DE19932488A1 - Vorrichtung und Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird eine Vorrichtung zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen, umfassend mindestens eine Lichtquelle, eine mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske und eine Steuerungseinheit, wobei die einzelnen Mikroverschlüsse unabhängig voneinander schaltbar sind. DOLLAR A Die Vorrichtung ist insbesondere zur Belichtung von DNA-, PNA- oder Peptid-Chips geeignet.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen.

DNA-Chips sind kleinste, meist planare Oberflächen, auf welchen räumlich geordnet eine große Anzahl verschiedener Oligomere (kurze, einsträngige DNA-Moleküle) angebracht sind. Solche Chips werden beispielsweise zur parallelen Erkennung zahlreicher DNA-Sequenzen in einer präparierten Gewebeprobe verwendet. Dazu benetzt man die Chipoberflä­ che mit einer Lösung von einsträngigen DNA-Stücken aus der Gewebeprobe, worauf sich komplementär passende DNA- Stücke aus der Lösung an die entsprechenden, an die Chi­ poberfäche angebrachten Oligomere anlagern (Hybridisie­ rung). Danach bestimmt man mit einer geeigneten Methode wie z. B. Fluoreszenzmarkierung, an welchen Stellen auf dem Chip eine Hybridisierung stattgefunden hat. Wenn man weiss, wo auf dem Chip welche Oligomere angebracht sind, kann man somit Rückschlüsse auf DNA-Sequenzen in der Ge­ webeprobe machen. Dazu definiert man in der Regel auf der Chip-Trägerfläche ein dichtes rechtwinkliges Raster. Auf jedem Rasterpunkt ist in Form eines kleinen Flecks genau eine Sorte von Oligomer angebracht. Die maximal mögliche Anzahl von verschiedenen DNA-Sequenzen auf dem Chip ist demzufolge gleich der Anzahl der Rasterpunkte. Da man möglichst viele Sorten von Oligomeren auf einen Chip auf­ bringen will, die Chips aber gleichzeitig so klein wie möglich sein sollten, um effektiv hybridisiert werden zu können, ist es ein wichtiges Ziel bei der Herstellung von DNA-Chips, eine möglichst hohe Rasterdichte zu erreichen.

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur DNA- Chip Herstellung bekannt.

