EP0789768A1 - Proteine g du virus respiratoire syncytial exprimee sur membrane bacterienne - Google Patents

Proteine g du virus respiratoire syncytial exprimee sur membrane bacterienne

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EP0789768A1
EP0789768A1 EP95939337A EP95939337A EP0789768A1 EP 0789768 A1 EP0789768 A1 EP 0789768A1 EP 95939337 A EP95939337 A EP 95939337A EP 95939337 A EP95939337 A EP 95939337A EP 0789768 A1 EP0789768 A1 EP 0789768A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
protein
bacterium
polypeptide
heterologous polypeptide
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95939337A
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German (de)
English (en)
Inventor
Hans Binz
Thien Nguyen Ngoc
Stefan Stahl
Mathias Uhlen
Per Ake Nygren
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Pierre Fabre Medicament SA
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Pierre Fabre Medicament SA filed Critical Pierre Fabre Medicament SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/882—Staphylococcus

Definitions

  • the present invention relates to a method of recombinant DNA technique making it possible to modify punctually by site-directed mutagenesis, nucleotides in a gene coding for a polypeptide sequence, useful in particular for obtaining vaccines by the oral route against the respiratory syncitial virus ( VRS); it also relates to recombinant peptides and bacteria capable of being obtained by this process, the compositions containing them, as well as the corresponding nucleotide sequences.
  • VRS respiratory syncitial virus
  • the respiratory syncytial virus (RSV) is the most common cause of respiratory diseases in newborns: bronchopneumopathies
  • RSV is classified in the family of Paramyxoviridae, genus pneumovirus comprising a non-segmented RNA genome, of negative polarity, coding for 10 specific proteins.
  • RSV structural proteins for a vaccine such as the envelope proteins called protein F (fusion protein) or protein G, a 22 Kd glycoprotein, a protein of 9.5 Kd, or the major capsid protein (protein N).
  • Application WO 89/02935 describes the protective properties of the entire F protein of RSV, optionally modified in monomeric or desacelylated form.
  • RSV infections of the upper airways treatment is essentially based on symptomatic medications identical to those of other viral infections.
  • RSV infections of the lower airways treatment in infants is based on maintaining proper hydration, aspirating secretions and administering oxygen if necessary.
  • a positive effect has been observed with ribavirin, a nucleotide active in vitro against
  • the subject of the present invention is a process for obtaining a peptide or a protein, characterized in that a non-pathogenic bacterium for mammals is introduced: a) a DNA sequence coding for a heterologous polypeptide carried by a peptide sequence between amino acid residues 130 and 230 of protein G of the respiratory syncytial virus, or a peptide sequence having at least 80% homology with said peptide sequence, b) the means allowing the expression of the polypeptide on the surface of the membrane of the bacteria.
  • the heterologous peptide can be expressed fused with a fragment allowing the anchoring in the membrane of the bacterium.
  • Protein G is an RSV envelope glycoprotein, with a molecular weight between 84 and 90 Kd, poor in methionine.
  • the sequence of protein G differs for subgroups A and B of RSV; the terms "protein G sequence" when used in the present application, should be understood as referring to both the sequence of subgroup A or of subgroup B, when this is not specified differently.
  • the Applicant has demonstrated that the sequence between amino acids 130 and 230 of the natural protein G is particularly suitable for inducing effective protection against infection by RSV, subgroups A and B, without inducing the pathologies observed. with vaccines based on the whole virus inactivated by formalin, or observed with whole F and G proteins.
  • the means allowing the expression of the polypeptide are known to those skilled in the art and are adapted according to the bacteria used.
  • the DNA sequence is introduced in the form of a plasmid, such as a shuttle plasmid.
  • the DNA sequence is integrated into the chromosome of the bacterium RSV proteins have to date been expressed in different expression systems such as vaccinia virus, baculoviruses or adenoviruses .
  • potential problems are associated with the presence of residual virus particles.
  • the method according to the present invention uses commensal bacteria from humans, apathogenic and edible.
  • gram-positive bacteria are used, in particular the bacteria may belong to the genus Staphylococcus.
  • Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus which are bacteria used in the food industry for many years, and can be administered, alive, orally.
  • Expression systems of heterologous epitopes on the surface of S. xylosus have been described in particular by N'guyen et al in Gene, 1993, 128. 89-94, as well as for S. carnosus by Samuelsson et al in J. Bacteriol. , 1995, 177, 1470-1476.
  • the heterologous polypeptide is expressed on the surface of the membrane of the bacterium, in a conformation essentially identical to that of the corresponding epitope of the natural protein G.
  • the presentation of the recombinant protein on the membrane surface of the bacteria depends on its chemical nature and its peptide sequence.
  • the amino acid cysteine at positions 173 and / or 186 has been replaced by an amino acid which does not form of disulfide bridge, in particular serine.
  • Such a mutation promotes the formation of the disulfide bridge between the cysteine residues remaining in positions 176 and 182, which is critical for the immunogenicity of the sequence; it prevents the formation of disordered disulfide bridges (A: Figures 1 and 2).
  • Peptides useful for the implementation of such a process are those comprising in particular one of the sequences ID No. 3 or ID No. 4.
  • the amino acids phenylalanine corresponding to positions 163, 165, 168 and / or 170 of the sequence of protein G are replaced by an acid polar amine, in particular serine (B: Figures 1 and 2).
  • polypeptide can in particular have the sequence ID No. 5.
  • the suppression of the hydrophobic region located near the critical loop between the two amino acids cysteine in positions 176 and 182, allows the recombinant protein to better cross the bacterial membrane and to correctly expose the immunodominant part on the membrane surface.
  • sequence of the heterologous peptide expressed in the bacterium can include the sequence ID No. 6.
