EP1210375A1 - Proteines recombinantes, et complexes moleculaires derives de ces proteines, analogues a des molecules impliquees dans les reponses immunitaires - Google Patents

Proteines recombinantes, et complexes moleculaires derives de ces proteines, analogues a des molecules impliquees dans les reponses immunitaires

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Publication number
EP1210375A1
EP1210375A1 EP00956572A EP00956572A EP1210375A1 EP 1210375 A1 EP1210375 A1 EP 1210375A1 EP 00956572 A EP00956572 A EP 00956572A EP 00956572 A EP00956572 A EP 00956572A EP 1210375 A1 EP1210375 A1 EP 1210375A1
Authority
EP
European Patent Office
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recombinant
proteins
cells
molecules
chains
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00956572A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Glaichenhaus
Laurent The Scripps Research Institute MALHERBE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6043—Heat shock proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the invention relates to recombinant proteins, and to molecular complexes derived from these proteins, analogous to molecules involved in immune responses.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • These molecules are made up of two polypeptide chains: the heavy chain, and the light chain.
  • MHC molecules are expressed on the surface of the presenting cells (dendritic cells, B lymphocytes, macrophages) in the form of molecular complexes with antigenic peptides, themselves derived from extracellular or intracellular proteins.
  • presenting cells dendritic cells, B lymphocytes, macrophages
  • MHC molecules belong to two distinct classes: those of class I, which are recognized by CD8 + T lymphocytes (cytotoxic T cells) and those of classes II which are recognized by CD4 + T lymphocytes (helper T cells). To be usable as probes for counting and measuring the frequency of T lymphocytes specific for a given antigen, such molecules and complexes must be produced in soluble form. These same soluble molecules and complexes can be used to modulate immune responses.
  • MHC class I molecules have been used to produce MHC class I molecules. After incubation of these molecules with antigenic peptides, the peptide / MHC complexes have been purified and obtained under form of tetramers after incubation with streptavidin. This last step is made possible by the addition at the carboxy-terminal end of the heavy chain of the MHC of a recognition site for the enzyme BirA, a bacterial enzyme, which is capable of catalyzing the addition of a biotin molecule.
  • BirA a bacterial enzyme, which is capable of catalyzing the addition of a biotin molecule.
  • Other teams have chosen to produce dimers of MHC class I molecules using the skeleton of an antibody.
  • the heavy chain of the MHC was linked to the heavy chain of an immunoglobulin (Ig for short) and the ⁇ -2-microglobulin linked to the light chain.
  • the Fc regions of the heavy chains associating via disulfide bridges, the molecules produced are dimers of MHC molecules.
  • the preparation of molecular probes that selectively bind to CD4 + T cells has proven to be much more difficult, presumably because of the intrinsic instability of MHC class II molecules.
  • Tetramers of class II molecules linked to an antigenic peptide, or dimers of these molecules obtained using the backbone of an antibody have been produced.
  • such constructions are sufficiently stable to be able to be used as molecular probes, thus opening up a wide field of application.
  • constructs can also be used to obtain analogues of T cell receptors capable of specifically recognizing such molecules.
  • the object of the invention is therefore to provide recombinant molecules and corresponding recombinant complexes, in which these molecules are associated with antigenic peptides, of great stability and of high affinity for their ligand.
  • the invention further relates to the immunological applications of these complexes as molecular probes.
  • the soluble recombinant proteins according to the invention consist at least of a dimer itself formed from the ⁇ and ⁇ chains of MHC class I or II molecules.
  • soluble recombinant proteins consist at least of a dimer itself formed of two proteins each consisting of all or a fused part of the alpha and beta chains of MHC class I or II molecules.
  • dimers are characterized in that they comprise, at the carboxy-terminal end of one or of the 2 chains, all or part of an Fc region of an immunoglobulin.
  • Part of an Fc region denotes a fragment corresponding to a natural fragment, or modified with respect to such a natural fragment, by substitution and / or by deletion and / or by mutation, but capable of binding to a protein possessing binding sites for the Fc region, such as protein A or protein G.
  • the Fc region corresponds more specifically to all or part of the CH 2 and / or CH 3 domain.
  • This domain can be modified with respect to the natural domain, but must be capable, in accordance with the invention, of binding to a protein of the protein A or G type having several binding sites for the Fc region of an Ig.
  • the immunoglobulin comprising the constant region referred to above can be an IgG, in particular the isotypes IgG1, IgG2a,
  • IgG2b IgG3, IgM, IgA, IgD or IgE.
  • the proteins of the invention are more particularly characterized in that they comprise all or part of the ⁇ or ⁇ chains of MHC molecules.
  • the chains ⁇ to ⁇ constituting the dimer comprise leucine slides, which promotes their pairing.
  • leucine slides are for example described by Scott et al (2) or Kalandadze et al (3).
  • the invention relates in particular to recombinant molecules associated in several dimers and in particular in tetramers and very especially in octamers.
