CZ295934B6 - Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují - Google Patents

Abstract

Popisuje se rekombinantní adenovirus, ve kterém je exprese nukleové sekvence kódující alespoň jeden gen virového původu, heterologního nebo homologního pod kontrolou induktibilního promotoru, a který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje terapeutický gen. Dále se popisuje použití těchto rekombinantních adenovirů pro přípravu virů AAV. Dalším předmětem je komplementární buněčná linie a odpovídající způsoby její přípravy. Rovněž se popisují farmaceutické kompozice obsahující adenovirus podle řešení.

Description

(57) Anotace:

Popisuje se rekombinantní adenovirus, ve kterém je exprese nukleové sekvence kódující alespoň jeden gen virového původu, heterologního nebo homologního pod kontrolou induktibilního promotoru, a který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje terapeutický gen. Dále se popisuje použití těchto rekombinantních adenovirů pro přípravu virů AAV. Dalším předmětem je komplementární buněčná linie a odpovídající způsoby její přípravy. Rovněž se popisují farmaceutické kompozice obsahující adenovirus podle řešení.

Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových virových vektorů, jejich přípravy a jejich využití. Rovněž se týká farmaceutických kompozic, které tyto virové vektory obsahují.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v korigování defícience nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, atd.) zavedením genetické informace do buňky nebo napadeného orgánu. Tato genetická informace může být zavedena buď in vitro do buňky vyjmuté z daného orgánu, přičemž modifikovaná buňka se zavede zpět do organismu, nebo přímo in vivo do vhodné tkáně. V tomto druhém případě se používá různých technik, zejména pak různé techniky transfekce implikující komplexy DNA a DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), DNA a nukleárních proteinů (Kanada et al., Science 243 (1989), 375), DNA et lipidů (Felgner et al,., PNAS 84 (1987) 7413), použití liposomů (Fraley et al, J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd.

Později se používání virů jakožto vektorů pro přenos genů objevilo jako slibná alternativa těchto fyzikálních technik přenosu. V tomto ohledu byla provedena testace různých virů se zaměřením na zjištění jejich schopností infikovat určité buněčné populace. Zejména šlo o retroviry (RSV, HMS, MMS, atd.), virus HSV a adeno-přidružené viry a adenoviry.

Pokud se týká adenovirů, jedná se o viry mající dvouvláknovou lineární DNA s velikostí asi 36 kb. Jejich genom obsahuje sekvenci obrácené repetice (ITR) na každém konci, enkapsidační sekvenci, rané a pozdní geny (viz obr. 1). Hlavní rané geny jsou obsaženy v oblastech El, E2, E3 a E4. Z nich pak jsou geny obsažené v obsažené v oblasti El (Ela a Elb) nezbytné pro virovou replikaci. Na příklad oblasti E4 a L5 jsou implikovány do virové propagace a hlavní pozdní geny jsou obsažené v oblastech LI až L5. Genom adenovirů Ad5 byl zcela sekvencován a je přístupný v příslušné databázi (viz zejména Genová banka - Genebank - M73260). Sekvencovány byly stejně tak části, dokonce celý genom adenovirů různých serotypů (Ad2, Ad7, Ad 12, atd.). Tyto virové vektory, které vykazují poměrně široké spektrum hostitelů, jsou schopné infikovat kiescentní buňky nepronikají do genomu infikované buňky a nebyly do dnešního dne zmiňovány v humánní patologii. S přihlédnutím k jejich vlastnostem již však byly použity pro přenos genů in vivo. Za tímto účelem byly připraveny vektory odvozené z adenovirů, inkorporující různé geny (β-gal, OTC, α-1ΑΤ, cytokiny, atd.).

Je jisté, že soubor těchto virových vektorů zahrnuje i četné virové geny, jejichž exprese není naopak žádoucí v genové terapii. Je nutné kontrolovat in vivo neexpresi divokých virových genů a/nebo proteinů z nich odvozených, které jsou schopné indukovat pro ošetřený organismus nežádoucí nebo dokonce neblahou imunitní a/nebo zánětovou reakci.

Za tímto účelem jsou konstrukce virových vektorů navrhované v současné době modifikovány takovým způsobem, aby znemožnily uvedeným vektorům replikovat se nezávislým způsobem v cílové buňce. Nazývají se defektivní víry. Genom defektivních virů je tedy zbaven alespoň sekvencí nutných pro replikaci zmíněného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď eliminovány (cele nebo částečně), nebo znefunkčněny či nahrazeny dalšími sekvencemi, zejména pak sekvencí kódující molekulu terapeutického významu. Defektivní virus si uchovává nicméně sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci částic viru.

Ve specifickém případě rekombinantních adenovirů jsou popsané konstrukce všeobecně vzato adenoviry s delecemi oblastí El (Ela a/nebo Elb) a případně E3, na jejichž úrovni jsou vloženy

-1 CZ 295934 B6 sekvence heterologní DNA (Lenvero et al., Gene 101 (1991) 1995, Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Další konstrukce zahrnují deleci na úrovni oblasti El a nepodstatné části oblasti E4 (WO 94/12649). Tyto defektivní rekombinantní adenoviry mohou být připraveny různými způsoby při využití vhodné buněčné linie či nikoliv, která bude schopna doplnit všechny defektivní funkce důležité pro replikaci rekombinantního adenoviru. V současné době vektory odvozené z adenovirů jsou všeobecně vzato produkovány v doplňkové linii (linie 293), do které byla integrována část genomu adenoviru. Přesněji, linie 293 obsahuje levý konec (asi 11 až 12 %) genomu adenoviru serotypu 5 (Ad5) obsahující levou ITR, oblast enkapsidace a oblast El zahrnující Ela, Elb a část oblasti kódující protein pIX. Tato linie je schopna transkomplementovat defektivní rekombinantní adenoviry pro oblasti El, to znamená zbavené cele nebo částečně oblasti El, nutné pro replikaci.

V žádném případě však není možné při produkci těchto defektivních virových vektorů vyloučit možnost rekombinací generujících replikativní části virů nebo transkomplementace in vivo buněčnými funkcemi typu ED1. Je zřejmé, že toto je zcela neslučitelné s jejich následným využitím v genové terapii. Přítomnost replikativních částí viru in vivo může mít velmi neblahé důsledky, jako na příklad vyvolání šíření virů a nekontrolovatelného roznášení spolu s rizikem zánětů, rekombinace, atd.

Souběžně s tím je nutné předcházet in vivo expresi odpovídajících virovým proteinů. I když nepředstavují nutné toxickou hrozbu pro buňky, jsou zcela nežádoucí, protože jsou schopné indukovat reakci imunitního systému, jako záněty a/nebo horečky, které mohou být velmi nebezpečné pro ošetřovaný organismus (D. Y., Schwarz, (1995), P.N.A.S 92, 1401 - 1405, J. F. Engelhardt, (1994), Human Gene Therapy, 5, 1217 - 1229 a (1994) P.N.A.S. 91, 6196 - 6200, Y. Yang, 1994), Immunity, 1, 433 - 442, (1995), J. Virol, 69, 2004 - 2015 a Nátuře Genetics, (1994) 7, 362 - 369).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález doporučuje řešení umožňující čelit těmto nedostatkům a je vhodné zejména pro přípravu skupin virů typu adenovirů vykazujících zvýšenou bezpečnost, protože jsou zbaveny především replikativních částí viru.

Proti očekávání přihlašovatel prokázal, že je možné, za pomoci původního promotorového systému účinným způsobem kontrolovat expresi virových genů, expresi, která je efektivní in vitro během virové produkce, ale naopak neefektivní později, in vivo, během terapeutického využití uvedených rekombinantních virů.

Přesněji řečeno, předkládaný vynález se týká rekombinantního adenoviru, u kterého exprese alespoň jednoho genu virového původu, homogenního či heterologního, je kontrolována induktibilním promotorem.

Ve smyslu předkládaného vynálezu se rozumí pod pojmem induktibilní promotér jakýkoliv promotor, jehož aktivita je iniciována přítomností chemického činidla a/nebo vnějšího činidla biologického, činidla, které v rámci předkládaného vynálezu vykazuje kromě jiného omezenou či nulovou toxicitu.

Pod pojmem „vnější“ se rozumí, že chemické a/nebo biologické činidlo přirozeně neexistuje v buňkách ošetřených požadovaným adenovirem.

Jako induktibilní promotory schopné využití podle předkládaného vynálezu je možno uvést promotory klasické, jako na příklad ty, které odpovídají těžkým kovům (CRC Boča Raton, FL (1991), 167 - 220, Brinster et al., Nátuře (1982), 296, 39 - 42), tepelným šokům, hormonům, (Lee et al., P.N.A.S. USA (1988), 85, 1204 - 1208, (1981), 294, 228 - 232, Klock et al. Nátuře

-2 CZ 295934 B6 (1987), 329, 734 - 736, Israel a Kaufman, Nucleic Acids Res. (1989), 17, 2589 - 2604) nebo chemickým činidlům typu glukózy, laktózy, galaktózy nebo antibiotikům.

Nedávno byl popsán promotér indukovatelný tetracyklinem, mimořádně výhodný v rámci předkládaného vynálezu.

Tento promotor, nazývaný promotor indukovatelný tetracyklinem, obsahuje minimální promotor vázaný operačně na jednoho či více operátorů tetracyklinu. To je vazba, na sekvence operátorů tetracyklinu, proteinu nazývaného „aktivátor transkripce“, vazba, která se utváří pouze na přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu, která umožňuje aktivaci minimálního promotoru a tedy transkripci jednoho Či více asociovaných virových genů.

Pokud se týká zejména proteinu nazývaného aktivátor transkripce je třeba říci, že se vyznačuje schopností vázat se za přítomnosti tetracyklinu na sekvence operátorů promotoru indukovatelného tetracyklinem a schopností aktivovat minimální promotor. Jedná se o protein tvořený dvěma polypeptidy, jedním, který se váže na operátorové sekvence tet za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu a druhým, jehož funkce spočívá v aktivaci zmíněné transkripce. První polypeptid proteinu nazývaného aktivátor transkripce je supresor tetracyklinu upravený takovým způsobem, aby projevoval reakci inversní reakci supresoru divokého, to znamená, že se váže na operátorové sekvence tak pouze v přítomnosti tetracyklinu a nikoliv v jeho nepřítomnosti. Pokud se jedná o druhý polypeptid, jde o oblast aktivace proteinu 16 viru Herpes Simplex.

V případě, že použitý induktibilní promotor bude ku příkladu indukovatelný glukózou nebo galaktózou, je možno zvážit použití aktivátoru transkripce konstruovaného podle tohoto modelu, to znamená na příklad Glu-VP16 nebo Gal4-VP16.

Podle předkládaného vynálezu je použitý induktibilní promotor indukovatelný tetracyklinem nebo jeho analogy, jak je popsáno výše.

