EP1228224A1 - Rekombinante attenuierte listerien zur immuntherapie - Google Patents

Rekombinante attenuierte listerien zur immuntherapie

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Publication number
EP1228224A1
EP1228224A1 EP00983012A EP00983012A EP1228224A1 EP 1228224 A1 EP1228224 A1 EP 1228224A1 EP 00983012 A EP00983012 A EP 00983012A EP 00983012 A EP00983012 A EP 00983012A EP 1228224 A1 EP1228224 A1 EP 1228224A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
listeria
expression vector
protein
trp
melana
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00983012A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Schadendorf
Annette Paschen
Trinad Chakraborty
Eugen Domann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1228224A1 publication Critical patent/EP1228224A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/0011—Cancer antigens
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    • A61K39/001191—Melan-A/MART
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins

Definitions

  • the present invention relates to Listeria expression vectors which allow expression of the human tumor-associated antigens tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1 and Trp-2, and to attenuated Listeria bacteria containing these expression vectors, these preferably being bacteria of the strain Listeria monocytogenes. These bacteria can be used for prophylactic, adjuvant or therapeutic immunotherapy, for example for the treatment of malignant melanoma.
  • the invention is essentially based on the technical problem of providing means for tumor therapy, in particular for the therapy of malignant melanoma, which do not show the disadvantages of the current therapy methods described above, in particular allow preventive use, as an adjuvant after removal of a Primary tumors are effective or are of therapeutic benefit in the stage of distant etastasis.
  • the Listeria expression vectors according to the invention or the recombinant attenuated Listeria bacteria are constructs which are active in gene therapy and which can be used for prophylactic or in the context of adjuvant or therapeutic tumor control, for example in the case of malignant melanoma.
  • a tumor-specific immune response can be generated by preferably oral immunization, i.e.
  • the body's cellular immune system can be used to target the tumor cells.
  • This treatment can also be combined with treatment methods such as chemotherapy or radiotherapy if necessary, but it preferably replaces the latter forms of therapy.
  • the present invention is based on the finding that prophylactic or therapeutic treatment of tumors is possible by means of immunization, preferably oral immunization, using the recombinant attenuated listeria according to the invention as a synthesis and transport vehicle for tumor-associated antigens.
  • the expression of the individual tumor-associated antigens is preferably carried out as fusion proteins in which, for example, a Listeria-specific signal sequence is fused to the N-terminus of the antigen. After expression, these fusion proteins are exported from the bacterial cells into the environment.
  • the bacteria After oral administration, the bacteria pass through the mucosal epithelium of the intestinal tract in the area of Peyer's plaques and are absorbed by the antigen-presenting cells (APCs) of the immune system located there by phagocytosis.
  • the Listeria are therefore initially in the phagosome of the infected cell into which they are placed Secretion fusion proteins, which are available for processing to generate HLA class I and HLA class II peptides. Due to the natural infection cycle, both the wild-type Listeria bacterium and defined attested mutants (provided they do not have a deletion of the hly gene) can pass into the cytosol of the cell.
  • the fusion proteins secreted in the cytosol are in turn accessible to processing for the generation of HLA class I peptides.
  • the peptides generated in both cell compartments are thus available for loading HLA I or HLA class II molecules.
  • the peptide-HLA complex is presented on the cell surface of the APCs and a specific T cell response (CD4 + and CD8 + T cells) is induced against the expressed tumor-associated antigens, ie a cellular cytotoxic immune response of the body's immune system against a tumor.
  • the tumor cells are specifically identified as degenerate and killed.
  • the advantages of this procedure include the fact that the body's own immune system is specifically mobilized in the direction of destruction of the tumor.
  • the present invention thus relates to a Listeria expression vector for immunotherapy, the Listeria expression vector comprising the following DNA sequences functionally linked: (a) a promoter active in Listeria; and (b) a DNA sequence coding for human tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1 or Trp-2 or antigenic epitopes derived therefrom.
  • promoter active in Listeria refers to all promoters which allow the expression of tumor-associated antigens in Listeria. These are preferably promoters of Listeria monocytogenes genes, for example constitutive promoters or promoters activated under the conditions of the infection. Promoters which lead to strong expression of the desired antigen are particularly preferred. This term also refers to promoter fragments or promoters with modified sequences that are still biologically active.
  • the promoter for the Listeria expression vectors is a promoter of the hly, actA, plcA, plcB or mpl gene, which are each active under the conditions of the infection and which are the Listeria proteins haemolysin, ActA , Encode phosphotidylinositol-specific phospholipase C, phosphatidylcholine-specific phospholipase C or metalloprotease.
  • actA / plcB promoter Domann et al. , (1992), EMBO J.
  • human tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1 or Trp-2 encoding DNA sequence refers to any DNA sequence that encodes all or part of the native protein. These DNA sequences and the derived amino acid sequences are described, for example: human tyrosinase gene: Genbank Accession No.: M27160 human trp-1 gene: Genbank Accession No.: AF001295 human trp-2 gene: Genbank Accession No.: D17547 human MelanA / MART -l Gen: Genbank Accession No .: U06452 Please also refer to Figures 1-4.
  • Trp-1, Trp-2 and MelanA / MART-l are differentiation antigens of melanocytic origin. Since these antigens are exclusively expressed in melanocytic cells (melanocytes) in the course of melanogenesis, they are extremely well suited to generate a specific immune response against melanoma cells. These differentiation antigens also have the advantage that they are expressed by up to 100% of the cells of a pigmented tumor (melanoma), whereas only approx. 50% of the melanoma cancer testis express antigens such as MAGE-1.
  • the enzymes tyrosinase, Trp-1, Trp-2 catalyze the process of pigment formation (malanine biosynthesis). The biosynthesis takes place in the specific organelles, the melanosomes, in the matrix of which the MelanA / MART-1 protein is also located.
  • the expression "for human coding DNA sequence” also relates to DNA sequences which encode such forms of human tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1 or Trp-2, the changes compared to the native form, ie for example Deletions, additions or exchanges of one or more amino acids and / or modified amino acid (s) or the attachment of an ubiquitin residue or modified oligosaccharide side chains, their antigenic properties remaining in whole or in part or in the desired manner, ie they have, for example, the properties described in the examples below with regard to the treatment of a tumor.
  • the exchanges preferably include "conservative" exchanges of amino acid residues, ie exchanges for biologically similar residues, for example the substitution of a hydrophobic residue (for example isoleucine, valine, leucine, methionine) for another hydrophobic residue, or the substitution of one polar residue for another polar residue (e.g. arginine against lysine, glutamic acid against aspartic acid etc.).
  • the exchanges also include "non-conservative" exchanges, which can maintain or even enhance the antigenic properties of the proteins or individual derived protein fragments (peptides). This can be biological or enzymatic Change the activity of the native protein.
  • Deletions can lead to the generation of molecules which are significantly smaller in size, ie which lack amino acids at the N or C terminus, for example.
  • the above variants also relate to variants which have a better effectiveness in combating tumors compared to the original form.
  • Methods for generating the above changes in the amino acid sequence or corresponding nucleic acid sequence are known to the person skilled in the art and are described in standard works in molecular biology, for example in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989).
