EP1177294A1 - Neuer zellulärer regulationsfaktor tto 20 - Google Patents

Neuer zellulärer regulationsfaktor tto 20

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Publication number
EP1177294A1
EP1177294A1 EP00929356A EP00929356A EP1177294A1 EP 1177294 A1 EP1177294 A1 EP 1177294A1 EP 00929356 A EP00929356 A EP 00929356A EP 00929356 A EP00929356 A EP 00929356A EP 1177294 A1 EP1177294 A1 EP 1177294A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tto
dna
protein
cells
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00929356A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus-Peter Koller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
Publication of EP1177294A1 publication Critical patent/EP1177294A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Definitions

  • the present invention relates to the cellular regulatory factor TTO 20 and DNA encoding it, and its manufacture and use for screening purposes to find modulators for TTO 20 activity.
  • interleukin-1 interleukin-1
  • IL-1 interleukin-1
  • An example of such cells are articular chondrocytes.
  • 1L-1 inhibits the synthesis of proteoglycans (PG) by chondrocytes and stimulates the production of prostaglandin E 2 and metallo-proteinases, which are able to degrade molecules of the extracellular matrix.
  • PG proteoglycans
  • IL-1 played a role in cartilage degradation in osteoarthritis and rheumatoid arthritis (Beuton HP & Tyler JA, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 154, 421-428; Aydelotte MB et al. Comm. Tiss. Res. 28, 143-159, Wood DD et al., Arthritis Rheum. 26, 975-983; Lohmander LS et al ., Trans. Orthop. Res. Soc. 17, 273).
  • Matrix metalloproteases are potential candidates for starting points for therapy with active substances that interact with these enzymes, but no specific molecular starting points have yet been identified that relate to early steps in the complex process that leads to cartilage degradation. For this reason, various approaches have been chosen in order to obtain such molecular starting points for drug therapy for osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Such an approach is described in European patent application EP 0 705 842 A2. The question was whether it would be possible to obtain potential molecular starting points for drug therapy for IL-1 ⁇ -induced cartilage degradation at the RNA level in human, articular chondrocytes from osteoarthritic cartilage.
  • RNA from 1L-1 ⁇ stimulated and non-stimulated human chondrocytes was subjected to a differential display of mRNA by reverse transcription and the polymerase chain reaction (DDRT-PCR).
  • DDRT-PCR reverse transcription and the polymerase chain reaction
  • the key element of this technology is the use of a set of oligonucleotide primers, one of which binds to the polyadenylated tail of the mRNA, while the others are random decamers that bind to various other sites on the mRNA.
  • mRNA subpopulations which are defined by a certain set of primes, are amplified after the reverse transcription and separated on DNA sequencing gels.
  • band patterns which are characteristic of each of the cell lines studied. For example, 100 different primer combinations should result in 10,000 different PCR products, which at least represent about half of the genes that are even expressed in a cell line.
  • a comparison of the band patterns of two different cell lines indicates those bands that correspond to differentially expressed genes.
  • European patent application EP 0 705 842 A2 discloses a series of short DNA sequences which have been identified in the manner described above. An analysis of the sequences showed that some of them had complete or very large identity to the sequences of known genes: a cDNA fragment with 100% identity became human osteopontin, another c-DNA fragment with 97.2% identity to human calnexin, another fragment with 99.5% identity to human TNF-stimulated gene 6 (TSG-6) was found. However, most of the fragments found could not be assigned to a known gene from the point of view of the sequence characterizing them. This group of cDNA fragments also includes the 400 bp long clone TTO 20/2 (2), from whose DNA sequence 152 bp were decoded.
  • antisense RNA in human chondrosarcorn cells which are regarded as model cells for cartilage differentiation, provided evidence of a role for TTO 20/2.
  • the antisense approach is based on the fact that the cultured cells are transformed with a vector which expresses antisense mRNA to TTO 20, but at the same time also an indicator protein, the activity of which indicates whether the antisense RNA was formed.
  • Such vectors are called bicistronic or dicistronic vectors.
  • the starting vector for the present constructs was pED4, the construction of which was described by Kaufmann et al. (Kaufmann et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 4485-4490).
  • antisense RNA complementary RNA
  • sense RNA complementary RNA
  • EST fragments which have no defined open reading frame can thus be used to work out the effect of the protein which is ultimately encoded by the associated gene, in that the "antisense expressed" EST switches off the reading of the coding sense mRNA or decreased.
  • antisense expression prevents the formation of a factor that plays a role in signal cascades this disturbed.
  • the factor is a transcription factor
  • the expression of several genes is disrupted. This can be recognized, for example, by morphologically visible changes that can be attributed to changes in the expression of secreted proteins, especially proteases.
  • Transformed cells can also be used in screening systems by trying to block the action of the antisense RNA.
  • DNA chip technology allows such changes to be analyzed directly by comparing the transcript profiles of transformed with untransformed or mock-transformed cells. The comparison then also allows conclusions to be drawn as to whether an EST plays a decisive role in the context of a clinical picture and is therefore suitable as a screening target.
  • the use of the vector is therefore also suitable for finding new targets and for profiling new drugs.
  • the vector is particularly suitable for setting up HTS systems for target validation.
  • EST clones are expediently grown in HTS formats, such as 96-well microtiter plates, and the insert DNA is amplified by means of PCR using suitable PCR primers, which, for example for cloning in one of the pED4 derivatives described, has a PST site on the 3 ′ side and the Generate an Eco RI interface on the 5 'side.
  • suitable PCR primers which, for example for cloning in one of the pED4 derivatives described, has a PST site on the 3 ′ side and the Generate an Eco RI interface on the 5 'side.
  • the PCR fragments generated in this way are cut with Pstl and Eco Rl and ligated into the vector dicistronic EGFP vector. The screening format is retained.
  • the ligated vector is pipetted onto prepared eukaryotic cells using commercially available pipetting robots with suitable transfection agents such as CaP0 4 , Fugene 6 (manufacturer: Boehringer, Mannheim; Lipofectamin, Life Technologies, Eggenstein) and the cells are transformed by conventional methods.
  • suitable transfection agents such as CaP0 4 , Fugene 6 (manufacturer: Boehringer, Mannheim; Lipofectamin, Life Technologies, Eggenstein) and the cells are transformed by conventional methods.
  • the screening format is also retained here.
  • the cells are incubated in the presence of C0 2 using conventional methods and are automatically checked for fluorescence emission in a fluorescence scanner after 24-72 hours.
  • Wells with transformed, fluorescent cells are then compared to transformed control cells, which were transfected with the vector without Pstl - Eco Rl insert, evaluated for changes in growth and changes in cell morphology, etc. If such changes occur, this indicates an essential effect of the expressed antisense RNA.
  • the isolation of the cloned DNA and the subsequent sequence analysis give an indication of the nucleotide sequence and thus the gene involved or the encoded protein. In this way, the first functional indications for gene activities can be found, the function of which cannot be derived by the EST itself.
  • the invention therefore relates to the TTO 20 protein containing the amino acid sequence according to Table 1.
  • Another object of the invention is a DNA coding for the protein mentioned, selected from the group containing
  • the invention also relates to an antibody which binds to the TTO 20 protein.
  • the invention also relates to a method for producing the TTO 20 protein, comprising the steps:
  • Another object of the invention is a method of identifying cell lines, cells or tissues expressing the TTO 20 protein using a nucleic acid probe that hybridizes with an RNA in a biological sample derived from a DNA as described above becomes.
  • the invention furthermore relates to the use of the DNA coding for the TTO 20 protein according to Table 1 for completing the DNA and protein sequence according to Table 1 by hybridization and / or PCR methods.
  • Another object of the invention is the use of the TTO 20 protein for determining its three-dimensional structure and the design of inhibitors or activators of the TTO 20 protein.
  • the invention also relates to the use of TTO 20 to find modulators of TTO 20 activity.
  • a diagnostic kit for the diagnosis of inflammatory diseases in particular rheumatoid arthritis, containing one
  • the homology search revealed significant similarities to two EST clones in the public database with the Genbank accession number M 51303 (sequence ID: g1192469) and accession number H 05077 (sequence ID: g868629).
