッド（ Cybrid）、ΨCon#0049及びΨCon#0064は、正常な複合体Ｉ及びIV活性を有した。多量相から単離されたクローンは類似する値を有したが、しかし高い程度の変動を示した。これはクローン内の種々の程度のヘテロプラズミィを表わすことができる。ΨAD#2418 についての多量相の複合体IV活性を、３種の細胞継代培養から成る３週の間モニターし、そしてそれらは安定し続けた。従って、移行される欠陥は少なくとも３種の細胞継代培養の間、安定して維持されているように思われ、そしてたぶん永久的である。融合された細胞は、AD及びPD神経細胞の特徴である複合体Ｉ及びIVの酵素活性において特定の低下を示したので、それらの方法は、AD及びPD患者の血液及び脳に見出される主要な生化学的及び遺伝子的欠陥のさらなる研究のための細胞モデル（AD及びPDサイブリッド細胞）を提供する。例ＸIII ADサイブリッドを用いての薬物のスクリーニング及び処置 ADサイブリッド細胞は新規及び独得の細胞モデル系を構成する。ADの処理において潜在的に有用である薬物のスクリーニングのためにモデル系を使用するためには、ADサイブリッドを、既知の剤、又はAD患者における電子輸送欠陥又はこの欠陥に明らかに起因する細胞劣化を改良する能力を有すると思われる剤の存在下で増殖せしめる。他方、スクリーニングは、完全に経験的な態様で行なわれ、そしてスクリーニングのための化合物は世界のいづれの場所においても入手できるものからランダムに選択され得る。もう１つの手段は、化合物の組合せの存在下でサイブリッドを増殖せしめることであり、又は他のタイプの栄養剤、ビタミン又は他の処置にそれらをゆだねることである。与えられた化合物による処理の期間の後、その処理されたサイブリッド培養物を上記方法を用いて試験し、未処理のサイブリッド対照サンプル及び正常な細胞の COX活性に対するそれらの COX活性を決定した。CO X活性の測定の他に、処理された及び未処理のサイブリッド対照が、その化学剤の添加がAD又はPDの特徴である形態学的変化を減じたかどうかを決定するために顕微鏡により観察される。処理された細胞が未処理のサイブリッドに対して、CO X活性の低下及び／又は形態学的劣化の低下を示す場合、その処理に使用される化合物は、ADを処理するための薬物としてのそれらの潜在的な有効性を評価するさらなる研究を保証する。さらに、そのような陽性結果は、他の類似する化学構造体がそのような活性についてスクリーンされることを示唆する。例ＸIV PDサイブリッド ADサイブリッドの構成について記載されるような態様で、パーキンソン氏病を有する患者及び年齢相当の対照からの血小板を、上記ρ°細胞により融合せしめ、PDサイブリッドを創造する。次に、個々のサイブリッドからのクローンを上記のようにして単離し、そしてそれらの複合体Ｉ活性を本出願においてあらかじめ記載された方法により測定する。例ＸＶ ADサイブリッド動物の調製もう１つの態様において、COXをコードする遺伝子に複数の又は単一の特異的な突然変異を担持するAD患者からの mtDNA又はミトコンドリアを、動物中に導入し、モザイク動物を創造する。新しく受精されたマウス胚（３〜10個の細胞段階）を、妊娠したマウスのファロピアン管から塩溶液洗浄により洗浄する。解剖用顕微鏡下で、個々の細胞を細かく切断し、そして上記態様に従って、ρ°状態を誘発するために臭化エチジウムにより処理する。臭化エチジウム処理のための適切な期間及び濃度の決定は、ミトコンドリアの機能が失なわれたことを確かめるためにサザン分析のためのいくつかの胚の犠牲を要する。次に、AD患者の血小板から単離された外因性ミトコンドリアを有する、そのようにして処理された細胞を再集団化し、ここでこの調製法は上記例ＸIIに記載されている。次に、１又は複数のその得られるサイブリッド細胞を、ファロピアン管中へのマイクロインジェクションにより擬似妊娠の子宮中に移植する。妊娠の最後で、１又は複数の子孫からの血液細胞の COX活性を試験し、ミトコンドリアがAD患者のミトコンドリアのように挙動することを確かめる。ADの COX遺伝欠陥の存在はまた、DNA配列分析により確かめられ得る。例ＸVI ADサイブリッド動物を用いての薬物のスクリーニング及び処置既知又は未知の剤を、サイブリッド動物に供給し、そして疾病表現型を助け、又は疾病表現型に関連する有害な結果に対して保護する剤を、アルツハイマー病の処置のための潜在的な薬物としてのさらなる研究のために選択する。さらに、細胞、たとえばニューロン及び筋芽細胞を、それらの動物から単離し、そして疾病表現型を助け又は疾病表現型に関連する有害な結果に対して保護する剤についてスクリーンするために使用する。そのような剤はまた、アルツハイマー病のための潜在的な処置としてさらに研究されるべきである。例ＸVII 糖尿病血液サンプルからの DNA抽出 14人の NIDDM患者からの血液サンプル（７〜８ml）を、EDTA Vacutainer管（S cientific Products，Waukegan Park，IL）に採取する。その血液サンプルを 25 00rpmで10分間、４℃で回転せしめる。