EP0778840A1 - Procede pour obtenir des produits actifs riches en adn - Google Patents

Procede pour obtenir des produits actifs riches en adn

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EP0778840A1
EP0778840A1 EP95929149A EP95929149A EP0778840A1 EP 0778840 A1 EP0778840 A1 EP 0778840A1 EP 95929149 A EP95929149 A EP 95929149A EP 95929149 A EP95929149 A EP 95929149A EP 0778840 A1 EP0778840 A1 EP 0778840A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
blood
subjected
separation
erythrocytes
Prior art date
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Ceased
Application number
EP95929149A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Bierne
Bruno Thuilliez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sa Les Eleveurs de la Champagne
Original Assignee
Sa Les Eleveurs de la Champagne
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining active products rich in deoxyribonucleic acid (DNA) from an animal source.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Deoxyribonucleic acid is a molecule of capital importance in biology since it is the molecule generating life: it contains in coded form the genetic information whose programmed emission is the basis of the formation of any living organism.
  • DNA has become a molecule of cosmetic interest, in particular for its. properties of absorption of ionizing radiation and, after biological depolymerization in contact with the human epidermis, by its capacity to supply in quality and quantity of the essential nutrients for the renewal and the regeneration of the epidermis.
  • DNA is a product of current consumption in particular as a standard, precursor or initiator of biosynthesis.
  • the sources' usual DNA are yeasts, certain plants and some animal products such as fish sperm or calf thymus. Extraction methods from these different sources are described in particular in the following documents:
  • All of these known sources have the main drawback of requiring the elimination of contaminating macromolecules such as structural proteins, polysaccharides, ribonucleic acids (RNA), lipids, enzymes, as well as residues from cell walls.
  • RNA ribonucleic acids
  • lipids lipids
  • enzymes as well as residues from cell walls.
  • a major difficulty encountered during the production of DNA from plant cells relates to the inhibition of deoxyribonucease (DNAse) so that the DNA is not degraded before its extraction.
  • DNAse deoxyribonucease
  • One of the aims of the present invention is therefore, on the one hand, to select a DNA source comprising a priori few products capable of being considered as contaminants and, on the other hand, to provide a process extracting the DNA contained in this source in order to obtain active products rich in DNA
  • Another object of the invention is to provide such a simple and economical method of obtaining which makes it possible to produce active products rich in DNA of good quality and at a low cost price.
  • this process for obtaining comprises the following steps:
  • the animal source used to obtain DNA is the blood of poultry or camelids.
  • birds and camelids are the only homeothermic animals with nucleated erythrocytes, or red blood cells, whose DNA is metabolically inactive.
  • the blood of birds such as poultry blood is currently a slaughter byproduct difficult to recover and having no market value due to its polluting nature.
  • the blood is collected at the time of the bleeding of the poultry directly on the slaughter line, then conveyed to a storage tank in which the blood is mixed with a preservative or anticoagulant such as a solution of sodium citrate with 3%.
  • the anti-coagulant can be introduced into the blood stream when it is transported to the storage tank.
  • the temperature of the latter is maintained at a temperature of the order of 4 ° C. in order to ensure correct preservation of the blood.
  • the separation of blood cells made up of approximately 98% erythrocytes, is carried out by centrifugation: the supernatant or plasma is eliminated and recovered with a view to recovering its components, some of which constitute interesting substitutes for the components of bovine plasma.
  • a buffer solution is used at the rate of one liter of buffer per liter of blood to centrifuge.
  • the buffer solution used is composed, for example, of: 150m M sodium chloride (NaCl), 1 mM Tris (hydoxy methyl) amino - methane - hydrochloric acid (Tris-Hcl), and its pH is 7.2.
  • the supernatant essentially comprising the blood plasma is removed and a pellet containing the blood cells, including the erythrocytes, is recovered. If necessary, this pellet can be put back into solution in the above buffer and subjected to a new centrifugation.
  • this pellet is mixed with a detergent in low concentration (for example Triton X 100; 1%; v / v) with stirring. .
  • a detergent in low concentration for example Triton X 100; 1%; v / v
  • the solution thus obtained is centrifuged at 250 g for 5 minutes at a temperature of + 4 ° C: the centrifugation pellet is resuspended in the above buffer solution and the suspension obtained is again centrifuged . This is repeated until a perfectly white product is obtained, therefore free of hemoglobin which is eliminated in the supernatant at each centrifugation: this product therefore only contains the nuclei
  • the solution thus obtained is subjected to a tangential filtration step, thus making it possible to recover the nuclei.
  • the membrane of these nuclei is burst by osmotic shock in distilled water and mixed at high speed.
  • chromatin solution containing approximately 1 g / l of DNA and approximately 1 g / l of histones, ie a yield per liter of treated blood of approximately 4 g / l of DNA and approximately 4 g /! histones.
  • the DNA fragments thus obtained can be classified according to their size into two categories: a highly polymerized part containing more than 2,500 base pairs, and a moderately polymerized part containing approximately 1,000 to 2,500 base pairs.
  • This chromatin solution which is a mixed active ingredient of DNA and histones, constitutes a nutrient rich in nucleotides and their components: phospho ⁇ que acid, nitrogen bases, ribose and animated acids.
  • This active ingredient can effectively enrich dietetic and cosmetic formulations.
  • Two categories of DNA can be extracted from this chromatin solution, according to the process of the present invention: one with high molecular weight or type A, the other with low molecular weight or type B.
  • Type A DNA is obtained by liquid chromatography in the presence of enzymes immobilized on a support from the chromatin solution.
  • the product thus obtained contains an active ingredient 90% purified and constitutes a source of laboratory products, on the one hand, and of nucleotides, on the other hand.
  • Type A DNA is obtained by acid precipitation and conditioned in this form: the DNA fragments are small (oligomers).