  • sequences having at least 80% and preferably at least 90% homology with the sequences mentioned above are suitable for the implementation of the invention. They include in particular the sequences resulting from point mutations in the nucleotide sequence and comprising the replacement of at least one amino acid by an equivalent amino acid; equivalent amino acid is understood to mean a molecule having a similar chemical structure and a similar molecular weight.
  • the invention also comprises a bacterium expressing a peptide or a protein, capable of being obtained by the method described in the present application. Said bacteria can be alive or killed.
  • the DNA sequence introduced into the bacterium leads to the expression of the heterologous polypeptide in the form of a fusion protein.
  • a sequence coding for another peptide is then incorporated into the construction, which will act as a "spacer” or spacer and allow optimal presentation of the heterologous polypeptide on the surface of the bacteria.
  • a protein which can advantageously be used as a "spacer” is a protein binding to human serum albumin, in particular the G protein of streptococcus (designated in the rest of the text by BB), or one of its fragments.
  • the fusion of the heterologous polypeptide with the spacer is done by the C-terminus of said polypeptide, to promote the accessibility of the antigen to the immune system.
  • Polypeptides or bacteria having one or more of the above characteristics are useful as medicaments.
  • the invention comprises pharmaceutical compositions, characterized in that they comprise a polypeptide or a bacterium according to the invention in admixture with pharmaceutically acceptable adjuvants.
  • the live vector oral vaccine must include the modified protein which has the optimal conformation to induce the best protection against RSV. This is why the present invention also relates to an application of such a pharmaceutical composition to the preparation of an oral vaccine intended to prevent infections caused by the respiratory syncytial virus.
  • the subject of the invention is the application of such a composition to the preparation of a parenteral, enteral or mucosal vaccine intended to prevent infections caused by the respiratory syncitial virus.
  • the subject of the invention is the nucleotide sequences coding for a polypeptide carried by a peptide sequence comprised between the amino acid residues 130 and 230 of the protein G of the respiratory virus or for a polypeptide having at least 80% homology with said sequence peptide, and further comprising the means allowing expression of the polypeptide on the surface of the membrane of a non-pathogenic bacterium of the genus Staphylococcus.
  • Figure 1 Construction of the shuttle vector pS-'mpl 8BBXM.
  • Figure 2 Construction of the shuttle vector pSPPmpl ⁇ BBXM.
  • Figure 3 Extraction and analysis of surface recombinant S. xylosus membrane proteins.
  • Figure 4 Analysis by flow cytometry of the recombinant proteins on the surface of S. xylosus.
  • Figure 5 Analysis by flow cytometry of the recombinant proteins on the surface of S. carnosus.
  • Figure 6a Antibody response induced by S. carnosus and the BB protein in BALB / c mice.
  • Figure 6b Antibody response induced by S. carnosus and the BB protein in C57B1 / 6 mice.
  • hybridization / ligation buffer 50mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 1 mM ATPP, 1 mM 1, 4-dithiothreitol [DTT ], 5% Polyethylene glycol [PEG] 8000.
  • the hybridization mixture is incubated at 70 ° C. for 5 min and allowed to return to 37 ° C. before adding 3 units of T4 DNA ligase (BRL) followed by 15 min of incubation at 37 ° C.
  • the reaction mixture is rinsed before adding 0.2 pmol of the following oligo.
  • the hybridization / ligation procedure is repeated as many times as a new 5 ′ phosphorylated complementary oligo is added.
  • the DNA duplex fixed on magnetic beads can be separated from the support by cutting with enzymes of suitable restrictions.
  • oligonucleotide linker (5'-AGCTTGGCTG TTCCGCCATGGCTCGAG- 3 ', with the complementary strand) is inserted into the HindIII site of the plasmid pSZZmpl ⁇ XM (Hansson et al, 1992, J. Bacteriol., 174: 4239-4245), thus creating two additional restriction sites Ncol and Xhol downstream of the HindIII site of the resulting vector pSZZmpl 8 (XhoI) XM.
  • a gene fragment encoding 198 amino acids, called BB, from the binding region of the serum albumin of the streptococcal protein G (Nygren et al, 1988. J. Mol.
  • the fragment is digested with HindIII and Xhol and cloned downstream of the multiple cloning site mp l ⁇ of the vector pSZZmpl 8 (XhoI) XM; the resulting vector pSZZmpl 8 (XhoI) BBXM is digested with NotI and HindIII.
  • the fragment containing ZZ is replaced by another fragment digested with the same vector rectification enzymes pE'mpl ⁇ (Sophia Hober, unpublished).
  • the resulting vector is named pSE'mpl ⁇ BBXM ( Figure 1).
  • hyieus is isolated by a SalI-HindIII digestion and ligated into the plasmid. pRIT28 previously digested with the same enzymes. The resulting plasmid designated pSLip contains the origin of both E. coli and S. aureus.
  • a gene fragment coding for the C-terminal part is generated by PCR with the primers (1: S'-CCGAATTCTCGAGGCTETTAAAGAAAATAC-S 'and 2: 5'- CCAAGCTTGGATCCTGCGCAGATCTTGGTGTTGGT _TTTTG-3 ') on the plasmid template pLipPS17 thus creating two restriction sites EcoRI and Xhol downstream and Fspl, BamHI, HindIII upstream.
  • the gene fragment coding for the C-terminal part of the propeptide is digested with EcoRI / HindIII and cloned into the vector pRIT28 to verify the sequence then digested XhoI / BamIII and transferred to the restriction sites SalI / BamHI of the vector pSLip.
  • the resulting plasmid pSPP is digested with HindIII, complemented by the Klenow polymerase enzyme and religated to give the plasmid pSPPHindIII.
  • the shuttle vector pSPPmpl ⁇ BBXM (FIG. 2) is constructed by NotI digestion of pSPPHindIII, followed by filling, digested with BamHI and ligated with a BamIII / EcoRV fragment isolated from pSE'mpl ⁇ BBXM.
