EP1040195A2 - Regulatorische dna-sequenzen des gens der humanen katalytischen telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung - Google Patents

Regulatorische dna-sequenzen des gens der humanen katalytischen telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung

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Publication number
EP1040195A2
EP1040195A2 EP98966334A EP98966334A EP1040195A2 EP 1040195 A2 EP1040195 A2 EP 1040195A2 EP 98966334 A EP98966334 A EP 98966334A EP 98966334 A EP98966334 A EP 98966334A EP 1040195 A2 EP1040195 A2 EP 1040195A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
telomerase
gene
intron
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98966334A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gustav Hagen
Maresa Wick
Dmitry Zubov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1040195A2 publication Critical patent/EP1040195A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • telomeres The genetic material of eukaryotic cells is distributed on linear chromosomes.
  • the ends of the genes are derived from the Greek words telos (end) and meros (part, segment) as telomeres.
  • Most telomeres consist of repetitions of short sequences that are mostly composed of
  • telomeres are built up from the sequence TTAGGG (Meyne et al, 1989).
  • telomeres perform various important functions. They prevent the fusion of chromosomes (McClintock, 1941) and thus the development of dicentric inheritance. Such chromosomes with two centromeres can lead to the development of cancer by loss of heterozygosity or doubling or loss of genes.
  • telomeres serve to distinguish intact hereditary systems from damaged ones. For example, yeast cells stopped dividing when they contained a chromosome without telomer (Sandeil and Zakian, 1993).
  • RNA primers are required to initiate DNA replication. After cleavage of the RNA primer, extension of the Okazaki fragments and subsequent ligation, the newly synthesized DNA is missing
  • telomeres also play an important role in regulating cellular aging (Olovnikov, 1973). Human somatic cells show a limited replication capacity in culture; after a certain time they become senese. In this state, the cells no longer divide even after stimulation with growth factors, but do not die, but remain metabolically active (Goldstein,
  • telomeres have central functions in the aging of cells and the stabilization of genetic material and prevention of cancer.
  • telomeres synthesize the telomeres
  • telomere As described above, organisms with linear chromosomes can only partially replicate their genome without a special protective mechanism. Most eukaryotes use a special enzyme, telomerase, to regenerate the telomer sequences. Telomerase is constitutively expressed in the unicellular organisms examined so far. In contrast, telomerase activity was only measured in germ cells and tumor cells in humans, whereas neighboring somatic tissue contained no telomerase (Kim et al, 1994).
  • the telomerase can also be referred to as terminal telomer transferase, which is located as a multiprotein complex in the cell nucleus.
  • telomere telomerase The proportion of human telomerase has long been known (Feng et al, 1995), The catalytic subunit of this enzyme group was recently identified in various organisms (Lingner et al, 1997; see our co-pending application PCT EP / 98/03468). These catalytic subunits of telomerase are strikingly homologous both to each other and to all known reverse transcriptases.
  • WO 98/14592 also describes nucleic acid and amino acid sequences of the catalytic telomerase subunit.
  • telomere activity was originally only detectable in germline cells, but not in normal somatic cells (Hastie et al., 1990; Kim et al., 1994). After developing a more sensitive detection method (Kim et al, 1994), low telomerase activity was also detected in hematopoieu cells (Broccoli et al, 1995; Counter et al, 1995; Hiyama et al, 1995). However, these cells still showed a reduction in telomeres (Vaziri et al, 1994; Counter et al, 1995). It has not yet been clarified whether the amount of enzyme in these cells is not sufficient to compensate for the loss of telomeres. or whether the measured telomerase activity stems from a subpopulation, for example incompletely differentiated CD34 + 38 + precursor cells (Hiyama et al, 1995). Evidence of telomerase activity in a single cell would be required for clarification.
  • telomerase hypothesis combines the loss of telomer sequences and cell aging with the activity of telomerase and the development of cancer.
  • shrinking of telomeres can be seen as a mechanism for tumor suppression. Differentiated cells that do not contain telomerase stop their cell division at a certain length of the telomeres.
  • telomere shortening is probably the main mechanism of tumor cells to stabilize their telomeres.
  • telomerase inhibition should allow therapy of tumors.
  • Conventional cancer therapies with cytostatics or short-wave radiation damage not only the tumor cells, but all the cells that divide in the body. But apart from tumor cells only
  • telomere inhibitors would attack the tumor cells more specifically and thus cause fewer undesirable side effects. Telomerase activity has been demonstrated in all tumor tissues tested so far, so that these therapeutic agents could be used against all types of cancer. The effect of telomerase inhibitors would occur when the telomeres of the cells have shortened to such an extent that the genome becomes unstable. Since tumor cells usually have shorter telomeres than normal somatic cells, cancer cells would first be eliminated by telomerase inhibitors. Cells with long telomeres, like the germ cells, would only be damaged much later. Telomerase inhibitors are therefore a pioneering way of treating cancer. Clear answers to the question of the type and target of physiological telomerase inhibitors will be possible if the regulation of the gene expression of telomerase is also identified.
  • Eukaryotic gene expression i.e. the cellular flow of information from DNA via RNA to protein has a variety of starting points for regulatory mechanisms. Individual control levels are e.g. gene amplification, recombination of gene loci, chromatin structure, DNA methylation, transcription, post-transcriptional mRNA modifications, mRNA transport, translation and post-translational protein modifications. According to previous studies, control at the level of transcription initiation is of the greatest importance (Latchman, 1991).
  • RNA polymerase II RNA polymerase II RNA polymerase II RNA polymerase II RNA polymerase II .
  • a comparison of the nucleotide sequences of promoter regions of many known genes shows that certain sequence motifs occur frequently in this region. These elements include the TATA box, the CCAAT box and the GC box, which are recognized by specific proteins.
  • the TATA box located about 30 nucleotides upstream from the start of transcription, is e.g. recognized by the TFIID subunit TBP (“TATA box binding protein”), whereas certain GC-rich sequence sections are specifically bound by the transcription factor Spl (“specificity protein 1”).
  • the constitutive control area includes the so-called core promoter, which enables the correct initiation of the transcription. It contains the UPE's (upstream promoter elements). written sequence elements that are necessary for efficient transl ription.
  • the regulatory control sections which may be intertwined with the UPE's, have sequence elements which may be involved in the signal-dependent regulation of transcription by hormones, growth factors, etc. They combine tissue or cell-specific promoter properties.
  • a characteristic feature of eukaryotic genes are DNA segments that can influence gene expression over comparatively large distances. These elements can be located upstream, downstream or within a transcription unit and, regardless of their orientation, theirs
  • sequence segments can increase (weaken) the promoter activity (enhancer) or (silencer). Similar to the promoter regions, enhancers and silencers harbor several binding sites for transcription factors.
  • the invention relates to the DNA sequences from the 5 'flanking region of the gene of the catalytically active human telomerase subunit and intron sequences for this gene.
  • the invention particularly relates to the 5 'flanking regulatory DNA
  • the invention further relates to regulatory regions of the 5'-flanking regulatory DNA sequence according to FIG. 4 (SEQ ID NO 1).
  • the present invention furthermore relates to intron sequences for the gene of the human catalytic telomerase subunit, in particular those which have a regulatory effect.
  • the intron sequences according to the invention are described in detail in the context of Example 5 (cf. SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
  • the invention further relates to a recombinant construct which contains the DNA sequences according to the invention, in particular the 5 '-flanking DNA sequence of the gene of the human catalytic telomerase subunit or partial regions thereof.
  • Recombinant constructs which, in addition to the DNA sequences according to the invention, in particular the 5 ′ -flanking DNA sequence of the gene of the human catalytic telomerase subunit or partial regions thereof, contain one or more further DNA sequences which code for polypeptides or proteins.
  • these further DNA sequences code for antitumor proteins.
  • antitumor proteins are those which directly or indirectly inhibit angiogenesis. These proteins include, for example:
  • Plasminogen activator inhibitor PAI-1
  • PAI-2 PAI-2
  • PAI-3 angiostatin
  • endostatin endostatin
  • platelet factor 4 TIMP-1
  • TIMP-2 TIMP-2
  • TIMP-3 leukemia inhibitory factor 4
  • Antitumor proteins which have a cytostatic effect on tumors directly or indirectly are also particularly preferred. These include in particular:
  • Tumor suppressor genes e.g. p53, retinoblastoma.
  • antitumor proteins which optionally stimulate inflammation in addition to the antitumor effect and thereby to
  • Eliminate tumor cells include, for example: RANTES, Monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, Macrophage inflammatory protein (MIP-l ⁇ , -ß), Neutrophil activating protein-2 (NAP-2), IL-3, IL-5, human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF.
  • RANTES Monocyte chemotactic and activating factor
  • MIP-l ⁇ , -ß Macrophage inflammatory protein
  • NAP-2 Neutrophil activating protein-2
  • IL-3 IL-5
  • LIF human leukemia inhibitory factor
  • IL-7 IL-11
  • IL-13 GM-CSF
  • G-CSF G-CSF
  • M-CSF M-CSF
  • antitumor proteins which, because of their action as enzymes, are able to convert precursors of an antitumor agent into an antitumor agent.
  • enzymes include, for example:
  • Catalase or phosphatase human alkaline phosphatase, type 5 acid phosphatase, human lysooxidase, human acid D-aminooxidase, human glutathione peroxidase, human eosinophil peroxidase, human thyroid peroxidase.
  • the above-mentioned recombinant constructs can also contain DNA sequences which code for factor VIII, IX or partial fragments thereof. These DNA sequences also include other blood coagulation factors
  • reporter proteins include, for example:
  • Chloramphenicol acetyl transferase CAT
  • LOC firefly luciferase
  • ß-galactosidase ß-gal
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • hGH human growth hormone
  • GUS ß-glucuronidase
  • GFP GFP and all variants derived from it, Aquarin, Obelin.
  • Recombinant constructs according to the invention can also contain DNA coding for the human catalytic telomerase subunit and its variants and fragments in an antisense orientation.
  • these constructs can also other protein subunits of human telomerase and the telomerase RNA
  • Component in antisense orientation included.
  • the recombinant constructs can also contain other protein subunits of human telomerase and the telomerase RNA
  • the invention further relates to a vector containing the above-mentioned DNA sequences according to the invention, in particular the 5 'flanking DNA sequences, and one or more of the above-mentioned other DNA sequences.
  • a preferred vector for such constructs is a virus, for example a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, vaccina virus, lentiviral virus, Sindbis virus and a Semliki Forest virus.
  • Plasmids are also preferred as vectors.
  • the invention further relates to pharmaceutical preparations containing recombinant constructs or vectors according to the invention; for example, preparation in a colloidal dispersion system.
  • Suitable colloidal dispersion systems are, for example, liposomes or polylysine ligands.
  • Dispersion systems can be supplemented by a ligand that attaches to membrane structures. tures of tumor cells binds.
  • a ligand can, for example, be linked to the construct or the vector or can also be part of the liposome structure.
  • Suitable ligands are in particular polyclonal or monoclonal antibodies or antibody fragments thereof, which bind with their variable domains to membrane structures of tumor cells, or terminal mannose-carrying substances, cytokines, growth factors or fragments or partial sequences thereof which bind to receptors on tumor cells.
  • Corresponding membrane structures are, for example, receptors for a cytokine or a growth factor, such as e.g. IL-1, EGF, PDGF, VEGF, TGF ß, insulin or insulin-like growth factor (ILGF), or adhesion molecules, such as. B. SLeX, LFA-1, MAC-1, LECAM-1 or VLA-4, or the mannose-6-phosphate receptor.
  • a growth factor such as e.g. IL-1, EGF, PDGF, VEGF, TGF ß, insulin or insulin-like growth factor (ILGF), or adhesion molecules, such as. B. SLeX, LFA-1, MAC-1, LECAM-1 or VLA-4, or the mannose-6-phosphate receptor.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to the vector constructs according to the invention, can also contain non-toxic, inert, pharmaceutically suitable excipients.
  • the application e.g. intravenously, intraarterially, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, anal, vaginally, nasally, transdermally, intraperitoneally, as an aerosol or orally
  • at the site of a tumor or the systematic application of these preparations are conceivable.
  • the vector constructs according to the invention can be used in gene therapy.
  • the invention further relates to a recombinant host cell, in particular a recombinant eukaryotic host cell, containing the constructs or vectors described above.
  • the invention further relates to a method for identifying substances which have the promoter, silencer or enhancer activity of catalytic telomerase
  • this method includes the following steps: A. Adding a candidate substance to a host cell containing the regulatory DNA sequence according to the invention, in particular the 5'-flanking regulatory DNA sequence for the gene of the human catalytic telomerase subunit or a regulatory region thereof, functionally linked to one Reporter gene,
  • the procedure can be used to identify substances that
  • Enhance promoter, silencer or enhancer activity of the catalytic telomerase subunit Enhance promoter, silencer or enhancer activity of the catalytic telomerase subunit.
  • the method can also be used to identify substances which have the promoter, silencer or enhancer activity of the catalytic telomerase
  • the invention further relates to a method for identifying factors which are specific to fragments of the DNA fragments according to the invention, in particular the 5 'flanking regulatory DNA sequence of the catalytic telomerase
  • Subunit tie. This method involves screening an expression cDNA library with the above-described DNA sequence or partial fragments of different lengths as a probe.
  • constructs or vectors described above can also be used for the production of transgenic animals.
  • the invention further relates to a method for detecting telomerase-associated conditions in a patient, which comprises the following steps: A. Incubation of a construct or vector containing the DNA sequence according to the invention, in particular the 5 'flanking regulatory DNA sequence for the gene of the human catalytic telomerase subunit or a regulatory region thereof and a reporter gene with body fluids or cellular samples,
  • telomerase-associated state indicates a pathogenic state.
  • Fig. 1 Southern blot analysis with genomic DNA of different species
  • Lane 1 contains Hind III cut ⁇ DNA as size markers (23.5, 9.4, 6.7, 4.4, 2.3, 2.0, and 0.6 kb). Lanes 2 through 10 contain human genomic DNA,
  • FIG. B Autoradiogram of a Southern blot analysis corresponding to FIG. A, hybridized with a radioactively labeled approximately 720 bp long hTC cDNA probe.
  • Fig. 2 Restriction analysis of the recombinant ⁇ DNA of the phage clone P12, which hybridizes with a probe from the 5 'region of the hTC cDNA.
  • the picture shows a photo of an ethidium bromide stained 0.4%
  • Lanes 1 and 2 contain Eco RI / Hind III cut ⁇ DNA or a 1 kb ladder from Gibco as a size marker. Lanes 3 - 7 contain 250 ng of DNA of the recombinant phage cut with Barn HI (lane 3), Eco RI (lane 4), Sal I (lane 5), Xho I (lane 6) and Sac I (lane 7). The arrows indicate the two ⁇ arms of the
  • A The picture shows a photo of an 0.8% agarose gel stained with ethidium bromide. Lanes 1 and 15 contain a 1 kb ladder from Gibco as a size marker. Lanes 2 to 14 contain 250 ng cut ⁇ -DNA from the recombinant phage clone.
  • the enzymes used were: Lane 2: Sac I, Lane 3: Xho I, Lane 4: Xho I, Xba I, Lane 5: Sac I, Xho I, Lane 6: Sal I, Xho I, Xba I, Lane 7: Sac I, Xho I, Xba I, lane 8: Sac I, Sal I, Xba I, lane 9: Sac I, Sal I, BamH I, lane 10: Sac I, Sal I, Xho I, lane 1 1: Not I, lane 12: Sma I, lane 13: empty, lane 14: not digested.
  • Fig. B Autoradiogram of a Southern blot analysis corresponding to Fig. A. An approximately 420 bp long 5'-hTC cDNA fragment was used as a probe for the hybridization.
  • Fig. 4 Partial DNA sequence of the 5 'flanking region and the promoter of the gene of the human catalytic telomerase subunit. The ATG start codon is highlighted in bold in the sequence. The sequence shown corresponds to SEQ ID NO 1.
  • Fig. 5 Identification of the translation start by primer extension analysis.
  • the figure shows an autoradiogram of a denaturing polyacrylamide gel, which was chosen to display a primer extension analysis.
  • An oligonucleotide with the sequence was used as a primer
  • the primer extension reaction was plotted in lane 1.
  • Lanes G, A, T, C, represent the sequence reactions with the same primer and the corresponding dideoxynucleotides.
  • the bold arrow indicates the main transcription start, the thin arrows indicate three secondary
  • Fig. 6 cDNA sequence of the human catalytic telomerase subunit (hTC; see our pending application PCT / EP / 98/03468). The sequence shown corresponds to SEQ ID NO 2.
  • Fig. 7 Structural organization and restriction map of the human hTC gene and its 5 'and 3' flanking region.
  • Fig. 8 HTL splice variants.
  • A Schematic structure of the hTC mRNA splice variants.
  • the complete hTC mRNA is shown as a gray rectangle in the upper area of the figure.
  • the 16 exons are shown according to their size.
  • the translation start (ATG) and the stop codon, as well as the telomerase-specific T motif and the seven RT motifs are highlighted.
  • the hTC variants are divided into deletion and insertion variants.
  • the missing exon sequences are marked in the deletions.
  • the insertions are highlighted by additional white rectangles.
  • the size and origin of the inserted sequences are indicated. Newly created stop codons are marked.
  • Variant INS2 is unknown.
  • Exon sequences are shown in lower case or in upper case.
  • the donor and acceptor sequences of the splice sites are highlighted as gray rectangles and their exon intron origin is also indicated.
  • Fig. 9 Identification of the transcription start by RT-PCR analysis.
  • the RT-PCR was carried out with cDNA library from HL 60 cells and genomic DNA as a positive control.
  • a common 3 ' primer hybridizes to a sequence region from exon 1. The position of the different 5' primers in the coding region or the 5 ' flanking region is indicated. In the negative control there was none Template DNA added in the PCR reaction.
  • M DNA size marker.
  • Translation start codon ATG (+1) are shown.
  • the putative region of the translation start is underlined.
  • Possible regulatory sequence segments within the 4000 bp upstream of the translation start are outlined. The sequence shown corresponds to SEQ ID NO 3.
  • Fig. 1 1 Activity of the hTC promoter in HEK-293 cells.
  • the first 5000 bp of the 5'-flanking hTC gene region are shown schematically in the upper area of the figure.
  • the ATG start codon is highlighted.
  • CpG-rich islands are marked by gray rectangles.
  • the sizes of the hTC promoter-luciferase constructs are shown on the left-hand side of the figure.
  • the motorless pGL2-Basic construct and the SV40 promoter construct pGL2-Pro were used as controls in each transfection.
  • the relative luciferase activity of the various promoter constructs in HEK cells is shown as a continuous bar on the right-hand side of the figure.
  • DNA-binding factors eg transcription factors
  • GCG Sequence Analysis program package from the "Genetics Computer Group” (Madison, USA).
  • ghTC catalytic telomerase subunit
  • 5 ' and 3 ' lying regions of this gene were cloned, the starting point of the transcription was determined, potential binding sites for DNA-binding proteins were identified and active promoter fragments were identified.
  • the sequence of the hTC cDNA (FIG. 6) is already described in our application PCT / ⁇ P / 98/03468, which is also pending. If not mentioned separately, all information on the cDNA position relates to this sequence.
  • a genomic Southern blot analysis determined whether ghTC represents a single gene in the human genome or whether there are multiple loci for the hTC gene or possibly also ghTC pseudogenes.
  • a commercially available zoo blot from Clontech was subjected to a Southern blot analysis.
  • This blot contains 4 ⁇ g Eco RI-cut genomic DNA from nine different species (human, monkey, rat, mouse, dog, cattle, rabbit, chicken and yeast). With the exception of yeast, chicken and
  • Human DNA was isolated from kidney tissue. Human genomic DNA was isolated from placenta and chicken genomic DNA was purified from liver tissue. In the autoradiogram in FIG. 1, an approximately 720 bp long hTC cDNA fragment, isolated from the hTC cDNA, variant Del2 (positions 1685 to 2349 plus 2531 to 2590 of FIG. 6 [Deletion 2; cf. example 5 of Fig. 8]), used. The experimental conditions for the hybridization and the washing steps of the blot were based on Ausubel et al. (1987).
  • the probe recognizes two specific DNA fragments.
  • the smaller Eco RI fragment about 1.5 to 1.8 kb in length, is probably two Eco R1 cleavage back in an intron of ghTC DNA. Based on this result, it can be assumed that there is only one singular ghTC gene in the human genome.
  • 5'-hTC cDNA fragment position 839 to 1345 of FIG. 6 hybridized.
  • the nitrocellulose filters were first in 2 x SSC (0.3 M NaCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 8.0) and then in a prehybridization solution (50% formamide; 5 x SSPE, pH 7.4; 5 x Denhards Solution; 0.25% SDS; 100 ⁇ g / ml herring sperm DNA) incubated at 42 ° C for two hours.
  • SSC 0.3 M NaCl
  • Tris-HCl pH 8.0
  • a prehybridization solution 50% formamide; 5 x SSPE, pH 7.4; 5 x Denhards Solution; 0.25% SDS; 100 ⁇ g / ml herring sperm DNA
  • the prehybridization solution was supplemented overnight with 1.5 ⁇ 10 6 cpm / ml solution of denatured, radioactively labeled sample. Unspecifically bound radioactive DNA was extracted under stringent conditions, ie through three five-minute washing steps with 2 x SSC; 0.1% SDS removed at 55 to 65 ° C. The analysis was carried out by autoradiography of the filters.
  • Phage clone P17 was found with an approximately 250 bp long hTC cDNA fragment (positions 1787 to 2040 of FIG. 6). Phage clone P2 was generated with an approximately 740 bp long hTC cDNA
  • ⁇ -DNA of this clone was analyzed in a Southern blot with a radioactively labeled approximately 440 bp long hTC cDNA fragment (position 1 to 440 of FIG. 6) hybridizes from the extreme 5 'region (FIG. 3).
  • this phage probably also contains the 5' sequence region flanking the ATG start codon.
  • restriction endonucleases were selected for DNA digestion, which on the one hand release the entire insert from EMBL3 Sp6 / T7 (cf. Example 2) and additionally cut in the insert .
  • a total of approximately 8.3 and approximately 6.5 kb Xho I subfragment and approximately 8.5, approximately 3.5 and approximately 3 kb Sac I partial fragments were inserted into the vector pBIuescript KS (+) ( Stratagene) was cloned.
  • the nucleotide sequence of 5123 bp 5 'flanking the ghTC gene region was determined by sequence analysis of these fragments, starting from the ATG start codon (FIG. 4; correspondingly
  • SEQ ID NO 1). 4 shows the first 5123 bp (starting from the ATG start codon). 10 (corresponding to SEQ ID NO 3) the entire cloned 5 'sequence.
  • restriction endonucleases were selected for DNA digestion, which on the one hand release the entire insert from EMLB3 Sp6 / T7 and additionally cut a few times in the insert.
  • a 7J kb, a 4.2 kb and a 1.5 kb XhoI-BamHI fragment and a 1.8 kb BamHI fragment were subcloned by combination digestion with the enzymes Xhol and BamHI.
  • Subfragments were made by digestion with the restriction enzyme Xhol. A total of 7.5 kb, 6.4 kb and 1.6 kb Xhol subfragment were cloned. A 4.8 kb, a 3 kb, a 2 kb and a 1.8 kb Sacl fragment were additionally subcloned by digestion with the restriction enzyme Sacl.
  • the approximately 13.5 kb insert of the phage clone P3 was subcloned by digestion with the restriction enzymes Sacl or Xhol.
  • the approximately 13.2 kb insert of phage clone P5 was subcloned by digestion with the restriction enzymes Sacl or Xhol. A total of 6.5 kb, 3.3 kb, 3.2 kb, 0.8 kb and 0.3 kb size SacI fragments and 7 kb and 3.2 kb size Xhol fragments were subcloned.
  • 3 genomic walks were carried out using the Genome Walker TM kit from Clontech (catalog number Kl 803-1) and various primer combinations.
  • 1 ⁇ l of human GenomeWalker Library HDL (from Clontech) was mixed with 10 pmol dNTP mix and a PCR reaction was carried out in 1 ⁇ Klen Taq PCR reaction buffer and 1 ⁇ Advantage Kien Taq polymerase mix (from Clontech).
  • the subcloned fragments and the Genomic Walking products were sequenced in single strands. Overlapping areas were identified and contigs formed using the Lasergene Biocomputing Software (DNASTAR Inc. Madison, Wisconsin, USA). A total of 2 large contigs were compiled from the collected sequences of the phage clones P12, P17, P2, P3 and P5 and the sequence data from the genomic walking. Contig 1 consists of sequence data from phage clone P12, P17 and the sequence data from genomic walking. Contig 2 was assembled from the sequences of phage clones P2, P3 and P5. Overlapping phage clone areas are shown schematically in FIG. 7. The sequence data of the 2 contigs are shown below. The ATG
  • CAGGCACTCC CCCAGATTCT AGGGCCTGGT TGCTGCTTCC CGAGGGCGCC ATCTGCCCTG GAGACTCAGC 6580
  • GAGACCATCT TTCTGGGTTC CAGGCCCTGG ATGCCAGGGA CTCCCCGCAG GTTGCCCCGC CTGCCCCAGC 12530 GCTACTGGCA AATGCGGCCC CTGTTTCTGG AGCTGCTTGG GAACCACGCG CAGTGCCCCT ACGGGGGGCT
  • ACAGCAGCCC CTGGCAGGTG TACGGCTTCG TGCGGGCCTG CCTGCGCCGG CTGGTGCCCC CAGGCCTCTG 12810
  • TTACCTATAA TCCTCTTCGC AATTTCAAGG GTGGGAATGA GAGGTGGGGA CGAGAACCCC CTCTTCCTGG 13370
  • CTCGTTGCCT CCTGGTCACT GGGCATTTGC TTTTATTTCT CTTTGCTTAG TGTTACCCCC TGATCTTTTT 17220 ATTGTCGTTG TTTGCTTTTG TTTATTGAGA CAGTCTCACT CTGTCACCCA GGCTGGAGTG TA90GGCAC
  • ACAGGTGCAA GCCACCGTGC CCGGCATACC TTGATCTTTT AAAATGAAGT CTGAAACATT GCTACCCTTG 17570 TCCTGAGCAA TAAGACCCTT AGTGTATTTT AGCTCTGGCC ACCCCCCAGC CTGTGTGCTG TTTTCCCTGC 17640
  • TTGTCGCCCA ACAGGAGCAT GACGTGAGCC ATGTGGATAA TTTTAAAATT TCTAGGCTGG GCGCGGTGGC 18270 TCACGCCTGT AATCCCAGCA CTTTGGGAGG CCAAGGCGGG TGGATCACGA GGTCAGGAGG TCGAGACCAT 18340
  • CAGACGGTGC CAGACCATGC GGTGAGCTGG ATATGCGGTG TCCGGATGGT GCAGGTCTGG GGTGAGGTTG 19320 CCAGGCCCTG CTGTGAGTTG GATGTGGGGT GTCCGGATGC TGCAGGTCCGTC90GGGG
  • CTCCTCTCGG GGGGCCTGTG GTGGCCATGG GGCAGGCGGC CTGGGAGAGC TGCCGTCACA CAGCCACTGG 5530
  • CTTCTGTCAC GTCACCCAGG TTCCGTTAGG GTCCTTGGGG AGATGGGGCT GGTGCAGCCT GAGGCCCCAC 7910
  • CTGTGTCCAA GTGTTCTCAT TGTTCAGTTC CCACCTGTGA GTGAGAACAT GTGGTGTTTG GTTTTCTTTC 8330
  • AAAGCTGTAA AGGGAACCCT CAGAAAATGT GGCCGCCAGG GGTGGTTTCA GGTGCTTTGC TGGGCTGTGT 10360
  • CTGCCAGGCC CAGCACCCTG CTCCAAATCA CCACTTCTCT GGGGTTTTCC AAAGCATTTA ACAAGGGTGT 11410
  • CTGTGGGAGT GAGGGTGCTC ACAACGGGAG CAGTTTTCTG TGCTATTTTG GTAAAAGGAA ATGGTGCACC 11900
  • CTGCACTCCA GCCTGGGCAA CAGAGTGAGA CTTCATCTTA AAAAAAAAAA AAAAAGTATC AGCATTCCAA 12670
  • TTCTCCTAAC CACCTGAGAG GTAGAGGAGG AAAGGCTCCA GGGGAGCAGC CGCCCTTGGT CACCCAGCTG 14210
  • AAGTCAGACC CATAGGCTCA GGGTGAGCCG GAGCCCAAGG TCGTGTTGGG GATGGCTGTG AAAGAAGAAA 14350
  • CAAGAATCGA CAACTTTATC ACAGAGGGAA GGGCCAATCT GTGGAGGCCA CAGGGCCAGC TTCTGCCTGG 17150 AGTCAGGGCA GGTGGTGGCA CAAGCCTCGG GGCTGTACCA AAGGGCAGTC GGGCACCACCC 172 GGCCG
  • CTGAAATTCA AGCCATGTCG AACCTGCGGT CCTGAGCTTA ACAGCTTCTA CTTTCTGTTC TTTCTGTGTT 20440
  • Exon-intron structure of the hTC gene The genomic organization of the hTC gene is shown schematically in FIG. 7. The coding region of the hTC gene is exposed 16 exons together, which vary in size between 62 bp and 1354 bp (see Table 1). Exon 1 contains the translation start codon ATG. The translation stop codon TGA and the 3 'untranslated region lie on exon 16 (FIG. 8). A possible polyadenylation signal (AATAAA) was not found either in exon 16 or in the 3195 bp of the following 3 'flanking region. Based on the
  • the exon-intron transitions were determined and listed in Table 1. With the exception of the 5 'splice site between exon 15 and intron 15, all exon-intron transitions match the published (Shapiro and Senapathy, 1987) splice consensus sequence. The size of the introns is between 104 bp and 8616 bp. Since Intron 6 was only partially isolated, the exact length of the hTC gene cannot be determined. Based on the partial sequence of -4660 bp obtained from Intron 6, the minimum size of the hTERT gene is 37 kb.
  • Introns 1-5 and the 5 'region of the intron 6 are contained in Contig 1: Intron 1: bp 11493-11596 (SEQ ID NO 4); Intron 2: bp 12951-21566 (SEQ ID NO 5); Intron 3: bp 21763-23851 (SEQ ID NO 6); Intron 4: bp 24033-24719 (SEQ ID NO 7);
  • Intron 5 bp 24900-25393 (SEQ ID NO 8); 5 'region of intron 6: bp 25550-26414 (SEQ ID NO 9).
  • Intron 7 bp 3879-4858 (SEQ ID NO 11);
  • Intron 8 bp 4945-7429 (SEQ ID NO 12);
  • Intron 9 bp 7544-9527 (SEQ ID NO 13); Intron 10: bp 9600-1 1470 (SEQ ID NO 14);
  • Intron 11 bp 11660-15460 (SEQ ID NO 15;
  • Intron 12 bp 15588-16467 (SEQ ID NO 16);
  • Intron 13 bp 16530-19715 (SEQ ID NO 17);
  • Intron 14 19841-20621 (SEQ ID NO 18); Intron 15: 20760-21295 (SEQ ID NO 19).
  • the 3 'non-transcribed area is also in Contig 2 at position 21960-25138 (SEQ ID NO 20).
  • the introns have the following sequences: Intron 1 (SEQ ID NO 4)
  • telomerase-characteristic T motif is located on exon 3.
  • the RT (reverse transcriptase) motifs 1-7 which are important for the catalytic function of telomerase are located on the following exons: RT motif 1 and 2 on exon 4, RT motif 4 Exon 9, RT motif 5 on exon 10, RT motif 6 and 7 on exon 11.
  • RT motif 3 is distributed on exon 5 and 6 (see Fig. 8).
  • the elucidation of the exon-intron structure of the hTC gene also shows that the four deletion or insertion variants of the hTC cDNA described in our patent application PCT / EP / 98/03469, as well as three others, as described in the literature (Kilian et al., 1997) described hTC insertion variants most likely represent alternative splice products. As shown in Fig. 8, the splice variants can be divided into two groups: deletion variants and insertion variants.
  • variants of the deletion group lack specific sequence segments.
  • the 36 bp in frame deletion in variant DEL1 most likely results from the use of an alternative 3 'splice acceptor sequence in exon 6, whereby part of the RT motif 3 is lost.
  • variant DEL2 the normal 5 'splice donor and 3' splice acceptor sequences from intron 6, 7 and 8 are not used. Instead, exon 6 is fused directly to exon 9, causing the open reading frame to shift and exon 10 to have a stop codon.
  • Variant Del3 represents a combination of variants 1 and 2.
  • the group of insertion variants is characterized by the insertion of intron sequences that lead to premature translation stop.
  • an alternative, 3' localized splice site in variant INS1 is used, which results in an insertion of the first 38 bp from intron 4 between exon 4 and exon 5.
  • This also results in Insertion of an intron 1 1 sequence region in variant INS2 from the use of an alternative 5 'splice donor sequence in intron 1 1. Since this variant has been insufficiently described in the literature (Kilian et al., 1997), the exact alternative 5 can be Do not determine the splice donor sequence of this variant.
  • the insertion of intron 14 sequences between exon 14 and exon 15 in variant INS3 results from the use of an alternative 3 ′′ splice acceptor sequence, as a result of which the 3 ′ part of intron 14 is not spliced.
  • the hTC variant INS4 (variant 4) described in our patent application PCT / EP / 98/03469 is characterized by the replacement of exon 15 and the 5 ′ portion of
  • proteins encode without reverse transcriptase activity, they could still play a crucial role as transdominant-negative telomerase regulators, e.g. compete for interaction with important attachment partners.
  • the 5 ' end of the hTC mRNA was determined by primer extension analysis.
  • the primer extension was carried out in a total volume for 1 h at 58 ° C.
  • the reaction was stopped by 4 ⁇ l of 0.5 M EDTA, pH 8.0 and the RNA was degraded after 30 ⁇ l of RNaseA (10 mg / ml) for 30 min at 37 ° C.
  • 2.5 ⁇ g of sheared calf thymus DNA and 100 ⁇ l of TE were added and extracted once with 150 ⁇ l of phenol / chloroform (1: 1).
  • the DNA was added with the addition of 15 ul 3 M Na
  • a main transcription start site was identified, the 1767 bp 5 ' from
  • ATG start codon of the hTC cDNA sequence is located (nucleotide position 3346 in
  • TTA + I TTGT The nucleotide sequence around this main transcription start (TTA + I TTGT) also represents an initiator element (Inr), which is in 6 of 7 nucleotides agrees with the consensus motif (PyPyA +1 Na / tPyPy) (Smale, 1997) of an initiator element.
  • TATA box No clear TATA box could be identified in the immediate vicinity of the experimentally identified main transcription start, so that the hTC promoter can probably be classified into the family of TATA-free promoters (Smale, 1997).
  • a potential TATA box from nucleotide position 1306 to 131 1 was found by bioinformatics analysis. The additional transcription starts observed around the main transcription start were also described for other TATA-less promoters (Geng and Johnson, 1993), e.g. in the highly regulated promoters of some cell cycle genes (Wick et al, 1995).
  • HL60 cells Starting point of the hTC transcript, a further translation start area would be identified in HL60 cells.
  • the region of the transcription start of the hTC gene in HL60 cells was limited to the bp -60 to -105 using RT-PCR analyzes.
  • genomic DNA was also used as a control for the PCR.
  • genomic DNA was also used as a control for the PCR.
  • Figure 9 only with the primer combinations HTRT5B-C5Rschreib, C5S-C5Rschreib and PRO-TESTl-C5Rschreib a PCR product was obtained, indicating that the starting point of hTC transcription in the region between bp-60 and bp-105 lies.
  • CpG Islands In the approximately 11.2 kb isolated 5 'flanking region of the hTC gene, there are several extremely GC-rich areas, so-called CpG Islands.
  • a CpG Islands with a GC content of> 70% ranges from bp - 1214 to intron 2.
  • Two other GC-rich areas with a GC content of> 60% range from bp -3872 to bp -31 13 or bp -5363 to bp -3941.
  • the location of the CpG Islands is shown graphically in Fig. 1 1.
  • Pattem "algorithm from the" GCG Sequence Analysis "program package from the” Genetics Computer Group "(Madison, USA) was carried out. As a result, various potential binding sites in the region up to -900 bp were upstream from Translation start codon ATG identified: five Spl binding sites, one c-Myc binding site, one CCAC box (FIG. 10). In addition, a CCAAT box and a second c-Myc binding site were found at positions -1788 and -3995 of the 5'-flanking region.
  • hTC promoter sequence sections were generated by PCR amplification and cloned 5 'before the reporter gene luciferase into the vector pGL2 from Promega.
  • the 8.5 kb SacI fragment subcloned from the P12 phage clone was chosen as the source for the PCR amplification.
  • 35 ng of this DNA was mixed with 10 pmol dNTP mix and one in lxPCR reaction buffer (PCR optimizer kit from InVitrogen) and a unit platinum Taq DNA polymerase (from Gibco / BRL) PCR reaction performed.
  • PCR optimizer kit from InVitrogen
  • a unit platinum Taq DNA polymerase from Gibco / BRL
  • the PCR was carried out in 3 steps. A two-minute denaturation at 94 ° C was followed by 30 PCR cycles in which the DNA was first denatured for 45 sec at 94 ° C and then the primers were attached for 5 min at 68 ° C and the DNA chain was extended. Finally, the chain was extended at 68 ° C for 10 min.
  • the primer PK-3A (5'-GCAAGCTTGACGCAGCGCTGCCTGAAACTCG-3 ', position -43 to -65) was chosen as the 3'-PCR primer, which recognizes a sequence region 42 bp upstream from the START codon ATG.
  • a 4051 bp promoter fragment was amplified (NPK8) by combining the PK-3A primer with the 5'-PCR primer PK-5B (5'-CCAGATCTCTGGAACACAGAGTGGCAGTTTCC-3 ', position -4093 to -4070).
  • the combination of the primer pair PK-3A and PK-5C (5'--
  • a 2068 bp promoter fragment was obtained by using the primer combination PK-3A and PK-5D (5'- GGAGATCTGATCTTGGCTTACTGCAGCCTCTG-3 ', position -2110 to -2087) amplified (NPK22).
  • the use of the primer combination PK-3A and PK-5E (5'-GGAGATCTGTCTGGATTCCTGGGAAGTCCTCA-3 ', position -1125 to -1102) finally led to the amplification of a 1083 bp promoter fragment (NPK27).
  • the PK-3A primer contains a HindIII recognition sequence.
  • the various 5 'primers contain a BglII recognition sequence.
  • the resulting PCR products were purified using the QIA quick spin PCR purification kit from Qiagen, according to the manufacturers, and then digested with the restriction enzymes Bglll and Hindlll.
  • the pGL2 promoter vector was digested with the same restriction enzymes and the SV40 promoter contained in this vector was released and separated.
  • the PCR promoter fragments were ligated into the vector and transformed into competent DH5 ⁇ bacteria from Gibco / BRL. Transformed bacterial clones became DNA for the promoter-activity analyzes described below using Qiagen
  • the activity of the hTC promoter was analyzed in transient transfections in eukaryotic cells.
  • CHO-Kl and HEK 293 cells were purchased from the American Type Culture collection.
  • CHO-Kl cells were kept in DMEM Nut Mix F-12 cell culture medium (Gibco-BRL, order number: 21331-020) with 0.15% streptomycin / penezillin, 2 mM glutamine and 10% FCS (Gibco-BRL) .
  • HEK 293 cells were cultivated in DMOD cell culture medium (Gibco-BRL, order number: 41965-039) with 0J5% streptomycin / penicillin, 2 mM glutamine and 10% FCS (Gibco-BRL).