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Abstract

Procédé pour obtenir des produits actifs riches en acides désoxyribonucléiques (ADN) à partir d'une source animale, caractérisé par le fait que ladite source est du sang de volaille ou de camélidés. Application pour l'obtention des produits riches en ADN de bonne qualité.

Description

Procédé pour obtenir des produits actifs riches en ADN.
La présente invention concerne un procédé pour obtenir des produits actifs riches en acide désoxyribonucléique (ADN) à partir d'une source animale.
L'acide désoxyribonucléique est une molécule d'importance capitale en biologie puisque c'est la molécule génératrice de la vie : elle renferme sous forme codée les informations génétiques dont l'émission programmée est à la base de la formation de tout organisme vivant.
Depuis quelques années, l'ADN est devenue une molécule d'intérêt cosmétologique en particulier pour ses. propriétés d'absorption des rayonnements ionisants et, après dépolymérisation biologique au contact de Pépiderme humain, par sa capacité à fournir en qualité et en quantité des nutriments essentiels au renouvellement et à la régénération de l'épiderme.
Pour les laboratoires de recherche, l'ADN, partiellement ou totalement dépoiymérisé, est un produit de consommation courante notamment comme éta¬ lon, précurseur ou amorce de biosynthèse. Actuellement, les sources' usuelles de l'ADN sont les levures, certains végétaux et quelques produits animaux tel que le sperme de poisson ou le thymus de veau. Des procédés d'extraction à partir de ces différentes sources sont no¬ tamment décrits dans les documents suivants :
FR-A-2.511.243, WO-A-β.403.835, FR-A-2.628.440 et CH-A-678.489. Toutes ces sources connues ont pour principal inconvénient de néces¬ siter l'élimination des macromolécules contaminantes tels que protéines structu¬ relles, polysaccharides, acides ribonucléiques (ARN), lipides, enzymes, ainsi que des résidus des parois cellulaires. Par exemple, une difficulté majeure rencontrée lors de la production d'ADN à partir de cellules végétales concerne l'inhibition de la désoxyribonuciéase (DNAse) afin que l'ADN ne soit pas dégradé avant son extrac¬ tion.
Aussi un des buts de la présente invention est-il, d'une part, de sélec¬ tionner une source d'ADN comportant a priori peu de produits susceptibles d'être considérés comme contaminants et, d'autre part, de fournir un procédé d'extraction de l'ADN contenu dans cette source afin d'obtenir des produits actifs riches en ADN
Un autre but de l'invention est de fournir un tel procédé d'obtention simple et économique permettant de produire des produits actifs riches en ADN de bonne qualité et d'un faible prix de revient Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé pour obtenir des produits actifs riches en acide désoxyribonucléique (ADN) à partir d'une source animale, qui est caractérisé, se¬ lon la présente invention, par le fait que cette source est le sang de volaille ou de camélidés.
Selon l'invention, ce procédé d'obtention comporte les étapes sui¬ vantes :
- récupération et conservation du sang
- séparation des cellules sanguines, dont les érythrocytes du plasma - isolement du noyau des érythrocytes
- éclatement de ces noyaux
- récupération d'une solution de chromatine renfermant l'ADN