白血球細胞及び血小板を含む淡黄褐色の被膜を除去する。５mlのTE緩衝液（10mMのトリス−HCl、１mMのEDTA、pH 7.5）を、前記淡黄褐色の被膜に添加する。この混合物を 2500rpmで10分間、４℃で回転せしめる。上清液を除去し、そしてTE緩衝液５ml、20％ SDS 200 μｌ及びプロテイナーゼＫ(400μｇ／mlの最終濃度)100μｌをペレットに添加する。この混合物を、連続的に振盪しながら、37℃で４時間インキュベートする。 DNAを、フェノールによる２回の洗浄、続いてクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）による２回の洗浄により抽出する。個々の洗浄の後、溶液を混合し、５分間放置し、そして 7000rpmで７分間、室温で回転せしめる。ゲノム DNA を、１／10体積の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２体積の 100％エタノールの添加により沈殿せしめる。DNAを４℃で20分間、回転し、そして上清液を除去する。次に、エタノール（70％）を添加し；その混合物を短時間、回転し、そして上清液を捨てる。乾燥ペレットをTE緩衝液に再懸濁し、そして使用まで、４℃で貯蔵する。DNAを、１：50の希釈溶液のＡ₂₆₀吸光度により定量化する。DNA配列決定標的のチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子配列を、例Ｉに記載のようにして増幅し、そしてクローン化する。例Ｉに記載のようにして得られた COX遺伝子挿入体を含むプラスミドDNAを、Midi Columnsを有するプラスミドQuik^TM Plasmid Purification Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)を用いて単離する。プラスミド DNA を35mlの細菌培養物から精製する。単離された DNAを、TE緩衝液 100μｌに再懸濁する。DNAを、１：50の希釈溶液のＡ₂₆₀吸光度により定量化する。二本鎖プラスミド DNAを用いての配列決定反応を、Prism^TM Ready Reaction D yeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems Division，P erkin Elmer Corp.，Foster City，CA)を用いて行なう。DNA配列を、ABI 373A A utomated DNA sequencer(Applied Biosystems Division，Perkin Elmer Corp.， Foster City，CA)を用いて螢光により検出する。遺伝子ウォーキング実験のために、オリゴヌクレオチドプライマーを、標準のβ−シアノエチルホスホラミジット化学を用いて、ABI 394 DNA／RNA Synthesizer 上で合成する。次のプライマー配列を、サブユニットＩ，II及びIIIのための COX遺伝子の公開された配列から調製する：配列決定反応を、製造業者の説明書に従って実施する。電気泳動及び配列の分析を、ABI 373A Data Collection and Analysis Software及びSequ ence Navigator Software(Applied Biosystems Division，Perkin Elmer Corp. ，Foster City，CA)を用いて実施する。配列決定ゲルを製造業者の規格に従って調製する。個々の個人からの平均10種の異なったクローンを配列決定する。得られる COX配列を整列せしめ、そして公開されている配列と比較する。公開されている配列とその得られる配列との差異を注目し、そして相補的 DNA鎖の配列により確かめる。後期開始の糖尿病を有する５人の患者は、COXサブユニット１及び２をコードする遺伝子において突然変異を有した（表９）。それらの突然変異は、神経学的な（アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンチントン病、Diffuse Lewy Bod y，Lews Bodyタイプの老人性痴呆症、Halvordan Spatz，パラ核上性麻痺、及び他の神経学的な疾病）又は老人対照には見出されない。上記数字は、一定の塩基の変更が個々の糖尿病患者のために配列決定された10 種のクローンにおいて観察されたことを示す。塩基の変更は、ヒトミトコンドリア COXサブユニットについて公開された配列に対しての観察された配列における差異である。コドン数は、その遺伝子の５′−末端の読み取り枠の開始から決定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/00 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 0276−2Ｊ 33/50 Ｔ 33/50 0276−2ＪＰ 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デイビス，ロバートイー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92130, サンディエゴ，グレンクリフウェイ 13272 (72)発明者ミラー，スコットウィリアムアメリカ合衆国，カリフォルニア 92075, ソレナビーチ，サウスナルドロード 781，アパートメント＃８