• 1. Alle Oligomere werden auf herkömmliche Weise einzeln im Reagenzglas synthetisiert und danach an den vorgesehe­ nen Rasterpunkten auf den Träger aufpipettiert, typi­ scherweise von einer automatischen Micropipettieranlage. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, da jedes Oli­ gomer einzeln hergestellt bzw. gekauft und von Hand der Pipettieranlage zugeführt werden muss. Die Rasterdichte ist durch die Positioniergenauigkeit der heute verfügba­ ren Pipettieranlagen und durch das minimale Abgabevolumen der typischerweise piezoelektrischen Mikropipetten stark limitiert.
• 2. Die Oligomere werden mit Hilfe einer automatischen Mi­ kropippetieranlage direkt auf dem Chip synthetisiert. Auf jedem Rasterpunkt wird die dort vorgesehene Oligomerkette Baustein für Baustein (Nukleobasen) aufgebaut. Das chemi­ sche Verfahren ist grundsätzlich das selbe wie bei der herkömmlichen Oligomer-Synthese im Reagenzglas. Der Un­ terschied ist, dass alle Oligomere gleichzeitig, von ei­ ner einzigen automatischen Anlage direkt am vorgesehenen Bestimmungsort hergestellt werden. Die bei Methode 1) se­ paraten Arbeitsschritte Oligomer-Synthese und Micropipet­ tierung werden somit zu einem einheitlichen Arbeits­ schritt zusammengefasst. Diese in situ Synthese läuft normalerweise wie folgt ab: Auf einem vorpräparierten Substrat tropft der Pipettierautomat sequentiell auf je­ dem Rasterpunkt die dort vorgesehene erste Nukleobase auf. Dies ist mechanisch nicht sehr aufwendig, da es nur 4 verschiedene Nukleobasen (C, T, G, A) gibt. Man kann dafür z. B. 4 aneinandergekoppelte Micropipetten verwen­ den. Nach dem Auftragen des ersten Nukleosidbausteins auf jedem Rasterpunkt wird das Substrat gewaschen und nach einem "Capping Schritt" die Schutzgruppen an den 5'-OH Funktionen entfernt, um die Reaktion mit dem jeweils nachfolgenden Nukleosidbaustein zu ermöglichen. Danach wird an jedem Rasterpunkt die zweite Nukleobase aufpipet­ tiert. Das Substrat wird dann wieder gewaschen und ent­ schützt. Auf diese Weise baut man Schritt für Schritt auf jedem Rasterpunkt die jeweils erforderlichen Oligomerket­ ten auf. Diese Methode ist nicht besonders schnell, da nacheinander auf jedem Rasterpunkt für jede Nukleobase neu pipettiert werden muss. Wie bei Methode 1) ist die Rasterdichte durch die Ungenauigkeit der Micropipetten beschränkt. Die Ungenauigkeit wirkt sich hier noch schlimmer aus, da jeder Rasterpunkt mehrmals nacheinander auf möglichst identische Weise getroffen werden muss.
• 3. Die Oligomere werden wie bei 2) direkt auf dem Träger synthetisiert, die gezielte Anbindung der richtigen Nu­ kleobasen an den richtigen Rasterpunkten geschieht jedoch durch eine vollkommen parallele, photolithographische Technik anstelle von sequenziellen, zielgenauen Pipet­ tierschritten. Das Verfahren basiert darauf, dass man mit Licht einer bestimmten Wellenlänge gezielt die 5'-OH Schutzgruppen von Oligonukleotiden entfernen kann. Durch geeignete örtliche Bestrahlungsmuster kann man somit Oli­ gonukleotid-Enden an genau jenen Rasterpunkten reaktions­ fähig machen, an denen man im nächsten Schritt eine neues Nukleosid anbringen will. Bei vollständiger Benetzung der Chipoberfläche mit einer Nukleotidbaustein-Lösung wird somit nur an den vorher belichteten Stellen ein Nukleo­ tidbaustein angebunden, alle unbelichteten Stellen blei­ ben unverändert. Die örtlichen Belichtungsmuster werden erzeugt, indem man eine microphotographische schwarz­ weiss Maske zwischen dem Substrat und der Lichtquelle po­ sitioniert, die alle Rasterstellen abdeckt, die nicht re­ aktionsfähig gemacht werden sollen. Die Verlängerung der Oligomer-Ketten auf allen Rasterpunkten um eine Nukleoba­ se geschieht demnach wie folgt: Mit Hilfe einer ersten Maske werden genau jene Rasterpunkte belichtet, welche um die erste der 4 möglichen Sorten von Nukleobasen (z. B. C) erweitert werden müssen. Danach wird der Chip mit einer Lösung des entsprechenden Nukleotidbausteins benetzt, worauf nur die belichteten Punkte um diese Base verlän­ gert werden. Da die neu angebundenen Basen noch alle über eine Schutzgruppe verfügen, werden sie in den folgenden Schritten nicht weiter reagieren, bis ihre Schutzgruppen durch eine weitere Belichtung abgespaltet werden. Nach diesem Reaktionsschritt wird der Chip gewaschen. Nun wer­ den mit Hilfe einer zweiten Maske genau jene Rasterstel­ len belichtet, welche um die zweite der 4 möglichen Sor­ ten von Nukleobasen (z. B. T) erweitert werden müssen. Darauf wird der Chip wiederum mit einer Lösung des ent­ sprechenden Nukleotidbausteins benetzt und die belichte­ ten Stellen dadurch um diese Base verlängert. Genauso verfährt man für die verbleibenden zwei Basen (z. B. G und A). Für die Verlängerung aller Oligomere um eine Nukle­ obase benötigt man demzufolge vier Belichtungsschritte bzw. 4 Photomasken. Diese Methode ist wegen der hohen Parallelität sehr effizient, zudem ist sie wegen der ho­ hen Präzision, die mit Photolithographie erreicht werden kann, geeignet, um sehr hohe Rasterdichten zu erzielen. Allerdings ist die Methode sehr aufwendig und somit teu­ er, da man für die Herstellung einer bestimmten Sorte von Chip zuerst eine grosse Anzahl von Photomasken erzeugen muss. Bei hohen Rasterdichten werden zudem hohe Anforde­ rungen an die Positionierungsgenauigkeit der Masken wäh­ rend der Belichtung gestellt, die effizient nur durch Verwendung von teuren Apparaturen erfüllt werden können.
• 4. Es wird dasselbe Verfahren angewandt wie bei 3), nur verwendet man anstelle der grossen Zahl von photographi­ schen Masken eine einzige, transmissive Flüssigkri­ stallanzeige, die elektronisch angesteuert wird und als dynamische Maske dient. Diese Methode ist einfach und billig, da keine photographischen Masken erzeugt werden müssen und das Positionierungsproblem entfällt. Ein mög­ liches Problem dieser Methode ist der limitierte optische Kontrast der heute verfügbaren Flüssigkristallanzeigen. Das Lichtintensitätsverhältnis zwischen belichteten und abgedeckten Punkten wird dadurch reduziert, was eine Aus­ beuteverminderung bei der Oligomersynthese zur Folge ha­ ben kann. Ausserdem liegt bei den meisten heute verfügba­ ren LCDs die Lichtausbeute unter 50% und ist zudem mei­ stens auf das sichtbare Licht optimiert. Viele LCDs ab­ sorbieren z. B. im für die Synthese besonders interessan­ ten UV-Bereich deutlich stärker als im sichtbaren be­ reich.
• 5. Man synthetisiert die Chips wie bei 3) und 4) nach dem photolithographischen Verfahren, erzeugt ein bestimmtes Belichtungsmuster auf dem Substrat jedoch nicht durch ge­ zielte Abdeckung von Rasterpunkten mit Hilfe einer stati­ schen oder dynamischen Maske, sondern indem man individu­ ell jedem zu belichtenden Rasterpunkt das Licht direkt über einen optischen Lichtleiter zuführt. Über jedem Ra­ sterpunkt wird das Ende einer optischen Lichtleiterfaser so angebracht, dass bei Lichteinkopplung in die Faser das am Ende austretendes Licht genau den entsprechenden Ra­ sterpunkt beleuchtet. Es wird also ein Faserbündel ver­ wendet, das aus genau so vielen Lichtleiterfasern besteht wie Rasterpunkte vorgesehen sind. Beliebige Belichtungs­ muster werden erzeugt, indem man jeder einzelnen Faser gezielt Licht einkoppelt oder nicht. Diese gezielte und unabhängige Lichteinkopplung in die einzelnen Lichtlei­ terfasern kann z. B. durch Leuchtdioden oder durch kommer­ ziell erhältliche, elektrisch gesteuerte optische Schal­ ter und einer Lichtquelle bewerkstelligt werden. Für jede Lichtleiterfaser wird dabei eine eigene, individuell an­ steuerbare Leuchtdiode bzw. Schalter benötigt. Der große Vorteil dieser Methode gegenüber Methode 4) ist der sehr hohe, (theoretisch unendliche) Kontrast, der er­ zielt werden kann, was eine deutliche Verbesserung der Syntheseausbeute ermöglicht. Es ist zudem eine sehr hohe Lichtausbeute möglich, da es heute zu allen wichtigen Wellenlängenbereichen Lichtleiterfasern gibt, welche im entsprechenden Wellenlängenbereich nur sehr schwach ab­ sorbieren. Der Nachteil der Methode ist, dass es sich so­ wohl bei den Leuchtdioden wie auch bei den optischen Schaltern um diskrete Bauteile einer gewissen Größe han­ delt. Da für die Synthese von Chips hoher Dichte eine große Zahl solcher Bauteile benötigt wird (für jeden Ra­ sterpunkt ein Bauteil), kann in solchen Fällen die Steu­ ereinheit eines solchen Systems sehr groß werden, was da­ zu führt, dass das System wegen seiner Größe in typischen Biochemielabors nicht problemlos eingesetzt werden kann.
• 6. Man synthetisiert die Chips wie bei 3), 4) und 5) nach dem photolithographischen Verfahren, belichtet hier aber die einzelnen Rasterpunkte mit Hilfe von Reflexion an kleinen Spiegeln.