Ainsi qu'il a été dit ci-dessus, la source animale utilisée pour obtenir de l'ADN, selon la présente invention, est le sang de volaille ou de camélidés. En ef- fet, les oiseaux et les camélidés sont les seuls animaux homéothermes possédant des érythrocytes, ou globules rouges, nucléés et dont l'ADN est métaboliquement inactif. De plus, le sang d'oiseaux tel que le sang de volaille, est actuellement un sous-produit d'abattage difficilement valorisable et n'ayant aucune valeur mar¬ chande du fait de son caractère polluant. Le sang est collecté au moment de la saignée de la volaille directement sur la chaîne d'abattage, puis acheminé vers une cuve de stockage dans laquelle le sang est mélangé à un conservateur ou anti-coagulant telle qu'une solution de citrate de sodium à 3 % . L'introduction de l'anti-coaguiant peut se faire dans le flux de sang lors de son acheminement vers la cuve de stockage. La température de celle-ci est maintenue à une température de l'ordre de 4°C afin d'assurer une con¬ servation correcte du sang.
La séparation des cellules sanguines, constituées à environ 98 % d'érythrocytes, est réalisée par centrifugation : le surnageant ou plasma est éliminé et récupéré en vue de la valorisation de ses composants dont certains constituent des substituts intéressants des composants du plasma bovin.
Cette séparation des cellules sanguines, dont les érythrocytes, est réa¬ lisée par centrifugation à 3.000g pendant 5 minutes à une température de +4°C : on utilise une solution tampon à raison, d'un litre de tampon par litre de sang à centrifuger. La solution tampon utilisée est composée, par exemple, de : 150m M de chlorure de sodium (NaCI), 1 mM de Tris (hydoxy méthyl) amino - méthane - chlorhydrique (Tris-Hcl), et son pH est de 7,2.
A l'issue de cette centrifugation, on élimine le surnageant comprenant essentiellement le plasma du sang et on récupère un culot renfermant les cellules sanguines dont les érythrocytes. Si nécessaire, on peut remettre ce culot en solu¬ tion dans le tampon ci-dessus et le soumettre â une nouvelle centrifugation.
Du culot récupéré à l'étape précédente, il faut isoler les noyaux qui renferment l'ADN Pour cela, on mélange ce culot avec un détergent en faible con¬ centration (par exemple Triton X 100 ; 1 % ; v/v) sous agitation. Selon une première variante de réalisation, la solution ainsi obtenue est centrifugée à 250g pendant 5 minutes à une température de +4° C : le culot de centrifugation est remis en suspension dans la solution tampon ci-dessus et la suspension obtenue est de nouveau centrifugée. Ceci est répété juqu'à obtenir un produit parfaitement blanc et donc dépourvu d'hémoglobine qui est éliminée dans le surnageant à chaque centrifugation : ce produit ne renferme donc que les noyaux
Selon une seconde variante de réalisation de la présente invention, la solution ainsi obtenue est soumise à une étape de filtration tangentielle, permettant de récupérer ainsi les noyaux. Afin de libérer l'ADN, on fait éclater la membrane de ces noyaux par choc osmotique en eau distillée et on mixe à haute vitesse.
On obtient ainsi une solution de chromatine renfermant environ 1g/l d'ADN et environ 1g/l d'histones, soit un rendement par litre de sang traité d'environ 4g/l d'ADN et d'environ 4g/! d'histones. Les fragments d'ADN ainsi obtenus peuvent être classés selon leur taille en deux catégories : une partie hautement polymérisée renfermant plus de 2.500 paires de bases, et une partie moyennement polymérisée renfermant envi¬ ron 1.000 à 2.500 paires de bases.
L'analyse de cette solution de chromatine montre une absence totale d'hémoglobine et d'A.R.N.
