EP1185364A1 - Vorrichtung und verfahren zur photolithographischen belichtung von biologischen stoffen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur photolithographischen belichtung von biologischen stoffen

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EP1185364A1
EP1185364A1 EP00943606A EP00943606A EP1185364A1 EP 1185364 A1 EP1185364 A1 EP 1185364A1 EP 00943606 A EP00943606 A EP 00943606A EP 00943606 A EP00943606 A EP 00943606A EP 1185364 A1 EP1185364 A1 EP 1185364A1
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EP
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light
solid phase
dna
light source
exposed
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00943606A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Aron Braun
Arno Heuermann
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Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
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Filing date
Publication date
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    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for the photolithographic exposure of biological substances.
  • DNA chips are the smallest, mostly planar surfaces, on which a large number of different oligomers (short, single-stranded DNA molecules) are attached in a spatially ordered manner. Such chips are used, for example, for the parallel recognition of numerous DNA sequences in a prepared tissue sample.
  • the chip surface is wetted with a solution of single-stranded DNA pieces from the tissue sample, whereupon complementary matching DNA pieces from the solution attach themselves to the corresponding oligomers attached to the chip surface (hybridization). Then you use a suitable method, such as fluorescent labeling, to determine at which locations on the chip hybridization has taken place. If you know where on the chip which oligomers are attached, you can draw conclusions about DNA sequences in the tissue sample.
  • the oligomers are synthesized directly on the chip with the help of an automatic micro pipetting system.
  • the oligomer chain provided there is built up block by block (nucleobases) on each grid point.
  • the chemical process is basically the same as for conventional oligomer synthesis in a test tube.
  • oligomers are produced at the same time, by a single automatic system directly at the intended destination.
  • the separate steps of oligomer synthesis and micropipetting in method 1) are thus combined into a single step.
  • This in situ synthesis normally proceeds as follows: on a prepared substrate, the automatic pipetting device sequentially drops the first nucleobase provided there on each grid point. This is not very mechanically complex since there are only 4 different nucleobases (C, T, G, A). For example, 4 micropipettes coupled together can be used. After the application of the first nucleoside building block on each grid point, the substrate is washed and after a "capping step" the protective groups on the 5 'OH functions are removed in order to react with the respective to enable subsequent nucleoside building block.
  • the second nucleobase is then pipetted on at each grid point.
  • the substrate is then washed again and deprotected.
  • the necessary oligomer chains are built up step by step on each grid point.
  • This method is not particularly fast, since new pipettes have to be pipetted on each grid point for each nucleobase.
  • the screen density is limited by the inaccuracy of the micropipettes. The inaccuracy has an even worse effect here, since each grid point must be hit several times in succession in an identical manner.
  • nucleobases at the correct raster points are done using a completely parallel, photolithographic technique instead of sequential, precise pipetting steps.
  • the method is based on the fact that light of a certain wavelength can be used to remove the 5 'OH protective groups from oligonucleotides in a targeted manner. Appropriate local radiation patterns can thus make oligonucleotide ends reactive at precisely those grid points to which a new nucleoside is to be attached in the next step.
  • a nucleotide building block is only attached to the previously exposed areas, all unexposed areas remain unchanged.
  • the local exposure patterns are generated by positioning a microphotographic black and white mask between the substrate and the light source, which covers all grid points that are not to be made reactive.
  • the extension of the oligomer chains on all halftone dots by one nucleobase takes place as follows: With the help of a first one
  • a possible problem with this method is the limited optical contrast of the liquid crystal displays available today (maximum 1: 100). The light intensity ratio between exposed and covered points is thereby reduced, which can result in a reduction in yield in oligomer synthesis.
  • the photolithographic method with dynamic liquid crystal masks is the only one that allows simple, cheap and reliable production of chips with high screen density.
  • the poor contrast of the liquid crystal displays leads to a reduction in the quality of the oligomer dots, which ultimately reduces the detection sensitivity of the chip.
  • the object of the present invention is therefore a
  • Another object of the invention is to provide a further method for the photolithographic exposure of biological substances.
  • a device for the photolithographic exposure of biological substances comprising at least one light source, an optical fiber bundle and a control unit, each of the optical fibers being independent of O 00/69553,
  • each other can be controlled with light and / or light can be coupled into it.
  • the light source emits monochromatic or continuous light in a wavelength range from 100 to 800 nm. It is particularly preferred that the light source is a laser, a light-emitting diode, a metal halide lamp, a gas discharge lamp, a gas excitation lamp, an incandescent lamp or an arc lamp.
  • light-emitting diodes and / or optical switches are arranged to control the individual light guides.
  • substances to be exposed are applied directly to the ends of the light guides.
  • substances to be exposed are arranged on a separate support.
  • substances to be exposed are arranged on a separate carrier, this carrier being a DNA chip, a PNA chip or a peptide chip.
  • the device preferably additionally has at least one detector.
  • At least one of the detectors is arranged such that it detects the light used for exposure and / or at least one detector is arranged such that it detects the light reflected by the exposed substances and / or generated by fluorescence and that for Light guide for the detectors, if necessary, light guides and / or light guide bundles O n
  • the detectors are CCD detectors and / or CCD cameras.
  • a dynamic mask is provided for controlling the individual light guides. It is also particularly preferred that a set of static masks is provided for controlling the individual light guides.
