EP0833896A1 - Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant

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EP0833896A1
EP0833896A1 EP96922971A EP96922971A EP0833896A1 EP 0833896 A1 EP0833896 A1 EP 0833896A1 EP 96922971 A EP96922971 A EP 96922971A EP 96922971 A EP96922971 A EP 96922971A EP 0833896 A1 EP0833896 A1 EP 0833896A1
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EP
European Patent Office
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promoter
adenovirus according
tetracycline
recombinant adenovirus
region
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96922971A
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German (de)
English (en)
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Martine Latta
Cécile Orsini
Michel Perricaudet
Edouard Prost
Emmanuelle Vigne
Patrice Yeh
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
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Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
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    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to new viral vectors, their preparation and their uses. It also relates to pharmaceutical compositions containing said viral vectors.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • different techniques exist, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • different viruses have been tested for their ability to infect certain cell populations.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses adenoviruses
  • viruses with linear double strand DNA with a size of approximately 36 kb.
  • Their genome includes in particular an inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence, early genes and late genes (see FIG. 1).
  • the main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions.
  • the genes contained in the El region are necessary for viral replication.
  • the E4 and L5 regions for example are involved in the viral spread and the main late genes are contained in regions LI to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260).
  • adenoviruses of different serotypes have also been sequenced.
  • These viral vectors advantageously have a fairly broad host spectrum, are capable of infecting quiescent cells, do not integrate into the genome of the infected cell, and have not been associated to date with significant pathologies in humans. 'man. Given their properties, they have already been used for gene transfer in vivo.
  • different vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different genes ( ⁇ -gal, OTC, ⁇ -lAT, cytokines, etc.).
  • the viral vector constructions currently proposed are modified so as to render said vectors incapable of replicating autonomously in the target cell. They are said to be defective.
  • the genome of defective viruses is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by a sequence coding for a molecule of therapeutic interest.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • the constructions described in the prior art are generally adenoviruses deleted from the El (El a and / or Elb) and possibly E3 regions into which the heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al ., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).
  • Other constructions include deletion at the level of the E1 region and a non-essential part of the E4 region (WO 94/12649).
  • adenovirus serotype 5 Ad5
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, necessary for replication.
  • replicative viral particles can have very harmful consequences such as for example inducing a viral propagation and causing an uncontrolled dissemination with risks of inflammatory reaction, recombination, etc ...
  • the present invention relates to a recombinant adenovirus in which the expression of at least one gene of viral origin, homologous or heterologous, is controlled by an inducible promoter.
  • inducible promoter means any promoter whose activity is initiated by the presence of an external chemical and / or biological agent, an agent which, in the context of the present invention also has reduced toxicity or even zero.
  • exterior is meant that the chemical and / or biological agent does not naturally exist in cells treated with the claimed adenovirus.
  • inducible promoters capable of being used according to the present invention, mention may in particular be made of conventional promoters such as those responding to heavy metals (CRC Boca Raton, FL (1991), 167-220; Brinster et al.
  • a promoter inducible by tetracycline comprises a minimal promoter operably linked to one or more tetracycline operator (s). It is the binding, to the tetracycline operator sequences, of a protein called "transcription activator", a binding which is established only in the presence of tetracycline or one of its analogs, which allows the activation of the minimal promoter and therefore the transcription of the associated viral gene or genes.
  • transcription activator a binding which is established only in the presence of tetracycline or one of its analogs, which allows the activation of the minimal promoter and therefore the transcription of the associated viral gene or genes.
  • transcription activator it is therefore characterized by its ability to bind, in the presence of tetracycline, to the operator sequences of the promoter inducible by tetracycline and its capacity to activate the minimal promoter. More preferably, it is a protein consisting of two polypeptides, a first polypeptide which binds to the operator tet sequences, in the presence of tetracycline or an analog thereof, and a second polypeptide whose function is more specifically to activate said transcription.
  • the first polypeptide of the protein known as transcription activator is a repressor of tetracycline mutated so as to manifest a behavior opposite to that of a wild repressor, that is to say that it binds to the tet operator sequences only in the presence and not in the absence of tetracycline.
  • the second polypeptide it is preferably the activation domain of protein 16 of the Herpes Simplex Virus.
  • the inducible promoter used is, for example, inducible to glucose or galactose, it is possible to envisage using a transcription activator constructed on this model, that is to say for example Glu-VP16 or Gal4-VP16.
  • the inducible promoter used is a promoter inducible to tetracycline or one of its analogs as described above.
  • a promoter inducible by tetracycline comprises a minimal promoter operably linked to a so-called regulatory sequence comprising at least one operator of the tetracycline "tet operator" or one of its analogs.
  • tetracycline analog is intended to cover any compound having structural homologies with tetracycline and being capable of binding to its receptor linked to the transactivation domain of the protein called trancription activator presented above, with a Ka of at least. at least about 10 6 M " 1.
  • analogs capable of being used according to the present invention mention may in particular be made of doxycycline, chlorotetracycline and ranhydrotetracycline.
  • minimal promoter any promoter sequence which alone is not capable of efficiently ensuring the transcription of the DNA sequence which is associated with it.
  • the activity of such a promoter turns out to be totally dependent on the binding of the transcription activator protein to the so-called regulatory sequence, in the presence of tetracycline.
  • this minimal promoter mainly has the function of directing transcription. In this perspective, it is preferably located upstream of the viral sequence so as to form with it a continuous nucleotide sequence.
  • This minimal promoter can be derived from the immediately early promoter of human Cytomegalovirus and more preferably is between nucleotides +75 to -53 or +75 to -31.
  • a minimal promoter deriving from a conventional promoter such as for example that activating the transcription of the gene coding for thymidine kinase.
  • a conventional promoter can also be minimized through one or more genetic mutations which render it incapable of ensuring efficient transcription of the gene associated with it alone. It can also be used in the context of the present invention, a minimal promoter deriving directly from the promoter naturally responsible for the expression of the viral gene considered.
  • a promoter called "TATA-less” as described by E. MARTINEZ et al. (EMBO Journal, (1994), 13, N ° 13, 3115-3126) so as to obtain the most basic background noise possible in the non-induced situation.
  • this irunirnal promoter is placed upstream of the nucleotide sequence the expression of which it controls, whether or not in substitution for its natural promoter.
  • the promoter of the nucleic acid sequence can in fact remain present but in an inactivated form or made non-functional by various techniques known to those skilled in the art and in particular by deletion, deletion and / or addition of one or more bases.
  • the ierinimal promoter is derived from the minimal promoter of the thymidine kinase of the Herpes Simplex Virus (Me Knight et al. (1984) Cell 37: 253-262). He is then designated by Tk. More preferably, it is represented in whole or in part by one of the sequences represented in SEQ ID No. 1 or No. 2 or one of their derivatives.
  • the term derivative designates any sequence obtained by modification of a genetic and / or chemical nature of given sequences and retaining the desired activity.
  • modification of a genetic and / or chemical nature is meant any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more nucleic acid.
  • the so-called regulatory sequence comprises at least one operator of tetracycline or one of its analogs.
  • the operator (s) are recognized by the transcription activator in the presence of tetracycline and therefore allow the activation of the minimal promoter.
  • the tet operator sequences which can be implemented can in particular be chosen from those described by Hillen & Wissemann (Protein-Nucleic Acid Interaction, Saeger & Heinemann, eds., Macmillan, London, (1989), 10, 143-162), Waters and al. (Nucleic Acids Res. (1983), 11, 525-539), Stuber et al. (P.N.A.S. USA, (1981), 78, 167-171), Unger et al. (Nucleic Acids Res. (1984), 12, 7693-7703) and Tovar et al. (Mol. Gen. Genêt. (1988), 215, 76-80).
  • the regulation sequence can comprise a single operator tet sequence or on the contrary several operator tet sequences up to number of 10 depending on whether or not it is desired to increase the regulation of transcription. According to a particular embodiment of the invention, the regulation sequence implements 2 operator tet sequences. It will then be called Op2.
  • the regulatory sequence is represented in whole or in part by one of the sequences represented in SEQ ID No. 3 or No. 4 or one of their derivatives.
  • this regulatory sequence is operatively linked upstream, that is to say at the 5 ′ end of the minimal promoter so as to allow transcription of the gene of viral origin, in the presence of the complex formed by the activator of transcription and its tetracycline ligand.
  • the regulatory sequence linked or not directly to the minimal promoter, the minimal promoter and the gene of viral origin.
  • this regulatory sequence within the minimal promoter, downstream of the viral nucleotide sequence to be transcribed, that is to say at its 3 ′ end. The order of succession is then in the 5 ′ to 3 ′ direction, minimal promoter, viral gene and regulatory sequence.
  • the promoter inducible to tetracycline combines with the minimal promoter of thymidine kinase called Tk, a regulatory sequence represented by Op2. In this particular case, it is identified below under the name Op2 / Tk. More preferably, the inducible promoter used according to the invention is represented in whole or in part by SEQ ID No. 5 or one of its derivatives.
  • This promoter inducible to tetracycline Op2 / Tk and more particularly that represented in whole or in part by SEQ ID No. 5 or one of its derivatives, also constitute one of the objects of the present invention.
  • the expression of the viral gene (s) operatively linked, in the claimed adenovirus, to an inducible promoter is totally subject to the binding of the complex formed by the transcription activator and the tetracycline, on the regulatory sequence of said promoter.
  • One of the objects of the present invention relates more particularly to an adenovirus comprising at least one homologous gene, that is to say adenoviral, the expression of which is controlled by an inducible promoter and more preferably by a promoter inducible to tetracycline.
  • the subject of the present invention is a recombinant adenovirus of which at least one genomic region essential for replication and / or viral propagation is placed in whole or in part under the control of a promoter inducible to tetracycline.
  • the region essential for replication and / or viral propagation according to the present invention is advantageously chosen from all or part of the E4 region, E2, the IVa2 region and / or the L5 region, etc.
  • the recombinant adenoviruses of the present invention comprise, as sequences necessary for replication and / or propagation, all or a functional part of the E2 or E4 regions. More particularly, with regard to the E4 region, the important genes are the ORF3, ORF6 and ORF6 / 7 genes.
  • the E2 region is involved in the regulation of viral DNA.
  • This E2 region consists of two E2A and E2B transcription subunits.
  • the E4 region is involved in the regulation of late gene expression, in the stability of late nuclear RNA, in the quenching of expression of host cell proteins and in the efficiency of DNA replication viral. Mutants lacking E4 are unable to spread. E4 thus constitutes a region essential for viral spread.
  • This E4 region consists of 7 open reading phases, designated ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3 / 4, ORF6 and ORF6 / 7 ( Figure 2).
  • ORF3 and ORF6 are the two genes essential for viral spread. Each of these genes is capable of inducing viral propagation, however ORF6 plays a more important role there than ORF3 (Huang and Hearing (1988), J. Virol. 63, 2605).
  • the entire region considered is placed under the control of a promoter inducible to tetracycline.
  • the E2 region may be a fragment corresponding to the 72K cDNA, to the 140K polymerase cDNA or to the 87K pre-terminal protein cDNA.
  • the E4 region it may in particular be the Taql-Bgl2 fragment corresponding to nucleotides 35576 -32490.
  • this part comprises at least one functional ORF3 or ORF6 gene.
  • the functional part of E4 consists essentially of ORF6.
  • the Bgl2 fragment, lying between positions 34115 to 32490 and containing the sequences of ORF6 and ORF7 of Ad5 can be positioned downstream of an inducible promoter as defined according to the invention.
  • the essential region consists of the region coding for the protein IVa2 and for example its cDNA.
  • the region coding for the protein IVa2 is included in a BglII-NruI fragment corresponding to nucleotides 3328 to 6316 on the sequence of the wild-type Ad5 adenovirus, a Dral-NlalII fragment corresponding to nucleotides 4029 to 5719 or a Xhal dral fragment corresponding to nucleotides 4029 to 5788.
  • the promoters of the regions essential for viral propagation are replaced within the viral genome by an inducible promoter and more preferably by a promoter inducible to tetracycline.
  • the recombinant adenoviruses of the invention carry a deletion of all or part of the El gene and have the E4 region, in whole or in part, under the control of a promoter inducible to tetracycline, preferably type Op2 / Tk.
  • the recombinant adenoviruses of the invention carry a deletion of all or part of the E1 gene and have the E2 region in whole or in part under the control of a promoter inducible to tetracycline, preferably of the Op2 type / rk.
  • the recombinant adenoviruses of the invention carry a deletion of all or part of the El and E2 genes and have the E4 region wholly or partly under the control of a promoter inducible to tetracycline, preferably of type Op2 / Tk.
  • the recombinant adenoviruses of the invention carry a deletion of all or part of the El and E4 genes and have the E2 region in whole or in part under the control of a promoter inducible to tetracycline, preferably of the Op2 type / Tk.
  • the recombinant adenoviruses of the invention also comprise a heterologous nucleic acid sequence comprising one or more therapeutic genes whose transfer and / or expression in a cell, an organ or an organism is sought.
  • the therapeutic genes which can thus be transferred are any gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can be a protein, a peptide, etc.
  • This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter has no pathology).
  • the expression of a protein makes it possible, for example, to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of a protein inactive or weakly active due to a modification, or to overexpress said protein.
  • the therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can for example supplement or provide a deficient activity in the cell allowing it to fight against a pathology.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), dystrophin or a mini dystrophin (FR 9111947), tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745 ), genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, etc., suicide genes: Thymidine kinase, cytosine deaminase, etc; or all or part of a natural or artificial immunoglobin, etc.
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs such as ribozymes.