Cette solution de chromatine qui est un actif mixte d'ADN et d'histones, constitue un nutriment riche en nucléotides et en leurs composants : acide phos- phoπque, bases azotées, ribose et acides animés. Cet actif peut efficacement enri¬ chir les formulations diététiques et cosmétiques. De cette solution de chromatine, on peut extraire, selon le procédé de la présente invention, deux catégories d'ADN : l'une à poids moléculaire élevé ou type A, l'autre à faible poids moléculaire ou type B.
L'ADN de type A est obtenu par chromatographie en phase liquide en présence d'enzymes immobilisés sur support à partir de la solution de chromatine. Le produit ainsi obtenu contient un actif purifié à 90 % et constitue une source de produits de laboratoire, d'une part, et de nucléotides, d'autre part.
La solution de chromatine et l'ADN de type A peuvent être commer¬ cialisés sous forme lyophilisée ou de précipitation alcoolique. L'ADN de type B est obtenu par précipitation acide et conditionnée sous cette forme : les fragments d'ADN sont de petites tailles (oligomères).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir des produits actifs riches en acides désoxyribonucléiques (ADN) à partir d'une source animale, caractérisé par le fait que ladite source est du sang de volaille ou de camélidés.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé par le fait qu'il com¬ prend les étapes suivantes :
- récupération et conservation du sang ; - séparation des cellules sanguines, dont les érythrocytes du plasma ;
- isolement du noyau des érythrocytes ;
- éclatement desdits noyaux ; et,
- récupération d'une solution de chromatine renfermant l'ADN
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que pour conserver le sang, on lui ajoute un anti-coagulant tel que du citrate de sodium.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la sépa¬ ration des éléments figurés du plasma est réalisée par centrifugation et que l'on récupère un culot renfermant les cellules sanguines dont les érythrocytes.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on mé¬ lange le culot issu de la séparation dans un détergent en faible concentration afin de récupérer après centrifugation un produit dépourvu d'hémoglobine.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on mé¬ lange le culot issu de la séparation dans un détergent en faible concentration et que l'on soumet la solution ainsi obtenue à une filtration tangentielle afin de récu¬ pérer un produit dépourvu d'hémoglobine.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait que l'on soumet le produit dépourvu d'hémoglobine ainsi obtenu â un choc osmo- tique et que l'on récupère une solution de chromatine renfermant de l'ADN
8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la solu¬ tion de chromatine est lyophilisée ou soumise à une précipitation alcoolique.
9. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la solu- s tion de chromatine est soumise à une chromatographie en phase liquide en pré¬ sence d'enzymes immobilisées sur support afin d'en extraire un ADN à poids mo¬ léculaire élevé.
10. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la solu- 0 tion de chromatine est soumise à une précipitation acide afin d'en obtenir un ADN à faible poids moléculaire.
EP95929149A 1994-09-02 1995-08-31 Procede pour obtenir des produits actifs riches en adn Ceased EP0778840A1 (fr)

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FR3080115B1 (fr) * 2018-04-17 2022-04-08 Saria Ind Procede d'obtention d'un hydrolysat peptidique a partir de proteines de sang d'animaux, et hydrolysat peptidique ainsi obtenu

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