Dafür wird ein spezieller Typ von Siliziumchip verwendet, der kommerziell für die Verwendung in Videoprojektoren hergestellt wird. Es handelt sich bei diesem Chip um eine kleine (einige Quadratcentimeter große) Siliziumoberflä­ che, auf dem in einem rechtwinklige Raster eine große Zahl (z. B. 768 × 576) mikroskopisch kleiner, rechteckiger (z. B. 17 µm × 17 µm) Metallspiegel angebracht sind. Jeder der Spiegel ist bezüglich seiner Diagonalachse beweglich gelagert und kann in zwei stabile Positionen A und B ge­ kippt werden, die sich um einige Winkelgrade unterschei­ den. Welcher der Spiegel sich in welcher der beiden Posi­ tionen befindet, kann durch elektronische Signale an den Chipeingängen beliebig eingestellt werden. So ein Mikro­ spiegel-Chip ("micromirror device") wird zusammen mit ei­ ner Lichtquelle, einer Optik und der zu belichtenden Ar­ ray-Oberfläche so angeordnet, dass jeder der Spiegel das reflektierte Licht in der Position A auf das Array wirft und in der Position B auf eine Lichtschluckende Fläche neben dem Array. Dabei gehört zu jeder Rasterposition auf dem zu belichtenden Array genau ein Spiegel, welcher Licht genau auf diese Rasterposition reflektiert, falls er sich in Position A befindet.