  • an apparatus is extremely preferred, wherein the light source emits such a spectrum of wavelengths which effects the deprotection of nucleotides, nucleotide analogs and peptide-nucleic acid building blocks for chain extension and for the construction of oligomers and that a bundle of optical fibers is arranged between this light source and the substrate , into which light can be selectively coupled by targeted control and that the solid phase on which the oligomer synthesis takes place is positioned precisely and rigidly behind the light guide bundle and that the solid phase on which the oligomer synthesis takes place is arranged in a chamber in the solutions and / or reagents necessary for DNA or PNA synthesis can be brought up to this solid phase by further devices.
  • a separate support is arranged as the solid phase on which the oligomer synthesis takes place. It is also preferred according to the invention that the ends of the optical fibers themselves are the solid phase for carrying out the oligomer synthesis.
  • Another object of the present invention is a method for the photolithographic exposure of biological substances, wherein they are arranged on a surface or at the end of an optical fiber and by means of
  • a light source originates, which is arranged at the other end of the light guide, whereby each point which lies opposite an end of the light guide is exposed independently of the other points, the exposure pattern being preselected by means of a control unit.
  • light of wavelength is used, which deprotects nucleotides, nucleotide analogs and peptide nucleic acid building blocks for chain extension and for building oligomers, and that one between them Arrows the light source and the substrate a bundle of optical fibers, m each of which is selectively coupled by selective control and that the solid phase on which the oligomer synthesis takes place is positioned precisely and rigidly behind the optical fiber bundle and that the solid phase on which the oligomer synthesis takes place , arranged in a chamber into which the solutions and / or reagents necessary for DNA or PNA synthesis are introduced to this solid phase by further devices.
  • the device according to the invention enables simple and inexpensive photolithographic production of DNA chips of high screen density with an exposure contrast of well over 1: 100. This makes the simple production of 00/695 ⁇
  • the device according to the invention and the method solve the problem in a completely new way by combining commercially available components. It enables the cheap production of DNA chips in a quality that was not possible before.
  • the basic concept of the device and the method according to the invention is that a specific exposure pattern is not generated on the substrate by specifically covering raster dots with the aid of a static or dynamic mask, but by individually directing the light to each raster dot to be exposed via an optical light guide feeds.
  • the end of an optical fiber must therefore be attached above each grid point in such a way that when light is coupled into the fiber, the light emerging at the end illuminates the corresponding grid point. Consequently, exactly as many optical fibers are required as raster points are provided.
  • Attach the right light source e.g. a laser diode of the correct wavelength.
  • Another possibility is the use of commercially available, electrically controllable optical switches. It is a hardware component with 2 connections for 2 optical fibers and an electrical control input. An electrical signal at the control input can determine whether the two optical fibers should be optically connected or not. One optical switch and two are therefore required for each grid point
  • Optical fibers Light is permanently coupled into the free end of the first fiber, the free end of the second fiber serves as light output and is fastened over the respective grid point. A single light source is sufficient for the light coupling if all input fibers are bundled accordingly.
  • Another option for targeted light coupling into the individual fibers of the optical fiber bundle is the use of automatically positioned static masks (e.g. photo or perforated masks) or an electronically controllable dynamic mask (e.g. LCD), which is placed between the light source and the input side of the static masks (e.g. photo or perforated masks) or an electronically controllable dynamic mask (e.g. LCD), which is placed between the light source and the input side of the static masks (e.g. photo or perforated masks) or an electronically controllable dynamic mask (e.g. LCD), which is placed between the light source and the input side of the
  • the masks can be used to specifically mask those fiber inputs into which no light is to be coupled during the respective exposure step.
  • the masks can be arranged geometrically differently and in particular can be much larger than the surface of the array to be exposed, since the light guide on the coupling side 69553 1
  • an unordered fiber bundle can also be attached over the substrate.
  • the points on a chip made in this way are then no longer grid-like, but randomly and irregularly arranged. In spite of this, the positions of the points are identical for all chips which have been produced with the same light guide arrangement. In principle, one can know which type of oligomer was synthesized at which point on the chip. For a given synthesis arrangement with random bundling of optical fibers, it is sufficient to couple light to each individual light guide one after the other and with a high-resolution CCD detector, which is placed in the substrate plane, to determine the position of the emerging light cones. In this way you can create a complete table with the assignment of all control addresses to the corresponding x-y substrate positions.
  • Chips that are manufactured with the appropriate arrangement are manufactured with the appropriate arrangement.
  • a separate photodetector must be attached to each fiber end instead of the light source (s).
  • Such an optical reading system with optical fibers can considerably simplify the C ip detection compared to the conventional detection method with CCD detectors.
  • a very interesting and novel application variant of the DNA chip synthesis process described here is the synthesis of oligomers directly on the ends of the light guides instead of on a separate substrate. This can be achieved by chemically preparing the optical fiber end faces through which the light exits in a manner similar to that of conventional DNA chip carrier surfaces. As a result, each end of the light guide itself becomes a small, independent carrier on which exactly one type of oligomer can now be synthesized using conventional photolythographic chemistry. The photo-activating light is therefore no longer radiated onto the carrier surface from the outside, but emerges directly on the carrier surface from the transparent, light-conducting carrier material.
  • tion can be used. As described above, this can be achieved by tightly bundling the fiber ends.
  • the oligomer point group produced remains inseparably connected to the device used for the production.