  • Such sequences can, for example, be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the therapeutic gene can also be a gene coding for an antigenic peptide capable of generating an immune response in humans.
  • the invention therefore allows the production of vaccines making it possible to immunize humans, in particular against microorganisms or viruses.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the epstein barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259 212).
  • the heterologous nucleic acid sequence also comprises a promoter region for functional transcription in the infected cell, as well as a region located 3 ′ of the gene of interest, and which specifies a transcriptional end signal and a site for polyadenylation.
  • the promoter region it may be a promoter region which is naturally resoonsable for the expression of the gene considered when it is capable of functioning in the infected cell. They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect. Likewise, they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, including the adenovirus used. In this regard, mention may be made, for example, of the promoters of the E1A, MLP, CMV, RSV, etc. genes.
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • the heterologous nucleic acid does not contain promoter sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • heterologous nucleic acid sequence may also comprise, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • This nucleic acid sequence is preferably present at the E1, E3 or E4 regions, in addition to or in replacement of deleted sequences.
  • the second main object of the present invention is an adenovirus comprising at least one gene of heterologous viral origin, the expression of which is controlled by an inducible promoter and more preferably a promoter inducible to tetracycline.
  • the gene of heterologous viral origin is or is derived from a gene of the genome of an AAV or one of its functional counterparts.
  • AAVs are relatively small DNA viruses that integrate into the genome of the cells they infect in a stable and site-specific manner. They are also capable of infecting a broad spectrum of cells, without inducing an effect on cell growth, morphology or differentiation. Furthermore, they do not seem to be involved in pathologies in humans.
  • the AAV genome has been cloned, sequenced and characterized. It comprises 4680 bases, and contains at each end an inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases, serving as an origin of replication for the virus.
  • ITR inverted repeat region
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the eap gene coding for the capsid proteins of the virus.
  • Three promoters were located there and named according to their approximate position in map units p5, pl9 and p40. At least four proteins are synthesized from the rep region and have been named after their apparent molecular mass, Re ⁇ 78, Rep68, Rep52 and Rep40.
  • the 2 mRNAs transcribed from the p5 promoter are used for the synthesis of Rep78 and Rep68.
  • Rep52 and Rep40 they are synthesized from the messengers originating from the promoter pl9.
  • cap gene codes for the proteins of the capsid of the virus (VP1, VP2 and VP3).
  • VP3 is the majority capsid protein and its amino acid sequence is contained in those of two larger but less abundant proteins VP1 and VP2 (draw a diagram).
  • rep genes . and cjrj have been characterized and their respective sequences described in the literature (Srivastava et al., J. Virol. 45 (1983) 555).
  • vectors derived from AAVs for gene transfer in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528).
  • the constructions used in gene therapy contain a deletion of the rep and / or cjp genes which are replaced by a gene of interest.
  • AAVs need the presence of a helper virus capable of transcomplementing the functions necessary for their replication. It may in particular be an adenovirus, a herpes virus or a vaccinia virus. (In the absence of such a helper virus, the AAVs remain in latent form in the genome of the infected cells, but cannot replicate and thus produce viral particles.)
  • a helper virus for example an adenovirus
  • the recombinant AAVs are therefore produced by co-transfection , in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the gene of interest bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV and of a plasmid carrying the genes of encapsidation (rep and cap genes) of AAV.
  • Co-infection with adenovirus starts a cascade of events that lead to the production of high AAV titers and significantly decrease the production of adenovirus.
  • This cascade starts with the synthesis of the Ela gene product which induces transcription from the p5 and p19 promoters and leads to the synthesis of a small amount of Rep proteins.
  • One or more Rep proteins synthesized from p5 then induce the synthesis in a more abundant quantity of mRNA from the 3 promoters at a much greater level and in a coordinated manner.
  • the AAV genome is either lost or integrated into the host chromosome.
  • Other genes than El A of the adenovirus are also necessary for efficient expression of the AAV genes.
  • the Applicant has demonstrated that it was possible to effectively place at least the expression of one of the AAV viral genes under the control of an inducible promoter in an adenovirus and more preferably to control the expression of AAV packaging functions, in particular the expression of the rep and / or cap genes, or of any functional homologous gene.
  • a functional counterpart corresponds to any gene obtained by modification (mutation, deletion, addition, etc.) of the rep or cap genes and having an activity of the same nature.
  • Such functional homologous genes can also be genes obtained by hybridization from nucleic acid libraries by means of probes corresponding to the rgp or cap genes.
  • a mutated re_p gene capable of being controlled according to the invention one can more particularly cite its mutant in1177 described in the publication Y. Yang et al., ((1992) Journal of virology, 6058-6069) and derived from '' insertion of serines between codons 286 and 287.
  • the inducible promoter used is a promoter inducible to tetracycline as defined above.
  • Such an adenovirus is advantageous for several reasons: it considerably simplifies, in terms of handling, the process for preparing stocks of AAV. Indeed, in this particular case, it essentially implements that said adenovirus comprising the rep and cap genes under the control of the inducible promoter, a recombinant AAV and an adequate cell line. Finally, the titers expected in AAV from such an adenovirus prove to be higher than those obtained according to a conventional process.
  • the inducible promoter can in particular be introduced in substitution for one of the promoters which normally lead to the expression of the gene (s) considered and in particular in substitution for the promoter p5, pl9 or p40.
  • the p5 promoter seems to be the most involved in the start of the cascade of events leading to the production of the virus, its substitution is more preferably carried out by a promoter inducible by tetracycline, preferably of the Op2 / Tk type.
  • tetracycline preferably of the Op2 / Tk type.
  • the AAV packaging functions under the control of the inducible promoter can be introduced into different regions of the genome of the claimed adenovirus.
  • the packaging functions are inserted in a region which does not disturb the ability of the virus to transcomplement the AAVs. It is also possible to insert the packaging functions into a functional region of the genome of said adenovirus, which region is then supplied in trans, either by a plasmid or by the cell line used. It is possible by example of inserting the rgp gene, the cjp gene or the rsp and cjp genes at the level of the El or E3 regions to replace or supplement the deleted sequences.
  • a sequence known as a negative regulatory sequence Such a sequence inserted in particular between the left ITR and the psi sequence of the claimed adenovirus on the one hand, and the sequence coding for the tetracycline-inducible promoter makes it possible to stem any parasitic transcriptional activation of rep and cap, induced if necessary by the enhancer located in the left ITR of the adenovirus and the psi sequence. Mention may in particular be made, as negative sequences which can be used according to the invention, of those identified in the vimentin promoter (Salvetti et al., (1993), Mol. Cell.
  • Biol., 1676-1685 in the interferon promoter (Whitemore et al. (1990), PNAS, 87, 7799-7803), in the light chain gene 2 of cardiac myosin (Ruoquian-Shen et al. (1991), Mol. Cell. Biol., 1676-1685 ) and in the mouse albumin promoter (Herbst et al. (1990), Mol. Cell. Biol., 3896-3905).
  • the invention relates to a recombinant adenovirus carrying an Op2 / Tk-rep-cap expression cassette.
  • the present invention also relates to the use of these adenoviruses integrating a viral sequence of AAV origin under the control of a promoter inducible to tetracycline to prepare AAVs.
  • the adenoviruses which are the subject of the invention comprise the ITR sequences and a sequence allowing the packaging.
  • these adenoviruses also have a non-functional E1 region.
  • the inverted repeat sequences constitute the origin of replication of adenoviruses. They are located at the 3 ′ and 5 ′ ends of the viral genome (cf. FIG. 1), from which they can be easily isolated according to the conventional techniques of molecular biology known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of the sequences are located at the 3 ′ and 5 ′ ends of the viral genome (cf. FIG. 1), from which they can be easily isolated according to the conventional techniques of molecular biology known to those skilled in the art.
  • ITR of human adenoviruses (in particular serotypes Ad2 and Ad5) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • Ad5 adenovirus for example, the left ITR sequence corresponds to the region comprising nucleotides 1 to 103 of the genome.
  • the packaging sequence (also called Psi sequence) is necessary for the packaging of viral DNA. This region must therefore be present to allow the preparation of defective recombinant adenoviruses according to the invention.
  • the packaging sequence is located in the genome of the adenoviruses, between the left ITR (5 ′) and the El gene (see FIG. 1). It can be isolated or artificially synthesized by conventional molecular biology techniques.
  • the nucleotide sequence of the packaging sequence of human adenoviruses (in particular the Ad2 and Ad5 serotypes) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • the packaging sequence corresponds to the region comprising nucleotides 194 to 358 of the genome.
  • the E1 region is inactivated by deletion of a PvuII-BglII fragment ranging from nucleotide 454 to nucleotide 3328, on the sequence of the adenovirus Ad5. This sequence is accessible in the literature and also on the database (see in particular Genebank n ° M73260).
  • the E1 region is inactivated by deletion of a HinfII-Sau3A fragment going from nucleotide 382 to nucleotide 3446.
  • adenoviruses of the invention can be prepared from adenoviruses of various origins. There are indeed various adenovirus serotypes, whose structure and properties vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. Thus, the lessons described in the present application can be easily reproduced by those skilled in the art for any type of adenovirus.
  • the adenoviruses of the invention can be of human, animal, or mixed (human and animal) origin. Concerning adenoviruses of human origin, it is preferred to use those classified in group C. More preferably, among the various serotypes of human adenovirus, it is preferred to use, within the framework of the present invention, adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5).
  • the adenoviruses of the invention can also be of animal origin, or contain sequences derived from adenoviruses of animal origin.
  • the Applicant has indeed shown that adenoviruses of animal origin are capable of infecting human cells with great efficiency, and that they are unable to propagate in the human cells in which they have been tested (cf. application WO 94 / 26914).
  • the Applicant has also shown that adenoviruses of animal origin are in no way trans-complemented by adenoviruses of human origin, which eliminates any risk of recombination and of propagation in vivo, in the presence of a human adenovirus, which can lead to the formation of an infectious particle.
  • the use of adenoviruses or adenovirus regions of animal origin is therefore particularly advantageous since the risks inherent in the use of viruses as vectors in gene therapy are even lower.
  • the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention can be of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or else simienne (example: after-sales service).
  • serotypes 1 to 10 accessible to ATCC such as for example the strains Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR- 827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) or the strains referenced ATCC VR- 831 to 835.
  • bovine adenoviruses it is possible to use the various known serotypes, and in particular those available at ATCC (types 1 to 8) under the references ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 and 769. It is possible to use also mention the murine adenoviruses FL (ATCC VR-550) and E20308 (ATCC VR-528), the sheep adenovirus type 5 (ATCC VR-1343), or type 6 (ATCC VR-1340); porcine adenovirus 5359), or simian adenoviruses such as in particular adenovirus referenced to ATCC under the numbers VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
  • adenoviruses or regions of adenoviruses of canine origin are used in the context of the invention, and in particular all the strains of adenoviruses CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 ( ATCC VR-800) for example].
  • Canine adenoviruses have been the subject of numerous structural studies. Thus, complete restriction maps of the CAV1 and CAV2 adenoviruses have been described in the prior art (Spibey et al., J. Gen. Virol.
  • the present invention further relates to a process useful for the preparation of AAV.
  • AAV relates to a process for the preparation of AAV characterized in that it comprises the co-transfection, in the presence of tetracycline or one of its analogs, of a cell line comprising in its genome the expression cassette a transcription activator, with an adenovirus comprising at least one gene of AAV origin under the control of a promoter inducible to tetracycline and either a recombinant virus derived from AAV or a plasmid carrying a transgene between the ITRs of the AAV. It is more preferably an adenovirus comprising, as heterologous viral genes, the rep and cap genes.
  • the method according to the invention takes advantage of the ability to induce the expression of these rep and cap genes placed under the control of a promoter inducible by tetracycline within an adenovirus, in the presence of a sufficient amount of the tetracycline and a transcription activator.
  • this process has the advantage of being simplified in terms of handling compared to a conventional process.
  • a co-infection of a cell line is implemented with an adenovirus as claimed and a recombinant virus derived from an AAV.
  • this method uses a cell line comprising in its genome an expression cassette for the protein known as transcription activator consisting of a first polypeptide capable of binding, in the presence of tetracycline or one of its analogs, to the regulatory sequence of the inducible promoter present in the adenovirus, associated with a second polypeptide which activates transcription.
  • transcription activator As regards more particularly the protein called transcription activator, it is therefore characterized by its ability to bind, in the presence of tetracycline, to the so-called regulatory sequence and its capacity to activate the minimal promoter which is associated with it. As explained above, it is a protein made up of two polypeptides, a first polypeptide which binds to the tet operator sequences, in the presence of tetracycline or an analog thereof, and a second polypeptide whose function is more specifically to activate said transcription.
  • the first polypeptide of the protein known as transcriptional activator is a repressor of tetracycline mutated so as to manifest a behavior opposite to that of a wild repressor, that is to say that it does not binds to operating tet sequences only in the presence and not in the absence of tetracycline.
  • This type of mutation can be carried out according to conventional biological techniques of the mutagenesis type.
  • the difference in amino acids between the wild-type repressor and the mutated repressor according to the present invention can consist of a substitution, deletion and / or addition of one or more amino acids. It has the effect of giving the repressor thus transformed two functional properties: it can bind to the regulatory sequence represented by tetracycline operators by analogy to the wild repressor; however it is inversely regulated by tetracycline.
  • the so-called Tn repressor may be mentioned more particularly. 10 which belongs to class B.
  • the repressor used is derived from this repressor wild TnlO. More specifically, it is a Tn10 repressor mutated into at least one amino acid located in position 71, 95, 101 or 102.
  • the second polypeptide present in the protein can be any already known transcriptional activation domain.