  • Such recombinant molecules are complexed with a natural or artificial protein comprising several binding sites for the constant regions of the immunoglobulins and thus making it possible to create multimers of dimers.
  • a natural or artificial protein comprising several binding sites for the constant regions of the immunoglobulins and thus making it possible to create multimers of dimers.
  • protein A commonly isolated from Staphylococus aureus, or even protein G of Streptococus (group C), or receptor multimers of the Fc regions obtained by genetic recombination.
  • the recombinant molecules as defined above complexed with antigenic peptides constitute analogues of MHC. These are soluble recombinant proteins characterized in that they are covalently or non-covalently linked to an antigenic peptide.
  • the invention relates to such complexes, characterized in that they comprise at the - NH 2 end of the ⁇ chain, an antigenic peptide attached via a flexible arm. This arm can have a variable length and allows the positioning of the antigenic peptide in the groove formed by the or each dimer. Such attachments are described for example by Kozono et al (4) and (5).
  • the nucleotide sequences of the invention have a reading frame corresponding to all or part of a protein as defined above.
  • the sequences coding for the recombinant fragments constituting the molecules defined above are introduced into expression vectors.
  • expression vectors As many expression vectors are used as there are fragments. However, it is also possible, as a variant, to use the same vector for several fragments.
  • expression vectors plasmids and in particular plasmids having a selection marker will advantageously be used. Satisfactory expression results have thus been obtained with plasmids capable of replicating in bacteria and comprising, as a selection marker, a gene for resistance to an antibiotic.
  • the promoters will be chosen so as to allow the expression of the recombinant gene in the expression system used.
  • eukaryotic expression systems mention may be made of recombinant baculovirus systems in insect cells, Drosophila cells, Hamster cells (CHO line) and Monkey cells (COS line). Expression can also be carried out in yeast cells.
  • bacteria are widely used, in particular E. coli.
  • the recombinant molecules produced are purified on immunoaffinity columns, in particular with antibodies. monoclonal or polyclonal, specific to the molecules of interest, or even with support materials such as beads, in particular agarose beads.
  • agarose beads coated with nickel can be used to purify the molecules.
  • the purified molecules obtained are then incubated with the proteins having the binding sites for the Fc region.
  • proteins are advantageously labeled for detection purposes, for example with a fluorophore.
  • the molecule obtained does not contain an antigenic peptide, and it is desired to have antigenic peptide / MHC analog complexes, it is incubated with this peptide in vi tro.
  • the study of the recombinant molecules according to the invention made it possible to demonstrate their great stability and a strong affinity in the immunological recognition tests.
  • the invention thus provides tools of great interest for the modulation of immunological processes.
  • antigen peptide / MHC class II analog complexes for counting and / or purifying T lymphocytes reacting with a given antigen and for characterizing the phenotype of these cells, that is to say determining or identify the molecules that they secrete or that they express on their surface.
  • This detection is carried out on a sample taken from a patient. It can be a blood sample, or carried out on secondary lymphoid organs, such as the lymph nodes, the spleen, or on tumors.
  • These molecules can advantageously be used to count or to purify these cells from cell suspensions as described above.
  • This application can also be implemented as predictive means as for the condition of a patient, in counting and determining the phenotype of self-reactive T cells in patients at risk.
  • the invention thus makes it possible to determine the stage of progression of the disease in patients suffering from autoimmune diseases or to evaluate the effectiveness of certain treatments or therapeutic interventions.
  • the invention also relates to the application of said multivalent complexes defined above in the diagnosis and the development of treatments for autoimmune diseases.
  • a number of autoimmune diseases are caused by the mobilization of self-reactive T cells that destroy the body's tissues. In some cases, for example in diabetics, the diagnosis of the disease is not made until late when the tissues are already destroyed.
  • the invention relates to the application of complexes for enrichment in a given type of T cells.
  • This application provides large quantities of T cells specific for a given antigen in vitro for cell therapy purposes. These cells can in fact be re-inoculated to patients as a preventive or curative measure.
  • the phenotype of complexed T cells can be counted and determined before inoculation.
  • the invention also relates to the application of multivalent recombinant molecules as cell stimulants
  • These molecules can be inoculated into an individual to stimulate the expansion and / or activation of T cells specific for a given antigen in the absence of any other cell, in particular of presenting cells.
  • This use is therefore advantageous for stimulating insufficient immune responses, for example with respect to MHC / tumor antigen complexes.
  • the recombinant molecules are inoculated in vivo, where appropriate after a step of prior ex vivo propagation.
  • FIG. 1 represents the sequence of the cDNA insert of the MHC chain A
  • FIG. 2 the plasmid construct containing the cDNA insert of FIG. 1,
  • FIG. 3 the sequence of the cDNA insert of the ⁇ chain of the MHC
  • FIG. 4 the plasmid construct containing the cDNA insert of FIG. 3
  • FIG. 5 the detailed plasmid construction of FIG. 4, and
  • FIG. 1 gives the cDNA sequence, from position 420 to 1940, and that of the coded peptide (437-1921) (SEQ ID No. 1).
