EP1121148A2 - Emulsion immunostimulante - Google Patents

Emulsion immunostimulante

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Publication number
EP1121148A2
EP1121148A2 EP99942961A EP99942961A EP1121148A2 EP 1121148 A2 EP1121148 A2 EP 1121148A2 EP 99942961 A EP99942961 A EP 99942961A EP 99942961 A EP99942961 A EP 99942961A EP 1121148 A2 EP1121148 A2 EP 1121148A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
emulsion
emulsion according
molecule
polynucleotide
lipid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99942961A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean Haensler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur Inc
Original Assignee
Aventis Pasteur SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pasteur SA filed Critical Aventis Pasteur SA
Publication of EP1121148A2 publication Critical patent/EP1121148A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Definitions

  • the invention relates to the field of vaccines and more particularly vaccine adjuvants.
  • Vaccines whether prophylactic or therapeutic, are intended to stimulate the immune system of the human or animal body to which they are administered, the immune system response can be either a humoral type response (production of antibodies), either a cell type response, or a combination of the two types of responses.
  • the immune system response can be either a humoral type response (production of antibodies), either a cell type response, or a combination of the two types of responses.
  • vaccination has consisted in administering to an organism a non-pathogenic version of a microorganism so as to prepare the immune system to react effectively in the event that the organism is subsequently caused to encounter the same microorganism, in its pathogenic version.
  • the antigen administered during vaccination can.
  • oligonucleotides that may immunostimuiatrice activity
  • these oligonucleotides can be administered as a vaccine adjuvant.
  • This reference also mentions the possibility of associating with these oligonucleotides by ionic, covalent bond or by encapsulation, means for targeting the administration of the oligonucleotide.
  • Such means can in particular consist of sterol, of lipid (for example a catiodic lipid, a virosome or a liposome) or of a binding agent specific to the target cell (for example a binder recognized by a receptor specific for the cell). target).
  • the invention relates to an immu ⁇ ostimulant emulsion of the oil in water type, comprising at least one aqueous phase and one oily phase, characterized in that it also comprises at least one immunostimulating polynucleotide of which at least a part is covalently coupled to at least one lipid molecule.
  • oil-in-water emulsion means a dispersion of oil droplets in an aqueous phase which may consist of a buffer such as the PBS buffer.
  • the oily phase consists of a pharmaceutically acceptable oil, which can be a mineral, animal or vegetable oil.
  • a metabolizable oil is used such as squalene, esters (in particular ethyl oleate, - j - isopropyl myristate), a vegetable oil (for example castor oil, sunflower oil, olive oil ...) or a modified vegetable oil (eg macrogol glycerides) .
  • a satisfactory emulsion by mixing 500 mg of squalene with 10 ml of PBS buffer in a device such as an ULTRA-TURRAX TM, then by microfluidizing the dispersion obtained using a microfluidizer such as Microfluidics TM, which allows to obtain oily particles whose diameter is less than 200 nm.
  • a surface-active agent in particular a surface-active agent whose HLB value (Hydrophilic / Lipophilic Balance) is between 6 and 14.
  • a surfactant chosen from the list of the following products: sorbitan esters and poiysorbates, ethoxylated castor oil hydrogenated or not, ethoxylated stearic acid, oleic alcohol 10 EO, cetostearyl alcohol 20 EO, glycerol stearate, propylene glycol stearate, lecithins, sodium lauryl sulfate, sodium stearate, ethoxylated glycerol cocoate. 70E, ethoxylated glycerol esters, ethoxylated oleic acids, l 'mannitan oleate. Particularly good results have been obtained using TWEEN TM 80.
  • the emulsion obtained is considered to be immunostimulatory if it is capable of causing or increasing the stimulation of the immune system, for example when it is administered together with a vaccine antigen.
  • the emulsion is used as an immunoadjuvant.
  • This immuno-adjuvant activity can be expressed in different ways:
  • - modify the nature of the response of the immune system to the administration of the antigen (for example, inducing a cellular response when the administration of the antigen alone provoked only a humoral response), - induce or increase the production of cytokines, or certain cytokines in particular
  • polynucleotide within the meaning of the present invention, is understood a single-stranded oligonucleotide having from 6 to 100 nuciéotides, preferably from 6 to 30 nuciéotides It can be oligonbonucleotide, or o godesoxy ⁇ bo-nucleotide preferably polynucleotides comprising basic sequences with reverse symmetry, as is the case in palindromic sequences (that is to say sequences of the ABCDEE'D'C'B'A 'type where A and A, B and B ', C and C, D and D' E and E 'are complementary bases in the sense of Watson and C ⁇ ck), and more particularly polynucleotides comprising at least one di ⁇ ucleotide sequence Cytosine, Guanme, in which Cytosine and Guanine are not methylated Any other polynucleotide known to be, by its very nature, immunostimulant, may be suitable for
  • At least one lipid molecule is covalently coupled to the polynucleotide.