  • it is the activation domain of protein 16 of the herpes simplex virus, more particularly of the 130 amino acids of the C-terminus of VP16 and more preferably of the 11 amino acids of this C terminal end of VP16 or of peptide portions of the C terminal part of VP16 (Sceipel K. et al EMBO J. 1992; 13, 4961-4968) or of derivatives.
  • the expression cassette for this transcription activator is preferably integrated into the genome of a cell line 293.
  • this transcription activator is also placed, in the cell line, under the control of a promoter inducible to tetracycline or one of its analogs as defined above. More preferably, it is a 293 cell line integrating in its genome the cassette Op2 / Tk-TetR-VP16.
  • the present invention also relates to a cell line comprising in its genome an expression cassette for a transcription activator as defined above, whether or not comprising an inducible promoter as defined according to the invention. More preferably, it is a cell line integrating into its genome the O ⁇ 2 / Tk-TetR-VP16 cassette.
  • the invention also relates to the use of this type of cell line for producing adenoviruses according to the invention or AAVs.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of adenoviruses comprising at least one of their genes whose expression is under the control of a promoter inducible by tetracycline.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared in different ways.
  • a first method consists in transfecting the DNA of the defective recombinant virus prepared in vitro (either by ligation or in the form of a plasmid) in a competent cell line, that is to say carrying in trans all the functions necessary for complementation virus, and a transcription activator. These functions are preferably integrated into the genome of the cell, which makes it possible to avoid the risks of recombination, and confers increased stability on the cell line.
  • the DNA of the defective recombinant virus carrying the appropriate deletions, one or more viral genes under the control of an inducible promoter tetracycline and one or more therapeutic genes.
  • the deletions are generally carried out on the DNA of the defective recombinant virus, by carrying out digests using appropriate restriction enzymes, then ligations, according to molecular biology techniques, as illustrated in the examples.
  • the viral or therapeutic genes and the inducible promoter can then be inserted into this DNA by enzymatic cleavage then ligation, at the level of the selected regions and in the chosen orientation.
  • the DNA thus obtained which therefore carries the appropriate deletions, one or more viral genes under the control of a promoter inducible to tetracycline and one or more therapeutic genes makes it possible to directly generate the claimed recombinant adenovirus.
  • the DNA of a first recombinant virus carrying the appropriate deletions (or a part of said deletions) and an inducible promoter such as for example Op2 / Tk is constructed, by ligation or in the form of a plasmid. This DNA is then used to generate a first recombinant virus carrying said deletions with an inducible promoter.
  • the DNA of this first virus is then isolated and co-transfected with a second plasmid or the DNA of a defective second recombinant virus carrying the appropriate deletions in particular a deletion in the E1 region, a region allowing homologous recombination and the case if necessary, a therapeutic gene.
  • This second step thus generates the recombinant virus according to the invention.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising one or more recombinant adenoviruses as described above.
  • compositions of the invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation can be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 * 4 pfu / ml, and preferably 10 ⁇ to 10 ⁇ pfu / ml.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of a culture appropriate cell count, and measuring, usually after 5 days, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the adenoviruses of the invention can be used for the treatment or prevention of many pathologies. They are particularly advantageous for the treatment of hyperproliferative pathologies (cancers, restenosis, etc.), by direct injection at the site concerned.
  • the present invention also relates to a method for the destruction of proliferative cells comprising the infection of said cells or of a part of them with an adenoviral vector as defined above.
  • the suicide gene is a gene which confers sensitivity to a therapeutic agent
  • the method of destruction according to the invention then comprises the treatment of the cells with said therapeutic agent.
  • the invention also relates to products comprising a recombinant adenovirus as defined above in which the suicide gene is a gene conferring sensitivity to a therapeutic agent; and said therapeutic agent, as a combination product for simultaneous, separate or spread over time use for the treatment of hyperproliferative pathologies.
  • the suicide gene is a thymidine kinase gene and the therapeutic agent is gancyclovir or acyclovir or an analog.
  • Recombinant vectors according to the invention have particularly attractive properties for use in gene therapy. These vectors indeed combine very high infection, safety and gene transfer properties.
  • Figure 1 Genetic organization of the Ad5 adenovirus. The complete sequence of Ad5 is available on the database and allows those skilled in the art to select or create any restriction site, and thus to isolate any region of the genome.
  • Figure 2 Genetic organization of the E4 region.
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham. Enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique
  • the verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • - Human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). This line contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of the human adenovirus Ad5 (12%).
  • - Human cell line KB From a human epidermal carcinoma, this line is accessible to the ATCC (ref. CCL17) as well as the conditions allowing its culture.
  • Hela Human cell line Hela: From a carcinoma of the human epithelium, this line is accessible to the ATCC (ref. CCL2) as well as the conditions allowing its culture.
  • MDCK canine cell line The culture conditions for MDCK cells have been described in particular by Macatney et al., Science 44 (1988) 9.
  • DBP6 cell line (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). This line consists of Hela cells carrying the E2 gene of adenovirus under the control of the LTR of MMTV.
  • This plasmid carries the sequence of the minimum promoter Tk preceded by two sequences of the tetracycline operator, these sequences are recognized by the tetracycline repressor when it is attached to tetracycline.
  • the plasmid pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481) is digested with Clal-BamHI and the sequence SEQ ID No. 5, comprising two tetracycline operators upstream of a minimum thymidine kinase promoter, is introduced between these two sites.
  • This plasmid is obtained by ClaI digestion of the plasmid ⁇ IC20H / Op2Tk and insertion of an Hpa2 fragment containing the ITR of Ad5 (coordinates: 1 / + 122).
  • This fragment comes from the commercial vector pSL1180 (Pharmacia) digested with Hind3, site into which the ITR produced by PCR is introduced. with Hind3 sites on each side of the amplified fragment.
  • rTR-Op2-TKprom The following order: rTR-Op2-TKprom.
  • This plasmid corresponds to the plasmid pIC20H / ITR-Op2Tk digested with Hind3, site into which is inserted the Nhe-Xbal fragment of PY6 containing the E4 region of Ad5.
  • plasmid ⁇ PY6 it is obtained according to the following protocol:
  • a plasmid pPY2 is prepared from the plasmid pIC20H.
  • This plasmid pPY2 corresponds to the cloning of the Avr2-SalI fragment (approximately 1.3 kb including the MMTV promoter) of the plasmid pMSG (Pharmacia) between the Xbal and Sali sites of the plasmid pIC20H prepared from an E. coli dam + context.
  • the plasmid pPY4 is derived from the plasmid pPY2 by deletion of a 35 bp fragment after cleavage with BamHI and Bgl2 and then religation.
  • the plasmid pPY5 corresponds to the plasmid pIC20H in which the Taql-Bgl2 fragment including the E4 region of the adenovirus type 5 located between positions 35576 (Taql) and 32490 (Bgl2), was cloned between the ClaI and BamHI sites.
  • the E4 region of the plasmid pPY5 is therefore included in an EcoRV-Sphl fragment which it is cloned after partial digestion between the SmaI and SphI sites of the plasmid pPY4, which generates the plasmid pPY6.
  • the plasmid pIC20H / ITR-Op2Tk-E4-L5 is digested with Xbal and Nrul to recover the corresponding fragment which carries ITR, Op2, the Tk promoter, E4 and L5 in order.
  • This fragment is inserted into the Xbal and Nrul sites of the plasmid pYG4 which contains the entire sequence of the adenovirus from the Xbal site to the Sphl site.
  • This plasmid pYG4-EP is a vector pIC20H in which the Sphl-Xbal fragment of Ad5 (coordinates: 25095-28590) is inserted between its Sphl and Xbal sites.
  • This pYG4-EP vector, deleted from the E3 viral adeno region has sufficient adenoviral sequences between the Sphl and Xbal sites to allow the complementary recombination of the adenovirus for the production of a recombinant adenovirus.
  • This intermediate plasmid makes it possible to introduce an EcoRI site downstream of Op2-Tk.
  • the presence of a restriction site in this position has two advantages. It is used to introduce this promoter upstream of rep-cap after having deleted the p5 promoter and it also makes it possible to insert this hybrid promoter upstream of TetR-VP16 for the preparation of a transformed 293 cell line as described in Example 3 below. -after.
  • the plasmid pIC20H / Op2-Tk obtained according to the protocol described in Example 1, is digested with BamHI, treated with T4 DNA polymerase to make the ends blunt and then redigested by EcoRV, the fragment originating from this digestion and carrying the Op2-Tk promoter is introduced into the EcoRV site of the commercial plasmid pBSSK +.
  • the orientation of the fragment is selected for the presence of an EcoRI site downstream of the promoter.
  • an EcoRI site is introduced at the +1 transcriptional level of the p5 promoter upstream of the coding sequence of Rep78 by the PCR technique on the plasmid ⁇ AV2 (Laughlin C, Gene (1983), 23, 69- 73). This reaction was carried out using the oligonucleotides:
  • This intermediate plasmid makes it possible to join the inducible promoter with rep.
  • the SalI-EcoRI fragments of pXL2630 and EcoRI-NruI of pMA4 are introduced at the Xhol (compatible with SalI) and Nrul sites of pIC20R (Marsh et al., Gene 22 (1984) 481) to give the plasmid pMA6.
  • the fragment thus generated of the plasmid pCA which contains the left end of the genome of the adenovirus Ad5 was then cloned between the EcoRI and Smal sites of the vector pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). This generates the plasmid pCB.
  • the plasmid pCB was then cut with EcoRI, its prominent 5 'ends were filled with the klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli, then it was cut with BamHI.
  • the fragment thus generated of the plasmid pCB which contains the left end of the genome of the adenovirus Ad5 was then cloned between the Nrul and BglII sites of the vector pIC20H. This generates the plasmid pCE, an interesting characteristic of which is that it has the first 382 base pairs of the adenovirus Ad5 followed by a cloning multisite.
  • the Sau3A (3346) - SstI (3645) fragment and the SstI (3645) - Narl (5519) fragment of the Ad5 adenovirus genome were first ligated and cloned between the ClaI and BamHI sites of the vector pIC20H, this which generates the plasmid pPY53.
  • the Sali- fragment Taql of the plasmid pPY53 prepared from a dam- context, containing the part of the genome of the adenovirus Ad5 between the Sau3A (3346) and Taql (5207) sites was then cloned between the SalI and ClaI sites of the vector pIC20H , which generates the plasmid pCA '.
  • the Narl (5519) - Nrul (6316) fragment of the Ad5 adenovirus genome prepared from a dam context and the Sall-Narl fragment of the pCC plasmid were then ligated and cloned between the SalI and Nrul sites of the vector. pIC20R. This generates the plasmid pCD '.
  • the EcoRV-SnaBI fragment of pMA6 carrying AAV Op2-Tk-rep-cap-polyA + (up to the SnaBI site position 4495 on the AAV sequence) is introduced into the EcoRV site of pCO1 in the two orientations by compared to the adenovirus ITR.
  • the plasmids thus obtained are designated pMA7 (orientation of the cassette in the opposite direction to the ITR of the adenovirus) and pMA8 (same orientation).
  • This section describes the construction of a defective recombinant adenovirus carrying the AAV's Op2-Tk-rep-cap-polyA + cassette.
  • This adenovirus is obtained by co-transfection of the plasmid pMA7 or pMA8 with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the El (E1A and E1B) regions of adenovirus.
  • the adenoviruses AdMA7 and AdMA8 were prepared by homologous in vivo recombination between the adenovirus AdRSV ⁇ gal and the plasmids pMA7 and pMA8 according to the following protocol: the plasmid pMA7 or pMA8 linearized by Ndel and the adenovirus AdRSVBgal linearized with Clal are cotransfected in line 293 in the presence of calcium phosphate to allow recombination. The recombinant adenoviruses thus generated are selected by plaque purification.
  • the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 1010 pfu / ml.
  • the viral particles are centrifuged on a cesium chloride gradient according to known techniques (see notably Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • the AdMA7 or AdMA8 adenovirus is stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • the plasmid pMA28 contains the entire sequence of Ad (E1-, E3-) carrying Op2: Tk repcap polyA + AAV in the E3 region. It was constructed by recombination in E. Coli by introducing the plasmid pMA24 for example in the strain C2110 (pXL2638) (El-, E3-) described in application PCT / FR96 / 00215 included here by reference.
  • the Xbal-Xbal fragment of the pMA7 plsmid carrying Op2: Tk repcap polyA + AAV was introduced at the Xbal site of pYG4-EP in place of the E3 region so that Op2: Tk repcap polyA + AAV is in the reverse orientation that of the E3 region.
  • the palsmide thus constructed is pMA22. 8.2 Construction of the plasmid pMA24 used to carry out the recombination in E.coli:
  • the Nhel-Spel fragment of pMA22 containing the Op2 Tk repcap polyA + AAV cassette flanked by sequences from 27082 to 28593 and from 3471 to 31509 of the Adenovirus was introduced at the compatible site of the plasmid pXL2756 to generate the plasmid pMA24 carrying the regions necessary for the recombination surrounding the Op2 cassette: Tk repcap polyA + AAV, the sacB gene of B. subtilis and the kanamycin resistance gene.
  • This plasmid was then transfected into 293 cells after digestion with Pacl
  • This part describes the construction of a line 293 carrying integrated in its genome the cassette of the hybrid transactivator TetR-VP16 under the control of the promoter Op2-Tk.
  • the plasmid pMA2 was constructed to establish a line by cotransfection of this plasmid pMA2 with a plasmid pMSCV (Hawley et al. J.Exp.Med. (1993), voll76, 1149-1163) carrying the resistance gene neomycin under the control of the promoter PGK (phosphoglyceratekinase).