  • the cDNA comprises, ligated together, successively, the fragments coding for the signal peptide of IA, IA ⁇ , a linker, an acid leucine slide, a linker, a Hinge region, the CH 2 region, then the CH region. 3 of Fc.
  • This construct is inserted into the plasmid shown in FIG. 2 and placed for the control of a metallothionein promoter inducible by CuS0 4 .
  • FIG. 3 gives the cDNA sequence, from position 420 to 1370, and that of the encoded peptide (440-1359) (SEQ ID No. 2)
  • the cDNA successively comprises the fragments, ligated together,: coding for a leader sequence, ⁇ 1, a LACK peptide (158-73), a linker, a thrombin site, a linker, IA ⁇ ( ⁇ l) IA ⁇ ( ⁇ 2 ), a linker, a basic leucine slide, a marker with histidine motifs.
  • Steps 2 and 3 are carried out by operating according to (6).
  • the transfected Drosophila cells are cultured in 3 l flasks, at 24 ° C., in Drosophila SFM medium (GIBCO-BRL), supplemented with 1% of FCS (fetal calf serum).
  • the production of LACK / IAd molecules is induced by adding CuSO 4 to the final concentration of 1 mM, then the medium is incubated for 5 to 6 days. The supernatants are collected and, by centrifugation, the cellular debris is removed (20 min, 10K, 4 ° C). The supernatants are then transferred to tubes and centrifuged again.
  • the supernatants are concentrated 8 to 10 times using a Prepscale R concentrator (Millipore, Inc.).
  • the product is frozen at -70 ° C. until 500 ml of concentrated supernatants are obtained.
  • MK-D6 (bed volume 5 ml), equilibrated beforehand in a buffer A of 20 mM sodium phosphate pH 7.0.
  • the elution speed is 10 to 20 ml / h.
  • the column is washed with 30 ml of buffer A (6 times the bed volume) at 0.5 ml / min.
  • the column is neutralized with buffer A.
  • ion exchange chromatography is immediately carried out after elution.
  • the protein concentration of each fraction is determined by denaturing gel electrophoresis.
  • the positive fractions are combined and loaded onto an ion exchange column (Mono Q) (Pharmacia Biotech).
  • Buffer B 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 and buffer C: Tris-HCl 20 mM pH 8.0 + 1M NaCl are used.
  • the LACK / lA > d ⁇ é molecules generally owe 30-36% in buffer C.
  • the fractions corresponding to the elution peak are collected and the protein concentration is determined by denaturing gel electrophoresis.
  • the positive fractions are combined and dialyzed at 4 ° C. against 2 l of PBS, pH 7.4.
  • the dialysis buffer is changed 2 times in 24 hours.
  • the protein concentration is determined according to the BCA test
  • a solution of protein A-coupled to a fluorophore consisting of Alexa 488 R (molecular probes # P-11047) is prepared at a concentration of 0.5 mg / ml in PBS 1 X, pH 7.4. (Protein A from Sigma)
  • peptide / MHC molecule 8 ⁇ g is thawed and 1.1 ⁇ l of protein A coupled to the fluorophore Alexa is added. The mixture is subjected to incubation at room temperature for 30 min, then a PBS / ASB (bovine serum albumin) mixture 0.1% is added for a final volume of 50 ⁇ l. 1 ⁇ l of mouse serum is added and the product is used directly as a coloring reagent.
  • PBS / ASB bovine serum albumin
  • D- Flow cytometry T cells are purified from the lymph nodes of a mouse. 10 cells are transferred to a tube and the staining reagent is added. Two hours later, the cells are washed in isotonic buffer and analyzed by flow cytofluorometry. The frequency of cells reacting with the staining reagent is determined by this method.

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Abstract

L'invention concerne des protéines recombinantes solubles, constituées au minimum d'un dimère lui-même formé des chaînes α et β des molécules du CMH de classe I ou II, caractérisées en ce qu'elles comportent à l'extrémité carboxy-terminale de l'une ou des 2 chaînes, tout ou partie d'une région Fc d'une immunoglobuline. Application des protéines recombinantes liées à un peptide antigénique en diagnostic et thérapeutique.

Description

Protéines recombinantes, et complexes moléculaires dérivés de ces protéines, analogues à des molécules impliquées dans les réponses immunitaires .
L'invention se rapporte à des protéines recombinantes, et à des complexes moléculaires dérivés de ces protéines, analogues à des molécules impliquées dans les réponses immunitaires .
Elle concerne également une méthode de production de telles molécules et de tels complexes, ainsi que leurs applications, en particulier pour le diagnostic et en thérapeutique .