  • the corresponding clones with the clone ID 283071 and 43508 were ordered from Genome Systems, St. Louis, USA, and completely sequenced.
  • the clone with the clone ID 283071 showed the largest insert of approx. 2580 bp, the clone with the ID 43508 is significantly smaller with an insert size of 2200 bp, but has 100%
  • Polyadenylation signal and ending with a poly A tail corresponds to the sequence given in Table 1 from nucleotide 706 to nucleotide 3262.
  • the reading frame in clone 283071 continues 15 amino acids and is then ended with a TAA stop codon.
  • the reading frame in KIAA0282 ORF continues 123 amino acids. This region and the complete 3 'untranslated region of approximately 2000 bp of the KIAA0282 sequence are different from the sequence of clone 283071. For an illustration, see FIG. 1.
  • Example 3 Verification of the connection from the 3 'region of TTO20 to the 5' region of KIAA0282
  • PCR strategy was chosen to clarify the relationship between the 5 'region of KIAA and the 3' region of TTO20 using an independent method.
  • Two forward primers were derived from the 5 'region of KIAA0282.
  • Primer 1 5'-CAACTCC TGTAT CACC-3 '(SEQ ID NO.:1)
  • primer 2 5'-AGTGCGATGTCTTCTACTG-3' (SEQ ID NO .: 2).
  • Reverse primers 3 and 4 were derived from the 3 'region of clone 283071.
  • Primer 3 5'- TCTAAAGGCAG GAGAGGAAC-3 '(SEQ ID NO .: 3).
  • Primer 4 5'- TTCATGTGTCTTGCTTACTC-3 '(SEQ ID NO .: 4).
  • a 2097 bp fragment should be able to be amplified using primers 1 and 4, and a fragment of 1211 bp using primer pairs 2 and 3.
  • the following cDNAs were used as the template for the polymerase chain reaction: Brain cDNA from the Multiple Tissue cDNA Panel Human 1 (order number: K1420-1, from Clontech, Heidelberg, Germany) and fetal brain cDNA from the Human Fetal cDNA Panel (order number: K1425 -1, from Clontech, Heidelberg, Germany). 0.5-1 ⁇ l aliquots were introduced into a PCR reaction with primer pairs 1 and 4.
  • PCR reaction was carried out using the buffers recommended by the manufacturer of the enzymes as follows: Polymerase mixture: 19 parts of AmpliTaq DNA polymerase (company Perkin-Elmer, Rothstadt, Germany) and 1 part pfu polymerase (company Stratagen, La Jolla, USA). Primer concentration: 10 pM. DNA cycler (Perkin bucket, model 480). PCR conditions for one cycle: 94 ° C, 2 min .; 94 ° C, 30 sec; 59 ° C, 30 sec .; 72 ° C, 30 sec .; 72 ° C, 7 min, reaction volume: 50 ⁇ l. After 25-30 cycles, the reaction was cooled to 4 ° C. and the reaction mixture in a 1, 2
  • % agarose gel analyzed.
  • the corresponding PCR fragment with a size of approx. 2100 bp could be amplified both from the brain cDNA and from the fetal brain cDNA. If 0.5-1 ⁇ l aliquots of these samples are used in a further, "nested" PCR reaction using the same conditions, but with primers 2 and 3, a PCR fragment of 1200 bp is produced. This clearly indicates the presence of a cDNA with the related 5 'region of KIAA0282 and the 3' region of TTO20.
  • the 2100 bp DNA fragment was cut out of the agarose gel and the DNA was electrophoresed (Ausubel et al.). The eluted DNA was taken up in 10 ⁇ l sterile water and cloned into the vector pCR2.1 according to the recommendations of the manufacturer (Invitrogen BV, Groningen, Holland). The PCR fragments were cloned with the aid of the TA cloning kit from the same manufacturer using the method specified by the manufacturer.
  • the cloned DNA fragment was sequenced using the chain termination method according to Sanger et al. with the aid of the dye terminators and a sequencer model 377 (Perkin Eimer, Langen, Germany). The sequencing confirms exactly the result obtained by the PCR analysis. Thereafter, the sequence given in Table 1 (nucleotides 685 to 3262) can be expanded on the 5 'side by the DNA sequence specified by KIAA0282. The complete sequence is shown in Table 1 (nucleotides 1 to 3262).
  • RNA analyzes demonstrate a more than fourfold induction of the expression of the gene in interleukin 1-stimulated chondrocytes.
  • the discoverers of the cDNA for KIAA0282 suggest a homology of the encoded protein with a zinc finger protein. Zinc finger proteins can act as transcription factors, so they play an essential role in the regulation of cellular activity.
  • an antisense expression approach with a part of the sequence (nucleotide 705 - nucleotide 3198 of Table 1) was chosen. This area includes both part of the coding and the non-coding 3 'area of the cDNA.
  • the dicistronic vector pED 4 was selected as the starting vector (FIG. 2; Kaufman et al., Nucleic Acids Research 19, 448-4490 (1991)).
  • the vector contains the following structural elements: origin of replication for replication in eukaryotic cells, the SV40 expression enhancer, the adenovirus major late promoter, the leader sequence of the adenovirus major late messenger RNA, a hybrid intron with splice site, the encephalomyocarditis virus leader sequence, the selection marker dihydrofolate reductase the SV40 polyadenelation signal, the adenovirus V1 RNA gene, an origin of replication and a selection marker for the multiplication of the vector in recombinant E. coli.
  • the selection marker dihydrofolate reductase should now be exchanged for the gene for the green fluorescent protein (GFP).
  • the expression of the GFP via the second cistron thus serves as a visible measure of the expression of the antisense construct in transient expression experiments.
  • Isolated plasmid DNA from pED4 was cut with the restriction endonucleases Cla1 and Xho1.
  • DNA was used commercially available vector pEGFP (Clontech, Heidelberg, Germany) with the restriction enzymes Sah and Not1 cut.
  • the DNA fragments were separated by electrophoresis. Since the singular cleavage site of Cla1 is approximately 350 bp after the coding dihydrofolate reductase sequence in the VA gene, a third fragment is required to restore the polyA part and the VA gene section.
  • a DNA fragment from the vector pED4 was amplified by means of PCR, which has an emergency interface at the 5 'end and a Cla interface at the 3' end and the still missing sequence of the polyA part and the VA gene includes. Primers used:
  • the PCR product was digested with Not1 and Cla1, separated by gel electrophoresis from nucleotides and isolated. The three fragments were pipetted together in an equimolar ratio, buffer, ATP and T4 ligase were added and ligated. The ligation mixture was transformed into E.coli DH5 ⁇ cells and plated on ampicillin selection plates. After isolating the plasmid DNA from transformants, the fragment size of the DNAs was checked using a BamH1 restriction digest. The original vector pED4 has three BamH1 interfaces, which result in three DNA fragments of approximately 2950bp, 2190bp and 220bp in size.
  • the new vector T782 Due to the gene exchange, the new vector T782 has four BamH1 interfaces, which lead to four DNA fragments of approx. 2950bp, 1315bp, 1075bp and 220 bp when BamHI digests the plasmid DNA. The correct sequence of the newly integrated indicator gene was verified by sequencing.
  • the plasmid map of the vector T782 is shown in FIG. 3.
  • the TTO20 sequence was amplified with the aid of PCR and appropriate primers and cloned into the GFP vector T782 via the Eco R1 site.
  • Reverse primer 5'-GGAATTCACTTCTGTGCAGTAACAGAG-3 '(SEQ ID NO .: 8)
  • the resulting approximately 2500 bp fragment was completely digested with the restriction enzyme Eco R1, separated by geo-electrophoresis and isolated.
  • the isolated fragment was cloned into the GFP vector also cut with Eco R1.
  • various recombinant clones were cut with the restriction enzyme Pstl after transformation of E. coli DH5 a and the fragments were analyzed by electrophoresis.
  • the fact that a unique PstI interface is made available via the vector in front of the Eco R1 cloning site means that, when the DNA fragment is correctly oriented in the vector, an approximately 310bp Pst 1 fragment is produced, while an approximately 810bp fragment Fragment in the pattern of the Pst fragments is missing.