  • CHO-Kl and HEK 293 cells were cultivated in a water-saturated atmosphere at 37 ° C. with gassing with 5% CO 2 .
  • the medium was suctioned off, the cells were washed with PBS (100 mM KH 2 PO 4 pH 7.2; 150 mM NaCl) and detached by adding a trypsin-EDTA solution (Gibco-BRL).
  • the trypsin was inactivated by adding the medium and the number of cells was determined using a Neubauer counting chamber in order to plate out the cells in the desired density.
  • HEK 293 cells were plated out in a 24 well cell culture plate per well. After 3 hours the HEK 293 medium was removed. Up to 2.5 ⁇ g of plasmid DNA, 1 ⁇ g of a CMV ß-Gal plasmid construct (Stratagene, order number: 200388), 200 ⁇ l serum-free medium and 10 ⁇ l transfection reagent (DOTAP from Boehringer Mannheim) were used for the transfection for 15 Incubated for minutes at room temperature and then dripped evenly onto the HEK 293 cells. After 3 hours, 1.5 ml of medium were added. The medium was changed after 20 hours. After another 24
  • the cells were harvested for hours to determine the luciferase and the ⁇ -gal activity. For this, the cells were lysed in the cell culture lysis reagent (25 mM Tris [pH 7.8] with H 3 PO 4 ; 2 mM CDTA; 2 mM DTT; 10% glycerol; 1% Triton X-100) for 15 minutes at room temperature. Twenty ul of this cell lysate was treated with 100 ul luciferase assay buffer (20mM tricine; 1.07mM (MgCO 3 ) Mg (OH) 5H 2 O;
  • Galactosidase assay buffer 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.3; 1 mM MgCl 2 ; 50 mM ⁇ -mercaptoethanol; 0.665 mg / ml ONPG) for at least 30 minutes at 37 ° C or until a slight yellow color appears.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of 1 M Na 2 CO 3 and the absorption at 420 nm was determined.
  • the standard deviation was also given.
  • the NPK 27 construct shows a 40-fold higher luciferase activity than the basal activity of the promoterless luciferase control construct (pGL2-basic) and a 2 to 3-fold higher activity than the SV40 promoter control construct (pGL2PRO).
  • pGL2-basic the basal activity of the promoterless luciferase control construct
  • pGL2PRO the promoterless luciferase control construct
  • pGL2PRO the SV40 promoter control construct
  • RNA component of human telomerase Science 269, 1236-1241.
  • telomere sequence (TTAGGG) n among vertebrates. Proc. Natl. Acad. Be. 86, 7049-7053.
  • RNA splice junetions of different classes of eukaryotes sequence statistics and functional implications in gene expression. Nucl. Acids Res. 15, 7155-7174.

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Abstract

Diese Erfindung betrifft regulatorische DNA-Sequenzen, beinhaltend Promotorsequenzen, sowie Intronsequenzen, für das Gen der humanen kalytischen Telomerase-Untereinheit. Darüber hinaus betrifft diese Erfindung die Verwendung dieser DNA-Sequenzen für pharmazeutische, diagnostische und therapeutische Zwecke, vor allem in der Behandlung von Krebs und Alterung.

Description

Regulatorische DNA-Sequenzen des Gens der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit und deren diagnostische und therapeutische Verwendung
Aufbau und Funktion der Chromosomenenden
Das genetische Material eukaryontischer Zellen ist auf linearen Chromosomen verteilt. Die Enden der Erbanlagen werden, abgeleitet von den griechischen Wörtern telos (Ende) und meros (Teil, Segment), als Telomere bezeichnet. Die meisten Telomere bestehen aus Wiederholungen von kurzen Sequenzen, die überwiegend aus
Thymin und Guanin aufgebaut sind (Zakian, 1995). In allen bislang untersuchten Wirbeltieren werden die Telomere aus der Sequenz TTAGGG aufgebaut (Meyne et al, 1989).
Die Telomere üben verschiedene wichtige Funktionen aus. Sie verhindern die Fusion von Chromosomen (McClintock, 1941) und damit die Entstehung von dizentrischen Erbanlagen. Solche Chromosomen mit zwei Centromeren können durch Verlust der Heterozygotie bzw. Verdopplung oder Verlust von Genen zur Entwicklung von Krebs führen.
Desweiteren dienen Telomere dazu, intakte Erbanlagen von beschädigten zu unterscheiden. So stellten Hefezellen ihre Zellteilung ein, wenn sie ein Chromosom ohne Telomer enthielten (Sandeil und Zakian, 1993).
Eine weitere wichtige Aufgabe erfüllen Telomere bei der DNA-Replikation eukaryontischer Zellen. Im Gegensatz zu den zirkulären Genomen von Prokaryonten können die linearen Chromosomen der Eukaryonten von dem DNA Polymerase- Komplex nicht vollständig repliziert werden. Zur Initiation der DNA-Replikation sind RNA-Primer notwendig. Nach Abspaltung der RNA-Primer, Verlängerung der Okazaki-Fragmente und anschließender Ligation fehlt dem neu-synthetisierten DNA-
Strang das 5'-Ende, denn dort kann der RNA-Primer nicht durch DNA ersetzt werden. Ohne besondere Schutzmechanismen würden daher die Chromosomen mit jeder Zellteilung sclrrumpfen ("end-replication problem"; Harley et al, 1990). Die nicht-kodierenden Telomersequenzen stellen vermutlich eine Pufferzone dar, um dem Verlust von Genen vorzubeugen (Sandell und Zakian, 1993).
Darüberhinaus spielen Telomere auch eine wichtige Rolle bei der Regulation der zellulären Alterung (Olovnikov, 1973). Humane somatische Zellen zeigen in Kultur eine limitierte Replikationskapazität; sie werden nach einer gewissen Zeit seneszent. In diesem Zustand teilen sich die Zellen selbst nach Stimulierung mit Wachstumsfak- toren nicht mehr, sterben aber nicht, sondern bleiben metabolisch aktiv (Goldstein,
1990). Verschiedene Beobachtungen sprechen für die Hypothese, daß eine Zelle anhand der Länge ihrer Telomere bestimmt, wie oft sie sich noch teilen kann (Allsopp et al, 1992).
Zusammenfassend besitzen die Telomere somit zentrale Funktionen bei der Alterung von Zellen sowie der Stabilisierung des genetischen Materials und Verhinderung von Krebs.
Das Enzym Telomerase synthetisiert die Telomere
Wie oben beschrieben können Organismen mit linearen Chromosomen ohne einen speziellen Schutzmechanismus ihr Genom nur unvollständig replizieren. Die meisten Eukaryonten verwenden zur Regeneration der Telomersequenzen ein spezielles Enzym, die Telomerase. In den bislang untersuchten Einzellern wird Telomerase konsti- tutiv exprimiert. Dagegen wurde in Menschen die Telomerase-Aktivität nur in Keimzellen und Tumorzellen gemessen, wogegen benachbartes somatisches Gewebe keine Telomerase enthielt (Kim et al, 1994).
Funktioneil kann die Telomerase auch als terminale Telomertransferase bezeichnet werden, die als Multiproteinkomplex im Zellkern lokalisiert ist. Während der RNA-
Anteil der humanen Telomerase schon seit längerem bekannt ist (Feng et al, 1995), wurde kürzlich die katalytische Untereinheit dieser Enzymgruppe in verschiedenen Organismen identifiziert (Lingner et al, 1997; vgl. unsere ebenfalls anhängige Anmeldung PCT EP/98/03468). Diese katalytischen Untereinheiten der Telomerase sind sowohl untereinander als auch zu bisher allen bekannten reversen Transkriptasen auffällig homolog.
Auch in WO 98/14592 werden Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der katalytischen Telomerase-Untereinheit beschrieben.
Aktivierung der Telomerase in menschlichen Tumoren
Eine Aktivität der Telomerase konnte in Menschen ursprünglich nur in Keimbahnzellen, nicht aber in normalen somatischen Zellen (Hastie et al., 1990; Kim et al., 1994) nachgewiesen werden. Nach der Entwicklung eines sensitiveren Nachweisverfahrens (Kim et al, 1994) wurde auch in hematopoieüschen Zellen eine geringe Telomerase- aktivität detektiert (Broccoli et al, 1995; Counter et al, 1995; Hiyama et al, 1995). Allerdings wiesen diese Zellen trotzdem eine Reduktion der Telomere auf (Vaziri et al, 1994; Counter et al, 1995). Noch ist nicht geklärt, ob die Menge an Enzym in diesen Zellen nicht ausreichend für eine Kompensation des Telomerverlustes ist. oder ob die gemessene Telomerase- Aktivität von einer Subpopulation, z.B. unvollständig ausdifferenzierten CD34+38+-Vorläuferzellen, heιτührt (Hiyama et al, 1995). Zur Klärung wäre ein Nachweis der Telomerase-Aktivität in einer einzelnen Zelle nötig.
Interessanterweise wurde jedoch in einer großen Zahl der bislang getesteten Tumor- gewebe eine signifikante nachgewiesen (1734/2031, 85 %;
Shay, 1997), während in normalem somatischen Gewebe keine Aktivität gefunden wurde (1/196, <1 %, Shay, 1997). Verschiedene Untersuchungen zeigten außerdem, daß in seneszenten Zellen, die mit viralen Oncoproteinen transformiert wurden, die Telomere weiterhin schrumpften und Telomerase nur in der Subpopulation entdeckt werden konnte, die die Wachstumskrise überlebte (Counter et al., 1992). In diesen immortalisierten Zellen waren auch die Telomere stabil (Counter et al, 1992). Ähnli- ehe Befunde aus Untersuchungen an Mäusen (Blasco et al, 1996) stützen die An- nahme, daß eine Reaktivierung der Telomerase ein spätes Ereignis in der Tumorgenese ist.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine "Telomerase-Hypothese" entwickelt, die den Verlust von Telomersequenzen und Zellalterung mit der Aktivität von Telomerase und der Entstehung von Krebs verbindet. In langlebigen Spezies wie dem Menschen kann das Schrumpfen der Telomere als ein Mechanismus zur Tumor- suppression angesehen werden. Ausdifferenzierte Zellen, die keine Telomerase enthalten, stellen bei einer bestimmten Länge der Telomere ihre Zellteilung ein.
Mutiert eine solche Zelle, so kann aus ihr nur dann ein Tumor entstehen, wenn die Zelle ihre Telomere verlängern kann. Ansonsten würde die Zelle weiterhin Telomersequenzen verlieren, bis ihre Chromosomen instabil werden und sie schließlich zugrunde geht. Die Reaktivierung der Telomerase ist vermutlich der Hauptmechanis- mus von Tumorzellen zur Stabilisation ihrer Telomere.
Aus diesen Beobachtungen und Überlegungen ergibt sich, daß eine Inhibition der Telomerase eine Therapie von Tumoren erlauben sollte. Konventionelle Krebstherapien mit Zytostatika oder kurzwelligen Strahlen schädigen nicht nur die Tumorzellen, sondern alle sich teilenden Zellen des Körpers. Da aber außer Tumorzellen nur
Keimbahnzellen eine signifikante Telomerase-Aktivität enthalten, würden Telomerase-lnliibitoren spezifischer die Tumorzellen angreifen und somit weniger unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen. In allen bislang getesteten Tumorgeweben wurde eine Telomerase-Aktivität nachgewiesen, so daß diese Therapeutika gegen alle Krebsarten eingesetzt werden könnten. Die Wirkung von Telomerase-lnliibitoren würde dann eintreten, wenn die Telomere der Zellen sich soweit verkürzt haben, daß das Genom instabil wird. Da Tumorzellen meist kürzere Telomere aufweisen als normale somatische Zellen, würden zuerst Krebszellen durch Telomerase-Inhibitoren eliminiert werden. Zellen mit langen Telomeren, wie die Keimzellen, würden dagegen erst viel später geschädigt werden. Telomerase-Inhibitoren stellen somit einen zukunftsweisenden Weg für die Therapierung von Krebs dar. Eindeutige Antworten auf die Frage nach der Art und den Angriffspunkten physiologischer Telomerase-Inhibitoren werden möglich sein, wenn auch die Regulation der Genexpression der Telomerase identifiziert ist.
Regulation der Genexpression in Eukaryonten
Die eukaryotische Genexpression, d.h. der zelluläre Informationsfluß von der DNA über die RNA zum Protein, weist vielfältige Ansatzpunkte für regulatorische Mecha- nismen auf. Einzelne Kontrollstufen sind z.B. die Gen-Amplifikation, Rekombination von Genloci, Chromatinstruktur, DNA-Methylierung, Transkription, posttrans- kriptionelle mRNA-Modifikationen, mRNA-Transport, Translation und post-trans- lationale Proteinmodifikationen. Nach bisherigen Studien besitzt die Kontrolle auf der Ebene der Transkriptionsinitiation die größte Bedeutung (Latchman, 1991).
Unmittelbar stromaufwärts vom Transl riptionsstart eines von der RNA-Polymerase II transkribierten Gens liegt eine Region, die für die Steuerung der Transl ription verantwortlich ist und als Promotorregion bezeichnet wird. Ein Vergleich der Nukleo- tidsequenzen von Promotorregionen vieler bekannter Gene zeigt, daß bestimmte Sequenzmotive in dieser Region häufig vorkommen. Zu diesen Elementen gehören unter anderem die TATA-Box, die CCAAT-Box und die GC-Box, die von spezifischen Proteinen erkannt werden. Die TATA-Box, die etwa 30 Nukleotide stromaufwärts vom Transkriptionsstart entfernt positioniert ist, wird z.B. von der TFIID- Untereinheit TBP („TATA-box binding protein") erkannt, wogegen bestimmte GC- reiche Sequenzabschnitte vom Transkriptionsfaktor Spl („specificity protein 1") spezifisch gebunden werden.
Funktionen kann man den Promotor in einen regulativen und einen konstitutiven Abschnitt unterteilen (Latchman, 1991). Der konstitutive Kontrollbereich umfaßt den sogenannten Kernpromotor („corepromoter"), der die korrekte Initiation der Transkription ermöglicht. Er enthält die als UPE's (upstream promoter elements") be- schriebenen Sequenzelemente, die für eine effiziente Transl ription notwendig sind. Die regulativen Kontrollabschnitte, die mit den UPE's verflochten sein können, weisen Sequenzelemente auf, die an der signalabhängigen Regulation der Transkription durch Hormone, Wachstumsfaktoren usw. beteiligt sein können. Sie ver- mittein gewebs- oder zellspezifische Promotoreigenschaften.
Ein charakteristisches Merkmal eukaryotischer Gene sind DNA-Abschnitte, die über vergleichsweise große Distanzen hinweg Einfluß auf die Genexpression nehmen können. Diese Elemente können stromaufwärts, stromabwärts oder innerhalb einer TranSakriptionseinheit lokalisiert sein und unabhängig von ihrer Orientierung ihre
Funktion wahrnehmen. Diese Sequenzabschnitte können die Promotoraktivität verstärken (Enhancer) oder abschwächen (Silencer). Ähnlich wie die Promotorregionen beherbergen auch Enhancer und Silencer mehrere Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren.
Die Erfindung betrifft die DNA-Sequenzen aus der 5 '-flankierenden Region des Gens der katalytisch aktiven humanen Telomerase-Untereinheit sowie Intronsequenzen für dieses Gen.
Die Erfindung betrifft insbesondere die 5 '-flankierende regulatorische DNA-
Sequenz, enthaltend die Promotor-DNA-Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telomerase Untereinheit gemäß Fig. 10 (SEQ ID NO 3).
Die Erfindung betrifft weiterhin regulatorisch wirksame Teilbereiche der 5'-flankie- renden regulatorischen DNA-Sequenz gemäß Fig. 4 (SEQ ID NO 1).
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung Intron-Sequenzen für das Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit, insbesondere solche, die regulatorische Wirkung haben. Die erfindungsgemäßen Intronsequenzen werden im Rahmen von Beispiel 5 detailliert beschrieben (vgl. SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20). Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes Konstrukt, das die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, insbesondere die 5 '-flankierende DNA-Sequenz des Gens der humanen katalytischen Telomerase Untereinheit oder Teilbereiche davon beinhaltet.
Bevorzugt sind rekombinante Konstrukte, die neben den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, insbesondere der 5 '-flankierenden DNA-Sequenz des Gens der humanen katalytischen Telomerase Untereinheit oder Teilbereichen davon, eine oder mehrere weitere DNA-Sequenzen, die für Polypeptide oder Proteine kodieren, enthalten.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodieren diese weiteren DNA-Sequenzen für antitumorale Proteine.
Besonders bevorzugte antitumorale Proteine sind solche, die die Angiogenese direkt oder indirekt inhibieren. Zu diesen Proteinen zählen beispielsweise:
Plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1), PAI-2, PAI-3, Angiostatin, Endostatin, Platelet factor 4, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, Leukemia Inhibitory Factor (LIF).
Ebenfalls besonders bevorzugt sind antitumorale Proteine, welche direkt oder indirekt eine zytostatische Wirkung auf Tumoren aufweisen. Hierzu zählen im besonderen:
Perforin, Granzym, IL-2, IL-4, IL-12, Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFN-ß,
IFN-γ, TNF, TNF-α, TNF-ß, Oncostatin M; Tumorsuppressorgene, wie z.B. p53, Retinoblastoma.
Weiterhin besonders bevorzugt sind antitumorale Proteine, welche gegebenenfalls zusätzlich zur antitumoralen Wirkung Entzündungen stimulieren und hierdurch zur
Elimination von Tumorzellen beitragen. Hierzu zählen beispielsweise: RANTES, Monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, Macrophage inflammatory protein (MIP-lα,-ß), Neutrophil activating protein-2 (NAP-2), IL-3, IL-5, human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF.
Weiterhin besonders bevorzugt sind antitumorale Proteine, welche aufgrund ihrer Wirkung als Enzyme in der Lage sind, Vorstufen eines antitumoralen Wirkstoffes in einen antitumoralen Wirkstoff zu überführen. Zu diesen Enzymen zählen beispiels- weise:
Herpes Simplex Virus Thymidinkinase, Varizella Zoster Virus Thymidi kinase, bakterielle Nitroreductase, bakterielle ß- Glukuronidase, pflanzliche ß-Glukuronidase aus Seeale careale, humane Glukuronidase, humane Carboxypeptidase, bakterielle Carboxypeptidase, bakterielle ß-Lactamase, bakterielle Cytosindeaminidase, humane
Katalase bzw. Phosphatase, humane alkalische Phosphatase, Typ 5 saure Phospha- tase, humane Lysooxidase, humane saure D-Aminooxidase, humane Glutathion Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase, humane Schilddrüsen Peroxidase.
Die obengenannten rekombinanten Konstrukte können auch DNA-Sequenzen enthalten, die für Faktor VIII, IX oder Teilfragmente davon kodieren. Zu diesen DNA- Sequenzen zählen auch andere Blutgerinnungsfaktoren
Die obengenannten rekombinanten Konstrukte können auch DNA-Sequenzen enthal- ten, die für ein Reporterprotein kodieren. Zu diesen Reporterproteinen zählen beispielsweise:
Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Glühwürmchen Luziferase (LUC), ß- Galaktosidase (ß-Gal), Sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP), Humanes Wachstumshormon (hGH), ß-Glukuronidase (GUS), Grün-fluoreszierendes Protein
(GFP) und alle davon abgeleiteten Varianten, Aquarin, Obelin. Erfindungsgemäße rekombinante Konstrukte können auch DNA kodierend für die humane katalytische Telomerase Untereinheit und deren Varianten und Fragmente in antisense Orientierung enthalten. Gegebenenfalls können diese Konstrukte auch andere Protein-Untereinheiten der humanen Telomerase und die Telomerase-RNA-
Komponente in antisense Orientierung enthalten.
Die rekombinanten Konstrukte können neben der DNA, kodierend für die humane katalytische Telomerase Untereinheit, sowie deren Varianten und Fragmente auch andere Protein-Untereinheiten der humanen Telomerase und die Telomerase-RNA-
Komponente enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, enthaltend die oben genannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, insbesondere die 5 '-flankierenden DNA-Sequen- zen, sowie eine oder mehrere der oben genannten anderen DNA-Sequenzen.
Bevorzugter Vektor für solche Konstrukte ist ein Virus, beispielsweise ein Retrovi- rus, Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus, Herpes Simplex Virus, Vaccina Virus, lentivirales Virus, Sindbis Virus und ein Semliki Forest Virus.
Ebenfalls bevorzugt sind Plasmide als Vektoren.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Präparate, enthaltend erfindungsgemäße rekombinante Konstrukte bzw. Vektoren; beispielsweise eine Zube- reitung in einem kolloidalen Dispersionssystem.
Geeignete kolloidale Dispersionssysteme sind beispielsweise Liposome oder Polyly- sin-Liganden.
Die Zubereitungen der erfindungsgemäßen Konstrukte bzw. Vektoren in kolloidalen
Dispersionssystemen können um einen Liganden ergänzt sein, der an Membranstruk- turen von Tumorzellen bindet. Ein solcher Ligand kann z.B. an das Konstrukt bzw. den Vektor angeknüpft sein oder auch Bestandteil der Liposomenstruktur sein.
Geeignete Liganden sind insbesondere polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente hiervon, die mit ihren variablen Domänen an Membranstrukturen von Tumorzellen binden, oder endständige Mannose-tragende Substanzen, Zytokine, Wachstunisfaktoren oder Fragmente bzw. Teilsequenzen hiervon, die an Rezeptoren auf Tumorzellen binden.
Entsprechende Membranstrukturen sind beispielsweise Rezeptoren für ein Zytokin oder einen Wachstumsfaktor, wie z.B. IL-1, EGF, PDGF, VEGF, TGF ß, Insulin oder Insulin-like Growth Factor (ILGF), oder Adhäsionsmoleküle, wie z. B. SLeX, LFA-1, MAC-1, LECAM-1 oder VLA-4, oder der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten auch nichttoxische, inerte, pharmazeutisch geeignete Trägerstoffe enthalten können. Vorstellbar sind die Applikation (z.B. intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan, intradermal, anal, vaginal, nasal, transdermal, intraperitonal, als Aerosol oder oral) am Ort eines Tumors oder die syste- mische Applikation dieser Zubereitungen.
Die erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte können in der Gentherapie eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine rekombinante Wirtszelle, insbesondere eine rekombinante eukaryotische Wirtszelle, enthaltend die vorstehend beschriebenen Konstrukte bzw. Vektoren.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der katalytischen Telomerase
Untereinheit beeinflussen, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfaßt: A. Zugabe einer Kandidatensubstanz zu einer Wirtszelle, enthaltend die erfindungsgemäße regulatorische DNA-Sequenz, insbesondere die 5'-flankie- rende regulatorische DNA-Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit oder einen regulatorisch wirksamen Teilbereich davon, funktionell verl nüpft mit einem Reportergen,
B. Messung des Substanzeffektes auf die Reportergenexpression.
Das Verfal ren kann eingesetzt werden zur Identifizierung von Substanzen, die die
Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der katalytischen Telomerase Untereinheit verstärken.
Das Verfahren kann weiterhin eingesetzt werden zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der katalytischen Telomerase
Untereinheit inhibieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfaliren zur Identifizierung von Faktoren, die spezifisch an Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente, insbesondere der 5 '-flankierenden regulatorischen DNA-Sequenz der katalytischen Telomerase
Untereinheit, binden. Diese Methode beinhaltet ein Screening einer Expressions- cDNA-Bibliothek mit der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilfragmenten unterschiedlichster Länge als Sonde.
Die vorstehend beschriebenen Konstrukte bzw. Vektoren können auch zur Herstellung transgener Tiere verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Detektion Telomerase-assozuerter Zustände bei einem Patienten, das folgende Schritte umfaßt: A. Inkubation eines Konstruktes bzw. Vektors, enthaltend die erfindungsgemäße DNA-Sequenz, insbesondere die 5 '-flankierende regulatorische DNA- Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit oder einen regulatorisch wirksamen Teilbereich davon sowie ein Reportergen mit Körperflüssigkeiten oder zellulären Proben,
B. Detektion der Reportergenaktivität, um einen diagnostischen Wert zu erhalten;
C. Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für das Reportergen- konstrukt in standardisierten normalen Zellen oder Körperflüssigkeiten des gleichen Typs wie die Testprobe;
Detektion diagnostischer Werte, die höher oder niedriger als Standardvergleichswerte liegen, indiziert einen Telomerase-assoziierten Zustand, der wiederum einen pathoge- nen Zustand indiziert.
Erläuterung der Abbildungen:
Fig. 1 : Southern Blot-Analyse mit genomischer DNA verschiedener Spezies
A: Foto eines Ethidiumbromid gefärbten 0,7 %igen Agarosegels mit etwa 4 μg Eco RI geschnittener genomischer DNA. Die Spur 1 enthält Hind III geschnittene λ-DNA als Größenmarker (23,5, 9,4, 6,7, 4,4, 2,3, 2,0, und 0,6 kb). Die Spuren 2 bis 10 enthalten genomische DNA von Mensch,
Rhesusaffe, Spraque Dawley Ratte, BALB/c Maus, Hund, Rind, Kaninchen, Huhn und Hefe (Saccharomyces cerevisiae).
B: Zu FigJ A korrespondierendes Autoradiogramm einer Southern Blot- Analyse, hybridisiert mit einer radioaktiv-markierten etwa 720 bp langen hTC-cDNA Sonde. Fig. 2: Restriktionsanalyse der rekombinanten λ-DNA des Phagenklons P12, der mit einer Sonde aus dem 5 '-Bereich der hTC-cDNA hybridisiert.
Die Abbildung zeigt ein Foto eines Ethidiumbromid gefärbten 0,4 %igen
Agarosegels. Die Spuren 1 und 2 enthalten Eco RI/Hind III gesclinittene λ-DNA bzw eine 1 kb Leiter der Firma Gibco als Größenmarker. Die Spuren 3 - 7 enhalten 250 ng mit Barn HI (Spur 3), Eco RI (Spur 4), Sal I (Spur 5), Xho I (Spur 6) und Sac I (Spur 7) geschnittene DNA des rekombinanten Phagens. Die Pfeile kennzeichnen die zwei λ-Arme des
Vektors EMBL3 Sp6/T7.
Fig. 3: Restriktionsanalyse und Southern Blot-Analyse der rekombinanten λ- DNA des Phagenklons, der mit einer Sonde aus dem 5 '-Bereich der hTC- cDNA hybridisiert.
A: Die Abbildung zeigt ein Foto eines Ethidiumbromid gefärbten 0,8%igen Agarosegels. Die Spuren 1 und 15 enthalten eine 1 kb Leiter der Firma Gibco als Größenmarker. Die Spuren 2 bis 14 enthalten 250 ng geschnittene λ-DNA vom rekombinanten Phagenklon. Als Enzyme wurden eingesetzt: Spur 2: Sac I, Spur 3: Xho I, Spur 4: Xho I, Xba I, Spur 5: Sac I, Xho I, Spur 6: Sal I, Xho I, Xba I, Spur 7: Sac I, Xho I, Xba I, Spur 8: Sac I, Sal I, Xba I, Spur 9: Sac I, Sal I, BamH I, Spur 10: Sac I, Sal I, Xho I, Spur 1 1 : Not I, Spur 12: Sma I, Spur 13: leer, Spur 14: nicht verdaut.
B: Zu FigJ A korrespondierendes Autoradiogramm einer Southern Blot- Analyse. Als Sonde für die Hybridisierung wurde ein etwa 420 bp langes 5'-hTC-cDNA Fragment eingesetzt. Fig. 4: Partielle DNA-Sequenz der 5 '-flankierenden Region und des Promotors vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit. Das ATG-Startcodon ist in der Sequenz fett hervorgehoben. Die dargestellte Sequenz entspricht SEQ ID NO 1.
Fig. 5: Identifizierung des Translcriptionsstarts durch Primer Extension- Analyse.
Die Abbildung zeigt ein Autoradiogramm eines denaturierenden Poly- acrylamidgels, welches zur Darstellung einer Primer Extension-Analyse gewählt wurde. Als Primer wurde ein Oligonukleotid mit der Sequenz
5'GTTAAGTTGTAGCTTACACTGGTTCTC 3 ' benutzt. In der Spur 1 wurde die Primer Extension Reaktion aufgetragen. Die Spuren G, A, T, C, stellen die Sequenzreaktionen mit dem gleichen Primer und den entsprechenden Dideoxynukleotiden dar. Der fette Pfeil kennzeichnet den Haupt-Transkriptionsstart, die dünnen Pfeile weisen auf drei Neben-
Transkriptionsstartpunkte hin.
Fig. 6: cDNA Sequenz der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit (hTC; vgl. unsere anhängige Anmeldung PCT/EP/98/03468). Die dargestellte Sequenz entspricht SEQ ID NO 2.
Fig. 7: Strukturelle Organisation und Restriktionsmappe des humanen hTC- Gens und dessen 5'- und 3 '-flankierende Region.
Exons sind als durchnummerierte schwarz ausgefüllte Rechtecke und
Introns als nicht ausgefüllte Bereiche hervorgehoben. Nichttranslatierte Sequenzabschnitte in den Exons sind schraffiert. Die Translation startet in Exon 1 und endet in Exon 16. Restriktionsenzymschnittstellen sind wie folgt gekennzeichnet: S, Sacl; X, Xhol. Die relative Anordnung der fünf Phagenklone (P2, P3, P5, P12, P17) und des Produktes aus dem
„Genomic walking" sind durch dünne Linien hervorgehoben. Wie durch die Punkte gekennzeichnet, ist die Sequenz von Intron 16 nur teilweise entschlüsselt.
Fig. 8: HTL Splicevarianten.
A: Schematische Struktur der hTC mRNA Splicevarianten. Die vollständige hTC mRNA ist als grau unterlegtes Rechteck im oberen Bereich der Abb. dargestellt. Die 16 Exons sind entsprechend ihrer Größe dargestellt. Der Translationsstart (ATG) und das Stop-Codon, sowie das Telomerase-spezifische T-Motiv und die sieben RT-Motive sind hervorgehoben. Die hTC-Varianten sind in Deletions- und Insertionsvarianten unterteilt. In den Deletionen sind die fehlenden Exonsequenzen markiert. Die Insertionen sind durch zusätzliche weiße Rechtecke hervorgehoben. Größe und Herkunft der insertierten Sequenzen sind angegeben. Neu entstandene Stop-Codons sind markiert. Die Größe der Insertion von
Variante INS2 ist unbekannt.
B: Exon Intron Übergänge der hTC-Splice-Varianten. Nichtgesplicte 5'- und 3 '-flankierte Sequenzen sind als weiße Rechtecke hervorgehoben. Die Herkunft der Exon und Intron Sequenzen ist angegeben. Intron und
Exon Sequenzen sind in Kleinbuchstaben, bzw. in Großbuchstaben dargestellt. Die Donor und Akzeptor Sequenzen der Splicestellen sind als graue Rechtecke unterlegt und deren Exon Intron Herkunft ist ebenfalls angegeben.
Fig. 9: Identifizierung des Transkriptionsstarts durch RT-PCR Analyse.
Die RT-PCR wurde mit cDNA-Bibliothek aus HL 60 Zellen und genomischer DNA als Positivkontrolle durchgeführt. Ein gemeinsamer 3'- Primer hybridisiert an eine Sequenzregion aus Exon 1. Die Position der verschiedenen 5' Primer in der kodierenden Region oder der 5'- flankierenden Region ist angegeben. In der Negativkontrolle wurde keine Template-DNA in der PCR-Reaktion zugegeben. M: DNA-Größen- marker.
Fig. 10: Nukleotidsequenz und Strukturmerkmale des hTC-Promotors. 11273 bp der 5 '-flankierenden hTC Gensequenz, beginnend mit dem
Translationsstartcodon ATG (+1) sind dargestellt. Die putative Region des Translationsstarts ist unterstrichen. Mögliche regulatorische Sequenzabschnitte innerhalb der 4000 bp stromaufwärts des Translationsstarts sind umrandet. Die dargestellte Sequenz entspricht SEQ ID NO 3.
Fig. 1 1 : Aktivität des hTC-Promotors in HEK-293 Zellen.
Im oberen Bereich der Abbildung sind die ersten 5000 bp der 5'- flankierenden hTC Genregion schematisch dargestellt. Das ATG- Startcodon ist hervorgehoben. CpG reiche Inseln sind durch graue Rechtecke markiert. Auf der linken Abbildungsseite sind die Größen der hTC Promotor-Luziferase Konstukte dargestellt. Das pomotorlose pGL2- Basic Konstrukt und das SV40 Promotorkonstrukt pGL2-Pro wurden in jeder Transfektion als Kontrollen eingesetzt. Auf der rechten Abbildungsseite sind ist die relative Luziferaseaktivität der verschiedenen Promotorkonstukte in HEK-Zellen als durchgehende Balken gezeigt. Die
Standardabweichung ist angegeben. Die Zahlenwerte repräsentieren den Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten, die in Duplikaten durchgeführt wurden.
Tab. 1 : Exon Intron Übergänge des hTC-Gens
Aufgelistet sind die Nukleotidsequenzen an den 3 '- und 5' Spliceübergängen des hTC-Gens. Die Konsensussequenzen für Donor und Akzeptorsequenzen (AG und GT) sind durch graue Rechtecke unterlegt. Intronsequenzen (Kleinbuchstaben) und Exonsequenzen (Groß- buchstaben), die die Spliceal zeptor- und Donorstellen flankieren sind gezeigt. Die Größe der Exons und Introns ist in bp angegeben. Tab. 2: Potentielle Bindungsstellen für DNA-bindende Faktoren in der Nukleotidsequenz von Intron 2
Die Suche nach möglichen DNA-bindenden Faktoren (z.B. Transkriptionsfaktoren) wurde mit dem „Find Pattem"-Algorithmuses aus dem „GCG Sequenz Analysis" Programmpacket der „Genetics Computer Group" (Madison, USA) durchgeführt. Aufgelistet sind die Abkürzungen der identifizierten DNA-bindenden Faktoren und deren Lokalisation in Intron 2.
Tab.1
3 ' Acceptor Sequence 5' Donor Sequence
Intron Exon Exon bp Exon Intron Intr bp No. on
No.
5' flankierende Region GTTTCAGGCAGCGCTGCGT 1 281 CGCCCCCTCCTTCCGCCAG gtgggcctccccggggtcg 1 104 cagggcgcttcccccgc ag GTGTCCTGCCTG.AAGGAGC 2 1354 TGGCTGCGCAGGAGCCCAG gtgaggaggtggtggccgt 2 8616 catgtccttctcgtt . ag GGGTTGGCTGTGTTCCGGC 3 196 TGCAAAGCATTGGAATCAG gtactgtatccccacgcca 3 208? gaggggctctctattgcag ACAGCACTTGAAGAGGGTG 4 181 GTTCCGCAGAGAAAAGAGG gtggctgtgctttggttta 4 687 cccatgctgtccccgccag GCCGAGCGTCTCACCTCGA 5 180 TGAGCTGTACTTTGTCAAG gtgggtgccggggaccccc 5 494 ctcgcctccactcacac ag GTGGATGTGACGGGCGCGT 6 156 CAAGGCCTTCAAGAGCCAC gtaaggttcacgtgtgata 6 >4660 ccctctcctctgccggc ag GTCTCTACCTTGACAGACC 7 96 TGCCGTCGTCATCGAGCAG gtctgggcactgccctgca 7 980 ctcccgtctgctttcgc ag AGCTCCTCCCTGAATGAGG 8 86 CCGTGCGCATCAGGGGCAA gtgagtσaggtggccaggt 8 248S ctgtgtcttσccgcσccag GTCCTACGTCCAGTGCCAG 9 114 CGGGGATTCGGCGGGACGG gtgaggcctcctcttcccc 9 1984 gtattttcccttatttt ag GCTGCTCCTGCGTTTGGTG 10 72 ACGCGA.AAACCTTCCTCAG gtgaggcccgtgccgtgtg 10 1871 cattgcccctctgcctt ag GACCCTGGTCCGAGGTGTC 11 189 TGCAGAGCGACTACTCCAG gtgagcgcacctggccgga 11 380X attcccccctgtgtctc ag CTATGCCCGGACCTCCATC 12 127 CCTGTTTCTGGATTTGCAG gtgagcaggctgatggtca 12 88n tctttcttggcgactct ag GTGAACAGCCTCCAGACGG 13 62 TCCTGCTGCAGGCGTACAG gtgagccgccaccaagggg 13 318'/ ctgtccgccatcc cti ag GTTTCACGCATGTGTGCTG 14 125 gtatgtgcaggtgcctggc 14 781 agcctctgttttcccc< ag GGATGTCGCTGGGGGCCAA 15 138 CTGGGGTCACTCAGGACAG gcaagtgtgggtggaggcc 15 536 tctgattttggccccgdagj CCCAGACGCAGCTGAGTCG 16 664 χττττcAGTTTTGAAAAAA 3' flankierende Region
Tab. 2
Beispiele
Das menschliche Gen für die katalytische Telomerase Untereinheit (ghTC), sowie die 5' und 3' liegenden Bereiche dieses Gens wurden kloniert, der Startpunkt der Transkription bestimmt, potentielle Bindungsstellen für DNA-bindende Proteine identifiziert, sowie aktive Promotorfragmente aufgezeigt. Die Sequenz der hTC- cDNA (Fig. 6) ist bereits in unserer ebenfalls anhängigen Anmeldung PCT/ΕP/98/03468 beschrieben. Wenn nicht gesondert erwähnt, beziehen sich sämtliche Angaben zur cDNA-Position auf diese Sequenz.
Beispiel 1
Durch eine genomische Southern Blot-Analyse wurde bestimmt, ob ghTC im menschlichen Genom ein Einzelgen darstellt oder mehrere Loci für das hTC-Gen bzw. eventuell auch ghTC-Pseudogene existieren.
Hierzu wurde ein kommerziell erhältlicher Zoo-Blot der Firma Clontech einer Southern Blot-Analyse unterzogen. Dieser Blot enthält 4 μg Eco RI gesclinittene genomische DNA von neun verschiedenen Spezies (Mensch, Affe, Ratte, Maus, Hund, Rind, Kaninchen, Huhn und Hefe). Mit Ausnahme von Hefe, Huhn und
Mensch wurde die DNA aus Nierengewebe isoliert. Die humane genomische DNA wurde aus Plazenta isoliert und die genomische DNA aus Huhn wurde aus Lebergewebe aufgereinigt. Im Autoradiogramm in Fig. 1 wurde als radioaktiv-markierte Sonde ein etwa 720 bp langes hTC-cDNA Fragment, isoliert aus der hTC cDNA, Variante Del2 (Position 1685 bis 2349 plus 2531 bis 2590 der Fig. 6 [Deletion 2; vergl. Beispiel 5 der Fig. 8]), eingesetzt. Die experimentellen Bedingungen für die Hybridisierung und die Waschschritte des Blots erfolgten in Anlehnung an Ausubel et al. (1987).
Im Fall der humanen DNA erkennt die Sonde zwei spezifische DNA-Fragmente. Das kleinere, etwa 1,5 bis 1,8 kb lange Eco RI-Fragment geht wahrscheinlich auf zwei Eco Rl-Schnittstellen in einem Intron der ghTC-DNA zurück. Aufgrund dieses Ergebnisses ist davon auszugehen, daß nur ein singuläres ghTC-Gen im menschlichen Genom vorliegt.