Claims

【特許請求の範囲】１．対象におけるアルツハイマー病の存在を検出するための方法であって、ａ）前記対象からミトコンドリアを含む生物学的サンプルを得；そしてｂ）アルツハイマー病の存在と相互関係するミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼ遺伝子の配列における少なくとも１つの突然変異を見出す；段階を含んで成る方法。２．少なくとも１つの突然変異が、シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155とコドン 415との間に存在する請求の範囲第１項記載の方法。３．シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子における少なくとも１つの突然変異が、コドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 4 15から成る群から選択されたコドンに存在する請求の範囲第２項記載の方法。４．少なくとも１つの突然変異がシトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン 20とコドン 150との間に存在する請求の範囲第１項記載の方法。５．シトクロムｃオキシダーゼII遺伝子における少なくとも１つの突然変異が、コドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110及びコドン 146から成る群から選択されたコドンに存在する請求の範囲第４項記載の方法。６．ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の配列における少なくとも１つの突然変異の存在が、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより決定される請求の範囲第１項記載の方法。７．ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の配列における少なくとも１つの突然変異の存在が、（ａ）標的核酸上でお互い隣接してアニールするオリゴヌクレオチド配列の連結に基づく方法；（ｂ）プライマーの組の使用に依存するポリメラーゼ鎖反応又はその変法；及び（ｃ）単一のヌクレオチドプライマー誘導の拡張アッセイ、から成る群から選択された方法を用いて決定される請求の範囲第１項記載の方法。８．前記連結方法がリガーゼ鎖反応である請求の範囲第７項記載の方法。９．前記使用されるプライマーの組のうち、１つが十分に相補的であり、そして他がミスマッチを含む請求の範囲第７項記載の方法。 10．前記ミスマッチが、使用されるプライマーの組の内部又は３′末端でのいづれかである請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子が、PCR, RT−PCR 及びインビトロDNA 複製の群から選択された方法を用いて増幅される請求の範囲第１項記載の方法。 12．前記突然変異が、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子のセンス又はアンチセンス鎖のいづれかに対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成るプローブにより見出される請求の範囲第１項記載の方法。 13．前記プローブが、（ａ）シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415；並びに（ｂ）シトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110、及びコドン 146の群から選択された１又は複数のコドンのセンス及びアンチセンス鎖に対して相補的な領域を含む請求の範囲第12項記載の方法。 14．アルツハイマー病を引き起こす遺伝子突然変異を検出するための方法であって、ａ）アルツハイマー病を有することが知られている対象からのミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の配列を決定し；ｂ）前記配列と、既知の野生型ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の配列とを比較し；そしてｃ）前記対象における再発性突然変異を同定する段階を含んで成る方法。 15．前記既知の野生型ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子が、〔配列番号１〕、〔配列番号２〕及び〔配列番号３〕から選択される請求の範囲第 14項記載の方法。 