Ve smyslu předkládaného vynálezu obsahuje promotor indukovatelný tetracyklinem minimální promotor vázaný operačně na sekvenci regulace obsahující alespoň operátor tetracyklinu „tet operátor“ nebo jeho analogu.

Pod pojmem analog tetracyklinu chápeme jakoukoliv sloučeninu vykazující strukturální homologie s tetracyklinem a schopnou vázat se na jeho receptor vázaný na oblast transaktivace proteinu nazývaného aktivátor transkripce a zmíněného výše, s Ka alespoň o 10⁶ M'¹. Pokud jde o analogy, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, je možno uvést především docycyklin, chlortetracyklin a anhydrotetracyklin.

Pod pojmem minimální promotor chápeme každou promoční sekvenci, která sama není schopna zajistit účinným způsobem transkripci sekvence DNA, která je jí asociována. Aktivita takovéhoto promotoru je zcela závislá na vazbě proteinu aktivátoru transkripce na sekvenci regulace, a to v přítomnosti tetracyklinu. Úkolem tohoto minimálního promotoru je orientovat transkripci. Za tím účelem je povětšinou situován před virovou sekvencí, takže s ní vytváří kontinuální nukleotidovou sekvenci.

Tento minimální promotor může být odvozen od ihned raného promotoru lidského cytomegaloviru a povětšinou se pohybuje mezi nukleotidy +75 až -53 nebo +75 až -31. Ovšem stejně tak je možné použít podle vynálezu minimální promotor odvozený z konvenčního promotoru, jako je příklad promotoru aktivujícího transkripci genu kódujícího thymidin-kinázu.

Konvenční promotor může být minimalizován jednou či několika genetickými mutacemi, které mu znemožní zajistit účinným způsobem transkripci asociovaného genu. V rámci předkládaného vynálezu může být rovněž využit minimální promotor odvozený přímo z promotoru přirozeně odpovědného za expresi daného virového genu. Také je možno zvažovat použití promotoru

-3CZ 295934 B6 nazývaného „TATA-less“, jak ho popsal E. MARTINEZ et al., (EMBO Joumal., (1994), 13. č. 13,3115- 3126), aby se získalo co nejbazálnější šumové pozadí za n eindukované situace.

Tento minimální promotor je uložen před nukleotidovou sekvenci, jejíž expresi kontroluje jako náhrada či nikoliv jejího přirozeného promotoru. Vlastní promotor nukleové sekvence může být i nadále přítomen, ale ve formě inaktivované nebo znefunkčnělé různými technikami, které jsou odborníkům dobře známy, zejména pak supresí, delecí a/nebo adicí jedné či více bází.

Podle vynálezu je minimální promotor odvozen z minimálního promotoru thymidin-kinázy viru Herpes Simplex (Mc Knight et al., (1984) Cell 37:253 - 262). Pak se označuje Tk.

Je představován cele nebo částečně jednou ze sekvencí uvedených v SEQ ID č. 1 neb č. 2 nebo jednoho z jejich derivátů.

Ve smyslu předkládaného vynálezu označuje termín „odvozený“ každou sekvenci získanou genetickou a/nebo chemickou modifikací daných sekvencí při zachování sledované aktivity. Genetickou a/nebo chemickou modifikací rozumíme jakoukoliv mutaci, substituci, deleci, adici a/nebo modifikaci jedné či více nukleových kyselin.

Tzv. regulační sekvence obsahuje alespoň jeden operátor tetracyklinu nebo jeho analogu. Operátor je rozeznán aktivátorem transkripce v přítomnosti tetracyklinu a umožňuje tedy z toho důvodu aktivaci minimálního promotoru.

Sekvence tet operátor, které mohou být využity, mohou být zvoleny ze sekvencí popsaných Hillenem a Wissemannem (Protein-Nucleic Acid Interaction, Saegen a Heinemann, eds., Macmillan, London, (1989), 10, 143 - 162), Waters et al., (Nucleic Acids Res. (1983), 11, 525 - 539), Stueber et al. (P.N.A.S. USA, (1981), 78, 167 -171), Unger et Al. (Nucleic Acids Res. (1984), 12, 7693 - 7703) a Tovar er al. (Mol. Gen. Genet. (1988), 215, 76 - 80).

Regulační sekvence může obsahovat jedinou operátorovou sekvenci tet nebo naopak několik operátorových sekvencí tet, jejichž počet dosáhnout až 10 sekvencí podle toho, chceme-li či nikoliv zvýšit regulaci transkripce. Podle specifického způsobu realizace předkládaného vynálezu využívá regulační sekvence dvou operátorových sekvencí tetr. Je označena jako Op2.

Regulační sekvence je reprezentována cele nebo částečně jednou ze sekvencí uvedenou v SED ID č. 3 nebo 4 nebo jedním z jejich derivátů.

Tato regulační sekvence je operačně vázána dopředně, to znamená na konec 5' minimálního promotoru takovým způsobem, aby byla umožněna transkripce genu virového původu za přítomnosti komplexu tvořeného aktivátorem transkripce a jeho tetracyklinového ligandu. Následně máme tedy v orientaci od 5' až po 3' regulační sekvenci, vázanou přímo či nepřímo na minimální promotor, dále minimální promotor a gen virového původu. Nicméně je možné rovněž zvážit možnost umístit tuto regulační sekvenci, v rámci minimálního promotoru, za nukleotidovou virovou sekvenci určenou k transkripci, to znamená, na její konec 3'. Pak b byl ve smyslu 5' a 3'. Následující sled: minimální promotor, virový gen a regulační sekvence.

Podle předkládaného vynálezu promotor indukovatelný tetracyklinem přidružuje k minimálnímu promotoru tymidin-kinázy označované jako Tk regulační sekvenci představovanou regulační sekvencí Op2. V tomto specifickém případu je identifikován jako Op2/Tk. Induktibilní promotor použitý podle předkládaného vynálezu je představován cele nebo částečně sekvencí SEQ ID č. 5 nebo jedním z jejich derivátů.

Tento promotor indukovatelný tetracyklinem Op2/Tk a zejména pak promotor představovaný cele nebo částečně sekvencí SEQ ID č. 5 nebo jedním z jejich derivátů tvoří rovněž jeden z předmětů předkládaného vynálezu.

-4CZ 295934 B6

V důsledku toho pak je exprese jednoho či více virových genů vázaných operačně v nárokovém adenoviru na induktibilní promotor cele podřízená fixaci komplexu tvořeného aktivátorem transkripce a tetracyklinem na regulační sekvenci daného promotoru.

Tato fixace je efektivní pouze za přítomnosti tetracyklinu. V jeho nepřítomnosti nebo v nepřítomnosti jednoho z jeho analogů, neexistuje žádná vazba mezi regulační sekvencí a aktivátorem transkripce. Důsledkem je nulová transkripce virové sekvence vázané na minimální promotor. Navíc pak činidlo indukující transkripci nemusí být průběžně přítomné.

Jeden z předmětů předkládaného vynálezu se týká adenoviru obsahujícího alespoň jeden homologní, to znamená adenovirální gen, jehož exprese je kontrolována induktibilním promotorem a především pak promotorem indukovatelným tetracyklinem. Předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní adenovirus, jehož alespoň jedna genová oblast podstatná pro replikaci a/nebo šíření virů je cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem. Oblast podstatná pro replikaci a/nebo šíření virů podle předkládaného vynálezu je výhodně zvolena z celku nebo části oblasti E4, E2, oblasti IVa2 a/nebo oblasti L5, atd.

Podle předkládaného vynálezu obsahují rekombinantní adenoviry jako sekvence nezbytné pro replikaci a/nebo šíření všechny nebo jeho funkční část oblastí E2 nebo E4. Pokud se jedná o oblast E4 důležitými geny jsou geny ORF3, ORF6 a ORF6/7.

Oblast E2 je implikována do regulace virové DNA. Tato oblast E2 je tvořena dvěma transkripčními podjednotkami E2A a E2B.

Oblast E4 se podílí na regulaci exprese pozdních genů, na stabilitě pozdních jádrových RNA, na tlumení exprese proteinů hostitelské buňky a účinnosti replikace virové DNA. Mutanti zbavení oblasti E4 nejsou schopni se šířit. Oblast E4 tak představuje oblast podstatnou pro virovou propagaci. tato oblast E4 má 7 otevřených čtecích fází označené ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 a ORF6/7 (obr. 2). Z nich pak ORF3 a ORF6 jsou dva geny podstatné pro šíření virů. Každý z těchto genů je schopen indukovat virovou propagaci, přičemž ORF6 zde hraje nicméně důležitější roli než ORFY3 (Huang a Hearing (1988), J. Viro. 63,2605).

V rámci určitého specifického způsobu je pak ve vektorech podle předkládaného vynálezu kontrolována promotorem indukovatelný tetracyklinem celá sledovaná oblast. Ve specifickém případě oblasti E2 se může jednat o fragment odpovídající kyselině cDNA odvozené z 72K, kyselině cDNA polymerázy odvozené z 140 K nebo kyselině cDNA preterminálního proteinu odvozené z 87K. Pokud jde o oblast E4, může se jedna především o fragment Taql-Bgl2 odpovídající nukleotidům 35576 - 32490.

V rámci jiného specifického způsobu je kontrolována exprese pouze jedné funkční části těchto oblastí, to znamená části umožňující šíření virů. V případě oblasti E4 tato část zahrnuje alespoň funkční gen ORF3 nebo ORF6. Funkční část oblasti E4 je tvořena v podstatě genem ORF6. Pro příklad uveďme, že zlomek Bgl2 situovaný mezi polohami 34115 až 32490 a obsahující sekvence genů ORF6 a ORF7 adenoviru Ad5 může být vložen za induktibilní promotor, jak je uvedeno v předkládaném vynálezu.

V rámci dalšího jiného specifického způsobu podle předkládaného vynálezu je podstatná oblast tvořena oblastí kódující protein IVa2 a na příklad jeho cDNA. V jiném realizačním prostupu je oblast kódující protein IVa2 obsažena ve zlomku BglII-Nrul odpovídajícím nukleotidům 3328 až 6316 na sekvenci divokého adenoviru Ad5, ve fragmentu Dral-NlalII odpovídajícím nukleotidům 4029 až 5719 nebo ve fragmentu Dral Xhol odpovídajícím nukleotidům 4029 až5788.

-5 CZ 295934 B6

V rámci preferovaného postupu podle předkládaného vynálezu jsou promotory oblastí podstatných pro šíření virů nahrazeny ve virovém genomu induktibilním promotorem, povětšinou pak promotorem indukovatelným tetracyklinem.

V rámci prvního specifického způsobu realizace nesou rekombinantní adenoviry podle vynálezu deleci celku nebo části genu El a mají oblast E2, cele nebo částečně, pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, povětšinou typu Op2/Tk.

V rámci dalšího uvedeného způsobu realizace nesou rekombinantní adenoviry podle vynálezu deleci celku nebo části genu El a mají oblast E2 cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, ponejvíce typu Op2/Tk.