Beispiel 2
Zur Isolierung der 5' flankierenden hTC-Gensequenz wurden ca 1,5 x 10ή Phagen einer humanen genomischen Plazenta-Genbibliothek (EMBL 3 SP6/T7 der Firma Clontech, Bestellnummer HL1067J) auf Nitrozellulosefilter (0,45 μm; Fa. Schleicher und Schuell) nach Angaben des Herstellers mit einem radioaktiv markierten, etwa
500 bp langen 5'-hTC-cDNA Fragment (Position 839 bis 1345 der Fig. 6) hybridisiert. Die Nitrozellulosefilter wurden zunächst in 2 x SSC (0,3 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0) und anschließend in einer Prähybridisierungslösung (50 % Formamid; 5 x SSPE, pH 7,4; 5 x Denhards-Lösung; 0,25 % SDS; 100 μg/ml Heringsperma-DNA) zwei Stunden bei 42°C inkubiert. Für die Hybrididsierung über
Nacht wurde die Prähybridisierungslösung mit 1,5 x 106 cpm/ml Lösung denaturierter, radioaktiv markierter Probe ergänzt. Unspezifisch gebundene, radioaktive DNA wurde unter stringenten Bedingungen, d.h. durch drei fünfminütige Waschschritte mit 2 x SSC; 0,1 % SDS bei 55 bis 65 °C entfernt. Die Auswertung erfolgte durch Autoradiographie der Filter.
Die in dieser Primäruntersuchung identifizierten Phagenklone wurden aufgereinigt Ausubel et al. (1987). In weitergehenden Analysen stellte sich ein Phagenklon P12 als potentiell positiv heraus. Eine λ-DNA Präparation dieses Phagens Ausubel et al. (1987) und der nachfolgende Restriktionsverdau mit Enzymen, die das genomische
Insert in Fragmenten freisetzen, zeigte, daß dieser Phagenklon ein ca. 15 kb Insert im Vektor enthält (Fig. 2).
Zur Isolierung der vollständigen hTC-Gensequenz wurden in unabhängigen Experimenten jeweils 1 bis 1,5 x 106 Phagen mit jeweils verschiedenen radioaktiv markierten Sonden wie oben beschrieben durchmustert. Die in diesen Primäruntersuchungen identifizierten, für die entsprechenden Sonden positiven Phagenklone wurden aufgereinigt. Der Phagenklon P17 wurde mit einem etwa 250 bp langen hTC-cDNA Fragment (Position 1787 bis 2040 der Fig. 6) gefunden. Der Phagenklon P2 wurde mit einem etwa 740 bp langen hTC-cDNA
Fragment (Position 1685 bis 2349 plus 2531 bis 2607 der Fig. 6 [Deletion 2; vergl. Beispiel 5]) identifiziert. Die Phagenklone P3 und P5 wurden mit einem 420 bp langen 3' hTC-cDNA Fragment (Position 3047 bis 3470 der Fig. 6) gefunden. Nach λ-DNA Präparation dieser Phagen und nachfolgendem Restriktionsverdau mit Enzymen, die das genomische Insert in Fragmenten freisetzen, wurden die Inserts in
Plasmide umkloniert (Beispiel 4).
Beispiel 3
Um zu untersuchen, ob auch das 5 '-Ende der hTC-cDNA im Insert des rekombinanten Phagenklons P12 vorliegt, wurde λ-DNA dieses Klons in einer Southern Blot Analyse mit einem radioaktiv markierten etwa 440 bp langen hTC-cDNA Fragment (Position 1 bis 440 der Fig. 6) aus dem extremen 5 '-Bereich hybridisiert (Fig. 3).
Da die isolierte λ-DNA des positiven Klons auch mit dem extremen 5 '-Ende der hTC-cDNA hybridisiert, enthält dieser Phage wahrscheinlich auch den das ATG- Startcodon flankierenden 5 '-Sequenzbereich.
Beispiel 4
Um das gesamte 15 kb lange Insert des positiven Phagenklons P12 in Teilfragmenten umzuklonieren und anschließend zu sequenzieren, wurden zum DNA-Verdau Restriktionsendonukleasen ausgewählt, die zum einem das gesamte Insert aus EMBL3 Sp6/T7 freisetzen (vgl. Beispiel 2) und zusätzlich im Insert schneiden. Insgesamt wurden ein etwa 8,3 und ein etwa 6,5 kb langes Xho I-Subfragment sowie ein etwa 8,5, ein etwa 3,5 und ein etwa 3 kb langes Sac I-Teilfragment in den Vektor pBIuescript KS(+) (Fa. Stratagene) umkloniert. Durch Sequenzanalyse dieser Fragmente wurde die Nukleotidsequenz von 5123 bp 5 '-flankierenden des ghTC- Genbereichs, ausgehend vom ATG-Startcodon bestimmt (Fig. 4; entsprechend
SEQ ID NO 1). In der Fig. 4 sind die ersten (ausgehend vom ATG-Startcodon) 5123 bp dargestellt. In der Fig. 10 (entsprechend SEQ ID NO 3) die gesamte klonierte 5' Sequenz.
Um das gesamte ca. 14,6 kb große Insert des Phagenklons P17 in Teilfragmenten umzuklonieren, wurden zum DNA-Verdau Restriktionsendonukleasen ausgewählt, die zum einen das gesamte Insert aus EMLB3 Sp6/T7 freisetzen und zusätzlich einige Male im Insert schneiden. Durch Kombinationsverdau mit den Enzymen Xhol und BamHI wurden ein 7J kb, ein 4,2 kb und ein 1 ,5 kb großes XhoI-BamHI- Fragment sowie ein 1 ,8 kb großes BamHI-Fragment subkloniert. Der Kombinations-
Restriktionsverdau mit den Enzymen Xhol und Xbal führte zur Klonierung von einem 6,5 kb großen Xhol-Xbal-Fragment, einem 6,5 kb und einem 1,5 kb großem Xhol-Fragment.
Die Umklonierung des ca. 17,9 kb großem Inserts des Phagenklons P2 in
Subfragmente erfolgte durch Verdau mit dem Restriktionsenzym Xhol. Insgesamt wurde ein 7,5 kb, ein 6,4 kb sowie ein 1,6 kb langes Xhol-Subfragment kloniert. Durch Verdau mit dem Restriktionsenzym Sacl wurde zusätzlich ein 4,8 kb, ein 3 kb, ein 2 kb sowie ein 1 ,8 kb großes Sacl-Fragment subkloniert.
Das ca. 13,5 kb große Insert des Phagenklons P3 wurde durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Sacl bzw. Xhol subkloniert. Dabei wurden ein 3,2 kb, ein 2 kb, ein 0,9 kb, ein 0,8 kb, ein 0,65 kb und ein 0,5 kb langes Sacl-Subfragment sowie ein 6,5 kb und ein 4,3 kb langes Xhol-Subfragment erhalten. Die Subklonierung des ca. 13,2 kb großen Inserts des Phagenklons P5 erfolgte durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Sacl bzw. Xhol. Insgesamt wurden Sacl- Fragmente von 6,5 kb, 3,3 kb, 3,2 kb, 0,8 kb und 0,3 kb Größe sowie Xhol- Fragmente von 7 kb und 3,2 kb Größe subkloniert.
Zur Klonierung des 3' von Phagenklon P17 und 5' von Phagenklon P2 gelegenen hTC-genomischen Sequenzbereichs wurden 3 Genomic Walkings mit Hilfe des Genome Walker™ Kits der Firma Clontech (Katalognummer Kl 803-1) und verschiedenen Primerkombinationen durchgeführt. In einem Endvolumen von 50 μl wurde 1 μl humaner GenomeWalker Library HDL (Fa. Clontech) mit lO pmol dNTP-Mix versetzt und in lxKlen Taq PCR-Reaktionspuffer und lxAdvantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa. Clontech) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Als Primer wurden 10 pmol eines internen genspezifischen Primers sowie 10 pmol des Adaptor Primers API (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; Fa. Clontech) zugefügt. Die PCR wurde als Touchdown-PCR in 3 Schritten durchgeführt. Zunächst wurde über 7 Zyklen für 20 sec bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 72°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert. Es folgten 37 Zyklen bei denen für 20 sec die DNA bei 94°C denaturiert wurde, die anschließende Primerver- längerung aber für 4 min bei 67°C erfolgte. Abschließend folgte eine Kettenver- längerung für 4 min bei 67°C. Im Anschluß an diese erste PCR wurde das PCR-
Produkt 1 :50 verdünnt. Ein μl dieser Verdünnung wurde in einer zweiten „nested" PCR zusammen mit 10 pmol dNTP-Mix in lxKlen Taq PCR-Reaktionspuffer und lxAdvantage Kien Taq Polymerase-Mix sowie 10 pmol eines „nested" gen- spezifischen Primers und 10 pmol des „nested" Marathon Adaptor Primers AP2 (5'- ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'; Fa. Clontech) eingesetzt. Die PCR-Bedingungen entsprachen den in der ersten PCR gewählten Parametern. Als einzige Ausnahme wurden im ersten PCR-Schritt statt 7 Zyklen nur 5 Zyklen gewählt und im zweiten PCR-Schritt statt 37 Zyklen nur 24 Zyklen durchlaufen. Produkte dieser Nested- GenomicWalking-PCR wurden in den TA-Cloning Vektor pCRII der Fa. InVitrogen kloniert. Im ersten Genomic Walking wurde der genspezifische Primer C3K2-GSP1 (5'- GACGTGGCTCTTGAAGGCCTTG-3') sowie der „nested" genspezifische Primer C3K2-GSP2 (5'-GCCTTCTGGACCACGGCATACC-3') zusammen mit der HDL- Library 4 eingesetzt und ein 1639 bp langes PCR-Fragment erhalten. Im zweiten Genomic Walking wurde mit dem genspezifischen Primer C3F2 (5'-
CGTAGTTGAGCACGCTGAACAGTG-3') und dem „nested" genspezifischen Primer C3F (5'-CCTTCACCCTCGAGGTGAGACGCT-3') aus der HDL-Library 4 ein PCR-Fragment von 685 bp Länge amplifiziert. Der dritte Genomic Walking Ansatz führte unter Einsatz des genspezifischen Primers DEL5-GSP1 (5'- GGTGGATGTGACGGGCGCGTACG-3') und des „nested" genspezifischen
Primers C5K-GSP1 (5'-GGTATGCCGTGGTCCAGAAGGC-3J zur Klonierung eines 924 bp PCR-Fragments aus der HDL-Library 1. Insgesamt wurden durch dieses Genomic Walking-Verfahren 2100 bp der 3' von Phagenklon P17 gelegenen genomischen hTC-Region identifiziert (s. Fig. 7).
Die subklonierten Fragmente sowie die Genomic Walking-Produkte wurden ein- zelsträngig sequenziert. Unter Verwendung der Lasergene Biocomputing Software (DNASTAR Inc. Madison, Wisconsin, USA) wurden überlappende Bereiche identifiziert und Contigs gebildet. Insgesamt wurden aus den gesammelten Sequenzen der Phagenklone P12, P17, P2, P3 und P5 sowie den Sequenzdaten aus dem Genomic Walking 2 große Contigs zusammengestellt. Contig 1 besteht aus Sequenzdaten von Phagenklon P12, P17 und den Sequenzdaten aus dem Genomic Walking. Contig 2 wurde aus den Sequenzen von Phagenklon P2, P3 und P5 zusammengesetzt. Überlappende Phagenklonbereiche sind in Fig. 7 schematisch dargestellt. Die Sequenzdaten der 2 Contigs sind nachfolgend dargestellt. Das ATG
Startcodon in Contig 1 ist unterstrichen. Das TGA Stopcodon ist in Contig 2 unterstrichen. Contigl :
ACTTGAGCCC AAGAGTTCAA GGCTACGGTG AGCCATGATT GCAACACCAC ACGCCAGCCT TGGTGACAGA 70 ATGAGACCCT GTCTCAAAAA AAAAAAAAAA AATTGAAATA ATAT.AAAGCA TCTTCTCTGG CCACAGTGGA 140 ACAAAACCAG AAATCAACAA CAAGAGGAAT TTTGAAAACT ATACAAACAC ATGAAAATTA AACAATATAC 210 TTCTGAATGA CCAGTGAGTC AATGAAGAAA TTAAAAAGGA AATTGAAAAA TTTATTTAAG CAAATGATAA 280 CGGAAACATA ACCTCTCAAA ACCCACGGTA TACAGCAAAA GCAGTGCTAA GAAGGAAGTT TATAGCTATA 350 AGCAGCTACA TCAAAAAAGT AGAAAAGCCA GGCGCAGTGG CTCATGCCTG TAATCCCAGC ACTTTGGGAG 420 GCCAAGGCGG GCAGATCGCC TGAGGTCAGG AGTTCGAGAC CAGCCTGACC AACACAGAGA AACCTTGTCG 490 CTACTAAAAA TACAAAATTA GCTGGGCATG GTGGCACATG CCTGTAATCC CAGCTACTCG GGAGGCTGAG 560 GCAGGATAAC CGCTTGAACC CAGGAGGTGG AGGTTGCGGT GAGCCGGGAT TGCGCCATTG GACTCCAGCC 630 TGGGTAACAA GAGTGAAACC CTGTCTCAAG AAAAAAAAAA AAGTAGAAAA ACTTAAAAAT ACAACCTAAT 700 GATGCACCTT AAAGAACTAG AAAAGCAAGA GCAAACTAAA CCTAAAATTG GTAAAAGAAA AGAAATAATA 770 AAGATCAGAG CAGAAATAAA TGAAACTGAA AGATAACAAT ACAAAAGATC AACAAAATTA AAAGTTGGTT 840 TTTTGAAAAG ATAAACAAAA TTGACAAACC TTTGCCCAGA CTAAGAAAAA AGGAAAGAAG ACCTAAATAA 910 ATAAAGTCAG AGATGAAAAA AGAGACATTA CAACTGATAC CACAGAAATT CAAAGGATCA CTAGAGGCTA 980 CTATGAGCAA CTGTACACTA ATAAATTGAA AAACCTAGAA AAAATAGATA AATTCCTAGA TGCATACAAC 1050 CTACCAAGAT TGAACCATGA AGAAATCCAA AGCCCAAACA GACCAATAAC AATAATGGGA TTAAAGCCAT 1120 AATAAAAAGT CTCCTAGCAA AGAGAAGCCC AGGACCCAAT GGCTTCCCTG CTGGATTTTA CCAATCATTT 1190 AAAGAAGAAT GAATTCCAAT CCTACTCAAA CTATTCTGAA AAATAGAGGA AAGAATACTT CCAAACTCAT 1260 TCTACATGGC CAGTATTACC CTGATTCCAA AACCAGACAA AAACACATCA AAAACAAACA AACAAAAAAA 1330 CAGAAAGAAA GAAAACTACA GGCCAATATC CCTGATGAAT ACTGATACAA AAATCCTCAA CAAAACACTA 1400 GCAAACCAAA TTAAACAACA CCTTCGAAAG ATCATTCATT GTGATCAAGT GGGATTTATT CCAGGGATGG 1470 AAGGATGGTT CAACATATGC AAATCAATCA ATGTGATACA TCATCCCAAC AAAATGAAGT ACAAAAACTA 1540 TATGATTATT TCACTTTATG CAGAAAAAGC ATTTGATAAA ATTCTGCACC CTTCATGATA AAAACCCTCA 1610 AAAAACCAGG TATACAAGAA ACATACAGGC CAGGCACAGT GGCTCACACC TGCGATCCCA GCACTCTGGG 1680 AGGCCAAGGT GGGATGATTG CTTGGGCCCA GGAGTTTGAG ACTAGCCTGG GCAACAAAAT GAGACCTGGT 1750 CTACAAAAAA CTTTTTTAAA AAATTAGCCA GGCATGATGG CATATGCCTG TAGTCCCAGC TAGTCTGGAG 1820 GCTGAGGTGG GAGAATCACT TAAGCCTAGG AGGTCGAGGC TGCAGTGAGC CATGAACATG TCACTGTACT 1890 CCAGCCTAGA CAACAGAACA AGACCCCACT GAATAAGAAG AAGGAGAAGG AGAAGGGAGA AGGGAGGGAG 1960 AAGGGAGGAG GAGGAGAAGG AGGAGGTGGA GGAGAAGTGG AAGGGGAAGG GGAAGGGAAA GAGGAAGAAG 2030 AAGAAACATA TTTCAACATA ATAAAAGCCC TATATGACAG ACCGAGGTAG TATTATGAGG AAAAACTGAA 2100 AGCCTTTCCT CTAAGATCTG GAAAATGACA AGGGCCCACT TTCACCACTG TGATTCAACA TAGTACTAGA 2170 AGTCCTAGCT AGAGCAATCA GATAAGAGAA AGAAATAAAA GGCATCCAAA CTGGAAAGGA AGAAGTCAAA 2240 TTATCCTGTT TGCAGATGAT ATGATCTTAT ATCTGGAAAA GACTTAAGAC ACCACTAAAA AACTATTAGA 2310 GCTGAAATTT GGTACAGCAG GATACAAAAT CAATGTACAA AAATCAGTAG TATTTCTATA TTCCAACAGC 2380 AAACAATCTG AAAAAGAAAC CAAAAAAGCA GCTACAAATA AAATTAAACA GCTAGGAATT AACCAAAGAA 2450 GTGAAAGATC TCTACAATGA AAACTATAAA ATGTTGATAA AAGAAATTGA AGAGGGCACA AAAAAAGAAA 2520 AGATATTCCA TGTTCATAGA TTGGAAGAAT AAATACTGTT AAAATGTCCA TACTACCCAA AGCAATTTAC 2590 AAATTCAATG CAATCCCTAT TAAAATACTA ATGACGTTCT TCACAGAAAT AGAAGAAACA ATTCTAAGAT 2660 TTGTACAGAA CCACAAAAGA CCCAGAATAG CCAAAGCTAT CCTGACCAAA AAGAACAAAA CTGGAAGCAT 2730 CACATTACCT GACTTCAAAT TATACTACAA AGCTATAGTA ACCCAAACTA CATGGTACTG GCATAAAAAC 2800 AGATGAGACA TGGACCAGAG GAACAGAATA GAGAATCCAG AAACAi^ATCC ATGCATCTAC AGTGAACTCA 2870 TTTTTGACAA AGGTGCCAAG AACATACTTT GGGGAAAAGA TAATCTCTTC AATAAATGGT GCTGGAGGAA 2940 CTGGATATCC ATATGCAAAA TAACAATACT AGAACTCTGT CTCTCACCAT ATACAAAAGC AAATCAAAAT 3010 GGATGAAAGG CTTAAATCTA AAACCTCAAA CTTTGCAACT ACTAAAAGAA AACACCGGAG AAACTCTCCA 3080 GGACATTGGA GTGGGCAAAG ACTTCTTGAG TAATTCCCTG CAGGCACAGG CAACCAAAGC AAAAACAGAC 3150 AAATGGGATC ATATCAAGTT AAAAAGCTTC TGCCCAGCAA AGGAAACAAT CAACAAAGAG AAGAGACAAC 3220 CCACAGAATG GGAGAATATA TTTGCAAACT ATTCATCTAA CAAGGAATTA ATAACCAGTA TATATAAGGA 3290 GCTCAAACTA CTCTATAAGA AAAACACCTA ATAAGCTGAT TTTCAAAAAT AAGCAAAAGA TCTGGGTAGA 3360 CATTTCTCAA AATAAGTCAT ACAAATGGCA AACAGGCATC TGAAAATGTG CTCAACACCA CTGATCATCA 3430 GAGAAATGCA AATCAAAACT ACTATGAGAG ATCATCTCAT CCCAGTTAAA ATGGCTTTTA TTCAAAAGAC 3500 AGGCAATAAC AAATGCCAGT GAGGATGTGG ATAAAAGGAA ACCCTTGGAC ACTGTTGGTG GGAATGGAAA 3570 TTGCTACCAC TATGGAGAAC AGTTTGAAAG TTCCTCAAAA AACTAAAAAT AAAGCTACCA TACAGCAÄTC 3640 CCATTGCTAG GTATATACTC CAAAAAAGGG AATCAGTGTA TCAACAAGCT ATCTCCACTC CCACATTTAC 3710 TGCAGCACTG TTCATAGCAG CCAAGGTTTG GAAGCAACCT CAGTGTCCAT CAACAGACGA ATGGAAAAAG 3780 AAAATGTGGT GCACATACAC AATGGAGTAC TACGCAGCCA TAAAAAAGAA TGAGATCCTG TCAGTTGCAA 3850 CAGCATGGGG GGCACTGGTC AGTATGTTAA GTGAAATAAG CCAGGCACAG AAAGACAAAC TTTTCATGTT 3920 CTCCCTTACT TGTGGGAGCA AAAATTAAAA CAATTGACAT AGAAATAGAG GAGAATGGTG GTTCTAGAGG 3990 GGTGGGGGAC AGGGTGACTA GAGTCAACAA TAATTTATTG TATGTTTTAA AATAACTAAA AGAGTATAAT 4060 TGGGTTGTTT GTAACACAAA GAAAGGATAA ATGCTTGAAG GTGACAGATA CCCCATTTAC CCTGATGTGA 4130 TTATTACACA TTGTATGCCT GTATCAAAAT ATCTCATGTA TGCTATAGAT ATAAACCCTA CTATATTAAA 4200 AATTAAAATT TTAATGGCCA GGCACGGTGG CTCATGTCCG TAATCCCAGC ACTTTGGGAG GCCGAGGCGG 4270 GTGGATCACC TGAGGTCAGG AGTTTGAAAC CAGTCTGGCC ACCATGATGA AACCCTGTCT CTACTAAAGA 4340 TACAAAAATT AGCCAGGCGT GGTGGCACAT ACCTGTAGTC CCAACTACTC AGGAGGCTGA GACAGGAGAA 4410 TTGCTTGAAC CTGGGAGGCG GAGGTTGCAG TGAGCCGAGA TCATGCCACT GCACTGCAGC CTGGGTGACA 4480 GAGCAAGACT CCATCTCAAA ACAAAAACAA AAAAAAGAAG ATTAAAATTG TAATTTTTAT GTACCGTATA 4550 AATATATACT CTACTATATT AGAAGTTAAA AATTAAAACA ATTATAAAAG GTAATTAACC ACTTAATCTA 4620 AAATAAGAAC AATGTATGTG GGGTTTCTAG CTTCTGAAGA AGTAAAAGTT ATGGCCACGA TGGCAGAAAT 4690 GTGAGGAGGG AACAGTGGAA GTTACTGTTG TTAGACGCTC ATACTCTCTG TAAGTGACTT AATTTTAACC 4760 AAAGACAGGC TGGGAGAAGT TAAAGAGGCA TTCTATAAGC CCTAAAACAA CTGCTAATAA TGGTGAAAGG 4830 TAATCTCTAT TAATTACCAA TAATTACAGA TATCTCTAAA ATCGAGCTGC AGAATTGGCA CGTCTGATCA 4900 CACCGTCCTC TCATTCACGG TGCTTTTTTT CTTGTGTGCT TGGAGATTTT CGATTGTGTG TTCGTGTTTG 4970 GTTAAACTTA ATCTGTATGA ATCCTGAAAC GAAAAATGGT GGTGATTTCC TCCAGAAGAA TTAGAGTACC 5040 TGGCAGGAAG.CAGGTGGCTC TGTGGACCTG AGCCACTTCA ATCTTCAAGG GTCTCTGGCC AAGACCCAGG 5110 TGCAAGGCAG AGGCCTGATG ACCCGAGGAC AGGAAAGCTC GGATGGGAAG GGGCGATGAG AAGCCTGCCT 5180
CGTTGGTGAG CAGCGCATGA AGTGCCCTTA TTTACGCTTT GCAAAGATTG CTCTGGATAC CATCTGGAAA 5250
AGGCGGCCAG CGGGAATGCA AGGAGTCAGA AGCCTCCTGC TCAAACCCAG GCCAGCAGCT ATGGCGCCCA 5320
CCCGGGCGTG TGCCAGAGGG AGAGGAGTCA AGGCACCTCG AAGTATGGCT TAAATCTTTT TTTCACCTGA 5390
5 AGCAGTGACC AAGGTGTATT CTGAGGGAAG CTTGAGTTAG GTGCCTTCTT TAAAACAGAA AGTCATGGAA 5460
GCACCCTTCT CAAGGGAAAA CCAGACGCCC GCTCTGCGGT CATTTACCTC TTTCCTCTCT CCCTCTCTTG 5530
CCCTCGCGGT TTCTGATCGG GACAGAGTGA CCCCCGTGGA GCTTCTCCGA GCCCGTGCTG AGGACCCTCT 5600
TGCAAAGGGC TCCACAGACC CCCGCCCTGG AGAGAGGAGT CTGAGCCTGG CTTAATAACA AACTGGGATG 5670
TGGCTGGGGG CGGACAGCGA CGGCGGGATT CAAAGACTTA ATTCCATGAG TAAATTCAAC CTTTCCACAT 5740
10 CCGAATGGAT TTGGATTTTA TCTTAATATT TTCTTAAATT TCATCAAATA ACATTCAGGA CTGCAGAAAT 5810
CCAAAGGCGT AAAACAGGAA CTGAGCTATG TTTGCCAAGG TCCAAGGACT TAATAACCAT GTTCAGAGGG 5880
ATTTTTCGCC CTAAGTACTT TTTATTGGTT TTCATAAGGT GGCTTAGGGT GCAAGGGAAA GTACACGAGG 5950
AGAGGCCTGG GCGGCAGGGC TATGAGCACG GCAGGGCCAC CGGGGAGAGA GTCCCCGGCC TGGGAGGCTG 6020
ACAGCAGGAC CACTGACCGT CCTCCCTGGG AGCTGCCACA TTGGGCAACG CGAAGGCGGC CACGCTGCGT 6090
15 GTGACTCAGG ACCCCATACC GGCTTCCTGG GCCCACCCAC ACTAACCCAG GAAGTCACGG AGCTCTGAAC 6160
CCGTGGAAAC GAACATGACC CTTGCCTGCC TGCTTCCCTG GGTGGGTCAA GGGTAATGAA GTGGTGTGCA 6230
GGAAATGGCC ATGTAAATTA CACGACTCTG CTGATGGGGA CCGTTCCTTC CATCATTATT CATCTTCACC 6300
CCCAAGGACT GAATGATTCC AGCAACTTCT TCGGGTGTGA CAAGCCATGA CAAAACTCAG TACAAACACC 6370
ACTCTTTTAC TAGGCCCACA GAGCACGGSC CACACCCCTG ATATATTAAG AGTCCAGGAG AGATGAGGCT 6440
20 GCTTTCAGCC ACCAGGCTGG GGTGACAACA GCGGCTGAAC AGTCTGTTCC TCTAGACTAG TAGACCCTGG 6510
CAGGCACTCC CCCAGATTCT AGGGCCTGGT TGCTGCTTCC CGAGGGCGCC ATCTGCCCTG GAGACTCAGC 6580
CTGGGGTGCC ACACTGAGGC CAGCCCTGTC TCCACACCCT CCGCCTCCAG GCCTCAGCTT CTCCAGCAGC 6650
TTCCTAAACC CTGGGTGGGC CGTGTTCCAG CGCTACTGTC TCACCTGTCC CACTGTGTCT TGTCTCAGCG 6720
ACGTAGCTCG CACGGTTCCT CCTCACATGG GGTGTCTGTC TCCTTCCCCA ACACTCACAT GCGTTGAAGG 6790
25 GAGGAGATTC TGCGCCTCCC AGACTGGCTC CTCTGAGCCT GAACCTGGCT CGTGGCCCCC GATGCAGGTT 6860
CCTGGCGTCC GGCTGCACGC TGACCTCCAT TTCCAGGCGC TCCCCGTCTC CTGTCATCTG CCGGGGCCTG 6930
CCGGTGTGTT CTTCTGTTTC TGTGCTCCTT TCCACGTCCA GCTGCGTGTG TCTCTGCCCG CTAGGGTCTC 7000
GGGGTTTTTA TAGGCATAGG ACGGGGGCGT GGTGGGCCAG GGCGCTCTTG GGAAATGCAA CATTTGGGTG 7070
TGAAAGTAGG AGTGCCTGTC CTCACCTAGG TCCACGGGCA CAGGCCTGGG G.-.TGGAGCCC CCGCCAGGGA 7140 m V CCCGCCCTTC TCTGCCCAGC ACTTTCCTGC CCCCCTCCCT CTGGAACACA GAGTGGCAGT TTCCACAAGC 7210
ACTAAGCATC CTCTTCCCAA AAGACCCAGC ATTGGCACCC CTGGACATTT GCCCCACAGC CCTGGGAATT 7280
CACGTGACTA CGCACATCAT GTACACACTC CCGTCCACGA CCGACCCCCG CTGTTTTATT TTAATAGCTA 7350
CAAAGCAGGG AAATCCCTGC TAAAATGTCC TTTAACAAAC TGGTTAAACA AACGGGTCCA TCCGCACGGT 7420
GGACAGTTCC TCACAGTGAA GAGGAACATG CCGTTTATAA AGCCTGCAGG CATCTCAAGG GAATTACGCT 7490
35 GAGTCAAAAC TGCCACCTCC ATGGGATACG TACGCAACAT GCTCAAAAAG AAAGAATTTC ACCCCATGGC 7560
AGGGGAGTGG TTAGGGGGGT TAAGGACGGT GGGGGCGGCA GCTGGGGGCT ACTGCACGCA CCTTTTACTA 7630
AAGCCAGTTT CCTGGTTCTG ATGGTATTGG CTCAGTTATG GGAGACTAAC CATAGGGGAG TGGGGATGGG 7700
GGAACCCGGA GGCTGTGCCA TCTTTGCCAT GCCCGAGTGT CCTGGGCAGG ATAATGCTCT AGAGATGCCC 7770
ACGTCCTGAT TCCCCCAAAC CTGTGGACAG AACCCGCCCG GCCCCAGGGC CTTTGCAGGT GTGATCTCCG 7840
40 TGAGGACCCT GAGGTCTGGG ATCCTTCGGG ACTACCTGCA GGCCCGAAAA GTAATCCAGG GGTTCTGGGA 7910
AGAGGCGGGC AGGAGGGTCA GAGGGGGGCA GCCTCAGGAC GATGGAGGCA GTCAGTCTGA GGCTGAAAAG 7980
GGAGGGAGGG CCTCGAGCCC AGGCCTGCAA GCGCCTCCAG AAGCTGGAAA AAGCGGGGAA GGGACCCTCC 8050
ACGGAGCCTG CAGCAGGAAG GCACGGCTGG CCCTTAGCCC ACCAGGGCCC ATCGTGGACC TCCGGCCTCC 8120
GTGCCATAGG AGGGCACTCG CGCTGCCCTT CTAGCATGAA GTGTGTGGGG ATTTGCAGAA GCAACAGGAA 8190
43 ACCCATGCAC TGTGAATCTA GGATTATTTC AAAACAAAGG TTTACAGAAA CATCCAAGGA CAGGGCTGAA 8260
GTGCCTCCGG GCAAGGGCAG GGCAGGCACG AGTGATTTTA TTTAGCTATT TTATTTTATT TACTTACTTT 8330
CTGAGACAGA GTTATGCTCT TGTTGCCCAG GCTGGAGTGC AGCGGCATGA TCTTGGCTCA CTGCAACCTC 8400
CGTCTCCTGG GTTCAAGCAA TTCTCGTGCC TCAGCCTCCC AAGTAGCTGG GATTTCAGGC GTGCACCACC 8470
ACACCCGGCT AATTTTGTAT TTTTAGTAGA GATGGGCTTT CACCATGTTG GTCAAGCTGA TCTCAAAATC 8540
50 CTGACCTCAG GTGATCCGCC CACCTCAGCC TCCCAAAGTG CTGGGATTAC AGGCATGAGC CACTGCACCT 8610
GGCCTATTTA ACCATTTTAA AACTTCCCTG GGCTCAAGTC ACACCCACTG GTAAGGAGTT CATGGAGTTC 8680
AATTTCCCCT TTACTCAGGA GTTACCCTCC TTTGATATTT TCTGTAATTC TTCGTAGACT GGGGATACAC 8750
CGTCTCTTGA CATATTCACA GTTTCTGTGA CCACCTGTTA TCCCATGGGA CCCACTGCAG GGGCAGCTGG 8820
GAGGCTGCAG GCTTCAGGTC CCAGTGGGGT TGCCATCTGC CAGTAGAAAC CTGATGTAGA ATCAGGGCGC 8890
55 AAGTGTGGAC ACTGTCCTGA ATCTCAATGT CTCAGTGTGT GCTGAAACAT GTAGAAATTA AAGTCCATCC 8960
CTCCTACTCT ACTGGGATTG AGCCCCTTCC CTATCCCCCC CCAGGGGCAG AGGAGTTCCT CTCACTCCTG 9030
TGGAGGAAGG AATGATACTT TGTTATTTTT CACTGCTGGT ACTGAATCCA CTGTTTCATT TGTTGGTTTG 9100
TTTGTTTTGT TTTGAGAGGC GGTTTCACTC TTGTTGCTCA GGCTGGAGGG AGTGCAATGG CGCGATCTTG 9170
GCTTACTGCA GCCTCTGCCT CCCAGGTTCA AGTGATTCTC CTGCTTCCGC CTCCCATTTG GCTGGGATTA 9240
60 CAGGCACCCG CCACCATGCC CAGCTAATTT TTTGTATTTT TAGTAGAGAC GGGGGTGGGT GGGGTTCACC 9310
ATGTTGGCCA GGCTGGTCTC GAACTTCTGA CCTCAGATGA TCCACCTGCC TCTGCCTCCT AAAGTGCTGG 9380
GATTACAGGT GTGAGCCACC ATGCCCAGCT CAGAATTTAC TCTGTTTAGA AACATCTGGG TCTGAGGTAG 9450
GAAGCTCACC CCACTCAAGT GTTGTGGTGT TTTAAGCCAA TGATAGAATT TTTTTATTGT TGTTAGAACA 9520
CTCTTGATGT TTTACACTGT GATGACTAAG ACATCATCAG CTTTTCAAAG ACACACTAAC TGCACCCATA 9590
65 ATACTGGGGT GTCTTCTGGG TATCAGCAAT CTTCATTGAA TGCCGGGAGG CGTTTCCTCG CCATGCACAT 9660
GGTGTTAATT ACTCCAGCAT AATCTTCTGC TTCCATTTCT TCTCTTCCCT CTTTTAAAAT TGTGTTTTCT 9730
ATGTTGGCTT CTCTGCAGAG AACCAGTGTA AGCTACAACT TAACTTTTGT TGGAACAAAT TTTCCAAACC 9800
GCCCCTTTGC CCTAGTGGCA GAGACAATTC ACAAACACAG CCCTTTAAAA AGGCTTAGGG ATCACTAAGG 9870
GGATTTCTAG AAGAGCGACC TGTAATCCTA AGTATTTACA AGACGAGGCT AACCTCCAGC GAGCGTGACA 9940
70 GCCCAGGGAG GGTGCGAGGC CTGTTCAAAT GCTAGCTCCA TAAATAAAGC AATTTCCTCC GGCAGTTTCT 10010
GAAAGTAGGA AAGGTTACAT TTAAGGTTGC GTTTGTTAGC ATTTCAGTGT TTGCCGACCT CAGCTACAGC 10080
ATCCCTGCAA GGCCTCGGGA GACCCAGAAG TTTCTCGCCC CCTTAGATCC AAACTTGAGC AACCCGGAGT 10150
CTGGATTCCT GGGAAGTCCT CAGCTGTCCT GCGGTTGTGC CGGGGCCCCA GGTCTGGAGG GGACCAGTGG 10220
CCGTGTGGCT TCTACTGCTG GGCTGGAAGT CGGGCCTCCT AGCTCTGCAG TCCGAGGCTT GGAGCCAGGT 10290
75 GCCTGGACCC CGAGGCTGCC CTCCACCCTG TGCGGGCGGG ATGTGACCAG ATGTTGGCCT CATCTGCCAG 10360
ACAGAGTGCC GGGGCCCAGG GTCAAGGCCG TTGTGGCTGG TGTGAGGCGC CCGGTGCGCG GCCAGCAGGA 10430
GCGCCTGGCT CCATTTCCCA CCCTTTCTCG ACGGGACCGC CCCGGTGGGT GATTAACAGA TTTGGGGTGG 10500 TTTGCTCATG GTGGGGACCC CTCGCCGCCT GAGAACCTGC AAAGAGAAAT GACGGGCCTG TGTCAAGGAG 10570
CCCAAGTCGC GGGGAAGTGT TGCAGGGAGG CACTCCGGGA GGTCCCGCGT GCCCGTCCAG GGAGCAATGC 10640
GTCCTCGGGT TCGTCCCCAG CCGCGTCTAC GCGCCTCCGT CCTCCCCTTC ACGTCCGGCA TTCGTGGTGC 10710
