EP1176190A1 - Milieux de culture cellulaire, notamment pour fécondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons. - Google Patents

Milieux de culture cellulaire, notamment pour fécondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons. Download PDF

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EP1176190A1 EP01401958A EP01401958A EP1176190A1 EP 1176190 A1 EP1176190 A1 EP 1176190A1 EP 01401958 A EP01401958 A EP 01401958A EP 01401958 A EP01401958 A EP 01401958A EP 1176190 A1 EP1176190 A1 EP 1176190A1
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embryos
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cells
vitro
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    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones

Definitions

  • compositions which can be used as cell culture media, in particular for follicles under development or for the maturation of cells of the male germ line, as well as for in vitro fertilization and the development of embryos, and more particularly mammalian embryos, in particular human embryos, possibly frozen.
  • ovulation allows the oocyte to pass into the fallopian tube to be eventually fertilized.
  • the embryo that results stay there 3 to 5 days to develop and reach the morula stages, then blastocyst.
  • the gametes, the embryo, the morula, then the blastocyst are surrounded by tubal fluid.
  • the composition of the latter is complex: it combines the fundamental components of the mother's inner environment with those of the liquid follicular, and it does not appear to undergo significant qualitative changes during of the first days of the post-ovulatory phase.
  • the embryo passes into the uterus, the mucosa of which has then reached a favorable state of development for implantation and implantation of the egg.
  • the passage of the embryo into the uterus takes place only when both are reached the level of physiological development compatible with implantation and implantation: blastocyst stage for the embryo, endometrium close to its secretory phase for the uterus.
  • the present invention follows from the discovery by the inventors of constant compositions which can be used for the cultivation of follicles or cells of the male germ line, only for oocyte fertilization and development from the embryo to the blastocyst stage, with comparable yields or even superior to those obtained with the compositions currently on the market.
  • compositions for the in vitro culture of cells characterized in that they comprise at least two growth factors (also designated GF, growth factors ), such as recombinant human growth factors, advantageously in combination with at least one compound from the family of corticoids involved in energy production in mammals, and more particularly from the family of glucocorticoids, such as hydrocortisone or a derivative of the same family, preferably in a form soluble in aqueous medium , and, where appropriate, in combination with at least one key coenzyme of energy metabolism, such as NAD / NADH and NADP / NADPH.
  • growth factors also designated GF, growth factors
  • recombinant human growth factors advantageously in combination with at least one compound from the family of corticoids involved in energy production in mammals, and more particularly from the family of glucocorticoids, such as hydrocortisone or a derivative of the same family, preferably in a form soluble in aqueous medium , and, where appropriate, in combination with at least one key coenzyme
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned compositions for the in vitro culture of follicles under development with a view to the maturation of the oocytes contained in said follicles, or for the maturation of cells of the male germ line, or for fertilization in vitro oocytes by spermatozoa, or for embryo culture, possibly after thawing of follicles, male cells, or embryos.
  • the growth factors contained in the compositions of the invention belong to 5 families of cytokines. Hormones and growth are present at balanced concentrations, compatible with physiological conditions.
  • the compositions of the invention provide the cells with growth and differentiation of the regulatory molecules which they imperatively have need.
  • these compositions are capable of allowing the maturation of immature human oocytes grown in the presence of follicular cells, as well as maturation of cells of the male germ line. They can also provide development of the human embryo up to the blastocyst stage. However, this stage has a plus high percentage of implantation in the uterus only when the embryo is transferred at a less advanced stage, especially at stages of two to about eight cells.
  • compositions of the invention contain at least three growth factors chosen from those listed above.
  • compositions contain at least IGF-1 and / or IGF-2.
  • compositions of the invention include all of the above growth factors.
  • the concentrations of growth and differentiation factors in the above-mentioned compositions of the invention are nanomolar, and advantageously between approximately 0.25 ⁇ g / L and approximately 60 ⁇ g / L, in particular between about 0.5 ⁇ g / L and about 50 ⁇ g / L.