  • pMA2 is constructed by inserting the SalI-EcoRI fragment from pXL2630 between the XhoI-EcoRI compatible sites of a plasmid pUHD17.1.
  • the plasmid pUHD17.1 is a plasmid comprising the sequences coding for a mutant tetracycline repressor operably linked to the sequence VP16.
  • This vector is derived from the vector pUHD15.1 (H. Bujard; PNASUSA 1992, 89, 55476-5551) which comprises the sequence of the tetracycline repressor W wO w 9 ? 7 / / / 0 ⁇ 0 ⁇ 9v4 ⁇ 7 / PCT / FR96 / 00968
  • the 293 Op2-Tk-TetR-VP16 line of the invention was constructed by co-transfection of the selected cells in the presence of calcium phosphate, by the plasmids pMA2 and pMSCV and a construct coding for the glucocorticoid receptor (Hollenberg and al, 1985). More specifically, the cells of line 293 in dishes 5 cm in diameter were transfected with 1 to 5 ⁇ g of plasmid pMA2.
  • the cells After transfection of the cells, these are washed, then the culture medium (MEM, Sigma) supplemented with fetal wish serum (7% final) is added and the cells are incubated for 20 hours. The following day, the cells are selected in the presence of geneticin G418 (Gibco-BRL, Life Technologies) at the
  • a number of clones were isolated, amplified and selected for their capacity to express a reporter gene, for example lacZ, under the control of the Op2-Tk promoter after addition of an appropriate concentration of tetracycline.
  • the plasmid used is pMA9 and was constructed by the introduction of a StuI-BamHI fragment from pRSVgalIX carrying the sequence coding for E. coli ⁇ -galactosidase and a signal nuclear localization in the plasmid pMA2 previously linearized with EcoRI; treated with bacteriophage T4 DNA polymerase to make its ends blunt and then digested with BamHI.
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.
  • ATCGATACTT TTCTCTATCA CTGATAGGGA GTGGTCTCGA GACTTTTCTC TATCACTGAT 60

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Abstract

La présente invention concerne un adénovirus recombinant dans lequel l'expression d'une séquence nucléique codant pour au moins ungène d'origine virale, homologue ou hétérologue, est placée sous contrôle d'un promoteur inductible. Elle se rapporte en outre à l'utilisation de ces adénovirus recombinants pour préparer des AAV, à une lignée cellulaire complémentaire et un procédé de préparation correspondants. Elle vise également des compositions pharmaceutiques contenant un adénovirus selon l'invention.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTS. LEUR UTILISATION POUR PREPARER
DES AAV. LIGNEE CELLULAIRE COMPLEMENTAIRE ET COMPOSITIONS
PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux, leur préparation et leurs utilisations. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs viraux.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de Hpides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
En ce qui concerne plus particulièrement les adénovirus, il s'agit de virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation, des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (El a et Elb notamment) sont nécessaires à la réplication virale. Les régions E4 et L5 par exemple sont impliquées dans la propagation virale et les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions LI à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adenovirus de sérotypes différents (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont également été séquencées. Ces vecteurs viraux présentent avantageusement un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Compte tenu de leurs propriétés, ils ont déjà été utilisés pour le transfert de gènes in vivo. A cet effet, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (β-gal, OTC, α-lAT, cytokines, etc).
Bien entendu, l'ensemble de ces vecteurs viraux comportent de nombreux gènes viraux dont l'expression n'est en revanche pas souhaitable en thérapie génique. Il est impératif de contrôler in vivo la non expression de gènes viraux sauvages et/ou de protéines qui en dérivent et qui sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire et/ou inflammatoire indésirable voire totalement néfaste à l'égard de l'organisme traité.
A ces fins, les constructions de vecteurs viraux actuellement proposées sont modifiées de manière à rendre lesdits vecteurs incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Ils sont dits défectifs. Généralement, le génome des virus défectifs est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par une séquence codant pour une molécule d'intérêt thérapeutique. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Dans le cas particulier des adénovirus recombinants, les constructions décrites dans l'art antérieur sont généralement des adénovirus délétés des régions El (El a et/ou Elb) et éventuellement E3 au niveau desquelles sont insérées les séquences d'ADN hetérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). D'autres constructions comportent une dêlétion au niveau de la région El et d'une partie non essentielle de la région E4 (WO 94/12649). Ces adénovirus recombinants défectifs peuvent être préparés de différentes façons mettant en oeuvre ou non une lignée cellulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives essentielles à la réplication de l'adénovirus recombinant. Actuellement, les vecteurs dérivés des adénovirus sont généralement produits dans une lignée de complémentation (lignée 293) dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 contient l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation et la région El, incluant Ela, Elb et une partie de la région codant pour la protéine pIX. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, nécessaire à la réplication.
Toutefois, on ne peut totalement exclure lors de la production de ces vecteurs viraux défectifs la possibilité de recombinaisons générant des particules virales replicatives ou des transcomplémentations in vivo par des fonctions cellulaires de type El. Il est évident que ce type d'événement est totalement incompatible avec leur utilisation subséquente en thérapie génique. La présence, in vivo, de particules virales replicatives peut avoir des conséquences très néfastes comme par exemple induire une propagation virale et provoquer une dissémination incontrôlée avec des risques de réaction inflammatoire, de recombinaison, etc...
Parallèlement, il est impératif de prévenir in vivo l'expression de protéines virales correspondantes. Bien que ne présentant pas nécessairement un caractère toxique à l'égard de la cellule, elles sont également fortement indésirables car susceptibles également d'induire des réponses du système immunitaire de type inflammation et/ou fièvres préjudiciables à l'égard de l'organisme traité. (D.Y. Schwarz, (1995), P.N.A.S 92, 1401-1405 ; J. F. Engelhardt, (1994), Human Gene Therapy, 5, 1217-1229 et (1994) P.N.A.S. 91, 6196-6200 ; Y. Yang, (1994), Immunity, 1, 433-442, (1995) J. Virol., 69, 2004-2015 et Nature Genetics, (1994) 7, 362-369). La présente invention a précisément pour objet de proposer une solution permettant de remédier à ces inconvénients et s'avère tout particulièrement utile pour préparer des lots de virus de type adénovirus présentant une sécurité accrue car notamment dépourvus de particules virales replicatives.
De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible, à l'aide d'un système promoteur original, de contrôler efficacement l'expression des gène viraux, expression qui est effective in vitro lors de la production virale mais en revanche ineffective ultérieurement, in vivo, lors de l'emploi thérapeutique desdits virus recombinants.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à un adénovirus recombinant dans lequel l'expression d'au moins un gène d'origine virale, homologue ou hetérologue, est contrôlée par un promoteur inductible.
Au sens de la présente invention, on entend par promoteur inductible tout promoteur dont l'activité est initiée par la présence d'un agent chimique et/ou biologique extérieur, agent qui, dans le cadre de la présente invention présente en outre une toxicité réduite voire nulle. Par "extérieur", il est entendu que l'agent chimique et/ou biologique n'existe pas naturellement dans les cellules traitées avec l'adénovirus revendiqué.
A titre de promoteurs inductibles susceptibles d'être mis en oeuvre selon la présente invention, on peut notamment citer les promoteurs classiques tels que ceux répondant à des métaux lourds (CRC Boca Raton, FL (1991), 167-220 ; Brinster et al.
Nature (1982), 296, 39-42), à des chocs thermiques, à des hormones, (Lee et al.
P.N.A.S. USA (1988), 85, 1204-1208; (1981), 294, 228-232 ; Klock et al. Nature
(1987), 329, 734-736 ; Israël & Kaufman, Nucleic Acids Res. (1989), 17, 2589-2604) ou à des agents chimiques de type glucose, lactose, galactose ou antibiotiques.
Tout récemment, il a été décrit un promoteur inductible par la tétracycline particulièrement avantageux dans le cadre de la présente invention. Ce promoteur, dit promoteur inductible à la tétracycline, comprend un promoteur minimal lié opérationnellement à un ou plusieurs opérateur(s) de la tétracycline. C'est la liaison, aux séquences opérateurs de la tétracycline, d'une protéine dite "activateur de transcription", liaison qui ne s'établit qu'en présence de tétracycline ou un de ses analogues, qui permet l'activation du promoteur minimal et donc la transcription du ou des gènes viraux associés.
En ce qui concerne plus particulièrement la protéine dite activateur de transcription, elle se caractérise donc par son aptitude à se lier, en présence de tétracycline, aux séquences opérateurs du promoteur inductible par la tétracycline et sa capacité à activer le promoteur minimal. Plus préférentiellement, il s'agit d'une protéine constituée de deux polypeptides, un premier polypeptide qui se lie aux séquences tet opérateur, en présence de tétracycline ou d'un analogue de celle-ci, et un second polypeptide dont la fonction est plus spécifiquement d'activer ladite transcription. Le premier polypeptide de la protéine dite activateur de transcription est un répresseur de la tétracycline muté de manière à manifester un comportement inverse à celui d'un répresseur sauvage c'est-à-dire qu'il ne se lie aux séquences tet opérateurs qu'en présence et non en absence de tétracycline. Quant au second polypeptide, il s'agit préférentiellement du domaine d'activation de la protéine 16 du Virus Herpès Simplex. Dans le cas où le promoteur inductible utilisé est par exemple inductible au glucose ou galactose, on peut envisager de mettre en oeuvre un activateur de transcription construit sur ce modèle c'est-à-dire par exemple Glu-VP16 ou Gal4- VP16.
~ Selon un mode préféré de l'invention, le promoteur inductible mis en oeuvre est un promoteur inductible à la tétracycline ou un de ses analogues tel que décrit ci-dessus.
Au sens de la présente invention, un promoteur inductible par la tétracycline comprend un promoteur minimal lié opérationnellement à une séquence dite de régulation comprenant au moins un opérateur de la tétracycline "tet opérateur" ou de l'un de ses analogues. Par analogue de la tétracycline, on entend couvrir tout composé présentant des homologies structurales avec la tétracycline et étant capable de se lier à son récepteur lié au domaine de transactivation de la protéine dite activateur de trancription présentée ci-dessus, avec un Ka d'au moins environ IO6 M"1. A titre d'analogues susceptibles d'être utilisés selon la présente invention on peut notamment citer la doxycycline, la chlorotétracycline et ranhydrotétracycline.
Par promoteur minimal, on entend désigner toute séquence promotrice qui seule n'est pas capable d'assurer efficacement la transcription de la séquence d'ADN qυi lui est associée. L'activité d'un tel promoteur s'avère totalement dépendante de la liaison de la protéine activateur de transcription à la séquence dite de régulation, en présence de tétracycline. En fait, ce promoteur minimal a surtout pour fonction d'orienter la transcription. Dans cette perspective, il est de préférence situé en amont de la séquence virale de manière à former avec elle une séquence nucléotidique continue. Ce promoteur minimal peut dériver du promoteur immédiatement précoce du Cytomegalovirus humain et plus préférentiellement est compris entre les nucléotides +75 à -53 ou +75 à -31. Toutefois, il est également possible d'employer selon l'invention un promoteur minimal dérivant d'un promoteur conventionnel comme par exemple celui activant la transcription du gène codant pour la thymidine kinase.
Un promoteur conventionnel peut également être rendu minimal par le biais d'une ou plusieurs mutations génétiques qui le rendent incapable d'assurer seul efficacement la transcription du gène qui lui est associé. Il peut également être mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, un promoteur minimal dérivant directement du promoteur naturellement responsable de l'expression du gène viral considéré. On peut également envisager l'utilisation d'un promoteur dit "TATA-less" tel que décrit par E. MARTINEZ et al. (EMBO Journal, (1994), 13, N°13, 3115- 3126) de manière à obtenir un bruit de fond le plus basai possible dans la situation non induite. De manière générale, ce promoteur irunirnal est placé en amont de la séquence nucléotide dont il contrôle l'expression, en substitution ou non de son promoteur naturel. Le propre promoteur de la séquence nucléique peut en effet demeurer présent mais sous une forme inactivée ou rendue non fonctionnelle par différentes techniques connues de l'homme de l'art et notamment par suppression, dêlétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases.
Selon un mode particulier de l'invention, le promoteur iriinimal dérive du promoteur minimal de la thymidine kinase du Virus Herpès Simplex (Me Knight et al. (1984) Cell 37:253-262). Il est alors désigné par Tk. Plus préférentiellement, il est représenté en tout ou partie par l'une des séquences représentées en SEQ ID N° 1 ou N° 2 ou l'un de leurs dérivés.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de séquences données et conservant l'activité recherchée. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on doit entendre toute mutation, substitution, dêlétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs acide nucléique.
En ce qui concerne la séquence dite de régulation, elle comprend au moins un opérateur de la tétracycline ou l'un de ses analogues. Le ou les opérateurs sont reconnus par l'activateur de transcription en présence de tétracycline et permettent donc de ce fait l'activation du promoteur minimal.
Les séquences tet opérateur pouvant être mises en oeuvre peuvent notamment être choisies parmi celles décrites par Hillen & Wissemann (Protein- Nucleic Acid Interaction, Saeger& Heinemann, eds., Macmillan, London, (1989), 10, 143-162), Waters et al. (Nucleic Acids Res. (1983), 11, 525-539), Stuber et al. (P.N.A.S. USA, (1981), 78, 167-171), Unger et al. (Nucleic Acids Res. (1984), 12, 7693-7703) et Tovar et al. (Mol. Gen . Genêt. (1988), 215, 76-80).