16．アルツハイマー病の存在と相互関係する遺伝子突然変異を含む、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の部分に対応するか又はその部分に対して相補的である単離されたヌクレオチド配列。 17．COXＩヌクレオチド5964〜7505、COXIIヌクレオチド7646〜8329又は COXII Iヌクレオチド9267〜10052 である遺伝子突然変異を含む請求の範囲第16項記載の単離されたヌクレオチド配列。 18．前記単離された配列が検出可能な剤によりラベルされる請求の範囲第16項記載の単離されたヌクレオチド配列。 19．前記検出可能な剤が放射性同位体、ハプテン、ビオチン、酵素、蛍光団又は化学発光団の群から選択される請求の範囲第16項記載の単離されたヌクレオチド配列。 20．前記検出可能な剤が、³²Ｐ、ジゴキシゲニン、ローダミン、アルカリホスファターゼ、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、フルオレセイン及びアクリジンの群から選択される請求の範囲第16項記載の単離されたヌクレオチド配列。 21．変異シトクロムｃオキシダーゼをコードする遺伝子の転写又は翻訳を阻害するための方法であって、ａ）前記遺伝子と、前記変異配列に対して特異的であるアンチセンス配列とを接触せしめ；そしてｂ）前記標的の変異シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子と前記アンチセンス配列との間で；前記アンチセンス配列が、野生型シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の転写又は翻訳を妨げないで、前記標的の変異シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子に結合し、そしてその転写又は翻訳を阻害する条件下で、ハイブリダイゼーションを可能する段階を含んで成る方法。 22．アルツハイマー病又は真性糖尿病が処理され、そしてシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子が、（ａ）シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415；並びに（ｂ）シトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110及びコドン 146のグループから選択される１又は複数のコドンで突然変異を含む請求の範囲第21項記載の方法。 23．ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子における１又は複数の突然変異に関連する疾病状態の検出のためのプローブであって、前記ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子における前記１又は複数の突然変異のセンス又はアンチセンス鎖のいづれかに対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成るプローブ。 24．前記プローブが、（ａ）シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415；並びに（ｂ）シトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110、及びコドン 146の群から選択された１又は複数のコドンのセンス及びアンチセンス鎖に対して相補的な領域を含む請求の範囲第23項記載のプローブ。 25．アルツハイマー病又は真性糖尿病遺伝子型の検出のためのプローブを含んで成るキットであって、前記プローブが、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子のセンス又はアンチセンス鎖のいづれかに対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とするキット。 26．前記プローブが、（ａ）シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415；並びに（ｂ）シトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110、及びコドン 146の群から選択された１又は複数のコドンのセンス及びアンチセンス鎖に対して相補的な領域を含む請求の範囲第28項記載のキット。 27．変異シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子又はそれから転写される変異mRNAに対して特異的であるアンチセンス配列を含んで成る療組成物であって、前記アンチセンス配列が、野生型シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の転写又は翻訳を妨げないで、前記標的の変異シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子に結合し、そしてその転写又は翻訳を阻害するように適合されることを含んで成る組成物。 