  • This lipid molecule is preferably a cholesterol or cholesterol derivative molecule.
  • the coupling can be carried out by covalent bonding at one or at each end of the polynucleotide, or again by inserting at least one lipid molecule next to each base.
  • Antigens whose effect it is possible to potentiate thanks to the emulsion according to the present invention, can be of varied nature, it can in particular be proteins, glycoproteins, glycoconjugates, polysaccharides or polynucleotides comprising fractions of DNA likely to lead to the expression of molecules ules of interest, it can also be a mixture of different antigens. Particularly good results have been obtained with a composition comprising influenza antigens as they are present in the commercial vaccine VAXIGRIP TM
  • An emulsion according to the invention can be obtained by proceeding in the following manner, first mixing, with stirring, the oil with the aqueous phase optionally consisting of a buffer solution in which a surfactant has been incorporated.
  • the mixture obtained is homogenized. by means, for example, of a propeller stirrer, in order to lead to an emulsion of the type oil in water.
  • the emulsion obtained is then treated using a microfluidizer in order to reduce the oil droplets to a diameter less than 200 nm
  • this emulsion When this emulsion is intended to be used as an immunoadjuvant, it is mixed with stirring, to a composition comprising the antigen whose effect it is desired to potentiate.
  • the mixing can advantageously be carried out in a volume ratio of 1. verify the unexpected effect and in particular the synergistic effect obtained on the stimulation of the immune system by the simultaneous use of a polynucleotide coupled to at least one lipid molecule, and its incorporation into an oil-in-water emulsion
  • compositions comprising only the antigen or the mixture of antigens vis-à-vis which it is desired to test the immunostimulating effect of the emulsion according to the invention, - or a composition, comprising the antigen or antigens d interest to which has been added a solution comprising only polynucleotides coupled to at least one lipid molecule,
  • compositions comprising the antigen or antigens of interest to which has been added an oil-in-water type emulsion, without polynucleotide, or with a polynucleotide lacking immunostimulatory activity with respect to the antigens administered,
  • composition comprising the antigen or antigens of interest to which an emulsion according to the invention has been added
  • the results obtained showed a significant synergistic effect of the elements constituting the emulsion according to the invention.
  • the emulsion obtained according to the invention has increased stability compared to emulsions of the same nature, i.e. those consisting of an identical aqueous phase and an oily phase, but devoid of polynucleotides.
  • Oligonucleotides are prepared using a synthesizer automaton provided by Applied Biosystems which implements the standard chemical method with phosphoramidite and which includes an oxidation step at each cycle. This oxidation step is carried out using an iodine / water / tetrahydrofuran / acetonitrile solution to obtain a phosphodiester bond and using a tetraethylthiuram / acetonitrile solution to obtain a phosphorothioate bond.
  • a 3 Db (S) oligonucleotide is thus prepared, the sequence of which is reproduced under SEQ ID NO 1 and which comprises phosphorothioate bonds over its entire length.
  • An MGC (S) oligonucleotide is also prepared, the sequence of which is reproduced in SEQ ID NO 2, which comprises both phosphodiester bonds and phosphorothioate bonds.
  • the phosphorothiate bonds are located at each end; there are 2 phosphorothioate bonds in 3 'and 5 phosphorothioate bonds in 5'.
  • This oligonucleotide does not have a palindromic sequence, and in particular no CG sequence.
  • Oligonucleotides are prepared which are coupled to the ends of the cholesterol molecules.
  • the synthesis of these 3 Db (S) -chol oligonucleotides and MGC (S) -chol is carried out in the same manner as in Example 1, with the exception of the Phosphoramidite reagent which is replaced by a specific reagent, Cholesterol-ON TM Phosphoramidite supplied by the company CLONTECH Lab. Inc, (USA), during the first and last synthesis cycle in order to obtain a cholesterol molecule inserted before each of the end nucleotides.
  • the nucleotide sequences obtained are identical to those of the oligonucleotides described in the previous example.
  • An immunostimulatory emulsion according to the invention is prepared by mixing 435 ⁇ l of the 2.3 g / l solution of 3Db (S) coupled to the cholesterol obtained in Example 2 (ie 1 mg of oligonucleotide), with 2 ml of the squalene / PBS emulsion obtained in Example 3, kept stirring.