Rekombinantní adenoviry podle vynálezu v rámci upřednostněného způsobu realizace vynálezu nesou deleci celku nebo části genů El a E2 a mají oblast E2 cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, ponejvíce typu Op2/Tk.

V rámci mimořádně výhodné varianty nesou rekombinantní adenoviry podle vynálezu deleci celku nebo části genů El a E4 a mají oblast E2 cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, ponejvíce typu Op2/Tk.

Rekombinantní adenoviry podle vynálezu obsahují výhodně kromě jiného i heterologní sekvenci nukleových kyselin obsahující jeden či více terapeutických genů, u kterých se snažíme o přenos do buňky, orgánu nebo organismu ajejich expresi v těchto subjektech.

Terapeutické geny, které tak mohou být transferovány jsou všechny geny, jejichž transkripce a případně tradukce do cílové buňky generuje produkty s terapeutickým účinkem.

Zejména se může jednat o geny kódující proteinové produkty s terapeutickým účinkem. Proteinový produkt takto kódovaný může být protein, peptid, atd. Tento proteinový produkt může být homologní s cílovou buňkou (to znamená produkt, který je normálně vyjádřen v cílové buňce, pokud tato nevykazuje žádné patologické příznaky). V takovémto případě umožňuje exprese proteinu například čelit nedostatečné expresi v buňce nebo expresi inaktivního nebo v důsledku modifikace nedostatečně aktivního proteinu nebo expresi takovéhoto proteinu výrazně zvýšit, terapeutický gen může rovněž kódovat mutant buněčného proteinu se zvýšenou stabilitou, modifikovanou aktivitou atd. Proteinový produkt může být rovněž heterologní s cílovou buňkou.

V takovém případě může vyjádřený protein doplnit deficientní aktivitu v buňce, což jí umožní bojovat proti patologickým jevům.

Z terapeutických produktů ve smyslu předkládaného vynálezu je možno uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, intererony, TNF, atd. (FR 9203120), faktory ovlivňující růst, neorotransmitory a jejich prekursory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atd., dále apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (FR 39 05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), geny potlačující tumory: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev., atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory ovlivňující koagulaci: faktory VII, VIII, IX, atd., sebevražedné geny: thymidin-kináza, cytosin-desamináza, atd. ne celek či část přírodního nebo umělého imunoglobulinu (Fab, ScFv, atd.), atd.

Terapeutický gen může být rovněž antimediátorový gen nebo sekvence, jehož či jejíž exprese v cílové buňce umožňuje kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm jako ribozomy. Takovéto sekvence mohou být ku příkladu přepsány v cílové buňce na komplementární RNA k buněčným RNAm a blokovat tak jejich přeměnu na protein způsobem popsaným v patentu EP 140 308:

Terapeutický gen může být rovněž gen kódující antigenový peptid, schopný generovat u člověka imunitní reakci. Při takovémto specifickém způsobu využití vynález umožňuje realizaci očkova

-6CZ 295934 B6 cích látek, které zajistí člověku imunitu, zejména proti mikroorganismům nebo virům. Může se jednat především o antigenové peptidy specifické pro virus Epsteina a Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (EP 185 573), virus pseudovztekliny nebo pro tumory (EP 259 212).

Všeobecně platí, že heterologní sekvence nukleových kyselin obsahuje rovněž promoční oblast funkční transkripce do infikované buňky, jakož i oblast nacházející se v 3' zainteresovaného genu specifikující signál ukončení transkripce a místo polyadenylace. Soubor těchto prvků tvoří expresní kazetu. Pokud jde o promoční oblast, zde se může jednat o promoční oblast přirozeně odpovědnou za expresi sledovaného genu, je-li tato schopna fungovat v infikované buňce. Může se rovněž tak jednak o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů, dokonce syntetických). Může se také jednat promoční sekvence eukaryotických nebo virových genů. Například se může jednat o promoční geny pocházející z genomu buňky, kterou chceme infikovat. Rovněž tak se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu viru, včetně použitého adenoviru. Z tohoto hlediska je možné uvést na příklad promotory genů El A, MLP, CMV, RSV, atd. Kromě jiného, tyto promoční oblasti mohou být modifikovány adicí aktivačních nebo regulačních sekvencí nebo sekvencí umožňujících tkáňově specifickou nebo majoritní expresi. Ostatně, jestliže heterologní kyselina nukleová neobsahuje promoční sekvence, může být vložena do genomu detektivního viru za takovouto sekvenci.

Heterologní sekvence nukleových kyselin může rovněž obsahovat, zejména před terapeutickým genem, signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt v sekvenčních cestách cílové buňky. Tato signální sekvence může být přirozenou signální sekvencí terapeutického produktu, ale může se rovněž jedna o jakoukoliv jinou funkční signální sekvenci nebo signální sekvenci umělou.

Tato sekvence nukleových kyselin bývá povětšinou na úrovni oblastí El, E3 nebo E4 jako náhražka nebo doplněk sekvencí odstraněných delecí.

Předkládaný vynález má jako druhý hlavní předmět adenovirus obsahující alespoň heterologní gen virového původu, jehož exprese je kontrolována induktibilním promotorem, především promotorem indukovatelným tetracyklinem.

Podle způsobu využití preferovaného vynálezu je heterologní gen virového původu odvozen z genu genomu viru AAV nebo jeho funkčních homologů.

AAV jsou viry mající DNA a relativně malou velikosti, které se integrují do genomu buněk, které infikují, a to stálým a pro dané místo specifickým způsobem. Jsou rovněž schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by indukovaly jakýkoliv vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Ostatně, jak se zdá, nejsou implikovány v patologických jevech u člověka. Genom virů AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje 4680 bází a má na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) zhruba se 145 bázemi pro replikaci viru. Zbytek genomu je rozdělen do 2 podstatných oblastí majících enkapsidační funkce : levé části genomu obsahující gen rep implikovaný ve virové replikaci a expresi virových genů pravé části genomu obsahující gen cap kódující kapsidační proteiny viru, byly zde lokalizovány tři promotory a pojmenovány podle své přibližné polohy v kartografických jednotkách p5, pl9 a p40. Čtyři proteiny jsou alespoň syntetizovány počínaje oblastí rep a pojmenovány podle své zjevné molekulové hmoty Rep78, Rep68, Rep52 a Rep40. Obě mRNA přepsané z promotoru p5 se používají pro syntézu Rep78 a Rep68. Rep52 a Rep40 jsou syntetizovány s mesažerů pocházejících z promotoru pl9. Pokud jde o gen cap, tento kóduje proteiny kapsidy viru (VP1, VP2 a VP3). VP3 je majoritní kapsidační protein a jeho aminokyselinová sekvence je obsažena v kapsidách obou největších, ale méně hojných proteinů VP1 a VP2 (viz schéma). Tyto geny rap a cap byly charakterizovány a jejich příslušné sekvence popsány v odborné literatuře (Srivastava et al., J. Virol. 45 (1983) 555).

-7CZ 295934 B6

Použití vektorů odvozených z AAA pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v odborné literatuře (viz především WO 91/180888, WO 93/09239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Všeobecně vzato, konstrukce použité v genové terapii obsahují deleci genů rep a/nebo cap, které jsou nahrazeny zainteresovaným genem.

Pro úspěšnou replikaci potřebují AAV přítomnosti pomocného viru („helper“) schopného transkomplementovat funkce nezbytné pro jejich replikaci. Může se jednat především o acenovirus, virus herpesu nebo virus vakcíny (v nepřítomnosti takovéhoto pomocného viru zůstávají AAV v latentní formě nadále obsažené v genomu infikovaných buněk, ale nemohou se replikovat a produkovat tak částečky virů). Rekombinantní AAV jsou tedy produkovány kotransfekcí, v buněčné linii infikované lidským pomocným virem (na příklad adenovirem), plazmidu obsahujícího zainteresovaný gen lemovaný dvěma oblastmi inversní repetice (ITR) daného AAV a plazmidu nesoucího enkapsidační geny (gen rep a cap) daného AAV. Koinfekce adenovirem spustí sled dějů vyúsťujících v produkci zvýšených titrů virů AAV a snižujících podstatným způsobem produkci adenoviru. Tento sled je uveden do pohybu syntézo produktu genu E1A, který indukuje transkripci z promotorů p5 a pl9 a vede k syntéze malého množství proteinů Rep. Jeden či více proteinů Rep syntetizovaných z p5 indukuje tedy syntézu s výraznějším množstvím RNAm ze 3 promotorů na úrovni podstatně vyšší a výrazně koordinovaným způsobem. V nepřítomnosti adenoviru je genom viru AAV buď ztracen, nebo integrován do chromosomu hostitele. Jiné geny adenoviru než E1A jsou rovněž nezbytné pro účinnou expresi genů viru AAV.

Předkladatel prokázal, že je možné umístit účinně alespoň expresi jednoho z virových genů viru AAV pod kontrolou promotoru indukovatelného v adenoviru a kontrolovat expresi enkapsidačních funkcí virů AAV, zejména pak expresi genů rep a/nebo cap nebo každého homologního funkčního genu.

Funkční homolog odpovídá každému genu získanému modifikací (mutace, potlačení, přidáni, atd.) genů rep nebo cap a vykazujících aktivitu stejné povahy. Takovéto funkční homologové geny mohou být rovněž geny získané hydridizací z ank nukleových kyselin pomocí sond odpovídajících genům rep nebo cap. Pokud jde o upravený gen rep, který může být kontrolován podle vynálezu, je možno uvést především jeho mutant inll77 popsaný v publikaci Y. Yang etal., (1992) Joumal of virology, 6058 - 6069) odvozený ze serinů vložených mezi kodóny 286 a 287.

Podle preferovaného realizačního postupu vynálezu je využívaný induktibilní promotor promotorem indukovatelným tetracyklinem, jak je definován výše.

Takovýto adenoviru je výhodný z několika hledisek : z hlediska manipulace výrazně zjednodušuje proces přípravy zásobních šarží virů AAV. V tomto specifickém případě se využívá pouze zmíněný adenovirus obsahující geny rep a cap pod kontrolou induktibilního promotoru, rekombinantní virus AAV a adekvátní buněčná linie. Požadované koncentrace viru AAV z takovéhoto acenoviru převyšují, jak se zdá, koncentrace získané klasickým způsobem.

Induktibilní promotor může být vložen jako náhrada jednoho z promotorů řídícího expresi sledovaného genu či sledovaných genů, zejména pak jako náhrada promotoru p5, pl9 nebo p40. Vzhledem ktomu že promotor p5 se zdá být nejvíce implikován v procesu spouštění sledu dějů vedoucích k produkci viru, dochází preferenčně kjeho nahrazení promotorem indukovatelným tetracyklinem, povětšinou typu Op2/Tk. Výhodou je, že takováto konstrukce umožňuje blokaci exprese genů rep a cap v nepřítomnosti tetracyklinu.