  • a subject of the invention is also the above-mentioned compositions for in vitro culture, comprising a compound of the family of corticoids as defined above, and preferably hydrocortisone.
  • the above-mentioned hydrocortisone is in the form of a water-soluble salt, in particular in the form of hydrocortisone hemisuccinate.
  • concentration of the hydrocortisone salt in the abovementioned compositions is between approximately 5 ⁇ 10 -7 M and approximately 10 -6 M, and is in particular approximately 7 ⁇ 10 -7 M, ie approximately 350 ⁇ g / L for hydrocortisone hemisuccinate.
  • the invention also relates to the compositions defined above which are in the form of lyophilisate, namely in the form of compositions of which the various constituents are brought to the dry state, and are liable to be redissolved in keeping their physico-chemical and biological properties.
  • a subject of the invention is also the application of the above-mentioned compositions or lyophilisates, as effector adjuvants for the preparation of culture media in vitro for follicles under development with a view to the maturation of the oocytes contained in said follicles, or for the maturation of cells of the male germ line, or for the in vitro fertilization of oocytes by sperm, or for the culture of embryos, optionally after thawing of follicles, male cells, or embryos, said culture media in vitro comprising a composition as defined above, in combination with the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos, said elements being chosen in particular from human serum albumin, or bovine, optionally recombinant, and / or mineral salts, and / or energy molecules such as glucose, pyruvate, and lactate, and / or amino acids for protein biosynthesis, and / or purine and
  • the invention also relates to a process for preparing in vitro culture media defined above, characterized in that it comprises a step of mixing a composition as defined above, where appropriate after dissolution in a volume appropriate of a composition mentioned above in the form of lyophilisate, with a solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos, said elements being as defined above .
  • a more particular subject of the invention is the in vitro culture media for follicles under development for the maturation of oocytes contained in said follicles, or for the maturation of cells of the male germ line, or for in vitro fertilization oocytes by spermatozoa, or for the cultivation of embryos, possibly after thawing of follicles, male cells, or embryos, said media being as obtained by implementing a process mentioned above, and being characterized in that they comprise a composition as defined above, in combination with the aforementioned elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos.
  • the invention also relates to a process for developing mammalian embryos, and more particularly human embryos, where appropriate after thawing of previously frozen embryos, characterized in that it comprises a step of culturing said in vitro cultures embryos, in a culture medium as defined above according to the invention, preferably during the first 6 days following in vitro fertilization , if appropriate after thawing, advantageously so as to obtain embryos at the blastocyst stage.
  • the subject of the invention is also a method of maturing mammalian follicles during development with a view to the maturation of oocytes contained in said follicles, and more particularly of human follicles, where appropriate after thawing of previously frozen follicles, characterized in what it includes a step of in vitro culture of follicles taken from the female, and more particularly from the woman, in a culture medium as defined above according to the invention, advantageously for approximately 3 days to approximately 6 days.
  • the invention also relates to a method for maturing cells of the male germ line of mammals, and more particularly human, if appropriate after thawing of previously frozen cells, characterized in that it comprises a step of culturing said cells in vitro. cells, in a culture medium as defined above according to the invention, advantageously for approximately 3 days to approximately 5 days.
  • the subject of the invention is also a method of in vitro fertilization of oocytes by spermatozoa, and more particularly of oocytes and spermatozoa of human origin, where appropriate after thawing of the previously frozen sperm, characterized in that it comprises a step of in vitro culture of the abovementioned oocytes and spermatozoa, in a culture medium as defined above according to the invention, advantageously for approximately 2 days to approximately 6 days.
  • compositions of the invention can be used both for the maturation of oocytes or that of cells of the male germ line, the in vitro fertilization of oocytes, and the maturation of embryos resulting from said fertilization, in particular up to blastocyst stage, possibly after thawing of follicles, male cells, or embryos.