  • the proteins are separated on two identical SDS-PAGE gels (12%) with the precolored standard molecular size markers (Gibco BRL). A gel is colored with Coomassie Blue. The second is transferred to Problot TM membrane (Applied Biosystem) for the immunoblot with the specific anti-G l antibody (obtained from rabbit serum immunized with the peptide G l (aal 74-187) according to current protocols d 'immunization). See Figure 3.
  • the cultures of the recombinant S. xylosus bacteria are made as described above.
  • To build a stock solution we resuspends the bacteria in a 0.1% PBS solution of Sodium Azide (w / v) at the final concentration estimated by optical density (600nm) equal to unity.
  • 30 ⁇ l of stock solution are aliquoted in each conical well of a microtiter plate, centrifuged at 550 g for 10 minutes at 4 ° C.
  • the bacterial pellet is resuspended in a volume of 150 ⁇ l of PBS solution containing rabbit serum polyclonal anti-G2 (titrated 1: 1,280,000) diluted to 1 / 200th, incubation for 30 minutes.
  • the bacterial cells are rinsed twice with PBS and incubated in 150 ⁇ l of a PBS solution containing anti-rabbit FITC (Sigma) diluted to 1/100 for a period of 30 minutes. After rinsing the cells twice with PBS buffer, it is resuspended in a Falcon tube containing 1 ml of PBS-Paraformaldehyde buffer 1% (w / v). The prepared samples are analyzed on the FACScanTM device (Becton Dickinson). The fluorescence distribution of each cell suspension is analyzed by the LYSIS HTM software and is represented by fluorescence histograms. See Figure 4.
  • Example 5 The cultures of the recombinant S. carnosus bacteria transformed by the shuttle vector pSPPG2BBXM, or pSPPG2subBBXM, or pSPPG2delBBXM are made as described in Example 2.
  • the analysis by FACscan is identical to that used in Example 3, with the only difference that the bacterial pellet is resuspended in a volume of 150 ⁇ l of PBS solution containing anti-G2 monoclonal mouse serum (860 ⁇ g / ⁇ l) diluted 1/400, incubation for 60 minutes.
  • the fluorescence distribution of each cell suspension is analyzed by the LYSIS II T M software and is represented by fluorescence histograms. See figure 5.
  • Example 5 Example 5
  • mice received 8 oral administrations (gastric intubation), once a week, of 10 10 S. carnosus, transformed by the vector pSPPBBXM, per mouse under 0.5 ml .
  • the dosage of anti-BB IgG serum antibodies is determined by ELISA test.
  • the secondary antibody is revealed by depositing 100 ⁇ l of Microvvell TMB substrate in all the wells, then the enzymatic reaction is blocked by adding 100 ⁇ l of 1 M H 2 S04 to all the wells of the microplate.
  • the results are read at 450 nm with the DYNATECH MR5000 or LABSYSTEMS iEMS plate reader).
  • the dosage of anti-staphylococcal IgG serum antibodies is determined by ELISA as described above.
  • the antigens adsorbed are whole Staphylococci at a concentration of 108 bacteria per well.
  • the results are read at 450 nm with the DYNATECH MRS 000 or LABSYSTEMS iEMS plate reader).
  • BALB / c mice receive 3 subcutaneous BB injections in the presence of Fréund adjuvants.
  • the blood is taken individually on D38 and the anti-BB titers are determined by ELISA test as described in Example 5.
  • FIG. 7 shows that 3 subcutaneous injections of 10 ng of BB do not induce an antibody response.
  • 3 injections of 10 9 S. xylosus expressing BB on its surface induce an anti-BB titer of 1/10000.
  • S. xylosus potentiates the immunogenicity of the antigen it expresses.
  • Comassie blue staining SDS-Page gel of the fusion proteins extracted from the bacterial membrane and purified by affinity on the Albumin column of the different constructions:

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour obtenir un peptide ou une protéine, caractérisé en ce qu'on introduit dans une bactérie non pathogène pour les mammifères: a) une séquence d'ADN codant pour un polypeptide hétérologue porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine G du virus respiratoire syncytial, sous-groupe A et B ou une séquence peptidique présentant au moins 80 % d'homologie avec ladite séquence peptidique; b) les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane de la bactérie. Elle concerne également un polypeptide conjugué et la bactérie vivante l'exprimant obtenus par le procédé, les compositions pharmaceutiques les renfermant et leur application à la préparation d'un vaccin ainsi que la séquence d'ADN codant pour ce polypeptide.

Description

Protéine G du vi rus respi ratoire syncitial exprimée sur membrane bactérienne
La présente invention se rapporte à un procédé de technique d'ADN recombinant permettant de modifier ponctuellement par mutagénèse dirigée, des nucléotides dans un gène codant pour une séquence polypeptidique, utile notamment pour l'obtention de vaccins par voie orale contre le virus respiratoire syncitial (VRS) ; elle concerne également des peptides et des bactéries recombinantes susceptibles d'être obtenus par ce procédé, les compositions les contenant, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes.
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est la cause la plus fréquente de maladies respiratoires chez le nouveau-né : bronchopneumopathies
(bronchiolites). L'OMS estime chaque année 50 millions de cas atteints du VRS, dont 160 000 décès dans le monde entier. Il existe deux sous groupes du virus (sous groupes A et B).
Le VRS est classé dans la famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité négative, codant pour 10 protéines spécifiques. II n'existe pas actuellement de vaccin disponible, contre le VRS. Les vaccins à virus inactivé se sont montrés inefficaces et ont même parfois aggravé les infections des nourrissons. Dans les années 60, les tentatives de vaccination avec le VRS inactivé à la formaline ont conduit à l'échec : au lieu de conférer une protection lors de la réinfection due au VRS, le vaccin a eu pour effet d'aggraver la maladie chez l'enfant.
La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiée sous forme monomérique ou désacélylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonce en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes. Toutefois les vaccins immunitaires testés à ce jour se sont montrés inefficaces ou ont induit une pathologie pulmonaire (bronchiolite ou péribronchite).