Diese Methode ist vergleichbar mit der Methode 4), nur dass für die Lichtmustererzeugung statt einer transmissi­ ven dynamischen Maske ein reflektives dynamisches Lichtablenkungsbauteil verwendet wird. Das System ist ähnlich einfach und klein wie jenes mit LCDs, kann aber einen höheren Kontrast und eine höhere Lichtausbeute über einen größeren Wellenlängenbereich erreichen. Dies kann sich auf die Qualität des synthetisierten DNA-Arrays sehr vorteilhaft auswirken. Allerdings kommt auch diese Metho­ de in Sachen Kontrast und Lichtausbeute bei weitem nicht an Methode 5) heran. Der Kontrast wird durch die nicht völlig unterdrückbaren parasitären Streulichteffekte ver­ mindert. Die Lichtausbeute ist nicht maximal, weil die Spiegel einen gewissen Teil des Lichts absorbieren und weil der Füllfaktor der heute verfügbaren Mikrospiegel­ chips unter 90% liegt. Das kommt daher, dass sich aus herstellungstechnischen Gründen zwischen den einzelnen Spiegeln recht große Lücken befinden (gesamthaft über 10% der Chipfläche), wo kein Licht reflektiert wird.

Diese Methoden nach dem Stand der Technik weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Die beiden attraktivsten Metho­ den, um günstig und flexibel DNA-Arrays hoher Rasterdich­ te herzustellen, sind die Methode mit den Lichtleitern und die Methode mit dem Mikrospiegel-Chip. Die Methode mit den Lichtleitern erlaubt einen extrem hohen Kontrast in einem weiten Wellenlängenbereich und somit eine hohe Qualität des DNA-Arrays, benötigt jedoch eine aufwendige und für viele Labors u. U. zu große Apparatur. Die Methode mit den Mikrospiegeln ist sehr einfach und mit einer kleinen Apparatur realisierbar und erlaubt einen recht hohen Kontrast in einem weiten Wellenlängenbereich, er­ reicht aber beiweitem nicht den Kontrast, der mit Licht­ leitern möglich ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwindet, d. h. den hohen Kontrast der Lichtleiter-Methode mit der Einfachheit und Kompaktheit der Mikrospiegel-Methode kombiniert. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines weiteren Verfahrens zur photolithographischen Belichtung biologischer Stoffe.

Die Aufgabe wird durch die gekennzeichneten Merkmale des Hauptanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Unteransprüchen gekenn­ zeichnet.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine neuartige Vorrichtung zur photolithographischen Belich­ tung von biologischen Stoffen geschaffen wird, umfassend mindestens eine Lichtquelle, eine mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske und eine Steuerungseinheit, wobei die einzelnen Mikroverschlüsse unabhängig voneinander schalt­ bar sind.

Bevorzugt ist es dabei, daß die Lichtquelle monochromati­ sches oder kontinuierliches Licht in einem Wellenlängen­ bereich von 100 bis 800 nm aussendet. Besonders bevorzugt ist es, daß die Lichtquelle ein Laser, eine Leuchtdiode, eine Metalldampflampe, eine Gasentladungslampe, eine Gasanregungslampe, eine Glühfadenlampe oder eine Lichtbo­ genlampe ist.

Weiterhin ist es vorteilhaft, daß die mit Mikroverschlüs­ sen versehene Lochmaske ein Mikroverschluss-Array ist.

Bevorzugt ist hierbei, daß das Mikroverschluss-Array Halbleitermaterialien umfaßt. Insbesondere bevorzugt ist es erfindungsgemäß, daß das Mikroverschluss-Array durch ein aus der klassischen Halbleitertechnik abgeleitetes Verfahren oder das LIGA-Verfahren (Lithographie, Galvano­ formung, Abformung) erhältlich ist.

Bevorzugt ist es ferner, daß zu belichtende Stoffe auf einem Träger angeordnet sind. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, daß zu belichtende Stoffe auf einem Träger an­ geordnet sind, wobei dieser Träger ein DNA-Chip, ein PNA- Chip oder ein Peptid-Chip ist.

Erfindungsgemäß weist die Vorrichtung zusätzlich minde­ stens einen Detektor auf.