On connaît le rôle majeur, dans une réponse immunitaire, des molécules codées par le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) .
Ces molécules sont constituées de deux chaînes polypeptidiques : la chaîne lourde, et la chaîne légère.
Les molécules du CMH sont exprimées à la surface des cellules présentatrices (cellules dendritiques, lymphocytes B, macrophages) sous la forme de complexes moléculaires avec des peptides antigéniques, eux-mêmes dérivés de protéines extracellulaires ou intracellulaires .
La reconnaissance de ces complexes peptide/CMH par un récepteur spécifique exprimé à la surface des lymphocytes T est à l'origine de toute réponse immunitaire à médiation cellulaire.
Les molécules du CMH appartiennent à deux classes distinctes : celles de classe I, qui sont reconnues par des lymphocytes T CD8+ (cellules T cytotoxiques) et celles de classes II qui sont reconnues par des lymphocytes T CD4+ (cellules T auxiliaires) . Pour être utilisables comme sondes permettant de dénombrer et de mesurer la fréquence des lymphocytes T spécifiques d'un antigène donné, de telles molécules et complexes doivent être produits sous forme soluble. Ces mêmes molécules et complexes solubles peuvent être utilisés pour moduler les réponses immunes .
La possibilité d'utiliser des molécules solubles du CMH pour détecter des lymphocytes T CD8+ a été démontrée pour la première fois par Altman et al en 1996 (1) . Depuis cette date, de nombreuses équipes ont utilisé cette stratégie pour dénombrer et caractériser le phenotype de lymphocytes T CD8+ réagissant avec des peptides viraux, bactériens ou dérivés d'antigènes tumoraux. Toutefois, l'application de cette stratégie pour la détection de lymphocytes T CD4+ s'est révélée problématique.
Dans la plupart des travaux publiés à ce jour, des systèmes d'expression bactériens ont été utilisés pour produire des molécules du CMH de classe I. Après incubation de ces molécules avec des peptides antigéniques, les complexes peptide/CMH ont été purifiés et obtenus sous forme de tétramères après incubation avec de la streptavidine . Cette dernière étape est rendue possible par l'addition à l'extrémité carboxy- terminale de la chaîne lourde du CMH d'un site de reconnaissance pour l'enzyme BirA, une enzyme bactérienne, qui est capable de catalyser l'addition d'une molécule de biotine. D'autres équipes ont choisi de produire des dimères de molécules du CMH de classe I en utilisant le squelette d'un anticorps. Dans ce cas, la chaîne lourde du CMH a été liée à la chaîne lourde d'une immunoglobuline (Ig en abrégé) et la β-2-microglobuline liée à la chaîne légère. Les régions Fc des chaînes lourdes s 'associant par l'intermédiaire de ponts disulfures, les molécules produites sont des dimères de molécules du CMH. Pour des raisons techniques, la préparation de sondes moléculaires se fixant sélectivement aux lymphocytes T CD4+ s'est avérée beaucoup plus difficile, vraisemblablement à cause de l'instabilité intrinsèque des molécules du CMH de classe II.
Des tétramères de molécules de classe II liées à un peptide antigénique, ou des dimères de ces molécules obtenus en utilisant le squelette d'un anticorps ont été produits.
Le problème de la stabilité et de l'affinité des récepteurs de lymphocytes T CD4+ pour leur ligand est résolu, conformément à l'invention, par l'utilisation de constructions assurant la formation de dimères donnant des complexes multivalents grâce à l'utilisation de molécules comportant plusieurs sites de liaison pour certaines régions des dimères.
De telles constructions sont envisageables aussi bien pour des molécules de CMH de classe I que pour celles de classe II.
De manière avantageuse, de telles constructions sont suffisamment stables pour pouvoir être utilisées comme sondes moléculaires ouvrant ainsi un large champ d'application.
Ces constructions sont également utilisables pour obtenir des analogues de récepteurs des cellules T capables de reconnaître spécifiquement de telles molécules.
L'invention a donc pour but de fournir des molécules recombinantes et des complexes recombinants correspondants, dans lesquels ces molécules sont associées à des peptides antigéniques, de grande stabilité et de forte affinité pour leur ligand.
Elle vise également leur production dans des cellules hôtes à l'aide de vecteurs d'expression appropriés.
L'invention vise en outre les applications immunologiques de ces complexes comme sondes moléculaires. Les protéines recombinantes solubles selon l'invention sont constituées au minimum d'un dimère lui-même formé des chaînes α et β des molécules du CMH de classe I ou II.
D'autres protéines recombinantes solubles selon l'invention sont constituées au minimum d'un dimère lui même formé de deux protéines constituées chacune de tout ou partie fusionnée des chaines alpha et béta des molécules du CMH de classe I ou II.
Ces dimères sont caractérisés en ce qu'ils comportent à l'extrémité carboxy-terminale de l'une ou des 2 chaînes, tout ou partie d'une région Fc d'une immunoglobuline .