CCGGAGCCCG ACGCCCCGCG TCCGGACCTG GAGGCAGCCC TGGGTCTCCG GATCAGGCCA GCGGCCAAAG 10780 GGTCGCCGCA CGCACCTGTT CCCAGGGCCT CCACATCATG GCCCCTCCCT CGGGTTACCC CACAGCCTAG 10850
GCCGATTCGA CCTCTCTCCG CTGGGGCCCT CGCTGGCGTC CCTGCACCCT GGGAGCGCGA GCGGCGCGCG 10920
GGCGGGGAAG CGCGGCCCAG ACCCCCGGGT CCGCCCGGAG CAGCTGCGCT GTCGGGGCCA GGCCGGGCTC 10990
CCAGTGGATT CGCGGGCACA GACGCCCAGG ACCGCGCTCC CCACGTGGCG GAGGGACTGG GGACCCGGGC 11060
ACCCGTCCTG CCCCTTCACC TTCCAGCTCC GCCTCCTCCG CGCGGACCCC GCCCCGTCCC GACCCCTCCC 11130 GGGTCCCCGG CCCAGCCCCC TCCGGGCCCT CCCAGCCCCT CCCCTTCCTT TCCGCGGCCC CGCCCTCTCC 11200
TCGCGGCGCG AGTTTCAGGC AGCGCTGCGT CCTGCTGCGC ACGTGGGAAG CCCTGGCCCC GGCCACCCCC 11270
GCGATGCCGC GCGCTCCCCG CTGCCGAGCC GTGCGCTCCC TGCTGCGCAG CCACTACCGC GAGGTGCTGC 11340
CGCTGGCCAC GTTCGTGCGG CGCCTGGGGC CCCAGGGCTG GCGGCTGGTG CAGCGCGGGG ACCCGGCGGC 11410
TTTCCGCGCG CTGGTGGCCC AGTGCCTGGT GTGCGTGCCC TGGGACGCAC GGCCGCCCCC CGCCGCCCCC 11480 TCCTTCCGCC AGGTGGGCCT CCCCGGGGTC GGCGTCCGGC TGGGGTTGAG GGCGGCCGGG GGGAACCAGC 11550
GACATGCGGA GAGCAGCGCA GGCGACTCAG GGCGCTTCCC CCGCAGGTGT CCTGCCTGAA GGAGCTGGTG 11620
GCCCGAGTGC TGCAGAGGCT GTGCGAGCGC GGCGCGAAGA ACGTGCTGGC CTTCGGCTTC GCGCTGCTGG 11690
ACGGGGCCCG CGGGGGCCCC CCCGAGGCCT TCACCACCAG CGTGCGCAGC TACCTGCCCA ACACGGTGAC 11760
CGACGCACTG CGGGGGAGCG GGGCGTGGGG GCTGCTGCTG CGCCGCGTGG GCGACGACGT GCTGGTTCAC 11830 CTGCTGGCAC GCTGCGCGCT CTTTGTGCTG GTGGCTCCCA GCTGCGCCTA CCAGGTGTGC GGGCCGCCGC 11900
TGTACCAGCT CGGCGCTGCC ACTCAGGCCC GGCCCCCGCC ACACGCTAGT GGACCCCGAA GGCGTCTGGG 11970
ATGCGAACGG GCCTGGAACC ATAGCGTCAG GGAGGCCGGG GTCCCCCTGG GCCTGCCAGC CCCGGGTGCG 12040
AGGAGGCGCG GGGGCAGTGC CAGCCGAAGT CTGCCGTTGC CCAAGAGGCC CAGGCGTGGC GCTGCCCCTG 12110
AGCCGGAGCG GACGCCCGTT GGGCAGGGGT CCTGGGCCCA CCCGGGCAGG ACGCGTGGAC CGAGTGACCG 12180 TGGTTTCTGT GTGGTGTCAC CTGCCAGACC CGCCGAAGAA GCCACCTCTT TGGAGGGTGC GCTCTCTGGC 12250
ACGCGCCACT CCCACCCATC CGTGGGCCGC CAGCACCACG CAGGCCCCCC ATCCACATCG CGGCCACCAC 12320
GTCCCTGGGA CACGCCTTGT CCCCCGGTGT ACGCCGAGAC CAAGCACTTC CTCTACTCCT CAGGCGACAA 12390
GGAGCAGCTG CGGCCCTCCT TCCTACTCAG CTCTCTGAGG CCCAGCCTGA CTGGCGCTCG GAGGCTCGTG 12460
GAGACCATCT TTCTGGGTTC CAGGCCCTGG ATGCCAGGGA CTCCCCGCAG GTTGCCCCGC CTGCCCCAGC 12530 GCTACTGGCA AATGCGGCCC CTGTTTCTGG AGCTGCTTGG GAACCACGCG CAGTGCCCCT ACGGGGTGCT 12600
CCTCAAGACG CACTGCCCGC TGCGAGCTGC GGTCACCCCA GCAGCCGGTG TCTGTGCCCG GGAGAAGCCC 12670
CAGGGCTCTG TGGCGGCCCC CGAGGAGGAG GACACAGACC CCCGTCGCCT GGTGCAGCTG CTCCGCCAGC 12740
ACAGCAGCCC CTGGCAGGTG TACGGCTTCG TGCGGGCCTG CCTGCGCCGG CTGGTGCCCC CAGGCCTCTG 12810
GGGCTCCAGG CACAACGAAC GCCGCTTCCT CAGGAACACC AAGAAGTTCA TCTCCCTGGG G.AAGCATGCC 12880 AAGCTCTCGC TGCAGGAGCT GACGTGGAAG ATGAGCGTGC GGGACTGCGC TTGGCTGCGC AGGAGCCCAG 12950
GTGAGGAGGT GGTGGCCGTC GAGGGCCCAG GCCCCAGAGC TGAATGCAGT AGGGGCTCAG AAAAGGGGGC 13020
AGGCAGAGCC CTGGTCCTCC TGTCTCCATC GTCACGTGGG CACACGTGGC TTTTCGCTCA GGACGTCGAG 13090
TGGACACGGT GATCTCTGCC TCTGCTCTCC CTCCTGTCCA GTTTGCATAA ACTTACGAGG TTCACCTTCA 13160
CGTTTTGATG GACACGCGGT TTCCAGGCGC CGAGGCCAGA GCAGTGAACA GAGGAGGCTG GGCGCGGCAG 13230 TGGAGCCGGG TTGCCGGCAA TGGGGAGAAG TGTCTGGAAG CACAGACGCT CTGGCGAGGG TGCCTGCAGG 13300
TTACCTATAA TCCTCTTCGC AATTTCAAGG GTGGGAATGA GAGGTGGGGA CGAGAACCCC CTCTTCCTGG 13370
GGGTGGGAGG TAAGGGTTTT GCAGGTGCAC GTGGTCAGCC AATATGCAGG TTTGTGTTTA AGATTTAATT 13440
GTGTGTTGAC GGCCAGGTGC GGTGGCTCAC GCCGGTAATC CCAGCACTTT GGGAAGCTGA GGCAGGTGGA 13510
TCACCTGAGG TCAGGAGTTT GAGACCAGCC TGACCAACAT GGTGAAACCC TATCTGTACT AAAAATACAA 13580 AAATTAGCTG GGCATGGTGG TGTGTGCCTG TAATCCCAGC TACTTGGGAG GCTGAGGCAG GAGAATCACT 13650
TGAACCCAGG AGGCGGAGGC TGCAGTGAGC TGAGATTGTG CCATTGTACT CCAGCCTGGG CGACAAGAGT 13720
GAAACTCTGT CTTTAAAAAA AAAAAGTGTT CGTTGATTGT GCCAGGACAG G3TAGAGGGA GGGAGATAAG 13790
ACTGTTCTCC AGCACAGATC CTGGTCCCAT CTTTAGGTAT GAAGAGGGCC ACATGGGAGC AGAGGACAGC 13860
AGATGGCTCC ACCTGCTGAG GAAGGGACAG TGTTTGTGGG TGTTCAGGGG ATGGTGCTGC TGGGCCCTGC 13930 CGTGTCCCCA CCCTGTTTTT CTGGATTTGA TGTTGAGGAA CCTCCGCTCC AGCCCCCTTT TGGCTCCCAG 14000
TGCTCCCAGG CCCTACCGTG GCAGCTAGAA GAAGTCCCGA TTTCACCCCC TCCCCACAAA CTCCCAAGAC 14070
ATGTAAGACT TCCGGCCATG CAGACAAGGA GGGTGACCTT CTTGGGGCTC TTTTTTTTCT TTTTTTCTTT 14140
TTATGGTGGC AAAAGTCATA TAACATGAGA TTGGCACTCC TAACACCGTT TTCTGTGTAC AGTGCAGAAT 14210
TGCTAACTCG GCGGTGTTTA CAGCAGGTTG CTTGAAATGC TGCGTCTTGC GTGACTGGAA GTCCCTACCC 14280 ATCGAACGGC AGCTGCCTCA CACCTGCTGC GGCTCAGGTG GACCACGCCG AGTCAGATAA GCGTCATGCA 14350
ACCCAGTTTT GCTTTTTGTG CTCCAGCTTC CTTCGTTGAG GAGAGTTTGA GTTCTCTGAT CAGGACTCTG 14420
CCTGTCATTG CTGTTCTCTG ACTTCAGATG AGGTCACAAT CTGCCCCTGG CTTATGCAGG GAGTGAGGCG 14490
TGGTCCCCGG GTGTCCCTGT CACGTGCAGG GTGAGTGAGG CGTTGCCCCC AGGTGTCCCT GTCACGTGTA 14560
GGGTGAGTGA GGCGCGGCCC CCGGGTGTCC CTGTCCCGTG CAGCGTGATT GAGGTGTGGC CCCCGGGTGT 14630 CCCTGTCACG TGTAGGGTGA GTGAGGCGCC ATCCCCGGGT GTCCCTGTCA CGTGTAGGGT GAGTGAGGCG 14700
TGGTCCCCGG GTGTCCCTGT CCCGTGCAGG GTGAGTGAGG CACTGTCCCC GGGTGTCCCT GTCACGTGCA 14770
GGGTGAGTGA GGCGCGGTCC CCGGGTGTCC CTCTCAGGTG TAGGGTGAGT GAGGCGCGGC CCCAGGGTGT 14840
CCCTGTCACG TGTAGGGTGA GTGAGGCACC GTCCCTGGGT GTCCCTCCCA GGTATAGGGT GAGTGAGGCA 14910
CTGTCCCCGG GTGTCCCTGT CACGTGCAGG GTGAGTGAGG CGCGGCCCCC GGGTGTCCCT CTCAGGTGCA 14980 GGGTGAGTGA GGCGCTGTCC CTGGGTGTCC CTGTCTCGTG TAGGGTGAGT GAGGCTCTGT CCCCAGGTGT 15050
CCTTGGCGTT TGCTCACTTG AGCTTGCTCC TGAATGTTTG CTCTTTCTAT AGCCACAGCT GCGCCGGTTG 15120
CCCATTGCCT GGGTAGATGG TGCAGGCGCA GTGCTGGTCC CCAAGCCTAT CTTTTCTGAT GCTCGGCTCT 15190
TCTTGGTCAC CTCTCCGTTC CATTTTGCTA CGGGGACACG GGACTGCAGG CTCTCGCCTC CCGCGTGCCA 15260
GGCACTGCAG CCACAGCTTC AGGTCCGCTT GCCTCTGTTG GGCCTGGCTT GCTCACCACG TGCCCGCCAC 15330 ATGCATGCTG CCAATACTCC TCTCCCAGCT TGTCTCATGC CGAGGCTGGA CTCTGGGCTG CCTGTGTCTG 15400
CTGCCACGTG TTGCTGGAGA CATCCCAGAA AGGGTTCTCT GTGCCCTGAA GGAAAGCAAG TCACCCCAGC 15470
CCCCTCACTT GTCCTGTTTT CTCCCAAGCT GCCCCTCTGC TTGGCCCCCT TGGGTGGGTG GCAACGCTTG 15540
TCACCTTATT CTGGGCACCT GCCGCTCATT GCTTAGGCTG GGCTCTGCCT CCAGTCGCCC CCTCACATGG 15610
ATTGACGTCC AGCCACAGGT TGGAGTGTCT CTGTCTGTCT CCTGCTCTGA GACCCACGTG GAGGGCCGGT 15680 GTCTCCGCCA GCCTTCGTCA GACTTCCCTC TTGGGTCTTA GTTTTGAATT TCACTGATTT ACCTCTGACG 15750
TTTCTATCTC TCCATTGTAT GCTTTTTCTT GGTTTATTCT TTCATTCCTT TTCTAGCTTC TTAGTTTAGT 15820
CATGCCTTTC CCTCTAAGTG CTGCCTTACC TGCACCCTGT GTTTTGATGT GAAGTAATCT CA^CATCAGC 15890 CACTTTCAAG TGTTCTTAAA ATACTTCAAA GTGTTAATAC TTCTTTTAAG TATTCTTATT CTGTGATTTT 15960
TTTCTTTGTG CACGCTGTGT TTTGACGTGA AATCATTTTG ATATCAGTGA CTTTTAAGTA TTCTTTAGCT 16030
TATTCTGTGA TTTCTTTGAG CAGTGAGTTA TTTGAACACT GTTTATGTTC AAGATATGTA GAGTATCAAG 16100
ATACGTAGAG TATTTTAAGT TATCATTTTA TTATTGATTT CTAACTCAGT TGTGTAGTGG TCTGTATAAT 16170 ACCAATTATT TGAAGTTTGC GGAGCCTTGC TTTGTGATCT AGTGTGTGCA TGGTTTCCAG AACTGTCCAT 16240
TGTAAATTTG ACATCCTGTC AATAGTGGGC ATGCATGTTC ACTATATCCA GCTTATTAAG GTCCAGTGCA 16310
AAGCTTCTGT CTCCTTCTAG ATGCATGAAA TTCCAAGAAG GAGGCCATAG TCCCTCACCT GGGGGATGGG 16380
TCTGTTCATT TCTTCTCGTT TGGTAGCATT TATGTGAGGC ATTGTTAGGT GCATGCACGT GGTAGAATTT 16450
TTATCTTCCT GATGAGTGAA TCTTTTGGAG ACTTCTATGT CTCTAGTAAT CTAGTAATTC TTTTTTTAAA 16520 TTGCTCTTAG TACTGCCACA CTGGGCTTCT TTTGATTAGT ATTTTCCTGC TGTGTCTGTT TTCTGCCTTT 16590
AATTTATATA TATATATATA TTTTTTTTTT TTTTGAGACA GAGTCTTGGT CTGTCGCCCA GGGTGAGTGC 16660
AGTGGTGTGA TCACAGGTCA GTGTAACTTT TACCTTCTGG CCTGAGCCGT CCTCTCACCT CAGCCTCCTG 16730
AGTAGCTGGA ACTGCAGACA CGCACCGCTA CACCTGGCTA ATTTTTAAAT TTTTTCTGGA GACAGGGTCT 16800
TGCTGTGTTG CCCAGGCTGG TCTCAAACTC TTGGACTCAA GGGATCCATC TACCTCGGCT TCCCAAAGTG 16870 CTGAATTACA GGCATGAGCC ACCATGTCTG GCCTAATTTT CAACACTTTT ATATTCTTAT AGTGTGGGTA 16940
TGTCCTGTTA ACAGCATGTA GGTGAATTTC CAATCCAGTC TGACAGTCGT TGTTTAACTG GATAACCTGA 17010
TTTATTTTCA TTTTTTTGTC ACTAGAGACC CGCCTGGTGC ACTCTGATTC TCCACTTGCC TGTTGCATGT 17080
CCTCGTTCCC TTGTTTCTCA CCACCTCTTG GGTTGCCATG TGCGTTTCCT GCCGAGTGTG TGTTGATCCT 17150
CTCGTTGCCT CCTGGTCACT GGGCATTTGC TTTTATTTCT CTTTGCTTAG TGTTACCCCC TGATCTTTTT 17220 ATTGTCGTTG TTTGCTTTTG TTTATTGAGA CAGTCTCACT CTGTCACCCA GGCTGGAGTG TAATGGCACA 17290
ATCTCGGCTC ACTGCAACCT CTGCCTCCTC GGTTCAAGCA GTTCTCATTC CTCAACCTCA TGAGTAGCTG 17360
GGATTACAGG CGCCCACCAC CACGCCTGGC TAATTTTTGT ATTTTTAGTA GAGATAGGCT TTCACCATGT 17430
TGGCCAGGCT GGTCTCAAAC TCCTGACCTC AAGTGATCTG CCCGCCTTGG CCTCCCACAG TGCTGGGATT 17500
ACAGGTGCAA GCCACCGTGC CCGGCATACC TTGATCTTTT AAAATGAAGT CTGAAACATT GCTACCCTTG 17570 TCCTGAGCAA TAAGACCCTT AGTGTATTTT AGCTCTGGCC ACCCCCCAGC CTGTGTGCTG TTTTCCCTGC 17640
TGACTTAGTT CTATCTCAGG CATCTTGACA CCCCCACAAG CTAAGCATTA TTAATATTGT TTTCCGTGTT 17710
GAGTGTTTCT GTAGCTTTGC CCCCGCCCTG CTTTTCCTCC TTTGTTCCCC GTCTGTCTTC TGTCTCAGGC 17780
CCGCCGTCTG GGGTCCCCTT CCTTGTCCTT TGCGTGGTTC TTCTGTCTTG TTATTGCTGG TAAACCCCAG 17850
CTTTACCTGT GCTGGCCTCC ATGGCATCTA GCGACGTCCG GGGACCTCTG CTTATGATGC ACAGATGAAG 17920 ATGTGGAGAC TCACGAGGAG GGCGGTCATC TTGGCCCGTG AGTGTCTGGA GCACCACGTG GCCAGCGTTC 17990
CTTAGCCAGT GAGTGACAGC AACGTCCGCT CGGCCTGGGT TCAGCCTGGA AAACCCCAGG CATGTCGGGG 18060
TCTGGTGGCT CCGCGGTGTC GAGTTTGAAA TCGCGCAAAC CTGCGGTGTG GCGCCAGCTC TGACGGTGCT 18130
GCCTGGCGGG GGAGTGTCTG CTTCCTCCCT TCTGCTTGGG AACCAGGACA AAGGATGAGG CTCCGAGCCG 18200
TTGTCGCCCA ACAGGAGCAT GACGTGAGCC ATGTGGATAA TTTTAAAATT TCTAGGCTGG GCGCGGTGGC 18270 TCACGCCTGT AATCCCAGCA CTTTGGGAGG CCAAGGCGGG TGGATCACGA GGTCAGGAGG TCGAGACCAT 18340
CCTGGCCAAC ATGATGAAAC CCCATCTGTA CTAAAAACAC AAAAATTAGC TGGGCGTGGT GGCGGGTGCC 18410
TGTAATCCCA GCTACTCGGG AGGCTGAGGC AGGAGAATTG CTTGAACCTG GGAGTTGGAA GTTGCAGTGA 18480
GCCGACATTG CACCACTGCA CTCCAGCCTG GCAACACAGC GAGACTCTGT CTCAAAAAAA AAAAAAAAAA 18550
AAAAAAAAAA AATTCTAGTA GCCACATTAA AAAAGTAAAA AAGAAAAGGT GAAATTAATG TAATAATAGA 18620 TTTTACTGAA GCCCAGCATG TCCACACCTC ATCATTTTAG GGTGTTATTG GTGGGAGCAT CACTCACAGG 18690
ACATTTGACA TTTTTTGAGC TTTGTCTGCG GGATCCCGTG TGTAGGTCCC GTGCGTGGCC ATCTCGGCCT 18760
GGACCTGCTG GGCTTCCCAT GGCCATGGCT GTTGTACCAG ATGGTGCAGG TCCGGGATGA GGTCGCCAGG 18830
CCCTCAGTGA GCTGGATGTG CAGTGTCCGG ATGGTGCACG TCTGGGATGA GGTCGCCAGG CCCTGCTGTG 18900
AGCTGGATGT GTGGTGTCTG GATGGTGCAG GTCAGGGGTG AGGTCTCCAG GCCCTCGGTG AGCTGGAGGT 18970 ATGGAGTCCG GATGATGCAG GTCCGGGGTG AGGTCGCCAG GCCCTGCTGT GAGCTGGATG TGTGGTGTCT 19040
GGATGGTGCA GGTCAGGGGT GAGGTCTCCA GGCCCTCGGT AAGCTGGAGG TATGGAGTCC GGATGATGCA 19110
GGTCCGGGGT GAGGTCGCCA GGCCCTGCTG TGAGCTGGAT GTGTGGTGTC TGGATGGTGC AGGTCTGGGG 19180
TGAGGTCACC AGGCCCTGCG GTGAGCTGGG TGTGCGGTGT CTGGATGGTG CAGGTCTGGA GTGAGGTCGC 19250
CAGACGGTGC CAGACCATGC GGTGAGCTGG ATATGCGGTG TCCGGATGGT GCAGGTCTGG GGTGAGGTTG 19320 CCAGGCCCTG CTGTGAGTTG GATGTGGGGT GTCCGGATGC TGCAGGTCCG GTGTGAGGTC ACCAGGCCCT 19390
GCTGTGAGCT GGATGTGTGG TGTCTGGATG GTGCAGGTCT GGGGTGAAGG TCGCCAGGCC CCTGCTTGTG 19460
AGCTGGATGT GTGGTGTCTG GATGGTGCAG GTCTGGAGTG AGGTCGCCAG GCCCTCGGTG AGCTGGATGT 19530
GCAGTGTCCA GATGGTGCAG GTCCGGGGTG AGGTCGCCAG ACCCTGCGGT GAGCTGGATG TGCGGTGTCT 19600
GGATGGTGCA GGTCTGGAGT GAGGTCGCCA GGCCCTCGGT GAGCTGGATG TATGGAGTCC GGATGGTGCC 19670 GGTCCGGGGT GAGGTCGCCA GACCCTGCTG TGAGCTGGAT GTGCGGTGTC TGGATGGTAC AGGTCTGGAG 19740
TGAGGTCGCC AGACCCTGCT GTGAGCTGGA TATGCGGTGT CCGGATGGTG CAGGTCAGGG GTGAGGTCTC 19810
CAGGCCCTCG GTGAGCTGGA GGTATGGAGT CCGGATGATG CAGGTCCGGG GTGAGGTCGC CAGGCCCTGC 19880
TGTGAACTGG ATGTGCGGCG TCTGGATGGT GCAGGTCTGG GGTGTGGTCG CCAGGCCCTC GGTGAGCTGG 19950
AGGTATGGAG TCCGGATGAT GCAGGTCCGG GGTGAGGTCG CCAGGCCCTG CTGTGAGCTG GATGTGCGGC 20020 GTCTGGATGG TGCAGGTCTG GGGTGTGGTC GCCAGGCCCT CGGTGAGCTG GAGGTATGGA GTCCGGATGA 20090
TGCAGGTCCG GGGTGAGGTT GCCAGGCCCT GCTGTGAGCT GGATGTGCTG TATCCGGATG GTGCAGTCCG 20160
GGGTGAGGTC GCCAGGCCCT GCTGTGAGCT GGATGTGCTG TATCCGGATG GTGCAGGTCT GGGGTGAGGT 20230
CACCAGGCCC TGCGGTGAGC TGGTTGTGCG GTGTCCGGTT GCTGCAGGTC CGGGGTGAGT TCGCCAGGCC 20300
CTCGGTGAGC TGGATGTGCG GTGTCCCCGT GTCCGGATGG TGCAGGTCCA GGGTGAGGTC GCTAGGCCCT 20370 TGGTGGGCTG GATGTGCCGT GTCCGGATGG TGCAGGTCTG GGGTGAGGTC GCCAGGCCTT TGGTGAGCTG 20440
GATGTGCGGT GTCTGCATGG TGCAGGTCTG GGGTGAGGTC GCCAGGCCCT TGGTGGGCTG GATGTGTGGT 20510
GTCCGGATGG TGCAGGTCCG GCGTGAGGTC GCCAGGCCCT GCTGTGAGCT GGATGTGCGG TGTCTGGATG 20580
GTGCAGGTCC GGGGTGAGGT AGCCAAGGCC TTCGGTGAGC TGGATGTGGG GTGTCCGGAT GGTGCAGGTC 20650
CGGGGTGAGG TCGCCAGGCC CTGCGGTTAG CTGGATATGC GGTGTCCGGA TGGTGCAGGT CCGGGGTGAG 20720 GTCACCAGGC CCTGCGGTTA GCTGGATGTG CGGTGTCTGG ATGGTGCAGG TCCGGGGTGA GGTCGCCAGG 20790
CCCTGCTGTG AGCTGGATGT GCTGTATCCG GATGGTGCAG GTCCGGGGTG AGGTCGCCAG GCCCTGCAGT 20860
GAGCTGGATG TGCTGTATCC GGATGGTGCA GGTCTGGCGT GAGGTCGCCA GGCCCTGCGG TTAGCTGGAT 20930
ATGCGGTGTC GGATGGTGCA GGTCCGGGGT GAGGTCACCA GGCCCTGCGG TTAGCTGGAT GTGCGGTGTC 21000
CGGATGGTGC AGGTCTGGGG TGAGGTCGCC AGGCCCTGCT GTGAGCTGGA TGTGCTGTAT CCGGATGGTG 21070 CAGGTCCGGG GTGAGGTCGC CAGGCCCTGC GGTGAGCTGG ATGTGCTGTA TCCGGATGGT GCAGGTCTGG 21140
CGTGAGGTCG CCAGGCCCTG CGGTGAGCTG GATGTGCAGT GTACGGATGG TGCAGGTCCG GGGTGAGGTC 21210
GCCAGGCCCT GCGGTGGGCT GTATGTGTGT TGTCTGGATG GTGCAGGTCC GGGGTGAGTT CGCCAGGCCC 21280 TGCGGTGAGC TGGATGTGTG GTGTCTGGAT GCTGCAGGTC CGGGGTGAGT TCGCCAGGCC CTCGGTGAGC 21350 TGGATATGCG GTGTCCCCGT GTCCGAATGG TGCAGGTCCA GGGTGAGGTC GCCAGGCCCT TGGTGGGCTG 21420 GATGTGCCGT GTCCGGATGG TGCAGGTCTG GGGTGAGGTC GCCAGGCCCT TGGTGAGCTG GATGTGCGGT 21490 GTCCGGATGG TGCAGGTCCG GGGTGAGGTC ACCAGGCCCT CGGTGATCTG GATGTGGCAT GTCCTTCTCG 21560 5 TTTAAGGGGT TGGCTGTGTT CCGGCCGCAG AGCACCGTCT GCGTGAGGAG ATCCTGGCCA AGTTCCTGCA 21630 CTGGCTGATG AGTGTGTACG TCGTCGAGCT GCTCAGGTCT TTCTTTTATG TCACGGAGAC CACGTTTCAA 21700 AAGAACAGGC TCTTTTTCTA CCGGAAGAGT GTCTGGAGCA AGTTGCAAAG CATTGGAATC AGGTACTGTA 21770 TCCCCACGCC AGGCCTCTGC TTCTCGAAGT CCTGGAACAC CAGCCCGGCC TCAGCATGCG CCTGTCTCCA 21840 CTTGCCTGTG CTTCCCTGGC TGTGCAGCTC TGGGCTGGGA GCCÄGGGGCC CCGTCACAGG CCTGGTCCAA 21910
10 GTGGATTCTG TGCAAGGCTC TGACTGCCTG GAGCTCACGT TCTCTTACTT GTAAAATCAG GAGTTTGTGC 21980 CAAGTGGTCT CTAGGGTTTG TAAAGCAGAA GGGATTTAAA TTAGATGGAA ACACTACCAC TAGCCTCCTT 22050 GCCTTTCCCT GGGATGTGGG TCTGATTCTC TCTCTCTTTT TTTTTTCTTT TTTGAGATGG AGTCTCACTC 22120 TGTTGCCCAG GCTGGAGTGC AGTGGCATAA TCTTGGCTCA CTGCAACCTC CACCTCCTGG GTTTAAGCGA 22190 TTCACCAGCC TCAGCCTCCT AAGTAGCTGG GATTACAGGC ACCTGCCACC ACGCCTGGCT AATTTTTGTA 22260
15 CTTTTAGGAG AGACGGGGTT TCACCATGTT GGCCAGGCTG GTCTCGAACT CATGACCTCA GGTGATCCAC 22330 CCACCTTGGC CTCCCAAAGT GCTGGGTTTA CAGGCTAAGC CACCGTGCCC AGCCCCCGAT TCTCTTTTAA 22400 TTCATGCTGT TCTGTATGAA TCTTCAATCT ATTGGATTTA GGTCATGAGA GGATAAAATC CCACCCACTT 22470 GGCGACTCAC TGCAGGGAGC ACCTGTGCAG GGAGCACCTG GGGATAGGAG AGTTCCACCA TGAGCTAACT 22540 TCTAGGTGGC TGCATTTGAA TGGCTGTGAG ATTTTGTCTG CAATGTTCGG CTGATGAGAG TGTGAGATTG 22610
20 TGACAGATTC AAGCTGGATT TGCATCAGTG AGGGACGGGA GCGCTGGTCT GGGAGATGCC AGCCTGGCTG 22680 AGCCCAGGCC ATGGTATTAG CTTCTCCGTG TCCCGCCCAG GCTGACTGTG GAGGGCTTTA GTCAGAAGAT 22750 CAGGGCTTCC CCAGCTCCCC TGCACACTCG AGTCCCTGGG GGGCCTTGTG ACACCCCATG CCCCAAATCA 22820 GGATGTCTGC AGAGGGAGCT GGCAGCAGAC CTCGTCAGAG GTAACACAGC CTCTGGGCTG GGGACCCCGA 22890 CGTGGTGCTG GGGCCATTTC CTTGCATCTG GGGGAGGGTC AGGGCTTTCC CTGTGGGAAC AAGTTAATAC 22960
25 ACAATGCACC TTACTTAGAC TTTACACGTA TTTAATGGTG TGCGACCCAA CATGGTCATT TGACCAGTAT 23030 TTTGGAAAGA ATTTAATTGG GGTGACCGGA AGGAGCAGAC AGACGTGGTG GTCCCCAAGA TGCTCCTTGT 23100 CACTACTGGG ACTGTTGTTC TGCCTGGGGG GCCTTGGAGG CCCCTCCTCC CTGGACAGGG TACCGTGCCT 23170 TTTCTACTCT GCTGGGCCTG CGGCCTGCGG TCAGGGCACC AGCTCCGGAG CACCCGCGGC CCCAGTGTCC 23240 ACGGAGTGCC AGGCTGTCAG CCACAGATGC CCAGGTCCAG GTGTGGCCGC TCCAGCCCCC GTGCCCCCAT 23310
J>0 GGGTGGTTTT GGGGGAAAAG GCCAAGGGCA GAGGTGTCAG GAGACTGGTG GGCTCATGAG AGCTGATTCT 23380 GCTCCTTGGC TGAGCTGCCC TGAGCAGCCT CTCCCGCCCT CTCCATCTGA AGGGATGTGG CTCTTTCTAC 23450 CTGGGGGTCC TGCCTGGGGC CAGCCTTGGG CTACCCCAGT GGCTGTACCA GAGGGACAGG CATCCTGTGT 23520 GGAGGGGCAT GGGTTCACGT GGCCCCAGAT GCAGCCTGGG ACCAGGCTCC CTGGTGCTGA TGGTGGGACA 23590
_ GTCACCCTGG GGGTTGACCG CCGGACTGGG CGTCCCCAGG GTTGACTATA GGACCAGGTG TCCAGGTGCC 23660 j5 CTGCAAGTAG AGGGGCTCTC AGAGGCGTCT GGCTGGCATG GGTGGACGTG GCCCCGGGCA TGGCCTTCAG 23730 CGTGTGCTGC CGTGGGTGCC CTGAGCCCTC ACTGAGTCGG TGGGGGCTTG TGGCTTCCCG TGAGCTTCCC 23800 CCTAGTCTGT TGTCTGGCTG AGCAAGCCTC CTGAGGGGCT CTCTATTGCA GACAGCACTT GAAGAGGGTG 23870 CAGCTGCGGG AGCTGTCGGA AGCAGAGGTC AGGCAGCATC GGGAAGCCAG GCCCGCCCTG CTGACGTCCA 23940 GACTCCGCTT CATCCCCAAG CCTGACGGGC TGCGGCCGAT TGTGAACATG GACTACGTCG TGGGAGCCAG 24010
40 AACGTTCCGC AGAGAAAAGA GGGTGGCTGT GCTTTGGTTT AACTTCCTTT TTAAACAGAA GTGCGTTTGA 24080 GCCCCACATT TGGTATCAGC TTAGATGAAG GGCCCGGAGG AGGGGCCACG GGACACAGCC AGGGCCATGG 24150 CACGGCGCCA ACCCATTTGT GCGCACAGTG AGGTGGCCGA GGTGCCGGTG CCTCCAGAAA AGCAGCGTGG 24220 GGGTGTAGGG GGAGCTCCTG GGGCAGGGAC AGGCTCTGAG GACCACAAGA AGCAGCCGGG CCAGGGCCTG 24290 GATGCAGCAC GGCCCGAGGT CCTGGATCCG TGTCCTGCTG TGGTGCGCAG CCTCCGTGCG CTTCCGCTTA 24360
45 CGGGGCCCGG GGACCAGGCC ACGACTGCCA GGAGCCCACC GGGCTCTGAG GATCCTGGAC CTTGCCCCAC 24430 GGCTCCTGCA CCCCACCCCT GTGGCTGCGG TGGCTGCGGT GACCCCGTCA TCTGAGGAGA GTGTGGGGTG 24500 AGGTGGACAG AGGTGTGGCA TGAGGATCCC GTGTGCAACA CACATGCGGC CAGGAACCCG TTTCAAACAG 24570 GGTCTGAGGA AGCTGGGAGG GGTTCTAGGT CCCGGGTCTG GGTGGCTGGG GACACTGGGG AGGGGCTGCT 24640 TCTCCCCTGG GTCCCTATGG TGGGGTGGGC ACTTGGCCGG ATCCACTTTC CTGACTGTCT CCCATGCTGT 24710
50 CCCCGCCAGG CCGAGCGTCT CACCTCGAGG GTGAAGGCAC TGTTCAGCGT GCTCAACTAC GAGCGGGCGC 24780 GGCGCCCCGG CCTCCTGGGC GCCTCTGTGC TGGGCCTGGA CGATATCCAC AGGGCCTGGC GCACCTTCGT 24850 GCTGCGTGTG CGGGCCCAGG ACCCGCCGCC TGAGCTGTAC TTTGTCAAGG TGGGTGCCGG GGACCCCCGT 24920 GAGCAGCCCT GCTGGACCTT GGGAGTGGCT GCCTGATTGG CACCTCATGT TGGGTGGAGG AGGTACTCCT 24990 GGGTGGGCCG CAGGGAGTGC AGGTGACCCT GTCACTGTTG AGGACACACC TGGCACCTAG GGTGGAGGCC 25060
55 TTCAGCCTTT CCTGCAGCAC ATGGGGCCGA CTGTGCACCC TGACTGCCCG GGCTCCTATT CCCAAGGAGG 25130 GTCCCACTGG ATTCCAGTTT CCGTCAGAGA AGGAACCGCA ACGGCTCAGC CACCAGGCCC CGGTGCCTTG 25200 CACCCCAGTC CTGAGCCAGG GGTCTCCTGT CCTGAGGCTC AGAGAGGGGA CACAGCCCGC CCTGCCCTTG 25270 GGGTCTGGAG TGGTGGGGGT CAGAGAGAGA GTGGGGGACA CCGCCAGGCC AGGCCCTGAG GGCAGAGGTG 25340 ATGTCTGAGT TTCTGCGTGG CCACTGTCAG TCTCCTCGCC TCCACTCACA CAGGTGGATG TGACGGGCGC 25410
60 GTACGACACC ATCCCCCAGG ACAGGCTCAC GGAGGTCATC GCCAGCATCA TCAAACCCCA GAACACGTAC 25480 TGCGTGCGTC GGTATGCCGT GGTCCAGAAG GCCGCCCATG GGCACGTCCG CAAGGCCTTC AAGAGCCACG 25550 TAAGGTTCAC GTGTGATAGT CGTGTCCAGG ATGTGTGTCT CTGGGATATG AATGTGTCTA GAATGCAGTC 25620 GTGTCTGTGA TGCGTTTCTG TGGTGGAGGT ACTTCCATGA TTTACACATC TGTGATATGC GTGTGTGGCA 25690 CGTGTGTGTC GTGGTGCATG TATCTGTGGC GTGCATATTT GTGGTGTGTG TGTGTGTGGC ACGTGTGTGT 25760 65 CCATGGTGTG TGTGCCTGTG GTGTGCATGT GTGTGTGTCT GTGACACGTG CATGTTCATG CTGTGTGCTG 25830 CATGTCTGTG ATGTGCCTAT TTGTGGTGTG TGTGTGCATG TGTCCGTGAC ATATGCGTGT CTATGGCATG 25900 GGTGTGTGTG GCCCCTTGGC CTTACTCCTT CCTCCTCCAG GCATGGTCCG CACCATTGTC CTCACGCTCT 25970 CGGGTGCTGG TTTGGGGAGC TCCACATTCA GGGTCCTCAC TTCTAGCATG GGTGCCCCTG TCCTGTCACA 26040 GGGCTGGGCC TTGGAGACTG TAAGCCAGGT TTGAGAGGAG AGTAGGGATG CTGGTGGTAC CTTCCTGGAC 26110 70 CCCTGGCACC CCCAGGACCC CAGTCTGGCC TATGCCGGCT CCATGAGATA TAGGAAGGCT GATTCAGGCC 26180 TCGCTCCCCG GGACACACTC CTCCCAGAGC GGCCGGGGGC CTTGGGGCTC GGCAGGGGTG AAAGGGGCCC 26250 TGGGCTTGGG TTCCCACCCA GTGGTCATGA GCACGCTGGA GGGGTAAGCC CTCAAAGTCG TGCCAGGCCG 26320 GGGTGCAGAG GTGAAGAAGT ATCCCTGGAG CTTCGGTCTG GGGAGAGGCA CATGTGGAAA CCCACAAGGA 26390 CCTCTTTCTC TGACTTCTTG AGCT 26414
75 Contig 2:
TGTGGGATTG GTTTTCATGT GTGGGATAGG TGGGGATCTG TGGGATTGGT TTTTATGAGT GGGGTAACAC 70 AGAGTTCAAG GCGAGCTTTC TTCCTGTAGT GGGTCTGCAG GTGCTCCAAC AGCTTTATTG AGGAGACCAT 140 ATCTTCCTTT GAACTATGGT CGGGTTTATA GTAAGTCAGG GGTGTGGAGG CCTCCCCTGG GCTCCCTGTT 210 CTGTTTCTTC CACTCTGGGG TCGTGTGGTG CCTGCTGTGG TGTGTGGCCG GTGGGCAGGG CTTCCAGGCC 280 TCCTTGTGTT CATTGGCCTG GATGTGGCCC TGGCTACGCT CCGTCCTTGG AATTCCCCTG CGAGTTGGAG 350 GCTTTCTTTC TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT ττττττττττ TGATAACAGA GTCTCGCTCT TTTTTGCCCA 420 GGCTGGAGTG GTTTGGCGTG ATCTTGGCTC ACTGCAACCT GTGCTTCCTG AGTTCAAGCA ATTCTCTTGC 490 CTCAGCCTCC CAAGTAGCTG GAATTATAGG CGCCCACCAC CATGCTGACT AATTTTTGTA ATTTTAGTAG 560 AGACGAGGTT TCTCCATGTT GGCCAGGCTG GTCTCGAACT CCTGACCTCA GGTGATCCTC CCACCTCGGC 630 CTCCCAAAGT GCTGGGATGA CAGGTGTGAA CCGCCGCGCC CGGCCGAGAC TCGCTTCCTG CAGCTTCCGT 700 GAGATCTGCA GCGATAGCTG CCTGCAGCCT TGGTGCTGAC AACCTCCGTT TTCCTTCTCC AGGTCTCGCT 770 AGGGGTCTTT CCATTTCATG ACTCTCTTCA CAGAAGAGTT TCACGTGTGC TGATTTCCCG GCTGTTTCCT 840 GCGTAATTGG TGTCTGCTGT TTATCGATGG CCTCCTTCCA TTTCCTTTAG GCTTTGTTTA TTGTTGTTTT 910 TCCGGCTCCT TGAAGGAAAA GTTTCGATTA TGGATGTTTG AACTTTCTTT TCTAAACAAG CATCTGAAGT 980 TGCCGTTTTC CCTCTAAAGC AGGGATCCCG AGGCCCCTGG CTGTGGAGTG GCACCGGTCT GGGGCCTGTT 1050 AGGAACCCGG CGCACAGCGG GAGGCTAGGT GGGGTGTGGG GAGCCAGCGT TCCCGCCTGA GCCCCGCCCC 1120 TCTCAGATCA GCAGTGGCAT GCGGTGCTCA GAGGCGCACA CACCCTACTG AGAACTGTGC GTGAGAGGGG 1190 TCTAGATTCT GTGCTCCTTA TGGGAATCTA ATGCCTGATG ATCTGAGGTG GAACCGTTTG CTCCCAAAAC 1260 CATCCCCTTC CCCACTGCTG TCCTGTGGAA AAATCGTCTT CCACGAAACC AGTCCCTGGT ACCACAATGG 1330 TTGGGGACCC TGTGCTAAAG ACCTGCTTCA GCAGCCTCTC GTCAGTGTTG ATATATTGGC TTTTCTGTGT 1400 TGAGTCCAGA ATAATTACGG ATTTCTGTGA TGCTTTCCGC CGACCTCAGA CCCATGGGCT ATTTGTGGGC 1470 GTGTTGCCTG CTCCTGGGTT GGGAAGGGTG CAGGCCCCAT GTACCTTCCT GTTACTGCCT TCCAGGTTGG 1540 TTCTCAGGGT TGAATCGTAC TCGATGTGGT TTTAGCCCAC GGCCCTGCCG CCAGCTCCTG GGGGCTGGGG 1610 AACATGCTGA AGCACAGAGT CACCGTGCGC GTCTTTTGAT GCCTCACAAG CTCGAGGCCT CCTGTGTCCG 1680 TGTTAGTGTG TGTCACGTGC CTGCTCACAT CCTGTCTTGG GGACGCAGGG GCTTAGCAGG TCCCGTAGTA 1750 AATGACAAGC GTCCTGGGGG AGTCTGCAGA ATAGGAGGTG GGGGTGCCGG TCTCTCTCCC GCGTCTTCAG 1820 ACTCTTCTCC TGCCTGTGCT GTGGCTGCAC CTGCATCCCT GCAATCCCTC CAGCACTGGG CTGGAGAGGC 1890 CCGGGAGCTC GAGTGCCACT TGTGCCACGT GACTGTGGAT GGCAGTCGGT CACGGGGGTC TGATGTGTGG 1960 TGACTGTGGA TGGCGGTTGG TCACAGGGGT CTGATGTGTG GTGACTGTGG ATGGCGGTCG TGGGGTCTGA 2030 TGTGGTGACT GTGGATGGCG GTCGTGGGGT CTGATGTGTG GTGACTGTGG ATGGCGGTCG TGGGGTCTGA 2100 TGTGGTGACT GTGGATGGCG GTCGTGGGGT CTGATGTGGT GACTGTGGAT GGCGGTCGTG GGGTCTGATG 2170 TGGTGACTGT GGATGGCAGT CGTGGGGTCT GATGTGTGGT GACTGTGGAT GGCGGTCGTG GGGTCTGATG 2240 TGGTGACTGT GGATGGCAGT CGTGGGGTCT GATGTGTGGT GACTGTGGAT GGCGGTCGTG GGGTCTGATG 2310 TGTGGTGACT GTGGATGGCG GTCGTGGGGT CTGATGTGTG GTGACTGTGG ATGGCGGTCG TGGGGTCTGA 2 80 TGTGTGGTGA CTGTGGATGG CGGTCGTGGG GTCTGATGTG GTGACTGTGG ATGGCGGTCG TGGGGTCTGA 2450 TGTGTGGTGA CTGTGGATGG TGATCGGTCA CAGGGGTCTG ATGTGTGGTG ACTGTGGATG GCGGTCGTGG 2520 GGTCTGATGT GTGGTGACTG TGGATGGTGA TCGGTCACAG GGGTCTGATG TGTGGTGACT GTGGATGGCG 2590 GTCGTGGGGT CTGATGTGTG GTGACTGTGG ATGGCGGTTG GTCCCGGGGG TCTGATGTGT GGTGACTGTG 2660 GATGGCGATC GGTCACAGGG GTCTGATGTG TGGTGACTGT GGATGGCGGT CGTGGGGTCT GATGTGTGGT 2730 GACTGTGGAT GGCGGTCGTG GGGTCTGATG TGTGGTGACT GTGGATGGCG GTCGTGGGGT CTGATGTGGT 2800 GACTGTGGAT GGCGGTCGTG GGGTCTGATG TGGTGACTGT GGATGGCGGT CGTGGGGTCT GATGTGTGGT 2870 GACTGTGGAT GGCGGTTGGT CCCGGGGGTC TGATGTGTGG TGACTGTGGA TGGCGGTCGT GGGGTCTGAT 2940 GTGGTGACTG TGGATGGCAG TCGTGGGGTC TGATGTGTGG TGACTGTGGA TGGCGGTCGT GGGGTCTGAT 3010 GTGTGGTGAC TGTGGATGGC GGTCGTGGGG TCTGATGTGT GGTGACTGTG GATGGCGGTC GTGGGGTCTG 3080 ATGTGTGGTG ACTGTGGATG GCGGTCGTGG GGTCTGATGT GGTGACTGTG GATGGCGGTC GTGGGGTCTG 3150 ATGTGTGGTG ACTGTGGATG GTGATCGGTC ACAGGGGTCT GATGTGTGGT GACTGTGGAT GGCGGTCGTG 3220 GGGTCTGATG TGTGGTGACT GTGGATGGCG GTCGTGGGGT CTGATGTGGT GACTGTGGAT GGCGGTCGTG 3290 GGGTCTGATG TGTGGTGACT GTGGATGGCG GTCGTAGGGT CTGATGTGTG GTGACTGTGG ATGGCAGTCG 3360 GTCACAGGGG TCTGATGTGT GGTGACTGTG GATGGCGGTC GTGGGGTCTG ATGTGTGGTG ACTGTGGATG 3430 GCGGTCGTGG GGTCTGATGT GTGGTGACTG TGGATGGCGG TCGTGGGGTC TGATGTGTGG TGACTGTGGA 3500 TGGCGGTCGT GGGGTCTGAT GTGGTGACTG TGGATGGTGA TCGGTCACAG GGGTCTGATG TGTGGTAGCT 3570 GCAGGTGGAG TCCCAGGTGT GTCTGTAGCT ACTTTGCGTC CTCGGCCCCC CGGCCCCCGT TTCCCAAACA 3640 GAAGCTTCCC AGGCGCTCTC TGGGCTTCAT CCCGCCATCG GGCTTGGCCG CAGGTCCACA CGTCCTGATC 3710 GGAAGAAACA AGTGCCCAGC TCTGGCCGGG GCAGGCCACA TTTGTGGCTC ATGCCCTCTC CTCTGCCGGC 3780 AGGTCTCTAC CTTGACAGAC CTCCAGCCGT ACATGCGACA GTTCGTGGCT CACCTGCAGG AGACCAGCCC 3850 GCTGAGGGAT GCCGTCGTCA TCGAGCAGGT CTGGGCACTG CCCTGCAGGG TTGGGCACGG ACTCCCAGCA 3920 GTGGGTCCTC CCCTGGGCAA TCACTGGGCT CATGACCGGA CAGACTGTTG GCCCTGGGGG GCAGTGGGGG 3990 GAATGAGCTG TGATGGGGGC ATGATGAGCT GTGTGCCTTG GCGAAATCTG AGCTGGGCCA TGCCAGGCTG 4060 CGACAGCTGC TGCATTCAGG CACCTGCTCA CGTTTGACTG CGCGGCCTCT CTCCAGTTCC GCAGTGCCTT 4130 TGTTCATGAT TTGCTAAATG TCTTCTCTGC CAGTTTTGAT CTTGAGGCCA AAGGAAAGGT GTCCCCCTCC 4200 TTTAGGAGGG CAGGCCATGT TTGAGCCGTG TCCTGCCCAG CTGGCCCCTC AGTGCTGGGT CTGAGGCCAA 4270 AGGAAACGTG TCCCCCTTCT TAGGAGGACG GGCCGTGTTT GAGCCACGCC CCGCTGAGCG GGCCTCTCAG 4340 TGCTGGGTCT GTCCACGTGG CCCTGTGGCC CTTTGCAGAT GTGGTCTGTC CACGTGGCCC TGTGGCTCTT 4410 TGCAGATGCC TGTTAGCACT TGCTCGGCTC TAGGGGACAG TCGTGTCCAC CGCATGAGGC TCAGAGACCT 4480 CTGGGCGAAT TTCCTTGGCT CCCAGGGTGG GGGTGGAGGT GGCCTGGGCT GCTGGGACCC AGACCCTGTG 4550 CCCGGCAGCT GGGCAGCAAC TCCTGGATCA CATATGCCAT CCGGGCCACG GTGGGCTGTG TGGGTGTGAG 4620 CCCAGCTGGA CCCACAGGTG GCCCAGAGGA GACGTTCTGT GTCACACACT CTGCCTAAGC CCATGTGTGT 4690 CTGCAGAGAC TCGGCCCGGC CAGCCCACGA TGGCCCTGCA TTCCAGCCCA GCCCCGCACT TCATCACAAA 4760 CACTGACCCC AAAAGGGACG GAGGGTCTTG GCCACGTGGT CCTGCCTGTC TCAGCACCCA CCGGCTCACT 4830 CCCATGTGTC TCCCGTCTGC TTTCGCAGAG CTCCTCCCTG AATGAGGCCA GCAGTGGCCT CTTCGACGTC 4900 TTCCTACGCT TCATGTGCCA CCACGCCGTG CGCATCAGGG GCAAGTGAGT CAGGTGGCCA GGTGCCATTG 4970 CCCTGCGGGT GGCTGGGCGG GCTGGCAGGG CTTCTGCTCA CCTCTCTCCT GCCCCTTCCC CACTGNCCTT 5040 CTGCCCGGGG CCACCAGAGT CTCCTTTTCT GGCCCCCGCC CCCTCCGGCT CCTGGGCTGC AGGCTCCCGA 5110