A l'heure actuelle il n'existe pas de traitement de fond des infections dues au VRS.
Les infections au VRS des voies aériennes supérieures : le traitement repose essentiellement sur les médications symptomatiques identiques à celles des autres infections virales.
Les infections au VRS des voies aériennes inférieures : le traitement chez les nourrissons repose sur le maintien d'une hydratation correcte, l'aspiration des sécrétions et l'administration d'oxygène si besoin. Un effet positif a été observé avec la ribavirine, nucléotide actif in vitro contre le
VRS.
Afin de faciliter l'administration du vaccin, il serait souhaitable de disposer d'un produit actif par voie orale, générant une bonne immunité, avec des effets secondaires réduits.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour obtenir un peptide ou une protéine, caractérisé en ce qu'on introduit dans une bactérie non pathogène pour les mammifères : a) une séquence d'ADN codant pour un polypeptide hétérologue porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine G du virus respiratoire syncytial, ou une séquence peptidique présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique, b) les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane de la bactérie.
Il sera ainsi possible d'observer une réponse immunitaire contre ledit polypeptide hétérologue lors de son administration, sans avoir recours à un adjuvant. Avantageusement le peptide hétérologue pourra être exprimé fusionné avec un fragment permettant l'ancrage dans la membrane de la bactérie. La protéine G est une glycoprotéine d'enveloppe du VRS, de poids moléculaire compris entre 84 et 90 Kd, pauvre en méthionine. La séquence de la protéine G diffère pour les sous-groupes A et B du VRS ; les termes "séquence de la protéine G" lorsqu'ils sont employés dans la présente demande, doivent s'entendre comme se référant à la fois à la séquence du sous-groupe A ou du sous-groupe B, lorsque cela n'est pas précisé différemment.
La Demanderesse a mis en évidence que la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G naturelle est particulièrement appropriée pour induire une protection efficace contre l'infection par le VRS, sous-groupes A et B, sans induire les pathologies observées avec les vaccins basés sur le virus entier inactivé par le formol, ou observées avec les protéines F et G entières.
Les moyens permettant l'expression du polypeptide sont connus de l'homme du métier et sont adaptés en fonction de la bactérie utilisée.
De préférence, la séquence d'ADN est introduite sous forme d'un plasmide, tel qu'un plasmide navette.
Selon un autre aspect de l'invention, la séquence d'ADN est intégrée dans le chromosome de la bactérie Les protéines du VRS ont été à ce jour exprimées dans différents systèmes d'expression comme le virus de la vaccine, les baculovirus ou les adénovirus. Cependant, des problèmes potentiels sont associés à la présence de particules virales résiduelles.
Le procédé selon la présente invention utilise des bactéries commensales de l'homme, apathogènes et comestibles. De préférence, on utilise des bactéries à coloration gram positive, en particulier les bactéries peuvent appartenir au genre Staphylococcus. Staphylococcus xylosus et Staphylococcus carnosus qui sont des bactéries utilisées dans l'industrie alimentaire depuis des nombreuses années, et peuvent être administrées, vivantes, par voie orale. Des systèmes d'expression d'épitopcs hétérologues à la surface de S. xylosus ont été notamments décrits par N'guyen et al dans Gène, 1993, 128. 89-94, ainsi que pour S. carnosus par Samuelsson et al dans J. Bacteriol. , 1995, 177, 1470-1476.
De préférence, le polypeptide hétérologue est exprimé à la surface de la membrane de la bactérie, sous une conformation essentiellement identique à celle de l'épitope correspondant de la protéine G naturelle. La présentation de la protéine recombinante à la surface membranaire de la bactérie dépend de sa nature chimique et de son enchaînement peptidique.
On peut utiliser la séquence naturelle de la protéine G du VRS et introduire une séquence d'ADN codant pour un peptide comportant la séquence ID n° 1 ou la séquence ID n° 2.
Selon un aspect de l'invention, dans la séquence correspondant à la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G, l'acide aminé cystéine en positions 173 et/ou 186 a été remplacé par un acide aminé ne formant pas de pont disulfure, en particulier la serine.
Une telle mutation favorise la formation du pont disulfure entre les résidus cystéine restant en positions 176 et 182, qui est critique pour l'immunogénicité de la séquence ; elle évite la formation de ponts disulfures désordonnés (A : Figures 1 et 2). Des peptides utiles pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont ceux comportant notamment l'une des séquences ID n° 3 ou ID n° 4.
Selon un autre aspect de l'invention dans la séquence du polypeptide hétérologue correspondant à la protéine G du VRS, les acides aminés phénylalanine correspondant aux positions 163, 165, 168 et/ou 170 de la séquence de la protéine G sont remplacés par un acide aminé polaire, en particulier la serine (B : Figures 1 et 2).
Cette modification peut être associée aux mutations précédemment citées. Un tel polypeptide peut notamment présenter la séquence ID n° 5.
Lors de la mise en oeuvre du procédé, la suppression de la région hydrophobique située à proximité de la boucle critique entre les deux acides aminés cystéine en positions 176 et 182, permet à la protéine recombinante de mieux traverser la membrane bactérienne et d'exposer correctement la partie immunodominante à la surface membranaire.
Selon encore un autre aspect de l'invention, dans la séquence peptidique correspondant à la protéine G du VRS, la séquence comprise entre les acides aminés numérotes 162 et 170 est délétée (C : Figures 1 et 2).
Plus particulièrement la séquence du peptide hétérologue exprimée dans la bactérie peut comporter la séquence ID n° 6. Dans tous les cas, αes séquences présentant au moins 80% et de préférence au moins 90% d'homologie avec les séquences mentionnées ci- dessus sont adaptées à la mise en oeuvre de l'invention. Elles comprennent notamment les séquences résultant de mutations ponctuelles dans la séquence nucleotidique et comportant le remplacement d'au moins un acide aminé par un acide aminé équivalent ; on entend par acide aminé équivalent une molécule ayant une structure chimique analogue et un poids moléculaire voisin.