28．アルツハイマー病及び真性糖尿病の群から選択された疾病が処理され、そして前記シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子が、（ａ）シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415；並びに（ｂ）シトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110及びコドン 146、の群から選択された１又は複数のコドンで突然変異を含む請求の範囲第27項記載の組成物。 29．対象におけるミトコンドリア起原の疾病の存在を進検出するための方法であって、ａ）前記対象からミトコンドリアを含む生物学的サンプルを得；そしてｂ）前記疾病の存在と相互関係する、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子の１又は複数のサブユニットにおける１又は複数の突然変異から生じる少なくとも１つの変異ポリペプチドを見出す段階を含んで成る方法。 30．前記疾病が、アルツハイマー病及び真性糖尿病の群から選択され、そして前記突然変異がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いて見出される請求の範囲第29項記載の方法。 31．変異シトクロムｃオキシダーゼサブユニットをコードするミトコンドリア mRNA分子にハイブリダイズし、そしてそれを切断するように適合されたリボザイム。 32．欠陥シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子を有するミトコンドリア中に接合体分子を選択的に導入するための方法であって、ａ）前記変異誘発されたミトコンドリア中に選択的に導入される接合体分子を提供し、ここで前記接合体分子にリンカーにより毒素又はイメージングリガンドに接合される標的分子を含んで成り；そしてｂ）前記変異ミトコンドリアと前記接合体分子とを接触せしめる；ことを含んで成る方法。 33．前記標的分子が、アクリジンオレンジ誘導体及びJC−１誘導体から成る群から選択された親油性カチオンである請求の範囲第32項記載の方法。 34．前記リンカーが、エステル、エーテル、チオエーテル、ホスホロジエステル、チオホスホロジエステル、カーボネート、カルバメート、ヒドラゾン、オキシム、アミノ及びアミドから選択された官能基を含む、請求の範囲第32項記載の方法。 35．前記標的分子及びリンカーが、10−Ｎ−（Ｒ₁−Ｘ）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）アクリジン誘導体〔ここで、Ｒ₁は５〜20個の炭素原子を含む脂肪族基であり、そしてＸはアルカン基の末端炭素原子に結合され、そしてエステル、エーテル、チオエーテル、ホスホロジエステル、チオホスホロジエステル、カーボネート、カルバメート、ヒドラゾン、オキシム、アミノ及びアミドの群から選択される〕を含んで成る請求の範囲第32項記載の方法。 36．前記標的分子が、ローダミン 123及びJC−１の誘導体から成る群から選択される請求の範囲第32項記載の方法。 37．前記標的分子がJC−１誘導体であり、そして前記リンカーがエステル、エーテル、チオエーテル、ホスホロジエステル、チオホスホロジエステル、カーボネート、カルバメート、ヒドラゾン、オキシム、アミノ及びアミドから選択された群を含んで成る請求の範囲第32項記載の方法。 38．前記リンカーが、JC−１誘導体の５，５′，６及び６′の炭素原子位置で４つの塩素原子の少なくとも１つの置換を通して前記JC−１誘導体に結合される請求の範囲第37項記載の方法。 39．前記リンカーが、JC−１誘導体の１，１′，３及び３′位置で４つのエチル基の少なくとも１つの末端の炭素原子に結合する水素原子の置換を通してJC− １誘導体に結合される請求の範囲第37項記載の方法。 40．前記リンカーが、JC−１誘導体のオレフィン性水素原子の１つの置換を通してJC−１誘導体に結合される請求の範囲第37項記載の方法。 41．前記リンカーが２〜20個の炭素原子のアルキル基をさらに含んで成る請求の範囲第37項記載の方法。 42．前記イメージングリガンドが、放射性同位体、ハプテン、ビオチン、酵素、蛍光団又は化学発光団の群から選択される請求の範囲第32項記載の方法。 43．前記毒素が、ホスフェート、チオホスフェート、ジニトロフェノール、及びマレイミド並びにアンチセンスオリゴ核酸から選択される請求の範囲第40項記載の方法。 44．不滅ρ°細胞系。 45．前記細胞系が不滅神経細胞系のρ°形である請求の範囲第44項記載の不滅 ρ°細胞系。 46．前記細胞系が未分化である請求の範囲第44項記載の不滅ρ°細胞系。 47．前記細胞系が分化するために誘導され得る請求の範囲第46項記載の未分化不滅ρ°細胞系。 