  • a protein or peptide encoded by a nucleic acid sequence modified in this way still has the desired antigenic properties of tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1 or Trp-2 (in whole or in part). features. These antigenic properties can be determined for the proteins / peptides by stimulating antigen-specific cytotoxic T cell lines. In the case of peptides, it is also advisable to check their HLA binding properties in the context of FACS analyzes.
  • the DNA sequences encoding the tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1, Trp-2 or the above variants should preferably have one transcription termination sequence and one
  • L i, steria expression vectors can be constructed according to the invention, inter alia for ligation of the fragments for the promoter and the tumor-associated antigens and insertion into the vector.
  • These methods include, for example, in vitro recombination techniques, synthetic methods, and in vivo recombination methods, as described, for example, in Ausubel and Frederick (1991), Current Protocols in Molecular Biology (J.Wiley & Sons, New York) are described.
  • Listeria expression vectors in which the DNA sequence coding for human tyrosinase, Trp-1, MelanA / MART-1 or Trp-2 is linked to a DNA sequence coding for a Listeria protein (fragment). that a fusion protein is encoded.
  • the portion derived from the Listeria protein preferably represents the N-terminal portion of the fusion protein.
  • Various Listeria proteins or fragments thereof are suitable for the production of this fusion protein, for example the genes disclosed above with regard to the Listeria promoters.
  • Listeria expression vectors in which the Listeria protein portion of the fusion protein comes from a protein involved in the lysis of the host vacuoles or in the movements of the bacteria in the host cell, preferably Listeriolysin 0 (Lyse), ActA (intracellular movement) or PI-PLC (lysis).
  • Listeriolysin 0 Lyse
  • ActA intracellular movement
  • PI-PLC lysis
  • the advantage of listeriolysin 0 to use a Listeria phospholipase or the ActA protein for the construction of fusion proteins is that these proteins are secreted. In the event of infection, these fusion proteins therefore preferentially get into the phagolysosome or cytosol of the infected cell, i.e. into the cell compartments in which the generation of HLA class I and HLA class II presented peptides takes place.
  • the fusion proteins can preferably look as follows: a) only the secretory signal sequence of a Listeria-specific protein is fused with
  • Protein sequence is fused to the antigen, c) a short fragment of the antigen is added
  • the present invention relates to Listeria expression vectors in which the Listeria protein portion of the Fusion protein comprises a signal sequence of a secreted Listeria protein.
  • the signal sequence is preferably derived from Listeria hemolysin, a Listeria phospholipase or the ActA protein.
  • the starting vector for the production of the Listeria expression vector according to the invention is any vector which leads to expression of the desired antigens in Listeria. This can be an autosomal or stably inserting vector into the Listeria genome.
  • the output vector is preferably a "shuttle" vector which can be propagated in another host, for example E. coli. Examples of such vectors are pKSV7 (Frankel et al., 1995, J. Immunol. 155: 4775-4782), pCGU34 (Paglia et al., 1997, Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575), pAUL-A ( Niebuhr et al., 1997, EMBO J. 16: 5444-5445) and pLIGAl60.
  • the present invention also relates to the Listeria expression vectors according to the invention (autosomal or stably integrated into the genome, for example via homologous recombination) containing recombinant, attenuated Listeria bacteria, preferably Listeria monocytogenes or Listeria innocua, the latter being particularly suitable for enhancing an immune response.
  • Listeria bacteria preferably Listeria monocytogenes or Listeria innocua, the latter being particularly suitable for enhancing an immune response.
  • the person skilled in the art can select suitable listeria according to the usual criteria with regard to the use of bacteria for vaccination, ie the listeria which can be used for the purposes according to the invention should have immunogenicity, but be sufficiently attenuated to allow safe use in humans. For this it is necessary that the mutant phenotype of the Listeria is absolutely stable, which is usually only possible by creating chromosomal deletions.
  • Attenuated mutants include mutants that are deficient in cell-to-cell spread, actA-negative mutants that are deficient in intracellular growth, hly2- (listeriolysin) negative mutants, and mutants that are at least one phospholipase -Gens are deficient (Guz et al., Infect. Immun. 63 (1995), 3665-3673).
  • suitable Listeria strains include the ⁇ mpl2 mutant (Paglia et al., Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575). Suitable attested Listeria strains are also described in the international patent application PCT / EP98 / 08096.
  • the present invention further relates to a medicament (vaccine) containing the recombinant attenuated Listeria bacteria according to the invention and their use for immunotherapy.
  • This immunotherapy is suitable for the treatment of pigmented tumor types, preferably for the therapy of malignant melanoma or malignant schwannoma
  • Carrier Suitable carriers and the formulation of such
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the medicament according to the invention can be administered, for example, for oral administration in the form of an elixir, a capsule or suspension.
  • the appropriate dosage and mode of administration preferably oral, intravenous or intraperitoneal administration, will be determined by the attending physician and will depend on various factors including, for example, the age, gender, weight of the patient, stage and severity of the tumor Mode of administration etc.
  • the administration must be in an effective amount, ie an amount that the tumor-associated antigen is expressed in an amount that an immune response in T- Cells against the tumor-associated antigen is induced, so that cells containing this antigen are destroyed.
  • the medicament according to the invention can either be administered alone or in combination with other tumor therapies.
  • Fig. 1 Representation of the cDNA coding region of human.
  • Tyrosinase and the derived protein sequence
  • Fig. 2 Representation of the cDNA coding region of human.
  • Trp-1 Trp-1 and the derived protein sequence
  • Fig. 3 Representation of the cDNA coding region of human.
  • Trp-2 Trp-2 and the derived protein sequence
  • Fig. 4 Representation of the cDNA coding region of human.
  • Fig. 5 Analysis of the surface markers of infected dentritic cells
  • the primer combination tyr / 5-LIGA and tyr / 3-LIGA (Table 2) was used to amplify a 5 '-deleted tyrosinase cDNA sequence. Both PCR amplificates were then treated as follows: Using the restriction sites mentioned, the fragment was cloned into the vector PLIGA160 in frame downstream of the plasmid-encoded actA signal sequence. The expression of the resulting fusion gene is controlled by the plasmid-encoded actA promoter (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723). The inserted DNA sequence and its transition points to the vector were sequenced for control.
  • the resulting expression vector was named pLIGA-tyrof (encodes entire tyrosinase cDNA) or pLIGA-tyro (encoded 5 '-deleted tyrosinase cDNA). The latter was deposited with the DSMZ on October 5 under the number DSM 13073.
  • TrD-1 antigen coding cDNA (Genbank accession number: AF001295) were PCR (see Table 1) using the specific primers given in Tables 1 and 2 (trpl-5/2-LIGA + trpl / 3-LIGA; trpl / 5-LIGA + trpl / 3-LIGA) introduced a Ndel or a Bgl II recognition sequence.
  • the primer combination trpl-5/2-LIGA and trpl / 3-LIGA (Tab. 1) was used to amplify the complete trp-1 cDNA sequence.
  • the primer combination trpl / 5-LIGA and trpl / 3-LIGA was used for the amplification of a 5 '-deleted trp-1 cDNA sequence. Both PCR amplificates were then treated as follows: using the restriction sites mentioned, the fragment was cloned into the vector pLIGA160 in frame downstream of the plasmid-encoded actA signal sequence. The expression of the resulting fusion gene is controlled by the plasmid-encoded actA promoter (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723). The inserted DNA sequence and its transition points to the vector were sequenced for control.