  • Hybridization and subsequent detection are then also carried out at the ends of the light guides, the light guides in the opposite direction being used again for fluorescence detection to read out the fluorescence signals.
  • the optical fiber tips can be chemically cleaned and the device can thus be made ready for a new synthesis.
  • FIG. 1 shows the schematic structure of a first embodiment of the device according to the invention, in which the activation of the fibers is represented by optical switches;
  • FIG. 2 shows the schematic structure of a second embodiment of the device according to the invention, in which the activation of the fibers by individual light sources is shown;
  • Fig. 3 shows the schematic structure during the exposure of a separate carrier (chip) and 00/69553 j_ 4
  • Fig. 4 shows the schematic structure during exposure, the substrate being located directly on the fiber ends.
  • FIG. 1 shows a first exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • the light is guided by means of the light guide F to the array carrier C via the electrically controlled optical switches B.
  • the controller S preferably a computer, provides the appropriate control of the individual switches B in a predetermined manner in the form of a dynamic or static mask.
  • FIG. 2 shows a second exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • the controller S preferably a computer, ensures the corresponding activation of the individual switches A in a predetermined manner.
  • control can take the form of a dynamic or static mask.
  • FIG. 3 shows in detail how the individual substrate points E on the array carrier C are exposed by the optical fibers F.
  • FIG. 4 shows that the substrates are arranged directly at the ends of the optical fibers F.
  • Light source B electrically controlled optical switch

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Abstract

Es wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen beschrieben, umfassend mindestens eine Lichtquelle (A), ein Lichtleiterbündel (F) und eine Steuerungseinheit (B), wobei jeder der Lichtleiter unabhängig voneinander mit Licht ansteuerbar und/oder Licht in diesen einkoppelbar ist. Die Vorrichtung ist insbesondere zur Belichtung von DNA-,PNA- oder Peptid-Chips geeignet.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen.
DNA-Chips sind kleinste, meist planare Oberflächen, auf welchen räumlich geordnet eine große Anzahl verschiedener Oligo ere (kurze, einsträngige DNA-Moleküle) angebracht sind. Solche Chips werden beispielsweise zur parallelen Erkennung zahlreicher DNA-Sequenzen in einer präparierten Gewebeprobe verwendet. Dazu benetzt man die Chipoberflä- ehe mit einer Lösung von einsträngigen DNA-Stücken aus der Gewebeprobe, worauf sich komplementär passende DNA- Stücke aus der Lösung an die entsprechenden, an die Chi- poberfäche angebrachten Oligomere anlagern (Hybridisierung) . Danach bestimmt man mit einer geeigneten Methode wie z.B. Fluoreszenzmarkierung, an welchen Stellen auf dem Chip eine Hybridisierung stattgefunden hat. Wenn man weiss, wo auf dem Chip welche Oligomere angebracht sind, kann man somit Rückschlüsse auf DNA-Sequenzen in der Gewebeprobe machen. Dazu definiert man in der Regel auf der Chip-Trägerfläche ein dichtes rechtwinkliges Raster. Auf jedem Rasterpunkt ist in Form eines kleinen Flecks genau eine Sorte von Oligomer angebracht. Die maximal mögliche Anzahl von verschiedenen DNA-Sequenzen auf dem Chip ist demzufolge gleich der Anzahl der Rasterpunkte. Da man möglichst viele Sorten von Oligomeren auf einen Chip aufbringen will, die Chips aber gleichzeitig so klein wie möglich sein sollten, um effektiv hybridisiert werden zu können, ist es ein wichtiges Ziel bei der Herstellung von DNA-Chips, eine möglichst hohe Rasterdichte zu erreichen. Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur DNA- Chip Herstellung bekannt.
1) Alle Oligomere werden auf herkömmliche Weise einzeln im Reagenzglas synthetisiert und danach an den vorgesehenen Rasterpunkten auf den Träger aufpipettiert, typischerweise von einer automatischen Micropipettieranlage. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, da jedes Oli- go er einzeln hergestellt bzw. gekauft und von Hand der Pipettieranlage zugeführt werden muss. Die Rasterdichte ist durch die hohe Winkelungenauigkeit der heute verfügbaren, typischerweise piezoelektrischen Mikropipetten stark limitiert.
2) Die Oligomere werden mit Hilfe einer automatischen Mi- kropippetieranlage direkt auf dem Chip synthetisiert. Auf jedem Rasterpunkt wird die dort vorgesehene Oligomerkette Baustein für Baustein (Nukleobasen) aufgebaut. Das chemische Verfahren ist grundsätzlich das selbe wie bei der herkömmlichen Oligomer-Synthese im Reagenzglas. Der
Unterschied ist, dass alle Oligomere gleichzeitig, von einer einzigen automatischen Anlage direkt am vorgesehenen Bestimmungsort hergestellt werden. Die bei Methode 1) separaten Arbeitsschritte Oligomer-Synthese und Micropi- pettierung werden somit zu einem einheitlichen Arbeitsschritt zusammengefasst . Diese in situ Synthese läuft normalerweise wie folgt ab: Auf einem vorpräparierten Substrat tropft der Pipettierautomat sequentiell auf jedem Rasterpunkt die dort vorgesehene erste Nukleobase auf. Dies ist mechanisch nicht sehr aufwendig, da es nur 4 verschiedene Nukleobasen (C, T, G, A) gibt. Man kann dafür z.B. 4 aneinandergekoppelte Micropipetten verwenden. Nach dem Auftragen des ersten Nukleosidbausteins auf jedem Rasterpunkt wird das Substrat gewaschen und nach einem "Capping Schritt" die Schutzgruppen an den 5 ' -OH Funktionen entfernt, um die Reaktion mit dem jeweils nachfolgenden Nukleosidbaustein zu ermöglichen. Danach wird an jedem Rasterpunkt die zweite Nukleobase aufpipet- tiert. Das Substrat wird dann wieder gewaschen und entschützt. Auf diese Weise baut man Schritt für Schritt auf jedem Rasterpunkt die jeweils erforderlichen Oligomerket- ten auf. Diese Methode ist nicht besonders schnell, da nacheinander auf jedem Rasterpunkt für jede Nukleobase neu pipettiert werden muss. Wie bei Methode 1) ist die Rasterdichte durch die Ungenauigkeit der Micropipetten beschränkt. Die Ungenauigkeit wirkt sich hier noch schlimmer aus, da jeder Rasterpunkt mehrmals nacheinander auf möglichst identische Weise getroffen werden muss.