  • An aqueous solution prepared extemporaneously containing hemisuccinate hydrocortisone and growth factors is distributed in 1ml vials, such that each vial contains 3.5 ⁇ g hydrocortisone hemisuccinate, 500 ng of EGF, 250 ng of TGF ⁇ , 500 ng of HGF, 12.5 ng of GM-CSF, 50 ng of GDF-9, 10 ⁇ g of NAD / NADH and 10 ⁇ g of NADP / NADPH.
  • the bottles are immediately lyophilized. Store the lyophilisate at + 4 ° C.
  • IGF-1 and IGF-2 are added to the initial solution containing the other constituents from bottle B, to obtain 125 ng of each per bottle, then the whole is freeze-dried.
  • a first step an experimental batch of medium containing the glucocorticoid and growth factors was prepared.
  • This culture medium was consisting of Upgraded B9 medium supplemented only with human insulin, hydrocortisone hemisuccinate, human EGF, TGF ⁇ , and IGF-1.

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Abstract

L'invention concerne des compositions pour la fécondation in vitro, ou pour la culture in vitro de follicules, de cellules germinales mâles, ou d'embryons, lesdites compositions comprenant au moins deux facteurs de croissance en association avec un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères. L'invention concerne également les milieux de culture obtenus à l'aide de ces compositions, ces dernières étant avantageusement sous forme de lyophilisat. L'invention a également pour objet des procédés de fécondation in vitro et des procédés de maturation de follicules, de cellules germinales mâles, ou d'embryons utilisant de tels milieux de culture, ainsi que des kits pour la mise en oeuvre de ces procédés et comprenant un lyophilisat susmentionné et une solution aqueuse, éventuellement commerciale, contenant les autres constituants desdits milieux de culture.

Description

La présente invention a pour objet des compositions utilisables en tant que milieux de culture cellulaire, notamment pour follicules en cours de développement ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la fécondation in vitro et le développement d'embryons, et plus particulièrement d'embryons de mammifères, notamment d'embryons humains, éventuellement congelés.
Après maturation du follicule de De Graaf, l'ovulation permet à l'ovocyte de passer dans la trompe de Fallope pour y être éventuellement fécondé. L'embryon qui en résulte y demeure 3 à 5 jours pour se développer et atteindre les stades morula, puis blastocyste.
Dans la trompe, les gamètes, l'embryon, la morula, puis le blastocyste sont environnés par le fluide tubaire. La composition de ce dernier est complexe : elle associe les composants fondamentaux du milieu intérieur de la mère à ceux du liquide folliculaire, et elle ne semble pas subir d'importants changements qualitatifs au cours des premiers jours de la phase post-ovulatoire. Parvenu au stade blastocyste, l'embryon passe dans l'utérus dont la muqueuse a alors atteint un état de développement favorable pour l'implantation et la nidation de l'oeuf.
Le passage de l'embryon dans l'utérus ne s'effectue que lorsque l'un et l'autre sont parvenus au niveau de développement physiologique compatible avec l'implantation et la nidation : stade blastocyste pour l'embryon, endomètre proche de sa phase sécrétoire pour l'utérus.
Dans le cas de l'assistance médicale à la procréation, ces conditions physiologiques suggèrent un milieu de culture unique et constant, et non pas séquentiel comme il en existe actuellement, associant tous les éléments nécessaires au développement, de la fécondation in vitro, éventuellement consécutive à l'ICSI (intra cytoplasmic sperm injection, ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes), jusqu'au transfert de l'embryon.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de compositions constantes utilisables aussi bien pour la culture de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon jusqu'au stade blastocyste, et ce avec des rendements comparables, voire supérieurs, à ceux obtenus avec les compositions actuellement sur le marché.
La présente invention a pour objet des compositions pour la culture in vitro de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux facteurs de croissance (encore désignés GF, growth factors), tels que des facteurs de croissance humains recombinants, avantageusement en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et plus particulièrement de la famille des glucocorticoïdes, tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de la même famille, de préférence sous une forme soluble en milieu aqueux, et, le cas échéant, en association avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
L'invention a plus particulièrement pour objet des compositions susmentionnées pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons.