  • Another emulsion is prepared by mixing 263 ⁇ l of the 3.81 g / l solution of MGC (S) coupled with cholesterol obtained in Example 2 (ie 1 mg of oligonucleotide) with 2 ml of the squalene emulsion / PBS obtained in Example 3, kept stirring.
  • Example 5
  • Immunization doses of different natures are prepared by adding, with stirring, 2 ml of splitted vaccine against influenza NIB16 (monovalent A / Singapore H1 N1) containing 100 ⁇ g of hemagglutinin HA in PBS buffer to 2 ml of each of the following preparations •
  • mice There are groups of 6 Balb / c female mice aged 6 to 8 weeks, each group corresponding to one of the preparations carried out in Example 6
  • Each of the mice is immunized with 200 ⁇ l of the preparation corresponding to its group and therefore receives 5 ⁇ g of HA by immunization, each mouse being immunized 2 times 3 weeks apart, with the same preparation 2 weeks after the second injection, the response to specific anti-HA antibodies is measured, using an ELISA test, and the GMT for lgG1 as well as for lgG2a The results obtained are indicated below:
  • results obtained confirm that the oligonucleotide 3Db (S) is well endowed with immunostimulatory properties because it is capable of inducing an increase in the antibody response compared to what is obtained during the administration of the antigens alone.
  • results obtained with the oligonucleotide MGC (S) do not demonstrate immunostimulatory activity.
  • the emulsion containing an immunostimulating polynucleotide such as the polynucleotide 3Db (S) leads to a production of antibodies clearly greater than that obtained with an emulsion containing the polynucleotide MGC (S) -chol; this effect is even more remarkable with regard to the production of IgG2a; which is indicative of an orientation of the immune response towards a TH1 type, orientation sometimes desired in certain vaccine targets.
  • Vaccine compositions are prepared comprising the following elements:
  • the doses are 50 ⁇ litres and include 50 micrograms of oligonucleotides.
  • compositions are administered to mice at OJ and D28; 5 to 6 weeks after the booster injection, the spleens of the mice are removed in order to evaluate the amount of n ⁇ interferer produced.
  • Immunization doses are prepared identical to those of Example 7, with the exception of the RSV antigens which are not in the presence of aluminum gel.
  • the doses of 50 ⁇ litres are administered intramuscularly to groups of 6 mice.
  • mice 4 weeks after immunization, the mice are bled and the anti-F protein antibody levels are determined by ELISA titration. The results obtained are summarized in the following table:

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Abstract

La présente invention concerne une émulsion immunostimulante de type huile dans eau, qui comprend une phase aqueuse et une phase huileuse, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un polynucléotide immunostimulant dont au moins une partie est couplée de façon covalente à au moins une molécule lipidique. L'invention concerne également une composition vaccinale comprenant à titre d'immunoadjuvant, une telle émulsion.

Description

EMULSION IMMUNOSTIMULANTE
L'invention concerne le domaine des vaccins et plus particulièrement les adjuvants de vaccins.
Les vaccins, qu'ils soient prophylactiques ou thérapeutiques, sont destinés à stimuler le système immunitaire de l'organisme humain ou animal auquel ils sont administrés, la réponse du système immunitaire pouvant être soit une réponse de type humorale (production d'anticorps), soit une réponse de type cellulaire, soit encore une combinaison des 2 types de réponses. De façon classique, depuis de nombreuses années, la vaccination a consisté à administrer à un organisme une version non pathogène d'un micro-organisme de façon à préparer le système immunitaire à réagir efficacement dans le cas où l'organisme serait amené ultérieurement à rencontrer le même micro- organisme, dans sa version pathogène. L'antigène administré lors de la vaccination peut . être de différentes natures : micro-organisme tué entier ou fragmenté, souche vivante atténuée du micro-organisme, fractions antigéniques du micro-organisme ou encore polyπucléotides susceptibles de conduire à l'expression par l'organisme d'une fraction aπtigénique. Depuis déjà longtemps, on a cherché à augmenter la réponse du système immunitaire ou à modifier sa nature, non pas simplement en agissant sur l'antigène administré ou sur son mode d'administration, mais également en lui adjoignant des substances immunostimulatrices ou adjuvants. Depuis l'adjuvant complet de Freund, de nombreux produits ont été testés, notamment des sels minéraux (tels que le chlorure de zinc, le phosphate de calcium, l'hydroxyde d'aluminium ou encore le phosphate d'aluminium par exemple), des saponines, des polymères, des lipides ou des fractions lipidiques( Lipide A, Monophosphoryl Lipid A), ...etc. Cependant, peu d'entre eux présentent toutes les caractéristiques souhaitées : être de bons immuno-adjuvants, stables, mais sans risque de toxicité.