"Partie d'une région Fc" désigne un fragment correspondant à un fragment naturel, ou modifié par rapport à un tel fragment naturel, par substitution et/ou par délétion et/ou par mutation, mais capable de se lier à une protéine possédant des sites de liaison pour la région Fc, telle que la protéine A ou la protéine G.
L'expression "capable de se lier" est illustrée par l'exemple 1C.
La région Fc correspond plus spécialement à tout ou partie du domaine CH2 et/ou CH3. Ce domaine peut être modifié par rapport au domaine naturel, mais doit être capable, conformément à l'invention, de se lier à une protéine du type protéine A ou G possédant plusieurs sites de liaison pour la région Fc d'une Ig.
L ' immunoglobuline comportant la région constante visée ci-dessus peut être une IgG, notamment les isotypes IgGl, IgG2a,
IgG2b, IgG3 , une IgM, une IgA, une IgD ou une IgE .
Les protéines de l'invention sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie des chaînes α ou β des molécules du CMH. De manière avantageuse, les chaînes α en β constituant le dimère comportent des glissières à leucine, ce qui favorise leur appariement .
De telles glissières à leucine sont par exemple décrites par Scott et al (2) ou Kalandadze et al (3) . L'invention vise en particulier les molécules recombinantes associées en plusieurs dimères et notamment en tétramères et tout spécialement en octamères.
De telles molécules recombinantes sont complexées avec une protéine naturelle ou artificielle comportant plusieurs sites de liaison pour les régions constantes des immunoglobulines et permettant ainsi de créer des multimères de dimères. On citera à titre d'exemple la protéine A communément isolée à partir de Staphylococus aureus , ou encore la protéine G de Streptococus (groupe C) , ou des multimères de récepteur des régions Fc obtenus par recombinaison génétique.
Les molécules recombinantes telles que définies ci- dessus complexées à des peptides antigéniques constituent des analogues de CMH. Il s'agit de protéines recombinantes soluble caractérisées en ce qu'elles sont liées de manière covalente ou non covalente à un peptide antigénique. L'invention vise de tels complexes, caractérisés en ce qu'ils comportent à l'extrémité - NH2 de la chaîne β, un peptide antigénique fixé par l'intermédiaire d'un bras flexible. Ce bras peut avoir une longueur variable et permet le positionnement du peptide antigénique dans le sillon formé par le ou chaque dimère. De telles fixations sont décrites par exemple par Kozono et al (4) et (5) .
Les molécules définies ci-dessus sont obtenues avantageusement selon les techniques décrites dans les Manuels de Biologie Moléculaire pour la préparation des gènes recombinants et leur expression dans des cellules eucaryotes ou procaryotes . On se référera ainsi par exemple aux ouvrages de
Sambrook et al (6) ou de Ausubel et al (7) .
Les séquences nucléotidiques de 1 ' invention possèdent un cadre de lecture correspondant à tout ou partie d'une protéine telle que définie ci-dessus. Les séquences codant pour les fragments recombinants constitutifs des molécules définies ci-dessus sont introduites dans des vecteurs d'expression. On utilise généralement autant de vecteurs d'expression que de fragments. Mais il est également possible, en variante, d'utiliser un même vecteur pour plusieurs fragments. Comme vecteurs d'expression, on utilisera avantageusement des plasmides et notamment des plasmides possédant un marqueur de sélection. Des résultats d'expression satisfaisants ont été ainsi obtenus avec des plasmides capables de se répliquer dans des bactéries et comportant, comme marqueur de sélection, un gène de résistance à un antibiotique.
Les promoteurs seront choisis de manière à permettre l'expression du gène recombinant dans le système d'expression utilisé. On citera à titre d'exemple le promoteur reconnu par la polymérase du bactériophage T4 ou, lorsqu'on utilise comme système d'expression des cellules de Drosophile, le promoteur du gène de la métallothionéine .
Comme systèmes d'expression eucaryote, on citera les systèmes baculovirus recombinants dans des cellules d'insecte, de cellules de Drosophile, des cellules de Hamster (lignée CHO) et des cellules de Singe (lignée COS) . On peut également effectuer une expression dans des cellules de levure.
Comme systèmes d'expression procaryote, les bactéries sont largement utilisées, en particulier E. coli . Les molécules recombinantes produites sont purifiées sur des colonnes d ' immunoaffinité, notamment avec des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, spécifiques des molécules d'intérêt, ou encore avec des matériaux supports comme des billes, notamment des billes d'agarose.
D'autres protocoles de purification peuvent être envisagés. En particulier, par exemple lorsque les molécules à purifier comportent 6 résidus histidine consécutifs, des billes d'agarose recouvertes de nickel peuvent être utilisées pour purifier les molécules.
Les molécules purifiées obtenues sont alors mises à incuber avec les protéines possédant les sites de liaison pour la région Fc .