48．前記細胞系が神経芽腫細胞系のρ°形である請求の範囲第47項記載の不滅 ρ°細胞系。 49．前記細胞系が神経芽腫細胞系SH−SY5Yのρ°形である請求の範囲第48項記載のρ°細胞系。 50．異なった生物学的起原のゲノムDNA 及びミトコンドリアDNA を有する培養された不滅細胞を含んで成るサイブリッド細胞系。 51．前記ゲノムDNA が不滅ρ°細胞系にその起原を有し、そして前記ミトコンドリアDNA がヒト組織サンプルにその起原を有する請求の範囲第50項記載のサイブリッド細胞系。 52．前記ゲノムDNA が、分化するために誘発できる末分化の不滅ρ°細胞系にその起原を有し、そして前記ミトコンドリアDNA がヒト組織サンプルにその起原を有する請求の範囲第50項記載のサイブリッド細胞系。 53．前記未分化の不滅ρ°細胞系が神経芽腫細胞系のρ°形である請求の範囲第52項記載のサイブリッド細胞系。 54．前記神経芽細胞系が神経芽細胞系SH−SY5Yに由来する請求の範囲第53項記載のサイブリッド細胞系。 55．前記ヒト組織サンプルが、ミトコンドリア欠陥に関連する疾病を有する患者に由来する請求の範囲第51項記載のサイブリッド細胞系。 56．前記ヒト組織サンプルが、ミトコンドリア欠陥に関連する疾病を有する患者に由来する請求の範囲第52項記載のサイブリッド細胞系。 57．前記未分化の不滅ρ°細胞系が神経芽腫細胞系のρ°形であり、そして前記ヒト組織サンプルがミトコンドリア欠陥に関連する神経性疾病を有する患者に由来する請求の範囲第52項記載のサイブリッド細胞系。 58．前記ヒト組織サンプルが、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンチントン病、失調症、Leberの遺伝性視覚神経障害、精神分裂病、ミオクロヌス− てんかん−乳酸−アシド−シス−及び発作(MELAS)、及びミオクロヌス−てんかん−疲労性−赤筋線維−症候群(MERRF)から成る群から選択される疾病を有する患者からである請求の範囲第51項記載のサイブリッド細胞系。 59．前記未分化の不滅ρ°細胞系が神経芽腫細胞系SH−SY5Yのρ°形であり、そして前記ヒト組織サンプルが、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンチントン病、失調症、Leberの遺伝性視覚神経障害、精神分裂病、ミオクロヌス− てんかん−乳酸−アシド−シス−及び発作(MELAS)、及びミオクロヌス−てんかん−疲労性−赤筋線維−症候群(MERRF)から成る群から選択される疾病を有する患者からである請求の範囲第52項記載のサイブリッド細胞系。 60．前記未分化の不滅ρ°細胞系が神経芽腫細胞系SH−SY5Yのρ°形であり、そして前記ヒト組織サンプルがアルツハイマー病を有する患者からである請求の範囲第52項記載のサイブリッド細胞系。 61．請求の範囲第52項記載のサイブリッド細胞系の細胞における分化の誘発に起因する分化されたサイブリッド細胞系。 62．サイブリッド細胞系を構成するための方法であって、ａ）ミトコンドリアの電子輸送を不可逆的に無能にすることができる化学薬剤により不滅細胞系を処理し、そして従って、前記細胞系を不滅ρ°細胞系に転換し；そしてｂ）前記サイブリッド細胞系を形成するために前記不滅ρ°細胞系を単離されたミトコンドリアによりトランスフェクトする；段階を含んで成る方法。 63．前記不滅細胞系が未分化であるが、しかし分化するために誘発することができる請求の範囲第62項記載の方法。 64．前記単離されたミトコンドリアが、ミトコンドリア欠陥に関連する障害を有することが知られている患者から精製される請求の範囲第62項記載の方法。 65．前記化学薬剤が臭化エチジウムである請求の範囲第62項記載の方法。 66．サイブリッド細胞系を構成するための方法であって、ａ）ミトコンドリア電子輸送を不可逆的に無能にするために臭化エチジウムにより不滅神経芽腫細胞系を処理し、そして従って前記細胞系を不滅のρ°神経芽腫細胞系に転換し；そしてｂ）前記サイブリッド細胞系を形成するために、前記不滅のρ°神経芽腫細胞系を、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンチントン病、失調症、Leber の遺伝性視覚神経障害、精神分裂病、オクロヌス−てんかん−乳酸−アシド−シス−及び発作(MELAS)及びミオクロヌス−てんかん−疲労性−赤筋線維−症候群( MERRF)から成る群から選択された障害を有する患者の組織から単離されたミトコンドリアによりトランスフェクトする；段階を含んで成る方法。 67．ミトコンドリア欠陥に関連する障害の処理への可能性ある利用性のための化合物を評価するための方法であって、ａ）不滅ρ°細胞系に起因するゲノムDNA、及びミトコンドリア欠陥に関連する疾病を有する患者の組織に起因するミトコンドリアDNA を有する培養された不滅サイブリッド細胞と予定量の試験化合物とを接触せしめ；ｂ）前記ミトコンドリア欠陥により影響される前記サイブリッド細胞における表現型特徴を測定し；そしてｃ）前記薬剤が、前記欠陥を欠いているミトコンドリアを有する対照細胞の特徴により類似的になるよう前記特徴を引き起こすことができるかどうか及びどの程度できるかを確立し、ここでこの能力は、前記化合物が前記障害の処理において可能性ある利用性を有することを示唆する；段階を含んで成る方法。 