  • the plasmid map of the bicistronic antisense vector T814 is shown in FIG. 4.
  • Chondrosarcoma cells are of particular interest because they can serve as a model for joint diseases.
  • the adherently growing cells were grown in culture bottles (75cm 2 ) with 20ml Dulbecco's MOD Eagle Medium (DMEM with 4.5g glucose / L) and the following additives: 10% fetal calf serum, 200m L-glutamine, 5mM sodium pyruvate, 20mM hepespuffer pH 7 , 2, 0.02 ⁇ g / ml Hydrocortisone, 0.1 ⁇ g / ml insulin, 0.025 mg / ml ascorbic acid and 0.05 mg / ml gentamycin.
  • DMEM Dulbecco's MOD Eagle Medium
  • the transformed condrosarcoma cells were first checked over a period of 16-48 hours after transfection for the appearance of green fluorescence, which is caused by the expression of the green fluorescent protein GFP. Already after 16 hours, cells glowing green could follow Fluorescence excitation can be recognized, which increased significantly over a period of 20 h.
  • RNA samples were taken up in 30 ul RNase-free water and stored at -20 ° C. The analysis of the RNA was carried out with the aid of Northemblots (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecularbiology, Vol. 1-3, John Wiley and Sons, New York, 1997) using digoxygenin-labeled DNA probe. The DNA was labeled in a PCR reaction using the DIG Probe Synthesis Kits from Boehringer (Mannheim, Germany).
  • Figure 1 Schematic representation of the clones 283071, 43508, KiAA 0282, TTO20 / 2 and g 868629
  • MLP adenovirus major late promoter
  • TPL leader sequence "adenovirus major late” mRNA
  • IVS hybrid intron with splice point
  • EM C-L encephalomyocarditis
  • DHFR selection marker dihydrofolate reductase
  • polyA SV40 polyadenylation signal
  • VA I adenovirus VA I RNA gene.
  • FIG. 2 Schematic representation of plasmid T 782; Abbreviations see Fig. 2
  • FIG. 4 Schematic representation of plasmid T 814; Abbreviations see Fig. 2
  • TTO 20-2 gene from 1 to 3262

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Abstract

Die Erfindung betrifft den zellulären Regulationsfaktor TTO 20, DNA kodierend dafür, seine Herstellung und Verwendung, Antikörper bindend an TTO 20 sowie die Verwendung der DNA kodierend für TTO 20 und einen Antikörper bindend an TTO 20 zur Verwendung in einem Diagnostik-Kit zur Festellung von entzündlichen Erkrangungen, insbesondere rheumatoider Arthritis.

Description

Beschreibung
Neuer zellulärer Regulationsfaktor TTO 20
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den zellulären Regulationsfaktor TTO 20 und DNA, kodierend dafür, sowie seine Herstellung und Verwendung zu Screening- Zwecken zur Auffindung von Modulatoren für die TTO 20-Aktivität.
Einleitung
Zu den vielen biologischen Effekten von lnterleukin-1 (IL-1 ) gehört die Wirkung von IL-1 auf den Metabolismus vieler Zelltypen aus dem Bindegewebe. Ein Beispiel für solche Zellen sind artikulare Chondrozyten. 1L-1 inhibiert die Synthese von Proteoglykanen (PG) durch Chondrozyten und stimuliert die Produktion von Prostaglandin E2 und Metallo-Proteinasen, welche fähig sind, Moleküle der extrazellulären Matrix zu degradieren.
Aufgrund experimenteller Resultate sowie dem Auffinden von IL-1 , PG- Fragmenten und proteolytischen Enzymen in entzündlich veränderten Gelenken wurde geschlossen, daß IL-1 eine Rolle bei der Knorpeldegradation bei der Osteoarthrose und der rheumatischen Arthritis spielt (Beuton HP & Tyler JA, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 154, 421-428; Aydelotte MB et al. Comm. Tiss. Res. 28, 143- 159, Wood DD et al., Arthritis Rheum. 26, 975-983; Lohmander LS et al., Trans. Orthop. Res. Soc. 17, 273). Matrix-Metalloproteasen sind potentielle Kandidaten für Ansatzpunkte für eine Therapie mit Wirkstoffen, die mit diesen Enzymen interagieren, jedoch sind bislang noch keine konkreten molekularen Ansatzpunkte identifiziert worden, die sich auf frühe Schritte in dem komplexen Geschehen beziehen, welches zur Knorpeldegradation führt. Aus diesem Grunde hat man verschiedene Ansätze gewählt, um solche molekularen Ansatzpunkte für eine medikamentöse Therapie von Osteoarthrose und rheumatoider Arthritis zu erhalten. Ein solcher Ansatz ist in der europäischen Patentanmeldung EP 0 705 842 A2 beschrieben. Man ging dort der Frage nach, ob es möglich wäre, potentielle molekulare Ansatzpunkte für eine medikamentöse Therapie von IL-1 ß induziertem Knorpelabbau auf der RNA-Ebene bei menschlichen, artikularen Chondrozyten aus osteoarthritischem Knorpel zu erhalten.
Zu diesem Zwecke sollten Gene identifiziert werden, die differentiell in erkranktem Knorpel exprimiert werden. Es wurde Gesamt-RNA von 1L-1 ß stimulierten und nicht- stimulierten menschlichen Chondrozyten einem differentiellen Display von mRNA durch reverse Transkription und der Polymerasekettenreaktion (DDRT-PCR) unterworfen. Diese Methode kann zur Identifizierung und Isolierung von Genen verwendet werden, die in zwei Zellpopulationen unterschiedlich (differentiell) exprimiert sind (Liang P & Gardee AB 1992, Science 257, 967-971 ; Liang P et al., AB 1993, Nucl. Acids Res. 21 , 3269-3275; Bauer D et al. 1993, Nucl. Acids Res. 21 , 4272-4280). Das Schlüsselelement dieser Technologie ist die Benutzung eines Satzes von Oligonukleotid-Primem, von denen einer an den polyadenylierten Schwanz der mRNA bindet, die anderen hingegen Zufalls-Dekamere sind, die an verschiedenen anderen Stellen der mRNA binden. Solche mRNA Subpopulationen, die durch einen bestimmten Satz von Primen definiert sind, werden nach der reversen Transkription amplifiziert und auf DNA-Sequenzierungsgelen aufgetrennt. Es zeigen sich Bandenmuster, die charakteristisch für eine jede der studierten Zellinien sind. So sollten zum Beispiel 100 verschiedene Primer-Kombinationen 10000 verschiedene PCR-Produkte ergeben, welche immerhin ungefähr die Hälfte der überhaupt in einer Zellinie exprimierten Gene repräsentieren. Ein Vergleich der Bandenmuster zweier verschiedener Zellinien weist auf diejenigen Banden hin, die zu differentiell exprimierten Genen korrespondieren. Aufgrund dieser Information ist es nun möglich, Banden von differentiell exprimierten Genprodukten aus dem Gel zu extrahieren, zu reamplifizieren, zu subklonieren und zu sequenzieren.
Einschränkend ist jedoch zu sagen, daß diese Methode eine Reihe von Schwierigkeiten mit sich bringt: 1. Durch die hohe Sensitivität der DDRT-PCR können leicht artifizielle Banden entstehen.
2. Die Auswertung komplexer Genexpressionsmuster ist schwierig.
3. Als Ausgangsmaterial stehen nur winzige RNA-Mengen zur Verfügung.
Diese Schwierigkeiten bedingen einige Unsicherheit der erhaltenen Ergebnisse.