  • the resulting expression vector was called pLIGA-trplf (encodes the entire trp-1 cDNA) or pLIGA-trpl (encoded 5 '-related trp-1 cDNA). The latter was deposited on October 5, 1999 with the DSMZ Braunschweig under DSM 13074.
  • Example 3 Provision of two different Listeria expression vectors expressing the human trp-2 protein
  • the primer combination trp2 / 5-LIGA and trp2 / 3-LIGA was used to amplify a 5 'deleted trp-2 cDNA sequence. Both PCR amplificates were then treated as follows: using the restriction sites mentioned, the fragment was cloned into the vector pLIGAl60 in frame downstream of the plasmid-encoded actA signal sequence. The expression of the resulting fusion gene is controlled by the plasmid-encoded actA promoter (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723). The inserted DNA sequence and its transition points to the vector were sequenced for control.
  • the resulting expression vector was called pLIGA-trp2f (encodes the entire trp-2 cDNA) or pLIGA-trp2
  • the Listeria expression vectors described in Examples 1 to 4 above were amplified in the E. coli strain XL2-Blue in each case in the L. monocytogenes strain EGD and in the attested mutants ⁇ hly2 and ⁇ actA (Guzmann et al., 1995, Infect Immun. 63: 3665-3573) by electroporation. The technique used for this is well known to the person skilled in the art. Plasmid-bearing listeria were identified from the plasmid-mediated erythromycin resistance.
  • the expression of the tumor-associated antigens is then determined using immunological detection methods (eg immunological staining, Western blot) using specific antibodies (MelanA-AK available from Novocastra; Tyrosinase-AK available from BioTrend, Cologne; Trp-1 AK described in Thomsen et al, 1985, J. Invest. Dermatol. 85: 169-174).
  • immunological detection methods eg immunological staining, Western blot
  • specific antibodies MelanA-AK available from Novocastra
  • Tyrosinase-AK available from BioTrend, Cologne
  • Trp-1 AK described in Thomsen et al, 1985, J. Invest. Dermatol. 85: 169-174.
  • the Listeria expression vector pLIGA-MelanA described in Example 4 above was, after amplification in the E.coli strain XL2-Blue, the L. monocytogenes strain EGD (G ⁇ zman et al., 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) Electroporation introduced. These bacteria were grown overnight at 37 ° C. in BHI (brain heart infusion) medium (manufacturer: Difco). A 1:50 dilution culture was set up and the growth of the bacteria continued until the middle log phase. The bacteria were harvested by centrifugation at 3000xg. The cells were washed three times with PBS and resuspended in PBS.
  • mice As a control, the EGD bacteria carrying the unchanged plasmid pLIGAl60 were also treated and cultivated. Mice from the transgenic strain HLA-A2k b (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1007-1015) were treated with the bacteria resuspended in PBS (EGD-pLIGA-MelanA and EGD-pLIGA160) in the 7-day period Interval immunized. The mice each received oral administration of lxlO 6 bacteria on day 0 and 1X10 7 bacteria on day 7, 14, 21, etc.
  • the primary goal of the immunization experiments is to generate a cellular cytotoxic T cell response.
  • the antigen-specific activity of cytotoxic T cells is considered the basis of an efficient antitumor immune response.
  • the spleens from 3 immunized mice are removed 7 days after the last immunization, pooled and mechanically processed so that a single cell suspension is present.
  • Spleen cells are transformed into a HLA-A2k b cell line
  • Antigen coding gene is stably transfected and can therefore be used
  • Stimulation of the cytotoxic activity of antigen-specific T cells can be used. After 5-7 days, the living cells are harvested and checked for their ability to lyse the mentioned antigen-expressing target cells in the 51 Cr release experiment which is well known to the person skilled in the art.
  • the MHC class I Melan A restricted lysis of MelanA expressing C1R-A2k b target cells is shown by lymphocytes which were primarily stimulated in vivo with the recombinant L. monocytogenes EGD pLIGA-MelanA vaccine strain. 7 days after the last immunization with EGD-pLIGA-MelanA or EGD-pUGA160 (negative control), the spleen cells were restimulated on day 5 after removal in vitro.
  • Tab. 1 Primer for the amplification of the c-DNA sequences coding for antigen.
  • the portion of a primer that binds to the complementary sequence of the c-DNA mentioned is underlined
  • the interaction of immature DC with bacteria can lead to their maturation and thus have a positive influence on their ability to stimulate T cells.
  • the maturation of the DC is accompanied by changes in the expression pattern of specific surface markers, i.e. the expression of specific surface molecules, which are essential for the stimulation of a cellular immune response, is increased.
  • specific surface markers i.e. the expression of specific surface molecules, which are essential for the stimulation of a cellular immune response.
  • costimulatory molecules such as CD40, CD80, CD86 or adhesion molecules such as CD54.
  • the CD83 surface molecule is a specific marker for mature dendritic cells, the function of which is still unclear.
  • the expression detection of these surface markers is carried out by means of immunofluorescence in a flow cytometer (FACS).
  • the cells were incubated indirectly or indirectly with the following monoclonal antibodies: FITC-conjugated anti-HLA-DR (Becton Dickinson, Heidelberg), anti-CD54 and PE-conjugated anti-CD83 (Coulter-Immunotech, Hamburg), PE-conjugated anti -CD80 (Pharmingen, Hamburg), FITC- conjugated anti-CD40 and FITC-conjugated anti-CD86 (Cymbus Biotechnology, Dianova, Hamburg).
  • FITC-conjugated anti-mouse IgG (Dianova, Hamburg) was used as a secondary reagent for anti-CD54 detection.
  • Mouse IgG was used as an isotype control.
  • the analysis of the expression of the surface markers on the dendritic cells was carried out by means of cytofluorometry (FACScan, Becton Dickinson). The result is shown in FIG. 5. This figure shows that the infection leads to an increased expression of specific costimulatory molecules. Furthermore, the infection leads to a maturation of the DC, which can be seen from the CD83 expression. These data show that infection of the DC with bacterial vaccine vectors has a positive effect on the phenotype of the antigen presenting cells.

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Abstract

Beschrieben werden Listeria-Expressionsvektoren, die die Expression der humanen Tumorantigene Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 und Trp-2 oder davon abgeleiteter antigener Epitope erlauben, sowie diese Expressionsvektoren enthaltende, attenuierte Listeria-Bakterien, wobei es sich vorzugsweise um Bakterien des Stamms Listeria monocytogenes handelt. Diese Bakterien können zur prophylaktischen, adjuvanten oder therapeutischen Immuntherapie, beispielsweise zur Behandlung des malignen Melanoms verwendet werden.

Description

Rekombinante attenuierte Listerien zur Im unt erapie
Die vorliegende Erfindung betrifft Listeria- Expressionsvektoren, die die Expression der humanen tumorassoziierten Antigene Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l und Trp-2 erlauben, sowie diese Expressionsvektoren enthaltende, attenuierte Listeria-Bakterien, wobei es sich vorzugsweise um Bakterien des Stamms Listeria monocytogenes handelt. Diese Bakterien können zur prophylaktischen, adjuvanten oder therapeutischen Immuntherapie, beispielsweise zur Behandlung des malignen Melanoms, verwendet werden.