68．ａ）不滅ρ°細胞系に起因するゲノムDNA、及びミトコンドリア欠陥に関連する疾病を有する患者の組織に起因するミトコンドリアDNA を有する培養された未分化の不滅サイブリッド細胞の分化を誘発し；ｂ）予定された量の試験化合物と前記分化されたサイブリッド細胞とを接触せしめ；ｃ）前記ミトコンドリア欠陥により影響される前記分化されたサイブリッド細胞における表現型特徴を測定し；そしてｄ）前記薬剤が、前記欠陥を欠いているミトコンドリアを有する対照細胞の特徴により類似的になるより前記特徴を引き起こすことができるかどうか及びどの程度できるかを確立し、ここでこの能力は、前記化合物が前記障害の処理において可能性ある利用性を有することを示唆する；段階を含んで成る請求の範囲第67項記載のミトコンドリア欠陥に関連する障害の処理への可能性ある利用性のある化合物を評価するための方法。 69．ミトコンドリア欠陥に関連する障害の診断方法であって、ａ）ミトコンドリアを含む生物学的サンプルを患者から得；ｂ）サイブリッド細胞を形成するために前記ミトコンドリアを不滅ρ°細胞中にトランスファーし；ｃ）試験される障害に関連するミトコンドリア欠陥により引き起こされる、前記サイブリッド細胞における表現型特徴を測定し；そしてｄ）前記サイブリッド細胞が、前記障害を有する患者の細胞と同じ程度の前記特徴を示し、これが前記患者における障害の存在を示す；段階を含んで成る方法。 70．ａ）ミトコンドリアを含む生物学的サンプルを患者から得；ｂ）サイブリッド細胞を形成するために前記ミトコンドリアを未分化の不滅ρ °細胞中にトランスファーし；ｃ）前記サイブリッド細胞の分化を誘発し；ｄ）試験される障害に関連するミトコンドリア欠陥により引き起こされる、前記分化されたサイブリッド細胞における１又は複数の表現型特徴を測定し；そしてｅ）前記サイブリッド細胞が、前記障害を有する患者の細胞と同じ程度の前記特徴を示し、これが前記患者における障害の存在を示す；段階を含んで成る請求の範囲第69項記載のミトコンドリア欠陥に関連する障害の診断方法。 71．異なった生物学的起原のゲノム及びミトコンドリアDNA を有する、多細胞非−ヒト動物を含んで成るサイブリッド動物。 72．サイブリッド動物の調製方法であって、ａ）多細胞非−ヒト動物から胚細胞を単離し；ｂ）前記胚細胞を、ミトコンドリア電子輸送を不可逆的に無能にすることができる化学薬剤により処理し、従って前記細胞をρ°状態に転換し；そしてｃ）前記サイブリッド動物を生成するために、前記不滅ρ°細胞系を他の細胞源から単離されたミトコンドリアによりトランスフェクトする；段階を含んで成る方法。 73．ミトコンドリア欠陥に関連する障害の処理への可能性ある利用性のための化合物を評価するための方法であって、ａ）予定された量の試験化合物と請求の範囲第71項記載のサイブリッド動物とを接触せしめ；ｂ）前記ミトコンドリア欠陥により影響される、前記サイブリッド動物における１又は複数の表現型特徴を測定し又は観察し；そしてｃ）前記薬剤が、前記欠陥を欠いているミトコンドリアを有する対照細胞の特徴により類似的になるよう前記特徴を引き起こすことができるかどうか及びどの程度できるかを確立し、ここでこの能力は、前記化合物が前記障害の処理において可能性ある利用性を有することを示唆する；段階を含んで成る方法。 74．異なった生物学的起原のゲノム及びミトコンドリア核酸を有する培養された細胞を含んで成るサイブリッド細胞系であって、前記ミトコンドリア核酸又はゲノム核酸が、後期開始の真性糖尿病の徴候を示すか又は後期開始の真性糖尿病の徴候を進行する危険性のある個人に由来することを特徴とするサイブリッド細胞系。 75．前記サイブリッドが、ａ）親細胞又は細胞系を、前記細胞又は細胞系をρ°細胞系に転換できる化学薬剤により処理し；そしてｂ）前記サイブリッド細胞系を形成するために、前記ρ°細胞系を単離されたミトコンドリアによりトランスフェクトする；ことにより製造される請求の範囲第74項記載のサイブリッド細胞系。 76．前記親細胞又は細胞系が未分化であるが、しかし分化するよう誘発され得る請求の範囲第75項記載のサイブリッド細胞系。 77．前記サイブリッド細胞系が不滅である請求の範囲第75項記載のサイブリッド細胞系。 78．前記サイブリッド細胞系が未分化であるが、しかし分化するよう誘発され得る請求の範囲第77項記載のサイブリッド細胞系。 79．前記親細胞又は細胞系が、接合体、分化でき、そして組織又は個体を生成することができる胚細胞、生殖細胞系、膵臓Ｂ細胞又は細胞系、脂肪細胞又は細胞系、筋肉細胞又は細胞系、及び膵臓Ｂ細胞系、脂肪細胞又は筋肉細胞以外のインスリン応答性細胞から成る群から選択される請求の範囲第75項記載のサイブリッド細胞系。 80．