On connaît ' d'autre part, par la demande WO 96/02555, des oligonucléotides pouvant avoir une activité immunostimuiatrice, ces oligonucléotides pouvant être administrés comme adjuvant vaccinal. Cette référence mentionne également la possibilité d'associer à ces oligonucléotides par liaison ionique, covalente ou par encapsulation, des moyens pour cibler l'administration de l'oligonucléotide. De tels moyens peuvent être notamment constitués de stérol, de lipide (par exemple un lipide catioπique, un virosome ou un liposome) ou un agent de liaison spécifique à la cellule-cible (par exemple un liant reconnu par un récepteur spécifique de la cellule-cible). Cette demande mentionne encore, parmi toutes les variantes d'utilisation des polynucléotides décrits, la possibilité de les administrer en conjonction avec un véhicule porteur pharmaceutiquement acceptable. Cette demande n'identifie pas de véhicule comme étant d'un intérêt particulier mais en donne une liste indicative et cite à cet égard notamment les solutions, les solvants, les milieux de dispersion, les agents-retard, les émulsioπs et autres; l'utilisation de tels milieux pour des substances pharmaceutiquement actives étant mentionnée comme étant bien connue dans ce domaine. Selon l'enseignement de ce document, la quantité d'oligonucléotides administrée doit l'être en quantité suffisante pour réaliser l'effet biologique recherché.
Or, les auteurs de la présente invention ont trouvé que, de façon tout à fait inattendue, il était possible d'accroître fortement l'effet immunoadjuvaπt d'un oligonucleotide, sans être obligé d'accroître la quantité d'oligonucléotides ou la quantité d'antigènes administrée.
Pour atteindre ce but, l'invention a pour objet une emulsion immuπostimulante du type huile dans eau, comprenant au moins une phase aqueuse et une phase huileuse, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un polynucléotide immunostimulant dont au moins une partie est couplée de façon covalente à au moins une molécule lipidique.
Aux fins de l'invention, on entend par emulsion de type huile dans eau, une dispersions de gouttelettes d'huile dans une phase aqueuse pouvant être constituée par du tampon tel que le tampon PBS. La phase huileuse est constituée par une- huile pharmaceutiquement acceptable, qui peut être une huile minérale, animale ou végétale. De préférence, on utilise une huile métabolisable telle que le squalène, les esters (notamment l'oléate d'éthyle, le - j - myristate d'isopropyle), une huile végétale( par exemple l'huile de ricin, l'huile de tournesol, l'huile d'olive...)ou encore une huile végétale modifiée (ex : les macrogol glycerides). On peut, notamment, obtenir une emulsion satisfaisante en mélangeant 500 mg de squalène à 10 ml de tampon PBS dans un appareil tel qu'un ULTRA-TURRAX™, puis en microfluidisant la dispersion obtenue grâce à un microfluidiseur tel que le Microfluidics™, ce qui permet d'obtenir des particules huileuses dont le diamètre est inférieur à 200 nm. Afin de faciliter la formation de l'emulsion, il est possible d'utiliser en outre un agent tensio-actif , notamment un agent tensio-actif dont la valeur HLB [Balance Hydrophile/Lipophile) est comprise entre 6 et 14. Il est notamment possible d'utiliser un agent tensio-actif choisi parmi la liste des produits suivants : les esters de sorbitan et les poiysorbates, l'huile de ricin éthoxylée hydrogénée ou non, l'acide stéarique éthoxylé, l'alcool oléique 10 OE, l'alcool cétostéarylique 20 OE, le stéarate de glycérol, le stéarate de propylène glycol, les lécithines, le lauryl sulfate de sodium, le stéarate de sodium, le cocoate de glycérol éthoxylé.70E , les esters de glycérol éthoxylés, les acides oléiques éthoxylés, l'oléate de mannitan. On a obtenu de particulièrement bons résultats en utilisant du TWEEN ™ 80. L'emulsion obtenue est considérée immuπostimulante si elle est capable de provoquer ou d'accroître la stimulation du système immunitaire, par exemple lors de son administration conjointement à un antigène vaccinal. Dans cette application, l'emulsion est utilisée comme immuno-adjuvant. Cette activité immuno-adjuvaπte peut s'exprimer de différentes façons :