Avantageusement, les facteurs de croissance contenus dans les compositions de l'invention appartiennent à 5 familles de cytokines. Les hormones et les facteurs de croissance sont présents à des concentrations équilibrées, compatibles avec les conditions physiologiques. Les compositions de l'invention apportent aux cellules en croissance et en différenciation les molécules régulatrices dont elles ont impérativement besoin. Ainsi, ces compositions sont susceptibles de permettre la maturation des ovocytes humains immatures cultivés en présence de cellules folliculaires, ainsi que la maturation des cellules de la lignée germinale mâle. Elles peuvent aussi assurer le développement de l'embryon humain jusqu'au stade blastocyste. Or, ce stade a un plus fort pourcentage d'implantation dans l'utérus que lorsque le transfert de l'embryon a lieu à un stade moins avancé, notamment aux stades de deux à environ huit cellules.
L'invention a plus particulièrement pour objet les compositions susmentionnées comprenant au moins deux facteurs de croissance choisis parmi :
  • le facteur de croissance hépatique, encore désigné HGF (hepatocyte growth factor),
  • le facteur de croissance de transformation α, encore désigné TGFα (transforming growth factor),
  • le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor),
  • le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF (epidermal growth factor) et/ou HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor),
  • les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF (growth differenciation factors), tels que le GDF-9,
  • les facteurs de croissance semblables-à-l'insuline, encore désignés IGF (insuline-like growth factors), tels que l'IGF-1 et/ou l'IGF-2.
Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent au moins trois facteurs de croissance choisis parmi ceux listés ci-dessus.
Des compositions particulièrement préférées contiennent au moins de l'IGF-1 et/ou de l'IGF-2.
De préférence encore, les compositions susmentionnées de l'invention comprennent tous les facteurs de croissance susmentionnés.
De préférence, les concentrations en facteurs de croissance et de différenciation dans les compositions susmentionnées de l'invention sont nanomolaires, et avantageusement comprises entre environ 0,25 µg/L et environ 60 µg/L, notamment entre environ 0,5 µg/L et environ 50 µg/L.
Avantageusement les concentrations des facteurs de croissance et de différenciation contenus dans les compositions de l'invention sont telles que :
  • la concentration d'EGF est d'environ 40 µg/L à environ 60 µg/L, notamment d'environ 50 µg/L,
  • la concentration de TGFα est d'environ 20 µg/L à environ 30 µg/L, notamment d'environ 25 µg/L,
  • la concentration d'HGF est d'environ 40 µg/L à environ 60 µg/L, notamment d'environ 50 µg/L,
  • la concentration de GM-CSF est d'environ 1,25 µg/L à environ 1,75 µg/L, notamment d'environ 1,5 µg/L,
  • la concentration de GDF-9 est d'environ 4 µg/L à environ 6 µg/L, notamment d'environ 5 µg/L,
  • la concentration de IGF-1 est d'environ 12,5 µg/L à environ 17,5 µg/L, notamment d'environ 15 µg/L,
  • la concentration de IGF-2 est d'environ 12,5 µg/L à environ 17,5 µg/L, notamment d'environ 15 µg/L.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant un composé de la famille des corticoïdes tel que défini ci-dessus, et de préférence de l'hydrocortisone.
Avantageusement, l'hydrocortisone susmentionnée se présente sous forme de sel hydrosoluble, notamment sous forme d'hémisuccinate d'hydrocortisone. De préférence, la concentration du sel d'hydrocortisone dans les compositions susmentionnées, est comprise entre environ 5 x 10-7 M et environ 10-6 M, et est notamment d'environ 7 x 10-7 M, soit environ 350 µg/L pour l'hémisuccinate d'hydrocortisone.