Bevorzugt ist dabei, daß mindestens einer der Detektoren derart angeordnet ist, daß dieser das zur Belichtung ver­ wendete Licht erfaßt und/oder mindestens ein Detektor derart angeordnet ist, daß dieser das von den belichte­ ten Stoffen reflektierte und/oder durch Fluoreszenz er­ zeugte Licht erfaßt und daß zur Lichtführung für die De­ tektoren gegebenenfalls Lichtleiter und/oder Lichtlei­ terbündel vorgesehen sind. Insbesondere bevorzugt ist es dabei, daß die Detektoren CCD-Detektoren und/oder CCD- Kameras sind.

Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist es, daß die mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske mittels eines Computers elektronisch ansteuerbar ist.

Äußerst bevorzugt ist dabei eine erfindungsgemäße Vor­ richtung, wobei die Lichtquelle ein solches Spektrum von Wellenlängen emittiert, welches die Entschützung von Nu­ kleotiden, Nukleotidanaloga und Peptid-Nukleinsäure Bau­ steinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligo­ meren bewirkt und daß zwischen dieser Lichtquelle und dem Substrat eine mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske angeordnet ist, deren Mikroverschlüsse durch gezielte An­ steuerung öffenbar und schließbar sind, wodurch der Durchtritt von Licht durch das jeweilige Loch ermöglicht oder verhindert wird, und daß hinter dem Mikroverschluss- Array die Festphase, auf der die Oligomersynthese statt­ findet, präzise und starr positioniert ist und daß die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfindet, in einer Kammer angeordnet ist, in die durch weitere Vor­ richtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Lö­ sungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heranführ­ bar sind.

Bevorzugt ist es ferner, daß man als Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, einen Träger anordnet. Besonders bevorzugt ist es dabei, daß man diese auf einer Oberfläche anordnet und mittels Licht, welches aus einer Lichtquelle stammt und welches man durch eine mit Mikro­ verschlüssen versehene Lochmaske dynamisch maskiert, be­ lichtet, wobei man jeden Punkt, welcher hinter einem Mi­ kroverschluss liegt, unabhängig von den anderen Punkten belichtet, wobei man das Belichtungsmuster mittels einer Steuerungseinheit vorwählt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, nämlich zur Belichtung von DNA- oder PNA- Chips, wobei man Licht der Wellenlängen verwendet, wel­ ches die Entschützung von Nukleotiden, Nukleotidanaloga und Peptid-Nukleinsäurebausteinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß man zwi­ schen dieser Lichtquelle und dem Substrat eine mit Mikro­ verschlüssen versehene Lochmaske anordnet, deren Mikro­ verschlüsse man durch gezielte Ansteuerung nach Bedarf öffnet oder schliesst und dadurch den Durchtritt von Licht durch das jeweilige Loch ermöglicht oder verhindert und daß man hinter der mit Mikroverschlüssen versehenen Lochmaske die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, präzise und starr positioniert und daß man die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfin­ det, in einer Kammer anordnet, in die man durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Lösungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heran­ führt.

Bevorzugt ist es erfindungsgemäß hierbei, daß man nach erfolgter Oligomerisierung auf den DNA- oder PNA-Chips weiterhin die nachfolgenden Hybridisierungen mit einer Ziel-DNA durchführt.

Erfindungsgemäß ist ferner ein Verfahren, wobei man zur Durchführung des Verfahrens eine erfindungsgemäße Vor­ richtung verwendet.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht eine einfa­ che, platzsparende und preiswerte photolithographische Herstellung von DNA-Chips hoher Rasterdichte in einer viel besseren Qualität, als bisher mit bekannten Vorrich­ tungen möglich war. Der Grund dafür ist, dass die völlig neuartige Verwendung eines Mikroverschluss-Arrays als dy­ namische photolithographische Maske einen viel höheren Belichtungskontrast und eine bessere Lichtausbeute ermög­ licht, als dies mit den bisher verwendeten, ähnlich platzsparenden und preiswerten Systemen möglich war.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das Verfahren lösen die gestellte Aufgabe auf völlig neuartige Art und Weise durch Kombination kommerziell erhältlicher Komponenten mit einer nach dem heutigen Stand der Technik für den Fachmann bekannten herstellbaren mikromechanischen Kompo­ nente. Es ermöglicht die billige Herstellung von DNA- Chips in einer Qualität, wie sie vorher nicht möglich war.