GGCCCCGGAA ACATGGCTCG GCTTGCGGCA GCCGGAGCGG AGCAGGTGCC ACACGAGGCC TGGAAATGGC 5180
AAGCGGGGTG TGGAGTTGCT CCTGCGTGGA GGACGAGGGG CGGGGGGTGT GTCTGGGTCA GGTGTGCGCC 5250
GAGCGTTTGA GCCTGCAGCT TGTCAGCTCC AAGTTACTAC TGACGCTGGA CACCCGGCTC TCACACGCTT 5320
GTATCTCTCT CTCCCGATAC AAAAGGATTT TATCCGATTC TCATTCCTGT CCCTGTCGTG TGACCCCCGC 5390
GAGGGCGCGG GCTCTTCTCT CTGTGACTAG ATTTCCCATC TGGAAAGTGC GGGGTTGACC GTGTAGTTTG 5460
CTCCTCTCGG GGGGCCTGTG GTGGCCATGG GGCAGGCGGC CTGGGAGAGC TGCCGTCACA CAGCCACTGG 5530
GTGAGCCACA CTCACGGTGG TAGAGCCACA GTGCCTGGTG CCACATCACG TCCTCTGGAT TTTAAGTAAA 5600
ACCACACACC TCCCGGCAGG CATCTGCCTG CGACCCTGTG TGTGCCTGGG GAGAGTGGTA GCACGGAGGA 5670
AATTCGTGCA CACTCAAGGT CATCAGCAAG GTCATCCGCA GTCAGGTGGA ACGTGGAGGC CTCTCTCTGG 5740
GATCGTCTCC AGCGGATAAA GGACTGTGCA CAGCTTCGGA AGCTTTTATT TAAAAATATA ACTATTAATT 5810
ATTGCATTAT AAGTAATCAC TAATGGTATC AGCAATTATA ATATTTATTA AAGTATAATT AGAAATATTA 5880
AGTAGTACAC ACGTTCTGGA AAAACACAAA TTGCACATGG CAGCAGAGTG AATTTTGGCC GAGGGACACG 5950
TGTGCACATG TGTGTAAGCG GCCCCCAGGC CCACAGAATT CGCTGACAAA GTCACCTCCC CAGAGAAGCC 6020
ACCACGGGCC TCCTTCGTGG TCGTGAATTT TATTAAGATG GATCAAGTCA CGTACCGTCC ACGTGTGGCA 6090
GGGCTTTGGG GAATGTGAGG TGATGACTGC GTCCTCATGC CCTGACAGAC AGGAGGTGAC TGTGTCTGTC 6160
CTGTCCCTAG GACACGGACA GGCCCGAAGC TCTAGTCCCC ATCGTGGTCC AGTTTGGCCT CTGAATAAAA 6230
ACGTCTTCAA AACCTGTTGC CCCAAAAACT AAGAACAGAG AGAGTTTCCC ÄTCCCATGTG CTCACAGGGG 6300
CGTATCTGCT TGCGTTGACT CGCTGGGCTG GCCGGACTCC TAGAGTTGGT GCGTGTGCTT CTGTGCAAAA 6370
AGTGCAGTCC TCTTGCCCAT CACTGTGATA TCTGCACCAG CAAGGAAAGC CTCTTTTCTT TTCTTTCTTT 6440
TTTTTTTTTT GAGACGGAAC GTCACTGTTG TCTGCCTGGG CTTGAGTGCA GTGGCGCGAT CTCAACTCAC 6510
TGCAACCTCC GCCTCCCGGG TTCCAGCATT TCTCCTGCCT CAGCCTCCCG AGCAGCTGAG ATTACAGGCA 6580
CCCACCCCCT GCGCCTGGCT AATTTTTGTA TTTTTAGTAG AGAGGGGTTT TTGCCATGTT GGCCAGGCTG 6650
GTCTCGAACT CCTGACCTCA GGTGATCCAC CCACCTCGGC CTCCCAAAGT GCTGGGATTA CAGGTGTGAG 6720
CCATCACGCC CAGCCGGAAA GCCTCTTTTT AAGGTGACCA CCTATAGCGC TTCCCGAAAA TAACAGGTCT 6790
TGTTTTTGCA GTAGGCTGCA AGCGTCTCTT AGCAACAGGA GTGGCGTCCT GTGGGCTCTG GGGATGGCTG 6860
AGGGTCGCGT GGCAGCCATG CCTTCTGTGT GCACCTTTAG GTTCCACGGG GCTATTCTGC TCTCACTGTT 6930
TGTCTGAAAA CGCACCCTTG GCATCCTTGT TTGGAGAGTT TCTGCTTCTC GTTGGTCATG CTGAAACTAG 7000
GGGCAAGGTT GTATCCGTTG GCGCGCAGCG GCTACATGTA GGGTCATGAG TCTTTCACCG TGGACAAATT 7070
CCTTGAAAAA AAAAAAAGGA GTCCGGTTAA GCATTCATTC CGGGTCAAGT GTCTGGTTCT GTGAATAAAC 7140
TCTAAGATTT AAGAAACCTT AATGAAAGAA AACCTTGATG ATTCAGAGCA AGGATGTGGT CACACCTGTG 7210
GCTGGATCTG TTTCAGCCGC CCCAGTGCAT GGTGAGAGTG GGGAGCAGGG ATTGTTTGTT CAGAGGTCTC 7280
ATCTGGTATG TTTCTGAGGT GTTTGCCGGC TGAATGGTAG ACGTGTCGTT TGTGTGTATG AGGTTCTGTG 7350
TCTGTGTGTG GCTCGGTTTG AGTGTACGCA TGTCCAGCAC ATGCCCTGCC CGTCTCTCAC CTGTGTCTTC 7420
CCGCCCCAGG TCCTACGTCC AGTGCCAGGG GATCCCGCAG GGCTCCATCC TCTCCACGCT GCTCTGCAGC 7490
CTGTGCTACG GCGACATGGA GAACAAGCTG TTTGCGGGGA TTCGGCGGGA CGGGTGAGGC CTCCTCTTCC 7560
CCAGGGGGGC TTGGGTGGGG GTTGATTTGC TTTTGATGCA TTCAGTGTTA ATATTCCTGG TGCTCTGGAG 7630
ACCATGACTG CTCTGTCTTG AGGAACCAGA CAAGGTTGCA GCCCCTTCTT GGTATGAAGC CGCACGGGAG 7700
GGGTTGCACA GCCTGAGGAC TGCGGGCTCC ACGCAGGCTC TGTCCAGCGG CCATGTCCAG AGGCCTCAGG 7770
GCTCAGCAGG CGGGAGGGCC GCTGCCCTGC ATGATGAGCA TGTGAATTCA ACACCGAGGA AGCACACCAG 7840
CTTCTGTCAC GTCACCCAGG TTCCGTTAGG GTCCTTGGGG AGATGGGGCT GGTGCAGCCT GAGGCCCCAC 7910
ATCTCCCAGC AGGCCCTCGA CAGGTGGCCT GGACTGGGCG CCTCTTCAGC CCATTGCCCA TCCCACTTGC 7980
ATGGGGTCTA CACCCAAGGA CGCACACACC TAAATATCGT GCCAACCTAA TGTGGTTCAA CTCAGCTGGC 8050
TTTTATTGAC AGCAGTTACT TTTTTTTTTT TAATACTTTA AGTTCTAGGG TACATGTGCA CGACGTGCAG 8120
GTTAGTTACA TATGTATACA TGTGCCATGT TGGTGTGCTG CACCCATTAA CTCATCATTT ACATTAGGTA 8190
TATCTCCTAA TGCTATCCCT CCCCACTCCC CCCATCCCAT GACAGGCCCT GGTGTGTGAT GTTCCCCACC 8260
CTGTGTCCAA GTGTTCTCAT TGTTCAGTTC CCACCTGTGA GTGAGAACAT GTGGTGTTTG GTTTTCTTTC 8330
CTTGCAATAG TTTGCTCAGA GTGATGGTTT CCAGCTTCGT CCATGTCCCT ACAAAGGACA TGAACTCATC 8400
CTTTTTTATG ACTGCATAGT ATTCCGTGGT GTATATGTGC CACATTTTCT TAATCCAGTC TATCATCGAT 8470
GGACATTTGG GTTGGTTGCA AGTCTTTGCT ACTGTGAATA GTGCCGCAAT AAACATACGT GTGCATGTGT 8540
CTTTATAGCA GCATGATTTA TAATCCTTTG GGTATATACC CAGTAATGGG ATGGCTGGGT CAAATGGTAT 8610
TTCTAGTTCT AGATCCTTGA GGAATCACCA CACTGTCTTC CACAATGGTT GAACTAGTTT ACACTCCCAC 8680
CAACAGTGTA AAAGTGTTCT GGTGCTGGAG AGGATGTGGA CAGCAGTTAT TTTTTTATGA AAATAGTATC 8750
ACTGAACAAG CAGACAGTTA GTGAAGGATG CGTCAGGAAG CCTGCAGGCC ACACAGCCAT TTCTCTCGAA 8820
GACTCCGGGT TTTTCCTGTG CATCTTTTGA AACTCTAGCT CCAATTATAG CATGTACAGT GGATCAAGGT 8890
TCTTCTTCAT TAAGGTTCAA GTTCTAGATT GAAATAAGTT TATGTAACAG AAACAAAAAT TTCTTGTACA 8960
CACAACTTGC TCTGGGATTT GGAGGAAAGT GTCCTCGAGC TGGCGGCACA CTGGTCAGCC CTCTGGGACA 9030
GGATACCTCT GGCCCATGGT CATGGGGCGC TGGGCTTGGG CCTGAGGGTC ACACAGTGCA CCATGCCCAG 9100
CTTCCTGTGG ATAGGATCTG GGTCTCGGAT CATGCTGAGG ACCACAGCTG CCATGCTGGT AAAGGGCACC 9170
ACGTGGCTCA GAGGGGGCGA GGTTCCCAGC CCCAGCTTTC TTACCGTCTT CAGTTATTTT TCCCTAAGAG 9240
TCTGAGAAGT GGGGCCGCGC CTGATGGCCT TCGTTCGTCT TCAGCTGGCA CAGAATTGCA CAAGCTGATG 9310
GTAAACACTG AGTACTTATA ATGAATGAGG AATTGCTGTA GCAGTTAACT GTAGAGAGCT CGTCTGTTGG 9380
AAAGAAATTT AAGTTTTTCA TTTAACCGCT TTGGAGAATG TTACTTTATT TATGGCTGTG TAAATTGTTT 9450
GACATTCAGT CCCTCGTAGA CAGATACTAC GTAAAAAGTG TAAAGTTAAC CTTGCTGTGT ATTTTCCCTT 9520
ATTTTAGGCT GCTCCTGCGT TTGGTGGATG ATTTCTTGTT GGTGACACCT CACCTCACCC ACGCGAAAAC 9590
CTTCCTCAGG TGAGGCCCGT GCCGTGTGTC TGTGGGGACC TCCACAGCCT GTGGGCTTTG CAGTTGAGCC 9660
CCCCGTGTCC TGCCCCTGGC ACCGCAGCGT TGTCTCTGCC AAGTCCTCTC TCTCTGCCGG TGCTGGATCC 9730
GCAAGAGCAG AGGCGCTTGG CCGTGCACCC AGGCCTGGGG GCGCAGGGGC ACCTTCGGGA GGGAGTGGGT 9800
ACCGTGCAGG CCCTGGTCCT GCAGAGACGC ACCCAGGTTA CACACGTGGT GAGTGCAGGC GGTGACCTGG 9870
CTCCTGCTGC TCTTTGGAAA GTCAAGAGTG GCGGCTCCTG GGGCCCCAGT GAGACCCCCA GGAGCTGTGC 9940
ACAGGGCCTG CAGGGCCGAG GCGGCAGCCT CCTCCCCAGG GTGCACCTGA GCCTGCGGAG AGCAGGAGCT 10010
GCTGAGTGAG CTGGCCCACA GCGTTCGCTG CGGTCACGTT CCTGCGTGGG GTTGTTTGGG ATCGGTGGGA 10080
GAATTTGGAT TTGCTGAGTG CTGCTGTCTT GAACCACGGA GATGGCTAGG AGTGGGTTTC AGAGTTGATT 10150
TTTGTGAATC AAACTAAAAT CAGGCACAGG GGACCTGGCC TCAGCACAGG GGATTGTCCA ATGTGGTCCC 10220
CCTCAAGGGC GCCCCACAGA GCCGGTGGGC TTGTTTTAAA GTGCGATTTG ACGAGGGACG AGAAACCTTG 10290
AAAGCTGTAA AGGGAACCCT CAGAAAATGT GGCCGCCAGG GGTGGTTTCA GGTGCTTTGC TGGGCTGTGT 10360
TTGTGAAAAC CCATTTGGAC CCGCCCTCCA AGTCCACCCT CCAGGTCCAC CCTCCAGGGC CGCCCTGGGC 10430 TGGGGGTATG CCTGGCGTTC CTTGTGCCGC AGCCCGGAGC ACAGCAGGCT GTGCACATTT AAATCCACTA 10500
AGATTCACTC GGGGGGAGCC CAGGTCCCAA GCAACTGAGG GCTCAGGAGT CCTGAGGCTG CTGAGGGGAC 10570
AGAGCAGACG GGGAACGCTG CTTCTGTGTG GCAAGTTCCT GAGGGTGCTG GCCAGGGAGG TGGCTCAGAG 10640
TGTATGTTGG GGTCCCACCG GGGGCAGAAC TCTGTCTCTG ATGAGTCGGC AGCCATGTAA CAGGAAGGGG 10710
5 TGGCCACAGG GAGCTGGGAA TGCACCAGGG GAGCTGCGCA GCTGGCCGAG GTCCCAGGGC CAGGCCACAG 10780
GAAGGGCAGG GGGACGCCCG GGGCCACAGC AGAGGCCGCA GGAAGGGAAG GGGATGCCCA GGCCAGAGCA 10850
GAGGCTACCG GGCACAGGGG GGCTCCCTGA GCTGGGTGAG CGAGGCTCAT GACTCGGCGA GGGAACCTCC 10920
TTGACGTGAA GCTGACGACT GGTGTTGCCC AGCTCACAGC CCAGCCAGGT CCCGCGCCTG AGCAGGAACT 10990
CAGAACCCTC CCCTTTGTCT AAAGCACAGC AGATGCCTTC AGGGCATCTA GGAGAAAACA GGCAAAGTCG 11060
10 TTGAGAAACG TCTTAAAAGA AGGTGGGATG GTGGCAATTT CTTGTCCAGA TTTTAGTCTG CCCCGGACCA 11130
CAGATGAGTC TATAACGGGA TTGTGGTGTT GCCATGGGGA CACATGAGAT GGACCATCAC AGAGGCCACT 11200
GGGGCTGCAC CTCCCATCTG AGTCCTGGCT GTCCCGGGTC CAGGCCAGGT TCTTGCATGC TCACCTACCT 11270
GTCCTGCCCG GGAGACAGGG AAAGCACCCC GAAGTCTGGA GCAGGGCTGG GTCCAGGCTC CTCAGAGCTC 11340
CTGCCAGGCC CAGCACCCTG CTCCAAATCA CCACTTCTCT GGGGTTTTCC AAAGCATTTA ACAAGGGTGT 11410
15 CAGGTTACCT CCTGGGTGAC GGCCCCGCAT CCTGGGGCTG ACATTGCCCC TCTGCCTTAG GACCCTGGTC 11480
CGAGGTGTCC CTGAGTATGG CTGCGTGGTG AACTTGCGGA AGACAGTGGT GAACTTCCCT GTAGAAGACG 11550
AGGCCCTGGG TGGCACGGCT TTTGTTCAGA TGCCGGCCCA CGGCCTATTC CCCTGGTGCG GCCTGCTGCT 11620
GGATACCCGG ACCCTGGAGG TGCAGAGCGA CTACTCCAGG TGAGCGCACC TGGCCGGAAG TGGAGCCTGT 11690
GCCCGGCTGG GGCAGGTGCT GCTGCAGGGC CGTTGCGTCC ACCTCTGCTT CCGTGTGGGG CAGGCGACTG 11760
20 CCAATCCCAA AGGGTCAGAG GCCACAGGGT GCCCCTCGTC CCATCTGGGG CTGAGCAGAA ATGCATCTTT 11830
CTGTGGGAGT GAGGGTGCTC ACAACGGGAG CAGTTTTCTG TGCTATTTTG GTAAAAGGAA ATGGTGCACC 11900
AGACCTGGGT GCACTGAGGT GTCTTCAGAA AGCAGTCTGG ATCCGAACCC AAGACGCCCG GGCCCTGCTG 11970
GGCGTGAGTC TCTCAAACCC GAACACAGGG GCCCTGCTGG GCATGAGTCC CTCTGAACCC GAGACCCTGG 12040
GGCCCTGCTG GGCGTGAGTC TCTCCGAACC CAGAGACTTC AGGGCCCTTT TGGGCGTGAG TCTCTCCGCT 12110
25 GTGAGCCCCA CACTCCAAGG CTCATCCACA GTCTACAGGA TGCCATGAGT TCATGATCAC GTGTGACCCA 12180
TCAGGGGACA GGGCCATGGT GTGGGGGGGG TCTCTACAAA ATTCTGGGGT CTTGTTTCCC CAGAGCCCGA 12250
GAGCTCAAGG CCCCGTCTCA GGCTCAGACA CAAATGAATT GAAGATGGAC ACAGATGCAG AAATCTGTGC 12320
TGTTTCTTTT ATGAATAAAA AGTATCAACA TTCCAGGCAG GGCAAGGTGG CTCACACCTA TAATCCCAGC 12390
ACTTTGGGAG GCCGAGGTGG GTGGATCACT TGAGGCCAGG AGTTTGAGGC CAACCTAACC AACATAGTGA 12460
30 AATTCCATTT CTACTTAAAA AATACAAAAA TTAGCCTGGC CTGGTGGCAC ACGCCTGTAG TCCCCGCTAT 12530
GCGGGAGGCT GAGGCAGGAG AATCATTTGA ACCCAGGAGG CAGAGGTTGC AGTGAGCCGA GATCACACCA 12600
CTGCACTCCA GCCTGGGCAA CAGAGTGAGA CTTCATCTTA AAAAAAAAAA AAAAAGTATC AGCATTCCAA 12670
AACCATAGTG GACAGGTGTT TTTTTATTCT GTCCTTCGAT AATATTTACT GGTGCTGTGC TAGAGGCCGG 12740
_ AACTGGGGGT GCCTTCCTCT GAAAGGCACA CCTTCATGGG AAGAGAAATA AGTGGTGAAT GGTTGTTAAA 12810 j5 CCAGAGGTTT AAACTGGGGT CCTGTCGTTC TGAGTTAACA GTCCAGATCT GGACTTTGCC TCTTTCCAGA 12880
ATGCTCCCTG GGGTTTGCTT CATGGGGGAG CAGCAGGTGT GGACACCCTC GTGATGGGGG AGCAGCAGGT 12950
GCAGACGCCC TCATGATGGG GGAGTGGCAG GTGCAGACAC CCTTGTGCAT GGTGCCCAGC ATGTCCCTGT 13020
TGCAGCTCCC TCCCCACAAG GATGCCGGTC TCCTGTGCTC CCCACAGTCC CTGCTTCCCT CTCACAGCCT 13090
TACCTGGTCC TGGCCTCCAC TGGCTTTGTC TGCATGATTT CCACATTTCC TGGGCTCCCA GCACCTCTTC 13160
40 GCCTCTCCCA GGCACCTCTG CAGTGCTGGC CATACCAGTC AGCTGTGAAC TGTCCACTGC TTATTTTGCT 13230
CCCCATGAAA TGTATTTTTT AGGACAGGCA CCCCTGGTTC CAGCCTCTGG CACAGCATCA GTGAATGTTA 13300
TTGAAGGACA AAGGACAGAC AAACAAATCA GGAAAATGGG TTCTCTCTAA ACACATTGCA AAGCCACAGA 13370
GGCTAGTGCA GGATGGGTGG GCATCAGGTC ATCAGATGTG GGTCCAATGC CAGAATATTC TGTGCTCCCA 13440
AAGGCCACTT GGTCAGAGTG TGTGCTTGCA GAGGTGGCTC TAAAAGCTCA GCAGTGGAGG CAGTGGTTCG 13510
45 CCATACTCAG GGTGAACTCA CATCCTCTGT GTCTGAAGTA TACAGCAGAG GCTTGAAGGG CATCTGGGAG 13580
AAGAAAACAG GCAAAATGAT TAAGAAAAGT GAAAAAGGAA AAGTGGTAAG ATGGGAATTT TCTTGTCCAG 13650
ATTTTAGTCT CCCAAACCAC AGCTCAGATG GTAGAATGTG GTCAGAACTG ATGGACAGAA CAATAGAACA 13720
AAACGGAAGC CCTATCTCTC AGAAACGTGT GTTAATGTGG TÄTGTGGCAC AGCTGATGGA AÄAGAGAGTG 13790
TGTGTGTAAT TTTTTTTTCT GAGAAAACTG ACTGGAAGCA AATAAGTTGT GTCTTTACAG CATATACCAG 13860
50 AGCAGATTCT AGGTAGAAGA GGAGACACAT GCAAACAACA CCAGCAACAG AAATAAAACA AAAGACTCAA 13930
AGGGAAGGGA GGTGAACGTT CCCTGGTTTG GTGTTGGGGA AGGACACACA GGGAGGCGGA TGAAACCAGT 14000
GAGGCAACGG GCATTGCTTT CACTGCAGAG AAACTCAGCT TGCCTGAGCC ACAGTGAAAA TGGCCATTCC 14070
CTGGAGCGTT TGTGCACGTG ATTTATTTAA GGCGCCCTGT GAGGTCCTGC ACATTCATCC TCTCACTTTG 14140
TTCTCCTAAC CACCTGAGAG GTAGAGGAGG AAAGGCTCCA GGGGAGCAGC CGCCCTTGGT CACCCAGCTG 14210
55 GCAAAGGGCA TGCATGATTG CAGCCTGGCC TCCTGCTCCG GGGCCCTTGC TCTGCCCGAG GACCCCACAC 14280
AAGTCAGACC CATAGGCTCA GGGTGAGCCG GAGCCCAAGG TCGTGTTGGG GATGGCTGTG AAAGAAGAAA 14350
TGGACGTCTG ATGCACACTT GGGAAGGTCC TACCAGCAGC GTCAAAGAAA TGCATGTGAA ACTGACAGCG 14420
AGACCCATCC CTCAAAGAAA CGCACGTGAA ACTGATGGCG AGACCTGTCC CCATCCCTCA TGCTGGCTCC 14490
TTTTCTGGGC TTGCCAAGAG CCAGCATCAG GTTGAGGCAA GCTGGAAAGA CTTTTCTGGA AAGCAGCTTG 14560
60 TTTGCATGGA AGTCCTCACA ATGTCCTGTG TCTTCCCAGT AATTCCACTT CTGAAGTGAC CAC-ACATTAT 14630
CACGGGTCTT ATTTACCATT TCCAGTGTTC CAGGCAGGGG GACTTGCCAC AGCAAGTCAC GAACCTGCCC 14700
AAATACAGGG CTAAGGAGAT ATTATGCATC ACAAAACTTG CTCTGCCATT AAACATTTTT CAAAGAATTT 14770
TTGAAGAATG TTTAATGGCA CAAAACGTTT ATTTCAATGT AGCAGTGTTC AAAGCTGGAT GTAAAAGAAC 14840
ACACCCCAGG AGCCTGCCGT GAATGTCATG TGTGTTCATC TTTGGACATG GACATACATG GGCAGTGAGT 14910
65 GGTGGTGAGG CCCTGGAGGA CATCGGTGGG ATGCCTCCAT CCTGCCCCTC TGGAGACACC ATGTGTGCCA 14980
CGTGCACTCA CTGGAGCCCT GTTTAGCTGG TGCCACCTGG CTCTTCCATC CCTGAGATTC AAACACAGTG 15050
AGATTCCCCA CGCCCAACTC AGTGTTCTCC CACAAAAAAC CTGAGTCACA CCTGTGTTCA CTCGAGGGAC 15120
GCCCGGGAGC CAGGGCTCCA CAGTTTATTA TGTGTTTTTG GCTGAGTTAT GTGCAGATCT CATCAGGGCA 15190
GATGATGAGT GCACAAACAC GGCCGTGCGA GGTTTGGATA CACTCAACAT CACTAGCCAG GTCCTGGTGG 15260
70 AGTTTGGTCA TGCAGAGTCT GGATGGCATG TAGCATTTGG AGTCCATGGA GTGAGCACCC AGCCCCCTCG 15330
GGCTGCAGCG CATGCCCCAG GCAGGACAAG GAAGCGGGAG GAAGGCAGGA GGCTCTTTGG AGCAAGCTTT 15400
GCAGGAGGGG GCTGGGTGTG GGGCAGGCAC CTGTGTCTGA CATTCCCCCC TGTGTCTCAG CTATGCCCGG 15470
ACCTCCATCA GAGCCAGTCT CACCTTCAAC CGCGGCTTCA AGGCTGGGAG GAACATGCGT CGCAAACTCT 15540
TTGGGGTCTT GCGGCTGAAG TGTCACAGCC TGTTTCTGGA TTTGCAGGTG AGCAGGCTGA TGGTCAGCAC 15610
75 AGAGTTCAGA GTTCAGGAGG TGTGTGCGCA AGTATGTGTG TGTGTGTGTG CGCGCGTGCC TGCAAGGCTG 15680
ATGGTGACTG GCTGCACGTA AGAGTGCACA TGTACGCATA TACACGTGAG CACATACATG TGTGCATGTG 15750
TGTACATGAA GGCATGGCAG TGTGTGCACA GGTGTGCAAG GGCACAAGTG TGTGCACATG CGAATGCACA 15820 CCTGACATGC ATGTGTGTTC GTGCACAGTC GTGTGGGCAT TCACGTGAGG TGCATGCGTG TGGGTGTGCA 15890
GTGTGAGTAG CATGTGTGCA CATAACATGT ATTGAGGGGT CCTCGTGTTC ACCCCGCTAG GTCCTCAGCA 15960
CCAGTGCCAC TCCTTACAGG ATGAGACGGG GTCCCAGGCC TTGGTGGGCT GAGGCTCTGA AGCTGCAGCC 16030
CTGAGGGCAT TGTCCCATCT GGGCATCCGC GTCCACTCCC TCTCCTGTGG GCTTCTGTGT CCACTCCCCC 16100 TCTCCTGTGG GCATTTACAT CCACTCCACT CCCTCTCTCC TGTGGGCATC CGCGTCCACT CCCCCTCTCT 16170
GTGGGCATCT GCGTCCACCT CCCCTCTCTG TGGGCATTTG CGTCCACTCC CTCTCCTGGT TCCTTCCTGT 16240
CTTGGCCGAG CCTCGGGGGC AGGCAGATGA CACAGAGTCT TGACTCGCCC AGGGTGGTTC GCAGCTGCCG 16310
GGTGAGGGCC AGGCCGGATT TCACTGGGAA GAGGGATAGT TTCTTGTCAA AATGTTCCTC TTTCTTGTTC 16380
CATCTGAATG GATGATAAAG CAAAAAGTAA AAACTTAAAA TCCCAGAGAG GTTTCTACCG TTTCTCACTC 16450 TTTCTTGGCG ACTCTAGGTG AACAGCCTCC AGACGGTGTG CACCAACATC TACAAGATCC TCCTGCTGCA 16520
GGCGTACAGG TGAGCCGCCA CCAAGGGGTG CAGGCCCAGC CTCCAGGGAC CCTCCGCGCT CTGCTCACCT 16590
CTGACCCGGG GCTTCACCTT GGAACTCCTG GGTTTTAGGG GCAAGGAATG TCTTACGTTT TCAGTGGTGC 16660
TGCTGCCTGT GCACAGTTCT GTTCGCGTGG CTCTGTGCAA AGCACCTGTT CTCCATCTCT GGGTAGTGGT 16730
AGGAGCCGGT GTGGCCCCAG GTGTCCCCAC TGTGCCTGTG CACTGGCCGT GGGACGTCAT GGAGGCCATC 16800 CCAGGGCAGC AGGGGCATGG GGTAAAGAGA TGTTTATGGG GAGTCTTAGC AGAGGAGGCT GGGAAGGTGT 16870
CTGAACAGTA GATGGGAGAT CAGATGCCCG GAGGATTTGG GGTCTCAGCA AAGAGGGCCG AGGTGGGTGC 16940
AGGTGAGGGT CGCTGGCCCC ACCCCCGGGA AGGTGCAGCA GAGCTGTGGC TCCCCACACA GCCCGGCCAG 17010
CACCTGTGCT CTGGGCATGG CTGTGCTCCT GGAACGTTCC CTGTCCTGGC TGGTCAGGGG GTGCCCCTGC 17080
CAAGAATCGA CAACTTTATC ACAGAGGGAA GGGCCAATCT GTGGAGGCCA CAGGGCCAGC TTCTGCCTGG 17150 AGTCAGGGCA GGTGGTGGCA CAAGCCTCGG GGCTGTACCA AAGGGCAGTC GGGCACCACA GGCCCGGGCC 17220
TCCACCTCAA CAGGCCTCCC GAGCCACTGG GAGCTGAATG CCAGGAGGCC GAAGCCCTCG CCCCATGAGG 17290
GCTGAGAAGG AGTGTGAGCA TTTGTGTTAC CCAGGGCCGA GGCTGCGCGA ATTACCGTGC ACACTTGATG 17360
TGAAATGAGG TCGTCGTCTA TCGTGGAAAC CCAGCAAGGG CTCACGGGAG AGTTTTCCAT TACAAGGTCG 17430
TACCATGAAA ATGGTTTTTA ACCCGAGTGC TTGCGCCTTC ATGCTCTGGC AGGGAGGGCA GAGCCACAGC 17500 TGCATGTTAC CGCCTTTGCA CCAGCTCCAG AGGCTTGGGA CCAGGCTGTC TCAGTTCCAG GGTGCGTCCG 17570
GCTCAGACCG CCCTCCTCTC TGCCTTCTCT CTCTGCCTCA AATCTTCCCT CGTTTGCATC TCCCTGACGC 17640
GTGCCTGGGC CCTCGTGCAA GCTGCTTGAC TCCTTTCCGG AAACCCTTGG GGTGTGCTGG ATACAGGTGC 17710
CACTGAGGAC TGGAGGTGTC TGACACTGTG GTTGACCCCA GGGTCCAGCT GGCGTGCTTG GGGCCTCCTT 17780
GGGCCATGAT GAGGTCAGAG GAGTTTTCCC AGGTGAAAAC TCCTGGGAAA CTCCCAGGGC CATGTGACCT 17850 GCCACCTGCT CCTCCCATAT TCAGCTCAGT CTTGTCCTCA TTTCCCCACC AGGGTCTCTA GCTCCGAGGA 17920
GCTCCCGTAG AGGGCCTGGG CTCAGGGCAG GGCGGCTGAG TTTCCCCACC CATGTGGGGA CCCTTGGGTA 17990
GTCGCTTGAT TGGGTAGCCC TGAGGAGGCC GAGATGCGAT GGGCCACGGG CCGTTTCCAA ACACAGAGTC 18060
AGGCACGTGG AAGGCCCAGG AATCCCCTTC CCTCGAGGCA GGAGTGGGAG AACGGAGAGC TGGGCCCCGA 18130
TTTCACGGCA GCCAGGCTGC AGTGGGCGAG GCTGTGGTGG TCCACGTGGC GCTGGGGGCG GGGTCTGATT 18200 CAAATCCGCT GGGGCTCGGC CTTCCTGGCC CGTGCTGGCC GCGCCTCCAC ACGGGCTTGG GGTGGACGCC 18270
CCGACCTCTA GCAGGTGGCT ATTTCTCCCT TTGGAAGAGA GCCCCTCACC CATGCTAGGT GTTTCCCTCC 18340
TGGGTCAGGA GCGTGGCCGT GTGGCAACCC CGGGACCTTA GGCTTATTTA TTTGTTTAAA AACATTCTGG 18410
GCCTGGCTTC CGTTGTTGCT AAATGGGGAA AAGACATCCC ACCTCAGCAG AGTTACTGAG AGGCTGAAAC 18480
CGGGGTGCTG GCTTGACTGG TGTGATCTCA GGTCATTCCA GAAGTGGCTC AGGAAGTCAG TGAGACCAGG 18550 TACATGGGGG GCTCAGGCAG TGGGTGAGAT GAGGTACACG GGGGGCTCAG GCAGTGGGTG AGGCCAGGTA 18620
CATGGGGGGC TCAGGCACTG GGTGAGATGA GGTACACGGG GGGCTCAGGC AGAGGGTCAG ACCAGGTACA 18690
CGGGGGCTCT GATCACACGC ACATATGAGC ACATGTGCAC ATGTGCTGTT TCATGGTAGC CAGGTCTGTG 18760
CACACCTGCC CCAAAGTCCC AGGAAGCTGA GAGGCCAAAG ATGGAGGCTG ACAGGGCTGG CGCGGTGGCT 18830
CACACCTGTA GTCCCAGCAC TTTGGGAGGC CGAGGCGAGA GGATCCCTTG AGCCCAGGAG TTTAAGACCA 18900 GCCTGAGCAA CATAGTAGAA CCCCATCTCT ATGAAAAATA AAAACAAAAA TTAGCTGAAC ATGGTGGTGT 18970
GCGCCTGTAG TTCCAATACT TGGGAGGCTG AAGTGGGAGG ATCACTTGAG CCCAGGAGGT GGAAGCTGCA 19040
GTGAGCTGAG ATTGCACCAC TGTACTGCAG CCTGGGTGAC AGAGTGAGAG CCCATCTCAA CAACAACAAA 19110
GAAGACTGAC AAATGCAGTT TCTTGGAAAG AAACATTTAG TAGGAACTTA ACCTACACAC AGAAGCCAAG 19180
TCGGTGTCTC GGTGTCAGTG AGATGAGATG ATGGGTCCTC ACACCATCAC CCCAGACCCA GGGTTTATGC 19250 ACCACAGGGG CGGGTGGCTC AGAAGGGATG CGCAGGACGT TGATATACGA TGACATCAAG GTTGTCTGAC 19320
GAAGGGCAGG ATTCATGATA AGTACCTGCT GGTACACAAG GAACAATGGA TAAACTGGAA ACCTTAGAGG 19390
CCTTCCCGGA ACAGGGGCTA ATCAGAAGCC AGCATGGGGG GCTGGCATCC AGGATGGAGC TGCTTCAGCC 19460
TCCACATGCG TGTTCATACA GATGGTGCAC AGAAACGCAG TGTACCTGTG CACACACAGA CACGCAGCTA 19530
CTCGCACACA CAAGCACACA CACAGACATG CATGCATGCA TCCGTGTGTG TGCACCTGTG CCCATGAGGA 19600 AACCCATGCA TGTGCATTCA TGCACGCACA CAGGCACCGG TGGGCCCATG CCCACACCCA CGAGCACCGT 19670
CTGATTAGGA GGCCTTTCCT CTGACGCTGT CCGCCATCCT CTCAGGTTTC ACGCATGTGT GCTGCAGCTC 19740
CCATTTCATC AGCAAGTTTG GAAGAACCCC ACATTTTTCC TGCGCGTCAT CTCTGACACG GCCTCCCTCT 19810
GCTACTCCAT CCTGAAAGCC AAGAACGCAG GTATGTGCAG GTGCCTGGCC TCAGTGGCAG CAGTGCCTGC 19880
CTGCTGGTGT TAGTGTGTCA GGAGACTGAG TGAATCTGGG CTTAGGAAGT TCTTACCCCT TTTCGCATCA 19950 GGAAGTGGTT TAACCCAACC ACTGTCAGGC TCGTCTGCCC GCCCTCTCGT GGGGTGAGCA GAGCACCTGA 20020
TGGAAGGGAC AGGAGCTGTC TGGGAGCTGC CATCCTTCCC ACCTTGCTCT GCCTGGGGAA GCGCTGGGGG 20090
GCCTGGTCTC TCCTGTTTGC CCCATGGTGG GATTTGGGGG GCCTGGCCTC TCCTGTTTGC CCTGTGGTGG 20160
GATTGGGCTG TCTCCCGTCC ATGGCACTTA GGGCCCTTGT GCAAACCCAG GCCAAGGGCT TAGGAGGAGG 20230
CCAGGCCCAG GCTACCCCAC CCCTCTCAGG AGCAGAGGCC GCGTATCACC ACGACAGAGC CCCGCGCCGT 20300 CCTCTGCTTC CCAGTCACCG TCCTCTGCCC CTGGACACTT TGTCCAGCAT CAGGGAGGTT TCTGATCCGT 20370
CTGAAATTCA AGCCATGTCG AACCTGCGGT CCTGAGCTTA ACAGCTTCTA CTTTCTGTTC TTTCTGTGTT 20440
GTGGAAATTT CACCTGGAGA AGCCGAAGAA AACATTTCTG TCGTGACTCC TGCGGTGCTT GGGTCGGGAC 20510
AGCCAGAGAT GGAGCCACCC CGCAGACCGT CGGGTGTGGG CAGCTTTCCG GTGTCTCCTG GGAGGGGAGC 20580
TGGGCTGGGC CTGTGACTCC TCAGCCTCTG TTTTCCCCCA GGGATGTCGC TGGGGGCCAA GGGCGCCGCC 20650 GGCCCTCTGC CCTCCGAGGC CGTGCAGTGG CTGTGCCACC AAGCATTCCT GCTCAAGCTG ACTCGACACC 20720
GTGTCACCTA CGTGCCACTC CTGGGGTCAC TCAGGACAGG CAAGTGTGGG TGGAGGCCAG TGCGGGCCCC 20790
ACCTGCCCAG GGGTCATCCT TGAACGCCCT GTGTGGGGCG AGCAGCCTCA GATGCTGCTG AAGTGCAGAC 20860
GCCCCCGGGC CTGACCCTGG GGGCCTGGAG CCACGCTGGC AGCCCTATGT GATTAAACGC TGGTGTCCCC 20930
AGGCCACGGA GCCTGGCAGG GTCCCCAACT TCTTGAACCC CTGCTTCCCA TCTCAGGGGC GATGGCTCCC 21000 CACGCTTGGG AGCCTTCTGA CCCCTGACCT GTGTCCTCTC ACAGCCTCTT CCCTGGCTGC TGCCCTGAGC 21070