In der europäischen Patentanmeldung EP 0 705 842 A2 sind eine Reihe von kurzen DNA-Sequenzen offenbart, die auf oben beschriebene Weise identifiziert wurden. Eine Analyse der Sequenzen zeigte, daß einige von ihnen völlige oder sehr große Identität zu den Sequenzen bereits bekannter Gene hatten: so wurde ein cDNA- Fragment mit 100 %iger Identität zu menschlichem Osteopontin, ein anderes c-DNA- Fragment mit 97,2 %iger Identität zu menschlichem Calnexin, ein weiteres Fragment mit 99,5 %iger Identität zu menschlichem TNF- stimuliertem Gen 6 (TSG-6) gefunden. Die meisten der gefundenen Fragmente waren jedoch unter dem Gesichtspunkt der sie charakterisierenden Sequenz keinem bekannten Gen zuzuordnen. Zu dieser Gruppe von cDNA-Fragmenten zählt auch der 400 bp lange Klon TTO 20/2(2), von dessen DNA-Sequenz 152 bp entschlüsselt wurden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun der Klon TTO 20/2 näher untersucht. Ein Mittel zur Untersuchung der funktioneilen Bedeutung des korrespondierenden Gens bzw. Genprodukts sind sogenannte Antisense- Experimente.
Hinweise auf eine Rolle von TTO 20/2 lieferte die Expression von Antisense RNA in humanen Chondrosarcornzellen, die als Modellzellen für Knorpeldifferenzierung gelten. Der Antisense Ansatz beruht darauf, daß die kultivierten Zellen mit einem Vektor transformiert werden, der Antisense mRNA zu TTO 20 exprimiert, gleichzeitig aber auch ein Indikatorprotein, dessen Aktivität anzeigt, ob die Antisense RNA gebildet wurde. Derartige Vektoren werden bicistronische oder dicistronische Vektoren genannt. Ausgangsvektor für die vorliegenden Konstrukte war pED4, dessen Konstruktion von Kaufmann et al. beschrieben wurde (Kaufmann et al., 1991 , Nucl. Acids Res. 19, 4485-4490).
In der Antisensetechnologie wird über die Expression einer komplementären RNA (Antisense-RNA), die an die proteinkodierende mRNA (Sense-RNA) bindet, die Ausbildung eines funktionalen Proteins eingeschränkt oder sogar verhindert. Im besonderen kann, wie die vorliegenden Beispiele belegen, Antisense RNA zu Teilbereichen der kodierenden mRNA sowie zum 3' oder 5' untranslatierten Bereich eingesetzt werden, um die Bildung des Zielproteins zu verhindern. Mit Hilfe des Vektors können somit EST Fragmente, die keinen definierten offenen Leserahmen haben, genutzt werden, um die Wirkung des Proteins herauszuarbeiten, welches vom zugehörigen Gen letztlich kodiert wird, indem der "Antisense exprimierte" EST die Ablesung der kodierenden Sense - mRNA ausschaltet oder verringert. Spielt die so blockierte Synthese des Zielproteins eine wichtige Rolle in der Zelle, hat dies direkte oder indirekte Auswirkungen auf Zellteilung, Zellwachstum, Synthese regulierter, exprimierter Proteine etc. Behindert beispielsweise die Antisense Expression die Ausbildung eines Faktors, der in Signalkaskaden eine Rolle spielt, wird diese gestört.
Ist der Faktor ein Transkriptionsfaktor, wird die Expression mehrerer Gene gestört. Dies kann beispielsweise erkannt werden an morphologisch sichtbaren Veränderungen, die auf veränderte Expression sekretierter Proteine, besonders von Proteasen, zurückgeführt werden können.
Die so identifizierten Gene bzw. deren Produkte können als therapeutische Targets für die Suche nach pharmakologisch aktiven Stoffen eingesetzt werden. Ebenso können damit transformierte Zellen verwendet werden in Screening Systemen, indem versucht wird, die Wirkung der Antisense RNA zu blockieren. Die DNA Chip Technologie erlaubt die direkte Analyse solcher Änderungen, indem man die Transkriptprofile von transformierten mit untransformierten bzw. Mock- transformierten Zellen vergleicht. Der Vergleich läßt dann auch Rückschlüsse zu, ob ein EST im Rahmen eines Krankheitsbildes eine entscheidende Rolle spielt und sich somit als Screening Target eignet. Die Verwendung des Vektors ist somit auch zum Auffinden neuer Targets und zur Profilierung von neuen Medikamenten geeignet. Der Vektor ist insbesondere geeignet zum Aufbau von HTS-Systemen für die Targetvalidierung. Zweckmäßigerweise werden dazu EST Klone in HTS-Formaten wie 96 well Mikrotiterplatten angezüchtet, die Insert DNA mit geeigneten PCR Primern über PCR amplifiziert, die beispielsweise für eine Klonierung in einem der beschriebenen pED4-Derivate an der 3'-Seite eine PST-Schnittstelle und der 5'-Seite eine Eco Rl-Schnittstelle generieren. In einem zweiten Schritt werden die so genierten PCR-Fragmente mit Pstl und Eco Rl geschnitten und in den Vektor dicistronischen EGFP Vektor ligiert. Dabei bleibt das Screening Format erhalten. Der ligierte Vektor wird mit kommerziell erhältlichen Pipettierrobotern mit geeigneten Transfektionsagenzien wie CaP04, Fugene 6 (Hersteller: Boehringer, Mannheim; Lipofectamin, Life Technologies, Eggenstein) o.a. auf vorbereitete eukaryontische Zellen pipettiert und die Zellen nach gängigen Verfahren transformiert. Auch hier bleibt das Screening Format erhalten. Die Zellen werden in Gegenwart von C02 nach gängigen Verfahren bebrütet und nach 24 - 72 Stunden automatisiert in einen Fluoreszenz-Scanner auf die Fluoreszenzemmission hin geprüft. Wells mit transformierten, fluoreszierenden Zellen werden anschließend gegenüber transformierten Kontrollzellen, die mit dem Vektor ohne Pstl - Eco Rl Insert transfiziert wurden, ausgewertet auf Veränderungen im Wachstum sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, etc.Treten derartige Veränderungen auf, deutet dies auf eine essentielle Wirkung der exprimierten Antisense RNA hin. Die Isolierung der klonierten DNA und die anschließende Sequenzanalyse geben den Hinweis auf die Nukleotidsequenz und damit das beteiligte Gen bzw. das kodierte Protein. Auf diese Weise lassen sich erste funktioneile Hinweise für Genaktivitäten finden, deren Funktion durch das EST selbst nicht abgeleitet werden kann. Gegenstand der Erfindung ist daher das TTO 20-Protein enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 1.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für das genannte Protein, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend
(a) die DNA - Sequenz gemäß Tabelle 1 , insbesondere Nukleotide 1 bis 1305;
(b) eine DNA die wenigstens zu 80 % identisch zu einer DNA gemäß (a) ist; oder (c) eine DNA, die im Hinblick auf den genetischen Code zu den DNA's aus (a) und (b) degeneriert ist.
Ebenfalls ist Gegenstand der Erfindung ein Antikörper, der an das TTO 20-Protein bindet.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Expressionsvektor zur Expression der oben beschriebenen DNA und eine Wirtszelle transfiziert oder transformiert mit diesem Expressionsvektor.
Auch ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des TTO 20- Proteins, enthaltend die Schritte:
(a) Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des TTO 20-Proteins ermöglichen; und
(b) Isolierung des TTO 20-Proteins aus den Wirtszellen oder dem Kulturmedium,
und ein TTO 20-Protein erhältlich durch das beschriebene Verfahren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, Zellen oder Geweben, welche das TTO 20-Protein exprimieren, bei dem eine Nukleinsäuresonde benutzt wird, die mit einer RNA in einer biologischen Probe hybridisiert, die von einer DNA wie oben beschrieben abgeleitet wird.
Darüberhinaus ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der DNA kodierend für das TTO 20-Protein gemäß Tabelle 1 zur Komplettierung der DNA- und Proteinsequenz gemäß Tabelle 1 durch Hybridisierungs- und/oder PCR - Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des TTO 20-Proteins zur Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur und dem Design von Inhibitoren oder Aktivatoren des TTO 20 - Proteins. Ebenfalls ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von TTO 20 zum Auffinden von Modulatoren der TTO 20 - Aktivität.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, enthaltend einen
Antikörper wie oben beschrieben und ein Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, enthaltend eine oben beschriebene DNA.