3) Die Oligomere werden wie bei 2) direkt auf dem Träger synthetisiert, die gezielte Anbindung der richtigen
Nukleobasen an den richtigen Rasterpunkten geschieht jedoch durch eine vollkommen parallele, photolithographische Technik anstelle von sequenziellen, zielgenauen Pi- pettierschritten. Das Verfahren basiert darauf, dass man mit Licht einer bestimmten Wellenlänge gezielt die 5' -OH Schutzgruppen von Oligonukleotiden entfernen kann. Durch geeignete örtliche Bestrahlungsmuster kann man somit Oli- gonukleotid-Enden an genau jenen Rasterpunkten reaktionsfähig machen, an denen man im nächsten Schritt eine neues Nukleosid anbringen will. Bei vollständiger Benetzung der Chipoberfläche mit einer Nukleotidbaustein-Lösung wird somit nur an den vorher belichteten Stellen ein Nukleo- tidbaustein angebunden, alle unbelichteten Stellen bleiben unverändert. Die örtlichen Belichtungsmuster werden erzeugt, indem man eine microphotographische schwarz- weiss Maske zwischen dem Substrat und der Lichtquelle positioniert, die alle Rasterstellen abdeckt, die nicht reaktionsfähig gemacht werden sollen. Die Verlängerung der Oligomer-Ketten auf allen Rasterpunkten um eine Nukleoba- se geschieht demnach wie folgt: Mit Hilfe einer ersten
Maske werden genau jene Rasterpunkte belichtet, welche um die erste der 4 möglichen Sorten von Nukleobasen (z.B. C) erweitert werden müssen. Danach wird der Chip mit einer Losung des entsprechenden Nukleotidbausteins benetzt, worauf nur die belichteten Punkte um diese Base verlan- gert werden. Da die neu angebundenen Basen noch alle ber eine Schutzgruppe verfugen, werden sie in den folgenden Schritten nicht weiter reagieren, bis ihre Schutzgruppen durch eine weitere Belichtung abgespaltet werden. Nach diesem Reaktionsschritt wird der Chip gewaschen. Nun wer- den mit Hilfe einer zweiten Maske genau jene Rasterstellen belichtet, welche um die zweite der 4 möglichen Sorten von Nukleobasen (z.B. T) erweitert werden müssen. Darauf wird der Chip wiederum mit einer Losung des entsprechenden Nukleotidbausteins benetzt und die belichte- ten Stellen dadurch um diese Base verlängert. Genauso verfahrt man für die verbleibenden zwei Basen (z.B. G und A) . Für die Verlängerung aller Oligomere um eine Nukleobase benotigt man demzufolge vier Belichtungsschritte bzw. 4 Photomasken. Diese Methode ist wegen der hohen Parallelität sehr effizient, zudem ist sie wegen der hohen Präzision, die mit Photolithographie erreicht werden kann, geeignet, um sehr hohe Rasterdichten zu erzielen. Allerdings ist die Methode sehr aufwendig ' nd somit teuer, da man für die Herstellung einer bestimmten Sorte von Chip zuerst eine grosse Anzahl von Photomasken erzeugen muss. Bei hohen Rasterdichten werden zudem hohe Anforderungen an die Positionierungsgenauigkeit der Masken wahrend der Belichtung gestellt, die effizient nur durch Verwendung von teuren Apparaturen erfüllt werden können.
4) Es wird dasselbe Verfahren angewandt wie bei 3), nur verwendet man anstelle der grossen Zahl von photographischen Masken eine einzige, transmissive Flüssigkristallanzeige, die elektronisch angesteuert wird und als dyna- mische Maske dient. Diese Methode ist einfach und billig, da keine photographischen Masken erzeugt werden müssen ~ nA, *.».., O 00/69553
und das Positionierungsproblem entfällt. Ein mögliches Problem dieser Methode ist der limitierte optische Kontrast der heute verfügbaren Flüssigkristallanzeigen (maximal 1:100). Das Lichtintensitätsverhältnis zwischen be- lichteten und abgedeckten Punkten wird dadurch reduziert, was eine Ausbeuteverminderung bei der Oligomersynthese zur Folge haben kann.