TCCTGGGGTC CTGAGCAAGT TCTCTCCCCG CCCCGCCGCT CCAGCGTCAC TGGGCTGCCT GTCTGCTCGC 21140
CCCGGTGGAG GGGTGTCTGT CCCTTCACTG AGGTTCCCAC CAGCCAGGGC CACGAGGTGC AGGCCCTGCC 21210 TGCCCGGCCA CCCACACGTC CTAGGAGGGT TGGAGGATGC CACCTCTGGC CTCTTCTGGA ACGGAGTCTG 21280 ATTTTGGCCC CGCAGCCCAG ACGCAGCTGA GTCGGAAGCT CCCGGGGACG ACGCTGACTG CCCTGGAGGC 21350 CGCAGCCAAC CCGGCACTGC CCTCAGACTT CAAGACCATC CTGGACTGAT GGCCACCCGC CCACAGCCAG 21420 GCCGAGAGCA GACACCAGCA GCCCTGTCAC GCCGGGCTCT ACGTCCCAGG GAGGGAGGGG CGGCCCACAC 21490 CCAGGCCCGC ACCGCTGGGA GTCTGAGGCC TGAGTGAGTG TTTGGCCGAG GCCTGCATGT CCGGCTGAAG 21560 GCTGAGTGTC CGGCTGAGGC CTGAGCGAGT GTCCAGCCAA GGGCTGAGTG TCCAGCACAC CTGCCGTCTT 21630 CACTTCCCCA CAGGCTGGCG CTCGGCTCCA CCCCAGGGCC AGCTTTTCCT CACCAGGAGC CCGGCTTCCA 21700 CTCCCCACAT AGGAATAGTC CATCCCCAGA TTCGCCATTG TTCACCCCTC GCCCTGCCCT CCTTTGCCTT 21770 CCACCCCCAC CATCCAGGTG GAGACCCTGA GAAGGACCCT GGGAGCTCTG GGAATTTGGA GTGACCAAAG 21840 GTGTGCCCTG TACACAGGCG AGGACCCTGC ACCTGGATGG GGGTCCCTGT GGGTCAAATT GGGGGGAGGT 21910 GCTGTGGGAG TAAAATACTG AATATATGAG TTTTTCAGTT TTGAAAAAAA TCTCATGTTT GAATCCTAAT 21980 GTGCACTGCA TAGACACCAC TGTATGCAAT TACAGAAGCC TGTGAGTGAA CGGGGTGGTG GTCAGTGCGG 22050 GCCCATGGCC TGGCTGTGCA TTTACGGAAG TCTATGAGTG AATGGGGTTG TGGTCAGTGC GGGCCCATGG 22120 CCTGGCTGGG CCTGGGAGGT TTCTGATGCT GTGAGGCAGG AGGGGAAGGA GGGTAGGGGA TAGACAGTGG 22190 GAGCCCCCAC CCTGGAAGAC ATAACAGTAA GTCCAGGCCC GAAGGGCAGC AGGGATGCTG GGGGCCCAGC 22260 TTGGGCGGCG GGGATGATGG AGGGCCTGGC CAGGGTGGCA GGGATGATGG GGGCCCCAGC TGGGGTGGCA 22330 GGGGTGATGG GGGGGGCTGG TCTGGGTGGC GGGGAAGATG GGGAAGCCTG GCTGGGCCCC CTCCTCCCCT 22400 GCCTCCCACC TGCAGCCGTG GATCCGGATG TGCTTCCCTG GTGCACATCC TCTGGGCCAT CAGCTTTCAT 22470 GGAGGTGGGG GGCAGGGGCA TGACACCATC CTGTATAAAA TCCAGGATTC CTCCTCCTGA ACGCCCCAAC 22540 TCAGGTTGAA AGTCACATTC CGCCTCTGGC CATTCTCTTA AGAGTAGACC AGGATTCTGA TCTCTGAAGG 22610 GTGGGTAGGG TGGGGCAGTG GAGGGTGTGG ACACAGGAGG CTTCAGGGTG GGGCTGGTGA TGCTCTCTCA 22680 TCCTCTTATC ATCTCCCAGT CTCATCTCTC ATCCTCTTAT CATCTCCCAG TCTCATCTGT CTTCCTCTTA 22750 TCTCCCAGTC TCATCTGTCA TCCTCTTACC ATCTCCCAGT CTCATCTCTT ATCCTCTTAT CTCCTAGTCT 22820 CATCCAGACT TACCTCCCAG GGCGGGTGCC AGGCTCGCAG TGGAGCTGGA CATACGTCCT TCCTCAGGCA 22890 GAAGGAACTG GAAGGATTGC AGAGAACAGG AGGGGCGGCT CAGAGGGACG CAGTCTTGGG GTGAAGAAAC 22960 AGCCCCTCCT CAGAAGTTGG CTTGGGCCAC ACGAAACCGA GGGCCCTGCG TGAGTGGCTC CAGAGCCTTC 23030 CAGCAGGTCC CTGGTGGGGC CTTATGGTAT GGCCGGGTCC TACTGAGTGC ACCTTGGACA GGGCTTCTGG 23100 TTTGAGTGCA GCCCGGACGT GCCTGGTGTC GGGGTGGGGG CTTATGGCCA CTGGATATGG CGTCATTTAT 23170 TGCTGCTGCT TCAGAGAATG TCTGAGTGAC CGAGCCTAAT GTGTATGGTG GGCCCAAGTC CACAGACTGT 23240 GTCGTAAATG CACTCTGGTG CCTGGAGCCC CCGTATAGGA GCTGTGAGGA AGGAGGGGCT CTTGGCAGCC 23310 GGCCTGGGGG CGCCTTTGCC CTGCAAACTG GAAGGGAGCG GCCCCGGGCG CCGTGGGCGG ACGACCTCAA 23380 GTGAGAGGTT GGACAGAACA GGGCGGGGAC TTCCCAGGAG CAGAGGCCGC TGCTCAGGCA CACCTGGGTT 23450 TGAATCACAG ACCAACaGGT CAGGCCATTG TTCAGCTATC CATCTTCTAC AAAGCTCCAG ATTCCTGTTT 23520 CTCCGGGTGT TTTTTGTTGA AATTTTACTC AGGATTACTT ATATTTTTTG CTAAAGTATT AGACCCTTAA 23590 AAAAGGTATT TGCTTTGATA TGGCTTAACT CACTAAGCAC CTACTTTATT TGTCTGTTTT TATTTATTAT 23660 TATTATTATT ATTAGAGATG GTGTCTACTC TGTCACCCAG GTTGTTAGTG CAGTGGCACA GTCATGGCTC 23730 GCTGTAGCCG CAAACCCCCA GGCTCAAGTG ATCCTCCGGC CTCAGCTTCC CAGAGTGCTG GGATTACAGG 23800 TGTGAGCCAC TGCCCTTGCC TGGCACTTTT AAAAACCACT ATGTAAGGTC AGGTCCAGTG GCTTCCACAC 23870 CTGTCATCCC AGTAGTTTGG GAAGCCGAGG CAGAAGGATT GTCTGAGGCC AGGAGTTTGA GACCAGCATG 23940 GGTAACATAG GGAGACCCCA TCTCTACAAA. AAATGCAAAA AGTTATCCGG GCGTGGGGTC CAGCATCTGT 24010 AGTCCCAGCT GCTCGGGAGG CTGAGTGGGA GGATCGCTTG AGCCCGGGAG GTCATGGCTG CAGTGAGCTG 24080 TGATTGTACC ATCGCACTCC AGCCTGGGCA ACAGAGTGAG ACCCTGTCTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAG 24150 AAGGAGAAGG AGAAGAGAAG AAGAAGGAAG AAGGAAAGAG AAGAAGAAGG AAGAAGGAAG AAAGAAGGAG 24220 AAGGAGGCCT GCTAGGTGCT AGGTAGACTG TCAAATCTCA GAGCAAAATG AAAATAACAA AGTTTTAAAG 24290 GGAAAGAAAA ACCCCAGCTC TTTGGACTTC CTTAGGCCTG AACTTCATCT CAAGCAGCTT CCTTCCACAG 24360 ACAAGCGTGT ATGGAGCGAG TGAGTTCAAA GCAGAAAGGG AGGAGAAGCA GGCAAGGGTG GAGGCTGTGG 24430 GTGACACCAG CCAGGACCCC TGAAAGGGAG TGGTTGTTTT CCTGCCTCAG CCCCACGCTC CTGCCGGTCC 24500 TGCACCTGCT GTAACCGTCG ATGTTGGTGC CAGGTGCCCA CCTGGGAAGG ATGCTGTGCA GGGGGCTTGC 24570 CAAACTTTGG TGGGTTTCAG AAGCCCCAGG CACTTGTGGC AGGCACAATT ACAGCCCCTC CCCAAAGATG 24640 CCCACGTCCT TCTCCTGGAA CCTGTGAATG TGTCACCCGC AAGGCAGAGG CTGGTGAAGG CTGCAGGTGG 24710 AATCACGGCT GCCAGTCAGC CGATCTTAAG GTCATCCTGG ATTATCTGGT GGGCCTGATA TGGCCACAAG 24780 GGTCCCTAGA AGTGAGAGAG GGAGGCAGGG GAGAGTCAGA GAGGGGACGT GAGAAGGACC ACTGGCCACT 24850 GCTGGCTTTG AGATGGAGGA GGGGGTCCCC AGCCAAGGAA TGGGGGCAGC CGCTCCATGC TGGAAAAGCA 24920 AGCAATCCTC CCCGGTCCTG AGGGCACACG GCCCTGCCCA CGCCTCGATT TCAGGCCAGT GGGACCTGTT 24990 TCAGCTTTCC GGCCTCCAGA GCTGTAAGAT GATGCGTTTG TGTTCAGCCA CTAAGCTGCA GTGATTCGTC 25060 ACAGCAGCAA ATGGAATAGC AGTACAGGGA AATGAATACA GGGACAGTTC TCAGAGTGAC TCTCAGCCCA 25130 CCCCTGGG 25138
Beispiel 5
Der Vergleich der oben beschriebenen genomischen hTC-Sequenz mit der Sequenz der hTC-cDNA (Fig. 6; entsprechend SEQ ID NO 2) ermöglichte die Aufklärung der
Exon-Intron-Struktur des hTC-Gens. Die genomische Organisation des hTC-Gens ist in Fig. 7 schematisch dargestellt. Die kodierende Region des hTC-Gens setzt sich aus 16 Exons zusammen, die in ihrer Größe zwischen 62 bp und 1354 bp variieren (s. Tabelle 1). Exon 1 enthält das Translationsstartcodon ATG. Das Translations- stopcodon TGA sowie der 3 ' untranslatierte Bereich liegen auf Exon 16 (Fig. 8). Ein mögliches Polyadenylierungssignal (AATAAA) wurde weder in Exon 16 noch in den 3195 bp der folgenden 3 '-flankierenden Region gefunden. Basierend auf der
Konsensussequenz
5 '-Exon Intron 3 '-Exon
Prä-mRNA A/C A G | G T A/G A . . . N C A G | G Häufigk.(%) 70 60 80 100 l OO 95 70 80 100 100 60
wurden die Exon-Intron-Übergänge bestimmt und in Tabelle 1 aufgeführt. Mit Ausnahme der 5'-Splice-Stelle zwischen Exon 15 und Intron 15 stimmen alle Exon- Intron-Übergänge mit der publizierten (Shapiro und Senapathy, 1987) Splice- Konsensussequenz überein. Die Größe der Introns liegt zwischen 104 bp und 8616 bp. Da Intron 6 nur zum Teil isoliert wurde, kann die exakte Länge des hTC-Gens nicht bestimmt werden. Basierend auf der von Intron 6 erhaltenen Teilsequenz von -4660 bp beträgt die minimale Größe des hTERT Gens 37 kb.
Die Introns 1-5 sowie der 5'-Bereich des Introns 6 sind in Contig 1 enthalten: Intron 1 : bp 11493-11596 (SEQ ID NO 4); Intron 2: bp 12951-21566 (SEQ ID NO 5); Intron 3: bp 21763-23851 (SEQ ID NO 6); Intron 4: bp 24033-24719 (SEQ ID NO 7);
Intron 5: bp 24900-25393 (SEQ ID NO 8); 5'-Bereich von Intron 6: bp 25550-26414 (SEQ ID NO 9).
Der 3 '-Bereich des Introns 6 sowie die Introns 7-15 sind in Contig 2 an folgenden Positionen lokalisiert:
3 '-Bereich von Intron 6: bp 1-3782 (SEQ ID NO 10);
Intron 7: bp 3879-4858 (SEQ ID NO 1 1);
Intron 8: bp 4945-7429 (SEQ ID NO 12);
Intron 9: bp 7544-9527 (SEQ ID NO 13); Intron 10: bp 9600-1 1470 (SEQ ID NO 14);
Intron 11 : bp 11660-15460 (SEQ ID NO 15;
Intron 12: bp 15588-16467 (SEQ ID NO 16);
Intron 13: bp 16530-19715 (SEQ ID NO 17);
Intron 14: 19841-20621 (SEQ ID NO 18); Intron 15: 20760-21295 (SEQ ID NO 19).
Der 3'-nichttranskribierte Bereich befindet sich ebenfalls im Contig 2 an Position 21960-25138 (SEQ ID NO 20).
Die genannten Introns haben im einzelnen folgende Sequenzen: Intron 1 ( SEQ ID NO 4 )
GTGGGCCTCCCCGGGGTCGGCGTCCGGCTGGGGTTGAGGGCGGCCGGGGGGAACCAGCGACATGCGGAGAGCAGCGCAGG CGACTCAGGGCGCTTCCCCCGCAG
Intron 2 (SEQ ID NO 5)
GTGAGGAGGTGGTGGCCGTCGAGGGCCCAGGCCCCAGAGCTGAATGCAGTAGGGGCTCAGAAAAGGGGGCAGGCAGAGCC CTGGTCCTCCTGTCTCCATCGTCACGTGGGCACACGTGGCTTTTCGCTCAGGACGTCGAGTGGACACGGTGATCTCTGCC TCTGCTCTCCCTCCTGTCCAGTTTGCATAAACTTACGAGGTTCACCTTCACGTTTTGATGGACACGCGGTTTCCAGGCGC CGAGGCCAGAGCAGTGAACAGAGGAGGCTGGGCGCGGCAGTGGAGCCGGGTTGCCGGCAATGGGGAGAAGTGTCTGGAAG CACAGACGCTCTGGCGAGGGTGCCTGCAGGTTACCTATAATCCTCTTCGCAATTTCAAGGGTGGGAATGAGAGGTGGGGA CGAGAACCCCCTCTTCCTGGGGGTGGGAGGTAAGGGTTTTGCAGGTGCACGTGGTCAGCCAATATGCAGGTTTGTGTTTA AGATTTAATTGTGTGTTGACGGCCAGGTGCGGTGGCTCACGCCGGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCTGAGGCAGGTGGA TCACCTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCCTATCTGTACTAAAAATACAAI.AATTAGCTG GGCATGGTGGTGTGTGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGC TGCAGTGAGCTGAGATTGTGCCATTGTACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGTGAAACTCTGTCTTTAAAAAAAV?^AGTGTT CGTTGATTGTGCCAGGACAGGGTAGAGGGAGGGAGATAAGACTGTTCTCCAGCACAGATCCTGGTCCCATCTTTAGGTAT G.AAGAGGGCCACATGGGAGCAGAGGACAGCAGATGGCTCCACCTGCTGAGGAAGGGACAGTGTTTGTGGGTGTTCAGGGG ATGGTGCTGCTGGGCCCTGCCGTGTCCCCACCCTGTTTTTCTGGATTTGATGTTGAGGAACCTCCGCTCCAGCCCCCTTT TGGCTCCCAGTGCTCCCAGGCCCTACCGTGGCAGCTAGAAGAAGTCCCGATTTCACCCCCTCCCCACAAACTCCCAAGAC ATGTAAGACTTCCGGCCATGCAGACAAGGAGGGTGACCTTCTTGGGGCTCTTTTTTTTCTTTTTTTCTTTTTATGGTGGC AAAAGTCATATAACATGAGATTGGCACTCCTAACACCGTTTTCTGTGTACAGTGCAGAATTGCTAACTCGGCGGTGTTTA CAGCAGGTTGCTTGAAATGCTGCGTCTTGCGTGACTGGAAGTCCCTACCCATCGAACGGCAGCTGCCTCACACCTGCTGC GGCTCAGGTGGACCACGCCGAGTCAGATAAGCGTCATGCAACCCAGTTTTGCTTTTTGTGCTCCAGCTTCCTTCGTTGAG GAGAGTTTGAGTTCTCTGATCAGGACTCTGCCTGTCATTGCTGTTCTCTGACTTCAGATGAGGTCACAATCTGCCCCTGG CTTATGCAGGGAGTGAGGCGTGGTCCCCGGGTGTCCCTGTCACGTGCAGGGTGAGTGAGGCGTTGCCCCCAGGTGTCCCT GTCACGTGTAGGGTGAGTGAGGCGCGGCCCCCGGGTGTCCCTGTCCCGTGCAGCGTGATTGAGGTGTGGCCCCCGGGTGT CCCTGTCACGTGTAGGGTGAGTGAGGCGCCATCCCCGGGTGTCCCTGTCACGTGTAGGGTGAGTGAGGCGTGGTCCCCGG GTGTCCCTGTCCCGTGCAGGGTGAGTGAGGCACTGTCCCCGGGTGTCCCTGTCACGTGCAGGGTGAGTGAGGCGCGGTCC CCGGGTGTCCCTCTCAGGTGTAGGGTGAGTGAGGCGCGGCCCCAGGGTGTCCCTGTCACGTGTAGGGTGAGTGAGGCACC GTCCCTGGGTGTCCCTCCCAGGTATAGGGTGAGTGAGGCACTGTCCCCGGGTGTCCCTGTCACGTGCAGGGTGAGTGAGG CGCGGCCCCCGGGTGTCCCTCTCAGGTGCAGGGTGAGTGAGGCGCTGTCCCTGGGTGTCCCTGTCTCGTGTAGGGTGAGT GAGGCTCTGTCCCCAGGTGTCCTTGGCGTTTGCTCACTTGAGCTTGCTCCTGAATGTTTGCTCTTTCTATAGCCACAGCT GCGCCGGTTGCCCATTGCCTGGGTAGATGGTGCAGGCGCAGTGCTGGTCCCCAAGCCTATCTTTTCTGATGCTCGGCTCT TCTTGGTCACCTCTCCGTTCCATTTTGCTACGGGGACACGGGACTGCAGGCTCTCGCCTCCCGCGTGCCAGGCACTGCAG CCACAGCTTCAGGTCCGCTTGCCTCTGTTGGGCCTGGCTTGCTCACCACGTGCCCGCCACATGCATGCTGCCAATACTCC TCTCCCAGCTTGTCTCATGCCGAGGCTGGACTCTGGGCTGCCTGTGTCTGCTGCCACGTGTTGCTGGAGACATCCCAGAA AGGGTTCTCTGTGCCCTGAAGGAAAGCAAGTCACCCCAGCCCCCTCACTTGTCCTGTTTTCTCCCAAGCTGCCCCTCTGC TTGGCCCCCTTGGGTGGGTGGC.AACGCTTGTCACCTTATTCTGGGCACCTGCCGCTCATTGCTTAGGCTGGGCTCTGCCT CCAGTCGCCCCCTCACATGGATTGACGTCCAGCCACAGGTTGGAGTGTCTCTGTCTGTCTCCTGCTCTGAGACCCACGTG GAGGGCCGGTGTCTCCGCCAGCCTTCGTCAGACTTCCCTCTTGGGTCTTAGTTTTGAATTTCACTGATTTACCTCTGACG TTTCTATCTCTCCATTGTATGCTTTTTCTTGGTTTATTCTTTCATTCCTTTTCTAGCTTCTTAGTTTAGTCATGCCTTTC CCTCTAAGTGCTGCCTTACCTGCACCCTGTGTTTTGATGTGAAGTAATCTCAACATCAGCCACTTTCAAGTGTTCTTAAA ATACTTCAAAGTGTTAATACTTCTTTTAAGTATTCTTATTCTGTGATTTTTTTCTTTGTGCACGCTGTGTTTTGACGTGA AATCATTTTGATATCAGTGACTTTTAAGTATTCTTTAGCTTATTCTGTGATTTCTTTGAGCAGTGAGTTATTTGAACACT GTTTATGTTCAAGATATGTAGAGTATCAAGATACGTAGAGTATTTTAAGTTATCATTTTATTATTGATTTCTAACTCAGT TGTGTAGTGGTCTGTATAATACCAATTATTTGAAGTTTGCGGAGCCTTGCTTTGTGATCTAGTGTGTGCATGGTTTCCAG .AACTGTCCATTGTAAATTTGACATCCTGTCAATAGTGGGCATGCATGTTCACTATATCCAGCTTATTAAGGTCCAGTGCA AAGCTTCTGTCTCCTTCTAGATGCATGAAATTCCAAGAAGGAGGCCATAGTCCCTCACCTGGGGGATGGGTCTGTTCATT TCTTCTCGTTTGGTAGCATTTATGTGAGGCATTGTTAGGTGCATGCACGTGGTAGAATTTTTATCTTCCTGATGAGTGAA TCTTTTGGAGACTTCTATGTCTCTAGTAATCTAGTAATTCTTTTTTTJAATTGCTCTTAGTACTGCCACACTGGGCTTCT TTTGATTAGTATTTTCCTGCTGTGTCTGTTTTCTGCCTTTAATTTATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTGAGACA GAGTCTTGGTCTGTCGCCCAGGGTGAGTGCAGTGGTGTGATCACAGGTCAGTGTAACTTTTACCTTCTGGCCTGAGCCGT CCTCTCACCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGAACTGCAGACACGCACCGCTACACCTGGCTAATTTTTAAATTTTTTCTGGA GACAGGGTCTTGCTGTGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAACTCTTGGACTCAAGGGATCCATCTACCTCGGCTTCCCAAAGTG CTGAATTACAGGCATGAGCCACCATGTCTGGCCTAATTTTCAACACTTTTATATTCTTATAGTGTGGGTATGTCCTGTTA ACAGCATGTAGGTGAATTTCCAATCCAGTCTGACAGTCGTTGTTTAACTGGATAACCTGATTTATTTTCATTTTTTTGTC ACTAGAGACCCGCCTGGTGCACTCTGATTCTCCACTTGCCTGTTGCATGTCCTCGTTCCCTTGTTTCTCACCACCTCTTG GGTTGCCATGTGCGTTTCCTGCCGAGTGTGTGTTGATCCTCTCGTTGCCTCCTGGTCACTGGGCATTTGCTTTTATTTCT CTTTGCTTAGTGTTACCCCCTGATCTTTTTATTGTCGTTGTTTGCTTTTGTTTATTGAGACAGTCTCACTCTGTCACCCA GGCTGGAGTGTAATGGCACAATCTCGGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCTCGGTTCAAGCAGTTCTCATTCCTCAACCTCA TGAGTAGCTGGGATTACAGGCGCCCACCACCACGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATAGGCTTTCACCATGT TGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAAGTGATCTGCCCGCCTTGGCCTCCCACAGTGCTGGGATTACAGGTGCAA GCCACCGTGCCCGGCATACCTTGATCTTTTAAAATGAAGTCTGAAACATTGCTACCCTTGTCCTGAGCAATAAGACCCTT AGTGTATTTTAGCTCTGGCCACCCCCCAGCCTGTGTGCTGTTTTCCCTGCTGACTTAGTTCTATCTCAGGCATCTTGACA CCCCCACAAGCTAAGCATTATTAATATTGTTTTCCGTGTTGAGTGTTTCTGTAGCTTTGCCCCCGCCCTGCTTTTCCTCC TTTGTTCCCCGTCTGTCTTCTGTCTCAGGCCCGCCGTCTGGGGTCCCCTTCCTTGTCCTTTGCGTGGTTCTTCTGTCTTG TTATTGCTGGTAAACCCCAGCTTTACCTGTGCTGGCCTCCATGGCATCTAGCGACGTCCGGGGACCTCTGCTTATGATGC ACAGATGAAGATGTGGAGACTCACGAGGAGGGCGGTCATCTTGGCCCGTGAGTGTCTGGAGCACCACGTGGCCAGCGTTC CTTAGCCAGTGAGTGACAGCAACGTCCGCTCGGCCTGGGTTCAGCCTGGAAAACCCCAGGCATGTCGGGGTCTGGTGGCT CCGCGGTGTCGAGTTTGAAATCGCGCAAACCTGCGGTGTGGCGCCAGCTCTGACGGTGCTGCCTGGCGGGGGAGTGTCTG CTTCCTCCCTTCTGCTTGGGi\ACCAGGACAAAGGATGAGGCTCCGAGCCGTTGTCGCCCAACAGGAGCATGACGTGAGCC ATGTGGATAATTTTAAAATTTCTAGGCTGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGCGGG TGGATCACGAGGTCAGGAGGTCGAGACCATCCTGGCCAACATGATGAAACCCCATCTGTACTAAAAACACAAAAATTAGC TGGGCGTGGTGGCGGGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCTGGGAGTTGGAA GTTGCAGTGAGCCGACATTGCACCACTGO.CTCCAGCCTGGC-?VACACAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAA •AAAAAAAAAAAATTCTAGTAGCCACATTAAAAAAGTAAAAAAGAAAAGGTGAAATTAATGTAATAATAGATTTTACTGAA GCCCAGCATGTCCACACCTCATCATTTTAGGGTGTTATTGGTGGGAGCATCACTCACAGGACATTTGACATTTTTTGAGC TTTGTCTGCGGGATCCCGTGTGTAGGTCCCGTGCGTGGCCATCTCGGCCTGGACCTGCTGGGCTTCCCATGGCCATGGCT GTTGTACCAGATGGTGCAGGTCCGGGATGAGGTCGCCAGGCCCTCAGTGAGCTGGATGTGCAGTGTCCGGATGGTGCACG TCTGGGATGAGGTCGCCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGTGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCAGGGGTGAGGTCTCCAG GCCCTCGGTGAGCTGGAGGTATGGAGTCCGGATGATGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATG TGTGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCAGGGGTGAGGTCTCCAGGCCCTCGGTAAGCTGGAGGTATGGAGTCCGGATGATGCA GGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGTGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGAGGTCACC AGGCCCTGCGGTGAGCTGGGTGTGCGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCTGGAGTGAGGTCGCCAGACGGTGCCAGACCATGC GGTGAGCTGGATATGCGGTGTCCGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGAGGTTGCCAGGCCCTGCTGTGAGTTGGATGTGGGGT GTCCGGATGCTGCAGGTCCGGTGTGAGGTCACCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGTGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCT GGGGTGAAGGTCGCCAGGCCCCTGCTTGTGAGCTGGATGTGTGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCTGGAGTGAGGTCGCCAG GCCCTCGGTGAGCTGGATGTGCAGTGTCCAGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGACCCTGCGGTGAGCTGGATG TGCGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCTGGAGTGAGGTCGCCAGGCCCTCGGTGAGCTGGATGTATGGAGTCCGGATGGTGCC GGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGACCCTGCTGTGAGCTGGATGTGCGGTGTCTGGATGGTACAGGTCTGGAGTGAGGTCGCC AGACCCTGCTGTGAGCTGGATATGCGGTGTCCGGATGGTGCAGGTCAGGGGTGAGGTCTCCAGGCCCTCGGTGAGCTGGA GGTATGGAGTCCGGATGATGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCTGTGAACTGGATGTGCGGCGTCTGGATGGT GCAGGTCTGGGGTGTGGTCGCCAGGCCCTCGGTGAGCTGGAGGTATGGAGTCCGGATGATGCAGGTCCGGGGTGAGGTCG CCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGCGGCGTCTGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGTGGTCGCCAGGCCCTCGGTGAGCTG GAGGTATGGAGTCCGGATGATGCAGGTCCGGGGTGAGGTTGCCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGCTGTATCCGGATG GTGCAGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGCTGTATCCGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGAGGT CACCAGGCCCTGCGGTGAGCTGGTTGTGCGGTGTCCGGTTGCTGCAGGTCCGGGGTGAGTTCGCCAGGCCCTCGGTGAGC TGGATGTGCGGTGTCCCCGTGTCCGGATGGTGCAGGTCCAGGGTGAGGTCGCTAGGCCCTTGGTGGGCTGGATGTGCCGT GTCCGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGAGGTCGCCAGGCCTTTGGTGAGCTGGATGTGCGGTGTCTGCATGGTGCAGGTCTG GGGTGAGGTCGCCAGGCCCTTGGTGGGCTGGATGTGTGGTGTCCGGATGGTGCAGGTCCGGCGTGAGGTCGCCAGGCCCT GCTGTGAGCTGGATGTGCGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGGTAGCCAAGGCCTTCGGTGAGCTGGATGTGGG GTGTCCGGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCGGTTAGCTGGATATGCGGTGTCCGGATGGTGCAGGT CCGGGGTGAGGTCACCAGGCCCTGCGGTTAGCTGGATGTGCGGTGTCTGGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGG CCCTGCTGTGAGCTGGATGTGCTGTATCCGGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCAGTGAGCTGGATG TGCTGTATCCGGATGGTGCAGGTCTGGCGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCGGTTAGCTGGATATGCGGTGTCGGATGGTGCA GGTCCGGGGTGAGGTCACCAGGCCCTGCGGTTAGCTGGATGTGCGGTGTCCGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGAGGTCGCC AGGCCCTGCTGTGAGCTGGATGTGCTGTATCCGGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCGGTGAGCTGG ATGTGCTGTATCCGGATGGTGCAGGTCTGGCGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCGGTGAGCTGGATGTGCAGTGTACGGATGG TGCAGGTCCGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTGCGGTGGGCTGTATGTGTGTTGTCTGGATGGTGCAGGTCCGGGGTGAGTT CGCCAGGCCCTGCGGTGAGCTGGATGTGTGGTGTCTGGATGCTGCAGGTCCGGGGTGAGTTCGCCAGGCCCTCGGTGAGC TGGATATGCGGTGTCCCCGTGTCCGAATGGTGCAGGTCCAGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTTGGTGGGCTGGATGTGCCGT GTCCGGATGGTGCAGGTCTGGGGTGAGGTCGCCAGGCCCTTGGTGAGCTGGATGTGCGGTGTCCGGATGGTGCAGGTCCG GGGTGAGGTCACCAGGCCCTCGGTGATCTGGATGTGGCATGTCCTTCTCGTTT.AAG
Intron 3 (SEQ ID NO 6)
GTACTGTATCCCCACGCCAGGCCTCTGCTTCTCGAAGTCCTGGAACACCAGCCCGGCCTCAGCATGCGCCTGTCTCCACT TGCCTGTGCTTCCCTGGCTGTGCAGCTCTGGGCTGGGAGCCAGGGGCCCCGTCACAGGCCTGGTCCAAGTGGATTCTGTG CAAGGCTCTGACTGCCTGGAGCTCACGTTCTCTTACTTGTAAAATCAGGAGTTTGTGCCAAGTGGTCTCTAGGGTTTGTA AAGCAGAAGGGATTTAAATTAGATGGAAACACTACCACTAGCCTCCTTGCCTTTCCCTGGGATGTGGGTCTGATTCTCTC TCTCTTTTTTTTTTCTTTTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCATAATCTTGGCTCACT GCAACCTCCACCTCCTGGGTTTAAGCGATTCACCAGCCTCÄGCCTCCT.AAGTAGCTGGGATTACAGGCACCTGCCACCAC GCCTGGCTAATTTTTGTACTTTTAGGAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCG.?υ.CTCATGACCTCAGG TGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGTTTACAGGCT.AAGCCACCGTGCCCAGCCCCCGATTCTCTTTTAATT CATGCTGTTCTGTATGAATCTTCAATCTATTGGATTTAGGTCATGAGAGGATAAAATCCCACCCACTTGGCGACTCACTG CAGGGAGCACCTGTGCAGGGAGCACCTGGGGATAGGAGAGTTCCACCATGAGCTAACTTCTAGGTGGCTGCATTTGAATG GCTGTGAGATTTTGTCTGCAATGTTCGGCTGATGAGAGTGTGAGATTGTGACAGATTCAAGCTGGATTTGCATCAGTGAG GGACGGGAGCGCTGGTCTGGGAGATGCCAGCCTGGCTGAGCCCAGGCCATGGTATTAGCTTCTCCGTGTCCCGCCCAGGC TGACTGTGGAGGGCTTTAGTCAGAAGATCAGGGCTTCCCCAGCTCCCCTGCACACTCGAGTCCCTGGGGGGCCTTGTGAC ACCCCATGCCCCAAATCAGGATGTCTGCAGAGGGAGCTGGCAGCAGACCTCGTCAGAGGTAACACAGCCTCTGGGCTGGG GACCCCGACGTGGTGCTGGGGCCATTTCCTTGCATCTGGGGGAGGGTCAGGGCTTTCCCTGTGGGAACAAGTTAATACAC .^VATGCACCTTACTTAGACTTTACACGTATTTAATGGTGTGCGACCCAACATGGTCATTTGACCAGTATTTTGGAAAGAAT TT.AATTGGGGTGACCGGAAGGAGCAGACAGACGTGGTGGTCCCCAAGATGCTCCTTGTCACTACTGGGACTGTTGTTCTG CCTGGGGGGCCTTGGAGGCCCCTCCTCCCTGGACAGGGTACCGTGCCTTTTCTACTCTGCTGGGCCTGCGGCCTGCGGTC AGGGCACCAGCTCCGGAGCACCCGCGGCCCCAGTGTCCACGGAGTGCCAGGCTGTCAGCCACAGATGCCCAGGTCCAGGT GTGGCCGCTCCAGCCCCCGTGCCCCCATGGGTGGTTTTGGGGGAAAAGGCCAAGGGCAGAGGTGTCAGGAGACTGGTGGG CTCATGAGAGCTGATTCTGCTCCTTGGCTGAGCTGCCCTGAGCAGCCTCTCCCGCCCTCTCCATCTGAAGGGATGTGGCT CTTTCTACCTGGGGGTCCTGCCTGGGGCCAGCCTTGGGCTACCCCAGTGGCTGTACCAGAGGGACAGGCATCCTGTGTGG AGGGGCATGGGTTCACGTGGCCCCAGATGCAGCCTGGGACCAGGCTCCCTGGTGCTGATGGTGGGACAGTCACCCTGGGG GTTGACCGCCGGACTGGGCGTCCCCAGGGTTGACTATAGGACCAGGTGTCCAGGTGCCCTGCAAGTAGAGGGGCTCTCAG AGGCGTCTGGCTGGCATGGGTGGACGTGGCCCCGGGCATGGCCTTCAGCGTGTGCTGCCGTGGGTGCCCTGAGCCCTCAC TGAGTCGGTGGGGGCTTGTGGCTTCCCGTGAGCTTCCCCCTAGTCTGTTGTCTGGCTGAGCAAGCCTCCTGAGGGGCTCT CTATTGCAG
Intron 4 (SEQ ID NO 7) GTGGCTGTGCTTTGGTTTAACTTCCTTTTTAAACAGAAGTGCGTTTGAGCCCCACATTTGGTATCAGCTTAGATGAAGGG CCCGGAGGAGGGGCCACGGGACACAGCCAGGGCCATGGCACGGCGCCAACCCATTTGTGCGCACAGTGAGGTGGCCGAGG TGCCGGTGCCTCCAGAAAAGCAGCGTGGGGGTGTAGGGGGAGCTCCTGGGGCAGGGACAGGCTCTGAGGACCACAAGAAG CAGCCGGGCCAGGGCCTGGATGCAGCACGGCCCGAGGTCCTGGATCCGTGTCCTGCTGTGGTGCGCAGCCTCCGTGCGCT TCCGCTTACGGGGCCCGGGGACCAGGCCACGACTGCCAGGAGCCCACCGGGCTCTGAGGATCCTGGACCTTGCCCCACGG CTCCTGCACCCCACCCCTGTGGCTGCGGTGGCTGCGGTGACCCCGTCATCTGAGGAGAGTGTGGGGTGAGGTGGACAGAG GTGTGGCATGAGGATCCCGTGTGCAACACÄCATGCGGCCAGGAACCCGTTTCAAACAGGGTCTGAGGAAGCTGGGAGGGG TTCTAGGTCCCGGGTCTGGGTGGCTGGGGACACTGGGGAGGGGCTGCTTCTCCCCTGGGTCCCTATGGTGGGGTGGGCAC TTGGCCGGATCCACTTTCCTGACTGTCTCCCATGCTGTCCCCGCCAG
Intron 5 (SEQ ID NO 8)
GTGGGTGCCGGGGACCCCCGTGAGCAGCCCTGCTGGACCTTGGGAGTGGCTGCCTGATTGGCACCTCATGTTGGGTGGAG GAGGTACTCCTGGGTGGGCCGCAGGGAGTGCAGGTGACCCTGTCACTGTTGAGGACACACCTGGCACCTAGGGTGGAGGC CTTCAGCCTTTCCTGCAGCACATGGGGCCGACTGTGCACCCTGACTGCCCGGGCTCCTATTCCCAAGGAGGGTCCCACTG GATTCCAGTTTCCGTCAGAGAAGGAACCGCAACGGCTCAGCCACCAGGCCCCGGTGCCTTGCACCCCAGTCCTGAGCCAG GGGTCTCCTGTCCTGAGGCTCAGAGAGGGGACACAGCCCGCCCTGCCCTTGGGGTCTGGAGTGGTGGGGGTCAGAGAGAG AGTGGGGGACACCGCCAGGCCAGGCCCTGAGGGCAGAGGTGATGTCTGAGTTTCTGCGTGGCCACTGTCAGTCTCCTCGC CTCCACTCACACAG
5* -Bereich Intron 6 (SEQ ID NO 9) GT.AAGGTTCACGTGTGATAGTCGTGTCCAGGATGTGTGTCTCTGGGATATGAATGTGTCTAGAATGCAGTCGTGTCTGTG ATGCGTTTCTGTGGTGGAGGTACTTCCATGATTTACACATCTGTGATATGCGTGTGTGGCACGTGTGTGTCGTGGTGCAT GTATCTGTGGCGTGCATATTTGTGGTGTGTGTGTGTGTGGCACGTGTGTGTCCATGGTGTGTGTGCCTGTGGTGTGCATG TGTGTGTGTCTGTGACACGTGCATGTTCATGCTGTGTGCTGCATGTCTGTGATGTGCCTATTTGTGGTGTGTGTGTGCAT GTGTCCGTGACATATGCGTGTCTATGGCATGGGTGTGTGTGGCCCCTTGGCCTTACTCCTTCCTCCTCCAGGCATGGTCC GCACCATTGTCCTCACGCTCTCGGGTGCTGGTTTGGGGAGCTCCACATTCAGGGTCCTCACTTCTAGCATGGGTGCCCCT GTCCTGTCACAGGGCTGGGCCTTGGAGACTGTAAGCCAGGTTTGAGAGGAGAGTAGGGATGCTGGTGGTACCTTCCTGGA CCCCTGGCACCCCCAGGACCCCAGTCTGGCCTATGCCGGCTCCATGAGATATAGGAAGGCTGATTCAGGCCTCGCTCCCC GGGACACACTCCTCCCAGAGCGGCCGGGGGCCTTGGGGCTCGGCAGGGGTGAAAGGGGCCCTGGGCTTGGGTTCCCACCC AGTGGTCATGAGCACGCTGGAGGGGTAAGCCCTCAAAGTCGTGCCAGGCCGGGGTGCAGAGGTGAAGAAGTATCCCTGGA GCTTCGGTCTGGGGAGAGGCACATGTGGAAACCCACAAGGACCTCTTTCTCTGACTTCTTGAGCT
3 x -Bereich Intron 6 (SEQ ID NO 10)