Beispiel 1 : Identifizierung von cDNAs mit der TTO20/2 Sequenz
In der Europäischen Patentanmeldung EP 0 705 842 A2 wird die mit TTO20/2 bezeichnete Teilsequenz von 152 bp offengelegt. Um Informationen über die komplette klonierte Sequenz zu erhalten, wurde die gesamte DNA von TTO 20/2 mit Hilfe des SP 6 Primers sequenziert. Die Sequenzierreaktionen wurden nach der Kettenabbruch-DNA-Sequenziermethode durchgeführt wie sie bei Sanger et al. (Sanger, F. et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467) beschrieben wurde. Aus der Sequenzierung ergab sich eine Gesamtlänge für das klonierte Insert von 272 bp. Mit dieser Sequenz wurde eine Homologiesuche in der GenBank (NCBI) und der EMBL-Datenbank durchgeführt. Dazu wurden die BLAST und FASTA Algorithmen genutzt, die Bestandteil des GCG DNA-Analysepaketes der Genetics Computer Group, Madison, USA, sind.
Die Homologiesuche ergab signifikante Ähnlichkeiten zu zwei EST-Klonen in der öffentlichen Datenbank mit der Genbank Zugangsnummer M 51303 (Sequenz ID: g1192469) und der Zugangsnummer H 05077 (Sequenz ID: g868629). Die entsprechenden Klone mit der Klon-ID 283071 bzw. 43508 wurden bei der Firma Genome Systems, St. Louis, USA, bestellt und komplett durchsequenziert. Der Klon mit der Klon-ID 283071 zeigte das größte Insert von ca. 2580 bp, der Klon mit der ID 43508 ist mit einer Insertgröße von 2200 bp deutlich kleiner, weist aber 100%
Sequenzhomologie zum Klon 283071 auf. Die komplette Sequenz des Klons 283071 ist in der Tabelle 1 dargestellt und beginnt bei Nucleotid 706.
Beispiel 2: Identifizierung eines offenen Leserahmens
Mit Hilfe des Programms „Translate" aus dem GCG Analysepaket wurde die sequenzierte DNA des Klons 283071 auf das Vorkommen von offenen Leserahmen (ORF) hin untersucht. Danach befindet sich am 5'-Ende der Sequenz ein offener Leserahmen, der für 200 Aminosäuren kodiert. Dem Stopkodon TAA folgend findet sich eine ca. 1950 bp lange, untranslatierte Region, gefolgt von einem
Polyadenylierungssignal und endend mit einem Poly A Schwanz. Die Sequenz entspricht der in Tabelle 1 von Nukleotid 706 bis Nukleotid 3262 angegebenen Sequenz.
Mit der 5' gelegenen DNA-Sequenz sowie mit der Proteinsequenz, die der offene Leserahmen definiert, wurde in öffentlichen Datenbanken eine Homologiesuche durchgeführt. Diese ergab, daß der offene Leserahmen perfekt homolog ist zu einer 184 Aminosäuren kodierenden Sequenz, die auf einer cDNA namens KIAA0282 lokalisiert ist (Genbank Zugangsnummer: g87458). Die Homologie zu KIAA0282 bricht nach der Aminosäuresequenz LQTSEG abrupt ab und ist auf der
Nukleotidebene auf 552bp beschränkt. Der Leserahmen in Klon 283071 geht 15 Aminosäuren weiter und wird dann mit einem TAA Stopkodon beendet. Dem gegenüber geht der Leserahmen im KIAA0282 ORF 123 Aminosäuren weiter. Dieser Bereich sowie die komplette 3' untranslatierte Region von ca. 2000 bp des KIAA0282 Sequenz ist unterschiedlich zur Sequenz von Klon 283071. Zur Veranschaulichung siehe Figur 1.
Beispiel 3: Verifizierung der Verbindung vom 3'-Bereich von TTO20 mit dem 5'-Bereich von KIAA0282
Um zu belegen, daß der 5'-kodierende Bereich des ORFs von KIAA0282 mit dem 3'- Bereich von TTO20 verknüpft ist, wurden weitere öffentlich zugängliche EST-Klone sequenziert. Dazu gehören neben dem oben erwähnten Klon 43508 auch der Klon 47831 sowie der Klon 36563, die von der Firma Genome Systems erhältlich sind. Die Sequenzen belegen eindeutig die Korrektheit der für TTO20 bestimmten Sequenz.
Um den Zusammenhang zwischen dem 5'-Bereich von KIAA und dem 3'-Bereich von TTO20 mit einem unabhängigen Verfahren deutlich zu machen, wurde folgende PCR-Strategie gewählt. Aus dem 5'-Bereich von KIAA0282 wurden zwei Vorwärtsprimer abgeleitet. Primer 1 : 5'-CAACTCC TGTAT CACC-3' (SEQ ID NO.:1), Primer 2: 5'-AGTGCGATGTCTTCTACTG-3' (SEQ ID NO.: 2). Aus dem 3'-Bereich von Klon 283071 wurden die Rückwärtsprimer 3 und 4 abgeleitet. Primer 3: 5'- TCTAAAGGCAG GAGAGGAAC-3' (SEQ ID NO.: 3). Primer 4: 5'- TTCATGTGTCTTGCTTACTC-3' (SEQ ID NO.: 4). Bei einem zusammenhängenden Bereich müßte sich unter der Verwendung der Primer 1 und 4 ein 2097bp großes Fragment amplifizieren lassen, sowie mit dem Primerpaar 2 und 3 ein 1211 bp großes Fragment. Als Matrize wurden für die Polymerase-Kettenreaktion folgende cDNAs benutzt: Gehirn cDNA aus dem Multiple Tissue cDNA Panel Human 1 (Bestellnummer: K1420-1 , Firma Clontech, Heidelberg, Deutschland) sowie Fötale Gehirn cDNA aus der Human Fetal cDNA Panel (Bestellnummer: K1425-1 , Firma Clontech, Heidelberg, Deutschland). 0,5-1 μl Aliquots wurden in eine PCR-Reaktion mit dem Primerpaar 1 und 4 eingebracht. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der vom Hersteller der Enzyme empfohlenen Puffer wie folgt durchgeführt: Polymerasegemisch: 19 Anteile AmpliTaq DNA-Polymerase (Firma Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland) und 1 Teil pfu-Polymerase (Firma Stratagen, La Jolla, USA). Primerkonzentration: 10 pM. DNA Cycler (Perkin Eimer, Modell 480). PCR-Bedingungen für einen Zyklus: 94 °C, 2 Min.; 94°C, 30 Sek.; 59°C, 30 Sek.; 72°C, 30 Sek.; 72°C, 7 Min, Reaktionsvolumen: 50 μl. Nach 25-30 Zyklen wurde die Reaktion auf 4°C abgekühlt und das Reaktionsgemisch in einem 1 ,2
%igen Agarosegel analysiert. Sowohl aus der Gehirn cDNA wie auch aus der fötalen Gehirn cDNA konnte das entsprechende PCR-Fragment in der Größe von ca. 2100bp amplifiziert werden. Setzt man 0,5-1 μl aliquots dieser Proben in eine weitere, "nested" PCR-Reaktion ein unter Verwendung gleicher Bedingungen, aber mit den Primern 2 und 3, entsteht ein PCR-Fragment in der Größe von 1200bp. Dies zeigt eindeutig das Vorhandensein einer cDNA mit zusammengehörigen 5'-Bereich von KIAA0282 und dem 3'-Bereich von TTO20 an.
Zur weiteren Bestätigung wurde das 2100 bp große DNA-Fragment aus dem Agarosegel herausgeschnitten und die DNA elektrophoretisch eluiert (Ausubel et al.). Die eluierte DNA wurde in 10 μl sterilem Wasser aufgenommen und in den Vektor pCR2.1 gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Firma Invitrogen BV, Groningen, Holland) einkloniert. Die Klonierung der PCR-Fragmente erfolgte unter Zuhilfenahme des TA-Cloning-Kits des gleichen Herstellers unter Verwendung des vom Hersteller vorgegebenen Verfahrens.