Avantageusement, les compositions définies ci-dessus contiennent des coenzymes clé du métabolisme énergétique susmentionnés, notamment à des concentrations telles que :
  • la concentration de NAD/NADH soit d'environ 1 mg/L,
  • la concentration de NADP/NADPH soit d'environ 1 mg/L.
L'invention concerne également les compositions définies ci-dessus se présentant sous forme de lyophilisat, à savoir sous forme de compositions dont les différents constituants sont amenés à l'état sec, et sont susceptibles d'être remis en solution en gardant leurs propriétés physico-chimiques et biologiques.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les lyophilisats susmentionnés, contenant :
  • au moins deux facteurs de croissance tels que définis ci-dessus, ou la totalité de ces facteurs,
  • au moins un composé de la famille des corticoïdes défini ci-dessus, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone,
  • et, le cas échéant, au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique défini ci-dessus, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
L'invention a également pour objet l'application des compositions ou lyophilisats susmentionnés, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi la sérum albumine humaine, ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine B5 (pantothènate), la vitamine B8 (biotine), la vitamine B1 (thiamine) et/ou de la vitamine C.
L'invention concerne également un procédé de préparation de milieux de culture in vitro définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition telle que définie ci-dessus, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d'une composition susmentionnée sous forme de lyophilisat, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé susmentionné, et étant caractérisés en ce qu'ils comprennent une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments susmentionnés utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons.
L'invention concerne également un procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, le cas échéant après décongélation d'embryons préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, de préférence pendant les 6 premiers jours suivant la fécondation in vitro, le cas échéant après décongélation, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes.
L'invention a également pour objet un procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 6 jours.
L'invention concerne également un procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 5 jours.
L'invention a également pour objet un procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 2 jours à environ 6 jours.
Avantageusement, les compositions de l'invention peuvent être utilisées à la fois pour la maturation des ovocytes ou celle des cellules de la lignée germinale mâle, la fécondation in vitro des ovocytes, et la maturation des embryons issus de ladite fécondation, notamment jusqu'au stade de blastocyste, éventuellement après décongélation des follicules, des cellules mâles, ou des embryons.
L'invention a également pour objet un kit (ou trousse) pour la préparation extemporanée d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé susmentionné, ce kit comprenant :
  • une composition sous forme de lyophilisat, telle que décrite ci-dessus,
  • et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, tels que les éléments définis ci-dessus, notamment un milieu commercial tel que le milieu Upgraded B9 de CCD.
La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit d'exemples de milieux de culture selon l'invention.
A titre de solution aqueuse telle que définie ci-dessus, le milieu de culture Upgraded B9 CCD disponible commercialement comprend principalement les composés suivants :
  • des sels minéraux : KCl, NaCl, MgSO4, NaHCO3, Na2HPO4, KH2PO4,
  • les acides aminés essentiels, ainsi que d'autres acides aminés tels que l'acide glutamique, la glycine, la taurine, la cystéine et la glutamine,
  • des oses et dérivés métaboliques, tels que glucose, pyruvate, lactate, acétate,
  • des vitamines, notamment des vitamines du groupe B et de la vitamine C,
  • des bases puriques et pyrimidiques,
  • des antibiotiques : pénicilline G, streptomycine.
Formule n°1
Dans cette formule, le milieu de culture Upgraded B9 CCD correspondant à la solution aqueuse définie ci-dessus, éventuellement additionné d'insuline humaine (notamment d'insuline recombinante à raison de 5 mg/L, sur la base de 1mg = 25 U), est complété par le lyophilisat contenant :
  • de l'hémisuccinate d'hydrocortisone (7 x 10-7 M, soit 350 µg/L),
  • des facteurs de croissance humains recombinants : EGF (50 µg/L), TGFα (25 µg/L), HGF (50 µg/L), GM-CSF (1,25 µg/L), GDF-9 (5 µg/L),
  • du NAD/NADH (1mg/L) et du NADP/NADPH (1mg/L).