TGTGGGATTGGTTTTCATGTGTGGGATAGGTGGGGATCTGTGGGATTGGTTTTTATGAGTGGGGTAACACAGAGTTCAAG GCGAGCTTTCTTCCTGTAGTGGGTCTGCAGGTGCTCCAACAGCTTTATTGAGGAGACCATATCTTCCTTTGAACTATGGT CGGGTTTATAGTAAGTCAGGGGTGTGGAGGCCTCCCCTGGGCTCCCTGTTCTGTTTCTTCCACTCTGGGGTCGTGTGGTG CCTGCTGTGGTGTGTGGCCGGTGGGCAGGGCTTCCAGGCCTCCTTGTGTTCATTGGCCTGGATGTGGCCCTGGCTACGCT CCGTCCTTGGAATTCCCCTGCGAGTTGGAGGCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTGATAACAGA GTCTCGCTCTTTTTTGCCCAGGCTGGAGTGGTTTGGCGTGATCTTGGCTCACTGCAACCTGTGCTTCCTGAGTTC?-AGCA ATTCTCTTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGAATTATAGGCGCCCACCACCATGCTGACTAATTTTTGTAATTTTAGTAG AGACGAGGTTTCTCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCTCCCACCTCGGCCTCCCAAAGT GCTGGGATGACAGGTGTGAACCGCCGCGCCCGGCCGAGACTCGCTTCCTGCAGCTTCCGTGAGATCTGCAGCGATAGCTG CCTGCAGCCTTGGTGCTGACAACCTCCGTTTTCCTTCTCCAGGTCTCGCTAGGGGTCTTTCCATTTCATGACTCTCTTCA CAGAAGAGTTTCACGTGTGCTGATTTCCCGGCTGTTTCCTGCGTAATTGGTGTCTGCTGTTTATCGATGGCCTCCTTCCA TTTCCTTTAGGCTTTGTTTATTGTTGTTTTTCCGGCTCCTTGAAGGAAAAGTTTCGATTATGGATGTTTGAACTTTCTTT TCTAAACAAGCATCTGAAGTTGCCGTTTTCCCTCTAAAGCAGGGATCCCGAGGCCCCTGGCTGTGGAGTGGCACCGGTCT GGGGCCTGTTAGGAACCCGGCGCACAGCGGGAGGCTAGGTGGGGTGTGGGGAGCCAGCGTTCCCGCCTGAGCCCCGCCCC TCTCAGATCAGCAGTGGCATGCGGTGCTCAGAGGCGCACACACCCTACTGAGAACTGTGCGTGAGAGGGGTCTAGATTCT GTGCTCCTTATGGGAATCTAATGCCTGATGATCTGAGGTGGAACCGTTTGCTCCCAAAACCATCCCCTTCCCCACTGCTG TCCTGTGGAAAAATCGTCTTCCACGAAACCAGTCCCTGGTACCAC?-ATGGTTGGGGACCCTGTGCTAAAGACCTGCTTCA GCAGCCTCTCGTCAGTGTTGATATATTGGCTTTTCTGTGTTGAGTCCAGAATAATTACGGATTTCTGTGATGCTTTCCGC CGACCTCAGACCCATGGGCTATTTGTGGGCGTGTTGCCTGCTCCTGGGTTGGGAAGGGTGCAGGCCCCATGTACCTTCCT GTTACTGCCTTCCAGGTTGGTTCTCAGGGTTGAATCGTACTCGATGTGGTTTTAGCCCACGGCCCTGCCGCCAGCTCCTG GGGGCTGGGGAACATGCTGAAGCACAGAGTCACCGTGCGCGTCTTTTGATGCCTCACAAGCTCGAGGCCTCCTGTGTCCG TGTTAGTGTGTGTCACGTGCCTGCTCACATCCTGTCTTGGGGACGCAGGGGCTTAGCAGGTCCCGTAGTAAATGACAAGC GTCCTGGGGGAGTCTGCAGAATAGGAGGTGGGGGTGCCGGTCTCTCTCCCGCGTCTTCAGACTCTTCTCCTGCCTGTGCT GTGGCTGCACCTGCATCCCTGCAATCCCTCCAGCACTGGGCTGGAGAGGCCCGGGAGCTCGAGTGCCACTTGTGCCACGT GACTGTGGATGGCAGTCGGTCACGGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTTGGTCACAGGGGTCTGATGTGTG GTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGG ATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTG GGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCAGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATG TGGTGACTGTGGATGGCAGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACT GTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGG CGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGTGATCGGTCA CAGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGTGATCGGTCACAG GGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTTGGTCCCGGGGG TCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGATCGGTCACAGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCT GATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGT GACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGAT GGCGGTTGGTCCCGGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGATGGCAG TCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGG TCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGT GGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGTGATCGGTCACAGGGGTCTGATGTGTGGT GACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGGTGACTGTGGAT GGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTAGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCAGTCG GTCACAGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGG GGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGATGTGTGGTGACTGTGGATGGCGGTCGTGGGGTCTGAT GTGGTGACTGTGGATGGTGATCGGTCACAGGGGTCTGATGTGTGGTAGCTGCAGGTGGAGTCCCAGGTGTGTCTGTAGCT ACTTTGCGTCCTCGGCCCCCCGGCCCCCGTTTCCCAAACAGAAGCTTCCCAGGCGCTCTCTGGGCTTCATCCCGCCATCG GGCTTGGCCGCAGGTCCACACGTCCTGATCGGAAGAAACAAGTGCCCAGCTCTGGCCGGGGCAGGCCACATTTGTGGCTC ATGCCCTCTCCTCTGCCGGCAG
Intron 7 (SEQ ID NO 11)
GTCTGGGCACTGCCCTGCAGGGTTGGGCACGGACTCCCAGCAGTGGGTCCTCCCCTGGGCAATCACTGGGCTCATGACCG GACAGACTGTTGGCCCTGGGGGGCAGTGGGGGGAATGAGCTGTGATGGGGGCATGATGAGCTGTGTGCCTTGGCGAAATC TGAGCTGGGCCATGCCAGGCTGCGACAGCTGCTGCATTCAGGCACCTGCTCACGTTTGACTGCGCGGCCTCTCTCCAGTT CCGCAGTGCCTTTGTTCATGATTTGCTAAATGTCTTCTCTGCCAGTTTTGATCTTGAGGCCAAAGGAAAGGTGTCCCCCT CCTTTAGGAGGGCAGGCCATGTTTGAGCCGTGTCCTGCCCAGCTGGCCCCTCAGTGCTGGGTCTGAGGCCAAAGGAAACG TGTCCCCCTTCTTAGGAGGACGGGCCGTGTTTGAGCCACGCCCCGCTGAGCGGGCCTCTCAGTGCTGGGTCTGTCCACGT GGCCCTGTGGCCCTTTGCAGATGTGGTCTGTCCACGTGGCCCTGTGGCTCTTTGCAGATGCCTGTTAGCACTTGCTCGGC TCTAGGGGACAGTCGTGTCCACCGCATGAGGCTCAGAGACCTCTGGGCGAATTTCCTTGGCTCCCAGGGTGGGGGTGGAG GTGGCCTGGGCTGCTGGGACCCAGACCCTGTGCCCGGCAGCTGGGCAGCAACTCCTGGATCACATATGCCATCCGGGCCA CGGTGGGCTGTGTGGGTGTGAGCCCAGCTGGACCCACAGGTGGCCCAGAGGAGACGTTCTGTGTCACACACTCTGCCTAA GCCCATGTGTGTCTGCAGAGACTCGGCCCGGCCAGCCCACGATGGCCCTGCATTCCAGCCCAGCCCCGCACTTCATCACA AACACTGACCCCAAAAGGGACGGAGGGTCTTGGCCACGTGGTCCTGCCTGTCTCAGCACCCACCGGCTCACTCCCATGTG TCTCCCGTCTGCTTTCGCAG Intron 8 ( SEQ ID NO 12 )
GTGAGTCAGGTGGCCAGGTGCCATTGCCCTGCGGGTGGCTGGGCGGGCTGGCAGGGCTTCTGCTCACCTCTCTCCTGCCC CTTCCCCACTGNCCTTCTGCCCGGGGCCACCAGAGTCTCCTTTTCTGGCCCCCGCCCCCTCCGGCTCCTGGGCTGCAGGC TCCCGAGGCCCCGGAAACATGGCTCGGCTTGCGGCAGCCGGAGCGGAGCAGGTGCCACACGAGGCCTGGAAATGGCAAGC GGGGTGTGGAGTTGCTCCTGCGTGGAGGACGAGGGGCGGGGGGTGTGTCTGGGTCAGGTGTGCGCCGAGCGTTTGAGCCT GCAGCTTGTCAGCTCCAAGTTACTACTGACGCTGGACACCCGGCTCTCACACGCTTGTATCTCTCTCTCCCGATACAAAA GGATTTTATCCGATTCTCATTCCTGTCCCTGTCGTGTGACCCCCGCGAGGGCGCGGGCTCTTCTCTCTGTGACTAGATTT CCCATCTGGAAAGTGCGGGGTTGACCGTGTAGTTTGCTCCTCTCGGGGGGCCTGTGGTGGCCATGGGGCAGGCGGCCTGG GAGAGCTGCCGTCACACAGCCACTGGGTGAGCCACACTCACGGTGGTAGAGCCACAGTGCCTGGTGCCACATCACGTCCT CTGGATTTTAAGTAAAACCACACACCTCCCGGCAGGCATCTGCCTGCGACCCTGTGTGTGCCTGGGGAGAGTGGTAGCAC GGAGGAAATTCGTGCACACTCAAGGTCATCAGCAAGGTCATCCGCAGTCAGGTGGAACGTGGAGGCCTCTCTCTGGGATC GTCTCCAGCGGAT.?VAAGGACTGTGCACAGCTTCGGAAGCTTTTATTTAAAAATATAACTATTAATTATTGCATTATAAGT AATCACTAATGGTATCAGCAATTATAATATTTATTAAAGTAT.AATTAGAAATATTAAGTAGTACACACGTTCTGGAAAAA CACAAATTGCACATGGCAGCAGAGTGAATTTTGGCCGAGGGACACGTGTGCACATGTGTGTAAGCGGCCCCCAGGCCCAC AGAATTCGCTGACAAAGTCACCTCCCCAGAGAAGCCACCACGGGCCTCCTTCGTGGTCGTGAATTTTATTAAGATGGATC AAGTCACGTACCGTCCACGTGTGGCAGGGCTTTGGGGAATGTGAGGTGATGACTGCGTCCTCATGCCCTGACAGACAGGA GGTGACTGTGTCTGTCCTGTCCCTAGGACACGGACAGGCCCGAAGCTCTAGTCCCCATCGTGGTCCAGTTTGGCCTCTGA ATAAAAACGTCTTCAAAACCTGTTGCCCCAAAAACTAAGAACAGAGAGAGTTTCCCATCCCATGTGCTCACAGGGGCGTA TCTGCTTGCGTTGACTCGCTGGGCTGGCCGGACTCCTAGAGTTGGTGCGTGTGCTTCTGTGCAAAAAGTGCAGTCCTCTT GCCCATCACTGTGATATCTGCACCAGCAAGGAAAGCCTCTTTTCTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAACGTCA CTGTTGTCTGCCTGGGCTTGAGTGCAGTGGCGCGATCTCAACTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCCAGCATTTCTC CTGCCTCAGCCTCCCGAGCAGCTGAGATTACAGGCACCCACCCCCTGCGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGAG GGGTTTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAGTGCTG GGATTACAGGTGTGAGCCATCACGCCCAGCCGGAAAGCCTCTTTTTAAGGTGACCACCTATAGCGCTTCCCGAAAATAAC AGGTCTTGTTTTTGCAGTAGGCTGCAAGCGTCTCTTAGCAACAGGAGTGGCGTCCTGTGGGCTCTGGGGATGGCTGAGGG TCGCGTGGCAGCCATGCCTTCTGTGTGCACCTTTAGGTTCCACGGGGCTATTCTGCTCTCACTGTTTGTCTGAAAACGCA CCCTTGGCATCCTTGTTTGGAGAGTTTCTGCTTCTCGTTGGTCATGCTGAAACTAGGGGCAAGGTTGTATCCGTTGGCGC GCAGCGGCTACATGTAGGGTCATGAGTCTTTCACCGTGGACAAATTCCTTGAAAAAAAAAAAAGGAGTCCGGTT.?-AGCAT TCATTCCGGGTCAAGTGTCTGGTTCTGTGAATAAACTCTAAGATTTAAGAAACCTTAATGAAAGAAAACCTTGATGATTC AGAGCAAGGATGTGGTCACACCTGTGGCTGGATCTGTTTCAGCCGCCCCAGTGCATGGTGAGAGTGGGGAGCAGGGATTG TTTGTTCAGAGGTCTCATCTGGTATGTTTCTGAGGTGTTTGCCGGCTGAATGGTAGACGTGTCGTTTGTGTGTATGAGGT TCTGTGTCTGTGTGTGGCTCGGTTTGAGTGTACGCATGTCCAGCACATGCCCTGCCCGTCTCTCACCTGTGTCTTCCCGC CCCAG
Intron 9 (SEQ ID NO 13)
GTGAGGCCTCCTCTTCCCCAGGGGGGCTTGGGTGGGGGTTGATTTGCTTTTGATGCATTCAGTGTTAATATTCCTGGTGC
TCTGGAGACCATGACTGCTCTGTCTTGAGGAACCAGACAAGGTTGCAGCCCCTTCTTGGTATGAAGCCGCACGGGAGGGG
TTGCACAGCCTGAGGACTGCGGGCTCCACGCAGGCTCTGTCCAGCGGCCATGTCCAGAGGCCTCAGGGCTCAGCAGGCGG GAGGGCCGCTGCCCTGCATGATGAGCATGTGAATTCAACACCGAGGAAGCACACCAGCTTCTGTCACGTCACCCAGGTTC CGTTAGGGTCCTTGGGGAGATGGGGCTGGTGCAGCCTGAGGCCCCACATCTCCCAGCAGGCCCTCGACAGGTGGCCTGGA CTGGGCGCCTCTTCAGCCCATTGCCCATCCCACTTGCATGGGGTCTACACCCAAGGACGCACACACCTAAATATCGTGCC AACCTAATGTGGTTCAACTCAGCTGGCTTTTATTGACAGCAGTTACTTTTTTTTTTTTAATACTTTAAGTTCTAGGGTAC ATGTGCACGACGTGCAGGTTAGTTACATATGTATACATGTGCCATGTTGGTGTGCTGCACCCATTAACTCATCATTTACA TTAGGTATATCTCCTAATGCTATCCCTCCCCACTCCCCCCATCCCATGACAGGCCCTGGTGTGTGATGTTCCCCACCCTG TGTCCAAGTGTTCTCATTGTTCAGTTCCCACCTGTGAGTGAGAACATGTGGTGTTTGGTTTTCTTTCCTTGCAATAGTTT GCTCAGAGTGATGGTTTCCÄGCTTCGTCCATGTCCCTACAAAGGACATGAACTCATCCTTTTTTATGACTGCATAGTATT CCGTGGTGTATATGTGCCACATTTTCTTAATCCAGTCTATCATCGATGGACATTTGGGTTGGTTGCAAGTCTTTGCTACT GTGAATAGTGCCGCAATAAACATACGTGTGCATGTGTCTTTATAGCAGCATGATTTATAATCCTTTGGGTATATACCCAG TAATGGGATGGCTGGGTCAAATGGTATTTCTAGTTCTAGATCCTTGAGGAATCACCACACTGTCTTCCACiUVTGGTTG.?iA CTAGTTTACACTCCCACCAACAGTGTAAAAGTGTTCTGGTGCTGGAGAGGATGTGGACAGCAGTTATTTTTTTATGAAAA TAGTATCACTG.AAC.AAGCAGACAGTTAGTGAAGGATGCGTCAGGAAGCCTGCAGGCCACACAGCCATTTCTCTCGAAGAC TCCGGGTTTTTCCTGTGCATCTTTTGAAACTCTAGCTCCAATTATAGCATGTACAGTGGATCAAGGTTCTTCTTCATTAA GGTTCAAGTTCTAGATTGAAATAAGTTTATGT.?^ACAGAAACAAAAATTTCTTGTACACACAACTTGCTCTGGGATTTGGA GGAAAGTGTCCTCGAGCTGGCGGCACACTGGTCAGCCCTCTGGGACAGGATACCTCTGGCCCATGGTCATGGGGCGCTGG GCTTGGGCCTGAGGGTCACACAGTGCACCATGCCCAGCTTCCTGTGGATAGGATCTGGGTCTCGGATCATGCTGAGGACC ACAGCTGCCATGCTGGTAAAGGGCACCACGTGGCTCAGAGGGGGCGAGGTTCCCAGCCCCAGCTTTCTTACCGTCTTCAG TTATTTTTCCCTAAGAGTCTGAGAAGTGGGGCCGCGCCTGATGGCCTTCGTTCGTCTTCAGCTGGCACAGAATTGCACAA GCTGATGGTAAACACTGAGTACTTATAATGAATGAGGAATTGCTGTAGCAGTTAACTGTAGAGAGCTCGTCTGTTGGAAA GAAATTTAAGTTTTTCATTTAACCGCTTTGGAGAATGTTACTTTATTTATGGCTGTGTAAATTGTTTGACATTCAGTCCC TCGTAGACAGATACTACGTAAAAAGTGTAAAGTTAACCTTGCTGTGTATTTTCCCTTATTTTAG
Intron 10 (SEQ ID NO 14)
GTGAGGCCCGTGCCGTGTGTCTGTGGGGACCTCCACAGCCTGTGGGCTTTGCAGTTGAGCCCCCCGTGTCCTGCCCCTGG CACCGCAGCGTTGTCTCTGCCAAGTCCTCTCTCTCTGCCGGTGCTGGATCCGCAAGAGCAGAGGCGCTTGGCCGTGCACC CAGGCCTGGGGGCGCAGGGGCACCTTCGGGAGGGAGTGGGTACCGTGCAGGCCCTGGTCCTGCAGAGACGCACCCAGGTT ACACACGTGGTGAGTGCAGGCGGTGACCTGGCTCCTGCTGCTCTTTGGAAAGTCAAGAGTGGCGGCTCCTGGGGCCCCAG TGAGACCCCCAGGAGCTGTGCACAGGGCCTGCAGGGCCGAGGCGGCAGCCTCCTCCCCAGGGTGCACCTGAGCCTGCGGA GAGCAGGAGCTGCTGAGTGAGCTGGCCCACAGCGTTCGCTGCGGTCACGTTCCTGCGTGGGGTTGTTTGGGATCGGTGGG AGAATTTGGATTTGCTGAGTGCTGCTGTCTTGAACCACGGAGATGGCTAGGAGTGGGTTTCAGAGTTGATTTTTGTGAAT CAAACTAAAATCAGGCACAGGGGACCTGGCCTCAGCACAGGGGATTGTCCAATGTGGTCCCCCTCAAGGGCGCCCCACAG AGCCGGTGGGCTTGTTTTAAAGTGCGATTTGACGAGGGACGAGAAACCTTGAAAGCTGT.AAAGGG.AACCCTCAGAAAATG TGGCCGCCAGGGGTGGTτTCAGGTGCTTTGCTGGGCTGTGTTTGTGAAAACCCATTTGGACCCGCCCTCCAAGTCCACCC TCCAGGTCCACCCTCCAGGGCCGCCCTGGGCTGGGGGTATGCCTGGCGTTCCTTGTGCCGCAGCCCGGAGCACAGCAGGC TGTGCACATTTAAATCCACTAAGATTCACTCGGGGGGAGCCCAGGTCCCAAGCAACTGAGGGCTCAGGAGTCCTGAGGCT GCTGAGGGGACAGAGCAGACGGGGAACGCTGCTTCTGTGTGGCAAGTTCCTGAGGGTGCTGGCCAGGGAGGTGGCTCAGA GTGTATGTTGGGGTCCCACCGGGGGCAGAACTCTGTCTCTGATGAGTCGGCAGCCATGTAACAGGAAGGGGTGGCCACAG GGAGCTGGGAATGCACCAGGGGAGCTGCGCAGCTGGCCGAGGTCCCAGGGCCAGGCCACAGGAAGGGCAGGGGGACGCCC GGGGCCACAGCAGAGGCCGCAGGAAGGGAAGGGGATGCCCAGGCCAGAGCAGAGGCTACCGGGCACAGGGGGGCTCCCTG AGCTGGGTGAGCGAGGCTCATGACTCGGCGAGGGAACCTCCTTGACGTGAAGCTGACGACTGGTGTTGCCCAGCTCACAG CCCAGCCAGGTCCCGCGCCTGAGCAGGAACTCAG.AACCCTCCCCTTTGTCT.AAAGCACAGCAGATGCCTTCAGGGCATCT AGGAGAAAACAGGGA.AAGTCGTTGAGAAACGTCTTAAAAGAAGGTGGGATGGTGGCAATTTCTTGTCCAGATTTTAGTCT GCCCCGGACCACAGATGAGTCTATAACGGGATTGTGGTGTTGCCATGGGGACACATGAGATGGACCATCACAGAGGCCAC TGGGGCTGCACCTCCCATCTGAGTCCTGGCTGTCCCGGGTCCAGGCCAGGTTCTTGCATGCTCACCTACCTGTCCTGCCC GGGAGACAGGGAAAGCACCCCG.?^AGTCTGGAGCAGGGCTGGGTCCAGGCTCCTCAGAGCTCCTGCCAGGCCCAGCACCCT
GCTCCAAATCACCACTTCTCTGGGGTTTTCC.AAAGCATTTAACAAGGGTGTCAGGTTACCTCCTGGGTGACGGCCCCGCA TCCTGGGGCTGACATTGCCCCTCTGCCTTAG
Intron 11 ( SEQ ID NO 15 ) GTGAGCGCACCTGGCCGGAAGTGGAGCCTGTGCCCGGCTGGGGCAGGTGCTGCTGCAGGGCCGTTGCGTCCACCTCTGCT TCCGTGTGGGGCAGGCGACTGCCAATCCCAAAGGGTCAGAGGCCACAGGGTGCCCCTCGTCCCATCTGGGGCTGAGCAGA AATGCATCTTTCTGTGGGAGTGAGGGTGCTCACAACGGGAGCAGTTTTCTGTGCTATTTTGGTAAAAGGAAATGGTGCAC CAGACCTGGGTGCACTGAGGTGTCTTCAGAAAGCAGTCTGGATCCGAACCCAAGACGCCCGGGCCCTGCTGGGCGTGAGT CTCTCAAACCCGAACACAGGGGCCCTGCTGGGCATGAGTCCCTCTGAACCCGAGACCCTGGGGCCCTGCTGGGCGTGAGT CTCTCCGAACCCAGAGACTTCAGGGCCCTTTTGGGCGTGAGTCTCTCCGCTGTGAGCCCCACACTCCAAGGCTCATCCAC AGTCTACAGGATGCCATGAGTTCATGATCACGTGTGACCCATCAGGGGACAGGGCCATGGTGTGGGGGGGGTCTCTACAA AATTCTGGGGTCTTGTTTCCCCAGAGCCCGAGAGCTCAAGGCCCCGTCTCAGGCTCAGACACAAATGAATTGAAGATGGA CACAGATGCAGAAATCTGTGCTGTTTCTTTTATGAATAAAAAGTATCAACATTCCAGGCAGGGCAAGGTGGCTCACACCT ATAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGCCAGGAGTTTGAGGCCAACCTAACCAACATAGTG AAATTCCATTTCTACTTAAAAAATACAAAAATTAGCCTGGCCTGGTGGCACACGCCTGTAGTCCCCGCTATGCGGGAGGC TGAGGCAGGAGAATCATTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCACTCCAGCCTGGGCA ACAGAGTGAGACTTCATCTTAAAAAAAAAAAAAAAAGTATCAGCATTCC.AAAACCATAGTGGACAGGTGTTTTTTTATTC TGTCCTTCGATAATATTTACTGGTGCTGTGCTAGAGGCCGGAACTGGGGGTGCCTTCCTCTGAAAGGCACACCTTCATGG GAAGAGAAATAAGTGGTGAATGGTTGTTAAACCAGAGGTTTAAACTGGGGTCCTGTCGTTCTGAGTTAACAGTCCAGATC TGGACTTTGCCTCTTTCCAGAATGCTCCCTGGGGTTTGCTTCATGGGGGAGCAGCAGGTGTGGACACCCTCGTGATGGGG GAGCAGCAGGTGCAGACGCCCTCATGATGGGGGAGTGGCAGGTGCAGACACCCTTGTGCATGGTGCCCAGCATGTCCCTG TTGCAGCTCCCTCCCCACAAGGATGCCGGTCTCCTGTGCTCCCCACAGTCCCTGCTTCCCTCTCACAGCCTTACCTGGTC CTGGCCTCCACTGGCTTTGTCTGCATGATTTCCACATTTCCTGGGCTCCCAGCACCTCTTCGCCTCTCCCAGGCACCTCT GCAGTGCTGGCCATACCAGTCAGCTGTGAACTGTCCACTGCTTATTTTGCTCCCCATGAAATGTATTTTTTAGGACAGGC ACCCCTGGTTCCAGCCTCTGGCACAGCATCAGTGAATGTTATTGAAGGACAAAGGACAGACAAACAAATCAGGAAAATGG GTTCTCTCT.AAACACATTGCAAAGCCACAGAGGCTAGTGCAGGATGGGTGGGCATCAGGTCATCAGATGTGGGTCCAATG CCAGAATATTCTGTGCTCCCAAAGGCCACTTGGTCAGAGTGTGTGCTTGCAGAGGTGGCTCTAAAAGCTCAGCAGTGGAG GCAGTGGTTCGCCATACTCAGGGTGAACTCACATCCTCTGTGTCTGAAGTATACAGCAGAGGCTTGAAGGGCATCTGGGA GAAGAAAACAGGCAi^AATGATTAAGAAAAGTGAAAAAGGAAAAGTGGTAAGATGGGAATTTTCTTGTCCAGATTTTAGTC TCCCAAACCACAGCTCAGATGGTAGAATGTGGTCAGAACTGATGGACAGAACAATAGAACAAAACGGAAGCCCTATCTCT CAGAAACGTGTGTTAATGTGGTATGTGGCACAGCTGATGGAAAAGAGAGTGTGTGTGTAATTTTTTTTTCTGAGAAAACT GACTGGAAGCAAATAAGTTGTGTCTTTACAGCATATACCAGAGCAGATTCTAGGTAGAAGAGGAGACACATGCAAACAAC ACCAGCAACAGAAATAAAACAAAAGACTC-z-AAGGGAAGGGAGGTGAACGTTCCCTGGTTTGGTGTTGGGGAAGGACACAC AGGGAGGCGGATGAAACCAGTGAGGCAACGGGCATTGCTTTCACTGCAGAGAAACTCAGCTTGCCTGAGCCACAGTGAAA ATGGCCATTCCCTGGAGCGTTTGTGCACGTGATTTATTTAAGGCGCCCTGTGAGGTCCTGCACATTCATCCTCTCACTTT GTTCTCCTAACCACCTGAGAGGTAGAGGAGGAAAGGCTCCAGGGGAGCAGCCGCCCTTGGTCACCCAGCTGGCAAAGGGC ATGCATGATTGCAGCCTGGCCTCCTGCTCCGGGGCCCTTGCTCTGCCCGAGGACCCCACACAAGTCAGACCCATAGGCTC AGGGTGAGCCGGAGCCCAAGGTCGTGTTGGGGATGGCTGTGAAAGAAGAAATGGACGTCTGATGCACACTTGGG.?y.GGTC CTACCAGCAGCGTCAAAGAAATGCATGTGAAACTGACAGCGAGACCCATCCCTCAAAGAAACGCACGTGAAACTGATGGC GAGACCTGTCCCCATCCCTCATGCTGGCTCCTTTTCTGGGCTTGCCAAGAGCCAGCATCAGGTTGAGGCAAGCTGGAAAG ACTTTTCTGGAAAGCAGCTTGTTTGCATGGAAGTCCTCACAATGTCCTGTGTCTTCCCAGTAATTCCACTTCTGAAGTGA CCAGACATTATCACGGGTCTTATTTACCATTTCCAGTGTTCCAGGCAGGGGGACTTGCCACAGCAAGTCACGAACCTGCC CAAATACAGGGCTAAGGAGATATTATGCATCACAAAACTTGCTCTGCCATTAAACATTTTTC.A.AAGAATTTTTGAAGAAT GTTTJU.TGGCACAAAACGTTTATTTCAATGTAGCAGTGTTCAAAGCTGGATGTAAAAGAACACACCCCAGGAGCCTGCCG TGAATGTCATGTGTGTTCATCTTTGGACATGGACATACATGGGCAGTGAGTGGTGGTGAGGCCCTGGAGGACATCGGTGG GATGCCTCCATCCTGCCCCTCTGGAGACACCATGTGTGCCACGTGCACTCACTGGAGCCCTGTTTAGCTGGTGCCACCTG GCTCTTCCATCCCTGAGATTCAAACACAGTGAGATTCCCCACGCCCAACTCAGTGTTCTCCCACAAAAAACCTGAGTCAC ACCTGTGTTCACTCGAGGGACGCCCGGGAGCCAGGGCTCCACAGTTTATTATGTGTTTTTGGCTGAGTTATGTGCAGATC TCATCAGGGCAGATGATGAGTGCACAAACACGGCCGTGCGAGGTTTGGATACACTCAACATCACTAGCCAGGTCCTGGTG GAGTTTGGTCATGCAGAGTCTGGATGGCATGTAGCATTTGGAGTCCATGGAGTGAGCACCCAGCCCCCTCGGGCTGCAGC GCATGCCCCAGGCAGGACAAGGAAGCGGGAGGAAGGCAGGAGGCTCTTTGGAGCAAGCTTTGCAGGAGGGGGCTGGGTGT GGGGCAGGCACCTGTGTCTGACATTCCCCCCTGTGTCTCAG
Intron 12 (SEQ ID NO 16) GTGAGCAGGCTGATGGTCAGCACAGAGTTCAGAGTTCAGGAGGTGTGTGCGCAAGTATGTGTGTGTGTGTGTGCGCGCGT GCCTGCAAGGCTGATGGTGACTGGCTGCACGTAAGAGTGCACATGTACGCATATACACGTGAGCACATACATGTGTGCAT GTGTGTACATGAAGGCATGGCAGTGTGTGCACAGGTGTGCAAGGGCACAAGTGTGTGCACATGCGAATGCACACCTGACA TGCATGTGTGTTCGTGCACAGTCGTGTGGGCATTCACGTGAGGTGCATGCGTGTGGGTGTGCAGTGTGAGTAGCATGTGT GCACATAACATGTATTGAGGGGTCCTCGTGTTCACCCCGCTAGGTCCTCAGCACCAGTGCCACTCCTTACAGGATGAGAC GGGGTCCCAGGCCTTGGTGGGCTGAGGCTCTGAAGCTGCAGCCCTGAGGGCATTGTCCCATCTGGGCATCCGCGTCCACT CCCTCTCCTGTGGGCTTCTGTGTCCACTCCCCCTCTCCTGTGGGCATTTACATCCACTCCACTCCCTCTCTCCTGTGGGC ATCCGCGTCCACTCCCCCTCTCTGTGGGCATCTGCGTCCACCTCCCCTCTCTGTGGGCATTTGCGTCCACTCCCTCTCCT GGTTCCTTCCTGTCTTGGCCGAGCCTCGGGGGCAGGCAGATGACACAGAGTCTTGACTCGCCCAGGGTGGTTCGCAGCTG CCGGGTGAGGGCCAGGCCGGATTTCACTGGGAAGAGGGATAGTTTCTTGTCAAAATGTTCCTCTTTCTTGTTCCATCTGA ATGGATGATAAAGCAAAAAGTAAAAACTTAAAATCCCAGAGAGGTTTCTACCGTTTCTCACTCTTTCTTGGCGACTCTAG
Intron 13 (SEQ ID NO 17)
GTGAGCCGCCACCAAGGGGTGCAGGCCCAGCCTCCAGGGACCCTCCGCGCTCTGCTCACCTCTGACCCGGGGCTTCACCT TGGAACTCCTGGGTTTTAGGGGCAAGGAATGTCTTACGTTTTCAGTGGTGCTGCTGCCTGTGCACAGTTCTGTTCGCGTG GCTCTGTGCAAAGCACCTGTTCTCCATCTCTGGGTAGTGGTAGGAGCCGGTGTGGCCCCAGGTGTCCCCACTGTGCCTGT GCACTGGCCGTGGGACGTCATGGAGGCCATCCCAGGGCAGCAGGGGCATGGGGTAAAGAGATGTTTATGGGGAGTCTTAG CAGAGGAGGCTGGGAAGGTGTCTGAACAGTAGATGGGAGATCAGATGCCCGGAGGATTTGGGGTCTCAGCAAAGAGGGCC GAGGTGGGTGCAGGTGAGGGTCGCTGGCCCCACCCCCGGGAAGGTGCAGCAGAGCTGTGGCTCCCCACACAGCCCGGCCA GCACCTGTGCTCTGGGCATGGCTGTGCTCCTGGAACGTTCCCTGTCCTGGCTGGTCAGGGGGTGCCCCTGCCAAGAATCG ACAACTTTATCACAGAGGGAAGGGCCAATCTGTGGAGGCCACAGGGCCAGCTTCTGCCTGGAGTCAGGGCAGGTGGTGGC ACAAGCCTCGGGGCTGTACCAAAGGGCAGTCGGGCACCACAGGCCCGGGCCTCCACCTCAACAGGCCTCCCGAGCCACTG GGAGCTGAATGCCAGGAGGCCGAAGCCCTCGCCCCATGAGGGCTGAGAAGGAGTGTGAGCATTTGTGTTACCCAGGGCCG AGGCTGCGCGAATTACCGTGCACACTTGATGTGAAATGAGGTCGTCGTCTATCGTGGAAACCCAGCAAGGGCTCACGGGA GAGTTTTCCATTACAAGGTCGTACCATGAAAATGGTTTTTAACCCGAGTGCTTGCGCCTTCATGCTCTGGCAGGGAGGGC AGAGCCACAGCTGCATGTTACCGCCTTTGCACCAGCTCCAGAGGCTTGGGACCAGGCTGTCTCAGTTCCAGGGTGCGTCC GGCTCAGACCGCCCTCCTCTCTGCCTTCTCTCTCTGCCTCAAATCTTCCCTCGTTTGCATCTCCCTGACGCGTGCCTGGG CCCTCGTGCAAGCTGCTTGACTCCTTTCCGGAAACCCTTGGGGTGTGCTGGATACAGGTGCCACTGAGGACTGGAGGTGT CTGACACTGTGGTTGACCCCAGGGTCCAGCTGGCGTGCTTGGGGCCTCCTTGGGCCATGATGAGGTCAGAGGAGTTTTCC CAGGTGAAAACTCCTGGGAAACTCCCAGGGCCATGTGACCTGCCACCTGCTCCTCCCATATTCAGCTCAGTCTTGTCCTC ATTTCCCCACCAGGGTCTCTAGCTCCGAGGAGCTCCCGTAGAGGGCCTGGGCTCAGGGCAGGGCGGCTGAGTTTCCCCAC CCATGTGGGGACCCTTGGGTAGTCGCTTGATTGGGTAGCCCTGAGGAGGCCGAGATGCGATGGGCCACGGGCCGTTTCCA AACACAGAGTCAGGCACGTGGAAGGCCCAGGAATCCCCTTCCCTCGAGGCAGGAGTGGGAGAACGGAGAGCTGGGCCCCG ATTTCACGGCAGCCAGGCTGCAGTGGGCGAGGCTGTGGTGGTCCACGTGGCGCTGGGGGCGGGGTCTGATTCAAATCCGC TGGGGCTCGGCCTTCCTGGCCCGTGCTGGCCGCGCCTCCACACGGGCTTGGGGTGGACGCCCCGACCTCTAGCAGGTGGC TATTTCTCCCTTTGGAAGAGAGCCCCTCACCCATGCTAGGTGTTTCCCTCCTGGGTCAGGAGCGTGGCCGTGTGGCAACC CCGGGACCTTAGGCTTATTTATTTGTTTAAAAACATTCTGGGCCTGGCTTCCGTTGTTGCTAAATGGGGAAAAGACATCC CACCTCAGCAGAGTTACTGAGAGGCTGAAACCGGGGTGCTGGCTTGACTGGTGTGATCTCAGGTCATTCCAGAAGTGGCT CAGGAAGTCAGTGAGACCAGGTACATGGGGGGCTCAGGCAGTGGGTGAGATGAGGTACACGGGGGGCTCAGGCAGTGGGT
GAGGCCAGGTACATGGGGGGCTCAGGCACTGGGTGAGATGAGGTACACGGGGGGCTCAGGCAGAGGGTCAGACCAGGTAC ACGGGGGCTCTGATCACACGCACATATGAGCACATGTGCACATGTGCTGTTTCATGGTAGCCAGGTCTGTGCACACCTGC
CCCAAAGTCCCAGGAAGCTGAGAGGCCAAAGATGGAGGCTGACAGGGCTGGCGCGGTGGCTCACACCTGTAGTCCCAGCA
CTTTGGGAGGCCGAGGCGAGAGGATCCCTTGAGCCCAGGAGTTTAAGACCAGCCTGAGCAACATAGTAGAACCCCATCTC
TATGAAAAATAAAAACAAAAATTAGCTGAACATGGTGGTGTGCGCCTGTAGTTCCAATACTTGGGAGGCTGAAGTGGGAG
GATCACTTGAGCCCAGGAGGTGGAAGCTGCAGTGAGCTGAGATTGCACCACTGTACTGCAGCCTGGGTGACAGAGTGAGA GCCCATCTCAACAACAACAAAGAAGACTGACA.AATGCAGTTTCTTGGAAAGAAACATTTAGTAGGAACTTAACCTACACA
CAGAAGCCAAGTCGGTGTCTCGGTGTCAGTGAGATGAGATGATGGGTCCTCACACCATCACCCCAGACCCAGGGTTTATG
CACCACAGGGGCGGGTGGCTCAGAAGGGATGCGCAGGACGTTGATATACGATGACATCAAGGTTGTCTGACGAAGGGCAG
GATTCATGATAAGTACCTGCTGGTACACAAGGAACAATGGATAAACTGGAAACCTTAGAGGCCTTCCCGGAACAGGGGCT
AATCAGAAGCCAGCATGGGGGGCTGGCATCCAGGATGGAGCTGCTTCAGCCTCCACATGCGTGTTCATACAGATGGTGCA CAGAAACGCAGTGTACCTGTGCACACACAGACACGCAGCTACTCGCACACACAAGCACACACACAGACATGCATGCATGC
ATCCGTGTGTGTGCACCTGTGCCCATGAGGAAACCCATGCATGTGCATTCATGCACGCACACAGGCACCGGTGGGCCCAT
GCCCACACCCACGAGCACCGTCTGATTAGGAGGCCTTTCCTCTGACGCTGTCCGCCATCCTCTCAG
Intron 14 (SEQ ID NO 18) GTATGTGCAGGTGCCTGGCCTCAGTGGCAGCAGTGCCTGCCTGCTGGTGTTAGTGTGTCAGGAGACTGAGTGAATCTGGG CTTAGGAAGTTCTTACCCCTTTTCGCATCAGGAAGTGGTTTAACCCAACCACTGTCAGGCTCGTCTGCCCGCCCTCTCGT GGGGTGAGCAGAGCACCTGATGGAAGGGACAGGAGCTGTCTGGGAGCTGCCATCCTTCCCACCTTGCTCTGCCTGGGGAA GCGCTGGGGGGCCTGGTCTCTCCTGTTTGCCCCATGGTGGGATTTGGGGGGCCTGGCCTCTCCTGTTTGCCCTGTGGTGG GATTGGGCTGTCTCCCGTCCATGGCACTTAGGGCCCTTGTGCAAACCCAGGCCAAGGGCTTAGGAGGAGGCCAGGCCCAG GCTACCCCACCCCTCTCAGGAGCAGAGGCCGCGTATCACCACGACAGAGCCCCGCGCCGTCCTCTGCTTCCCAGTCACCG TCCTCTGCCCCTGGACACTTTGTCCAGCATCAGGGAGGTTTCTGATCCGTCTGAAATTCAAGCCATGTCGAACCTGCGGT CCTGAGCTTAACAGCTTCTACTTTCTGTTCTTTCTGTGTTGTGGAAATTTCACCTGGAGAAGCCGAAGAAAACATTTCTG TCGTGACTCCTGCGGTGCTTGGGTCGGGACAGCCAGAGATGGAGCCACCCCGCAGACCGTCGGGTGTGGGCAGCTTTCCG GTGTCTCCTGGGAGGGGAGCTGGGCTGGGCCTGTGACTCCTCAGCCTCTGTTTTCCCCCAG
Intron 15 (WEQ ID NO 19)
GCAAGTGTGGGTGGAGGCCAGTGCGGGCCCCACCTGCCCAGGGGTCATCCTTGAACGCCCTGTGTGGGGCGAGCAGCCTC AGATGCTGCTGAAGTGCAGACGCCCCCGGGCCTGACCCTGGGGGCCTGGAGCCACGCTGGCAGCCCTATGTGATTAAACG CTGGTGTCCCCAGGCCACGGAGCCTGGCAGGGTCCCCAACTTCTTGAACCCCTGCTTCCCATCTCAGGGGCGATGGCTCC CCACGCTTGGGAGCCTTCTGACCCCTGACCTGTGTCCTCTCACAGCCTCTTCCCTGGCTGCTGCCCTGAGCTCCTGGGGT CCTGAGCAAGTTCTCTCCCCGCCCCGCCGCTCCAGCGTCACTGGGCTGCCTGTCTGCTCGCCCCGGTGGAGGGGTGTCTG TCCCTTCACTGAGGTTCCCACCAGCCAGGGCCACGAGGTGCAGGCCCTGCCTGCCCGGCCACCCACACGTCCTAGGAGGG TTGGAGGATGCCACCTCTGGCCTCTTCTGGAACGGAGTCTGATTTTGGCCCCGCAG
3 λ-untranskribierter Bereich (SEQ ID NO 20)
