EP0734448A1 - Therapie genique de la restenose au moyen de vecteur adenovial - Google Patents

Therapie genique de la restenose au moyen de vecteur adenovial

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EP0734448A1
EP0734448A1 EP95927778A EP95927778A EP0734448A1 EP 0734448 A1 EP0734448 A1 EP 0734448A1 EP 95927778 A EP95927778 A EP 95927778A EP 95927778 A EP95927778 A EP 95927778A EP 0734448 A1 EP0734448 A1 EP 0734448A1
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EP
European Patent Office
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adenovirus
gene
use according
restenosis
genes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95927778A
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German (de)
English (en)
Inventor
Didier Branellec
Jean-François DEDIEU
Patrice Denefle
Laurent Feldman
Michel Perricaudet
Gabriel Steg
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Centelion SAS
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to a method for the treatment of restenosis by gene therapy, comprising the administration of a recombinant adenovirus comprising a suicide gene. It also relates to particular pharmaceutical compositions allowing the local and effective administration of the recombinant viruses.
  • Atherosclerosis is a complex, polygenic disease, which is defined histologically by deposits (lipid or fibro-lipid plaques) of lipids and other blood derivatives in the wall of the large arteries (aorta, coronary arteries, carotid) . These plaques, more or less calcified depending on the progress of the process, can be combined with lesions and are linked to the accumulation in the arteries of fatty deposits consisting essentially of cholesterol esters. These plaques are accompanied by a thickening of the arterial wall, with enlargement of the smooth muscle, appearance of foam cells and accumulation of fibrous tissue.
  • the atherosclerotic plaque is very clearly in relief on the wall, which gives it a stenosing character responsible for vascular occlusions by atheroma, thrombosis or embolism which occur in the most affected patients. These lesions can therefore lead to very serious cardiovascular pathologies such as infarction, sudden death, heart failure, cerebrovascular accidents, etc.
  • vascular smooth muscle cells LVMC
  • the present invention provides an advantageous solution to this problem.
  • the present invention indeed provides a particularly effective and selective method for the treatment of post-angioplasty restenosis by gene therapy.
  • the method of the present invention consists mainly in administering a recombinant adenovirus comprising a suicide gene, capable of specifically sensitizing the proliferating smooth vascular muscle cells to a therapeutic agent.
  • the simultaneous or subsequent administration of this therapeutic agent then leads to the selective death of the cells.
  • the advantages of the present invention lie in particular in the strong capacity of the adenoviruses of the invention to infect proliferating vascular smooth muscle cells. This makes it possible to use relatively small amounts of active principle (recombinant adenovirus), and also allows effective and very rapid action on the sites to be treated.
  • the adenoviruses of the invention are also capable of expressing, at very high levels, the suicide genes introduced, which gives them a very effective therapeutic action.
  • the adenoviruses of the invention due to their episomal nature, have a limited persistence in proliferative cells and therefore a transient effect perfectly suited to the desired therapeutic effect.
  • the applicant has also developed a method of particularly advantageous administration which makes it possible to infect with great efficiency certain target cells essential to the desired therapeutic effect
  • a first object of the invention therefore relates to the use of a defective recombinant adenovirus comprising a suicide gene for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of restenosis
  • the term “suicide gene” is intended to mean any gene the expression product of which confers on the infected cell sensitivity to a therapeutic agent.
  • the thymidine kinase gene the expression product of which confers on mammalian cells a sensitivity to certain therapeutic agents such as ganciclovir or acyclovir
  • the cytosine deaminase gene the expression product of which confers on mammalian cells a sensitivity to 5-fluoro-cytosine (5-FC)
  • the herpes simplex virus thymidine kinase is capable of phosphorylating nucleoside analogs such as acyclovir and ganciclovir
  • nucleoside analogs such as acyclovir and ganciclovir
  • the human herpes virus thymidine kinase gene (hTK HSV-1) is used.
  • the sequence of this gene has been described in the literature (see in particular McKnight et al, Nucleic Acid Res 8 (1980) 5931) It is also possible to use derivatives of this sequence exhibiting greater substrate specificity or better kinase activity. Such derivatives can in particular be obtained by mutagenesis at the binding site as described previously (Balasubramaniam et al, J Gen Virol 71 (1990) 2979, Munir et al, JBC 267 (1992) 6584)
  • cytosine deaminase the expression product of which confers on mammalian cells a sensitivity to 5-fluorocytosine (5-FC).