- rendre visible la réponse du système immunitaire à l'administration conjointe de l'antigène et de l'emulsion, alors que la réponse à l'administration de l'antigène seul ne l'était pas,
- accroître le degré de la réponse du système immunitaire sans en modifier la nature (par exemple : augmenter la quantité d'anticorps produits),
- modifier la nature de la réponse du système immunitaire à l'administration de l'antigène (par exemple, induire une réponse cellulaire alors que l'administration de l'antigène seul provoquait uniquement une réponse humorale), - induire ou accroître la production de cytokines, ou de certaines cytokines en particulier
Par "polynucléotide" au sens de la présente invention, on comprend un oligonucleotide simple brin ayant de 6 à 100 nuciéotides, de préférence de 6 à 30 nuciéotides II peut s'agir d'oligonbonucléotide, ou d'o godesoxyπbo- nucléotide On utilise de préférence des polynucléotides comprenant des séquences de base à symétrie inversée, tel que cela est le cas dans les séquences palindromiques (c'est-à-dire des séquences de type ABCDEE'D'C'B'A' où A et A, B et B', C et C, D et D' E et E' sont des bases complémentaires au sens de Watson et Cπck), et plus particulièrement des polynucléotides comprenant au moins une séquence diπucléotidique Cytosine, Guanme, dans laquelle la Cytosine et la Guanine ne sont pas méthylées Tout autre polynucléotide connu pour être, par sa nature même, immunostimulant, peut convenir aux fins de l'invention Ainsi, il est possible également d'utiliser les oligonucléotides immunostimulants décrits dans la demande de brevet WO96/02555 On a obtenu de particulièrement bons résultats en utilisant un polynucléotide dont la séquence des bases est la suivante GAGAACGCTCGACCTTCGAT Les oligonucléotides convenant aux fins de l'invention peuvent se présenter sous forme de phosphodiester, ou afin d'être plus stables sous forme de phosphorothioates ou d'hybrides phosphodiester/phosphorothioates Bien qu'il soit possible d'utiliser des oligonucléotides provenant de sources d'acides nucléiques existantes tel que l'ADN géπomique ou le cADN, on préfère utiliser des oligonucléotides de synthèse Ainsi, il est possible d'élaborer des oligonucléotides sur support solide en utilisant la méthode β-cyano éthyl phosphoramidite (Beaucage, S L and Caruthers, M H Tetrahedron Letters 22, 1859 - 1862 (1981 )) pour l'assemblage 3'-5', puis on procède à une précipitation en éthanol en présence d'acétate de sodium 0,3 M non ajusté en pH (0,3M en final) On effectue ensuite une précipitation par 4 volumes d'éthaπol à 80% SUIVI d'un séchage avant de procéder a une reprise par de l'eau pure Les oligonucléotides phosphorothioatés ont un des atomes d'Oxygène composant le groupement Phosphate qui est remplacé par un atome de Soufre Leur synthèse peut être effectuée comme précédemment décrit, sauf à remplacer la solution lode/eau/pyπdine tétrahydrofurane qui est utilisée lors de l'étape d'oxydation nécessaire à la synthèse des liaisons phosphodiester par une solution TETD (tétraethylthiuram disulfide) apportant les ions sulfates permettant de produire le groupement phosphorothioate
On peut également envisager d'autres modifications des liaisons phosphodiesters, des bases ou des sucres, pour modifier les propriétés des oligonucléotides utilisés, et notamment pour accroître leur stabilité
Selon l'invention, on couple au polynucléotide au moins une molécule lipidique de façon covalente Cette molécule lipidique est de préférence une molécule de cholestérol ou de dérivé de cholestérol Le couplage peut être effectué par liaison covalente à une ou à chaque extrémité du polynucléotide, ou encore par insertion à côté de chaque base d'au moins une molécule lipidique Ce couplage peut être effectué directement lors de la synthèse du polynucléotide en utilisant dans le synthétiseur d'oligonucléotides un réactif de type Cholestérol Phosphoramidite au lieu du réactif Phosphoramidite habituellement utilisé Les antigènes dont il est possible de potentialiser l'effet grâce à l'emulsion selon la présente invention, peuvent être de nature variée , il peut notamment s'agir de protéines, de glycoprotéiπes, de glycoconjugués, de polyosides ou encore de polynucléotides comprenant des fractions d'ADN susceptibles de conduire à l'expression de molécules d'intérêt , il peut également s'agir d'un mélange de différents antigènes De particulièrement bons résultats ont été obtenus avec une composition comprenant des antigènes de la grippe tels qu'ils sont présents dans le vaccin commercial VAXIGRIP™