Ces protéines sont avantageusement marquées aux fins de détection, par exemple par un fluorophore .
Lorsque la molécule obtenue ne comporte pas de peptide antigénique, et qu'on souhaite disposer de complexes peptide antigénique/analogue de CMH, on la fait incuber avec ce peptide in vi tro.
L'étude des molécules recombinantes selon l'invention a permis de mettre en évidence leur grande stabilité et une forte affinité dans les essais de reconnaissance immunologique . L'invention fournit ainsi des outils de grand intérêt pour la modulation des processus immunologiques .
Elle vise en particulier l'utilisation des complexes peptide antigénique/analogues de CMH de classe II pour dénombrer et/ou purifier les lymphocytes T réagissant avec un antigène donné et pour caractériser le phenotype de ces cellules, c'est- à-dire déterminer ou identifier les molécules qu'elles sécrètent ou qu'elles expriment à leur surface. Cette détection est réalisée sur un prélèvement effectué sur un patient. Il peut s'agir d'un prélèvement sanguin, ou effectué sur des organes lymphoides secondaires, comme les ganglions lymphatiques, la rate, ou encore sur des tumeurs. Ces molécules peuvent avantageusement être utilisées pour dénombrer ou pour purifier ces cellules à partir de suspensions cellulaires comme décrit ci-dessus.
Alternativement, elles peuvent être utilisées pour visualiser ces cellules sur des coupes cellulaires. II est ainsi possible de préciser le statut immunologique d'un individu.
Cette application revêt un grand intérêt pour le développement de vaccins contre certains agents pathogènes ou de vaccins anti-tumoraux. On sait que pour juger de l'efficacité d'un vaccin, le meilleur moyen consiste à vacciner un grand nombre d'individus et à suivre le devenir de cette population lorsqu'elle est exposée à l'agent infectieux dans des conditions naturelles.
Cette approche est toutefois difficile à cause notamment des coûts considérables qu'elle engendre, et de la difficulté de trouver suffisamment de volontaires .
L'utilisation des complexes selon l'invention, en tant que sondes moléculaires se fixant sélectivement à des lymphocytes T CD4+ de spécificité donnée, permet de comparer rapidement l'efficacité de différentes préparations vaccinales et de déterminer le nombre et les intervalles optimaux entre les rappels .
Dans une étude en pré-clinique, on inocule des individus avec des préparations vaccinales renfermant le ou les antigènes, puis on dénombre les cellules T présentes dans un prélèvement, réagissant avec des complexes selon l'invention. La réponse des individus permet d'apprécier la réaction vis-à-vis du peptide antigénique.
Cette application peut être également mise en oeuvre comme moyens prédictifs quant à l'état d'un patient, en dénombrant et en déterminant le phenotype de cellules T autorëactives chez des malades à risques.
L'invention permet ainsi de déterminer le stade d'avancement de la maladie chez des patients souffrant de maladies auto-immunes ou d'évaluer l'efficacité de certains traitements ou d'interventions thérapeutiques.
L'invention vise également l'application desdits complexes multivalents définis ci-dessus dans le diagnostic et la mise au point de traitements de maladies auto-immunes.
Un certain nombre de maladies auto-immunes sont dues à la mobilisation de lymphocytes T auto-réactifs qui provoquent la destruction des tissus de l'organisme. Dans certains cas, par exemple chez les diabétiques, le diagnostic de la maladie n'est effectué que tardivement lorsque les tissus sont déjà détruits.
Pour empêcher la destruction des tissus, et bloquer le développement de la maladie, il est indispensable d'effectuer un diagnostic précoce. La possibilité de dénombrer, grâce à l'invention, les lymphocytes T auto-réactifs dans le sang des patients à risque constitue une avancée considérable.
Prenant en compte que les lymphocytes T auto-réactifs jouent un rôle déterminant dans le développement des maladies auto-immunes, de très nombreuses stratégies thérapeutiques visent à éliminer ces lymphocytes, ou à les empêcher d'exercer leur pouvoir pathogène, on mesurera l'intérêt de pouvoir dénombrer grâce à l'invention les lymphocytes T auto-réactifs dans le sang des patients traités, de comparer l'efficacité de différents traitements, et d'adapter le traitement en fonction de la réponse du malade.
Selon un autre aspect, l'invention vise l'application des complexes pour l'enrichissement en un type de cellules T donné . Cette application permet de disposer de grandes quantités de cellules T spécifiques d'un antigène donné in vi tro à des fins de thérapie cellulaire. Ces cellules peuvent être en effet ré-inoculées à des patients à titre préventif ou curatif.
On peut là encore dénombrer et déterminer, avant l'inoculation, le phenotype des cellules T complexées.
L'invention vise encore l'application des molécules recombinantes multivalentes comme agents stimulants des cellules
T.
Ces molécules peuvent être inoculées à un individu pour stimuler l'expansion et/ou l'activation de cellules T spécifiques d'un antigène donné en l'absence de toute autre cellule, en particulier de cellules présentatrices.