  • Cytosine deaminase is capable of catalyzing the deamination of cytosine to uracil
  • the cells which express this gene are therefore capable of converting 5-fluoro-cytosine (5-FC) into 5-fluoro-uracil (5-FU), which is a toxic metabolite
  • the sequence of this gene has been described in literature (Anderson et al Arch Microbiol 152 (1989) 115)
  • thymidine kinase gene constitutes a particularly advantageous embodiment
  • adenovirus serotypes For the construction of the adenoviruses according to the invention, different serotypes can be used. There are indeed many adenovirus serotypes, the structure and properties of which vary somewhat. Among these serotypes, it is however preferred to use in the context of the present invention.
  • adenoviruses type 2 or 5 Ad 2 or Ad 5
  • Ad 2 or Ad 5 adenoviruses of animal origin
  • adenoviruses of animal origin mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, urine origin (example Mavl, Beard et al, Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example.
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example]
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin Preferably, one uses in the context of the invention adenoviruses of human or canine or mixed origin.
  • the adenoviruses according to the invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell
  • the genome of defective adenoviruses used in the context of The present invention therefore lacks at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the suicide gene
  • the defective adenovirus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles
  • the defective adenoviruses of the invention comprise the ITRs, a sequence allowing the packaging and the suicide gene.
  • the El gene and at least one of the E2 genes, E4, L1-L5 are non-functional
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the or the genes considered Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents
  • a defective adenovirus is used, made non-functional by a total or partial deletion of the region E 1 and a deletion in the region E4
  • the region E4 comprises 7 reading phases
  • the deletion in the region E4 can be transcomplemented by the presence, in the cell line used for the multiplication of viruses, either simply from the reading phase ORF6 or from the reading phases ORF6 and ORF6 / 7
  • the preferred adenoviruses according to the invention are chosen from the following - Defective recombinant adenovirus ⁇ E1, ⁇ E4 comprising a deletion of all or part of the E1 region and a deletion of all or part of the E4 region -Defective recombinant adenovirus ⁇ E1, ORF3 ", ORF6", comprising a deletion of all or part of the E1 region and nucleotides 34801-34329 and 341 15-33126 of the E4 region
  • ORFl + comprising a deletion of all or part of the E1 region and a deletion of the E4 region with the exception of the ORF1 reading phase. More specifically, the deletion in the E4 region at its 5 ′ end included in the reading phase ORF7 and its 3 ′ end included in the reading phase ORF2 For example in the region covering nucleotides 33093- 35053.
  • adenovirus ⁇ E1, ⁇ E4 comprising a deletion of all or part of the E1 region and a deletion covering the entire E4 region, for example among the following deletions nucleotides 32720-35835, or 33466- 35355, or 33093-35355
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J 3 (1984) 2917) In particular , they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying, among other things, the suicide gene. Homologous recombination occurs after cotransfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al, J Gen Virol 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of an adenovirus Ad5 (12%).
  • Strategies for the construction of vectors derived from adenoviruses have also been described in applications Nos. FR 93 05954 and FR 93 08596.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • the suicide gene is placed under the control of a promoter allowing its expression in the infected cells.
  • a promoter can be the promoter of the suicide gene, a heterologous promoter or a synthetic promoter.
  • they may be promoters derived from eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, including the virus used.
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences or allowing tissue-specific expression. It may in fact be particularly advantageous to use expression signals which are active specifically or mainly in vascular smooth muscle cells, so that the suicide gene is not expressed and does not produce its effect until the virus has actually infected a vascular smooth muscle cell.
  • expression signals which are active specifically or mainly in vascular smooth muscle cells, so that the suicide gene is not expressed and does not produce its effect until the virus has actually infected a vascular smooth muscle cell.
  • the promoters active specifically or mainly in vascular smooth muscle cells mention may be made in particular of the promoter of ⁇ -actin of smooth muscle.
  • a defective recombinant adenovirus comprising a suicide gene under the control of a viral promoter, preferably chosen from LTR-RSV or the early promoter of CMV.
  • it is a promoter active specifically or mainly in vascular smooth muscle cells.
  • the present invention thus provides a particularly effective method for the treatment of restenosis. Furthermore, to further increase the efficiency and specificity of the treatment, the Applicant has developed a method allowing local administration of the recombinant adenoviruses at the sites to be treated. More particularly, this method is based on the use of an angioplasty balloon coated with a hydrophilic film (for example a hydrogel) soaked with adenovirus, which can thus be applied in a precise manner on the site to be treated, and allow a local and effective release of the adenoviruses at the level of the cells to be treated.