Die Sequenzierung des klonierten DNA Fragments erfolgte nach der Kettenabruchmethode nach Sanger et al. unter Zuhilfenahme der Dye-Terminatoren und eines Sequenzierers Modell 377 (Firma Perkin Eimer, Langen, Deutschland). Die Sequenzierung bestätigt exakt den durch die PCR-Analyse erhaltenen Befund. Danach kann die in Tabelle 1 (Nukleotide 685 bis 3262) angegebene Sequenz 5'- seitig um die von KIAA0282 vorgegeben DNA-Sequenz erweitert werden. Die komplette Sequenz ist in Tabelle 1 (Nukleotide 1 bis 3262) wiedergegeben.
Beispiel 4: Funktionshinweise
Die Herkunft der ESTs aus verschiedenen Geweben deuten auf eine Beteiligung des exprimierten Gens bei entzündlichen Prozessen hin. Die RNA-Analysen (siehe EP-A 0 705 842) belegen eine mehr als vierfache Induktion der Expression des Gens in Interleukin 1 ß- stimulierten Chondrozyten. Aufgrund der bioinformatischen Analysen schlagen die Entdecker der cDNA für KIAA0282 eine Homologie des kodierten Proteins mit einem Zinkfingerprotein vor. Zinkfingerproteine können als Transkriptionsfaktoren wirken, spielen also eine essentielle Rolle bei der Regulation des Zellgeschehens. Um eine unmittelbare Information über eine mögliche Funktion von TTO20 zu erhalten, wurde ein Antisense Expressionsansatz mit einem Teilbereich der Sequenz (Nukleotid 705 - Nukleotid 3198 der Tabelle 1) gewählt. Dieser Bereich schließt sowohl einen Teil des kodierenden wie auch den nicht kodierenden 3'-Bereich der cDNA ein.
4. I . Konstruktion des Antisense Expressionsvektors
Als Ausgangsvektor wurde der dicistronische Vektor pED 4 gewählt (Fig. 2; Kaufman et al., Nucleic Acids Research 19, 448 - 4490 (1991)). Für diesen Vektor, dessen Konstruktion detailliert bei Kaufman et al. beschrieben und dessen Vorläuferplasmid pMT2 unter der Nr. ATCC 67122 bei der ATCC erhältlich ist, war bereits gezeigt worden, daß über das erste Cistron Antisense RNA exprimiert werden kann. Der Vektor enthält folgende Strukturelemente: Replikationsursprung für die Replikation in eukaryontischen Zellen, den SV40 Expressionsenhancer, den Adenovirus Major Late Promotor, die Leadersequenz des Adenovirus Major Late Messenger RNA, ein hybrides Intron mit Spleiß-Stelle, die Enzephalomyokarditis Virus Leadersequenz, den Selektionsmarker Dihydrofolatreduktase, das SV40 Polyadenelierungssignal, das Adenovirus V1 RNA-Gen, einen Replikationsursprung sowie einen Selektionsmarker für die Vermehrung des Vektors in rekombinantem E.coli. In einem ersten Schritt sollten nun der Selektionsmarker Dihydrofolatreduktase ausgetauscht werden gegen das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP). Die Expression des GFPs über das zweite Cistron dient somit bei transienten Expressionsexperimenten als sichtbares Maß für die Expression des Antisense Konstrukts.
Isolierte Plasmid DNA von pED4 wurde mit den Restriktionsendonukleasen Cla1 und Xho1 geschnitten. Für die Isolierung des Gens für GFP wurde DNA des kommerziell erhältliche Vektors pEGFP (Firma Clontech, Heidelberg, Deutschland) mit den Restriktionsenzymen Sah und Not1 geschnitten. Die DNA-Fragmente wurden geielektrophoretisch aufgetrennt. Da die singuläre Schnittstelle von Cla1 ca. 350bp nach der kodierenden Dihydrofolatreduktasesequenz im VA-Gen liegt, wird ein drittes Fragment zur Wiederherstellung des PolyA-Teils und des VA-Genabschnitts benötigt. Mittels PCR wurde ein DNA-Fragment aus dem Vektor pED4 amplifiziert, das am 5'-Ende über eine Not-Schnittstelle und am 3'-Ende über eine Cla- Schnittstelle verfügt und die noch fehlende Sequenz des PolyA-Teils und des VA- Gens beinhaltet. Verwendete Primer:
Vorwärtsprimer Not L:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCAGGAAGATGCTTTCAAGTTC-3' (SEQ ID NO.: 5)
Rückwärtsprimer Cla R:
5'-ACAGGCTCTCCTTTTGCAC-3' (SEQ ID NO.: 6)
Das PCR-Produkt wurde mit Not1 und Cla1 verdaut, geielektrophoretisch von Nukleotiden getrennt und isoliert. In äquimolarem Verhältnis wurden die drei Fragmente zusammenpipettiert, mit Puffer, ATP und T4-Ligase versetzt und ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli DH5 σ-Zellen transformiert und ausplattiert auf Ampicillin Selektionsplatten. Nach Isolierung der Plasmid-DNA aus Transformanden wurde über einen BamH1 Restriktionsverdau die DNAs auf ihre Fragmentgröße überprüft. Der Ursprungsvektor pED4 verfügt über drei BamH1 -Schnittstellen, die drei DNA-Fragmente von ca. 2950bp, 2190bp und 220bp Größe ergeben. Durch den Genaustausch verfügt der neue Vektor T782 über vier BamH1 -Schnittstellen, die bei einem BamHI-Verdau der Plasmid-DNA zu vier DNA-Fragmenten von ca. 2950bp, 1315bp, 1075bp und 220 bp führen. Die korrekte Sequenz des neu integrierten Indikatorgens wurde durch Sequenzierung abgesichert. Die Plasmidkarte des Vektors T782 ist in Figur 3 wiedergegeben. Für die Antisense Expression der RNA von TTO20 wurde mit Hilfe von PCR und entsprechenden Primern die TTO20-Sequenz amplifiziert und über die Eco R1- Schnittstelle in den GFP-Vektor T782 einkloniert.
Verwendete Primer:
Vorwärtsprimer: 5'-GGAATTCGATCAGATCTCTCACTGCAC-3' (SEQ ID NO.: 7)
Rückwärtsprimer: 5'-GGAATTCACTTCTGTGCAGTAACAGAG-3' (SEQ ID NO.: 8)
Das entstehende, ca. 2500bp große Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym Eco R1 komplett verdaut, geielektrophoretisch aufgetrennt und isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den ebenfalls mit Eco R1 geschnittenen GFP-Vektor einkloniert. Um sicherzustellen, daß das einklonierte Fragment in Antisenserichtung einkloniert wurde, wurden verschiedene rekombinante Klone nach Transformation von E.coli DH5 a mit dem Restriktionsenzym Pstl geschnitten und die Fragmente geielektrophoretisch analysiert. Dadurch, daß vor der Eco R1-Klonierungsstelle über den Vektor eine singuläre Pstl -Schnittstelle zur Verfügung gestellt wird, entsteht bei korrekter Orientierung des DNA-Fragments in dem Vektor zusätzlich ein ca. 310bp großes Pst 1 -Fragment, während ein ca. 810bp großes Fragment im Muster der Pst- Fragmente fehlt. Die Plasmidkarte des bicistronischen Antisense-Vektors T814 ist in Fig. 4 wiedergegeben.
4.2. Transfektion von humanen Chondrosarkomzellen mit dem Antisense-Vektor
Chondrosarkomzellen sind deshalb von besonderem Interesse, weil sie als Modell für Gelenkserkrankungen dienen können. Die adhärent wachsenden Zellen wurden in Kulturflaschen (75cm2) mit 20ml Dulbecco's MOD Eagle Medium (DMEM mit 4,5g Glukose/L) und folgenden Zusätzen angezogen: 10% fötales Kälberserum, 200 m L-Glutamin, 5mM Natriumpyruvat, 20mM Hepespuffer pH 7,2, 0,02 μg/ml Hydrokortison, 0,1 μg/ml Insulin, 0,025 mg/ml Ascorbinsäure und 0,05mg/ml Gentamycin. Alle 3-4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinierung von den Kulturflaschen abgelöst, in 10ml frischen Kulturmedium aufgenommen, durch Zentrifugation vom Trypsin befreit, im Verhältnis 1 :5 - 1 :10 verdünnt und neu ausgesät. Zur Trypsinierung wurde Trypsin/EDTA in einer Konzentration von 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA benutzt. 1 ml dieser Lösung blieb für 2-5 Minuten bei 37°C auf den Zellen. Die Stammkultur von Chondrosarkomzellen war in 10% DMSO und 90% des Kulturmediums bei -80°C eingelagert. Für die Transfektion von DNA in Chondrosarkomzellen wurden verschieden Methoden ausgetestet, darunter die Calciumphosphatmethode, die DEAE-
Dextranmethode, Liposomen vermittelte Transfektionsmethoden, Verwendung aktivierter Dendrimere, und Elektroporation. Die besten Transfektionsraten wurden erreicht, wenn das Transfektionsagenz Fugene 6 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) verwendet wurde.