Gegenwärtig stützt sich die Tumortherapie im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo-, adjuvante Chemo- und Radiotherapie. Allerdings haben diese Therapien die folgenden gravierenden Nachteile: (a) Sie sind im metastasierenden Krankheitsstadium bzw. als vorbeugende Therapie nach Entfernung des Primärtumors kaum wirksam, d.h. eine Heilung im Metastasierungsstadium ist nicht mehr möglich, (b) sie sind im Bezug auf das klinische Ansprechen, auf die
Dauer des rezidivfreien Intervalls, die Gesamtüberlebenszeit sowie die Lebensqualität des Patienten sehr unzureichend und
(c) sie weisen eine Reihe von teilweise schwerwiegenden
Nebenwirkungen auf, beispielsweise eine beträchtliche Schädigung von normalem Gewebe. Darüberhinaus gibt es bisher keine präventiven Möglichkeiten, die beispielsweise auf einer "Schutzimpfung" beruhen könnten. Dies wäre aber gerade hinsichtlich des malignen Melanoms sehr wünschenswert.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Mittel zur Tumortherapie, insbesondere zur Therapie des malignen Melanoms, bereitzustellen, die nicht die vorstehend beschriebenen Nachteile der gegenwärtigen Therapieverfahren ausweisen, insbesondere eine präventive Anwendung erlauben, als Adjuvanz nach Entfernung eines Primärtumors wirksam sind bzw. im Stadium der Fern etastasierung von therapeutischem Nutzen sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Bei den erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren bzw. den rekombinanten attenuierten Listeria-Bakterien handelt es sich um gentherapeutisch wirksame Konstrukte, die zur prophylaktischen oder im Rahmen einer adjuvanten oder therapeutischen Tumorbekämpfung, beispielsweise beim malignen Melanom, eingesetzt werden können. Dabei kann durch eine vorzugsweise orale Immunisierung eine tumorspezifische Immunantwort erzeugt, d.h. durch das körpereigene zelluläre Immunsystem kann eine gezielte Bekämpfung der Tumorzellen erreicht werden. Diese Behandlung kann außerdem bei Bedarf mit Behandlungsverfahren wie Chemotherapie oder Radiotherapie kombiniert werden, vorzugsweise ersetzt sie jedoch die letzteren Therapieformen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Befund, daß mittels einer Immunisierung, vorzugsweise oralen Immunisierung, unter Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten attenuierten Listerien als Synthese- und Transportvehikel für tumorassoziierte Antigene eine prophylaktische bzw. therapeutische Behandlung von Tumoren möglich ist. Die Expression der einzelnen tumorassoziierten Antigene erfolgt dabei bevorzugt als Fusionsproteine, bei denen beispielsweise eine Listerien-spezifische Signalssequenz an den N-Terminus des Antigens fusioniert ist. Nach Expression werden diese Fusionsproteine aus den Bakterienzellen in die Umgebung exportiert. Nach oraler Applikation passieren die Bakterien das mukosale Epithel des Intestinaltrakts im Bereich der Peyerschen Plaques und werden durch die dort lokalisierten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) des Immunsystems durch Phagocytose aufgenommen. Die Listerien liegen daher zunächst im Phagosom der infizierten Zelle vor, in das sie die Fusionsproteine sekretieren, die damit einer Prozessierung zur Generierung von HLA Klasse I und HLA Klasse II Peptiden zur Verfügung stehen. Aufgrund des natürlichen Infektionszyklus können sowohl das Wildtyp-Listerien-Bakterium als auch definierte attentuierte Mutanten (sofern sie keine Deletion des hly Gens aufweisen) in das Cytosol der Zelle übertreten. Die ins Cytosol sekretierten Fusionsproteine sind wiederum einer Prozessierung zur Generierung von HLA-Klasse I Peptiden zugänglich. Die in beiden Zellkompartimenten (Phagosom und Cytosol) generierten Peptide stehen somit zur Beladung von HLA I bzw. HLA-Klasse II Molekülen zur Verfügung. Der Peptid-HLA- Komplex wird an der Zelloberfläche der APCs präsentiert und es wird eine spezifische T-Zellantwort (CD4+ und CD8+ T-Zellen) gegen die exprimierten tumorassoziierten Antigene induziert, d.h. eine zelluläre cytotoxische Immunantwort des körpereigenen Immunsystems gegen einen Tumor. Dadurch werden die Tumorzellen gezielt als entartet erkannt und abgetötet. Die Vorteile dieses Vorgehens liegen u.a. darin, daß das körpereigene Immunsystem gezielt in Richtung einer Zerstörung des Tumors mobilisiert wird. Es stellt ein einfaches Immunisierungsverfahren dar, da die APCs die tumorassoziierten Antigene mittels einer bakteriellen Infektion erhalten, d.h. bei dem erfindungsgemäßen Vorgehen ist keine arbeitsintensive ex vivo-Modifikation autologer APCs erforderlich, da ein natürlich vorkommender Infektionsprozess zur Modifizierung der Zellen des Immunsystems ausgenutzt wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Listeria- Expressionsvektor zur Immuntherapie, wobei der Listeria- Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktioneil verknüpft umfaßt: (a) einen in Listeria aktiven Promotor; und (b) eine für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz oder davon abgeleitete antigene Epitope.
Der hier verwendete Ausdruck "in Listeria aktiver Promotor" bezieht sich auf alle Promotoren, die in Listeria die Expres s i on der tumoras s o z i i erten Ant i gene er l auben . Vorzugsweise handelt es sich dabei um Promotoren von Listeria monocytogenes-Genen, beispielsweise konstitutive oder unter den Bedingungen der Infektion aktivierte Promotoren. Besonders bevorzugt sind Promotoren, die zu einer starken Expression des gewünschten Antigens führen. Dieser Begriff bezieht sich auch auf Promotor-Fragmente oder Promotoren mit modifizierten Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Promotor für die Listeria-Expressionsvektoren um einen Promotor des hly-, actA, plcA, plcB oder mpl-Gens, die jeweils unter den Bedingungen der Infektion aktiv sind und die die Listeria- Proteine Haemolysin, ActA, Phosphotidylinositol-spezifische Phospholipase C, Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C bzw. Metalloprotease codieren. Diese Promotoren sind bereits in der Literatur ausführlich beschrieben: actA/plcB Promotor: Domann et al . , (1992), EMBO J.
11: 1981-1990 (Die Transkription des actA und des plcB Gens wird durch einen gemeinsamen Promotor gesteuert) - hly Promotor: Domann et al . , (1989), Nucleic Acids
Res. 17: 6406 plcA Promotor: Domann et al . , (1991), Mol.
Microbiol. 5: 361-366 mpl Promotor: Domann et al . , (1991), Infect . Immun. 59: 65-72
Der hier verwendete Ausdruck "für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz" betrifft jede DNA-Sequenz, die das native Protein ganz oder teilweise codiert. Diese DNA-Sequenzen sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind beispielsweise beschriebenen: humanes Tyrosinase-Gen: Genbank Accession Nr: M27160 humanes trp-1 Gen: Genbank Accession Nr. : AF001295 humanes trp-2 Gen: Genbank Accession Nr. : D17547 humanes MelanA/MART-l Gen: Genbank Accession Nr.: U06452 Hierzu wird außerdem auf die Figuren 1-4 verwiesen.