  • a hydrophilic film for example a hydrogel
  • the applicant has also shown that the viruses and the method according to the invention allow an efficient and selective transfer of genes into an atheromatous artery. More particularly, the Applicant has demonstrated for the first time the ability of adenoviruses to transfer a therapeutically effective gene into an atheromatous artery. This is absolutely essential since the therapeutic efficacy of the treatment of restenosis requires demonstrating the capacity to transfer the therapeutic gene, in the right cells and with appropriate efficiency, under the pathophysiological conditions.
  • the atheromatous arteries are characterized by the presence at the intima level (i) of deposits of extracellular matrix, (ii) of lipid deposits consisting essentially of foam cells of macrophagic type and (iii) of smooth muscle cells in proliferation.
  • the results presented below show that, in these atheromatous arteries, the viruses according to the invention allow a lower percentage of infection but of greater specificity (taking into account the presence of cells of macrophagic type in this case , the macrophagic cells not being transduced) and being accompanied by a significant therapeutic efficacy.
  • the results obtained show in particular a very selective transfer of the adenovirus into the target cells, that is to say the smooth muscle cells in proliferation. Over the entire cell population present in the atheromatous zone, more than 95% of the infected cells are vascular smooth muscle cells. Thus, the macrophagic cells present at the level of the intima are not infected at all (no infected macrophagic cell has been detected).
  • the treatment according to the invention makes it possible to infect a percentage less than 1% (0.2% for example). This is much lower than the results described previously in healthy arteries or with lesions of the wall but which do not represent a pathophysiological situation of restenosis (endothelial abrasion of a healthy artery).
  • the Applicant has also shown that the infection of this small percentage of cells nevertheless allows an important therapeutic effect, demonstrated in particular by measuring the diameter luminal This result is particularly surprising and implies the existence of an induced cytotoxic effect ("by-stander" effect) in vivo.
  • the invention therefore describes for the first time a method allowing the selective transfer of genes into vascular smooth muscle cells.
  • Another subject of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a defective recombinant adenovirus and a hydrogel More specifically, the invention relates to a composition comprising a defective recombinant adenovirus comprising a suicide gene, and a hydrogel
  • the hydrogel used in the context of The present invention can be prepared from any biocompatible and non-cytotoxic polymer (homo or hetero). Such polymers have, for example, been described in application WO93 / 08845. Some of them, such as in particular those obtained from ethylene oxide and / or propylene, are commercial
  • the treatment method of the invention therefore advantageously consists in introducing, at the site to be treated, a composition comprising a hydrogel soaked in recombinant adenoviruses.
  • the hydrogel can be deposited directly on the surface of the tissue to be treated, for example during a surgical procedure.
  • the hydrogel can be introduced at the site to be treated by means of a catheter, for example a catheter. balloon, especially during angioplasty, which avoids any additional trauma due to a new intervention at the angioplasty site.
  • the soaked hydrogel is introduced at the site to be treated by means of a balloon catheter, protected by a sleeve.
  • the hydrogel has many advantages; it makes it possible to improve the sliding.
  • the hydrogel can be used with any type of angioplasty balloon, which in particular allows the use of infusion balloons.
  • the adenoviruses according to the invention are administered by means of infusion balloons, in particular of balloon catheters with channels ("channeled balloon angioplasty catheter", Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA) .
  • the latter consists of a conventional balloon covered with a layer of 24 perforated channels which are perfused by an independent lumen through an additional infusion orifice.
  • infusion balloons which maintain blood flow and thus reduce the risk of myocardial ischemia, when the balloon is inflated, also make it possible to locally deliver a drug at normal pressure, for a relatively long time, more than twenty minutes. , which is necessary for optimal infection.
  • hydrogel-coated infusion balloon catheter It is particularly advantageous to use a hydrogel-coated infusion balloon catheter.
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a defective recombinant adenovirus and poloxamer. More specifically, the invention relates to a composition comprising a defective recombinant adenovirus comprising a suicide gene, and poloxamer.
  • Poloxamer 407 is a non-toxic biocompatible polyol, it is commercially available (BASF, Parsippany, NJ).
  • a treatment method of the invention therefore advantageously consists in introducing, at the site to be treated, a composition comprising poloxamer soaked in recombinant adenoviruses.
  • the poloxamer can be deposited directly on the surface of the tissue to be treated, for example during a surgical intervention.
  • the poloxamer be introduced at the site to be treated by means of a catheter, for example a balloon catheter, in particular during angioplasty, which makes it possible to avoid any additional trauma due to a new intervention at the angioplasty site.