L'invention comprend également une bactérie exprimant un peptide ou une protéine, susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit dans la présente demande. Ladite bactérie peut être vivante ou tuée.
Selon un aspect avantageux de l'invention, la séquence d'ADN introduite dans la bactérie conduit à l'expression du polypeptide hétérologue sous forme d'une protéine de fusion. On incorpore alors dans la construction une séquence codant pour un autre peptide, qui jouera le rôle d' "espaceur" ou élément d'espacement et permettra une présentation optimale du polypeptide hétérologue à la surface de la bactérie. Une protéine pouvant avantageusement être utilisée comme "espaceur" est une protéine de liaison à la sérumalbumine humaine, en particulier la protéine G du streptocoque (désignée dans la suite du texte par BB), ou l'un de ses fragments. La fusion du polypeptide hétérologue avec l'élément d'espacement se fait par l'extrémité C terminale dudit polypeptide, pour favoriser l'accessibilité de l'antigène au système immunitaire.
Les polypeptides ou les bactéries présentant une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessus sont utiles à titre de médicament.
L'invention comprend des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent un polypeptide ou une bactérie selon l'invention en mélange avec des adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Le vaccin oral à base de vecteur vivant doit comprendre la protéine modifiée qui présente la conformation optimale pour induire la meilleure protection contre le VRS. C'est pourquoi la présente invention à également pour objet une application d'une telle composition pharmaceutique à la préparation d'un vaccin par voie orale destiné à prévenir les infections provoquées par le virus respiratoire syncytial. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'application d'une telle composition à la préparation d'un vaccin par voie parentérale, entérale ou mucosale destiné à prévenir les infections provoquées par le virus respiratoire syncitial.
Enfin, l'invention a pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine G du virus respiratoire ou pour un polypeptide présentant au moins 80 % d'homologie avec ladite séquence peptidique, et comportant en outre les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane d'une bactérie non pathogène du genre Staphylococcus. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes :
Figure 1 : Construction du vecteur navette pS-'mpl 8BBXM. Figure 2 : Construction du vecteur navette pSPPmpl δBBXM.
Figure 3 : Extraction et analyse des protéines membranaires de S. xylosus recombinantes de surface. Figure 4 : Analyse par cytométrie de flux des protéines recombinantes à la surface de S. xylosus. Figure 5 : Analyse par cytométrie de flux des protéines recombinantes à la surface de S. carnosus. Figure 6a: Réponse anticorps induites par S. carnosus et la protéine BB chez la souris BALB/c. Figure 6b: Réponse anticorps induites par S. carnosus et la protéine BB chez la souris C57B1/6.
Figure 7 : Réponse anticorps induite par la protéine BB. Exemple 1
A- Construction de gène : Matériels et méthodes
Dans un microtube Eppendorf, on rince 300 μg de billes avec du tampon washing/binding ( 1M NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA) avant d'ajouter 0,2 pmole de l'oligo biotinylé, 15 minutes d'incubation à température ambiante pour le binding. Les billes avec l'oligo fixé sont rincées et sédimentées. 0,2 pmole de l'oligo phosphorylé en 5' suivant est ajouté dans 60 μl de tampon hybridation/ligation (50mM Tris-HCl pH7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATPP, 1 mM 1 ,4-dithiothreitol [DTT], 5% Polyéthylène glycol [PEG] 8000). Le mélange d'hybridation est incubé à 70"C pendant 5 mn et laissé revenir à 37° C avant d'ajouter 3 unités de T4 DNA ligase (BRL) suivi de 15 mn d'incubation à 37° C. Le mélange réactionnel est rincé avant d'ajouter 0,2 pmole d'oligo suivant. La procédure d'hybridation/ligation est répétée autant de fois qu'on ajoute un nouveau oligo complémentaire phosphorylé en 5'. A la fin, le duplex d'ADN fixé sur billes magnétiques peut être séparé du support en coupant avec les enzymes de restrictions convenables.
B- Construction du vecteur navette S. xylosus
Un linker d'oligonucléotides (5'-AGCTTGGCTG TTCCGCCATGGCTCGAG- 3', avec le brin complémentaire) est inséré dans le site HindIII du plasmide pSZZmplδXM (Hansson et al, 1992, J. Bacteriol., 174: 4239-4245), créant ainsi deux sites de restriction supplémentaires Ncol et Xhol en aval du site HindIII du vecteur résultant pSZZmpl 8(XhoI)XM. Un fragment de gène codant 198 acides aminés, nommé BB, de la région de fixation du sérum albumine de la protéine G streptococcique (Nygren et al, 1988. J. Mol. Reconig., l_:69-74), est généré par PCR avec les amorces ( 1 = 5'- CCGAATTCAA GCTTAGATGC TCTAGCAAAA GCCAAG-3' et 2 = 5 '-CCCCTGCAGT TAGGATCCCT CGAGAGGTAA TGCAGCTAAA ATTTCATC-3') sur le template plasmidique pSPGl (Guss et al., 1986, EMBO J. ï : 1567-1575). Le fragment est digéré avec HindIII et Xhol et clone en aval du site multiple de clonage mp l δ du vecteur pSZZmpl 8(XhoI)XM ; le vecteur résultant pSZZmpl 8(XhoI) BBXM est digéré par Notl et HindIII. Le fragment renfermant ZZ est remplacé par un autre fragment digéré par les mêmes enzymes de rectrictions du vecteur pE'mpl δ (Sophia Hober, non publié). Le vecteur résultant est nommé pSE'mplδBBXM (Figure 1 ).