Diese Methoden nach dem Stand der Technik weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Unter den oben beschriebenen
Herstellungsmethoden für DNA-Chips ist die photolithographische Methode mit dynamischen Flüssigkristall-Masken die einzige, die eine einfache, billige und zuverlässige Herstellung von Chips mit hoher Rasterdichte erlaubt. Der mangelhafte Kontrast der Flüssigkristallanzeigen hat jedoch eine Verminderung der Qualität der Oligomerpunkte zur Folge, was letztendlich die Detektionsempfindlichkeit des Chips vermindert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine
Vorrichtung zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwindet. Eine weiter Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines weiteren Verfahrens zur photolithographischen Belichtung biologischer Stoffe.
Die Aufgabe wird durch die kennzeichneten Merkmale des Hauptanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Unteransprüchen gekennzeichnet .
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Vorrichtung zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen geschaffen wird, umfassend mindestens eine Lichtquelle, ein Lichtleiterbündel und eine Steue- rungseinheit, wobei jeder der Lichtleiter unabhängig von- O 00/69553 ,
einander mit Licht ansteuerbar und/oder Licht in diesen einkoppelbar ist.
Bevorzugt ist es dabei, daß die Lichtquelle monochromati- sches oder kontinuierliches Licht in einem Wellenlängenbereich von 100 bis 800 nm aussendet. Besonders bevorzugt ist es, daß die Lichtquelle ein Laser, eine Leuchtdiode, eine Metalldampflampe, eine Gasentladungslampe, eine Gasanregungslampe, eine Glühfadenlampe oder eine Lichtbogen- lampe ist.
Weiterhin vorteilhaft ist es, daß zur Ansteuerung der einzelnen Lichtleiter Leuchtdioden und/oder optische Schalter angeordnet sind.
Besonders vorteilhaft ist es ferner, daß zu belichtende Stoffe direkt an den Enden der Lichtleiter aufgebracht sind. Bevorzugt ist es aber auch, daß zu belichtende Stoffe auf einem separaten Träger angeordnet sind.
Ganz besonders bevorzugt ist es, daß zu belichtende Stoffe auf einem separaten Träger angeordnet sind, wobei dieser Träger ein DNA-Chip, ein PNA-Chip oder ein Peptid- Chip ist.
Erfindungsgemäß weist die Vorrichtung vorzugsweise zusätzlich mindestens einen Detektor auf.
Bevorzugt ist dabei, daß mindestens einer der Detektoren derart angeordnet ist, daß dieser das zur Belichtung verwendete Licht erfaßt und/oder mindestens ein Detektor derart angeordnet ist, daß dieser das von den belichteten Stoffen reflektierte und/oder durch Fluoreszenz erzeugte Licht erfaßt und daß zur Lichtführung für die Detektoren gegebenenfalls Lichtleiter und/oder Lichtleiterbündel O n
vorgesehen sind. Insbesondere bevorzugt ist hierbei, daß die Detektoren CCD-Detektoren und/oder CCD-Kamera sind.
Ganz besonders bevorzugt ist es, daß zur Ansteuerung der einzelnen Lichtleiter eine dynamische Maske vorgesehen ist. Besonders bevorzugt ist es auch, daß zur Ansteuerung der einzelnen Lichtleiter ein Satz von statischen Masken vorgesehen ist.
Äußerst bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei die Lichtquelle ein solches Spektrum von Wellenlängen emittiert, welches die Entschützung von Nukleotiden, Nukleotidanaloga und Peptid-Nukleinsäurebausteinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß zwischen dieser Lichtquelle und dem Substrat ein Bündel von Lichtleiterfasern angeordnet ist, in welche jeweils durch gezielte Ansteuerung selektiv Licht einkop- pelbar ist und daß hinter dem Lichtleiterbündel die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, präzise und starr positioniert ist und daß die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfindet, in einer Kammer angeordnet ist, in die durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Lösungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heranführbar sind.
Bevorzugt ist es erfindungsgemäß hierbei, daß man als Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, einen separaten Träger anordnet. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, daß die Enden der Lichtleiterfasern selbst die Festphase zur Durchführung der Oligomersynthese sind.
Ein weitere Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen, wobei man diese auf einer Oberfläche o- der am Ende eines Lichtleiters anordnet und mittels
Licht, welches durch Lichtleiter geführt ist und aus ei- O 00/69553 D
ner Lichtquelle stammt, welche am anderen Ende der Lichtleiter angeordnet ist, belichtet, wobei man jeden Punkt, welcher einem Lichtleiterende gegenüberliegt, unabhängig von den anderen Punkten belichtet, wobei man das Belich- tungsmuster mittels einer Steuerungseinheit vorwählt.
Bevorzugt ist es hierbei nämlich zur Belichtung von DNA- oder PNA-Chips, daß man Licht der Wellenlangen verwendet, welches die Entschutzung von Nukleotiden, Nukleotidanalo- ga und Peptid-Nukleinsaurebaustemen zur Kettenverlange- rung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß man zwischen dieser Lichtquelle und dem Substrat ein Bündel von Lichtleiterfasern anordnet, m welche jeweils durch gezielte Ansteuerung selektiv Licht eingekoppelt wird und daß man hinter dem Lichtleiterbundel die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, präzise und starr positioniert und daß man die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfindet, in einer Kammer anordnet, in die man durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Losungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heranfuhrt.
Erfmdungsgemaß bevorzugt ist ferner, daß m?n nach erfolgter Oligomeπsierung auf den DNA- oder PNA-Chips wei- terhm die nachfolgenden Hybridisierungen mit einer Ziel- DNA durchführt.