  • the soaked poloxamer is introduced at the site to be treated by means of a balloon catheter, protected by a sleeve.
  • the poloxamer has essentially the same advantages as the hydrogel while having a lower viscosity. It is particularly advantageous to use an infusion balloon catheter coated with poloxamer, in particular with channel balloon catheters. In this case, the advantages of both are combined, ie the possibility of keeping the balloon inflated during a period of longer time while keeping the sliding properties and site-specificity of the poloxamer easy In this case, we also obtain optimal infection efficiency
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories)
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose gels or acrylamide, extracts with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol then incubated in the presence of phage T4 DNA ligase (Biolabs) according to the supplier's recommendations
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by a gentle treatment with nuclease S 1.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1_3 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham. Enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique
  • Example 1 Construction of the vector Ad-LTR-TK carrying the TK gene under the control of the promoter of the LTR of the sorcoma virus (LTR-RSV) (FIG. 1).
  • This example describes the construction of a recombinant adenovirus comprising the thymidine kinase gene of the herpes simplex virus (tk) under the control of a viral promoter (LTR-RSV promoter).
  • This adenovirus was constructed by homologous recombination between the defective adenovirus Ad-dll324 and the plasmid pRSVtk carrying the " tk gene under the control of the RSV promoter (example 1.3).
  • This plasmid was constructed from the plasmid pONTtk (example 1.1), by substitution of the promoter transactivable by EBNA1 by the promoter RSV (example 1.2.).
  • the BglII-NcoI fragment containing the thymidine kinase (tk) gene of the he ⁇ ippo simplex virus type 1 was isolated from the plasmid pHSV-106 (marketed by Gibco BRL), repaired by the action of the klenovv fragment and then inserted into the site Smal of the plasmid pGEM7zf (+) (marketed by Promega) The Smal and BglII sites are destroyed during this step, the Ncol site is preserved
  • the plasmid obtained was designated p7tkl
  • This example describes the construction of a plasmid containing a chimeric promoter consisting of a sequence necessary for transactivation by the EBNA1 antigen and of the TPI promoter of the EBV virus.
  • the EcoRI (7315) -SmaI (8191) fragment of the EBV virus was isolated from strain B95-8 The complete sequence of the EBV virus has been described by Baer et al (Nature 310 (1984) 207) This fragment contains the sequences necessary for transactivation by nuclear antigen 1 (EBNA1) (D Reisman & B Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol 6 pp 3838-3846)
  • This fragment was then fused to the fragment Nrul (166 241) -PstI (166 559) of EBV B95-8 (the PstI site a was digested with T4 polymerase), containing the TPI promoter
  • the chimeric promoter thus obtained was then inserted into the cloning multisite of the plasmid pBlue
  • the plasmid pONTtk comprises the gene for the thymidine kinase of the heres simplex virus (tk) cloned in the plasmid p7tkl, under the control of the chimeric promoter EBNA1-RE / TP1 cloned in the plasmid pONTl
  • the BamHI-XhoI fragment from pONTl which contains the chimeric promoter transactivated by EBNA-1 and EBNA-2, and the Xhol-ClaI fragment from p7tkl which contains the open reading phase of tk were cloned at the BamHI sites (478) and ClaI (4550) of the plasmid pAd RSVbgal
  • the plasmid pAd RSVbGal contains, in the orientation 5 ′ -> 3 ′,
  • the PvuII fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus comprising the ITR sequence, the origin of replication, the packaging signals and the amplifier E 1 A, - the gene coding for b-galactosidase under the control of the RSV promoter (from Rous sarcoma virus),
  • the plasmid obtained was designated pONTtk.
  • plasmid pRSVtk This plasmid was constructed from the plasmid pONTtk (example 1.1.), By substitution of the promoter transactivable by EBNA1 by the promoter RSV. For this, the RSV promoter was isolated in the form of a BamHI-SalI fragment from the plasmid pAd.RSV. ⁇ gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626), then cloned with BamHI (478) and Sall (1700) sites of the plasmid pONTtk. The resulting plasmid was designated pRSVtk ( Figure 1).
  • the vector pRSVtk was linearized and cotransfected with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trcms the functions coded by the El regions (El A and El 1B) of adenovirus.
  • the adenovirus Ad-RSV-tk was obtained by homologous recombination in vivo between the mutant adenovirus Ad-dll324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) and the vector pRSVtk, according to the following protocol: the plasmid pRSVtk, linearized by Xmnl, and the adenovirus Ad-dll324, linearized by the enzyme ClaI, were co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus generated were selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus was amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 ° pfu / ml.