Das grundlegende Konzept der erfindungsgemäßen Vorrich­ tung und des Verfahrens besteht darin, dass man für die Erzeugung bestimmter Belichtungsmuster auf der Chip- Trägeroberfläche eine mikrotechnisch hergestellte, mit kleinen, elektrisch ansteuerbaren optischen Verschlüssen versehene Lochmaske (Mikroverschluss-Array, microshutter device) verwendet, welche zwischen die Lichtquelle und die Trägeroberfläche gebracht wird. Jedes Loch besitzt einen eigenen, individuell ansteuerbaren elektromechani­ schen Verschluss. Dadurch kann unabhängig für jedes ein­ zelne Loch eingestellt werden, ob Licht durch dieses durchtreten kann oder nicht. Ein Loch mit geöffnetem Ver­ schluss erlaubt den Durchtritt eines Lichtbündels, das auf die Chip-Trägeroberfläche fällt und dort einen be­ stimmten Bereich belichtet. Jedes der Löcher definiert also auf eindeutige Weise einen Bereich auf der Träger­ oberfläche, welcher belichtet wird, wenn der zugehörige Verschluss geöffnet ist und unbelichtet bleibt, wenn der Verschluss geschlossen ist. Es können also genau so viele Punkte auf dem Chip unabhängig voneinander belichtet wer­ den wie Löcher/Verschlüsse in der Maske vorhanden sind. Die Maske muss so beschaffen sein, dass sich jede belie­ bige Kombination von geöffneten und geschlossenen Löchern einstellen lässt. Typischerweise wird eine Maske mit ei­ ner rasterförmigen Anordnung von Verschlüssen herge­ stellt, was die Herstellung der üblichen, rasterförmigen DNA-Chips ermöglicht. Die Herstellbarkeit von elektrisch ansteuerbaren Mikroverschluss-Arrays mit rechteckigen Lö­ chern mit Kantenlängen von einigen zehntel Milimetern ist in der Praxis bereits demonstriert worden (Sergej Fati­ kow, Ulrich Rembold: "Microsystem Technology and Microro­ botics", Springer-Verlag 1997, S. 89-90 und S. 118-120; Th. Kraus, M. Baltzer, E. Obermeier: "A Micro Shutter for Applications to Optical and Thermal Detectors", Transdu­ cers 97, Chicago Illinois, USA, June 16-19 1997, Digest of Technical Papers, 67-70). Es ist davon auszugehen, dass mit der schnell voranschreitenden Entwicklung in der Mikrosystemtechnologie bald Arrays von optischen Ver­ schlüssen viel kleinerer Dimension herstellbar sein wer­ den. Damit wird mit so einer Vorrichtung die Produktion von DNA-Chips hoher Dichte und mit einer großen Anzahl von Punkten möglich werden.

Eine vollständige, für die automatische Herstellung von DNA-Chips taugliche Vorrichtung besteht im wesentlichen aus einer mit einer Kollimationsoptik versehenen Licht­ quelle, einem Mikroverschluss-Array, gegebenenfalls einer Abbildungsoptik, einem chemischen Synthesegerät mit einer auf einer Seite transparenten und mit einer Befestigung für den Chip-Träger versehenen Synthesekammer, und diver­ sen für die Konstruktion benötigten Montagekomponenten. Zusätzlich wird eine elektronische, typischerweise compu­ tergestützte Steuerungseinheit benötigt, welche alle Vor­ gänge während einer DNA-Chipsynthese steuert und über­ wacht.

Kernstück der Erfindung ist die Anordnung bestehend aus der Lichtquelle, der Mikroverschluss-Array und der Syn­ thesekammer. Die Lichtquelle wird so angeordnet, dass sie durch die transparente Wand der Synthesekammer einen in der Synthesekammer befestigten Chip-Träger beleuchtet, wenn sich sonst nichts im Strahlengang befindet. Der Mi­ kroverschluss-Array wird nun so in den Strahlengang zwi­ schen der Lichtquelle und der Synthesekammer angeordnet, dass die für die Oligomersynthese vorgesehene Fläche auf dem Chip-Träger vollständig in seinem Schatten liegt und keinerlei Belichtung erfährt, wenn alle Verschlüsse des Mikroverschluss-Arrays geschlossen sind, jedoch ein Be­ lichtungsmuster auf die für die Oligomersynthese vorgese­ hene Fläche geworfen wird, falls die Verschlüsse entspre­ chend geöffnet sind. Der Mikroverschluss-Array erhält bei dieser Anordnung die Rolle einer dynamischen Lochmaske mit elektronisch einstellbarem Lochmuster, welche er­ laubt, zu einem gegebenen Zeitpunkt für jeden einzelnen Oligomer-Punkt des DNA-Chips individuell einzustellen, ob er belichtet werden soll oder nicht. Mit dieser neuarti­ gen Vorrichtung können DNA-Chips nach der bekannten pho­ tolithographischen Methode synthetisiert werden.