Cette utilisation est donc intéressante pour stimuler des réponses immunitaires insuffisantes par exemple vis-à-vis de complexes CMH/antigène tumoral.
Dans le cas de maladies infectieuses, on inocule in vivo les molécules recombinantes, le cas échéant après une étape de propagation préalable ex vivo .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés, à titre purement illustratif, dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 5, qui représentent respectivement
- la figure 1 représente la séquence de 1 ' insert d 'ADNc de la chaîne A du CMH,
- la figure 2, la construction plasmidique contenant 1 ' insert d'ADNc de la figure 1,
- la figure 3, la séquence de 1 ' insert d'ADNc de la chaîne β du CMH, - la figure 4, la construction plasmidique contenant 1 ' insert d'ADNc de la figure 3,
- la figure 5, la construction plasmidique détaillée de la figure 4 , et
- la figure 6, un octamère peptide/CMH de classe II selon l'invention.
Exemple 1 : Production de complexes peptide/CMH de type II
1. Construction des plasmides recombinants . Construction de l'ADNc codant pour la protéine recombinante IAα-/Fc (clone 461) et insertion dans un plasmide
Cette construction est illustrée par la figure 1 qui donne la séquence d'ADNc, de la position 420 à 1940, et celle du peptide codé (437-1921) (SEQ ID N° 1) . L'ADNc comprend, ligués entre eux, successivement, les fragments codant pour le peptide signal d ' IA , IA α, un linker, une glissière à leucine acide, un linker, une région Hinge, la région CH2, puis la région CH3 de Fc .
Cette construction est insérée dans le plasmide représenté sur la figure 2 et placée pour le contrôle d'un promoteur de métallothionéine inductible par CuS04.
. Construction de l'ADNc codant pour la protéine recombinante
LACK/I-A β-/glissière à leucine (clone 268) et insertion dans un plasmide
Cette construction est illustrée par la figure 3, qui donne la séquence d'ADNc, de la position 420 à 1370, et celle du peptide codé (440-1359) (SEQ ID N° 2)
L'ADNc comprend successivement les fragments, ligués entre eux, : codant pour une séquence leader, βl, un peptide LACK (158-73), un linker, un site thrombine, un linker, IAβ (βl) IAβ (β2) , un linker, une glissière à leucine basique, un marqueur à motifs histidine .
Cette construction est insérée dans le plasmide représenté sur la figure 4, et détaillé sur la figure 5. 2. Transfection des plasmides dans des cellules de
Drosophile
3. Sélection des transmettants stables
Les étapes 2 et 3 sont réalisées en opérant selon (6) .
4. Production et purification des complexes
A) Production
On met en culture les cellules transfectées de Drosophile dans des flacons de 3 1, à 24°C, dans un milieu SFM Drosophile (GIBCO-BRL) , supplémenté avec 1% de SVF (sérum de veau foetal) .
Lorsque la densité cellulaire atteint 5 x 10 cellules/ml, on induit la production de molécules LACK/IAd en ajoutant CuS04 à la concentration finale de 1 mM, puis on soumet le milieu à incubation durant 5 à 6 jours. On recueille les surnageants et, par centrifugation, on élimine les débris cellulaires (20 min, 10K, 4°C) . Les surnageants sont ensuite transférés dans des tubes et à nouveau centrifugés .
On concentre les surnageants 8 à 10 fois en utilisant un concentrateur PrepscaleR (Millipore, Inc.) On congèle à -70°C jusqu'à l'obtention de 500 ml de surnageants concentrés.
B) Purification On décongèle les surnageants à 37°C. On centrifuge 15 min à 10K. Les surnageants sont ensuite transférés dans de nouveaux tubes et à nouveau centrifugés 15 min à 10 K.
On les charge alors sur une colonne d ' immunoaffinitê
MK-D6 (volume de lit 5 ml) , équilibrée au préalable dans un tampon A de 20 mM de phosphate de sodium pH 7,0. La vitesse d'élution est de 10 à 20 ml/h.
La colonne est lavée avec 30 ml de tampon A (6 fois le volume de lit) à 0,5 ml/min.
Pour l'élution, on utilise 15 ml de CAPS 50 mM pH 11,5 en opérant par gravidité.
On recueille 15 fractions de 1 ml chacune.
Chaque fraction est neutralisée avec 300 μl de phosphate de sodium (200 mM, pH 6,2). On ajoute immédiatement des inhibiteurs de protéase (CompleteR, Roche Diagnostics) dans chaque échantillon.
On neutralise la colonne avec le tampon A.
Pour éviter 1 ' aggrégation des molécules de peptide/CMH, on effectue immédiatement une chromatographie par échange d'ions après l'élution. On détermine la concentration protéique de chaque fraction par électrophorèse en gel dénaturant .