  • the viral particles are then purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • the Ad-RSV-tk adenovirus can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • Example 2 Activity of an adenovirus according to the invention in the presence of ganciclovir on smooth muscle cells in culture.
  • the activity of the adenovirus containing the TK gene prepared in Example 1 was checked on in vitro models of smooth muscle cells.
  • the smooth muscle cells isolated from aorta of rats and rabbits were infected. by the recombinant adenovirus Ad-RSV-tk, and incubated in the presence of ganciclovir.
  • the effect of the Ad-RSV-tk / ganciclovir combination on cell viability is then confirmed by MTT colorimetric test, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, according to the technique. described by Mosman (J. Immunol.Meth 65 (1983) 55), or more precisely by cell counting
  • vascular smooth muscle cells are cultured by enzymatic digestion of rabbit aorta NZW according to a method adapted from Chamley et al (Cell Tissue Res 177 • 503-522 1977) The cells are maintained in the presence of 20 % of fetal calf serum and used for all of the tests (see below) before the tenth passage
  • smooth muscle cells are characterized by immunostaining using anti- ⁇ SM- antibodies actin (Sigma)
  • the rabbit aorta CMLVs are incubated in the presence of the adenovirus diluted in culture medium (DMEM, 0.5% FCS) After approximately one hour at 37 ° C in a humid atmosphere, the medium containing the adenoviral solution is aspirated and replaced with culture medium (DMEM, 0.5% FCS) for a period of 18 to 24 hours
  • DMEM adenovirus diluted in culture medium
  • Different concentrations of ganciclovir are then added to a medium rich in SVF (10%)
  • the cells are counted (100% of cell viability corresponding to cells not transduced by Ad-RSV-TK and not treated with ganciclovir)
  • the Ad-RSV-TK ganciclovir combination induces a cytotoxic effect against rabbit CMLV (see Figure 3) This cytotoxicity varies depending on the concentration of ganciclovir and the multiplicity of Ad-RSV-TK infection .
  • the combination Ad-RSV-TK (MOI 1000) / ganciclovir (25 ⁇ M) results in total cytolysis
  • the IC50 is 0.3 ⁇ M
  • the concentrations of ganciclovir active in vitro, on CML are compatible with therapeutic use.
  • the immunodetection of the HSV-TK protein therefore illustrates the importance of the "bystander” effect observed on CMLVs treated with the Ad-RSV-TK / ganciclovir combination.
  • This "bystander” effect can have its counterpart in vivo.
  • these data strongly suggest that a limited transfer of Ad-RSV-TK adenovirus, especially in a pathological artery, can lead to a significant reduction in the neointimal mass, rich in CML and responsible for restenosis in the patient.
  • This example describes the development of a particularly effective technique for percutaneous gene transfer.
  • This technique is based on the use of a hydrogel balloon catheter.
  • the results presented show that, quite advantageously, this technique makes it possible to effectively infect certain privileged cell populations, in particular for the treatment of restenosis
  • This example was carried out using a defective recombinant adenovirus comprising the E coli ⁇ -galactosidase gene under the control of the RSV-RSV promoter and a nuclear localization signal
  • the construction of this adenovirus has been described notably in Stratford-Perricaudet et al, (J Clin Invest 90 (1992) 626)
  • Ad-RSV ⁇ -Gal adenovirus (1-2 10 10 pfu in 100 ⁇ l of phosphate buffer) was deposited on a balloon catheter previously coated with hydrogel (Hydroplus, Mansfield Médical, Boston Scientific Corp, Watertown, MA) (Riessen et al, Hum Gene Ther 4 (1993) 749)
  • the catheter used is a balloon catheter of 2 cm in length, and with a diameter between 2.5 and 3 mm
  • the catheter was then introduced, using a sleeve protector, in the right femoral artery A pressure of one atmosphere was then applied, then the catheter was directed to the external iliac artery where a pressure of 6 atmosphere was then applied to the balloon for 30 minutes
  • This experiment was carried out on 27 rabbits 3 to 28 days after administration, the animals were sacrificed by overdose of pentobarbital
  • the arteries of the sacrificed animals were isolated, and the expression of ⁇ -galactosidase was detected by staining in the presence of X-gal according to the technique of
  • the transfer efficiency was determined on 7 rabbits treated. All these animals received 5.10 ⁇ pfu of adenovirus to infect an arterial segment 2 cm in length, so that the multiplicity of infection is similar for each animal.