On peut obtenir une emulsion selon l'invention en procédant de la façon suivante on mélange tout d'abord, sous agitation, l'huile avec la phase aqueuse constituée éventuellement par une solution tampon dans laquelle a été incorporé un surfactant Le mélange obtenu est homogénéisé au moyen, par exemple, d'un agitateur à hélice, afin de conduire à une emulsion du type huile dans eau. De préférence, on traite ensuite l'emulsion obtenue au moyen d'un microfluidiseur afin de réduire les gouttelettes d'huile à un diamètre inférieur à 200 nm
Puis, cette emulsion étant maintenue sous agitation, on lui ajoute simplement le polynucléotide auquel a été couplé le lipide, et on obtient l'emulsion objet de la présente invention
Lorsque cette emulsion est destinée à être utilisée comme immuno- adjuvant, on la mélange sous agitation, à une composition comprenant l'antigène dont on souhaite potentialiser l'effet Le mélange peut être avantageusement effectué dans un rapport volumique de 1 On peut, ensuite, vérifier l'effet inattendu et notamment l'effet synergique obtenu sur la stimulation du système immunitaire par l'utilisation simultanée d'un polynucléotide couplé à au moins une molécule de lipide, et son incorporation à une emulsion de type huile dans eau A cette fin, il est possible de réaliser un test d'immunogénicité sur des souris divisées en plusieurs groupes, à qui on administre, suivant le groupe
- soit une composition comprenant uniquement l'antigène ou le mélange d'antigènes vis-à-vis desquels on veut tester l'effet immunostimulant de l'emulsion selon l'invention, - soit une composition, comprenant l'antigène ou les antigènes d'intérêt à laquelle a été ajoutée une solution comprenant uniquement des polynucléotides couplés à au moins une molécule de lipides,
- soit une composition comprenant l'antigène ou les antigènes d'intérêt à laquelle a été ajoutée une emulsion de type huile dans eau, sans polynucléotide, ou avec un polynucléotide dépourvu d'activité immunostimulante vis-à-vis des antigènes administrés,
- soit une composition comprenant l'antigène ou les antigènes d'intérêt à laquelle a été ajoutée une emulsion selon l'invention
Pour chacune des souris immunisées, on peut, ensuite, déterminer la quantité et la nature des anticorps produits ce qui permet de déterminer la GMT (ou Moyenne Géométrique du Titre en Anticorps) , on peut également effectuer des dosages des cytokines produites , en outre, on peut effectuer des dosages permettant de déterminer la réponse cellulaire du système immunitaire.
Les résultats obtenus ont montré un effet synergique important des éléments constituant l'emulsion selon l'invention. De plus, l'emulsion obtenue selon l'invention présente une stabilité accrue par rapport aux émulsions de même nature, i.e. celles constituées d'une phase aqueuse et d'une phase huileuse identiques, mais dépourvues de polynucléotides.
Les exemples qui suivent illustrent de façon plus précise un mode de réalisation de l'invention.
Exemple 1
On prépare des oligonucléotides grâce à un automate synthétiseur fourni par Applied Biosystems qui met en œuvre la méthode chimique standard au phosphoramidite et qui comporte à chaque cycle une étape d'oxydation. Cette étape d'oxydation est réalisée au moyen d'une solution iode/eau/tétrahydrofurane/acétonitrile pour obtenir une liaison phosphodiester et au moyen d'une solution tétraéthylthiuram/acétonitrile pour obtenir une liaison phosphorothioate. On prépare ainsi un oligonucleotide 3 Db(S) dont la séquence est reproduite sous SEQ ID NO 1 et qui comporte des liaisons phosphorothioate sur toute sa longueur.
On prépare également un oligonucleotide MGC (S) dont la séquence est reproduite à SEQ ID NO 2, qui comporte à la fois des liaisons phosphodiester et des liaisons phosphorothioate. Les liaisons phosphorothiate sont situées à chaque extrémité ; il y a 2 liaisons phosphorothioate en 3' et 5 liaisons phosphorothioate en 5'. Cet oligonucleotide ne possède pas de séquence palindromique, et notamment pas de séquence CG.