Erfindungsgemaß ist ferner ein Verfahren, wobei man zur Durchfuhrung des Verfahrens eine erfindungsgemaße Vor- richtung verwendet.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die erfindungsgemaße Vorrichtung eine einfache und preiswerte photolithographische Herstellung von DNA-Chips hoher Rasterdichte mit einem Belichtungskontrast von weit über 1:100 ermöglichen. Dadurch wird erstmals die einfache Produktion von 00/695 π
qualitativ hochstehenden DNA-Chips in jedem beliebigen Labor möglich.
Die erfindungsgemaße Vorrichtung und das Verfahren losen die gestellte Aufgabe auf völlig neuartige Art und Weise durch Kombination kommerziell erhaltlicher Komponenten. Es ermöglicht die billige Herstellung von DNA-Chips in einer Qualität, wie sie vorher nicht möglich war.
Das grundlegende Konzept der erfindungsgemaßen Vorrichtung und des Verfahrens besteht darin, dass man ein bestimmtes Belichtungsmuster auf dem Substrat nicht durch gezielte Abdeckung von Rasterpunkten mit Hilfe einer statischen oder dynamischen Maske erzeugt, sondern indem man individuell jedem zu belichtenden Rasterpunkt das Licht direkt über einen optischen Lichtleiter zufuhrt. Es muss also über jedem Rasterpunkt das Ende einer optischen Lichtleiterfaser so angebracht sein, dass bei Lichteinkopplung in die Faser das am Ende austretendes Licht ge- nau den entsprechenden Rasterpunkt beleuchtet. Es werden folglich genau so viele Lichtleiterfasern benotigt wie Rasterpunkte vorgesehen sind. Um so beliebige Belichtungsmuster erzeugen zu können, muss unabhängig für ede einzelne Lichtleiterfaser gesteuert werden können, ob ihr zu einem gegebenen Zeitpunkt Licht eingekoppelt wird oder nicht. Durch gezieltes Einkoppeln bzw. nicht Einkoppeln von Licht in die richtigen Fasern kann man somit bei jedem Belichtungsschritt ausschliesslich jene Rasterpunkte belichten, die aktiviert werden müssen, wahrend man alle anderen unbelichtet lasst.
Das gezielte Einkoppeln von Licht in die jeweils richtigen Fasern muss vollautomatisch elektronisch gesteuert werden können, damit die Methode einfach durchfuhrbar ist. Eine mögliche technische Losung ist, am Anfang jedes Lichtleiters eine eigene, elektrisch ein- und ausschalba- O 00/69553 1 Q
re Lichtquelle (z.B. eine Laserdiode richtiger Wellenlange) anzbringen. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von kommerziell erhältlichen, elektrisch ansteuerbaren optische Schaltern. Es handelt sich dabei um eine Hardware-Komponente mit 2 Anschlüssen für 2 Lichtleiterfasern und einem elektrischen Steuerungseingang. Durch ein elektrisches Signal am Steuerungseingang kann bestimmt werden, ob die beiden Lichtleiterfasern optisch verbunden werden sollen oder nicht. Für jeden Rasterpunkt benotigt man somit einen optischen Schalter und zwei
Lichtleiterfasern. Dem freien Ende der ersten Faser koppelt man permanent Licht ein, das freie Ende der zweiten Faser dient als Lichtausgang und wird über dem jeweiligen Rasterpunkt befestigt. Für die Lichteinkopplung genügt eine einzige Lichtquelle, wenn man alle Eingangsfasern entsprechend bündelt.
F r die elektrische Steuerung sind beide Methoden der gezielten Lichteinkopplung gleichwertig. Man benotigt le- diglich eine Ansteuerelektronik, die jeden Rasterpunkt individuell adressieren kann. Grundsatzlich spielt es keine grosse Rolle, ob man dabei Leuchtdioden oder optische Schalter ansteuert.
Eine weitere Möglichkeit zur gezielten Lichteinkopplung in die einzelnen Fasern des Lichtleiterfaserbundels ist die Verwendung von automatisch positionierten statischen Masken (z.B. Photo- oder Lochmasken) oder einer elektronisch ansteuerbaren dynamischen Maske (z.B. LCD), welche man zwischen die Lichtquelle und die Eingangsseite des
Faserbundeis bringt. Mit den Masken kann man gezielt jene Fasereingange verdecken, in die beim jeweiligen Belichtungsschritt kein Licht eingekoppelt werden soll. Die Masken können dabei geometrisch anders angeordnet und insbesondere viel großer sein als die zu belichtende Ar- rayflache, da auf der Emkopplungsseite das Lichtleiter- 69553 1
bundel beliebig aufgefächert bzw. in die einzelnen Fasern aufgetrennt werden kann.
Für die maximal erzielbare Chip-Rasterdichte ist es grundsatzlich irrelevant, wieviel Platz das Lichtemkopp- lungssyste (einzelne Lichtquellen, optische Schalter, statische oder dynamische Masken) beansprucht. Die Rasterdichte ist allein davon abhangig, wie dicht man die Faserenden bundein kann, an denen das Licht austritt. Diese Möglichkeit der geometrischen Verdichtung stellt den wesentlichsten Nutzen der Erfindung dar. Bei einem typischen Faserdurchmesser um 100 Mikrometer kann man auf der Belichtungsseite ungefähr 10000 Rasterpunkte auf einem Quadratzentimeter erreichen, was für viele Anwendun- gen hinreichend ist.