Bei den Antigenen Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 und MelanA/MART-l handelt es sich um Differenzierungsantigene melanocytären Ursprungs. Da diese Antigene ausschießlich in melanozytären Zellen (Melanocyten) im Rahmen der Melanogenese exprimiert werden, sind sie außerordentlich gut geeignet, um eine spezifische Immunantwort gegen Melanomzellen zu generieren. Diese Differenzierungsantigene haben zudem den Vorteil, daß sie von bis zu 100% der Zellen eines pigmentierten Tumors (Melanom) exprimiert werden, wohingegen nur ca. 50% der Melanome Cancer-Testis Antigene, wie z.B. MAGE-1, exprimieren. Die Enzyme Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 katalysieren den Prozeß der Pigmentbildung (Malaninbiosynthese) . Die Biosynthese findet in den spezifischen Organellen, den Melanosomen statt, in deren Matrix auch das MelanA/MART-l Protein lokalisiert ist .
Der Ausdruck "für humane codierende DNA-Sequenz" betrifft darüber hinaus auch DNA-Sequenzen, die solche Formen von humaner Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l bzw. Trp-2 codieren, die Veränderungen gegenüber der nativen Form, d.h. beispielsweise Deletionen, Additionen oder Austausche von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) oder die Anheftung eines Ubiquitin-Restes aufweisen oder veränderte Oligosaccharidseitenketten, wobei ihre antigenen Eigenschaften ganz oder teilweise bzw. in der gewünschten Weise bleiben, d.h. sie weisen beispielsweise die in den nachstehenden Beispielen hinsichtlich der Behandlung eines Tumors beschriebenen Eigenschaften auf. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d.h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z.B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z.B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z.B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Zu den Austauschen zählen auch "nicht-konservative" Austausche, die die antigenen Eigenschaften der Proteine bzw. einzelner abgeleiteter Proteinfragmente (Peptide) erhalten oder sogar verstärken können. Dies kann durchaus die biologische bzw. enzymatische Aktivität des nativen Proteins verändern. Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d.h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Die vorstehenden Varianten betreffen auch Varianten, die im Vergleich zu der ursprünglichen Form eine bessere Wirksamkeit hinsichtlich der Tumorbekämpfung aufweisen. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Aminosäuresequenz bzw. entsprechenden Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) . Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein bzw. Peptid noch über die erwünschten antigenen Eigenschaften der Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l bzw. Trp-2 (ganz oder teilweise) verfügt. Diese antigenen Eigenschaften lassen sich für die Proteine/Peptide anhand der Stimulierung Antigen-spezifischer cytotoxischer T- Zellinien feststellen. Im Falle der Peptide bietet sich außerdem eine Überprüfung ihrer HLA-Bindungseigenschaften im Rahmen von FACS Analysen an. Vorzugsweise sollten die Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l, Trp-2 bzw. die vorstehenden Varianten codierenden DNA-Sequenzen eine Transkriptionsterminationssequenz und eine
Translationsterminationssequenz zur Gewährleistung einer stabilen und korrekten Transkription bzw. Translation aufweisen.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion der erfindungsgemäßen L i,s t e r i a - Expressionsvektoren, u.a. zur Ligation der Fragmente für den Promotor und die tumorassoziierten Antigene und Insertion in den Vektor, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Ausubel und Frederick (1991) , Current Protocols in Molecular Biology (J.Wiley & Sons, New York) beschrieben sind.
Am meisten bevorzugt sind Listeria-Expressionsvektoren, bei denen die für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l bzw. Trp-2 codierende DNA-Sequenz mit einer ein Listeria- Protein (fragment) codierenden DNA-Sequenz so verknüpft ist, daß ein Fusionsprotein codiert wird. Vorzugsweise stellt der von dem Listeria-Protein stammende Anteil den N-terminalen Anteil des Fusionsproteins dar. Verschiedene Listeria-Proteine bzw. Fragmente davon sind zur Herstellung dieses Fusionsprotein geeignet, beispielsweise die vorstehend hinsichtlich der Listeria-Promotoren offenbarten Gene. Noch mehr bevorzugt sind Listeria-Expressionsvektoren, bei denen der Listeria-Protein-Anteil des Fusionsproteins von einem an der Lyse der Wirtsvakuolen oder an Bewegungen der Bakterien in der Wirtszelle beteiligten Protein stammt, vorzugsweise Listeriolysin 0 (Lyse) , ActA (intrazelluläre Bewegung) oder PI-PLC (Lyse) . Der Vorteil von Listeriolysin 0, eine Listeria- Phospholipase oder das ActA-Protein zur Konstruktion von Fusionsproteinen einzusetzen, liegt darin, daß diese Proteine sekretiert werden. Im Falle einer Infektion gelangen diese Fusionsproteine daher bevorzugt ins Phagolysosom bzw. ins Cytosol der infizierten Zelle, d.h. in die Zellkompartimente, in denen die Generierung von HLA-Klasse I und HLA-Klasse II präsentierten Peptiden stattfindet. Die Fusionsproteine können vorzugsweise wie folgt aussehen: a) lediglich die sekretorische Signalsequenz eines Listerien-spezifischen Proteins wird mit dem Antigen fusioniert b) die sekretorische Signalsequenz inklusive eines
Ausschnitts der sich daran anschließenden nativen
Proteinsequenz wird mit dem Antigen fusioniert, c) ein kurzes Fragment des Antigens wird unter
Aufrechterhaltung des Leserahmens in die Sequenz des genannten Listerien-Proteins eingebaut.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Listeria- Expressionsvektoren, bei denen der Listeria-Protein-Anteil des Fusionsproteins eine Signalsequenz eines sezernierten Listeria-Proteins umfaßt. Vorzugsweise stammt die Signalsequenz vom Listeria-Haemolysin, einer Listeria- Phospholipase oder dem ActA-Protein.