Exemple 2
On prépare des oligonucléotides auxquels sont couplés aux extrémités des molécules de cholestérol. La synthèse de ces oligonucléotides 3 Db(S)-chol et MGC(S)-chol est effectuée de la même manière qu'à l'exemple 1 , à l'exception du réactif Phosphoramidite qui est remplacé par un réactif spécifique, le Cholestérol-ON™ Phosphoramidite fourni par la société CLONTECH Lab. Inc, (USA), lors du premier et du dernier cycle de synthèse afin d'obtenir une molécule de cholestérol insérée avant chacun des nuciéotides d'extrémité. Les séquences de nuciéotides obtenues sont identiques à celles des oligonucléotides décrits à l'exemple précédent.
Exemple 3
On dispose de 10 ml de tampon PBS auxquels on ajoute 25 mg de Tween™80 et 500 mg de squalène. Le mélange obtenu est émulsionné grâce à un appareil ULTRA-TURRAX™ T25 pendant 1 min à 13500 tours/min. L'emulsion obtenue est ensuite fluidisée grâce à un traitement de 5 cycles à 500 Psi dans un microfluidiseur Microfluidics™.
Exemple 4
Préparation d'une emulsion squalène/PBS comprenant des polynucléotides couplés à du cholestérol.
On prépare une emulsion immunostimulante selon l'invention en mélangeant 435 μl de la solution à 2,3 g/1 de 3Db(S) couplé au cholestérol obtenue à l'exemple 2 (soit 1 mg d'oligonucléotide), avec 2 ml de l'emulsion squalène/PBS obtenue à l'exemple 3, maintenue sous agitation. On prépare une autre emulsion en mélangeant 263 μl de la solution à 3,81 g/l de MGC(S) couplé à du cholestérol obtenue à l'exemple 2 (soit 1 mg d'oligonucléotide) avec 2 ml de l'emulsion squalène/PBS obtenue à l'exemple 3, maintenue sous agitation. Exemple 5
Préparation des compositions d'immunisation
On prépare des doses d'immunisation de différentes natures en ajoutant sous agitation 2 ml de vaccin splitté contre la grippe NIB16 (monovalent A/Singapore H1 N1 ) contenant 100 μg d'hémagglutiπine HA en tampon PBS à 2 ml de chacune des préparations suivantes •
- tampon PBS - solution MGC(S) obtenue à l'exemple 1 ,
- solution MGC(S)-chol obtenue à l'exemple 2,
- emulsion MGC(S)-chol obtenue à l'exemple 4,
- solution 3Db(S) obtenue à l'exemple 1 ,
- solution 3Db(S)-chol obtenue à l'exemple 2, - emulsion 3Db(S)-chol obtenue à l'exemple 4
Exemple 6
Immunisation On dispose de groupes de 6 souris Balb/c femelles âgées de 6 à 8 semaines, chaque groupe correspondant à une des préparations effectuées à l'exemple 6 Chacune des souris est immunisée avec 200μl de la préparation correspondant à son groupe et reçoit donc 5μg de HA par immunisation, chaque souris étant immunisée 2 fois à 3 semaines d'intervalle, avec la même préparation 2 semaines après la deuxième injection, on mesure la réponse en anticorps spécifiques anti-HA, grâce à un test ELISA, et on détermine la GMT pour les lgG1 ainsi que pour les lgG2a Les résultats obtenus sont indiqués ci-après :
GMT/lgG1 GMT/lgG2a
HA uniquement 38 062 2 137
HA/MGC(S) 37 518 1 050
HA MGC(S)-chol 28 039 1 498
HA/MGC(S)-chol/émulsion 264 776 26 981
HA/3Db(S) 63 939 43 529
HA/3Db(S)-chol 65 904 31 066
HA/3Db(S)-chol/émulsion 611 301 218 142
Les résultats obtenus confirment que l'oligonucleotide 3Db(S) est bien doté de propriétés immunostimulaπtes car il est capable d'induire un accroissement de la réponse en anticorps par rapport à ce qui est obtenu lors de l'administration des antigènes seuls. Par contre, les résultats obtenus avec l'oligonucleotide MGC(S) ne démontrent pas d'activité immunostimulante . D'autre part, on remarque que, de façon inattendue, l'emulsion contenant un polynucléotide immunostimulant tel que le polynucléotide 3Db(S) conduit à une production d'anticorps nettement supérieure à celle obtenue avec une emulsion contenant le polynucléotide MGC(S)-chol; cet effet est encore plus remarquable en ce qui concerne la production d'lgG2a; ce qui est indicateur d'une orientation de la réponse immunitaire vers un type TH1 , orientation parfois souhaitée dans certaines cibles vaccinales. En effet, en considérant que l'effet attendu d'une emulsion est l'effet obtenu avec l'emulsion HA/MGC(S)-chol, ( l'oligonucleotide MGC(S) n'ayant par lui- même aucun effet immunostimulant vis-à-vis des antigènes administrés ainsi que cela est analysé ci-dessus), on note un effet synergique important de l'emulsion selon l'invention car le titre obtenu pour la production d'anticorps, que ce soit pour les lgG1 ou de façon plus nette encore pour les lgG2a, est nettement supérieur à la somme des titres obtenus séparément pour chacune des 2 compositions (emulsion HA/MGC(S) d'une part et solution HA/3Db(S) d'autre part) Exemple 7.