  • tissue samples from the liver, brain, testes, heart, lung, kidney, and skeletal muscle, as well that an arterial segment adjacent to the treated site were removed immediately after the sacrifice.
  • the transfer and the expression of the gene were demonstrated by PCR (by means of probes directed against the gene coding for protein IX of the adenovirus and against the lacZ gene) and histochemistry.
  • the results obtained show that none of the samples taken from the animals treated with a balloon catheter coated with hydrogel, present a coloration in the tissues tested. Similarly, no presence of virus could be detected by PCR in the samples tested, even using an optimized and very sensitive protocol of 45 amplification cycles
  • Example 4 Arterial transfer of the adenovirus Ad-RSV-TK.
  • the efficiency of arterial transfer was evaluated in a restenosis model in the New Zealand white rabbit.
  • the rabbits were previously put on a high cholesterol diet (1%) for two weeks.
  • the iliac artery was abraded using a latex balloon (4F) by five successive inflations.
  • the animals were again placed on a cholesterol-lowering diet for six weeks.
  • the arterial transfer was performed percutaneously, according to the procedure described above, at the level of the injured artery.
  • the Ad-RSV-TK adenovirus (4.10 ⁇ pfi in 40 ⁇ l of phosphate buffer) was therefore deposited on a balloon catheter previously coated with hydrogel (Hydroplus, Mansfield Médical, Boston Scientific Co ⁇ ., Watertown, MA) (Riessen et al., Hum. Gene Ther. 4 (1993) 749).
  • the catheter used is a balloon catheter 2 cm in length and 2.5 mm in diameter.
  • the severity of the lesion therefore makes it possible to assess the effectiveness of a gene transfer treatment on a pathological artery.
  • the lesions induced in this animal model are rich in macrophages but also rich in smooth muscle cells which constitute the therapeutic target of gene transfer.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode pour le traitement de la resténose par la thérapie génique, comprenant l'administration d'un adénovirus recombinant comportant un gène suicide.

Description

THERAPIE GENIQUE DE LA RESTENOSE AU MOYEN DE VECTEUR ADENOVIAL
La présente invention concerne une méthode pour le traitement de la resténose par la thérapie génique, comprenant l'administration d'un adénovirus recombinant comportant un gène suicide. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques particulières permettant l'administration locale et efficace des virus recombinants.
L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépôts (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Ces lésions peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, l'insuffisance cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, etc.
Depuis 1977, la technique d'angioplastie a été développée pour permettre une intervention non chirurgicale au niveau de la plaque d'athérosclérose. Cependant, le traitement d'une lésion athéroscleuse par angioplastie résulte de façon très fréquente (jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en une resténose consécutive à la blessure mécanique de la paroi artérielle. Un événement clef de ce mécanisme est la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la média vers l'intima, notamment du fait de l'absence de protection et/ou de rétrocontrôle exercé par les cellules endothéliales de l'intima.
Le traitement de la resténose par administration de substances chimiques ou protéiques capables de tuer les cellules musculaires lisses vasculaires a été proposé dans l'art antérieur. Ainsi, des dérivés de psolarènes, incorporés par les cellules prolifératives et sensibilisant alors ces cellules à l'action de la lumière, ont été utilisés (March et al, 1993, circulation, 87: 184-191). De même, certaines cytotoxines constituées d'une protéine de fusion entre un fragment de toxine de plante ou bactérienne et un facteur de croissance ont également été utilisées (Pickering et al, J. Clin Invest , 1993, 91:724-729, Biro et al, 1992, Cire. Res , 71 640-645, Casscells et al, Proc Natl.Acad.Sci.USA, 1992, 89 7159-7163). Cependant, ces traitements présentent de nombreux inconvénients, tels que leur faible spécificité, leur efficacité moyenne, un délai d'action important et une toxicité potentielle.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ce problème. La présente invention fournit en effet une méthode particulièrement efficace et sélective pour le traitement de la resténose post-angioplastie par la thérapie génique. La méthode de la présente invention consiste principalement à administrer un adénovirus recombinant comportant un gène suicide, capable de sensibiliser spécifiquement les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération à un agent thérapeutique L'administration simultanée ou subséquente de cet agent thérapeutique entraine alors la mort sélective des cellules sensibilisées Les avantages de la présente invention résident notamment dans la forte capacité des adénovirus de l'invention à infecter les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération. Ceci permet d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace et très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à très hauts niveaux les gènes suicides introduits, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché Enfin, la demanderesse a également mis au point une méthode d'administration particulièrement avantageuse qui permet d'infecter avec une grande efficacité certaines cellules cibles essentielles à l'effet thérapeutique recherché
Un premier objet de l'invention concerne donc l'utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose
Comme indiqué ci-avant, on entend au sens de la présente invention par gène suicide tout gène dont le produit d'expression confère à la cellule infectée une sensibilité à un agent thérapeutique. A titre d'exemple, on peut citer le gène de la thymidine kinase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir, ou le gène de la cytosine désaminase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoro-cytosine (5-FC)