Enkapsidační funkce viru AAV pod kontrolou induktibilního promotoru mohou být zavedeny do různých oblastí genomu nárokovaného adenoviru. Výhodou je, že enkapsidační funkce jsou vloženy do oblasti nenarušující schopnost viru transkomplementovat viry AAV. Rovněž je možné vložit enkapsidační funkce do funkční oblasti genomu zmíněného adenoviru, když tato oblast je vložena do polohy trans buď plazmidem, nebo použitou buněčnou linií. Na příklad je možné vlo

-8CZ 295934 B6 žit gen rep, gen cap nebo geny rep a cap na úrovni oblasti El nebo E3 jakožto náhradu nebo doplněk sekvencí odstraněných delecí.

Pro eliminaci transkripčního úniku podmíněného blízkostí oblasti ITR-psi je možno kromě jiného vložit sekvenci nazývanou sekvence negativní regulace. Takováto sekvence vložená zejména mezi levou ITR a sekvenci psi požadovaného adenoviru na jedné straně a sekvenci kódující promotor indukovatelný tetracyklinem umožňuje omezit veškerou parazitní transkripční aktivaci rep a cap indukovanou v takovém případě zesilovačem transkripce nacházejícím se v levé IR adenoviru a sekvenci psi. Pokud jde o negativní sekvence, které mohou být podle vynálezu použity, je možno uvést především sekvence identifikované v promotoru vimentin (Salvatti et al., (1993), Mol Cell. Biol., 1676 - 1685) v promotoru interferon (Whitemore et al. (1990), P.N.A.S., 87, 7799 - 7803), v genu 2. lehkého řetězce kardiálního myozinu (Ruoguian-Shen et al., (1991), Mol. Cell, biol., 1676 - 1685) a v myším albuminním promotoru (Herbst et al. (1990), Mol. Cell. Biol. 3896 - 3905).

Podle preferovaného realizačního způsobu se předkládaný vynález týká rekombinantního adenoviru nesoucího expresní kazetu Op2/Tk-rep-cap.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž využívání těchto adenoviru integrujících virovou sekvenci původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem pro přípravu virů AAV.

Adenoviry, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, obsahují sekvence obrácené repetice (ITR) a jednu sekvenci umožňující enkapsidaci. Tyto adenoviry mají kromě jiného i nefunkční oblast El.

Sekvence obrácené repetice (ITR) jsou zdrojem replikace adenovirů. Jsou lokalizovány na koncích 3' a 5' virového genomu (viz obr. 1), odkud mohou být snadno izolovány klasickými metodami molekulární biologie známými všem odborníkům. Nukleotidová sekvence sekvencí ITR lidských adenovirů (především serotypů Ad2 a Ad5) je popsána v odborné literatuře, stejně jako psí adenoviry (především CAV1 a CAV2). Pokud jde o příklad o adenovirus Ad5 odpovídá levá sekvence ITR oblasti obsahující nukleotidy 1 až 103 genomu.

Sekvence enkapsidace (zejména popsaná jako sekvence Psi) je nezbytná pro enkapsidaci virové DNA. Tato oblast musí tedy být přítomná pro umožnění přípravy defektních rekombinantních adenovirů podle vynálezu. Sekvence enkapsidace je umístěna v genomu adenoviru mezi ITR levého konce 5' a genu El (Obrázek 1). Může být izolována nebo uměle syntetizována klasickými technikami molekulární biologie. Nukleotidová sekvence enkapsidace lidského acenoviru (zejména serotypů Ad2 a Ad5) je popsána v literatuře, stejně jako adenovirus psí (zejména CAV1 a CAV2). Co se týče například adenoviru Ad5, sekvence enkapsidace odpovídá oblasti obsahující nukleotidy 194 až 358 genomu.

Podle obzvláště výhodného postupu je v rekombinantních adenovirech podle předkládaného vynálezu oblast El inaktivována delecí fragmentu PvuII-BglII zasahující od nukleotidu 454 po nukleotid 3328 na sekvenci adenoviru Ad5. Tato sekvence je zmiňována v odborné literatuře a rovněž je zjistitelná z databáze (viz zejména genová banka Genebank č. M73260). V jiném preferovaném způsobu realizace je oblast El inaktivována delecí fragmentu HinfH-Sau3A zasahující od nukleotidu 382 po nukleotid 3446.

Adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny z adenovirů různého původu. Existuje skutečná celá řada různých serotypů adenovirů, jejichž struktura a schopnosti se poněkud odlišují, ale které vykazují srovnatelné genetické uspořádání.

Adenoviry podle vynálezu mohou být lidského, živočišného nebo kombinovaného původu (lidské a živočišné). Pokud jde o adenoviry lidského původu, přednostně se využívají adenoviry

-9CZ 295934 B6 zařazené do skupiny C. Z různých serotypů lidských adenovirů se přednostně využívá v rámci předkládaného vynálezu adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5).

Jak je uvedeno výše, adenoviry podle vynálezu mohou být rovněž živočišného původu nebo obsahovat sekvence pocházející z adenovirů živočišného původu. Předkladatel skutečně prokázal, že adenoviry živočišného původu jsou schopné infikovat podstatně účinněji lidské buňky a že se nedokáží šířit v lidských buňkách, ve kterých byly testovány (viz WO 94/26914). Předkladatel rovněž prokázal, že adenoviry živočišného původu nejsou nijak transkomplementovány adenoviry lidského původu, což vylučuje jakékoliv riziko rekombinace nebo propagace in vivo v přítomnosti lidského adenovirů, což může vést k utvoření infekční částečky. Použití adenovirů nebo oblastí adenovirů živočišného původu je tedy obzvláště výhodné, protože rizika souvisejí s použitím virů jakožto vektorů v genové terapii jsou ještě menší.

Adenoviry živočišného původu využitelné v rámci předkládaného vynálezu mohou být původu psího, bovinního, myšího (na příklad Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího (příklad : SAV). Z ptačích adenovirů je možno uvést serotypy 1 až 10 nacházející se ve sbírce ATCC, jak ku příkladu kmeny Phelps (ATCC VR - 432), Fontes (ATCC VR - 280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) nebo kmeny ATCC VR-831 až 835. Zbovinních adenovirů je možno použít různé známé serotypy a zejména serotypy disponibilní v ATCC (typy 1 až 8) pod odkazem ATCC VR-313, 314d, 639-642, 768 a 769. Rovněž je možno uvést myší adenoviry FL (ATCC VR-550) a E20308 (ATCC VR-528), ovčí adenovirus typu 5 (ATCC VR1343) nebo typu 6 (ATCC VR-1340), dále pak adenovirů prasečí (5359) nebo opičí adenoviiy, jako viry uvedené v ATCC pod označením VR-591-594, 941-943, 195-203, atd.

Z různých adenovirů živočišného původu se využívá v rámci vynálezu adenovirů nebo oblastí adenovirů psího původu a zejména všech kmenů adenovirů CAV2 (ku příkladu kmen manhattan nebo A26/61 /ATCC VR8-800). Adenoviry psího původu byly již dříve předmětem četných strukturálních studií. Již dříve byly popsány kompletní restrikční mapky adenovirů CAV1 a CAV2 (spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165) a geny Ela, E3 a sekvence obrácené repetice byly (ITR) klonovány a sekvencovány (viz Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241, Linné, Virus Res. 23 (1992), 119, WO 91/11525).

Předkládaný vynález se vztahuje kromě jiného i na postup vhodný pro přípravu AAV. Přesněji řečeno, předmětem předkládaného vynálezu je proces přípravy AAV vyznačující se tím, že zahrnuje kotransfekci, v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu, buněčné linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce s adenovirem obsahujícím alespoň gen původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelné tetracyklinem a buď rekombinantní virus odvozený z AAV, nebo plazmid nesoucí transgen mezi ITR a AAV.

Povětšinou se jedná o adenovirů obsahující jako heterologní virové geny, geny rep a cap.

Postup podle vynálezu využívá schopnost indukovat expresi těchto genů rep a cap vložených pod kontrolu promotoru indukovatelného tetracyklinem uvnitř adenovirů za přítomnosti dostatečného množství tetracyklinu a transkripčního aktivátoru.

Jak bylo uvedeno výše, tento postup má tu výhodu, že manipulace je zde v porovnání s klasickým způsobem zjednodušena. V daném případě s využívá pouze koinfekce buněčné linie adenovirem podle nároku a rekombinantním virem odvozeným z AAV.

Kromě adenovirů transformovaného podle vynálezu využívá tento postup buněčné linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu proteinu nazývaného aktivátor transkripce. Tento aktivátor je tvořen prvním polypeptidem, který je schopen se vázat za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů na regulační sekvenci induktibilního promotoru přítomného v adenovirů přidruženého k druhému polypeptidu, který aktivuje transkripci.

-10CZ 295934 B6

Pokud jde o protein nazývaný aktivátor transkripce, ten se vyznačuje schopností vázat se v přítomnosti tetracyklinu na regulační sekvenci a schopností aktivovat minimální přidružený promotor. Jedná se o protein tvořený dvěma polypeptidy, prvním, který se váže na operátorové sekvence tet za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu a druhým, jehož funkce spočívá v aktivování transkripce.

Podle vynálezu je první polypeptid proteinu nazývaného aktivátor transkripce supresor tetracyklinu mutovaný tak, aby vykazoval reakci opačnou k reakci divokého supresoru, to znamená, že se na operátorové sekvence tet váže pouze v přítomnosti a ne v nepřítomnosti tetracyklinu. Tento typ mutace může být realizován klasickými biologickými postupy typu mutagenéze. Rozdíl v aminokyselinách mezi divokým supresorem a supresorem mutovaným podle vynálezu může spočívat v náhradě, deleci a/nebo přidání jedné nebo několika aminokyselin. Tím jsou do takto transformovaného supresoru vloženy dvě funkční schopnosti: dokáže se vázat na regulační sekvenci zpodobněnou tetracyklinovými operátory analogicky k divokému supresoru. Naproti tomu je regulován inversním způsobem tetracyklinem.

Četné skupiny divokých supresorů tetracyklinu byly popsány v odborné literatuře, z nichž uveďme zejména skupiny A, B, C, D, E. Zejména je možno zmínit supresor nazývaný Tn 10, který patří do kategorie B. Podle vynálezu používaný supresor je odvozen z tohoto divokého supresoru TnlO. Přesněji řečeno, jedná se o supresor TnlO mutovaný alespoň v aminokyselinu lokalizovanou v polohách 71, 95, 101 nebo 102.

Obsahuje cele nebo částečně sekvenci aminokyselin zobrazenou v SEQ ID č. 8. Označuje se TetR.

Pokud jde o druhý polypeptid přítomný v proteinu nazývaném aktivátor transkripce, může se jednat o jakoukoliv již známou oblast aktivace transkripce. Podle vynálezu se jedná o oblast aktivace proteinu 16 viru herpes simplex, zejména 130 aminokyselin terminálního konce C proteinu VP16 a 11 aminokyselin tohoto terminálního konce proteinu VP16 nebo šarže peptidů terminální části C proteinu VP16 (Sceipel K. et al., EMBOJ. 1992, 13, 4961 - 4968) nebo derivátů.