Falls es zu aufwendig ist, die über dem Substrat anzubringenden Lichtleiterfaserenden in einem gleichmassigen, rechtwinkligen Gitterraster anzuordnen, kann man auch ein ungeordnetes Faserbundel über dem Substrat befestigen. Die Punkte auf einem so angefertigten Chip sind dann nicht mehr rasterformig, sondern zufallig und unregelmäßig angeordnet. Trotzdem sind bei allen Chips, die mit derselben Lichtleiteranordnung hergestellt worden sind, die Positionen der Punkte identisch. Grunsatzlich kann man wissen, welche Oligomersorte an welcher Stelle des Chips synthetisiert worden ist. Es genügt für eine gegebene Syntheseanordnung mit zufalliger Lichtfaserbundelung, ein einziges Mal nacheinander jedem einzelnen Lichtleiter Licht emzukoppeln, und mit einem hochauflosendem CCD-Detektor, der in die Substratebene gelegt wird, die Position der austretenden Lichtkegel festzustellen. Auf diese Weise kann man eine vollständige Tabelle mit der Zuordnung aller Ansteuerungsadressen zu den entsprechenden x-y Substratpositionen erstellen.
Diese Information verwendet man spater bei der Auswertung aller Chips, die mit der entsprechenden Anordnung 0/69553 12
Chips, die mit der entsprechenden Anordnung hergestellt werden.
Für eine Auswertung nach dem Fluoreszenzmarkierungsver- fahren kann man optional die selbe ungerasterte Lichtleiteranordnung verwenden, die man bei der Herstellung verwendet hat, nur dass man nun am anderen Faserende nicht Licht einkoppelt, sondern mit Photodetektoren das jetzt stellenweise auf der Substratseite eintretende Fluores- zenzlicht misst. Dazu muss man an Stelle der Lichtquelle (n) an jedem Faserende einen separaten Photodetektor anbringen. Ein solches optisches Lesesystem mit Lichtleitern kann die C ip-Detektion gegenüber der herkömmlichen Detektionsmethode mit CCD-Detektoren erhebliche vereinfa- chen.
Eine sehr interessante und neuartige Anwendungsvariante des hier beschriebenen DNA-Chip Syntheseverfahrens ist die Synthese von Oligomeren direkt auf den Lichtleiteren- den anstatt auf einem separaten Substrat. Dies kann erreicht werden, indem man die Lichtleiterfaser-Endflächen, durch die das Licht austritt, auf ähnliche Weise chemisch präpariert wie sonst bei herkömmlichen DNA-Chips Trägerfläche. Dadurch wird jedes Lichtleiterende selber zu einem kleinen, unabhängigen Träger, auf welchem man nun mit der üblichen photolythographischen Chemie genau eine Sorte von Oligomer synthetisieren kann. Das photoaktivierende Licht wird somit nicht mehr von aussen auf die Trägeroberfläche aufgestrahlt, sondern tritt direkt an der Trägeroberfläche aus dem transparenten, lichtleitenden Trägermaterial aus. Statt einer einzigen Trägerfläche mit vielen verschiedenen, kleinen Oligomerpunkten hat man nun eine Vielzahl von getrennten kleinen Trägerflächen mit je einer Sorte von Oligomer darauf. Wie bei den her- kömmlichen Chips müssen die Oligo erpunkte dicht beieinander liegen, damit sie für eine effiziente Hybridisie- 00/69553
rung verwendet werden können. Dies kann wie oben beschrieben durch dichte Bündelung der Faserenden erreicht werden .
Bei einer solchen Synthese auf Lichtleiterenden bleibt die hergestellte Oligomerpunkteschar untrennbar mit der zur Herstellung verwendeten Vorrichtung verbunden. Hybridisierung und anschliessende Detektion werden dann ebenfalls an den Lichtleiterenden vorgenommen, wobei man für eine Fluoreszenzdetektion wieder die Lichtleiter in umgekehrter Richtung zum Auslesen der Fluoreszensignale verwendet. Nach einem Synthese-Hybridisierung- Detektionszyklus kann man die Lichtleiterfaserspitzen chemisch reinigen und die Vorrichtung somit für eine Neue Synthese bereitmachen.
Die vorliegende Erfindung soll anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 den schematischen Aufbau einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher die Ansteuerung der Fasern durch optische Schalter darge- stellt ist;
Fig. 2 den schematisch Aufbau einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher die Ansteuerung der Fasern durch einzelne Lichtquellen darge- stellt ist;
Fig. 3 den schematischen Aufbau während der Belichtung eines separaten Trägers (Chip) und 00/69553 j_ 4
Fig. 4 den schematischen Aufbau während der Belichtung, wobei sich das Substrat direkt an den faserenden befindet.
In Figur 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer erindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Aus der Lichtquelle A wird mittels der Lichtleiter F das Licht über die elektrisch angesteuerten optischen Schalter B auf den Array-Träger C geleitet. Die Steuerung S, vorzugsweise ein Computer, sorgt für die entsprechende Ansteuerung der einzelnen Schalter B in vorgegebener Weise in Form einer dynamischen oder statischen Maske.