C. Construction du vecteur navette S. carnosus Le plasmide pLipPS17 (Demleitner et al 1994. FEMS Microbiol. Lett.
121: 189-198) est construit à partir du vecteur pLipPSl (Liebl et al. 1986. Mol. Gen. Genêt. 204: 166-173) par introduction d'un site de restriction Bsml au début de la séquence signal de la lipase, un site BcII à la fin de la séquence signal, et un site Bglll à la fin de la région codant pour le propeptide par mutagénèse dirigée in vitro. Un fragment de gène constituant en entier le vecteur S. carnosus pLipPS17, excepté un fragment codant la partie C-terminale du propeptide et la majorité de la lipase mature de S. hyieus, est isolé par une digestion SalI-HindIII et ligué dans le plasmide pRIT28 préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide résultant désigné pSLip contient l'origine de replication à la fois d'E. coli et S. aureus. Pour restaurer la région C-terminale du propeptide de la lipase, un fragment de gène codant pour la partie C-terminale est g é n é r é e p a r P C R a v e c l e s a m o r c e s ( 1 : S'-CCGAATTCTCGAGGCTŒTAAAGAAAATAC-S ' e t 2 : 5'-CCAAGCTTGGATCCTGCGCAGATCTTGGTGTTGGT _TTTTG-3') sur le template plasmidique pLipPS17 créant ainsi deux sites de restrictions EcoRI et Xhol en aval et Fspl, BamHI, HindIII en amont. Le fragment de gène codant pour la partie C-terminale du propeptide est digéré par EcoRI/HindIII et clone dans le vecteur pRIT28 pour vérifier la séquence puis digéré XhoI/BamIII et transféré aux sites de restrictions SalI/BamHl du vecteur pSLip. Le plasmide résultant pSPP est digéré par HindIII, complémentc par l'enzyme polymérase de Klenow et religué pour donner le plasmide pSPPHindIII. Le vecteur navette pSPPmplδBBXM ( figure 2 ) est construit par digestion Notl de pSPPHindIII, poursuivi par un remplissage, digéré par BamHI et ligué avec un fragment BamlII/EcoRV isolé de pSE'mpl δBBXM. Exemple 2
Extraction et analyse de protéines mcmbranaires des S. xylosus recombinants :
Dans un erlenmeyer de 1 litre, on inocule 250 ml de milieu (7,5 g de TSB, 12,5 g de Yeast extract) contenant du Chloramphénicol (20 μg/ml) avec 5 ml de préculture (ovcrnight) de S. xylosus transformé par le vecteur navette pSE'G2BBXM ou pSE'G2subBBXM ou pSE'G2delBBXM selon le protocole de Gôtz et al, 1981 , J BacterioL, 145:74-81. Incuber sous agitation à température = 32° C pendant une durée de 6 heures. Centrifuger le milieu à 5000 rpm, 12 min et à température = 4° C. Le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de TST, on rajoute 200 μl de solution contenant de la lysostaphine ( 1 mg/ml) et 200 μl de lysozyme (50 mg/ml). Incuber pendant une heure à température = 37° C sous agitation modérée. Soniquer la solution pendant 2 min, avec l'appareil Vibra cell équipé d'une sonde dont la puissance est réglée à 7. Centrifuger à 13 500 rpm, pendant 20 min, à température = 4° C. Les protéines sont purifiées par affinité : le surnageant est passé sur colonne d'affinité IISA-Sépharose (Sérum Albumine Humaine). Après avoir rincé la colonne, les protéines sont éluées avec un tampon acide pli 2,7 et lyophilisées.
Les protéines sont séparées sur deux gels SDS-PAGE ( 12%) identiques avec les marqueurs de tailles moléculaires standard (Gibco BRL) précolorés. Un gel est coloré au Bleu de Coomassie. Le deuxième est transféré sur membrane Problot™ (Applied Biosystem) pour l'immunoblot avec l'anticorps spécifique anti-G l (obtenu à partir du sérum de lapin immunise avec le peptide G l (aal 74-187) selon les protocoles courants d'immunisation). Voir Figure 3.
Exemple 3
Analyse par Cytométrie de flux (FΛCScan™) des protéines recombinantes à la surface de S. xylosus
Les cultures des bactéries recombinantes S. xylosus sont faites comme décrit précédemment. Pour constituer une solution stock, on resuspend la bactérie dans une solution de PBS à 0,1% de Sodium Azide (p/v) à la concentration finale estimée par densité optique (600nm) égale à l'unité. On aliquote 30 μl de solution stock dans chaque puits conique d'une plaque de microtitres, on centrifuge à 550 g pendant 10 minutes à 4° C. On resuspend le culot bactérien dans un volume de 150 μl de solution de PBS contenant du sérum lapin polyclonal anti-G2 (titré 1/1 280 000) dilué au l/200ème, incubation pendant 30 minutes. On rince deux fois les cellules bactériennes avec du PBS et on incube dans 150 μl d'une solution de PBS renfermant de l'anti-lapin FITC (Sigma) dilué au l/100ème pendant une durée de 30 minutes. Après avoir rincé les cellules deux fois avec du tampon PBS, on resuspend dans un tube Falcon contenant 1 ml de tampon PBS-Paraformaldéhyde 1% (p/v). Les échantillons préparés sont analysés sur l'appareil FACScanTM (Becton Dickinson) . La distribution de fluorescence de chaque suspension cellulaire est analysée par le logiciel LYSIS HTM et est représentée par des histogrammes de fluorescence. Voir Figure 4.
Exemple 4
Analyse par cytométrie de flux (FΛCscan™ ) des protéines recombinantes à la surface de S. carnosus.