Les fractions positives sont rassemblées et chargées sur colonne échangeuse d'ions (Mono Q) (Pharmacia Biotech) .
On utilise un tampon B : Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 et un tampon C : Tris-HCl 20 mM pH 8,0 + 1M NaCl .
On opère selon les gradients suivants :
0-5 min : 0% C; 5-20 min : 0-50% C ; 20-21 min : 50-
100% C ; 21-25 min : 100% C ; 25-26 min : 100% C ; 26-30 min :
0%C. Les molécules LACK/lA > dα é ,l-uent généralement à 30-36% en tampon C. On recueille les fractions correspondant au pic d'elution et on détermine la concentration protéique par électrophorèse en gel dénaturant .
Les fractions positives sont rassemblées et dialysées à 4°C contre 2 1 de PBS, pH 7,4.
On change le tampon de dialyse 2 fois en 24 h. La concentration en protéines est déterminée selon le test BCA
(Biorad) . Les échantillons sont congelés à -70°C en petites fractions (8 μg) . Les rendements sont de l'ordre de 0,5 mg/1 de surnageant cellulaire.
C. Production de complexes multivalents (figure 6)
On prépare une solution de protéine A-couplée à un fluorophore constitué par Alexa 488R (sondes moléculaires # P-11047) à une concentration de 0,5 mg/ml dans PBS 1 X, pH 7,4. (Protéine A de Sigma)
Des aliquotes de 100 μl sont préparés et congelés à -20°C.
Un aliquote de molécule peptide/CMH (8 μg) est décongelé et on ajoute 1,1 μl de protéine A couplée au fluorophore Alexa. On soumet le mélange à incubation à température ambiante pendant 30 min, puis on ajoute un mélange PBS/ASB (albumine de sérum bovin) 0,1 % pour un volume final de 50 μl . On ajoute 1 μl de sérum de souris et on utilise directement le produit comme réactif de coloration.
D- Cytoflurométrie de flux On purifie des cellules T à partir des ganglions lymphatiques d'une souris. On transfère 10 cellules dans un tube et on ajoute le réactif de coloration. Deux heures plus tard, les cellules sont lavées en tampon isotonique et analysées en cytofluorométrie de flux. La fréquence des cellules réagissant avec le réactif de coloration est déterminée par cette méthode.
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7/ Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Ed John iley and Sons, Inc., 1997.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Protéines recombinantes solubles, constituées au minimum d'un dimère lui-même formé des chaînes α et β des molécules du CMH de classe I ou II, caractérisées en ce qu'elles comportent à l'extrémité carboxy-terminale de l'une ou des 2 chaînes, tout ou partie d'une région Fc d'une immunoglobuline.
2/ Protéines recombinantes solubles selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie des chaînes α ou β des molécules du CMH.
3/ Protéines recombinantes solubles selon la revendication 1 ou 2 , caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie du domaine CH2 et/ou CH3 de la région Fc .
4/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que les chaînes qui constituent le dimère comportent des glissières à leucine .
5/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles sont associées en plusieurs dimères et notamment en tétramères ou en octamères .
6/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont complexées à des protéines naturelles ou artificielles, comportant plusieurs sites de liaison pour les régions constantes des immunoglobulines, telles que la protéine A, la protéine G, ou des multimères de récepteur des régions Fc obtenus par recombinaison génétique. 7/ Protéines recombinantes solubles selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont liées de manière covalente ou non covalente à un peptide antigénique.
8/ Protéines recombinantes solubles selon la revendication 7, caractérisées en ce que le peptide antigénique est fixé à l'extrémité amino-terminale de la chaîne β par l'intermédiaire d'un bras flexible.
9/ Séquences nucléotidiques possédant un cadre de lecture correspondant à tout ou partie d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10/ Vecteurs d'expression, notamment plasmides, caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence selon la revendication 9.
11/ Cellules procaryotes ou eucaryotes porteuses d'au moins un vecteur selon la revendication 10.
12/ Utilisation des protéines selon la revendication 7 ou 8, pour dénombrer et/ou purifier les lymphocytes T réagissant avec un antigène donné et pour caractériser le phenotype de ces cellules . 13/ Utilisation selon la revendication 12, comme protéines immunostimulantes, notamment pour le développement de vaccins .
14/ Utilisation selon la revendication 12, comme moyen prédictif de l'état d'un patient pour dénombrer et déterminer le phenotype de cellules T autoréactives chez des malades à risques, ou à des fins thérapeutiques. 15/ Utilisation des protéines selon la revendication 7 ou 8, pour la purification et/ou l'enrichissement de lymphocytes T spécifiques d'un antigène donné, soit à partir de cultures cellulaires, soit à partir de prélèvements sur un patient.
16/ Utilisation selon la revendication 15, caractérisé en ce que les populations de lymphocytes T enrichies en un type de cellules T donné sont utilisées à des fins de thérapie cellulaire .
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