La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaîne d'ADN en cours d'élongation, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F L Moolten, Cancer Res 46 (1986) 5276) Cette stratégie permet ainsi d'éliminer spécifiquement les cellules exprimant le gène TK De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules en cours de division sont affectées
Plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1) La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al , Nucleic Acid Res 8 (1980) 5931) Il est également possible d'utiliser des dérivés de cette séquence présentant une plus grande spécificité de substrat ou une meilleure activité kinase De tels dérivés peuvent en particulier être obtenus par mutagénèse au niveau du site de liaison comme décrit précédemment (Balasubramaniam et al , J Gen Virol 71 (1990) 2979, Munir et al , JBC 267 (1992) 6584)
II est également possible d'utiliser le gène de la cytosine désaminase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoro- cytosine (5-FC) La cytosine désaminase est capable de catalyser la désamination de la cytosine en uracile Les cellules qui expriment ce gène sont donc capables de convertir la 5-fluoro-cytosine (5-FC) en 5-fluoro-uracile (5-FU), qui est un métabolite toxique La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (Anderson et al Arch Microbiol 152 (1989) 115)
Plus généralement, tout gène capable de conférer aux cellules infectées une sensibilité à un agent thérapeutique peut être utilisé dans le cadre de la présente invention Le gène de la thymidine kinase constitue un mode de réalisation particulièrement avantageux
Pour la construction des adénovirus selon l'invention, différents sérotypes peuvent être utilisés II existe en effet de nombreux sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu Parmi ces sérotypes, on préfère cependant utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954) Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, urine, (exemple Mavl, Beard et al , Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple . SAV) De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple] De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-avant, les adénovirus selon l'invention sont défectifs, c'est- à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène suicide Préférentiellement, l'adénovirus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et le gène suicide Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes
Plus préférentiellement on utilise un adénovirus défectif, rendu non fonctionnel par une délétion totale ou partielle de la région E 1 et une délétion dans la région E4 La région E4 comprend 7 phases de lecture La délétion dans la région E4 peut être transcomplémentée par la présence, dans la lignée cellulaire servant à la multiplication des virus, soit simplement de la phase de lecture ORF6 soit des phases de lecture ORF6 et ORF6/7
Les adénovirus préférés selon l'invention sont choisis parmi les suivants -Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4 comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de tout ou partie de la région E4 -Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ORF3", ORF6", comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et des nucléotides 34801-34329 et 341 15- 33126 de la région E4
-Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4, ORFl+ comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORFl . Plus spécifiquement la délétion dans la région E4 a son extrémité 5' comprise dans la phase de lecture ORF7 et son extrémité 3' comprise dans la phase de lecture ORF2 Par exemple dans la région couvrant les nucléotides 33093- 35053. -Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4, ORF4+ comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF4 Plus particulièrement deux délétions sont faites, l'une dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF7 et dont extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF6, l'autre dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF3 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORFl ou dans la région promotrice de E4 Par exemple une délétion couvrant les nucléotides 33093-33695 et une délétion couvrant les nucléotides 34634-35355
-Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4, comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion couvrant la totalité de la région E4 chiosie par exemple parmis les délétions suivantes nucléotides 32720-35835, ou 33466- 35355, ou 33093-35355
La construction de ces vecteurs est décrite dans les brevets n° FR 9500749 et n°FR 9506532
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J 3 (1984) 2917) En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène suicide La recombinaison homologue se produit après co- transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al , J Gen Virol 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n° FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Avantageusement, dans les adénovirus de l'invention, le gène suicide est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées. Il peut s'agir du propre promoteur du gène suicide, d'un promoteur hétérologue ou d'un promoteur synthétique. Notamment, il peut s'agir de promoteurs issus de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs El A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires, de manière à ce que le gène suicide ne soit exprimé et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule musculaire lisse vasculaire. Parmi les promoteurs actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires on peut citer notamment le promoteur de l'actine α du muscle lisse.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un adénovirus recombinant défectif comprenant un gène suicide sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.