V případě postupu výroby nárokovaného AAV je expresní kazeta tohoto aktivátoru transkripce integrována do genomu buněčné linie 293.

Podle předkládaného vynálezu je exprese tohoto aktivátoru transkripce rovněž vložena, v buněčné linii, pod kontrolu promotoru indukovatelného tetracyklinem nebo jeho analogy, jak bylo uvedeno výše. Jedná se o buněčnou linii 293 integrující ve svém genomu kazetu Op2/Tk-TetRVP16.

Předmětem vynálezu je rovněž buněčná linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce obsahující či nikoli induktibilní promotor, jak bylo definováno podle vynálezu. Jedná se o buněčnou linii integrující ve svém genomu kazetu Op2/Tk-TetR-VP16.

Vynález se rovněž týká použití tohoto typu buněčné linie pro produkci adenovirů nebo AAVs podle vynálezu.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy adenovirů obsahujících alespoň jeden z jejich genů, jejichž exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem.

Defektivní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny různými způsoby.

První z nich spočívá v přenosu DNA defektivního rekombinantního viru připraveného in vitro (ligací nebo ve formě plazmidu) do příslušné buněčné linie, to znamená nesoucí v poloze trans veškeré funkce nutné pro komplementaci viru a aktivátor transkripce. Tyto funkce jsou integro

-11 CZ 295934 B6 vány do genomu buňky, což zabraňuje rizika rekombinace a zajišťuje buněčné linii vyšší stabilitu.

Vektory, které se rozmnožily v přítomnosti dostatečného množství tetracyklinu nebo jeho analogů, jsou získány, purifikovány a amplifikovány klasickými metodami molekulární biologie.

Podle jedné varianty využití je možné připravit in vitro, buď ligací, nebo ve formě plazmidu, DNA defektivního rekombinantního viru nesoucího přizpůsobené delece, jeden či několik virových genů pod kontrolou promotoru induktibilního tetracyklinem a jeden nebo několik terapeutických genů. Suprese jsou povšechně realizovány na DNA defektivního rekombinantního viru digescí za pomoci přizpůsobených, vhodných restrikčních enzymů, nebo ligací, podle metod molekulární biologie, jak dokreslují uvedené příklady. Virové nebo terapeutické geny a induktibilní promotor mohou být následně vloženy do této DNA štěpením enzymů, pak ligací, a to na úrovni zvolených oblastí a ve zvolené orientaci. Takto získaný DNA nesoucí vhodné delece, jeden nebo několik virových genů pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem a jeden nebo několik terapeutických genů umožňuje generovat přímo nárokovaný rekombinantní adenovirus.

Také je možno připravit rekombinantní virus v následných etapách umožňujících postupnou introdukci heterologních genů a induktibilního promotoru. DNA prvního rekombinantního viru nesoucí vhodné delece (nebo jejich část) a induktibilní promotor, jako ku příkladu Op2/Tk, je získána ligací nebo ve formě plazmidu. Tato DNA je pak použita pro získání prvního rekombinantního viru nesoucího zmíněné delece s induktibilním promotorem. DNA tohoto prvního viru je pak izolována a kotransferována s druhým plazmidem nebo s DNA druhého defektivního rekombinantního viru nesoucí vhodné delece, zejména deleci v oblasti El, oblast umožňující homologní rekombinaci a případně terapeutický gen. Tato druhá etapa tedy generuje, podle vynálezu, rekombinantní virus.

Předkládaný vynález se týká rovněž jakékoliv farmaceutické kompozice obsahující jeden či několik rekombinantních adenovirů, jak ke uvedeno výše. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány za účelem podávánítopickou, orální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí, transdermální cestou.

Farmaceutická kompozice obsahuje farmaceutická vehikula přijatelná pro injikovatelnou formulaci. Může se jednat zejména o solné roztoky (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draslo, vápník nebo hořčík, atd., nebo směsi těchto solí), sterilní izotonické, nebo u suché kompozice, zejména lyofílizované, které přidáním sterilizované vody nebo fyziologického séra, umožňují vytvoření injikovatelných tekutin.

Dávky viru použitelné pro injikování mohou být upraveny podle různých parametrů, zejména v závislosti na aplikovaném způsobu podávání, patologii, genu, který má být exprimován nebo v závislosti na časové délce ošetřování. Všeobecně vzato, rekombinantní adenoviry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek v rozsahu od 10⁴ do 10¹⁴ pfu/ml, povětšinou od 10⁶ do 10’° pfu/ml. Termín pfu („plaque forming unit“) odpovídá infekční schopnosti virového roztoku a je ručen infekcí vhodné buněčné kultury a změřením, všeobecně po 5 dnech, počtu pláží infikovaných buněk. Metody určování koncentrace pfu virového roztoku jsou v odborné literatuře dobře zdokumentovány.

Adenoviry podle vynálezu mohou být použity pro ošetření nebo prevenci různých patologií. Obzvláště výhodné jsou pro ošetřování hyperproliferativních patologií (rakovina, restenóza, atd.) injikováním přímo do napadaného místa. Z tohoto hlediska se týká předkládaný vynález také metody ničení proliferativních buněk obsahující infikování zmíněných buněk nebo jejich části adenovirovým vektorem, jak je popsáno výše. V případě, že sebevražedný gen je genem předávajícím citlivost terapeutickému činidlu, metoda destrukce podle vynálezu zahrnuje následně ošetření buněk zmíněným terapeutickým činidlem. Pro využití této metody jsou předmětem

- 12CZ 295934 B6 vynálezu produkty obsahující rekombinantní adenovirus, ve kterém sebevražedný gen je gen, který předává citlivost terapeutickému činidlu a toto činidlo je pak jakožto produkt kombinace, využito pro souběžné oddělené nebo časově rozložené ošetření hyperproliferativních patologií. Sebevražedný gen je gen thymidin-kinázy a terapeutické činidlo je gancyklovir nebo acyclovir nebo jeho analog.

Rekombinantní vektory podle vynálezu mají mimořádně výhodné vlastnosti pro použití v genové terapii. Tyto vektory kombinují výrazné schopnosti infikovat, zabezpečovat a přenášet geny.

Předkládaný vynález je uceleněji popsán pomocí následných příkladů a obrázků, které je třeba chápat jako ilustrativní a nikoliv limitativní.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Genetická organická adenoviru Ad5. Kompletní sekvence Ad5 je k dispozici v databázi a umožňuje odborníkovi selektovat nebo vytvořit jakékoliv místo restrikce a izolovat tak jakoukoliv oblast genomu.

Obrázek 2: Genetická organizace oblasti E4

Obrázek 3: Genetická organizace AAV.

Běžné metody molekulární biologie

Klasické metody běžně používané v molekulární biologii, jako přípravné extrakce plazmidické DNA, odstřeďování plazmidické DNA v gradientu chloridu cesia, elektroforéza na agarózovém nebo akrylamidovém gelu, čištění fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo fenolchloroformem, precipitace DNA v solném prostředí etaholem nebo izopropylalkoholem, transformace na Escherichia coli, atd.. jsou odborníkům dobře známé a dostatečně v odborné literatuře popsané (Miniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratoř, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M., et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987).

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratories).

Pokud jde o ligace, fragmenty DNA mohou být odděleny podle své velikosti elektroforézou v agarózovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, vysráženy etanolem a pak inkubovány za přítomnosti DNA ligace fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Plnění proeminentních konců 5' může být provedeno fragmentem Klenow DNA polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podle upřesnění dodavatele. Zničení proeminentních konců 3' se uskuteční v přítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Zničení proeminentních konců 5' se uskuteční ošetřením nukleázou Sl.

Mutagenéze řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být uskutečněna metodou vyvinutou Taylorem et al. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764) za použití sady dodávané Amershamem. Enzymová amplifíkace fragmentů DNA technikou nazývanou PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaktion, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354, Mullis K.B. etFallona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350) může být provedena za použití „DNA thermal cycler“ (Perkin Elmer Cetus) podle upřesnění výrobce.

- 13 CZ 295934 B6

Ověření nukleotidových sekvencí může být uskutečněno metodou vyvinutou Sangerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, (1977) 5463 - 5467) za použití sady distribuované Amershamem.

Použité buněčné linie

V následně uvedených příkladech mohou být použity tyto buněčné linie:

- lidská embryonální renální linie 293 (Graham et al., J. Gen. Viro. 36 (1977) 59). Tato linie obsahuje zejména levou část genomu lidského adenoviru Ad5 (12 %) integrovanou do svého genomu.

- linie lidských buněk KB; tato linie, pocházející z lidského epidermálního karcinomu, je dosažitelná v ATCC (rev. CCL17), stejně jako podmínky umožňující její pěstování.

- linie lidských buněk Hela: tato linie, pocházející z karcinomu lidského epitelu, je dosažitelná v ATCC (rev. CCL2), stejně jako podmínky umožňující její pěstování.

- linie psích buněk MDCK: podmínky pěstování buněk MDCK byly popsány Macatneyem et al., Science 44 (1988) 9.

- linie buněk gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). Tato linie je tvořena buňkami Hela nesoucími gen E2 adenoviru pod kontrolou sekvence LTR od MMTV.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce adenoviru nesoucího svoji oblast E4 pod kontrolou promotoru Op2-Tk

Konstrukce plazmidu pIC20H/Op2-Tk

Tento plazmid nese sekvenci minimálního promotoru Tk, kterému předcházejí dvě sekvence tetracyklického operátoru. Tyto sekvence jsou rozeznány tetracyklinovým supresorem, je-li fixován tetracyklinem.

Za tím účelem jsou plazmid pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481) digerovaný subjektem Clal-BamHI a sekvence SEQ ID č. 5 obsahující dva operátory tetracyklinu před minimálním promotorem thymidm-kinázy vloženy mezi tato dvě místa.

Konstrukce plazmidu pCI20H/ITR-Op2-Tk

Tento plazmid se získává digescí Clal plazmidu pIC20H/Op2Tk a vložením fragmentu Hpa2 s obsahem ITR adenoviru Ad5 (koordináty: 1/+122). Tento fragment pochází z komerčního vektoru pSL1180 (Pharmacia) digerovaného enzymem Hind3, což je místo, do kterého je vložena ITR získaná reakcí PCR s místy enzymy Hind3 po obou stranách amplifikovaného fragmentu.

V následném pořadí se získá: ITR-Op2-TKprom.