Zwischen 2 x 105 und 4 x 105-Zellen wurden in jeweils 1 Well einer 6-Well- Zellkulturplatte eingesät (Firma Bekton & Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Die Zellen befanden sich in ca. 2ml Nährlösung. Jeweils 0,5 - 2 μg isolierte und mit Hilfe des Qiafilter Plasmid Midikit (Firma Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigte DNA wurden für die Transfektion eingesetzt. Dazu wurden die Zellen zunächst bei 37°C in einem Brutschrank mit 5% C02 für 18 - 24 h inkubiert. Die Zellen sollten zu 50 - 80% konfluent gewachsen sein. Beste Transfektionsraten erreicht man, wenn man 4 x 105 Zellen/Well einsät, 2 μg DNA und 6 μl Fugene/100 μl serumfreiem Medium verwendet. Die Transfektion wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
4.3. Antisenseexpression in Chondrosarkomzellen
Die transformierten Kondrosarkomzellen wurden über einen Zeitraum von 16 - 48 Stunden nach Transfektion zunächst auf die Erscheinung der grünen Fluoreszenz, die durch die Expression des grün floureszenten Proteins GFP zustande kommt, hin überprüft. Bereits nach 16 Stunden konnten grün leuchtende Zellen nach Fluoreszenzanregung erkannt werden, die sich über einen Zeitraum von 20 h deutlich verstärkte.
Zum Nachweis der gebildeten Antisense RNA wurden Zellen von jeweils zwei Wells einer 6-Well-Platte verwendet. Für die Isolierung der RNA wurde ein RNeasy Miniprep Kit der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Die RNA-Proben wurden in 30 μl RNase-freiem Wasser aufgenommen und bei -20°C aufbewahrt. Die Analyse der RNA erfolgte mit Hilfe von Northemblots (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecularbiology, Vol. 1- 3, John Wiley und Sons, New York, 1997) unter Verwendung von Digoxygenin- markierter DNA-Sonde. Die Markierung der DNA wurde in einer PCR-Reaktion mittels der DIG Probe Synthesis Kits der Firma Boehringer (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Als Matrize diente das zuvor gereinigte, von den Nukleotiden befreite PCR-Fragment mit dem ca. 2,5 kb großen TTO20 Anteil. Bei Hybridisierung mit dieser Sonde wird zeitabhängig deutlich die Expression der Antisense RNA in den transferierten Chondrosarkomzellen sichtbar.
Gegenüber nichttransformierten Chondrosarkomzellen ist die Zellform der transformierten Zellen nicht deutlich verändert. Jedoch ist eine ungleiche Verteilung der GFP-Floureszenz gegenüber einer Kontrolltransfektion sichtbar, die mit einem entsprechenden Vektor, der anstelle TTO20 Antisense die Antisense RNA von Cofilin, einem Cytoskelett regulierenden Protein.durchgeführt wurde. Die fleckenhafte Fluoreszenzverteiiung läßt vermuten, daß das Cytoskelett der Zellen gegenüber den Kontrollen verändert ist. Dies weist auf eine direkte Funktion der exprimierten Antisense RNA auf die Unterdrückung des von TTO20 gebildeten Proteins hin. Figurenlegende:
Figur 1 : Schematische Darstellung der Klone 283071 , 43508, KiAA 0282, TTO20/2 und g 868629
Figur 2: Schematische Darstellung des Plasmids pED4; Abkürzungen: SV40 =
SV40 Enhancer und Ursprung der Replikation; MLP = Adenovirus "Major Late" Promotor; TPL = Leadersequenz "Adenovirus Major Late" mRNA; IVS = hybrides Intron mit Spleißstelle; EM C-L = Encephalomyocarditis
Leadersequenz; DHFR = Selektionsmarker Dihydrofolatreduktase; polyA = SV40 Polyadenylierungssignal; VA I = Adenovirus VA I RNA-Gen.
Figur 3: Schematische Darstellung des Plasmids T 782; Abkürzungen siehe Fig. 2
Figur 4: Schematische Darstellung des Plasmids T 814; Abkürzungen siehe Fig. 2
Tabelle 1:
TTO 20-2 Gen von 1 bis 3262
1 GCCCTGGCCCCGGTGCCCCGCAACTCCTGTATCACCTGCCCCCAGTGTCACCGCAGCCTC 1 A A P V P R N S C I T C P Q C H R S 61 ATCCTGGATGACCGGGGGCTCCGCGGCTTCCCCAAGAATCGCGTACTGGAAGGGGTAATT
21 I L D D R G I- R G F P K N R V E G V I 121 GACCGCTACCAGCAGAGCAAAGCCGCGGCCCTCAAGTGCCAGCTCTGCGAGAAGGCGCCC
41 D R Y Q Q S K A A A L K C Q L C E K A P 181 AAGGAAGCCACCGTCATGTGCGAACAGTGCGATGTCTTCTACTGCGATCCGTGCCGCCTG - 61 K E A T V M C E Q C D V F Y C D P C R L
241 CGCTGCCACCCGCCCCGGGGGCCCCTAGCCAAGCACCGCCTGGTGCCCCCGGCCCAGGGT
81 R C H P P R G P L A K H R V P P A Q G
301 CGTGTGAGCCGGAGGCTGAGCCCACGCAAGGTCTCCACCTGCACAGACCACGAGCTGGAG 101 R V S R R L S P R K V S T C T D H E E 361 AACCACAGCATGTACTGCGTGCAATGCAAGATGCCCGTGTGCTACCAGTGCTTGGAGGAG 121 N H S M Y C V Q C K M P V C Y Q C E E 21 GGCAAACACTCCAGCCACGAAGTCAAGGCTCTGGGGGCCATGTGGAAACTACATAAGAGC
141 G K H S S H E V K A L G A W K I- H K S
481 CAσCTCTCCCAGGCGCTGAACGGACTGTCAGACAGGGCCAAAGAAGCCAAGGAσTTTCTG 161 Q S Q A L N G L S D R A K E A K E F L
541 GTACAGCTGCGCAACATGGTCCAGCAGATCCAGGAGAACAGTGTGGAGTTTGAAGCCTGT 181 V Q L R N V Q Q I Q E N S V E F E A C
601 CTGGTGGCCCAATGTGATGCCCTCATCGATGCCCTCAACAGAAGAAAAGCCCAGCTGCTG 201 L V A Q- C D A L I D A I- N R R K A Q I- I- 661 GCCCGCGTCAACAAσGAGCATGAGCACAAGCTGAAGGTGGTTCGAGATCAGATCTCTCAC 221 A R V N K E H E H K L K V V R D Q I S H 721 TGCACAGTGAAATTGCGCCAGACCACAGGTCTCATGGAGTACTGCTTGGAGGTGATTAAG 241 C T V K R Q T T G M E Y C L E V I K 781 GAAAATGATCCTAGTGGTTTTTTGCAGATTTCTGACGCCCTCATAAGAAGAGTGCACCTG 261 E N D P S G F L Q I S D A L I R R V H L 841 ACTGAGGATCAGTGGGGTAAAGGCACACTCACTCCAAGGATGACCACGGACTTTGACTTG 281 T E D Q W G K G T L T P R M T T D F D 901 AGTCTGGACAACAGCCCTCTGCTGCAATCCATCCACCAGCTGGATTTCGTGCAAGTGAAA 301 S L D N S P I- L Q S I H Q --- D F V Q V K 961 GCTTCCTCTCCAGTCCCAGCAACCCCTATCCTACAGCTGGAGGAATGTTGTACCCACAAC 321 A S S P V P A T P I I- Q L E E C C T H N 1021 AACAGCGCTACGTTGTCCTGGAAACAGCCACCTCTGTCCACGGTGCCCGCCGATGGATAC 341 N S A T L S W K Q P P L S T V P A D G Y 1081 ATTCTGGAGCTGGATGATGGCAACGGTGGTCAATTCCGGGAGGTGTATGTGGGGAAGGAG