Der große Vorteil dieser erfindungsgemässen Vorrichtung zur photolithographischen Herstellung von DNA-Chips ge­ genüber den bekannten Vorrichtungen mit Photomasken, LCDs und Mikrospiegeln ist die klar höhere Lichtausbeute an den jeweils belichteten Stellen und die höhere Lichtun­ terdrückung an den unbelichteten Stellen, was einen höhe­ ren Kontrast zur Folge hat. Sowohl die ungeschwärzten Stellen auf Photomasken als auch die Trägerplättchen und Polfilter von LCDs als auch die Metalloberflächen von Mi­ krospiegeln absorbieren einen Teil des Lichts, der da­ durch für die photochemische Reaktion verlorengeht. Im Gegensatz dazu findet in einem geöffneten Loch eines Mi­ kroverschluss-Arrays keinerlei Wechselwirkung des Lichts mit irgendeinem Feststoff statt, das gesamte Licht tritt völlig unverändert durch das Loch durch. Gleichzeitig wird der Lichtstrahl bei einem geschlossenen Loch annä­ hernd zu 100% blockiert, da dann das Loch durch eine völ­ lig lichtundurchlässige Klappe oder einen Schieber - bei der heutigen Technologie typischerweise aus Metall - ab­ gedeckt ist. Falls doch noch ein bisschen Licht durch­ tritt, liegt das an Streueffekten bzw. an der Tatsache, dass die Klappe möglicherweise nicht satt auf dem Lochrand aufliegt. Solche mechanischen Probleme lassen sich jedoch durch geeignetes Design des Mikroverschlusses beliebig minimieren. Eine vergleichbare Lichtunterdrüc­ kung ist von den 3 oben genannten Vorrichtungen nur bei den Photomasken möglich, falls bei deren Herstellung eine entsprechend starke Schwärzung möglich ist.

In ihren herrvorragenden optischen Eigenschaften ist die erfindungsgemässe Vorrichtung vergleichbar mit der schon bekannten Vorrichtung mit Lichtleiterfasern, die eine ähnlich hohe Lichteffiziez und einen ähnlich hohen Kon­ trast erlaubt. Der große Vorteil gegenüber den Lichtlei­ terfasern ist, dass für eine Herstellung von Chips mit vielen Punkten die Vorrichtung mit einem Mikroverschluss- Array viel einfacher konstruierbar und viel kompakter ist. Sie kann als Tischgerät realisiert werden und passt dadurch in jedes typische Biochemielabor, was bei einer Vorrichtung mit Lichtleiterfasern nach dem heutigen Stand der Technik nicht unbedingt möglich ist. Durch die Ein­ fachheit des Aufbaus ist die erfindungsgemässe Vorrich­ tung zudem potentiell viel günstiger herstellbar als eine Vorrichtung mit Lichtleiterfasern.

Somit stellt die Erfindung eine klare Verbesserung zur heutigen Technologie für DNA-Chipsynthese dar.

Die vorliegende Erfindung soll anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert werden.

Es zeigt:

Fig. 1 den schematischen Aufbau einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

In Fig. 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer er­ findungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Aus der Licht­ quelle A wird das Licht, welches durch eine Kollimation­ soptik und gegebenenfalls durch Filter 8 geführt wird, über die Mikroverschluss-Lochmaske H auf den Array-Träger C geleitet. Die Steuerung I, vorzugsweise ein Computer, sorgt für die entsprechende Ansteuerung der einzelnen Mi­ kroverschlüsse F und G der Lochmaske. Ist ein Mikrover­ schluss geöffnet wie in F, so wird die darunterliegende Stelle D des DNA-Array-Trägers C belichtet. Umgekehrt wird in dem Fall, in dem der Mikroverschluss wie in G ge­ schlossen ist, die darunterliegende Stelle E auf dem Ar­ ray-Träger C nicht belichtet. Der Computer I sorgt für die entsprechende Ansteuerung der Verschlüsse F und G der Lochmasken.

Dem Fachmann ist klar, wie die einzelnen Bauteile in ei­ ner erfindungsgemäßen Vorrichtung anzuordnen sind Auch die entsprechende Programmierung der Steuerung mittels Computerprogrammen ist dem Fachmann an sich bekannt.