Formule n°2
Dans cette formule, le milieu de culture Upgraded B9 CCD, contenant éventuellement de l'insuline humaine, est complété par le lyophilisat contenant :
  • de l'hémisuccinate d'hydrocortisone (7 x 10-7 M, soit 350 µg/L),
  • des facteurs de croissance humains recombinants : EGF (50 µg/L), TGFα (25 µg/L), HGF (50 µg/L), GM-CSF (1,25 µg/L), GDF-9 (5 µg/L),
  • IGF-1 (12,5 µg/L), IGF-2 (12,5 µg/L),
  • et du NAD/NADH (1mg/L et du NADP/NADPH (1mg/L).
A) PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE POUR LES APPLICATIONS SUSMENTIONNEES SELON LA FORMULE N°1
Le milieu de culture doit être préparé extemporanément par mélange de deux flacons :
  • un flacon A, qui se présente sous la forme d'une solution d'un volume de 10 ml et qui contient le milieu Upgraded B9 dans lequel est éventuellement dissoute l'insuline;
  • un flacon B, qui se présente sous la forme d'un lyophilisat et qui contient l'hémisuccinate d'hydrocortisone et les facteurs de croissance, le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
Au moment de l'emploi, reprendre le lyophilisat du flacon B par un faible volume (∼ 0,5 ml) de la solution du flacon A. Transférer le contenu du flacon B ainsi dissous dans le flacon A. Homogénéiser. Cette opération dilue donc au dixième la concentration initiale des constituants du flacon B.
Fabrication du flacon A
Dans le cas de l'addition d'insuline, il convient de préciser qu'à l'état cristallin, les molécules d'insuline sont unies entre elles par des forces intermoléculaires qui ne se rompent qu'en milieu acide. Pour être mise en solution aqueuse, l'insuline doit donc être dissoute à pH 3 (HCI 0,1 N). Le pH de la solution est ensuite amené à 7,5 (NaOH 0,1N); cette opération doit être effectuée le plus rapidement possible, afin d'éviter des altérations de la molécule. Un léger précipité peut apparaítre à pH5 ; il se redissout ensuite.
Préparer une solution à 100 U/ml. Ajouter la solution d'insuline au milieu Upgraded B9, dans les proportions de 1,25 ml pour 1 L, respectivement. Répartir en flacons de 10 ml qui seront fermés. Conserver la solution à +4°C. Le bulletin analytique de l'insuline, comportant, entre autres, l'activité et, éventuellement, les tests de sécurité, doit être joint ; celui-ci doit être communiqué par le fournisseur de l'insuline.
Fabrication du flacon B
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant l'hémisuccinate d'hydrocortisone et les facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1ml, de telle façon que chaque flacon contienne 3,5 µg d'hémisuccinate d'hydrocortisone, 500 ng d'EGF, 250 ng de TGFα, 500 ng d'HGF, 12,5 ng de GM-CSF, 50 ng de GDF-9, 10 µg de NAD/NADH et 10 µg de NADP/NADPH. Les flacons sont immédiatement lyophilisés. Conserver le lyophilisat à + 4°C.
Conditions de fabrication
Toutes les opérations sont effectuées avec des matières premières stériles et en milieu stérile.
B) PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE POUR LES APPLICATIONS SUSMENTIONNEES SELON LA FORMULE N°2
IGF-1 et IGF-2 sont ajoutés à la solution initiale contenant les autres constituants du flacon B, pour obtenir 125 ng de chacun par flacon, puis l'ensemble est lyophilisé.
Les conditions de fabrication et de conservation sont les mêmes que celles du milieu préparé selon la formule n°1.
C) PREPARATION D'UN MILIEU CONTENANT DE L'HYDROCORTISONE ET DES FACTEURS DE CROISSANCE
Dans une première étape, un lot expérimental de milieu contenant le glucocorticoïde et des facteurs de croissance a été préparé. Ce milieu de culture était constitué de milieu Upgraded B9 complété seulement par de l'insuline humaine, de l'hémisuccinate d'hydrocortisone, de l'EGF, du TGFα, et de l'IGF-1 humains.