ATCTCATGTTTGAATCCTAATGTGCACTGCATAGACACCACTGTATGCAATTACAGAAGCCTGTGAGTGAZ.CGGGGTGGT GGTCAGTGCGGGCCCATGGCCTGGCTGTGCATTTACGGAAGTCTATGAGTGAATGGGGTTGTGGTCAGTGCGGGCCCATG GCCTGGCTGGGCCTGGGAGGTTTCTGATGCTGTGAGGCAGGAGGGGAAGGAGGGTAGGGGATAGACAGTGGGAGCCCCCA CCCTGGAAGACATAACAGTAAGTCCAGGCCCGAAGGGCAGCAGGGATGCTGGGGGCCCAGCTTGGGCGGCGGGGATGATG GAGGGCCTGGCCAGGGTGGCAGGGATGATGGGGGCCCCAGCTGGGGTGGCAGGGGTGATGGGGGGGGCTGGTCTGGGTGG CGGGG.AAGATGGGGAAGCCTGGCTGGGCCCCCTCCTCCCCTGCCTCCCACCTGCAGCCGTGGATCCGGATGTGCTTCCCT GGTGCACATCCTCTGGGCCATCAGCTTTCATGGAGGTGGGGGGCAGGGGCATGACACCATCCTGTATAAAATCCAGGATT CCTCCTCCTGAACGCCCCAACTCAGGTTGAAAGTCACATTCCGCCTCTGGCCATTCTCTTAAGAGTAGACCAGGATTCTG ATCTCTGAAGGGTGGGTAGGGTGGGGCAGTGGAGGGTGTGGACACAGGAGGCTTCAGGGTGGGGCTGGTGATGCTCTCTC ATCCTCTTATCATCTCCCAGTCTCATCTCTCATCCTCTTATCATCTCCCAGTCTCATCTGTCTTCCTCTTATCTCCCAGT CTCATCTGTCATCCTCTTACCATCTCCCAGTCTCATCTCTTATCCTCTTATCTCCTAGTCTCATCCAGACTTACCTCCCA GGGCGGGTGCCAGGCTCGCAGTGGAGCTGGACATACGTCCTTCCTCAGGCAGAAGGAACTGGAAGGATTGCAGAGAACAG GAGGGGCGGCTCAGAGGGACGCAGTCTTGGGGTGAAGAAACAGCCCCTCCTCAGAAGTTGGCTTGGGCCACACGAAACCG AGGGCCCTGCGTGAGTGGCTCCAGAGCCTTCCAGCAGGTCCCTGGTGGGGCCTTATGGTATGGCCGGGTCCTACTGAGTG CACCTTGGACAGGGCTTCTGGTTTGAGTGCAGCCCGGACGTGCCTGGTGTCGGGGTGGGGGCTTATGGCCACTGGATATG GCGTCATTTATTGCTGCTGCTTCAGAGAATGTCTGAGTGACCGAGCCTAATGTGTATGGTGGGCCCAAGTCCACAGACTG TGTCGTAAATGCACTCTGGTGCCTGGAGCCCCCGTATAGGAGCTGTGAGGAAGGAGGGGCTCTTGGCAGCCGGCCTGGGG GCGCCTTTGCCCTGCAAACTGGAAGGGAGCGGCCCCGGGCGCCGTGGGCGGACGACCTCAAGTGAGAGGTTGGACAGAAC AGGGCGGGGACTTCCCAGGAGCAGAGGCCGCTGCTCAGGCACACCTGGGTTTGAATCACAGACCAACaGGTCAGGCCATT GTTCAGCTATCCATCTTCTACAAAGCTCCAGATTCCTGTTTCTCCGGGTGTTTTTTGTTGAAATTTTACTCAGGATTACT TATATTTTTTGCTAAAGTATTAGACCCTTAAAAAAGGTATTTGCTTTGATATGGCTTAACTCACTAAGCACCTACTTTAT TTGTCTGTTTTTATTTATTATTATTATTATTATTAGAGATGGTGTCTACTCTGTCACCCAGGTTGTTAGTGCAGTGGCAC AGTCATGGCTCGCTGTAGCCGCAAACCCCCAGGCTCAAGTGATCCTCCGGCCTCAGCTTCCCAGAGTGCTGGGATTACAG GTGTGAGCCACTGCCCTTGCCTGGCACTTTTAAAAACCACTATGTAAGGTCAGGTCCAGTGGCTTCCACACCTGTCATCC CAGTAGTTTGGGAAGCCGAGGCAGAAGGATTGTCTGAGGCCAGGAGTTTGAGACCAGCATGGGTAACATAGGGAGACCCC ATCTCTACAAAAAATGCAAAAAGTTATCCGGGCGTGGGGTCCAGCATCTGTAGTCCCAGCTGCTCGGGAGGCTGAGTGGG AGGATCGCTTGAGCCCGGGAGGTCATGGCTGCAGTGAGCTGTGATTGTACCATCGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGA GACCCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGGAGAAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAAGAAGGAAAGAGAAGAAGAAG GAAGAAGGAAGAAAGAAGGAGAAGGAGGCCTGCTAGGTGCTAGGTAGACTGTCAAATCTCAGAGCAAAATGAAAATAACA AAGTTTTAAAGGGAAAGAAAAACCCCAGCTCTTTGGACTTCCTTAGGCCTGAACTTCATCTCAAGCAGCTTCCTTCCACA GACAAGCGTGTATGGAGCGAGTGAGTTCAAAGCAGAAAGGGAGGAGAAGCAGGCAAGGGTGGAGGCTGTGGGTGACACCA GCCAGGACCCCTGAAAGGGAGTGGTTGTTTTCCTGCCTCAGCCCCACGCTCCTGCCGGTCCTGCACCTGCTGTAACCGTC GATGTTGGTGCCAGGTGCCCACCTGGGAAGGATGCTGTGCAGGGGGCTTGCCAAACTTTGGTGGGTTTCAGAAGCCCCAG GCACTTGTGGCAGGCACAATTACAGCCCCTCCCCAAAGATGCCCACGTCCTTCTCCTGGAACCTGTGAATGTGTCACCCG CAAGGCAGAGGCTGGTGAAGGCTGCAGGTGGAATCACGGCTGCCAGTCAGCCGATCTTAAGGTCATCCTGGATTATCTGG TGGGCCTGATATGGCCACAAGGGTCCCTAGAAGTGAGAGAGGGAGGCAGGGGAGAGTCAGAGAGGGGACGTGAGAAGGAC CACTGGCCACTGCTGGCTTTGAGATGGAGGAGGGGGTCCCCAGCCAAGGAATGGGGGCAGCCGCTCCATGCTGGAAAAGC AAGCAATCCTCCCCGGTCCTGAGGGCACACGGCCCTGCCCACGCCTCGATTTCAGGCCAGTGGGACCTGTTTCAGCTTTC CGGCCTCCAGAGCTGT.?-AGATGATGCGTTTGTGTTCAGCCACTAAGCTGCAGTGATTCGTCACAGCAGCAAATGGAATAG CAGTACAGGGAAATGAATACAGGGACAGTTCTCAGAGTGACTCTCAGCCCACCCCTGGG
Die Charakterisierung der Exons zeigte interessanterweise, daß die in unserer Patentanmeldung PCT/EP/98/03469 beschriebenen, funktioneil wichtigen hTC- Protein-Domänen auf separaten Exons angeordnet sind. Das Telomerase- charakteristische T-Motiv befindet sich auf Exon 3. Die für die katalytische Funktion der Telomerase wichtigen RT (Reverse-Transkriptase)-Motive 1-7 liegen auf folgenden Exons: RT Motiv 1 und 2 auf Exon 4, RT Motiv 4 auf Exon 9, RT Motiv 5 auf Exon 10, RT Motiv 6 und 7 auf Exon 11. RT Motiv 3 liegt verteilt auf Exon 5 und 6 vor (s. Fig. 8).
Die Aufklärung der Exon-Intron-Struktur des hTC-Gens zeigt auch, daß die in unserer Patentanmeldung PCT/EP/98/03469 beschriebenen vier Deletions- bzw. Insertions-Varianten der hTC-cDNA ebenso wie drei weitere, in der Literatur (Kilian et al., 1997) beschriebene hTC-Insertions-Varianten höchstwahrscheinlich alternative Splice-Produkte darstellen. Wie in Fig. 8 gezeigt, lassen sich die Splice Varianten in zwei Gruppen einteilen: Deletionsvarianten und Insertionsvarianten.
Den hTC-Varianten der Deletionsgruppe fehlen spezifische Sequenzabschnitte. Die 36 bp in frame Deletion in Variante DEL1 resultiert höchstwahrscheinlich aus der Benutzung einer alternativen 3 '-Splice Akzeptorsequenz in Exon 6, wodurch ein Teil des RT Motivs 3 verlorengeht. In Variante DEL2 werden die normalen 5 '-Splice Donor- und 3'-Splice-Akzeptor Sequenzen von Intron 6, 7 und 8 nicht benutzt. Stattdessen wird Exon 6 direkt an Exon 9 fusioniert, wodurch eine Verschiebung des offenen Leserahmens entsteht und in Exon 10 ein Stopcodon auftritt. Variante Del3 stellt eine Kombination aus Variante 1 und 2 dar.
Die Gruppe der Insertions-Varianten zeichnet sich durch die Insertion von Intronsequenzen aus, die zu vorzeitigen Translationsstop führen. Anstelle der normalerweise benutzten 5 '-Splice Donorsequenz von Intron 5 wird eine alternative, 3 '-lokalisierte Splicestelle in Variante INS1 benutzt, wodurch eine Insertion der ersten 38 bp aus Intron 4 zwischen Exon 4 und Exon 5 entsteht. Ebenso resultiert die Insertion eines Intron 1 1 -Sequenzbereichs in Variante INS2 aus der Benutzung einer alternativen 5 '-Splice Donorsequenz in Intron 1 1. Da diese Variante in der Literatur (Kilian et al., 1997) nur unzureichend beschrieben wurde, läßt sich die genaue alternative 5 '-Splice Donorsequenz dieser Variante nicht bestimmen. Die Insertion von Intron 14 Sequenzen zwischen Exon 14 und Exon 15 in Variante INS3 entsteht durch die Benutzung von einer alternativen 3 "-Splice Akzeptorsequenz, wodurch der 3'-Teil von Intron 14 nicht gesplict wird.
Die in unserer Patentanmeldung PCT/EP/98/03469 beschriebene hTC-Variante INS4 (Variante 4) zeichnet sich durch den Ersatz von Exon 15 und dem 5'-Teilbereich von
Exon 16 durch die ersten 600 bp des Introns 14 aus. Diese Variante ist auf den Gebrauch einer alternativer internen 5 '-Splice Donorsequenz in Intron 14 und einer alternativen 3 '-Splice Akzeptorsequenz in Exon 16 zurückzuführen, woraus ein veränderter C-Terminus resultiert.
Die in v vo-Generation wahrscheinlich nicht-funktioneller hTC-Proteinvarianten, die mit der Funktion des vollständigen hTC-Proteins interferieren könnten, stellt zusätlich zur Transkriptionsregulation einen möglichen Mechanismus dar, um die hTC-Proteinfunktion zu kontrollieren. Bis heute ist die Funktion der hTC- Splicevarianten nicht bekannt. Obwohl die meisten dieser Varianten vermutlich für
Proteine ohne Reverse-Transkriptase-Aktivität kodieren, könnten sie dennoch eine entscheidende Rolle als transdominant-negative Telomerase-Regulatoren spielen, indem sie z.B. um die Interaktion mit wichtigen Bindungspartnern kompetieren.
Die Suche nach möglichen Transkriptionsfaktorbindungstellen wurde mit dem „Find
Pattern"-Algorithmuses aus dem „GCG Sequenz Analysis" Programmpacket der „Genetics Computer Group" (Madison, USA) durchgeführt. Dadurch wurden verschiedene potentielle Bindungsstellen für Transl iptionsfaktoren in der Nukleotidsequenz von Intron 2 identifiziert, die in der Tab. 2 aufgelistet sind. Darüberhinaus wurde im Intron 1 eine Spl -Bindungsstelle (Pos. 43) und im 5'- untranslatiertem Bereich eine c-Myc-Bindungsstelle (cDNA-Position 29-34, vergl. Fig. 6) gefunden.
Beispiel 6
Um den oder die Startpunkt(e) der hTC-Transkription in HL 60 Zellen zu ermitteln, wurde das 5 '-Ende der hTC-mRNA durch Primer-Extension- Analyse bestimmt.
Es wurden 2 μg PolyA+-RNA aus HL-60-Zellen für 10 min bei 65°C denaturiert. Zur Primeranlagerung wurden 1 μl RNasin (30-40 U/ml) und 0,3-1 pmol radioaktiv markierter Primer (5'GTTAAGTTGTAGCTTACACTGGTTCTC 3 '; 2,5-8xl05 cpm) zugegeben und für 30 min bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 20 μl inkubiert. Nach Zugabe von 10 μl 5xReverse Transkriptase-Puffer (Fa. Gibco-BRL), 2 μl 10 raM dNTPs, 2 μl RNasin (s.o.), 5μl 0J M DTT (Fa. Gibco-BRL) 2 μl ThermoScript RT (15 U/μl; Fa. Gibco-BRL) und 9 μl DEPC-behandeltes Wasser erfolgte die Primer-Verlängerung in einem Gesamtvolumen für 1 h bei 58°C. Die Reaktion wurde durch 4 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0, gestoppt und die RNA nach Zugabe von 1 μl RNaseA (10 mg/ml) für 30 min bei 37°C abgebaut. Hierauf wurden 2,5 μg gescherte Kalbsthymus-DNA und 100 μl TE addiert und einmal mit 150μl Phenol/Cloroform (1 : 1) extrahiert. Die DNA wurde unter Zusatz von 15 μl 3 M Na-
Acetat und 450 μl Ethanol für 45 min bei -70°C gefällt und anschließend für 15 min bei 14000 Upm abzentrifugiert. Das Präzipitat wurde einmal mit 70 %igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 8 μl Sequenzierungs-Stoplösung gelöst. Nach 5 min Denaturierung bei 80°C wurden die Proben auf ein 6 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch (Ausubel et al., 1987) aufgetrennt (Fig. 5).
Hierbei wurde eine Haupt-Transkriptionsstartstelle identifiziert, die 1767 bp 5' vom
ATG-Startcodon der hTC-cDNA Sequenz lokalisiert ist (Nukleotidposition 3346 in
Fig. 4). Die Nukleotidsequenz um diesen Haupttranskriptionsstart (TTA+ITTGT) repräsentiert darüberhinaus ein Initiator-Element (Inr), das in 6 von 7 Nukleotiden mit dem Konsensusmotiv (PyPyA+1Na/tPyPy) (Smale, 1997) eines Initiator- Elementes übereinstimmt.
In unmittelbarer Nähe des experimentell identifizierten Haupt-Transkriptionsstartes konnte keine eindeutige TATA-Box identifiziert werden, so daß der hTC-Promoter wahrscheinlich in die Familie der TATA-losen Promotoren (Smale, 1997) einzuordnen ist. Allerdings wurde durch Bioinformatik Analyse eine potentielle TATA- Box von Nukleotidposition 1306 bis 131 1 (Fig. 4) gefunden. Die zusätzlich um den Haupt-Transkriptionsstart beobachteten Neben-Transkriptionsstarts wurden auch bei anderen TATA-losen Promotoren beschrieben (Geng and Johnson, 1993), wie z.B. in den stark regulierten Promotoren einiger Zellzyklusgene (Wick et al, 1995).
Beispiel 7
Zusätzlich zu dem in Beispiel 6 beschriebenen, in HL60 Zellen identifizierten
Startpunkt des hTC Transkriptes, wαirde ein weiterer Transl ptionsstartbereich in HL60 Zellen identifiziert. Anhand von RT-PCR-Analysen wurde die Region des Transkriptionsstarts des hTC-Gens in HL60 Zellen auf die bp -60 bis -105 eingegrenzt.
Unter Einsatz von 0,4 μg Poly A-RNA aus HL60 Zellen (Clontech) und dem genspezifischen Primer GSP13 (5'-CCTCCAAAGAGGTGGCTTCTTCGGC-3\ cDNA-Position 920-897) wurde hierfür die cDNA mit Hilfe des „First Strand cDNA- Synthesis Kit" (Clontech) nach Angaben der Hersteller synthetisiert. In einem Endvolumen von 50 μl wurden 1 μl cDNA mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in
1 xPCR-Reaktionspuffer F (PCR-Optimizer Kit der Fa. InVitrogen) und einem Unit Platinum-Taq-DNA Polymerase (Fa. Gibco/BRL) eine PCR-Reaktion durchgefül rt. Als Primer wurden jeweils 10 pmol der nachfolgend definierten 5'- und 3'-Primer zugefügt. Die PCR wurde in 3 Schritten durchgeführt. An eine zweiminütige Dena- turierung bei 94°C schlössen sich 36 PCR-Zyklen an, in denen die DNA zunächst für
45 sec bei 94°C denaturiert wurde und anschließend für 5 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert wurde. Zum Abschluß folgte für 10 min eine Kettenverlängerung bei 68°C. Insgesamt wurden sechs verschiedene 5'-PCR Primer (Primer HTRT5B: 5'-CGCAGCCACTACCGCGAGGTGC-3', cDNA- Position 105 bis 126; Primer C5S: 5'-CTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGC- 3', 5 '-flankierende Region -49 bis -23; Primer PRO-TEST 1 : 5'-
CTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAG-3', 5 '-flankierende Region -74 bis -52; Primer PRO-TEST2: 5'-CCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCC-3\ 5 '-flankierende Region -112 bis -91 ; Primer PRO-TEST4: 5'-CCAGCTCCGCCTCCTCCGCGC-3', 5 '-flankierende Region -191 - -171 ; Primer RP-3A: 5'- CTAGGCCGATTCGACCTCTCTCC-3', 5 '-flankierende Region -All bis -405) mit dem 3'-PCR Primer C5Rrück (5'-GTCCCAGGGCACGCACACCAG-3\ cDNA- Position 245 bis 225) kombiniert. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den Oligo-dT- und GSP13-geprimten cDNAs auch genomische DNA für die PCR eingesetzt. Wie in Fig. 9 gezeigt, wurde nur mit den Primerkombinationen HTRT5B-C5Rrück, C5S- C5Rrück und PRO-TESTl-C5Rrück ein PCR-Produkt erhalten, was darauf hinweist, daß der Startpunkt der hTC-Transkription in der Region zwischen bp-60 und bp-105 liegt.
Beispiel 8
In der ca. 11,2 kb isolierten 5 '-flankierenden Region des hTC-Gens befinden sich mehrere extrem GC-reiche Bereiche, sog. CpG Islands. Ein CpG Islands mit einem GC-Gehalt von > 70 % reicht von bp - 1214 bis in Intron 2. Zwei weitere GC-reiche Bereiche mit einem GC-Gehalt von > 60 % reichen von bp -3872 bis bp -31 13 bzw. bp -5363 bis bp -3941. Die Lage der CpG Islands ist in der Fig. 1 1 graphisch dargestellt.
Die Suche nach möglichen Transkriptionsfaktorbindungstellen wurde mit dem „Find
Pattem"-Algorithmuses aus dem „GCG Sequenz Analysis" Programmpacket der „Genetics Computer Group" (Madison, USA) durchgeführt. Dadurch wurden verschiedene potentielle Bindungsstellen in der Region bis -900 bp upstream vom Translations-Startcodon ATG indentifiziert: fünf Spl -Bindungsstellen, eine c-Myc- Bindungsstelle, eine CCAC-Box (Fig. 10). Zusätzlich wurden eine CCAAT-Box und eine zweite c-Myc-Bindungsstelle an den Positionen -1788 bzw. -3995 der 5'- flankierenden Region gefunden.
Beispiel 9
Um die Aktivität des hTC-Promotors zu analysieren, wurden durch PCR-Ampli- fikation vier verschieden lange hTC-Promotorsequenzabschnitte generiert und 5' vor das Reportergen Luziferase in den Vektor pGL2 der Fa. Promega kloniert. Als DNA-
Quelle für die PCR-Amplifikation wurde das aus dem Phagenklon P12 subklonierte, 8,5 kb große Sacl-Fragment gewählt. In einem Endvolumen von 50 μl wurden 35 ng dieser DNA mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in lxPCR-Reaktionspuffer (PCR- Optimizer Kit der Fa. InVitrogen) und einem Unit Platinum-Taq-DNA Polymerase (Fa. Gibco/BRL) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Als Primer wurden jeweils
20 pmol der nachfolgend definierten 5'- und 3'-Primer zugefügt. Die PCR wurde in 3 Schritten durchgeführt. An eine zweiminütige Denaturierung bei 94°C schlössen sich 30 PCR-Zyklen an, in denen die DNA zunächst für 45 sec bei 94°C denaturiert wurde und anschließend für 5 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA- Kette verlängert wurde. Zum Abschluß folgte für 10 min eine Kettenverlängerung bei 68°C. Als 3'-PCR-Primer wurde jeweils der Primer PK-3A (5'- GCAAGCTTGACGCAGCGCTGCCTGAAACTCG-3', Position -43 bis -65) gewählt, der einen Sequenzbereich 42 bp upstream vom START-Codon ATG erkennt. Durch Kombination des PK-3A-Primers mit dem 5'-PCR-Primer PK-5B (5'- CCAGATCTCTGGAACACAGAGTGGCAGTTTCC-3', Position -4093 bis -4070) wurde ein 4051 bp großes Promotor-Fragment amplifiziert (NPK8). Die Kombination des Primerpaares PK-3A und PK-5C (5'-
CCAGATCTGCATGAAGTGTGTGGGGATTTGCAG-3', Position -3120 bis- 3096) führte zur Amplifikation eines 3078 bp großen Promotorfragmentes (NPK15). Ein 2068 bp großes Promotorfragment wurde durch die Verwendung der Primer- kombination PK-3A und PK-5D (5'- GGAGATCTGATCTTGGCTTACTGCAGCCTCTG-3', Position -2110 bis -2087) amplifziert (NPK22). Der Einsatz der Primerkombination PK-3A und PK-5E (5'- GGAGATCTGTCTGGATTCCTGGGAAGTCCTCA-3', Position -1125 bis -1 102) führte schließlich zur Amplifikation eines 1083 bp großen Promotorfragmentes (NPK27). Der PK-3A Primer enthält eine Hindlll Erkennungssequenz. Die verschiedenen 5'-Primer enthalten eine Bglll-Erkennungssequenz.
Die entstandenen PCR-Produkte wurden mit Hilfe des QIA quick spin PCR Purification Kits der Fa. Qiagen nach Angaben der Hersteller aufgereinigt und anschließend mit den Restriktionsenzymen Bglll und Hindlll verdaut. Mit den gleichen Restriktionsenzymen wurde der pGL2-Promotor-Vektor verdaut und der in diesem Vektor enthaltene SV40-Promotor freigesetzt und abgetrennt. Die PCR- Promotorfragmente wurden in den Vektor ligiert, in kompetente DH5α-Bakterien der Fa. Gibco/BRL transformiert. Aus transformierten Bakterienklonen wurde DNA für die nachfolgend beschriebenen Promotor-Aktivitäts-Analysen mit Hilfe des Qiagen
Plasmid-Kits der Fa. Qiagen isoliert.
Beispiel 10
Die Aktivität des hTC-Promotors wurde in transienten Transfektionen in eukaryotischen Zellen analysiert.
Alle Arbeiten mit eukaryotischen Zellen erfolgten an einem sterilen Arbeitsplatz. CHO-Kl und HEK 293 Zellen wurden von der American Type Culture collection bezogen.
CHO-Kl Zellen wurden in DMEM Nut Mix F-12 Zellkulturmedium (Fa. Gibco- BRL, Bestellnummer: 21331-020) mit 0,15 % Streptomycin/Penezillin, 2 mM Glutamin und 10 % FCS (Fa. Gibco-BRL) gehalten. HEK 293 Zellen wurden in DMOD Zellkulturmedium (Fa. Gibco-BRL, Bestellnummer: 41965-039) mit 0J5 % Streptomycin/Penizillin, 2 mM Glutamin und 10 % FCS (Fa. Gibco-BRL) kultiviert.
CHO-Kl und HEK 293 Zellen wurden in wasssergesättigter Atmosphäre bei 37°C unter Begasung mit 5 % C02 kultiviert. Bei konfluentem Zellrasen wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS (100 mM KH2PO4 pH 7,2; 150 mM NaCl) gewaschen und durch Zugabe einer Trypsin-EDTA Lösung (Fa. Gibco-BRL) abgelöst. Das Trypsin wurde durch Mediumzugabe inaktiviert und die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer ermittelt, um die Zellen in gewünschter Dichte auszu- plattieren.
Für die Transfektion wurden pro Well jeweils 2x lO3 -HEK 293 Zellen in einer 24- well Zellkulturplatte ausplattiert. Nach 3 Stunden wurde das HEK 293 Medium entfernt. Für die Transfektion wurden bis zu 2,5 μg Plasmid-DNA, 1 μg eines CMV ß-Gal Plasmidkonstruktes (Fa. Stratagene, Bestellnummer: 200388), 200 μl serumfreies Medium und 10 μl Transfektionsreagenz (DOTAP der Fa. Boehringer Mannheim) für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf die HEK 293 Zellen gleichmäßig aufgetropft. Nach 3 Stunden wurden 1 ,5 ml Medium hinzugegeben. Nach 20 Stunden wurde das Medium gewechselt. Nach weiteren 24
Stunden wurden die Zellen zur Bestimmung der Luziferase- und der ß-Gal-Aktivität geemtet. Dazu wurden die Zellen im Zellkultur-Lysisreagenz (25 mM Tris [pH 7,8] mit H3PO4; 2 mM CDTA; 2 mM DTT; 10% Glycerol; 1% Triton X-100) für 15 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Zwanzig μl dieses Zellysats wurden mit 100 μl Luziferase-Assaypuffer (20 mM Tricin; 1,07 mM (MgCO3) Mg(OH) 5H2O;
2,67 mM MgSO4; 0J mM EDTA; 33,3 mM DTT; 270 μM Coenzym A; 470 μM Luciferin, 530 μM ATP) gemischt und das durch die Luziferase generierte Licht gemessen.
Zur Messung der ß-Galaktosidaseaktivität wurden gleiche Mengen Zellysat und ß-
Galaktosidase-Assaypuffer (100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,3; 1 mM MgCl2; 50 mM ß-Merkaptoethanol; 0,665 mg/ml ONPG) für mindestens 30 Minuten bei 37°C oder bis eine leichte Gelbfärbung auftrat, inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl 1 M Na2CO3 gestoppt und die Absorption bei 420 nm bestimmt.
Für die Analyse des hTC-Promotors wurden vier verschieden lange hTC-Promotor- sequenzabschnitte 5' vor das Reportergen Luziferase kloniert (vergl. Beispiel 9).
In der Fig. 1 1 sind die relativen Luziferase Aktivitäten zweier unabhängiger Transfektionen mit den Konstrukten NPK8, NPK15, NPK22 und NPK27 in HEK 293 Zellen aufgetragen. Jedes Experiment wurde in Duplikaten durchgeführt.
Darüberhinaus wurde die Standardabweichung angegeben. Das Konstukt NPK 27 zeigt eine 40fach höhere Luziferaseaktivität als die Basalaktivität des promotorlosen Luziferase-Kontrollkonstrutes (pGL2-basic) und eine 2 bis 3fach höhere Aktivität als das SV40 Promotorkontroll-Konstrukt (pGL2PRO). Interessanterweise wurde im Vergleich zu dem Konstrukt NPK27 eine 2 bis 3fach geringere Luziferaseaktivität in mit längeren hTC Promotorkonstukten (NPK8, NPK15, NPK22) transfizierten Zellen beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in CHO Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt).
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Claims

Patentansprüche
1. Regulatorische DNA-Sequenzen für das Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit.
2. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Intronsequenzen gemäß SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und/oder 20 oder um regulatorisch wirksame Fragmente dieser Sequenzen handelt.
3. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die 5'-flankierende regulatorische DNA-Sequenz für das Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit gemäß Fig. 10 (SEQ ID NO 3) oder um regulatorisch wirksame Fragmente dieser DNA-Sequenz handelt.
4. Rekombinantes Konstrukt, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Rekombinantes Konstrukt gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die für Polypeptide oder Proteine kodieren.
6. Vektor, enthaltend ein rekombinantes Konstrukt gemäß Anspruch 4 oder 5.
7. Verwendung von rekombinanten Konstrukten bzw. Vektoren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Herstellung von Arzneimitteln.
8. Rekombinante Wirtszellen, enthaltend rekombinante Konstrukte bzw. Vektoren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6.
9. Verfaliren zur Identifizierung von Substanzen, die die Promotor-, Silencer- oder Enhanceraktivität der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit beeinflussen, das folgende Schritte umfaßt:
A. Zugabe einer Kandidatensubstanz zu einer Wirtszelle, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, funktionell verknüpft mit einem Reportergen,
B. Messung des Substanzeffektes auf die Reportergenexpression.
10. Verfahren zur Identifizierung von Faktoren, die spezifisch an die DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder an Fragmente davon binden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Expressions-cDNA-Bibliothek mit einer DNA- Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Teilfragmenten unter- schiedlichster Länge als Sonde screent.
1 1. Transgene Tiere, enthaltend rekombinante Konstrukte bzw. Vektoren gemäß Ansprüchen 4 bis 6.
12. Verfahren zur Detektion Telomerase-assozuerter Zustände bei einem
Patienten, das folgende Schritte umfaßt:
A. Inkubation eines rekombinanten Konstruktes bzw. Vektors gemäß Ansprüchen 4 bis 6 das bzw. der zusätzlich ein Reportergen enthält mit Körperflüssigkeiten oder zellulären Proben,
B. Detektion der Reportergenaktivität, um einen diagnostischen Wert zu erhalten, Vergleich des diagnostischen Wertes mit Standardwerten für das Reportergenkonstrukt in standardisierten normalen Zellen oder Körperflüssigkeiten des gleichen Typs wie die Testprobe.
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