Bezugszeichenliste

A Lichtquelle
B Kollimationsoptik und Filter
C DNA-Chip Träger
D Belichtete Stelle auf dem Chip
E Unbelichtete Stelle auf dem Chip
F Geöffneter Verschluss
G Geschlossener Verschluss
H Mikroverschluss-Lochmaske
I Elektronische Steuerung

Claims (18)

1. Vorrichtung zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen, umfassend mindestens eine Lichtquelle, eine mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske und eine Steuerungseinheit, wobei die ein­ zelnen Mikroverschlüsse unabhängig voneinander schaltbar sind.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle monochromatisches oder kontinu­ ierliches Licht in einem Wellenlängenbereich von 100 bis 800 nm aussendet.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle ein Laser, eine Leuchtdiode, eine Metalldampflampe, eine Gasentladungslampe, eine Gasanregungslampe, eine Glühfadenlampe oder eine Lichtbogenlampe ist.

4. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske ein Mikroverschluss-Array ist.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroverschluss-Array Halbleitermaterialien umfaßt.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroverschluss-Array durch ein aus der klas­ sischen Halbleitertechnik abgeleitetes Verfahren oder das LIGA-Verfahren (Lithographie, Galvanoformung, Ab­ formung) erhältlich ist.

7. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu belichtende Stoffe auf einem Träger angeordnet sind.

8. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu belichtende Stoffe auf einem Träger angeordnet sind, wobei dieser Träger ein DNA-Chip, ein PNA-Chip oder ein Peptid-Chip ist.

9. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zusätz­ lich mindestens einen Detektor umfaßt.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Detektoren derart angeordnet ist, daß dieser das zur Belichtung verwendete Licht erfaßt und/oder mindestens ein Detektor derart ange­ ordnet ist, daß dieser das von den belichteten Stof­ fen reflektierte und/oder durch Fluoreszenz erzeugte Licht erfaßt und daß zur Lichtführung für die Detek­ toren gegebenenfalls Lichtleiter und/oder Lichtlei­ terbündel vorgesehen sind.

11. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, da­ durch gekennzeichnet, daß die Detektoren CCD- Detektoren und/oder CCD-Kameras sind.

12. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske mittels eines Computers elektro­ nisch ansteuerbar ist.

13. Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle ein sol­ ches Spektrum von Wellenlängen emittiert, welches die Entschützung von Nukleotiden, Nukleotidanaloga und Peptid-Nukleinsäure Bausteinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß zwi­ schen dieser Lichtquelle und dem Substrat eine mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske angeordnet ist, deren Mikroverschlüsse durch gezielte Ansteuerung öf­ fenbar und schließbar sind, wodurch der Durchtritt von Licht durch das jeweilige Loch ermöglicht oder verhindert wird, und daß hinter dem Mikroverschluss- Array die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, präzise und starr positioniert ist und daß die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfindet, in einer Kammer angeordnet ist, in die durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Syn­ these notwendigen Lösungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heranführbar sind.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeich­ net, daß man als Festphase, auf der die Oligomersyn­ these stattfindet, einen Träger anordnet.

15. Verfahren zur photolithographischen Belichtung von biologischen Stoffen, wobei man diese auf einer Ober­ fläche anordnet und mittels Licht, welches aus einer Lichtquelle stammt und welches man durch eine mit Mi­ kroverschlüssen versehene Lochmaske dynamisch mas­ kiert, belichtet, wobei man jeden Punkt, welcher hin­ ter einem Mikroverschluss liegt, unabhängig von den anderen Punkten belichtet, wobei man das Belichtungs­ muster mittels einer Steuerungseinheit vorwählt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, nämlich zur Belichtung von DNA- oder PNA-Chips, dadurch gekennzeichnet, daß man Licht der Wellenlängen verwendet, welches die Entschützung von Nukleotiden, Nukleotidanaloga und Peptid-Nukleinsäurebausteinen zur Kettenverlängerung und zum Aufbau von Oligomeren bewirkt und daß man zwischen dieser Lichtquelle und dem Substrat eine mit Mikroverschlüssen versehene Lochmaske anordnet, deren Mikroverschlüsse man durch gezielte Ansteuerung nach Bedarf öffnet oder schliesst und dadurch den Durch­ tritt von Licht durch das jeweilige Loch ermöglicht oder verhindert und daß man hinter der mit Mikrover­ schlüssen versehenen Lochmaske die Festphase, auf der die Oligomersynthese stattfindet, präzise und starr positioniert und daß man die Festphase, auf welcher die Oligomersynthese stattfindet, in einer Kammer an­ ordnet, in die man durch weitere Vorrichtungen die zur DNA oder PNA Synthese notwendigen Lösungen und/oder Reagenzien an diese Festphase heranführt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man nach erfolgter Oligomerisierung auf den DNA- oder PNA-Chips weiterhin die nachfolgenden Hybridi­ sierungen mit einer Ziel-DNA durchführt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung des Verfahrens eine Vorrich­ tung gemäß Anspruch 1 verwendet.