Les cultures des bactéries recombinantes S. carnosus transformées par le vecteur navette pSPPG2BBXM , ou pSPPG2subBBXM, ou pSPPG2delBBXM sont faites comme décrits dans l'exemple 2. L'analyse par FACscan est identique à celle utilisée dans l'exemple 3, à la seule différence que le culot bactérien est resuspendu dans un volume de 150 μl de solution de PBS contenant du sérum souris monoclonal anti-G2 (860 μg/μl) dilué 1/400, incubation pendant 60 minutes. La distribution de fluorescence de chaque suspension cellulaire est analysée par le logiciel LYSIS II TM et est représentée par des histogrammes de fluorescence. Voir figure 5. Exemple 5
Réponse immunitaire de souris immunisés par voie orale avec des S. carnosus exprimant l'antigène BB à leur surface.
Des lots de 5 souris BALB/c ou C57B1/6 ont reçu 8 administrations orales (intubation gastrique), à raison d'une par semaine, de 1010 S. carnosus, transformés par le vecteur pSPPBBXM, par souris sous 0,5 ml.
Le dosage des anticorps sériques IgG anti-BB est déterminé par test ELISA.
100 μl de BB à 1 μg/ml par puits sont adsorbés en incubant toute la nuit à 4°C. La microplaque est ensuite rincée 3 fois avec du PBS IX. On ajoute dans chaque puit 200 μl de PBS-gélatine à 0,5% après incubation 90 minutes à 37°C, on rince 3 fois avec du PBS IX. Les sérums à tester sont alors déposés dans les puits, puis incubés 2 heures à température ambiante et rincés 3 fois avec du PBS IX. La révélation est obtenue en déposant 100 μl d'anticorps anti-Ig de souris conjugué à la peroxydase , incubation 60 minutes à température ambiante, puis rinçage 3 fois avec du PBS IX. L'anticorps secondaire est révélé en déposant dans tous les puits 100 μl de substrat TMB Microvvell puis la réaction enzymatique est bloquée en ajoutant 100 μl d'H2S04 1 M dans tous les puits de la microplaque. La lecture des résultats est réalisée à 450 nm avec le lecteur de plaques DYNATECH MR5000 ou LABSYSTEMS iEMS).
Le dosage des anticorps sériques IgG anti-staphylocoques est déterminé par ELISA comme décrit précédemment. Les antigènes adsorbés sont des Staphylocoques entiers à la concentration de 108 bactéries par puits. La lecture des résultats est réalisée à 450 nm avec le lecteur de plaques DYNATECH MRS 000 ou LABSYSTEMS iEMS).
Les réponses anticorps induites chez la souris sont représentées sur les figures 6a et 6b. Exemple 6
Effet adjuvant du vecteur vivant
Des souris BALB/c (N ≈ 5) reçoivent 3 injections sous -cutanées de BB en présence d'adjuvants de Fréund. Le sang est prélevé individuellement à J38 et les titres anti-BB sont déterminés par test ELISA comme décrit dans l'exemple 5. La figure 7 montre que 3 injections sous-cutanées de 10 ng de BB n'induisent pas de réponse anticorps. En revanche, 3 injections de 109 S. xylosus exprimant BB à sa surface induisent un titre anti-BB de 1/10000. S. xylosus potentialise l'immunogénicité de l'antigène qu'il exprime.
LEGENDE DF IA FIGURE 3
A) Coloration au bleu de Comassie : Gel SDS-Page des protéines de fusion extraites de membrane bactérienne et purifiées par affinité sur colonne Albumine des différents constructions :
- Puits HW : Marqueurs de taille moléculaire (en Kda).
- puits 1 : S.xylosus (pSE*G2BBXM).
- puits 2 : S.xylosus (pSE'G2subBBXM). • puits 3 : S.xylosus (pSE'G2delBBXM ).
B) Immunoblot des protéines de fusion extraites de membrane bactérienne et purifiées par affinité sur colonne Albumine des différents constructions avec anticorps polyclonal lapin anti-G l .
- Puits HW : Marqueurs de taille moléculaire prέcolorés ( en Kda).
- puits 1 : S.xylosus [pSE'G2B8XM].
- puits 2 : S.xylosus [pSE'G2subBBXM].
- puits 3 : S.xylosus (pSE'G2deIBBXM). LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
Ci) DEPOSANT:
CA) NOM: PIERRE FABRE MEDICAMENT
CB) RUE: 45 PLACE ABEL GANCE CQ VILLE: BOULOGNE
CE) PAYS: FRANCE
CF) CODE POSTAL: 92100
Cii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE D'OBTENTION D'UN PEPTIDE DERIVE DU VIRUS RESPIRATOIRE SYNCITIAL, POLYPEPTIDE ET BACTERIE L'EXPRIMANT, ET LEURS APPLICATIONS A TITRE DE MEDICAMENT
Ciii) NOMBRE DE SEQUENCES: 10
Civ) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
CA) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
CB) ORDINATEUR: IBM PC compatible
CC) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
CD) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 COEB)
Cvi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
CA) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9413309
CB) DATE DE DEPOT: 07-NOV-1994
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 303 paires de bases
CB) TYPE: nucléotide
CC) NOMBRE DE BRINS: simple
CD) CONFIGURATION: linéaire
Cii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
Ci ) CARACTERISTIQUE:
CA) NOM/CLE: CDS
CB) EMPLACEMENT:!..303
Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA 48 Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gin Thr Gin Pro Ser Lys 1 5 10 15
CCG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC 96 Pro Thr Thr Lys Gin Arg Gin Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn 20 25 30
GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC 144 Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser 35 40 45
AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA 192 Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys 50 55 60
CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA 240 Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys 65 70 75 80
ACC ACC AAA AAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG 288 Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val 85 90 95
CCG ACC ACC AAA CCA 303
Pro Thr Thr Lys Pro 100
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 303 paires de bases
CB) TYPE: nucléotide
CC) NOMBRE DE BRINS: simple
CD) CONFIGURATION: linéaire
Cii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
Cix) CARACTERISTIQUE:
CA) NOM/CLE: CDS
CB) EMPLACEMENT:!..303
Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 :
ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG ACC AAC AAA 48 Thr Ala Gin Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gin Thr Asn Lys CCG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC CCG CCG AAA AAA CCG AAA GAT 96 Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp 20 25 30
GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC 144 Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly 35 40 45
AAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA 192 Asn Asn Gin Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys 50 55 60
CCG AAA AAG AAA CCG ACC ATC AAA CCG ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA 240 Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys 65 70 75 80
ACC ACC AAC AAA CGT GAT CCG AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG 288 Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys 85 90 95
GAA ATC ATC ACC AAC 303
Glu Ile Ile Thr Asn 100
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 :
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 303 paires de bases
CB) TYPE: nucléotide
CC) NOMBRE DE BRINS: simple
CD) CONFIGURATION: linéaire
Cii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
Cix) CARACTERISTIQUE:
CA) NOM/CLE: CDS
CB) EMPLACEMENT:!..303
Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3 :
ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA 48 Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gin Thr Gin Pro Ser Lys 1 5 10 15 CCG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC 96 Pro Thr Thr Lys Gin Arg Gin Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn 20 25 30
GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG AGC AGC ATC TGC AGC 144 Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser 35 40 45
AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC AGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA 192 Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys 50 55 60
CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA 240 Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys 65 70 75 80
ACC ACC AAA AAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG 288 Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val 85 90 95
CCG ACC ACC AAA CCA 303 Pro Thr Thr Lys Pro 100
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 303 paires de bases
CB) TYPE: nucléotide
CC) NOMBRE DE BRINS: simple
CD) CONFIGURATION: linéaire
Cii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
Cix) CARACTERISTIQUE:
CA) NOM/CLE: CDS
CB) EMPLACEMENT:!..303
Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG ACC AAC AAA 48
Thr Ala Gin Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gin Thr Asn Lys 1 5 10 15 CCG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC CCG CCG AAA AAA CCG AAA GAT 96 Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp 20 25 30
GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC AGC AGC ATC TGC GGC 144 Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Gly 35 40 45
AAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC AGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA 192 Asn Asn Gin Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys 50 55 60
CCG AAA AAG AAA CCG ACC ATC AAA CCG ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA 240 Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys 65 70 75 80
ACC ACC AAC AAA CGT GAT CCG AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG 288 Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys 85 90 95
GAA ATC ATC ACC AAC 303
Glu Ile Ile Thr Asn 100
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5
Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 30 acides aminés
CB) TYPE: acide aminé
CC) NOMBRE DE BRINS: simple
CD) CONFIGURATION: linéaire
Cii) TYPE DE MOLECULE: protéine
Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Asn Asn Asp Ser His Ser Glu Val Ser Asn Ser Val Pro Ser Ser Ile 1 5 10 15
Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile 20 25 30
C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 30 acides aminés
CB) TYPE: acide aminé
CC) NOMBRE DE BRINS: simple
CD) CONFIGURATION: linéaire
Cii) TYPE DE MOLECULE: protéine
Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Asn Asn Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala 1 5 10 15
Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr 20 25 30

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir un peptide ou une protéine, caractérisé en ce qu'on introduit dans une bactérie non pathogène pour les mammifères : a) une séquence d'ADN codant pour un polypeptide hétérologue porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine G du virus respiratoire syncytial, sous-groupe A et B ou une séquence peptidique présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique, b) les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane de la bactérie.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour le polypeptide hétérologue est liée à une séquence codant pour un fragment polypeptidique espaceur et en ce que lesdites séquences seront exprimées sous forme d'une protéine de fusion, le fragment espaceur étant lié à l'extrémité C terminale du polypeptide hétérologue.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la bactérie est une bactérie gram positif.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la bactérie appartient au genre Staphylococcus.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la bactérie est choisie parmi Staphylococcus xylosus et Staphylococcus carnosus.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue est exprimé à la surface de la membrane de la bactérie, sous une conformation essentiellement identique à celle de l'épitope correspondant de la protéine G naturelle du virus respiratoire syncytial, sous-groupe A ou B.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est introduite dans la bactérie sous forme d'un plasmide.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est introduite par intégration dans le chromosome de la bactérie.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comporte la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 130 et 230 de la protéine G ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie, ou la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 130 à 230 de la protéine G dans laquelle l'acide aminé cystéine en position 173 et/ou 186 a été remplacé par un acide aminé ne formant pas de pont disulfure, en particulier la serine.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que dans la séquence du polypeptide hétérologue, les acides aminés phénylalanine correspondant aux positions 163, 165, 1 8 et/ou 170 de la séquence de la protéine G sont remplacés par un acide aminé polaire, en particulier la serine.
1 1. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comporte la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 130 et 230 de la protéine G ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie, dans laquelle la séquence comprise entre les acides aminés numérotés 162 et 170 est délétée.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comporte l'une des séquences : séquence ID n° 1 ou séquence ID n° 2.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comporte l'une des séquences : séquence ID n° 3 ou séquence ID n° 4.
14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comporte la séquence ID n° 5.
15. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comporte la séquence ID n° 6.
16. Polypeptide conjugue susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 15.
17. Bactérie vivante exprimant un peptide conjugué, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 15.
18. A titre de médicament, polypeptide selon la revendication 16 ou bactérie selon la revendication 17.
19. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon la revendication 16 ou une bactérie selon la revendication 17.
20. Application d'une composition selon la revendication 19 à la préparation d'un vaccin par voie orale destiné à prévenir les infections provoquées par le virus respiratoire syncytial.
21. Application d'une composition selon la revendication 19 à la préparation d'un vaccin par voie parentérale, entérale ou mucosale destiné à prévenir les infections provoquées par le virus respiratoire syncitial.
22. Séquence d'ADN codant pour un polypeptide portée par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine G du virus respiratoire ou pour un polypeptide présentant au moins 80 % d'homologie avec ladite séquence peptidique, et comportant en outre les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane d'une bactérie non pathogène du genre Staphylococcus.
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