真性糖尿病の診断又は処理への利用のための化合物を評価するための方法であって、ａ）不滅ρ°細胞系に起因するゲノムDNA、及び真性糖尿病に関連する疾病を有するヒトの組織に起因するミトコンドリアDNA を有する培養されたサイブリッド細胞と予定量の試験化合物とを接触せしめ；そしてｂ）前記ミトコンドリア欠陥により影響される前記サイブリッド細胞における表現型特徴を測定する；ことを含んで成る方法。 81．前記ρ°細胞系が不滅である請求の範囲第80項記載の方法。 82．真性糖尿病の診断及び処理への利用性のための化合物を評価するための方法であって、ａ）ρ°細胞系に起因するゲノムDNA、及び後期開始の真性糖尿病に関連する障害を有するヒトの組織に起因するミトコンドリアDNAを有する培養された未分化の不滅サイブリッド細胞の分化を誘発し；ｂ）予定された量の前記化合物と前記分化されたサイブリッド細胞とを接触せしめ；そしてｃ）前記ミトコンドリア欠陥により影響される前記分化されたサイブリッド細胞における表現型特徴を測定する；ことを含んで成る方法。 83．前記ρ°細胞系が不滅である請求の範囲第82項記載の方法。 84．ミトコンドリア起原のヒト疾病の存在を検出するための方法であって、ａ）前記ヒトからミトコンドリアを含む生物学的サンプルを得；そしてｂ）前記疾病と相互関係する少なくとも１つのミトコンドリア突然変異又は遺伝子の存在を決定する；ことを含んで成る方法。 85．前記少なくとも１つのミトコンドリア突然変異又は遺伝子がシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子における突然変異である請求の範囲第84項記載の方法。 86．前記疾病がアルツハイマー病及び真性糖尿病から選択される請求の範囲第 85項記載の方法。 87．前記シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子における突然変異が、シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415；並びにシトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20 、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110 、及びコドン 146の群から選択された１又は複数のコドンである請求の範囲第86 項記載の方法。 88．ミトコンドリア起原のヒト疾病の存在と相互関係する少なくとも１つの突然変異を含む、ミトコンドリアDNA 配列に対して少なくとも部分的に相補的である単離されたヌクレオチド配列。 89．前記ミトコンドリアDNA 配列が、COXＩヌクレオチド5967〜7505及び COXI Iヌクレオチド7646〜8329における突然変異から成る群から選択された少なくとも１つの突然変異を含む、請求の範囲第88項記載の単離されたヌクレオチド配列。 90．前記ミトコンドリア起原のヒト疾病が真性糖尿病及びアルツハイマー病から選択される請求の範囲第88項記載の単離されたヌクレオチド配列。 91．前記ミトコンドリアDNA 配列が、シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子におけるコドン 155とコドン 415との間での突然変異及びシトクロムｃオキシダーゼ II遺伝子におけるコドン20とコドン 146との間での突然変異から成る群から選択された少なくとも１つの突然変異を含む請求の範囲第80項記載の単離されたヌクレオチド配列。 92．前記ミトコンドリアDNA 配列が、シトクロムｃオキシダーゼＩ遺伝子のコドン 155、コドン 167、コドン 178、コドン 193、コドン 194及びコドン 415、及びシトクロムｃオキシダーゼII遺伝子のコドン20、コドン22、コドン68、コドン71、コドン74、コドン90、コドン95、コドン 110及びコドン 146から成る群から選択されたコドンで見出される少なくとも１つの突然変異を含む請求の範囲第91項記載の単離されたヌクレオチド配列。 93．１又は複数の変異シトクロムｃオキシダーゼをコードする核酸の転写又は翻訳を阻害するための方法であって、ａ）前記遺伝子又は複数の遺伝子と、前記変異配列又は複数の配列に対して特異的なアンチセンス配列とを接触せしめ；そしてｂ）前記標的シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子又は複数の遺伝子と前記アンチセンス配列又は複数の配列との間でハイブリダイゼーションを可能にする；ことを含んで成る方法。 94．前記ハイブリダイゼーションが、前記アンチセンス配列又は複数の配列が、野生型シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子又は他のミトコンドリア遺伝子の転写又は翻訳を妨げないで、前記標的の変異シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子又は複数の遺伝子に結合し、そしてその転写又は翻訳を阻害する条件下で実施される請求の範囲第93項記載の方法。