Ausgangsvektor für die Herstellung des erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektor ist jeder Vektor, der in Listeria zur Expression der gewünschten Antigene führt. Dabei kann es sich um einen autosomalen oder stabil in das Listeria-Genom inserierenden Vektor handeln. Vorzugsweise ist der Ausgangsvektor ein "Shuttle" -Vektor , der sich in einem weiteren Wirt, beispielsweise E. coli, vermehren läßt. Derartige Vektoren sind beispielsweise pKSV7 (Frankel et al . , 1995, J. Immunol. 155: 4775-4782), pCGU34 (Paglia et al . , 1997, Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575), pAUL-A (Niebuhr et al . , 1997, EMBO J. 16: 5444-5445) und pLIGAl60.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren (autosomal oder stabil in das Genom integriert, beispielsweise über homologe Rekombination) enthaltende rekombinante , attenuierte Listeria-Bakterien, vorzugsweise Listeria monocytogenes oder Listeria innocua, wobei letzterer sich insbesondere zur Verstärkung einer Immunantwort eignet. Die Auswahl geeigneter Listerien kann für den Fachmann nach üblichen Kriterien hinsichtlich des Einsatzes von Bakterien für die Vakzinierung erfolgen, d.h. die für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendbaren Listerien sollten über Immunogenizität verfügen, jedoch ausreichend attenuiert sein, um die sichere Anwendung beim Menschen zu erlauben. Dazu ist es nötig, daß der Mutantenphänotyp der Listerien absolut stabil ist, was üblicherweise nur.durch die Erzeugung chromosomaler Deletionen möglich ist. Zu den Beispielen für attenuierte Mutanten zählen Mutanten, die hinsichtlich der Ausbreitung von Zelle zu Zelle defizient sind, actA-negative Mutanten, die hinsichtlich des intrazellulären Wachstums defizient sind, hly2- (Listeriolysin) -negative Mutanten, sowie Mutanten, die zumindest hinsichtlich eines Phospholipase-Gens defizient sind (Guz än et al . , Infect. Immun. 63 (1995), 3665-3673). Zu den Beispielen für geeignete Listeria-Stämme zählen die Δmpl2- Mutante (Paglia et al . , Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575). Geeignete attentuierte Listeria-Stämme sind auch in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP98/08096 beschrieben. Verfahren zur Transformation der vorstehenden Listerien mit den erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren, beispielsweise Elektroporation, zur phänotypischen Selektion von Tr ans f orman t en und zur Expression der die tumorassoziierten Antigene (gegebenenfalls als Fusionsproteine) codierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Listeria-Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein die erfindungsgemäßen rekombinanten attenuierten Listeria- Bakterien enthaltendes Arzneimittel (Impfstoff) bzw. deren Verwendung zur Immuntherapie . Diese Immuntherapie eignet sich zur Behandlung pigmentierter Tumorarten, vorzugsweise zur Therapie des malignen Melanoms oder des malignen Schwannoms
(Untergruppe der Neuroblastome) . Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen
Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger
Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc.. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann beispielsweise zur oralen Verabreichung in Form eines Elixiers, einer Kapsel oder Suspension verabreicht werden. Die geeignete Dosierung und die Art der Verabreichung, vorzugsweise orale, intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung werden von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium und Schweregrad des Tumors, der Art der Verabreichung etc.. Jedenfalls muß die Verabreichung in einer wirksamen Menge erfolgen, d.h. einer Menge, daß das tumorassoziierte Antigen in einer Menge exprimiert wird, daß eine Immunantwort in T- Zellen gegenüber dem tumorassoziierten Antigen induziert wird, so daß dieses Antigen enthaltende Zellen zerstört werden. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann entweder allein verabreicht werden oder in Kombination mit weiteren Tumortherapien.
Erfindungsgemäße Expressionsvektoren wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) , Mascheroder Weg lb, Braunschweig jeweils am 5. Oktober 1999 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Die hinterlegten Proben haben folgende Hinterlegungsnummern erhalten:
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp2 DSM 13072 Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-tyro DSM 13073 Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trpl DSM 13074
Die Figuren erläutern weiter die Erfindung.
Fig. 1: Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl .
Tyrosinase und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz
Fig. 2: Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
Trp-1 und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz
Fig. 3: Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
Trp-2 und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz
Fig. 4: Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
MART-1/MelanA und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz
Fig. 5: Analyse der Ober f ächenmarker infizierter dentritischer Zellen
Die Expression der Oberf lächenmarker nicht mit L. monoycytogenes Bakterien infizierter dentritischer Zellen (dünne Linien) sowie die infizierter dentritischer Zellen (dicke Linien) wurden analysiert. Schattierte graue Histogramme repräsentieren die Kontrollen
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1: Herstellung zweier verschiedener die humane
Tyrosinase exprimierender Listeria- Expressions e toren
Am 5 ' - und am 3 ' -Ende der für die menschliche tumorassoziierte Tyrosinase-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer: M27160) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tab. 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (tyr-5/2- LIGA+tyr/3-LIGA ; tyr/5-LIGA+tyr/3-LIGA) eine Ndel bzw. eine Sall-Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination tyr- 5/2-LIGA und tyr/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifizierung der vollständigen Tyrosinase cDNA-Sequenz eingesetzt. Die Primerkombination tyr/5-LIGA und tyr/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur Amplifizierung einer 5 ' -deletierten Tyrosinase cDNA-Sequenz eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurden dann wie folgt behandelt: Unter Ausnutzung der genannten Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor PLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA- Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al . , 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723). Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert. Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pLIGA-tyrof (codiert gesamte Tyrosinase cDNA) bzw. pLIGA-tyro (codiert 5 ' -deletierte Tyrosinase cDNA) . Letzterer wurde bei der DSMZ am 5. Oktober unter der Nummer DSM 13073 hinterlegt.
Beispiel 2: Herstellung zweier verschiedener das humane trp-1 Protein exprimierender Listeria-
Expressionsvektoren
Am 5'- und am 3 ' -Ende der für das menschliche tumorassoziierte Trp-1 Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer : AF001295) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tab. 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (trpl-5/2- LIGA+trpl/3-LIGA ; trpl/5-LIGA+trpl/3-LIGA) eine Ndel bzw. eine Bgl II Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination trpl-5/2-LIGA und trpl/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifikation der vollständigen trp-1 cDNA-Sequenz eingesetzt. Die Primerkombination trpl/5-LIGA und trpl/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur Amplifikation einer 5 ' -deletierten trp-1 cDNA-Sequenz eingesetzt. Beider PCR-Amplifikate wurden dann wie folgt behandelt: Unter Ausnutzung der genannten Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA- Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al . , 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert. Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pLIGA-trplf (codiert die gesamte trp-1 cDNA) bzw. pLIGA-trpl (codiert 5 ' -deletierte trp-1 cDNA) . Letzterer wurde am 5. Oktober 1999 bei der DSMZ Braunschweig unter DSM 13074 hinterlegt .
Beispiel 3: Bereitstellung zweier verschiedener das humane trp-2 - Protein exprimierender Listeria-Expressionsvektoren
Am 5'- und am 3 ' -Ende der für das menschliche tumorassoziierte Trp-2 Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer : D17547) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (trp2-5/2- LIGA+trp-2/3-LIGA ; trp2/5-LIGA+trp2/3-LIGA) eine Ndel bzw. eine Sal I Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination trp2-5/2-LIGA und trp2/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifikation der vollständigen trp-2 cDNA-Sequenz eingesetzt. Die Primerkombination trp2/5-LIGA und trp2/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur Amplifizierung einer 5 ' -deletierten trp-2 cDNA-Sequenz eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurde dann wie folgt behandelt : Unter Ausnutzung der genannten Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGAl60 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA- Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al . , 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert.
Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pLIGA-trp2f (codiert die gesamte trp-2 cDNA) bzw. pLIGA-trp2
(codiert 5 ' -deletierte trp-2 cDNA) . Letzterer wurden am 5.
Oktober 1999 bei der DSMZ Braunschweig unter DSM 13072 hinterlegt.