Konstrukce plazmidu pIC20H/ITR-Op-2Tk-E4

Tento plazmid odpovídá plazmidu pIC20H/ITR-Op2-Tk digerovanému enzymem Hind3, což je místo, do kterého je vložen fragment Nhe-Xbal PY6 obsahující oblast E4 adenoviru 5. Plazmid pPY6 se získává následovně:

- 14CZ 295934 B6

Plazmid pPY6 se připraví z plazmidů pIC20H. Tento plazmid pPY2 odpovídá klonování fragmentu Avr2-Sall (Asi 1.3 kb s obsahem promotoru subjektu MMTV) plazmidů pMSG (Pharmacia) mezi místy Xbal a Sall plazmidů pIC20H připraveného z kontextu E. coli dam+. Plazmid pPY4 je odvozen z plazmidů pPY2 delecí fragmentu o velikosti 35 pb po vyštípnutí subjektem BamHl a Bgl2 a následné religaci. Plazmid pPY5 odpovídá plazmidů pIC20H, ve kterém fragment Taql-Bgl2 odpovídající oblast E4 adenoviru typu 5 umístěnou mezi polohami 35576 (Taql) a 32490 (Bgl2) byl klonován mezi místy Clal a BamHl. Oblast E4 plazmidů pPY5 je tedy vložena do fragmentu EcoRV-Sphl, který se klonuje po částečné digesci mezi místy Smál a Sphl plazmidů pPY4, v důsledku čehož se generuje plazmid pPY6

Konstrukce plazmidů pIC20H/ITR-Op2-Tk-E4-L5

Tento plazmid se získá degescí plazmidů pIC20H/ITR-Op-2Tk-E4 enzymem Kpnl a Xbal a vložením fragmentu enzymu Kpnl - Xbal o velikosti 3,1 Kb adenoviru Ad5 (koordináty: 33959-30470) obsahujícího celou oblast 5.

Konstrukce plazmidů pYG4-EP

Plazmid pIC20H/ITR-Op2-Tk-E4—L5 je degerován enzymem Xbal a Nrul, aby se získal odpovídající fragment, který ponese v následujícím pořadí ITR, Op2, promotor Tk, E4 a L5. Tento fragment je vložen v místech Xbal a Nrul plazmidů pYG4, který obsahuje celou sekvenci adenoviru od místa Xbal až po místo Shl. Tento plazmid pYG4-Ep je vektor pIC20h, ve kterém je fragment Sphl-Xbal adenoviru Ad5 (koordináty : 25095 - 28590) vložen mezi míst Sphl a Xbal.

Tento vektor pYG4-EP, s delecí acenovirové oblasti E3, obsahuje dostatečné množství adenovirových sekvencí mezi Sphl a Xbal pro doplňkovou rekombinaci adenoviru za účelem produkce rekombinantního adenoviru.

Konstrukce rekombinantního adenoviru

Je realizována kotransfekcí buněk 293/TerR-VP16 připravených podle níže uvedeného příkladu 3 s plazmidem pYG4 linearizovaným digesci Sphl a s adenovirem RSV-Pgal nebo s adenovirem nesoucím transgen, linearizovaným digesci SrFl za přítomnosti či nepřítomnosti tetracyklinu. Dále se pak postupuje podle klasických metod virologie pro selekci a amplifíkaci rekombinantního adenoviru.

Příklad 2

Konstrukce rekombinantního adenoviru nesoucího geny rep - cap aceno-přidruženého viru pod kontrolou promotoru Op2/Tk:

Konstrukce intermediálního plazmidů pXI2630

Tento intermediální plazmid umožňuje vložit místo EcoRI za Op2-Tk. Přítomnosti místa restrikce v této poloze je významná ze dvou důvodů. Slouží k vložení tohoto promotoru před rep-cap po předcházejícím potlačení promotoru p5 a rovněž umožňuje vložit tento hybridní promotor před TetR-VP16 za účelem přípravy buněčné linie 293 transformované jak je popsáno v níže uvedeném příkladu 3.

Za tím účelem je plazmid pIC20H/Op2-Tk, získaný podle protokolu popsaného v příkladu 1, digerovaný subjektem BamHl, ošetřený DNA polymerázou odvozenou z T4 za účelem uvolnění konců, pak znovu digerovaný subjektem EcoRV a fragment pocházející z této digesce a nesoucí

-15CZ 295934 B6 promotor Op2-Tk je pak vložen do místa EcorRV komerčního plazmidu pBSSK+. Orientace fragmentu je zvolena se zaměřením na přítomnost místa EcoRI za promotorem.

Vložení místa EcoRI na úrovni +1 transkripčního promotoru p5:

Pro potlačení promotoru p5 se vkládá místo EcoRI na úrovni +1 transkripčního promotoru p5 před sekvenci kódující Rep78 metodou PCR na plazmidu pAV2 (Laughlin C., Gene (1983) 23, 69 - 73). Tato reakce byla realizována pomocí oligonukleotidu:

SEQ ID č. 6 (sek 5269): 5' GAATTCTTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCG 3' EcoRI

SEQ ID č. 7 (sek 5039): 5' CTCCATGTACCTGGCTGA 3'

Takto generovaný plazmid byl vložen do pCRII (Invitrogen), aby se získal plazmid pMA4. Nukleotidová sekvence tohoto fragmentu pak byla ověřena.

Konstrukce plazmidu pMA6 s vazbou Op2-Tk-rep-cap:

Tento intermediární plazmid umožňuje vazbu induktibilního promotoru srep. Fragmenty Sall-EcoRI odvozené z pXL2630 a fragmenty EcoRI-Nrul odvozené z pMA4 jsou vloženy do míst Xhol (slučitelné s Sáli) a Nrul subjektu pIC20R (Marsh et al., Gene 32 (1984) 841) za účelem získání plazmidu pMA6.

Konstrukce plazmidu pCOl (obr. 7 EX94008) obsahujícího levou část adenoviru Ad5 až po místo Hinfl (382), multimísto klonování a fragment Sau3A (3446) - Nrul (6316) adenoviru Ad5.

5-a/ Konstrukce plazmidu pCE

Fragment ECoRI-Xbal odpovídající levému konci genomu adenoviru Ad5 byl nejdříve klonován mezi místy EcoRI a Xbal vektoru pIC19H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Tím byl generován plazmid pCA. Tento plazmid pCA pak byl následně vyštípnut enzymem Hinfl, jeho proeminentní konce 5' byly naplněny fragmentem klenow odvozeným z DNA polymerázy I z E. coli, který pak byl vyštípnut subjektem EcoRI. Takto generovaný fragment plazmidu pCA, který obsahuje levý konec genomu adenoviru Ad5, byl následně klonován mezi místy EcoRIl a Smál vektoru pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Tím byl generován plazmid pCB. Tento plazmid pCB byl pak následně vyštípnut subjektem EcoRIl, jeho proeminentní konce 5' byly naplněny fragmentem klenow odvozeným z DNA polymerázy I z E. coli, aby pak byl následně vyštípnut subjektem BamHI. Takto generovaný fragment plazmidu pCB, který obsahuje levý konec genomu adenoviru Ad5, pak byl následně klonován mezi místy Nrul a BglII vektoru pIC20H. Tím je generován plazmid pCE, který se vyznačuje tím, že má 382 prvních párů bází adenoviru Ad5 následovaných multimístem klonování.

5-b/Konstrukce plazmidu pCD'

Fragment Sau3A (3346) - Sstl (3645) a fragment Ssrl (3645) - Bari (5519) genomu adenoviru Ad5 byly nejdříve podrobeny ligací a klonování mezi místy Clal a BamHI vektoru pIC20H, čímž byl generován plazmid pPY53. Fragment Sall-Taql plazmidu pPY53 připraveného z kontextu dam- s částí genomu adenoviru Ad5 situovanou mezi místy Sau3A (3346) a Taql (5207) byl pak klonován mezi místy Sáli a Clal vektoru pIC20H, čímž byl generován plazmid pCA'. Fragment Taql (5207) - Narl (5519) genomu adenoviru Ad5 připraveného z kontextu dam- a fragment Sall-Taql plazmidu pCA'pak byly podrobeny procesu ligace a byly klonovány mezi místy Sáli a Narl vektoru pIC20H. Tím byl generován plazmid pCC. Fragment Narl (5519) - Nrul (6316) genomi adenoviru Ad5 připraveného z kontextu dam- a fragment Sall-Narl plazmidu pCC'pak

-16CZ 295934 B6 byly podrobeny procesu ligace a klonovány mezi místy Sáli a Nrul vektoru pIC20R. Tím byl generován plazmid pCD'.

5-c/ Konstrukce plazmidu pCOl

Částečná digesce enzymem Xhol a následná kompletní digesce subjektem Sáli plazmidu pCD'generuje fragment restrikce s obsahem sekvence adenoviru Ad5 z místa Sau3A (3446) do místa Nrul (6316). Tento fragment byl klonován v místě Sáli plazmidu pCE. Tím byl generován plazmid pCOl.

Konstrukce plazmidu pMA7 a pMA8

Fragment EcoRV-SnaBI odvozený z MA6 s Op2-Tk-Rep-cap-poly A+ z AAV (až po místo SnaBI polohu 4495 na sekvenci viru AAV) je vložen od místa EcoRI zpCOl v obou orientacích v poměru k ITR adenoviru. Takto získané plazmidy jsou označeny pMA7 (orientace kazety v inversním směru ITR adenoviru) a pMA8 (stejná orientace).

Konstrukce rekombinantního adenoviru nesoucího kazetu Op2-Tk-rep-cap:

Tato část popisuje konstrukci defektivního rekombinantního adenoviru nesoucího kazetu Op2-Tk-rep-cap-polyA+ adenoviru AAV. Tento adenovirus je získán kotransfekcí plazmidu pMA7 nebo pMA8 s deficientním adenovirovým vektorem v buňkách helper (linie 293) vkládajících do polohy trans funkce kódované oblastmi El (E1A a E1B) daného adenoviru. Adenoviry AdMA7 a AdMA8 byly připraveny homologní rekombinací in vivo mezi adenovirem AdRSVPgal a plazmidy pMA7 a pMA8 podle následujícího protokolu : plazmid pMA7 nebo pMA8 linearizovaný subjektem Ndel a adenovirus AdRSVBgal linearizovaný subjektem Clal jsou kotransfektovány do linie 293 za přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem rekombinace. Rekombinantní adenoviry takto generované jsou selektovány purifikací na desce. Po izolování je rekombinantní adenovirus amplifíkován do buněčné linie 293, což vede k vytvoření supernatantů kultury s obsahem nepurifíkovaného rekombinantního defektivního adenoviru, který má titr asi 1010 pfu/ml. Pro účely purifikace jsou virové částečky odstředěny na gradientu chloridu cesia běžně známou technikou (viz zejména Graham et al., Virology 52 (1973) 456).

Adenoviru AdMA7 nebo AdMA8 je konservován při -80 °C ve 20 % glycerolu.

Konstrukce rekombinantního adenoviru nesoucího Op2 / Tk rep-cap polyA+AAV v oblasti E3:

Tato část popisuje konstrukci rekombinantního adenoviru eliminovaného delecí pro El nesoucího Op2/Tk rep-cap polyA+AAV v oblasti E3.