La séquence de régulation peut comprendre une unique séquence tet opérateur ou au contraire plusieurs séquences tet opérateur pouvant atteindre jusqu'au nombre de 10 selon que l'on souhaite ou non augmenter la régulation de la transcription. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence de régulation met en oeuvre 2 séquences tet opérateur. Elle sera alors dite Op2.
Plus préférentiellement, la séquence de régulation est représentée en tout ou partie par l'une des séquences représentées en SEQ ID N° 3 ou N° 4 ou l'un de leurs dérivés.
Classiquement, cette séquence de régulation est liée opérationnellement en amont c'est-à-dire à l'extrémité 5' du promoteur minimal de manière à permettre la transcription du gène d'origine virale, en présence du complexe formé par l'activateur de transcription et de son ligand tétracycline. On a ainsi successivement, dans l'orientation 5' à 3', la séquence de régulation, liée directement ou non au promoteur minimal, le promoteur minimal et le gène d'origine virale. Toutefois, on peut également envisager de placer cette séquence de régulation, au sein du promoteur minimal, en aval de la séquence nucléotide virale à transcrire c'est-à-dire à son extrémité 3'. L'ordre de succession est alors dans le sens 5' à 3', promoteur minimal, gène viral et séquence de régulation.
Selon un mode préféré de l'invention, le promoteur inductible à la tétracycline associe au promoteur minimal de la thymidine kinase dit Tk, une séquence de régulation représentée par Op2. Il est dans ce cas particulier identifié ci-après sous la dénomination Op2/Tk. Plus préférentiellement, le promoteur inductible mis en oeuvre selon l'invention est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N° 5 ou l'un de ses dérivés.
Ce promoteur inductible à la tétracycline Op2/Tk et plus particulièrement celui représenté en tout ou partie par la SEQ ID N° 5 ou l'un de ses dérivés, constituent également un des objets de la présente invention.
En conséquence, l'expression du ou des gènes viraux liés opérationnellement, dans l'adénovirus revendiqué, à un promoteur inductible, est totalement subordonnée à la fixation du complexe formé par l'activateur de transcription et la tétracycline, sur la séquence de régulation dudit promoteur.
Cette fixation n'est effective qu'en présence de tétracycline. En absence de tétracycline ou de tout analogue de celle-ci, il n'y a pas de liaison établie entre la séquence de régulation et l'activateur de transcription. Il s'en suit aucune transcription de la séquence virale liée au promoteur minimal. Qui plus est, avantageusement, l'agent induisant la transcription n'a pas à être présent continuellement.
Un des objets de la présente invention concerne plus particulièrement un adénovirus comprenant au moins un gène homologue c'est-à-dire adenoviral dont l'expression est contrôlée par un promoteur inductible et plus préférentiellement par un promoteur inductible à la tétracycline.
Ainsi, dans un mode particulier, la présente invention a pour objet un adénovirus recombinant dont au moins une région génomique essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale est placée en tout ou partie sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline. La région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale selon la présente invention est avantageusement choisie parmi tout ou partie de la région E4, E2, la région IVa2 et/ou la région L5, etc.
Selon un mode particulièrement avantageux, les adénovirus recombinants de la présente invention, comprennent à titre de séquences nécessaires à la réplication et/ou la propagation, tout ou une partie fontionnelle des régions E2 ou E4. Plus particulièrement, s'agissant de la région E4, les gènes importants sont les gènes ORF3, ORF6 et ORF6/7.
La région E2 est impliquée dans la régulation de l'ADN viral. Cette région E2 est constituée de deux sous unités de transcription E2A et E2B. La région E4 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des mutants dépourvus de E4 sont incapables de se propager. E4 constitue ainsi une région essentielle à la propagation virale. Cette région E4 est constituée de 7 phases ouvertes de lecture, désignées ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 et ORF6/7 (figure 2). Parmi celles-ci, ORF3 et ORF6 sont les deux gènes essentiels à la propagation virale. Chacun de ces gènes est capable d'induire la propagation virale, ORF6 y jouant toutefois un rôle plus important que ORF3 (Huang et Hearing (1988), J. Virol. 63, 2605).
Dans un mode particulier, dans les vecteurs de l'invention, la totalité de la région considérée est placée sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline. Dans le cas particulier de la région E2, il peut s'agir d'un fragment correspondant à l'ADNc de la 72K, à l'ADNc de la polymérase de 140K ou à l'ADNc de la protéine pré-terminale de 87K. En ce qui concerne la région E4, il peut s'agir en particulier du fragment Taql-Bgl2 correspondant aux nucléotides 35576 -32490.
Dans un autre mode particulier, seule l'expression d'une partie fonctionnelle de ces régions c'est-à-dire suffisante pour permettre la propagation virale, est contrôlée. Dans le cas particulier de E4, cette partie comprend au moins un gène ORF3 ou ORF6 fonctionnel. Préférentiellement, la partie fonctionnelle de E4 est constituée essentiellement de ORF6. A titre d'exemple, le fragment Bgl2, compris entre les positions 34115 à 32490 et contenant les séquences des ORF6 et ORF7 de l'Ad5 peut être positionné en aval d'un promoteur inductible tel que défini selon l'invention.
Dans un autre mode particulier de la présente invention, la région essentielle est constituée de la région codant pour la protéine IVa2 et par exemple son ADNc. Dans un autre mode de réalisation, la région codant pour la protéine IVa2 est comprise dans un fragment BglII-NruI correspondant aux nucléotides 3328 à 6316 sur la séquence de l'adénovirus Ad5 sauvage, un fragment Dral-NlalII correspondant aux nucléotides 4029 à 5719 ou un fragment dral à Xhol correspondant aux nucléotides 4029 à 5788.
Selon un mode préféré de l'invention, les promoteurs des régions essentielles à la propagation virale sont remplacés au sein du génome viral par un promoteur inductible et plus préférentiellement par un promoteur inductible à la tétracycline. Dans un premier mode particulier de réalisation, les adénovirus recombinants de l'invention portent une dêlétion de tout ou partie du gène El et possèdent la région E4, en tout ou partie, sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline, de préférence de type Op2/Tk. Dans un autre mode particulier de réalisation, les adénovirus recombinants de l'invention portent une dêlétion de tout ou partie du gène El et possèdent la région E2 en tout ou partie sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline, de préférence de type Op2/rk.
Toujours selon un mode préféré de réalisation, les adénovirus recombinants de l'invention portent une dêlétion de tout ou partie des gènes El et E2 et possèdent la région E4 en tout ou partie sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline, de préférence de type Op2/Tk.
Dans une variante particulièrement avantageuse, les adénovirus recombinants de l'invention portent une dêlétion de tout ou partie des gènes El et E4 et possèdent la région E2 en tout ou partie sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline, de préférence de type Op2/Tk.
Avantageusement, les adénovirus recombinants de l'invention comportent en outre une séquence d'acides nucléiques hetérologue comportant un ou plusieurs gènes thérapeutiques dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché.
Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique.
Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits proteiques ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle- ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hetérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de cioissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une mini dystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), etc.
Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires comme les ribozymes. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.
Le gène thérapeutique peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation de vaccins permettant d'immuniser l'homme, notamment contre des microorganismes ou des virus. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Généralement, la séquence d'acides nucléiques hetérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadenylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement resoonsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hetérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hetérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. Cette séquence d'acides nucléiques est de préférence présente au niveau des régions El, E3 ou E4, en supplément ou en remplacement de séquences délétées.
La présente invention a pour second objet principal un adénovirus comportant au moins un gène d'origine virale hetérologue dont l'expression est contrôlée par un promoteur inductible et plus préférentiellement un promoteur inductible à la tétracycline. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention le gène d'origine virale hetérologue est ou dérive d'un gène du génome d'un AAV ou un de ses homologues fonctionnels.
Les AAV sont des virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont également capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend 4680 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène eap codant pour les protéines de capside du virus. Trois promoteurs y ont été localisés et nommés selon leur position approximative en unités cartographiques p5, pl9 et p40. Quatre protéines sont au moins synthétisées à partir de la région rep et ont été nommés d'après leur masse moléculaire apparente, Reρ78, Rep68, Rep52 et Rep40. Les 2 mRNA transcrits à partir du promoteur p5 sont utilisés pour la synthèse de Rep78 et Rep68. Quant à Rep52 et Rep40 ils sont synthétisés à partir des messagers provenant du promoteur pl9. En ce qui concerne plus particulièrement le gène cap, il code pour les protéines de la capside du virus (VP1, VP2 et VP3). VP3 est la protéine de capside majoritaire et sa séquence en acides aminés est contenue dans celles de deux protéines plus grandes mais moins abondantes VP1 et VP2 ( faire un schéma). Ces gènes rep. et cjrj ont été caractérisés et leur séquences respectives décrites dans la littérature (Srivastava et al., J. Virol. 45 (1983) 555).
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Généralement, les constructions utilisées en thérapie génique contiennent une dêlétion des gènes rep et/ou cjp qui sont remplacés par un gène d'intérêt.
Pour se répliquer, les AAV ont besoin de la présence d'un virus auxiliaire ("helper") capable de transcomplémenter les fonctions nécessaires à leur réplication . H peut s'agir en particulier d'un adénovirus, d'un virus de l'herpès ou d'un virus de la vaccine. (En l'absence d'un tel virus auxiliaire, les AAV restent sous forme latente dans le génome des cellules infectées, mais ne peuvent se répliquer et ainsi produire des particules virales.) Classiquement, les AAV recombinants sont donc produits par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant le gène d'intérêt bordé de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. La co-infection avec l'adénovirus démarre une cascade d'événements qui aboutissent à la production de titres élevés d'AAV et diminuent sensiblement la production d'adenovirus. Cette cascade démarre par la synthèse du produit du gène Ela qui induit la transcription à partir des promoteurs p5 et pl9 et conduit à la synthèse d'une petite quantité de protéines Rep. Une ou plusieurs protéines Rep synthétisées à partir de p5 induisent alors la synthèse en quantité plus abondante d'ARNm à partir des 3 promoteurs à un niveau beaucoup plus important et d'une manière coordonnée. En absence d'adenovirus, le génome d'AAV est soit perdu soit intégré dans le chromosome de l'hôte. D'autres gènes que El A de l'adénovirus sont aussi nécessaires pour une expression efficace des gènes de l'AAV.
Avantageusement, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de placer efficacement au moins l'expression d'un des gènes viraux de l'AAV sous contrôle d'un promoteur inductible dans un adénovirus et plus préférentiellement de contrôler l'expression des fonctions d'encapsidation d'AAV en particulier l'expression des gènes rep et/ou cap, ou de tout gène homologue fonctionnel.
Un homologue fonctionnel correspond à tout gène obtenu par modification (mutation, suppression, addition, etc) des gènes rep ou cap et présentant une activité de même nature. De tels gènes homologues fonctionnels peuvent également être des gènes obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques au moyen de sondes correspondant aux gènes rgp ou cap. A titre de gène re_p muté susceptible d'être contrôlé selon l'invention, on peut plus particulièrement citer son mutant inll77 décrit dans la publication Y. Yang et al.,( (1992) Journal of virology, 6058- 6069) et dérivant d'une insertion de serines entre les codons 286 et 287.
Selon un mode préféré de l'invention, le promoteur inductible mis en oeuvre est un promoteur inductible à la tétracycline tel que défini précédemment.
Un tel adénovirus est avantageux à plusieurs titres : il simplifie considéra¬ blement sur le plan des manipulations, le procédé pour préparer des stocks en AAV. En effet, dans ce cas particulier, on met essentiellement en oeuvre que ledit adénovirus comportant les gènes rep et cap sous contrôle du promoteur inductible, un AAV recombinant et une lignée cellulaire adéquate. Enfin, les titres attendus en AAV à partir d'un tel adénovirus s'avèrent supérieurs à ceux obtenus selon un procédé classique.
Le promoteur inductible peut notamment être introduit en substitution d'un des promoteurs conduisant normalement l'expression du ou des gène(s) considéré(s) et en particulier en substitution du promoteur p5, pl9 ou p40. Le promoteur p5 semblant être le plus impliqué dans le démarrage de la cascade d'événements conduisant à la production du virus, on procède plus préférentiellement à sa substitution par un promoteur inductible par la tétracycline de préférence de type Op2/Tk. Avantageusement, une telle construction permet de verrouiller l'expression de rep et cap en absence de tétracycline
Les fonctions d'encapsidation d'AAV sous contrôle du promoteur inductible, peuvent être introduites dans différentes régions du génome de l'adénovirus revendiqué. Avantageusement, les fonctions d'encapsidation sont insérées dans une région ne perturbant pas la capacité du virus à transcomplémenter les AAV. Il est également possible d'insérer les fonctions d'encapsidation dans une région fonctionnelle du génome dudit adénovirus, laquelle région étant alors apportée en trans, soit par un plasmide, soit par la lignée cellulaire utilisée. Il est possible par exemple d'insérer le gène rgp, le gène cjp ou les gènes rsp et cjp au niveau des régions El ou E3 en remplacement ou supplément des séquences déletées.
Pour abolir toute fuite transcriptionnelle due à la proximité de la région ITR- psi, on peut en outre introduire une séquence dite séquence de régulation négative. Une telle séquence insérée notamment entre l'ITR gauche et la séquence psi de l'adénovirus revendiqué d'une part, et la séquence codant pour le promoteur inductible à la tétracycline permet d'endiguer toute activitation transcriptionnelle parasitaire de rep et cap, induite le cas échéant par l'enhancer situé dans l'ITR gauche de l'adénovirus et la séquence psi. A titre de séquences négatives pouvant être mises en oeuvre selon l'invention, on peut notamment citer celles identifiées dans le promoteur vimentine (Salvetti et al., (1993), Mol. Cell. Biol., 1676-1685) dans le promoteur interferon ( Whitemore et al. (1990), P.N.A.S., 87, 7799-7803), dans le gène de chaine 2 légère de la myosine cardiaque (Ruoquian-Shen et al. (1991), Mol. Cell. Biol., 1676-1685) et dans le promoteur albumine de souris (Herbst et al. (1990), Mol. Cell. Biol., 3896-3905).