361 I I- E L D D G N G G Q F R E V Y V G K E 1141 ACAATGTGCACTGTGGATGGTCTTCACTTCAACAGCACATACAACGCTCGGGTCAAGGCC 381 T M C T V D G H F N S T Y N A R V K A
1201 TTCAACAAAACAGGAGTCAGCCCGTACAGCAAGACCCTGGTCCTCCAAACGTCTGAGGGT 401 F N K T G V S P Y S K T L V L Q T S E G
1261 AAGGCCCTTCAGCAGTATCCCTCAGAGCGAGAACTGCGTGGCATCTAAAGTGGCTGGCAA 421 K A Q Q Y P S E R E R G I * (SEQ ID NO.: 10) 1321 GCCCGGAGGTAACCCCACCACTGCCCACATTCCTGAAGTGTTTCCATGACTTGCTCTGCA
1381 TTCTGCACAGAGCCGCTGTTCCTCTCCTGCCTTTAGAGAGCCTATGGTATGTGGATGTGA 1441 TCAAACCAAAGATTCCACATCGGCAGTTCCAATGGCTTGGGCCGGCGGCTTCCTTTGATA
1501 ACAATCTAAATAAGCTGCAGTTGAAGAAGCTGAAAAATGAAGGCCTGAATGTσCCCCTGG 1561 TGTGTAAGACAAATGTATCTAGGCTCTAGAGCAGGCTCCCATTCTCCACCGATACACATC 1621 ATGTGCCAGTTTTGCCCAGATGATTCTAAATTACTCTGTAGTACTTGCTTGTTCTGAGGG 1681 TGGGACCTAGGTTCTTTCCAGTCGTGGATTTGTATGACTGAATGTGTTTCAAATGGGTGG 1741 TGGGGTGCTAGAGCTGTTTAGAGAGGGCCTGTTGGCTGCTCCTGGCTTACCCACTTAGAC
1801 TGCCTCCGTTTCATACCCAAAGCGGAGGCCGTCAGCACCAGGATTGAGACTTCCTGTGGG
1861 CACCAAACAGGAAGAGACCAGCAACTTCGCATTACCCGCCATTTTCATCTTTGCCAGTCC 1921 CTTCAGTCTTGGCTAGGCTACCGAGAGCCACCATACAAGGTTCATCTCTAGAGAATTTTT
1981 GCTTCTTAGCTATACTTTAAATATTTTGGTCATCAAAGACAAGTAATGTGTCTCAGATGA
2041 GAGGCTTGAATTTGATGGCCAGATATAACCTCTGAGGCTTTTAACATTTTCATTTTAAGA 2101 GTAAGCAAGACACATGAAATTAAACCTACAAGGAGGTATTTGTGGCTGGTGCCAAAGCAT 2161 TCTGACACTTTGGGGTGTCATTTTAATCAAAGAAATCACCCCCCCACCTCACCGGGATTC
2221 TCCATAACTTCCCTCTGCAGAACTAATTATGTTGATTTTGTTCAAGTTCAAGATGTTAGC 2281 TAAAAGAACTATGGTGGTGTTTTTTTTCCCACTTCCCACAAACCTCAACATGTGCCAGTC 2341 ACCCTAAAATGCTTCACATGGTTAAAAACAAGCACAATTTTGAATCCTACAGCAAGGATG 2401 AAAGGCCCCTAGCCGTGAAAACAGTGCTTTGGGGAGCAGTTGTCAGTCTAAGTGATGCTA 2461 TTCCAAGAGAAGGATATGCTGAGGGAAAATGCCCACATGACCTGTTCCCATTTGGAGTAC
2521 AGTGATGTGGTAGCTACAGCTTCCCCCAGAATTATCATTTTAGCACCTTCTCTCAGGGAT 2581 GACCTATCAGTTTGAGAGCAGTTGCCTCTTTTCTCAAAATACCATACTAACTGCTAAAGC 2641 CCTCCAAGAGTCTTTCCTAGATGCAACGCAGAAGGCCCTTGCTGGTGATGGCCTCATTTC 2701 CCATGTGTGTACAAGGTGGTTTGATTGAAGAGTGAAGTGCATGCCTGCAGAGCAGAGAGA 2761 AATTTGTAGCAATGTTGCTAATATGTGTTATCAGATCTGCGGGAAAACTATTTCTATTCA
2821 TAATACATCATGGGAATCATACTATTCTGGTAAAAATCAGTTATTAGCATAACAGCCTGA
2881 GCACTTATGTCTCTCGTTTCATCCTGCAGGAGGATGTAGCGCCTCAGTTTATTTTAATGT 2941 TCATAAGATTATGGTGTCTAATTTAATAAATTACAGGATTGGAACTGCGATCCTTGGTAC
3001 CACAGTCACAGAACTGGGGGTCATTTTCTAGATGAAACAAACGGAACAAGTTCTCTTCCA 3061 ACAAAGAAACTGTACTGTAGAAATTAATTTCCTCCATGAATTTTATATATTGTGTACAAA
3121 TATAAGGTATGTATCTGAATACAAAGAAAAGCCTATCATCATATAGATATCAGTATTCTC 3181 TGTTACTGCACAGAAGTAATTTTCTCATGATGAAATAAAGTTCACACACATACTTTCTCC 3241 ATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3262 (SEQ ID NO.: 9)

Claims

Patentansprüche:
1. TTO 20-Protein enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 1 (SEQ ID NO.: 10).
2. DNA, kodierend für das Protein nach Anspruch 1 , ausgewählt aus der Gruppe enthaltend
(a) die DNA - Sequenz gemäß Tabelle 1 (SEQ ID NO.: 9), insbesondere Nukleotide 1 bis 1305; (b) eine DNA die wenigstens zu 80 % identisch zu einer DNA gemäß (a) ist; oder
(c) eine DNA, die im Hinblick auf den genetischen Code zu den DNA's aus (a) und (b) degeneriert ist.
3. Antikörper, der an das Protein nach Anspruch 1 bindet.
4. Expressionsvektor zur Expression einer DNA gemäß Anspruch 2.
5. Wirtszelle transfiziert oder transformiert mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 4.
6. Verfahren zur Herstellung des TTO 20-Proteins gemäß Anspruch 1 , enthaltend die Schritte:
(a) Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des TTO 020-Proteins ermöglichen; und
(b) Isolierung des TTO 20-Proteins aus den Wirtszellen oder dem Kulturmedium.
7. TTO 20-Protein gemäß Anspruch 1 , erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6.
8. Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, Zellen oder Geweben, welche das TTO 20-Protein gemäß Anspruch 1 exprimieren, bei dem eine
Nukleinsäuresonde benutzt wird, die mit einer RNA in einer biologischen Probe hybridisiert, die von einer DNA gemäß Anspruch 2 abgeleitet wird.
9. Verwendung der DNA gemäß Anspruch 2 (a) zur Komplettierung der DNA- und Proteinsequenz gemäß Tabelle 1 durch Hybridisierungs- und/oder PCR-
Verfahren.
10. Verwendung des TTO 20-Proteins gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur und dem Design von Inhibitoren oder Aktivatoren des TTO-20- Proteins.
11. Verwendung des TTO 20 Proteins gemäß Anspruch 1 zum Auffinden von Substanzen, welche die Aktivität von TTO 20 beeinflussen.
12. Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, enthaltend einen Antikörper gemäß Anspruch 3.
13. Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, enthaltend eine DNA gemäß Anspruch
2.
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