Plazmid pMA28 obsahuje celou sekvenci adenoviru Ad (E1-, E3-) nesoucího Op2 / Tk rep-cap polyA+AAV v oblasti E3. Byl konstruován rekombinací v E. Coli vložením plazmidu pMA24 na příklad do kmene C2110 (pXL2638) (E1-, E3-) popsaného v přihlášce pCT/FR96/00215.

8.1 Konstrukce intermediálního plazmidu pMA22:

Fragment Xbal- Xbal odvozený z plazmidu pMA7 nesoucího kazetu Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV byl vložen do místa Xbal subjektu pYG4-Ep místo oblasti E3 tak, že Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV je v opačné orientaci k orientaci oblasti E3.

Takto konstruovaný plazmid je označen pMA22.

8.2. Konstrukce plazmidu pMA24 užívaného pro rekombinací v E. coli:

-17CZ 295934 B6

Fragment Nhel-Spel odvozený z plazmidu pMA22 nesoucího kazetu Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV lemovanou sekvencemi 27082 - 28593 a 3471 - 31509 adenoviru byl vložen do kompatibilního místa plazmidu pXL2756 za účelem generování plazmidu pMA24 nesoucího oblasti nezbytné pro rekombinaci zahrnující kazetu Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV, gen sacB s B. subtilis a gen rezistence proti kanamycinu.

8.3 Konstrukce rekombinantního adenoviru s Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV v oblasti E3:

Konstrukce byla provedena rekombinaci vE. coli elektroporací plazmidu pMA24 do kmene C2110 (pXL2688) nebo c2110 (pXL2789) při volbě druhé operace rekombinace v prostředí Lb, sukrózy, tetracyklinu. Tak se získá kmen C2110 nesoucí plazmid pMA28. Tento plazmid pak byl transfektován do buněk 293 po digesci subjektem Pacl.

Příklad 3

Konstrukce linie produkující 293 Op2 - Tk - TetR - VP16:

Tato část popisuje konstrukci linie 293 nesoucí ve svém genomu integrovanou kazetu hybridního transaktivátoru TetR-VP16 pod kontrolou promotoru Op2-Tk. Za tím účelem byl plazmid pMA2 konstruován pro vytvoření linie kontransfekcí plazmidu pMA2 s plazmidem pMSCV (Hawley et al., J. Exp. Med. (1993), vol76, 1149 - 1163) nesoucím gen rezistence proti neomycinu pod kontrolou promotoru PGK (fosfoglycerat-kináza). Plazmid pMA2 je konstruován tak, že se vloží fragment Sal-EcoRI se subjektem pXL2630 mezi kompatibilní místa Xhol-EcoRI plazmidu pUHD17.1. Ten obsahuje sekvence kódující mutovaný supresor tetracyklinu operačně vázaný na sekvenci VP16. Tento vektor je odvozen od vektoru pUHD15.1 (H. Bujard, P.N.A.S. U.S.A. 1992, 89, 55476 - 5551), který obsahuje sekvenci divokého tetracyklinového supresoru přidruženého 130 aminokyselinám terminálního konce C viru herpes simplex VP16. Fragment XbalEco47III s 399 páry bází odpovídajících aminokyselinám 3 - 135 mutovaného supresoru tetracyklinu je zaměněn za odpovídající fragment omezení sUHD15.1, aby se získal vektor pUHD17.1.

Linie 293 Op2-Tk-TetR-VP16 vynálezu byla konstruována kotransfekcí buněk zvolených v přítomnosti fosforečnanu vápenatého plazmidy pMA2 a pMSCV a konstrukcí kódující receptor s obsahem glukokortikoidů. Přesněji, buňky linie 293 ve schránkách o průměru 5 cm byly transfektovány prostřednictvím 1 až 5 pg plazmidu pMA2.

Selekce klonů rezistentních vůči geneticinu

Po transfekci jsou buňky promyty, je přidáno prostředí kultury (MEM, Sigma) doplněné fetálním telecím sérem (7 %) a buňky jsou po dobu 20 hodin inkubovány. Příštího dne se buňky selektují v přítomnosti geneticinu G418 (Gibco-BRL, Life Technologies) v koncentraci 400 mg/1. Geneticin se mění každé tři dny a selektovatelné klony se objeví zhruba po 3 týdnech. Jakmile jsou všechny netransfetované buňky mrtvé, přežívají pouze buňky s vloženým genem odolnosti a ty se pak dělí kvůli generování buněčných klonů. Když jsou buněčné klony dostatečně velké, aby mohly být postřehnutelné pouhým okem, jsou individuálně transferovány do kulturových otvorů desky „24 otvorů“. Každý klon je potom postupně amplifíkován v přítomnosti geneticinu zprvu v otvorech kulturované desky „12 otvorů“, pak „6 otvorů“ a pak je amplifíkován v buněčných kulturových schránkách. Každý buněčný klon je tedy konservovány zmrazením v kapalném dusíku.

Určitý počet klonů byl izolován, amplifíkován a selektován se zaměřením na jejich schopnost exprimovat reportérový gen na příklad lacZ pod kontrolou promotéru Op2-Tk po přidání přiměřené koncentrace tetracyklinu. Použitým plazmidem je pMA9 vytvořený vložením fragmentu StuI-BamHI odvozeného zpRSVgalIX nesoucího sekvenci kódující β-galaktoidázu E. coli a

-18CZ 295934 B6 signál jádrové lokalizace v plazmidů pMA2 předběžně linearizovaným prostřednictvím subjektu EcoRI, ošetřeným prostřednictvím DNA polymerázy bakteriofágu T4 za účelem uvolnění jeho konců a digesce prostřednictvím BamHI.

Z těchto klonů pak byly klony umožňující podmíněnou expresi rep-cap nesených adenovirem popsaným výše a umožňujícím produkci AAV se zvýšenými titry použity jakožto produkční linie.

SEZNAM SEKVENCÍ

INFORMACE O SEQ ID Č. 1: Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 61 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární Typ molekuly: cDNA

Popis sekvence: SEQ ID č. 1:

GATCCGGTCG CTCGGTGTTC

GAGGCCACGC GTCACCTTAA. TATGCGAAGT

GGACCTCGGA

INFORMACE O SEQ ID Č. 2:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 64 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: cDNA

Popis sekvence: SEQ ID č. 2:

AGATCTGCGG TCCGAGGTCC

ACTTCGCATA

TTAAGGTGAC

CGTGGCCTCG

ACACCGAGCG

ACCG

INFORMACE O SEQ ID Č. 3:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 67 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

-19CZ 295934 B6

Typ molekuly: cDNA

Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

CGATACTTTT CTCTATCACT	GATAGGGAGT	GGTCTCGAGA	CTTTTCTCTA
CACTGATAGG			60
GAGTGGT			67
INFORMACE 0 SEQ ID Č. 4:
Charakteristika sekvence: (A) Délka: 75 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární
Typ molekuly: cDNA
Popis sekvence: SEQ ID č. 4:
CGCAGATCTA CCACTCCCTA	TCAGTGATAG	AGAAAAGTCT	CGAGACCACT
CCCTATCAGT			60
GATAGAGAAA AGTAT			75
INFORMACE 0 SEQ ID Č. 5:
Charakteristika sekvence: (A) Délka: 141 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární
Typ molekuly: cDNA
Popis sekvence: SEQ ID č. 5:
ATCGATACTT TTCTCTATCA	CTGATAGGGA	GTGGTCTCGA	GACTTTTCTC
TATCACTGAT			60
AGGGAGTGGT AGATCTGCGG	TCCGAGGTCC	ACTTCGCATA	TTAAGGTGAC
GCGTGGCCTC			120
GAACACCGAG CGACCGGATC C			141

INFORMACE O SEQ ID Č. 6:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

-20CZ 295934 B6

Typ molekuly: cDNA

Popis sekvence: SEQ ID č. 6:

GAATTCTTTTCGAAGCGGGAG GTTTGAACGC G

INFORMACE O SEQ ID Č. 7:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: cDNA

Popis sekvence: SEQ ID č. 7:

CTCCATGTAC CTGGCTGA

INFORMACE O SEQ ID Č. 8:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 206 párů bází (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: cDNA

Popis sekvence: SEQ ID č. 8:

Met

Ser

Arg

Leu

Asp

Lys

Ser

Lys

Val

Ile

Asn

Ser

Ala

Leu

Glu

Leu

1

5

10

15

Leu

Asn

Glu

Val

Gly

Ile

Glu

Gly

Leu

Thr

Thr

Arg

Lys

Leu

Ala

Gin

20

25

30

Leu

Leu

Gly

Val

Glu

Gin

Pro

Thr

Leu

Tvr

Trp

His

Val

Lys

Asn

Lys

35

40

45

-21 CZ 295934 B6

Arg

Ala 50

Leu

Leu

Asp Ala

Leu 5'5

Ala

Ile

Glu

Met

Leu 60

Asp

Arg

Hus

Thr

K1S

Phe

Cys

Pro

Leu

Lys

Gly

1...

Ser

Trp

Gin

Asp

Phe

Leu

Arg

Asn

65

70

75

80

Asn

Ala

Lys

Ser

Phe

Arg

Cys

Ala

Leu

Leu

Se r

His

Arg

Asn

Gly

Ala

85

90

95

Lys

Val

His

Ser

Glu

Thr

Arg

Pro

Thr

Glu

Lys

Gin

Tyr

Glu

Thr

L^u

100

105

1 10

Glu

Asn

Gin

Leu

Ala

Ph.s

Leu

Cvs

Gin

Gin

Gly

Phe

Ser

Leu

Glu

Asn

1 15

120

(25

Ala

Leu

Tyr

Ala

Leu

Ser

Ala

Val

Gly

His

Phe

Thr

Leu

Gly

Cys

Val

130

1 35

140

Leu

Glu

Asp

Gin

Glu

His

Gin

Val

A let

G u u

Glu

Arg

Glu

Th

p

1 45

1 50

1 55

1 60

Thr

Asp

Ser

Met

Pro

Pro

Leu

Leu

Arg

Gin

Ala

Ile

Glu

Leu

Phe

165

170

1 75

Asp

His

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro

Ala

Phe

Leu

Phe

Gly

Glu

Leu

Ile

(80

i 85

150

Ile

Cys

Gly

Leu

Glu

Lys

Glrt

Leu

Lys

Cys

Glu

Ser

Ser

195 2C0 205

Claims (69)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní adenovirus, který obsahuje induktibilní promotor, přičemž alespoň jeden gen adenovirového původu je umístěn pod kontrolu induktibilního promotoru, a dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje terapeutický gen.
2. 2. Rekombinantní adenovirus podle nároku 1, kde induktibilní promotor je zvolen z promotorů reagujících na těžké kovy, tepelné rázy, hormony nebo tetracyklin.
3. 3. Adenovirus podle nároku 1 nebo 2, kde se jedná o promotor induktovatelný tetracyklinem nebo jeho analogy.
4. 4. Adenovirus podle nároku 3, kde promotor induktovatelný tetracyklinem obsahuje minimální promotor sdružený operačně s regulační sekvencí obsahující alespoň operátor tetracyklinu.
5. 5. Adenovirus podle nároku 4, kde regulační sekvence obsahuje alespoň dva operátory tetracyklinu.
6. 6. Adenovirus podle nároku 4 nebo 5, kde regulační sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 4 nebo její derivát.
7. 7. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 6, kde minimální promotor je odvozen z lidského CM V.