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un adénovirus recombinant portant une cassette d'expression Op2/Tk-rep-cap.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de ces adénovirus intégrant une séquence virale d'origine AAV sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline pour préparer des AAV.
Dans un mode de réalisation préféré, les adénovirus objets de l'invention comprennent les séquences ITR et une séquence permettant l'encapsidation. Préférentiellement ces adénovirus possèdent en outre une région El non fonctionnelle.
Les séquences inversées répétées (ITR) constituent l'origine de réplication des adénovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences
ITR des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence ITR gauche correspond à la région comprenant les nucléotides 1 à 103 du génome.
La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à l'encapsidation de l'ADN viral. Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adenovirus recombinants défectifs selon l'invention. La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adénovirus, entre l'ITR gauche (5') et le gène El (Cf figure 1). Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire. La séquence nucléotidique de la séquence d'encapsidation des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence d'encapsidation correspond à la région comprenant les nucléotides 194 à 358 du génome.
Selon un mode particulièrement avantageux, dans les adénovirus recombinants de la présente invention, la région El est inactivée par dêlétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n° M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par dêlétion d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446.
Les adénovirus de l'invention peuvent être préparés à partir d'adenovirus d'origines diverses. Il existe en effet différents sérotypes d'adenovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Ainsi, les enseignements décrits dans la présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adenovirus.
Plus particulièrement, les adénovirus de l'invention peuvent être d'origine humaine, animale, ou mixte (humaine et animale). Concernant les adénovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents sérotypes d'adenovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
Comme indiqué plus haut, les adénovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adenovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adénovirus d'origine animale sont capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande WO 94/26914). La demanderesse a également montré que les adénovirus d'origine animale ne sont nullement trans-complémentés par des adénovirus d'origine humaine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en présence d'un adénovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse. L'utilisation d'adenovirus ou de régions d'adenovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles.
Les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les sérotypes 1 à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les différents sérotypes connus, et notamment ceux disponibles à l'ATCC (types 1 à 8) sous les référencesATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769. On peut également citer les adénovirus murins FL (ATCC VR-550) et E20308 (ATCC VR- 528), l'adénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340) ; l'adénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que notamment les adénovirus référencée à l'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
De préférence, parmi les différents adénovirus d'origine animale, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus ou des régions d'adenovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. Les adénovirus canins ont fait l'objet de nombreuses études structurales. Ainsi, des cartes de restriction complètes des adénovirus CAV1 et CAV2 ont été décrites dans l'art antérieur (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences ITR ont été clones el séquences (voir notamment Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241 ; Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
La présente invention se rapporte en outre à un procédé utile pour la préparation d'AAV.
Plus précisément, elle a pour objet un procédé de préparation d'AAV caractérisé en ce qu'il comprend la co-transfection, en présence de tétracycline ou un de ses analogues, d'une lignée cellulaire comprenant dans son génome la cassette d'expression d'un activateur de transcription, avec un adénovirus comprenant au moins un gène d'origine AAV sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline et, soit un virus recombinant dérivé de l'AAV soit un plasmide portant un transgène entre les ITR de l'AAV. Il s'agit plus préférentiellement d'un adénovirus comprenant à titre de gènes viraux heterologues les gènes rep et cap.
Le procédé selon l'invention met à profit la faculté d'induire l'expression de ces gènes rep et cap placés sous contrôle d'un promoteur inductible par la tétracycline au sein d'un adénovirus, en présence d'une quantité suffisante de la tétracycline et d'un activateur de transcription.
Comme explicité auparavant, ce procédé a pour avantage d'être simplifié sur le plan des manipulations par rapport à un procédé classique. Dans le cas présent, on ne met en oeuvre qu'une co-infection d'une lignée cellulaire par un adénovirus tel que revendiqué et un virus recombinant dérivé d'un AAV. Outre l'adénovirus transformé selon l'invention, ce procédé met en oeuvre une lignée cellulaire comportant dans son génome une cassette d'expression de la protéine dite activateur de transcription constitué d'un premier polypeptide capable de se lier, en présence de tétracycline ou un de ses analogues, à la séquence de régulation du promoteur inductible présent dans l'adénovirus, associé à un second polypeptide qui active la transcription.
En ce qui concerne plus particulièrement la protéine dite activateur de transcription, elle se caractérise donc par son aptitude à se lier, en présence de tétracycline, à la séquence dite de régulation et sa capacité à activer du promoteur minimal qui lui est associé. Comme explicité précédemment, il s'agit d'une protéine constituée de deux polypeptides, un premier polypeptide qui se lie aux séquences tet opérateur, en présence de tétracycline ou d'un analogue de celle-ci, et un second polypeptide dont la fonction est plus spécifiquement d'activer ladite transcription.
Selon un mode privilégié de l'invention, le premier polypeptide de la protéine dite activateur transcriptionnel est un répresseur de la tétracycline muté de manière à manifester un comportement inverse à celui d'un répresseur sauvage c'est-à-dire qu'il ne se lie aux séquences tet opératrices qu'en présence et non en absence de tétracycline. Ce type de mutation peut être effectué selon des techniques biologiques classiques de type mutagénèses. La différence en acides aminés entre le répresseur sauvage et le répresseur muté conforme à la présente invention peut consister en une substitution, dêlétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés. Elle a pour effet de conférer au répresseur ainsi transformé deux propriétés fonctionnelles: il peut se lier à la séquence de régulation figurée par des opérateurs tétracycline par analogie au répresseur sauvage ; en revanche il est régulé de manière inverse par la tétracycline.
De nombreuses classes de répresseurs sauvages de la tétracycline ont déjà été décrites dans la littérature parmi lesquelles on peut notamment citer les classes A, B, C, D et E. A titre représentatif de ces répresseurs, on peut plus particulièrement mentionner le répresseur dit Tn 10 qui appartient à la classe B. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention le répresseur mis en oeuvre dérive de ce répresseur sauvage TnlO. Plus précisément, il s'agit d'un répresseur TnlO muté en au moins un acide aminé localisé en position 71, 95, 101 ou 102.
Plus préférentiellement, il possède en tout ou partie, la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N° 8. Il sera dit TetR. En ce qui concerne le second polypeptide présent dans la protéine dite activateur de transcription, il peut s'agir de n'importe quel domaine d'activation transcriptionnel déjà connu. Selon un mode réalisation préféré de l'invention, il s'agit du domaine d'activation de la protéine 16 du virus herpès simplex, plus particulièrement des 130 acides aminés de l'extrémité C terminale de VP16 et plus préférentiellement des 11 acides aminés de cette extrémité C terminale de VP16 ou encore de portions peptidiques de la partie C terminale de VP16 (Sceipel K. et al EMBO J. 1992 ; 13, 4961-4968) ou de dérivés.
Dans le cas du procédé de production d'AAV revendiqué, la cassette d'expression de cet activateur de transcription est de préférence intégrée dans le génome d'une lignée cellulaire 293.
Selon un mode préféré de l'invention, l'expression de cet activateur de transcription est également placée, dans la lignée cellulaire, sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline ou un de ses analogues tel que défini précédemment. Plus préférentiellement, il s'agit d'une lignée cellulaire 293 intégrant dans son génome la cassette Op2/Tk- TetR-VP16.
La présente invention a également pour objet une lignée cellulaire comportant dans son génome une cassette d'expression d'un activateur de transcription tel que défini précédemment comprenant ou non un promoteur inductible comme défini selon l'invention. Plus préférentiellement, il s'agit d'une lignée cellulaire intégrant dans son génome la cassette Oρ2/Tk- TetR-VP16.
L'invention se rapporte également à l'utilisation de ce type de lignée cellulaire pour produire des adénovirus selon l'invention ou des AAVs. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'adenovirus comportant au moins un de leurs gènes dont l'expression est sous contrôle d'un promoteur inductible par la tétracycline.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés de différentes façons.
Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus, et un activateur de transcription. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui permet d'éviter les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire.
Ensuite, les vecteurs qui se sont multipliés en présence d'une quantité suffisante en tétracycline ou l'un de ses analogues, sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Selon une variante de mise en oeuvre, il est possible de préparer in vitro, soit par ligature, soit sous forme de plasmide, l'ADN du virus recombinant défectif portant les délétions appropriées, un ou plusieurs gènes viraux sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline et un ou des gènes thérapeutiques. Les suppressions sont généralement réalisées sur l'ADN du virus recombinant défectif, par mise en oeuvre de digestions au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligatures, selon les techniques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les gènes viraux ou thérapeutiques et le promoteur inductible peuvent ensuite être insérés dans cet ADN par clivage enzymatique puis ligature, au niveau des régions sélectionnées et dans l'orientation choisie. L'ADN ainsi obtenu, qui porte donc les délétions appropriées, un ou plusieurs gènes viraux sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline et un ou des gènes thérapeutiques permet de générer directement l'adénovirus recombinant revendiqué.
Il est également possible de préparer le virus recombinant en étapes successives, permettant l'introduction successive des gènes heterologues et du promoteur inductible. Ainsi, l'ADN d'un premier virus recombinant portant les délétions appropriées (ou une partie desdites délétions) et un promoteur inductible comme par exemple Op2/Tk est construit, par ligature ou sous forme de plasmide. Cet ADN est ensuite utilisé pour générer un premier virus recombinant portant lesdites délétions avec un promoteur inductible. L'ADN de ce premier virus est ensuite isolé et co-transfecté avec un second plasmide ou l'ADN d'un second virus recombinant défectif portant les délétions appropriées notamment une dêlétion dans la région El, une région permettant la recombinaison homologue et le cas échéant, un gène thérapeutique. Cette deuxième étape génère ainsi le virus recombinant selon l'invention.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants tels que décrits précédemment.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 10*4 pfu/ml, et de préférence 10^ à 10^^ pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies. Ils sont particulièrement avantageux pour le traitement des pathologies hyperprolifératives (cancers, resténose, etc), par injection directe au niveau du site concerné. A cet égard, la présente invention concerne également une méthode pour la destruction de cellules proliferatives comprenant l'infection desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un vecteur adenoviral tel que défini ci-dessus. Dans le cas où le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique, la méthode de destruction selon l'invention comprend ensuite le traitement des cellules par ledit agent thérapeutique. Pour la mise en oeuvre de cette méthode, l'invention a également pour objet les produits comprenant un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant dans lequel le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique; et ledit agent thérapeutique, comme produit de combinaison pour une utilisation simultannée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des pathologies hyperprolifératives. Plus particulièrement, le gène suicide est un gène thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir ou un analogue. Des vecteurs recombinants selon l'invention possèdent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génique. Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité et de capacité de transfert de gènes très élevées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Figure 1 : Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome. Figure 2 : Organisation génétique de la région E4.
Figure 3: Organisation génétique de l'AAV.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 ; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 23_0_ (1985) 1350-
1354 ; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 15_5_ (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucieotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Lignées cellulaires utilisées
Dans les exemples qui suivent, les lignées cellulaires suivantes ont ou peuvent être utilisées :
- Lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). - Lignée de cellules humaines KB : Issue d'un carcinome épidermique humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (ref. CCL17) ainsi que les conditions permettant sa culture.
- Lignée de cellules humaines Hela : Issue d'un carcinome de l'épithélium humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (ref. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture.
- Lignée de cellules canines MDCK : Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988) 9.
- Lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). Cette lignée est constituée de cellules Hela portant le gène E2 d'adenovirus sous le contrôle du LTR de MMTV.
EXEMPLE 1
Construction d'un adénovirus portant son domaine E4 sous contrôle d'un promoteur Op2-Tk. 1- Construction du plasmide pIC20H/Op2-Tk:
Ce plasmide porte la séquence du promoteur minimum Tk précédé par deux séquences de l'opérateur tétracycline, ces séquences sont reconnues par le répresseur tétracycline lorsqu'il est fixé à la tétracycline.
Pour l'obtenir, le plasmide pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481) est digéré par Clal-BamHI et la séquence SEQ ID N° 5, comprenant deux opérateurs tétracycline en amont d'un promoteur minimum thymidine kinase, est introduite entre ces deux sites.
2- Construction du plasmide pIC20H/ITR-Op2Tk
Ce plasmide est obtenu par digestion Clal du plasmide ρIC20H/Op2Tk et insertion d'un fragment Hpa2 contenant l'ITR de l'Ad5 (coordonnées: 1/+122). Ce fragment provient du vecteur commercial pSL1180 (Pharmacia) digéré par Hind3, site dans lequel est introduit l'ITR fabriqué par PCR. avec des sites Hind3 de chaque coté du fragment amplifié. On obtient dans l'ordre suivant: rTR-Op2-TKprom.