In Figur 2 ist ein zweites Ausführungsbeispiel einer er- findungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Aus einer Vielzahl von der Lichtquellen A wird mittels der Lichtleiter F das Licht auf den Array-Träger C geleitet. Die Steuerung S, vorzugsweise ein Computer, sorgt für die entsprechende Ansteuerung der einzelnen Schalter A in vorgegebe- ner Weise. Auch hier kann die Ansteuerung in Form einer dynamischen oder statischen Maske erfolgen.
Figur 3 zeigt im Detail, wie die einzelnen Substratpunkte E auf dem Array-Träger C durch die Lichtleiterfasern F belichtet werden.
In Figur 4 ist gezeigt, daß die Substrate direkt an der Enden der Lichtleiterfasern F angeordnet sind.
Dem Fachmann ist klar, wie die einzelnen Bauteile in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung anzuordnen sind. Auch die entsprechende Programmierung der Steuerung mittels Computerprogrammen ist dem Fachmann an sich bekannt. 00/69553 15
Bezugszeichenliste
A: Lichtquelle B: elektrisch angesteuerter optischer Schalter
C: Array-Träger
D: Substrat an den Faserenden
E: Substratpunkte auf dem Array-Träger
F: Lichtleiterfaser S: Steuerung (Computer)

Claims

00/69553 -_ gPatentansprüche
1. Vorrichtung zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen, umfassend mindestens eine Lichtquelle, ein Lichtleiterbündel und eine Steuerungseinheit, wobei jeder der Lichtleiter unabhängig voneinander mit Licht ansteuerbar und/oder Licht in diesen einkoppelbar ist.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle monochromatisches oder kontinuierliches Licht in einem Wellenlängenbereich von 100 bis 800 nm aussendet.
3. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle ein Laser, eine Leuchtdiode, eine Metalldampflampe, eine Gasentladungslampe, eine Gasanregungslampe, eine Glühfadenlampe oder eine Licht- bogenlampe ist.
4. Vorrichtung gemäß einem der voranstellenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ansteuerung der einzelnen Lichtleiter Leuchtdioden und/oder optische Schalter angeordnet sind.
5. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu belichtende Stoffe direkt an den Enden der Lichtleiter aufgebracht sind.
6. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu belichtende Stoffe auf einem separaten Träger angeordnet sind.
7. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu belichtende Stoffe auf 00/69553 ^ η
einem separaten Träger angeordnet sind, wobei dieser Träger ein DNA-Chip, ein PNA-Chip oder ein Peptid- Chip ist.
8. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zusätzlich mindestens einen Detektor umfaßt.
9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Detektoren derart angeordnet ist, daß dieser das zur Belichtung verwendete Licht erfaßt und/oder mindestens ein Detektor derart angeordnet ist, daß dieser das von den belichteten Stoffen reflektierte und/oder durch Fluoreszenz erzeugte Licht erfaßt und daß zur Lichtführung für die Detektoren gegebenenfalls Lichtleiter und/oder Lichtleiterbündel vorgesehen sind.
10. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9, da- durch gekennzeichnet, daß die Detektoren CCD- Detektoren und/oder CCD-Kameras sind.
11. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ansteuerung der ein- zelnen Lichtleiter eine dynamische Maske vorgesehen ist .
12. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ansteuerung der ein- zelnen Lichtleiter ein Satz von statischen Masken vorgesehen ist.
13. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle ein sol- ches Spektrum von Wellenlängen emittiert, welches die Entschützung von Nukleotiden, Nukleotidanaloga und 00/69553 , ß
Peptid-Nukleinsäurebausteinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß zwischen dieser Lichtquelle und dem Substrat ein Bündel von Lichtleiterfasern angeordnet ist, in welche je- weils durch gezielte Ansteuerung selektiv Licht ein- koppelbar ist und daß hinter dem Lichtleiterbündel die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, präzise und starr positioniert ist und daß die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfin- det, in einer Kammer angeordnet ist, in die durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Lösungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heranführbar sind.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, einen separaten Träger anordnet .
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Enden der Lichtleiterfasern selbst die Festphase zur Durchführung der Oligomersynthese sind.
16. Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen, wobei man diese auf einer Oberfläche oder am Ende eines Lichtleiters anordnet und mittels Licht, welches durch Lichtleiter geführt ist und aus einer Lichtquelle stammt, welche am anderen Ende der Lichtleiter angeordnet ist, belichtet, wobei man jeden Punkt, welcher einem Lichtleiterende gegenüberliegt, unabhängig von den anderen Punkten belichtet, wobei man das Belichtungsmuster mittels einer Steuerungseinheit vorwählt.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, nämlich zur Belichtung von DNA- oder PNA-Chips, dadurch gekennzeichnet, daß 00/69553 1 g
man Licht der Wellenlängen verwendet, welches die Entschützung von Nukleotiden, Nukleotidanaloga und Peptid-Nukleinsäurebausteinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß man zwischen dieser Lichtquelle und dem Substrat ein Bündel von Lichtleiterfasern anordnet, in welche jeweils durch gezielte Ansteuerung selektiv Licht eingekoppelt wird und daß man hinter dem Lichtleiterbündel die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfin- det, präzise und starr positioniert und daß man die
Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfindet, in einer Kammer anordnet, in die man durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Lösungen und/oder Reagenzien an diese Fest- phase heranführt.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man nach erfolgter Oligomerisierung auf den DNA- oder PNA-Chips weiterhin die nachfolgenden Hybridi- sierungen mit einer Ziel-DNA durchführt.
19. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung des Verfahrens eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 verwendet.
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