On prépare des compositions vaccinales comprenant les éléments suivants:
- antigènes sous-unitaires contre le RSV (ou Virus Syncitial Respiratoire) en présence de gel d'aluminium, à raison de 1 μgramme de protéines totales (Protéines F, G et M) en tampon PBS ou additionné suivant le cas des éléments suivants:
- solution 3Db(S) obtenue à l'exemple 1 ,
- emulsion 3 Db(S) obtenue à l'exemple 4,
- emulsion MGC(S) obtenue à l'exemple 4.
Les doses sont de 50μlitres et comprennent 50 microgrammes d'oligonucléotides.
Ces compositions sont administrées à des souris à JO et à J28; 5 à 6 semaines après l'injection de rappel, on prélève les rates des souris afin d'évaluer la quantité d'interfér n γ produite.
On obtient les résultats suivants, après dosage ELISA effectué après restimulation secondaire in vitro:
Quantité d' Interféron en pg/ml
Antigènes + Adjuvant aluminium 3432 2565 2998
Antigènes + Adjuvant aluminium 13400
+ 3 Db(S) 9543 1147
Antigènes + Adjuvant aluminium 5130
+ emulsion MGC(S) 9216 7173
Antigènes + Adjuvant aluminium 57394
+ emulsion selon l'invention 42285 49839 Ces résultats montrent clairement la synergie obtenue en utilisant un oligonucleotide immunostimulant et une emulsion selon l'invention , lorsqu'on s'intéresse au RSV et qu'on observe la production d'interféron γ qui est un bon indicateur de la réponse TH1.
Exemple 8:
On prépare des doses d'immunisation identiques à celles de l'exemple 7, à l'exception des antigènes RSV qui ne sont pas en présence de gel d'aluminium. Les doses de 50μlitres sont administrées en intramusculaire à des groupes de 6 souris.
4 semaines après l'immunisation, les souris sont saignées et les taux d'anticorps anti-protéines F sont déterminés par titrage ELISA. Les résultats obtenus sont récapitulés dans le tableau suivant :
Ces résultats confirment l'intérêt d'utiliser une emulsion selon l'invention dans le cas ou les antigènes sont les antigènes du Virus Syncitial Respiratoire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Emulsion immunostimulaπte du type huile dans eau, comprenant au moins une phase aqueuse et une phase huileuse, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un polynucléotide immunostimulant dont au moins une partie est couplée de façon covalente à au moins une molécule lipidique.
2. Emulsion selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la molécule lipidique est une molécule de cholestérol.
3. Emulsion selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polynucléotide immunostimulant comprend au moins une séquence palindromique.
4. Emulsion selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polynucléotide immunostimulant est un oligodesoxynucléotide phosphodiester, phosphorothioate ou un hybride phosphodiester phosphorothioate".
5. Emulsion selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polynucléotide immunostimulant comprend une séquence
G AG AAC G CTC G AC CTTC G AT.
6. Emulsion selon une des revendications précédentes caractérisée en ce que la partie couplée à au moins une molécule lipidique est située à l'extrémité 5' du polynucléotide.
7. Emulsion selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la molécule lipidique est une molécule de cholestérol.
8. Emulsion selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, au moins un surfactant.
9. Emulsion selon la revendication 8, caractérisée en ce que le surfactant est du Tween 80.
10. Emulsion selon une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la phase huileuse comprend du squalène
11. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une emulsion immunostimulante selon une des revendications 1 à 10.
12. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène vaccinal contre la grippe.
13. Composition vaccinale selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène vaccinal du Virus Syncitial Respiratoire.
14. Utilisation d'une emulsion selon une des revendications 1 à 10, pour la fabrication d'un médicament destiné à stimuler le système immunitaire.
15. Utilisation d'une emulsion selon une des revendications 1 à 10, pour la fabrication d'un médicament destiné à produire une réponse de type TH1.
16. Utilisation d'une emulsion selon une des revendications 1 à 10, pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la sécrétion d'iπterféron γ.
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