Beispiel 4: Herstellung eines das humane MelanA/MART-l
G e n e x p r i m i e r e n d e n L i s t e r i a - Expressionsvektors
Am 5'- und am 3 ' -Ende der für das menschliche tumorassoziierte MelanA-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer : U06452) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Primer (melanA-5/2-LIGA, melanA/3- LIGA) eine Ndel bzw. eine Bgl II Erkennungssequenz eingeführt. Unter Ausnutzung der Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA-Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al . , 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert. Beispiel 5: Antigen-Expression in Listeria monocytogenes
Die in den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Listeria-Expressionsvektoren wurde nach Amplifikation in dem E.coli-Stamm XL2-Blue jeweils in den L. monocytogenes Stamm EGD sowie in die attentuierten Mutanten Δhly2 und ΔactA (Guzmann et al . , 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) mittels Elektroporation eingeführt. Die dazu angewandte Technik ist dem Fachmann hinreichend bekannt. Plasmidtragende Listerien wurden anhand der plasmidvermittelten Erythromycin-Resistenz identifiziert. Die Expression der tumorassoziierten Antigene wird dann unter Anwendung immunologischer Nachweisverfahren (z.B. immunologische Färbung, Western Blot) mittels spezifischer Antikörper (MelanA-AK erhältlich von Fa. Novocastra; Tyrosinase-AK erhältlich von Fa. BioTrend, Köln; Trp-1 AK beschrieben in Thomsen et al , 1985, J. Invest. Dermatol. 85: 169-174) bestimmt. Jedes der tumorassoziierten Antigene konnte nachgewiesen werden, d.h. der gewählte Expressionsweg war erfolgreich.
Beispiel 7: Immunisierung von Mäusen des transgenen MäuseStamms HLA-A2
Der im vorstehenden Beispiel 4 beschriebene Listeria- Expressionsvektor pLIGA-MelanA wurde nach Amplifikation im E.coli-Stamm XL2-Blue in den L. monocytogenes Stamm EGD (Gύzman et al . , 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) mittels Elektroporation eingeführt. Diese Bakterien wurden über Nacht bei 37°C in BHI (Brain-Heart-Infusion) -Medium (Hersteller: Fa. Difco) angezüchtet. Es wurde eine 1:50 Verdünnungskultur angelegt und das Wachstum der Bakterien bis zur mittleren log- Phase fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 3000xg geerntet. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und in PBS resuspendiert. Zur Kontrolle wurden die das nicht-veränderte Plasmid pLIGAl60 tragenden EGD-Bakterien ebenso behandelt und kultiviert. Mäuse vom transgenen Stamm HLA-A2kb (Vitiello et al . , 1991, J. Exp . Med. 173: 1007-1015) wurden mit den in PBS resuspendierten Bakterien (EGD-pLIGA-MelanA und EGD-pLIGA160) im 7-tägigen Intervall immunisiert. Die Mäuse erhielten jeweils eine orale Applikation von lxlO6 Bakterien an Tag 0 und 1X107 Bakterien an Tag 7, 14, 21, usw.
Primäres Ziel der Immunisierungsexperimente ist die Erzeugung einer zellulären cytotoxischen T-Zellantwort . Die Antigen- spezifische Aktivität cytotoxischer T-Zellen gilt als Grundlage einer effizienten antitumorösen Immunantwort.
Die Milzen von je 3 immunisierten Mäusen werden 7 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, gepoolt und mechanische bearbeitet, daß eine Einzelzellsuspension vorliegt. Die
Milzzellen werden mit einer zur HLA-A2kb transgenen Zellinie
(C1R-A2kb) restimuliert . Diese Zellinie ist mit dem MelanA-
Antigen kodierenden Gen stabil transfiziert und kann daher zur
Stimulierung der cytotoxischen Aktivität Antigen-spezifischer T-Zellen eingesetzt werden. Nach 5-7 Tagen werden die lebenden Zellen geerntet und im dem Fachmann hinreichend bekannten 51Cr- Freisetzungsexperiment auf ihre Fähigkeit hin überprüft, die genannten Antigen-exprimierenden Zielzellen zu lysieren.
L. monocytogenes
% Spezifische Lyse der MdanA-exprimierenden CIR-Alk* Zielzellen EGD EffektoπTarget Verhältnis 50:1 25:1 10:1 pLIGA-MelanA 30 25 18
PUGA160
Dargestellt ist die MHC-Klasse I Melan A restringierte Lyse von MelanA exprimierenden C1R-A2kb ZielzeUen durch Lymphocyten die in vivo mit dem rekombinanten L. monocytogenes EGD pLIGA-MelanA Vakzinstamm primär stimuliert wurden. 7 Tage nach der letzten Immunisierung mit EGD-pLIGA-MelanA bzw. EGD-pUGA160 (Negativkontrolle) wurden die Milzzellen an Tag 5 nach Entnahme in vitro restimuliert. Zur in vitro Restimulierung wurde die zum immunisierten HLA-A2k transgenen Mausstamm syngene C1R-A2kb Zellinie, die stabil mit dem humanen MelanA kodierenden Gen transfiziert wurde, eingesetzt. Zum Ende der Kultur wurden die Lymphocyten im s,Cr-
Freisetzungsexperiment auf ihre Fähigkeit zur Lyse der CIR-A∑k" MelanA transfizierten Zellinie hin getestet.
EGD-p IGA160 : Negativkontrolle Tabelle 1
Primer zur Amplrfizieruno der vollständigen Antiqen-kodieren en c-DNA
Tab. 1: Primer zur Amplifizierung der Antigen kodierenden c-DNA Sequenzen Fett markiert ist jeweils die Erkennungssequenz spezifischer Restriktionsenzyme, die fύr die Ktonierung des PCR-Amplifikats in den Vektor pLIGA160 eingesetzt wurden. Unterstrichen ist der Anteil eines Primers, der an die komplementäre Sequenz der genannten c-DNA bindet
PCR Bedingungen zur AmpTrfizierung der genannten c-DNA Fragmente:
• Initiale Denaturierung: 3 Min. bei 94"C
• Zyklus (40 X): 0,5 Min. bei 94*C
1 Min. bei 55*C 1,5 Min. bei 68βC
• abschließende Polymerisation: 7 Min. bei 68βC Tabelle 2
Primer zur Amplifizierunα der δ'-verkürzteri Antiαen-kodierenden c-DNA
Tab. Primer zur Amptifizierung der Antigen kodierenden 5'- deietierten c-DNA
Sequenzen Fett markiert ist jeweils die Erkennungssequenz spezifischer Restriktionsenzyme, die für die Ktonierung des PCR-Amplifikats in den Vektor pUGA160 eingesetzt wurden. Unterstrichen ist der Anteil eines Primers, der an die komplementäre Sequenz der genannten c-DNA bindet
PCR Bedingungen zur Amplifizierung der genannten c-DNA Fragmente:
• Initiale Denaturierung: 3 Min. bei 94°C
• Zyklus (40 X): 0.5 Min. bei 94'C
1 Min. bei 55*C 1,5 Min. bei ββ'C
• abschließende Polymerisation: 7 Min. bei 68#C . Beispiel 8: Infektion humaner dendritischer Zellen mit
L. monocytogenes EGD und der attentuierten Mutante . monocytogenes Δhly2
Da rekombinante Listerien als Vektorsystem im Rahmen einer anti-Melanom-Vakzine in den Menschen eingesetzt werden sollen, ist es notwendig, neben Untersuchungen im Tiermodell auch die Wechselwirkung dieser Bakterien mit den humanen Zellen des Immunsystems zu analysieren. Aus diesem Grund wurde die Interaktion von Listeria monocytogenes EGD (Wildtypstamm) sowie von weiteren attentuierten Stämmen mit humanen dendritischen Zellen (DZ) untersucht. Nur DZ sind nach Aufnahme einer Antigen-Vakzine in der Lage gegen das betreffende Antigen eine primäre Immunantwort zu initiieren (Banchereau et al . , (1998), Nature 392, S. 245-252). Für eine effiziente Belieferung der DZ mit der anti-Melanom-Vakzine ist es daher notwendig, daß diese Zellen durch die Listerien infiziert werden können. Zur Bestimmung der Inf ekt ionse f f i z i enz wurde das folgende Experiment durchgeführt: Nach einem Standardprotokoll (Thurner et al . (1999), J. Immunol. Methods 223, S. 1-15) wurden aus den Zellen des peripheren Blutes in-vitro unreife DZ generiert, die mit den Bakterien in einem Verhältnis von 1 (DZ) : 5 (Bakterien) infiziert wurden (d.h. 1 x 105 DZ wurden mit 5 x 105 Bakterien inkubiert) . Um die Infektionseffizienz zu erhöhen, wurde für 5 Minuten bei 1200 rpm zentrifugiert . Nach einer Stunde Inkubation wurde 10 μg/ml Gentamycin zu den Kulturen addiert, um die extrazellulären Bakterien abzutöten. Weitere 3 Stunden später wurden die DZ zweimal mit PBS gewaschen und durch Inkubation mit 1% NP-40 PBS lysiert, um die phagozytotisch aufgenommenen Bakterien freizusetzen. Zur Bestimmung der Bakterienzahl wurden Aliquots des Lysats auf Bakterien-Wuchsagar ("Brain Heart Infusion Agar") plattiert. Da jedes intakte Bakterium nach Inkubation eine Kolonie auf dem Agar bildet, ist die Zahl der intrazellulären Bakterien als Zahl der Kolonie-formenden Einheiten (CFU) definiert. Die nachfolgende Tabelle 3 stellt das Ergebnis der Infektionsexperimente dar, welche belegen, daß unreife humane DZ effizient durch Listerien infiziert werden können.