   -22CZ 295934 B6
8. 8. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 7, kde minimální promotor odpovídá oblasti situované mezi nukleotidy +75 až -53 nebo +75 až -31 promotoru odvozeného z lidského CM V.
9. 9. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 6, kde promotor je homologní nebo heterologní promotor virového genu, obsahující mutaci, která eliminuje schopnost zajistit sám transkripci genu virového původu, který kontroluje.
10. 10. Adenovirus podle nároku 9, kde minimální promotor je odvozen z homologního promotoru daného virového genu.
11. 11. Adenovirus podle nároku 9, kde minimální promotor je odvozen z promotoru thymidinkinázy viru Herpes Simplex.
12. 12. Adenovirus podle nároku 11, kde minimální promotor obsahuje sekvenci SEQ ID č. 1 nebo SEQ ID č. 2 nebo její derivát.
13. 13. Adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 12, kde minimální promotor je umístěn před virový gen určený k transkripci náhradou za jeho vlastní promotor.
14. 14. Adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 13, který obsahuje kromě již zmíněného minimálního promotoru vlastní promotor daného virového genu, avšak v inaktivované nebo nefunkční formě.
15. 15. Adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 14, kde regulační sekvence je umístěna před minimální promotor.
16. 16. Adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 14, kde regulační sekvence je umístěna za daný virový gen.
17. 17. Adenovirus podle nároku 16, kde regulační sekvence je přímo vázána či nikoli na daný virový gen.
18. 18. Adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 17, kde induktibilní promotor obsahuje element Op2/Tk.
19. 19. Adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 6 nebo 9 až 18, kde induktibilní promotor obsahuje sekvence SEQ ID č. 5 nebo její derivát.
20. 20. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 19, který obsahuje alespoň jeden homologní gen, jehož exprese je pod kontrolou induktibilního promotoru.
21. 21. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 20, který obsahuje alespoň jeden homologní gen, jehož exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem nebo jeho analogy.
22. 22. Rekombinantní adenovirus podle nároku 20 nebo 21, kde gen nebo geny představují část nebo celou genomovou oblast adenoviru, nutnou pro jeho replikaci a/nebo propagaci.
23. 23. Rekombinantní adenovirus podle nároku 22, kde oblast nutná pro jeho replikaci a/nebo propagaci je zvolena z celé oblasti nebo části oblasti E4, E2, IVa2 a/nebo L5.

    -23 CZ 295934 B6
24. 24. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, kde oblast E2 je reprezentována fragmentem zvoleným z fragmentů odpovídající cDNA odvozené z 72K, cDNA polymerázy odvozené z 140K a cDNA preterminálního proteinu odvozené z 87K.
25. 25. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, kde oblast E4 je reprezentována fragmentem Taql-Bgl2 odpovídajícím nukleotidům 35576-32490.
26. 26. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, kde oblast E4S je reprezentována alespoň kódujícím rámcem ORF6.
27. 27. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23 nebo 25, kde oblast E4 je reprezentována fragmentem Bgl2 situovaným mezi polohami 34115 a 32490 a sekvencemi ORF6 a ORF7.
28. 28. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, kde oblast kódující IVa2 je tvořena fragmentem zvoleným z fragmentů BglII-NruI s nukleotidy 3328 až 6316, fragmentů Dral-NlalII odpovídajících nukleotidům 4029 až 5719 a fragmentů Dral-Xhol odpovídajících fragmentu 4029 až 5788 na sekvenci adenoviru Ad5.
29. 29. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 23 a 25 až 27, který nese deleci celku nebo části genu El a má celou oblast E4 nebo její část pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
30. 30. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 24, který nese deleci celku nebo části genu El a má celou oblast E2 nebo její část pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
31. 31. Rekombinantní adenovirus nároků 1 až 27 a 29, který nese deleci celku nebo části genů El a E2 a má celou oblast E4 nebo její část pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
32. 32. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 27 a 30, který nese deleci celku nebo části genů El a E4 a má celou oblast E2 nebo její část pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
33. 33. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 20 až 32, kde oblast pod kontrolou promotoru Op2/Tk je zbavena svého vlastního promotoru.
34. 34. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 20 až 33, který obsahuje také sekvenci nukleových kyselin kódující jeden či více terapeutických genů.
35. 35. Rekombinantní adenovirus podle nároku 34, kde sekvence nukleových kyselin je přítomna v oblastech El, E3 nebo E4 jako náhrada nebo doplněk sekvencí eliminovaných deleci.
36. 36. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 19, který obsahuje alespoň jeden heterologní gen virového původu, jehož exprese je pod kontrolou induktibilního promotoru.
37. 37. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 19 a 36, který obsahuje alespoň jeden heterologní gen virového původu, jehož exprese je pod kontrolou promotoru induktovatelného tetracyklinem nebo jeho analogy.
38. 38. Rekombinantní adenovirus podle nároku 36 nebo 37, kde gen je genem z genomu viru AAV nebo jeho funkčním homologem nebo jeho derivátem.
39. 39. Rekombinantní adenovirus podle nároku 38, kde gen představuje enkapsidační funkce viru AAV.

    -24CZ 295934 B6
40. 40. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 36 až 39, který obsahuje exprimovatelné geny rep a/nebo cap viru AAV nebo jejich homology pod kontrolou induktibilního promotoru.
41. 41. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 36 až 40, který nese expresní kazetu Op2/Tk-rep-cap.
42. 42. Rekombinantní adenovirus podle nároku 41, kde promotor Op2/Tk nahrazuje původní promotor p5.
43. 43. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 36 až 42, kde heterologní gen virového původu a induktibilní promotor jsou přítomny na úrovni oblasti El genomu zmíněného viru jako náhrada na doplněk sekvencí eliminovaných delecí.
44. 44. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 43, který obsahuje svoje oblasti ITR a sekvenci umožňující enkapsidaci.
45. 45. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 44, kde je alespoň oblast El nefunkční.
46. 46. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 45, kde genom adenoviru je lidského, živočišného nebo kombinovaného původu.
47. 47. Rekombinantní adenovirus podle nároku 46, kde adenovirus lidského původu je vybrán z adenovirů skupiny c, a to výhodně z adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad5).
48. 48. Rekombinantní adenovirus podle nároku 47, kde adenovirus živočišného původu je vybrán z adenovirů psího, bovinního, myšího, ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího původu.
49. 49. Použití rekombinantního adenoviru podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 48 s obsahem alespoň genu původu AAV pod kontrolou promotoru induktovatelného tetracyklinem pro přípravu AAV.
50. 50. Způsob přípravy AAV, vyznačující se tím, že zahrnuje kontransfekci, v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů, buněčné linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce s adenovirem podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 48 obsahujícím alespoň gen původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem a buď rekombinantní virus odvozený z AAV, nebo enkapsidační plazmid nesoucí transgen mezi ITR daného AAV.
51. 51. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že adenovirus obsahuje geny rep a kap pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem.
52. 52. Způsob podle nároku 50 nebo 51, vy z n a č uj í c i se tím, že produkce viru AAV je indukována přítomností dostatečného množství tetracyklinu nebo jeho analogů.
53. 53. Způsob podle nároků 50 až 52, vyznačující se tím, že transformovaná buněčná linie je odvozena z linie 293.
54. 54. Způsob podle nároku 53, vy z n ač uj í cí se tím, že buněčná linie 293 obsahuje ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce tvořeného prvním polypeptidem schopným se vázat za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu na regulační sekvenci induktibilního promotoru přítomného v adenoviru sdruženého s druhým polypeptidem aktivujícím transkripci.

    -25CZ 295934 B6
55. 55. Způsob podle nároku 54, v y z n a č u j í c í se tím, že první polypeptid je divoký supresor tetracyklinu, který obsahuje mutaci, udělující mu schopnost vázat se na regulační sekvenci induktibilního promotoru výlučně v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů.
56. 56. Způsob podle nároku 55, vyznačující se tím, že mutací je zde delece, substituce a/nebo delece alespoň aminokyseliny sekvence kódující divoký supresor tetracyklinu.
57. 57. Způsob podle nároku 55 nebo 56, vyznačující se tím, že mutovaný supresor tetracyklinu je divoký supresor TnlO mutovaný alespoň v jednu ze svých aminokyselin lokalizovaných v polohách 71, 95, 101 nebo 102.
58. 58. Způsob podle jednoho z nároků 54 až 57, vy z n a č u j í c í se tím, že se jedná o supresor tetracyklinu obsahující sekvenci SEQ ID č. 8.
59. 59. Způsobpodle jednoho znároků 54 až 58, vyznačující se t í m , že druhý polypeptid obsahuje oblast aktivace transkripce proteinu.
60. 60. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že se jedná o protein virion 16, VP16, subjektu HSV.
61. 61. Způsob podle jednoho z nároků 50 až 60, vy z n a č uj í c í se t í m , že expresní kazeta zmíněného aktivátoru transkripce obsahuje promotor indukovatelný tetracyklinem nebo jeho analogy.
62. 62. Způsob podle jednoho z nároků 50 až 61,vyznačující se tím, že využívá buněčnou linii 293 integrující ve svém genomu expresní kazetu Op2/Tk-TetR-VP16.
63. 63. Buněčná linie, která je linií 293 integrující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce podle nároků 54 až 60.
64. 64. Buněčná linie podle nároku 63, která integruje ve svém genomu expresní kazetu Op2/Tk-TetR-VP16.
65. 65. Použití buněčné linie podle nároku 63 nebo 64 pro produkci adenovirů nebo AAV.
66. 66. Způsob produkce adenovirů podle kteréhokoliv znároků 1 až 35, vyzn ač u j ící se tím, že zahrnuje krok kotransfekce, v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů, buněčné linie nesoucí v poloze trans funkce nezbytné pro komplementaci adenovirů a aktivátor transkripce podle nároků 54 až 60, přičemž první DNA pro kotransfekci obsahuje levou část genomu zmíněného adenovirů s delecí v oblasti Ela druhá DNA pro kotransfekci obsahuje alespoň pravou část genomu zmíněného adenovirů s oblastí důležitou pro jeho replikaci, pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, a část společnou s částí první DNA, a krok, kdy se izolují produkované rekombinantní adenoviry.
67. 67. Způsob podle nároku 66, vyznaču j í cí se tím, že první nebo druhá DNA nese kromě jiného zainteresovanou heterologní sekvenci DNA.

    -26CZ 295934 B6
68. 68. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň rekombinantní adenovirus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35.
69. 69. Farmaceutická kompozice podle nároku 68, vyznačující se tím, že obsahuje 5 farmaceuticky přijatelné vehikulum pro injikovatelnou formulaci.