3- Construction du plasmide ρIC20H/ITR-Oρ2Tk-E4
Ce plasmide correspond au plasmide pIC20H/ITR-Op2Tk digéré par Hind3, site dans lequel est inséré le fragment Nhe-Xbal de PY6 contenant la région E4 de l'Ad5. En ce qui concerne le plasmide ρPY6, il est obtenu selon le protocole suivant :
On prépare un plasmide pPY2 à partir du plasmide pIC20H. Ce plasmide pPY2 correspond au clonage du fragment Avr2-Sall (environ 1.3 kb incluant le promoteur du MMTV) du plasmide pMSG (Pharmacia) entre les sites Xbal et Sali du plasmide pIC20H préparé à partir d'un contexte E. coli dam+. Le plasmide pPY4 dérive du plasmide pPY2 par dêlétion d'un fragment de 35 pb après coupure par BamHI et Bgl2 puis religature. Le plasmide pPY5 correspond au plasmide pIC20H dans lequel le fragment Taql-Bgl2 incluant la région E4 de l'adénovirus de type 5 située entre les positions 35576 (Taql) et 32490 (Bgl2), a été clone entre les sites Clal et BamHI. La région E4 du plasmide pPY5 est donc incluse dans un fragment EcoRV-Sphl que l'on clone après digestion partielle entre les sites Smal et Sphl du plasmide pPY4, ce qui génère le plasmide pPY6.
4- Construction du plasmide pIC20H/ITR-Op2Tk-E4-L5
Il est obtenu par digestion du plasmide pIC20H/ITR-Op2Tk-E4 par Kpnl et Xbal et insertion du fragment Kpnl-Xbal de 3, 1Kb de l'Ad5 (coordonnées : 33595-30470) contenant toute la région L5.
5- Construction du plasmide pYG4-EP
On digère le plasmide pIC20H/ITR-Op2Tk-E4-L5 par Xbal et Nrul pour récupérer le fragment correspondant qui porte dans l'ordre l'ITR, Op2, le promoteur Tk, E4 et L5. Ce fragment est inséré dans les sites Xbal et Nrul du plasmide pYG4 qui contient toute la séquence de l'adénovirus depuis le site Xbal jusqu'au site Sphl. Ce plasmide pYG4-EP est un vecteur pIC20H dans lequel le fragment Sphl-Xbal de l'Ad5 (coordonnées: 25095-28590) est inséré entre ses sites Sphl et Xbal.
Ce vecteur pYG4-EP, délété de la région adéno virale E3 possède suffisament de séquences adénovirales entre les sites Sphl et Xbal pour permettre la recombinaison complémentaire de l'adénovirus pour la production d'un adénovirus recombinant.
6- Construction de l'adénovirus recombinant
Elle est réalisée par cotransfection de cellules 293/TetR-VP16, préparées selon l'exmple 3 ci-dessous, avec le plasmide pYG4 linéarisé par digestion Sphl et avec l'adénovirsu RSV-βgal ou un adénovirus portant un transgène, linéarisé par digestion Srfl en présence ou non de tétracycline. On procède ensuite selon les techniques de virologie classiques pour la sélection et l'amplification de l'adénovirus recombinant. EXEMPLE 2
Construction de l'adénovirus recombinant portant les gènes rep-cap de l'AAV sous contrôle du promoteur Op2/Tk: 1- Construction du plasmide intermédiaire pXL2630:
Ce plasmide intermédiaire permet d'introduire un site EcoRI en aval de Op2-Tk. La présence d'un site de restriction en cette position présente deux intérêts. Il sert à introduire ce promoteur en amont de rep-cap après avoir supprimé le promoteur p5 et il permet également d'insérer ce promoteur hybride en amont de TetR-VP16 pour la préparation d'une lignée cellulaire 293 transformée comme décrit en exemple 3 ci-après.
Pour ce faire, le plasmide pIC20H/Op2-Tk, obtenu selon le protocole décrit en exemple 1, est digéré par BamHI, traité par l'ADN polymérase de T4 pour rendre les extrémités franches puis redigéré par EcoRV, le fragment provenant de cette digestion et portant le promoteur Op2-Tk est introduit au site EcoRV du plasmide commercial pBSSK+. L'orientation du fragment est sélectionnée pour la présence d'un site EcoRI en aval du promoteur.
3- Introduction d'un site EcoRI au niveau du +1 transcriptionnel de p5:
Pour supprimer le promoteur p5, on introduit un site EcoRI au niveau du +1 transcriptionnel du promoteur p5 en amont de la séquence codante de Rep78 par la technique de PCR sur le plasmide ρAV2 ( Laughlin C, Gene (1983), 23, 69-73). Cette réaction a été réalisée à l'aide des oligonucléotides:
SEQ ID N°6( seq5269) : 5 ' GAATTCTTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCG 3 ' EcoRI
SEQ ID N°7( seq5039): 5 ' CTCCATGTACCTGGCTGA 3 '
Le fragment ainsi généré a été introduit dans pCRII (Invitrogen) pour donner le plasmide pMA4. La séquence nucléotidique de ce fragment a été vérifiée. 4- Construction du plasmide pMA6 portant la jonction Op2-Tk-rep-cap:
Ce plasmide intermédiaire permet de faire la jonction du promoteur inductible avec rep. Les fragments SalI-EcoRI de pXL2630 et EcoRI-NruI de pMA4 sont introduits aux sites Xhol (compatible avec Sali) et Nrul de pIC20R (Marsh et al., Gene 22 (1984) 481) pour donner le plasmide pMA6.
5- Construction du plasmide pCOl (figure 7 EX94008) qui contient la partie gauche de l'adénovirus Ad5 jusqu'au site Hinfl (382). un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - Nrul (6316) de l'adénovirus Ad5.
5-a / Construction du plasmide pCE Le fragment EcoRI-Xbal correspondant à l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été clone entre les sites EcoRI et Xbal du vecteur pIC19H (Marsh et al., Gene 22 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été clone entre les sites EcoRI et Smal du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCB. Le plasmide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémités 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été clone entre les sites Nrul et BglII du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage.
5-b/ - Construction du plasmide pCD'
Le fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) et le fragment SstI (3645) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clones entre les sites Clal et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment Sali- Taql du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de l'adénovirus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et Taql (5207) a ensuite été clone entre les sites Sali et Clal du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment Taql (5207) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Taql du plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites Sali et Narl du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCC. Le fragment Narl (5519) - Nrul (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Narl du plasmide pCC ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites Sali et Nrul du vecteur pIC20R. Ceci génère le plasmide pCD'.
5-c/ - Construction du plasmide pCOl
Une digestion partielle par Xhol puis une digestion complète par Sali du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site Nrul (6316). Ce fragment a été clone dans le site Sali du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pCOl.
6- Construction des plasmides pMA7 et pMA8.
Le fragment EcoRV-SnaBI de pMA6 portant Op2-Tk-rep-cap-polyA+de l'AAV (jusqu'au site SnaBI position 4495 sur la séquence de l'AAV) est introduit au site EcoRV de pCOl dans les deux orientations par rapport à l'ITR de l'adénovirus. Les plasmides ainsi obtenus sont désignés pMA7 (orientation de la cassette en sens inverse de l'ITR de l'adénovirus) et pMA8 (même orientation).
7- Construction de l'adénovirus recombinant portant Op2-Tk-rep-cap:
Cette partie décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif portant la cassette Op2-Tk-rep-cap-polyA+de l'AAV. Cet adénovirus est obtenu par co-transfection du plasmide pMA7 ou pMA8 avec un vecteur adenoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adenovirus. Plus précisément les adénovirus AdMA7 et AdMA8 ont été préparés par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus AdRSVβgal et les plasmides pMA7 et pMA8 selon le protocole suivant: le plasmide pMA7 ou pMA8 linéarisé par Ndel et l'adénovirus AdRSVBgal linéarisé par Clal sont cotransfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Pour la purification, les particules virales sont centrifugées sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notament Graham et al., Virology 52 (1973)456).
L'adénovirus AdMA7 ou AdMA8 est conservé à -80°C dans 20 % glycérol.
8 Construction de l'adénovirus recombinant portant Op2 / Tk rep-cap polyA+AAV dans la région E3:
Cette partie décrit la construction d'un adénovirus recombinant délété pour El portant Op2:Tk repcap polyA + AAV dans la région E3.
Le plasmide pMA28 contient toute la séquence de l'Ad(El-, E3-) portant Op2:Tk repcap polyA + AAV dans la région E3. Il a été construit par recombinaison dans E. Coli en introduisant le plasmide pMA24 par exemple dans la souche C2110 (pXL2638) (El-, E3-) décrite dans la demande PCT/FR96/00215 incluse ici par référence.
8.1 Construction du plasmide intermédiaire pMA22 :
Le fragment Xbal- Xbal du plsmide pMA7 portant Op2:Tk repcap polyA + AAV a été introduit au site Xbal de pYG4-EP à la place de la région E3 de telle sorte que Op2:Tk repcap polyA + AAV soit dans l'orientation inverse de celle de la région E3. Le palsmide ainsi construit est pMA22. 8.2 Construction du plasmide pMA24 utilisé pour effectuer la recombinaison dans E.coli :
le fragment Nhel-Spel de pMA22 contenant la cassette Op2:Tk repcap polyA + AAV flanquée des séquences de 27082 à 28593 et de 3471 à 31509 de l'Adénovirus a été introduite au site compatible du plasmide pXL2756 pour générer le plasmide pMA24 portant les régions nécessaires à la recombinaison encadrant la cassette Op2:Tk repcap polyA + AAV, le gène sacB de B. subtilis et le gène de résistance à la kanamycine.
8.3 Construction de l'adénovirus recombinant portant Op2:Tk repcap polyA + AAV dans la région E3 :
Elle a été faite par recombinaison dans E. coli en electroporant le plasmide pMA24 dasn la souche C2110 (pXL2688) ou c2110 (pXL2789) en sélectionnant un deuxième événement de recombinaison sur milieu LB, sucrose, tétracycline. On obtient ainsi une souche C2110 portant le plasmide pMA28.
Ce plasmide a ensuite été transfecté dans les cellules 293 après digestion par Pacl
EXEMPLE 3
Construction de la lignée productrice 293 Op2-Tk-TetR-VP16:
Cette partie décrit la construction d'une lignée 293 portant intégrée dans son génome la cassette du transactivateur hybride TetR-VP16 sous le contrôle du promoteur Op2- Tk. A cette fin, le plasmide pMA2 a été construit pour établir une lignée par cotransfection de ce plasmide pMA2 avec un plasmide pMSCV (Hawley et al. J.Exp.Med. (1993), voll76, 1149-1163) portant le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur PGK (phosphoglyceratekinase). pMA2 est construit en inserrant le fragment SalI-EcoRI de pXL2630 entre les sites compatibles XhoI-EcoRI d'un plasmide pUHD17.1. Le plasmide pUHD17.1 est un plasmide comprenant les séquences codant pour un répresseur de la tétracycline muté lié opérationnellement à la séquence VP16. Ce vecteur dérive du vecteur pUHD15.1( H. Bujard ; P.N.A.S. U.S.A. 1992, 89, 55476-5551) qui comprend la séquence du répresseur tétracycline W wO w 9 ?7 ///0υ0υ9v4^7 / PCT/FR96/00968
35
sauvage associée aux 130 acides aminés de l'extrémité C-terminale du virus de l'herpès simplex VP16. Un fragment Xbal-Eco47III de 399 paires de bases correspondant aux acides aminés 3 à 135 du répresseur de la tétracycline muté est échangé contre le fragment de restriction correspondant de pUHD15.1 pour conduire à pUHD17.1.
5 La lignée 293 Op2-Tk-TetR-VP16 de l'invention a été construite par co-transfection des cellules choisies en présence de phosphate de calcium, par les plasmides pMA2 et pMSCV et une construction codant pour le récepteur aux glucocorticoïdes (Hollenberg et al, 1985). Plus précisément, les cellules de la lignée 293 en boites de 5cm de diamètre ont été transfectées par 1 à 5 μg de plasmide pMA2.
10 Sélection des clones résistants à la généticine
Après transfection des cellules, celles ci sont lavées, puis le milieu de culture (MEM, Sigma) supplémente en sérum de voeu foetal (7 % final) est ajouté et les cellules sont mises à incuber pendant 20 heures. Le lendemain, on sélectionne les cellules en présence de généticineG418 (Gibco-BRL, Life Technologies) à la
15 concentration effective de 400 mg/1. La généticine est changée tous les trois jours et les clones sélectionnables apparaissent après environ 3 semaines. Quand toutes les cellules non transfectées sont mortes, seules les cellules ayant inséré le gène de resistance subsistent et se divisent pour générer des clones cellulaires. Quand les clones cellulaires sont suffisamment gros pour être visibles à l'oeil nu, ils sont
20 individuellement transférer dans les puits de culture d'une plaque de culture "24 trous". Chaque clone est ensuite progressivement amplifié en présence de généticine d'abord dans les puits d'une plaque de culture "12 trous", puis "6 trous" pour être ensuite amplifié en boites de culture cellulaires. Chaque clone cellulaire est alors conservé par congélation dans l'azote liquide.
25 Un certain nombre de clones ont été isolés, amplifiés et sélectionnés pour leur capacité à exprimer un gène reporter par exemple lacZ sous contrôle du promoteur Op2-Tk après addition d'une concentration appropriée de tétracycline. Le plasmide utilisé est pMA9 et a été construit par introduction d'un fragment StuI-BamHI de pRSVgalIX portant la séquence codant pour la β-galactosidase d'E.coli et un signal de localisation nucléaire dans le plasmide pMA2 préalablement linéarisé par EcoRI; traité à l'ADN polymérase du bactériophage T4 pour rendre ses extrémités franches puis redigéré par BamHI.
Parmi ces clones, ceux permettant une expression conditionnelle de rep-cap porté par l'adénovirus décrit précédemment et permettant la production d'AAV à des titres élevés ont été utilisés comme lignée productrice.
LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 40.91.69.22
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96 (ii) TITRE DE L' INVENTION:
UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 61 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
GATCCGGTCG CTCGGTGTTC GAGGCCACGC GTCACCTTAA TATGCGAAGT GGACCTCGGA 60 C 61
(3) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 64 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: AGATCTGCGG TCCGAGGTCC ACTTCGCATA TTAAGGTGAC CGTGGCCTCG ACACCGAGCG 60 ACCG 64
(4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 67 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
CGATACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT GGTCTCGAGA CTTTTCTCTA CACTGATAGG 60 GAGTGGT 67
(5) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 75 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGCAGATCTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG AGAAAAGTCT CGAGACCACT CCCTATCAGT 60 GATAGAGAAA AGTAT 75
(6) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 141 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
ATCGATACTT TTCTCTATCA CTGATAGGGA GTGGTCTCGA GACTTTTCTC TATCACTGAT 60
AGGGAGTGGT AGATCTGCGG TCCGAGGTCC ACTTCGCATA TTAAGGTGAC GCGTGGCCTC 120 GAACACCGAG CGACCGGATC C 141
(7) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE; SEQ ID NO: 6:
GAATTCTTTT GAAGCGGGAG GTTTGAACGC G 31
(8) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CTCCATGTAC CTGGCTGA 18
(9) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 206 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu 1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gin 20 25 30
Leu Leu Gly Val Glu Gin Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys 35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His Thr 50 55 60
His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gin Asp Phe Leu Arg Asn 65 70 75 80
Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly Ala 85 90 95
Lys Val His Ser Glu Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gin Tyr Glu Thr Leu 100 105 110
Glu Asn Gin Leu Ala Phe Leu Cys Gin Gin Gly Phe Ser Leu Glu Asn 115 120 125
Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys Val
130 135 140 Leu Glu Asp Gin Glu His Gin Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr Pro
145 150 155 160
Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gin Ala Ile Glu Leu Phe
165 170 175
Asp His Gin Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu Ile 180 185 190
Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gin Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser 195 200 205

Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus recombinant dans lequel l'expression d'au moins un gène d'origine virale, homologue ou hetérologue, est placée sous contrôle d'un promoteur inductible.
2. Adénovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur inductible est choisi parmi les promoteurs répondant à des métaux lourds, à des chocs thermiques, à des hormones ou à la tétracycline.
3. Adénovirus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un promoteur inductible par la tétracycline ou un de ses analogues.
4. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que le promoteur inductible par la tétracycline comprend un promoteur minimal associé opérationnellement à une séquence de régulation comprenant au moins un opérateur de la tétracycline.
5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence de régulation comprend au moins deux opérateurs de la tétracycline.
6. Adénovirus selon la revendication 4 ou 5 caractérisé en ce que la séquence de régulation est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N° 3, la SEQ ID N° 4 ou l'un de leurs dérivés.
7. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que le promoteur minimal dérive du CMV humain.
8. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisé en ce que le promoteur minimal correspond à la région comprise entre les nucléotides +75 à -53 ou +75 à -31 du promoteur CMV humain.
9. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur, homologue ou hetérologue du gène viral, muté de manière à être incapable d'assurer seul la transcription du gène d'origine viral qu'il contrôle.
10. Adénovirus selon la revendication 9 caractérisé en ce que le promoteur minimal dérive d'un promoteur homologue du gène viral considéré.
11. Adénovirus selon la revendication 9 caractérisé en ce que le promoteur minimal dérive du promoteur de la thymidine kinase du Virus Herpès Simplex.
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce que le promoteur minimal est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N°l ou la SEQ ID N°2 ou l'un de leurs dérivés.
13. Adénovirus selon l'une des revendications 4 à 12 caractérisé en ce que le promoteur minimal est placé en amont du gène viral à transcrire, en substitution ou non de son propre promoteur.
14. Adénovirus selon l'une des revendications 4 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend outre ledit promoteur minimal, le propre promoteur du gène viral considéré mais sous une forme inactivée ou non fonctionnelle.
15. Adénovirus selon l'une des revendications 4 à 14 caractérisé en ce que la séquence de régulation est placée en amont du promoteur minimal.
16. Adénovirus selon l'une des revendications 4 à 14 caractérisé en ce que la séquence de régulation est placée en aval du gène viral considéré.
17. Adénovirus selon la revendication 16 caractérisé en ce que la séquence de régulation est directement liée ou non au gène viral considéré.
18. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le promoteur inductible est représenté par Op2/Tk.
19. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 ou 9 à 18 caractérisé en ce que le promoteur inductible est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N° 5 ou l'un de ses dérivés.
20. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes comprenant au moins un gène homologue dont l'expression est placée sous contrôle d'un promoteur inductible.
21. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes comprenant au moins un gène homologue dont l'expression est placée sous contrôle d'un promoteur inductible par la tétracycline ou un de ses analogues.
22. Adénovirus recombinant selon la revendication 20 ou 21 caractérisé en ce qu'il s'agit de tout ou partie d'une région génomique dudit adénovirus, essentielle à sa réplication et/ou sa propagation.
23. Adénovirus recombinant selon la revendication 22 caractérisé en ce que la région essentielle à sa réplication et/ou sa propagation est choisie parmi tout ou partie de la région E4, E2 la région IVa2 et/ou la région L5.
24. Adénovirus recombinant selon la revendication 23 caractérisé en ce que la région E2 est représentée par un fragment choisi parmi les fragments correspondant à l'ADNc de la 72K, l'ADNc de la polymérase de 140K et l'ADNc de la protéine pré-terminale de 87K.
25. Adénovirus recombinant selon la revendication 23 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par le fragment Taql-Bgl2 correspondant aux nucléotides 35576-32490.
26. Adénovirus recombinant selon la revendication 23 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par au moins la phase codante ORF6.
27. Adénovirus recombinant selon la revendication 23 ou 25 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par le fragment Bgl2 compris entre les positions 34115 à 32490 contenant les séquences de ORF6 et ORF7.
28. Adénovirus recombinant selon la revendication 23 caractérisé en ce que la région codant pour IVa2 est constituée d'un fragment choisi parmi les fragments
BglII-NruI comprenant les nucléotides 3328 à 6316, Dral- NlaM correspondant aux nuléotides 4029 à 5719 et Dral-Xhol correspondant au fragment 4029 à 5788, sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
29. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 23 et 25 à 27 caractérisé en ce qu'il porte une dêlétion de tout ou partie du gène El et possède la région E4, en tout ou partie, sous contrôle d'un promoteur inductible Op2/Tk-
30. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 24 caractérisé en ce qu'il porte une dêlétion de tout ou partie du gène El et possède la région E2, en tout ou partie, sous contrôle d'un promoteur inductible Op2/Tk.
31. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 27 et 29 caractérisé en ce qu'il porte une dêlétion de tout ou partie des gènes El et E2 et possède la région E4, en tout ou partie, sous contrôle d'un promoteur inductible Op2/Tk.
32. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 27 et 30 caractérisé en ce qu'il porte une dêlétion de tout ou partie des gènes El et E4 et possède la région E2, en tout ou partie, sous contrôle d'un promoteur inductible Op2/Tk.
33. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 20 à 32 caractérisé en ce que la région placée sous contrôle d'un promoteur Op2/Tk est dépourvue de son propre promoteur.
34. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 20 à 33 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une séquence d'acides nucléiques codant pour un ou plusieurs gènes thérapeutiques.
35. Adénovirus recombinant selon la revendication 34 caractérisé en ce que ladite séquence d'acides nucléiques est présente au niveau des région El, E3 ou E4, en supplément ou en remplacement de séquences délétées.
36. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 19 comprenant au moins un gène hetérologue d'origine virale dont l'expression est placée sous contrôle d'un promoteur inductible.
37. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 19 et 36 comprenant au moins un gène hetérologue d'origine virale dont l'expression est placée sous contrôle d'un promoteur inductible par la tétracycline ou un de ses analogues.
38. Adénovirus recombinant selon la revendication 36 ou 37 caractérisé en ce que le gène est ou dérive d'un gène du génome d'un virus adéno-associés (AAV) ou un de ses homologues fonctionnels.
39. Adénovirus recombinant selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un gène représentant les fonctions d'encapsidation d'un virus adéno-associés - (AAV).
40. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 36 à 39 caractérisé en ce qu'il comprend l'expression des gènes rep et/ou cap d'AAV ou un de leurs homologues sous contrôle d'un promoteur inductible.
41. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 36 à 40 caractérisé en ce qu'il porte une cassette d'expression Op2/Tk-rep-cap.
42. Adénovirus recombinant selon la revendication 41 caractérisé en ce que le promoteur Op2/Tk remplace le promoteur p5 d'origine.
43. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications 36 à 42 caractérisé en ce que le gène hetérologue d'origine virale et le promoteur inductible sont présents au niveau des région El du génome dudit adénovirus, en supplément ou en remplacement de séquences délétées.
44. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend ses ITR et une séquence permettant l'encapsidation.
45. Adénovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes dans lequel au moins la région El est non fonctionnelle.
46. Adénovirus recombinant selon l'une des revendication précédentes caractérisé en ce que le génome d'adenovirus est d'origine humaine, animale, ou mixte.
47. Adénovirus recombinant selon la revendication 46 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
48. Adénovirus recombinant selon la revendication 47 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine animale sont choisis parmi les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ovine, porcine, aviaire et simienne.
49. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant au moins un gène d'origine AAV sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline pour la préparation d'AAV.
50. Procédé de préparation d'AAV caractérisé en ce qu'il comprend la co¬ transfection, en présence de tétracycline ou un de ses analogues, d'une lignée cellulaire, comprenant dans son génome la cassette d'expression d'un activateur de transcription, avec un adénovirus comprenant au moins un gène d'origine AAV sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline et soit un virus recombinant dérivé de l'AAV ou un plasmide d'encapsidation, portant un transgène entre les ITR de l'AAV.
51. Procédé selon la revendication 50 caractérisé en ce que l'adénovirus comprend les gènes rep et cap sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline.
52. Procédé selon la revendication 50 ou 51 caractérisé en ce que la production d'AAV est induite par la présence d'une quantité suffisante de tétracycline ou un de ses analogues.
53. Procédé selon l'une des revendications 50 à 52 caractérisé en ce que la lignée cellulaire transformée dérive de la lignée 293.
54. Procédé selon la revendication 53 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une lignée cellulaire 293 comportant dans son génome la cassette d'expression d'un activateur de transcription constitué d'un premier polypeptide capable de se lier, en présence de tétracycline ou un de ses analogues, à la séquence de régulation du promoteur inductible présent dans l'adénovirus, associé à un second polypeptide qui active la transcription.
55. Procédé selon la revendication 54 caractérisé en ce que le premier polypeptide est un répresseur de type sauvage de la tétracycline muté de manière à lui conférer la capacité de se lier à la séquence de régulation dudit promoteur inductible uniquement en présence de tétracycline ou un de ses analogues.
56. Procédé selon la revendication 55 caractérisé en ce que la mutation est une dêlétion, substitution et/ou dêlétion d'au moins un acide aminé de la séquence codant pour un répresseur tétracycline de type sauvage.
57. Procédé selon la revendication 55 ou 56 caractérisé en ce que le répresseur tétracycline muté est le répresseur sauvage TnlO muté en au moins un de ses acides aminés localisés en position 71, 95, 101 ou 102.
58. Procédé selon l'une des revendications 54 à 57 caractérisé en ce qu'il s'agit du répresseur tétracycline représenté en tout ou partie en SEQ ID N°8.
59. Procédé selon l'une des revendications 54 à 58 caractérisé en ce que le second polypeptide comprend le domaine d'activation de transcription d'une protéine.
60. Procédé selon la revendication 59 caractérisé en ce qu'il s'agit de la protéine virion 16, VP16, du HSV.
61. Procédé selon l'une des revendications 50 à 60 caractérisé en ce que la cassette d'expression dudit activateur de transcription comprend un promoteur inductible à la tétracycline ou l'un de ses analogues.
62. Procédé selon l'une des revendications 50 à 61 caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une lignée cellulaire 293 intégrant dans son génome la cassette d'expression Op2/Tk-TetR-VP16.
63. Lignée cellulaire caractérisée en ce qu'il s'agit d'une lignée 293 intégrant dans son génome une cassette d'expression d'un activateur de transcription tel que défini en revendications 54 à 60.
64. Lignée cellulaire selon la revendication 63 caractérisée en ce qu'elle intègre dans son génome la cassette d'expression Op2/Tk-TetR-VP16.
65. Utilisation d'une lignée cellulaire selon la revendicatiori 63 ou 64 pour produire des adénovirus ou des AAV.
66. Procédé de production d'adenovirus selon l'une des revendications 1 à 35 caractérisé en ce qu'il comprend la co-transfection d'une lignée cellulaire portant en trans les fonctions nécessaires à la complémentation de l'adénovirus et un activateur de transcription tel que défini en revendication 54 à 60.
- un premier ADN comprenant la partie gauche du génome dudit adénovirus, possédant une dêlétion dans la région El, et
- un second ADN comprenant au moins la partie droite du génome dudit adénovirus, possédant au moins une région essentielle à sa réplication sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline, et une partie commune à celle du premier ADN, en présence de tétracycline ou un de ses analogues, et on récupère les adénovirus produits par recombinaison.
67. Procédé selon la revendication 66 caractérisé en ce que le premier ou le second ADN porte en outre une séquence d'ADN hetérologue d'intérêt.
68. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 35.
69. Composition pharmaceutique selon la revendication 68 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.
70. Promoteur inductible à la tétracycline caractérisé en ce qu'il s'agit de l'Op2/Tk.
71. Promoteur selon la revendication 70 caractérisé en ce que la séquence Op2/Tk est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N° 5.
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