Pour compléter un flacon de 10 ml de milieu Upgraded B9, appelé flacon A, nous avons utilisé :
  • 12,5 µl d'une solution aqueuse d'insuline humaine à 100 U/ml. Cette solution était présentée sous la forme d'un flacon de 10 ml, appelé ici flacon B. Les tests de sécurité (virus et prions) avaient été préalablement effectués.
  • un flacon de lyophilisat d'une capacité de 1,2 ml, appelé ici flacon C, contenant l'hémisuccinate d'hydrocortisone (3,5µg) et les facteurs de croissance et de différenciation humains recombinants EGF (500 ng), TGFα (250 ng), et IGF-1 (125ng). Pour la préparation de ce flacon, l'hémisuccinate d'hydrocortisone (1,4 mg), l'EGF (200 µg), le TGFα (100 µg), et l'IGF-1 (50µg) ont été dissous dans 400 ml d'une solution aqueuse d'albumine humaine sécurisée (1 g/L). Cette solution a été passée sur filtre de 0,2 µm, puis répartie dans 393 flacons de 5 ml, à raison de 1ml par flacon. Ces derniers ont été lyophilisés. Toutes ces opérations ont été effectuées en milieu stérile.

Claims (18)

  1. Composition pour la culture in vitro de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux facteurs de croissance en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et, le cas échéant, avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
  2. Composition selon la revendication 1, pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons.
  3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux facteurs de croissance choisis parmi :
    le facteur de croissance hépatique, encore désigné HGF,
    le facteur de croissance de transformation α, encore désigné TGFα,
    le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF,
    le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF et/ou HB-EGF,
    les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF, tels que le GDF-9,
    les facteurs de croissance semblables-à-l'insuline, encore désignés IGF, tels que l'IGF-1 et/ou l'IGF-2.
  4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois facteurs de croissance, ou tous les facteurs listés dans la revendication 3.
  5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les concentrations en facteurs de croissance sont nanomolaires.
  6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les concentrations en facteurs de croissance sont comprises entre environ 0,25 µg/L et environ 60 µg/L, notamment entre environ 0,5 µg/L et environ 50 µg/L.
  7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, est un composé de la famille des glucocorticoïdes, tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de la même famille, sous forme hydrosoluble.
  8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'hydrocortisone sous forme de sel tel qu'un hémisuccinate.
  9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de lyophilisat.
  10. Lyophilisats définis dans la revendication 9, contenant :
    au moins deux facteurs de croissance définis dans l'une des revendications 1 à 6, ou la totalité de ces facteurs,
    un composé de la famille des corticoïdes définis dans la revendication 7 ou 8, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone,
    et, le cas échéant, du NAD/NADH et du NADP/NADPH.
  11. Application des compositions ou lyophilisats selon l'une des revendications 1 à 10, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition selon l'une des revendications 1 à 8, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi la sérum albumine humaine, ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B et/ou de la vitamine C.
  12. Procédé de préparation de milieux de culture in vitro définis dans la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition selon l'une des revendications 1 à 8, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d'une composition susmentionnée sous forme de lyophilisat selon les revendications 9 ou 10, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 11.
  13. Milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, où pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 12, et étant caractérisés en ce qu'ils comprennent une composition selon l'une des revendications 1 à 8, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 11.
  14. Procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, le cas échéant après décongélation d'embryons préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture selon la revendication 13, notamment pendant les 6 premiers jours suivant la fécondation in vitro, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes.
  15. Procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture selon la revendication 13, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 6 jours.
  16. Procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture selon la revendication 13, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 4 jours.
  17. Procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture selon la revendication 13, avantageusement pendant environ 2 jours à environ 6 jours.
  18. Kit pour la préparation extemporanée d'un milieu selon la revendication 13, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend :
    une composition sous forme de lyophilisat selon les revendications 9 ou 10,
    et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, tels que définis dans la revendication 11.
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