Tabelle 3
L . monocytogenes EGD L . monocytogenes Δhly2 (Wildtyp) (Deletion des
Listeriolysingens )
CFU 2,94 x 105 4,82 x 104
Beispiel 9: Bestimmung des Einflusses der Infektion auf den
Phänotyp von dendritischen Zellen
Die Wechselwirkung unreifer DZ mit Bakterien kann zu ihrer Ausreifung führen und damit einen positiven Einfluß auf ihre Fähigkeit haben, T-Zellen zu stimulieren. Die Reifung der DZ geht mit Veränderungen im Expressionsmuster spezifischer Oberflächenmarker einher, d.h. die Expression spezifischer Oberflächenmoleküle, die für die Stimulierung einer zellulären Immunantwort essentiell sind, wird verstärkt. Dabei handelt es sich um costimulatorische Moleküle wie CD40, CD80, CD86 oder um Adhesionsmoleküle wie CD54. Das CD83-Oberflächenmolekül ist ein spezifischer Marker für reife dendritische Zellen, dessen Funktion allerdings noch unklar ist. Der Expressionsnachweis dieser Oberflächenmarker erfolgt mittels Immunfluoreszenz im Durchflußzytometer (FACS) .
Um den Einfluß der Listeria-Infektion auf den Phänotyp humaner DZ zu bestimmen, wurde wie folgt vorgegangen: Nach einem Standardprotokoll (Thurner et al . (1999), J. Immunol. Methods 223, S. 1-15) wurden aus den Zellen des peripheren Blutes in- vitro unreife DZ generiert, die mit L. monocytogenes EGD
Wildtypstamm-Bakterien in einem Verhältnis von 1 (DZ) : 5
(Bakterien) infiziert wurden (d.h. 1 x 105 DZ wurden mit 5 x
105 Bakterien inkubiert) . Um die Infektionseffizienz zu erhöhen, wurde für 5 Minuten bei 1200 rpm zentrifugiert . Nach einer Stunde Inkubation wurde 10 μg/ml Genta ycin zu den Kulturen addiert, um die extrazellulären Bakterien abzutöten. Die Ansätze wurden dann für weitere 20 Stunden inkubiert. Als Kontrollen wurden Parallelkulturen verwendet, die uninfiziert gelassen wurden. Danach wurden die DZ geerntet und gewaschen. Die Zellen wurden indirekt oder indirekt mit den folgenden monoklonalen Antikörpern inkubiert: FITC-konjugiertes anti- HLA-DR (Becton Dickinson, Heidelberg) , anti-CD54 und PE- konjugiertes anti-CD83 (Coulter-Immunotech, Hamburg) , PE- konjugiertes anti-CD80 (Pharmingen, Hamburg), FITC- konjugiertes anti-CD40 und FITC-konjugiertes anti-CD86 (Cymbus Biotechnology, Dianova, Hamburg) . FITC-konjugiertes anti-Maus- IgG (Dianova, Hamburg) wurde als sekundäres Reagenz für den anti-CD54-Nachweis verwendet. Maus-IgG wurde als Isotyp- Kontrolle verwendet. Die Analyse der Expression der Oberflächenmarker auf den dendritischen Zellen wurde mittels Cytofluorometrie (FACScan, Fa. Becton Dickinson) durchgeführt. Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt. Diese Figur zeigt, daß es durch die Infektion zu einer verstärkten Expression spezifischer costimulatorischer Moleküle kommt. Desweiteren kommt es durch die Infektion zu einer Ausreifung der DZ, sichtbar anhand der CD83-Expression. Diese Daten zeigen, daß die Infektion der DZ mit bakteriellen Vakzinvektoren einen positiven Effekt auf den Phänotyp der Antigen-präsentierenden Zellen hat.

Claims

Patentansprüche
1. Listeria-Expressionsvektor zur Immuntherapie, wobei der Listeria-Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktioneil verknüpft umfaßt:
(a) einen in Listeria aktiven Promotor; und
(b) eine für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz.
2. Listeria-Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der in Listeria aktive Promotor der Promotor des hly-, actA-, plcA-, plcB- oder mpl-Gens ist.
3. Listeria-Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, zusätzlich eine ein Protein codierende DNA so enthaltend, daß ein ein Listeria-Protein und humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-l oder Trp-2 umfassendes Fusionsprotein codiert wird.
4. Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das Listeria- Protein ein an der Lyse der Wirtsvakuolen oder an der Wanderung der Wirtszelle beteiligtes Enzym ist.
5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei das Listeria- Protein Listeriolysin 0, PI-PLC oder ActA ist.
6. Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das Listeria- Protein eine Signalssequenz eines sezernierten Listeria- Proteins umfaßt.
7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz von Haemolysin (Listeriolysin 0) , einer Phospholipase (PI-PLC) oder dem ActA-Protein stammt.
8. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der von pKSV7, pAUL-A oder pLIGAlβO stammt.
9. Rekombinantes attenuiertes Listeria-Bakterium, den Listeria-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend.
10. Rekombinantes attenuiertes Listeria-Bakterium nach Anspruch 9, das Listeria monocytogenes ist.
11. Impfstoff, ein rekombinantes attenuiertes Listeria- Bakterium nach Anspruch 9 oder 10 enthaltend.
12. Verwendung des rekombinanten attenuierten Listeria- Bakteriu s nach Anspruch 9 oder 10 zur Immuntherapie.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Immuntherapie die Therapie des malignen Melanoms ist.
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