Selon un autre mode avantageux, il s'agit d'un promoteur actif spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour le traitement de la resténose. Par ailleurs, pour augmenter encore l'efficacité et la spécificité du traitement, la demanderesse a mis au point une méthode permettant une administration locale des adénovirus recombinants au niveau des sites à traiter. Plus particulièrement, cette méthode repose sur l'utilisation d'un ballon d'angioplastie enrobé d'un film hydrophile (par exemple un hydrogel) imbibé d'adénovirus, qui peut ainsi être appliqué de manière précise sur le site à traiter, et permettre une libération locale et efficace des adénovirus au niveau des cellules à traiter.
En outre, la demanderesse a montré que, sur des artères saines, cette méthode d'administration permettait d'infecter un pourcentage élevé de cellules de la média (jusqu'à 9,6%), qui sont les cibles les plus logique pour la prévention de la resténose.
De manière tout à fait avantageuse, la demanderesse a également montré que les virus et la méthode selon l'invention permettaient un transfert efficace et sélectif de gènes dans une artère athéromateuse. Plus particulièrement, la demanderesse a démontré pour la première fois la capacité des adénovirus de transférer un gène thérapeutiquement efficace dans une artère athéromateuse. Ceci est tout à fait essentiel puisque l'efficacité thérapeutique du traitement de la resténose passe par la démonstration de la capacité à transférer le gène thérapeutique, dans les bonnes cellules et avec une efficacité appropriée, dans les conditions physiopathologiques. Les artères athéromateuses sont caractérisées par la présence au niveau de l'intima (i) de dépots de matrice extracellulaire, (ii) de dépots lipidiques constitués essentiellement de cellules spumeuses de type macrophagique et (iii) de cellules musculaires lisses en prolifération.
Les résultats présentés ci-après montrent que, dans ces artères athéromateuses, les virus selon l'invention permettent un pourcentage d'infection moindre mais d'une plus grande spécificité (compte tenu de fait de la présence de cellules de type macrophagique dans ce cas, les cellules macrophagiques n'étant pas transduites) et s'accompagnant d'une efficacité thérapeutique importante. Les résultats obtenus montrent notamment un transfert très sélectif de l'adénovirus dans les cellules cibles, c'est à dire les cellules musculaires lisses en prolifération. Sur l'ensemble de la population cellulaire présente au niveau de la zone athéromateuse, plus de 95% des cellules infectées sont des cellules musculaires lisses vasculaires. Ainsi, les cellules macrophagiques présentes au niveau de l'intima ne sont pas infectées du tout (aucune cellule macrophagique infectée n'a été détectée). S'agissant des cellules musculaires lisses en prolifération (dans la néointima), le traitement selon l'invention permet d'infecter un pourcentage inférieur à 1% (0.2% par exemple). Ceci est bien inférieur aux résultats décrits antérieurement dans des artères saines ou présentant des lésions de la paroi mais qui ne représentent pas une situation physiopathologique de la resténose (abrasion endothéliale d'une artère saine). La demanderesse a également montré que l'infection de ce faible pourcentage de cellules permettait néanmoins un effet thérapeutique important, mis en évidence notamment par la mesure du diamètre luminal Ce résultat est particulièrement surprenant et implique l'existence d'un effet cytotoxique induit (effet "by-stander") in vivo L'invention décrit donc pour la première fois une méthode permettant le transfert sélectif de gènes dans les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération dans une artère athéromateuse comprenant l'administration dans ladite artère d'un adénovirus recombinant défectif contenant ledit gène au moyen d'un cathéter à ballonet d'angioplastie Le terme transfert sélectif implique un transfert essentiellement dans les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération et pas de transfert dans les cellules macrophagiques environnantes Cette méthode permet un traitement de la resténose par transfert d'un gène suicide tel que le gène TK puis traitement par le gancyclovir ou l'acyclovir par exemple Cette méthode de traitement est en outre caractérisée par un effet de toxicité induite in vivo
Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif et un hydrogel Plus spécifiquement, l'invention concerne une composition comprenant un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide, et un hydrogel L'hydrogel utilisé dans le cadre de la présente invention peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845 Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux
La méthode de traitement de l'invention consiste donc avantageusement à introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant un hydrogel imbibé d'adénovirus recombinants. L'hydrogel peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale Avantageusement, l'hydrogel être introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, notamment lors de l'angioplastie, ce qui permet d'éviter tout traumatisme supplémentaire du à une nouvelle intervention au site d'angioplastie. De manière particulièrement avantageuse, l'hydrogel imbibé est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet, protégé par un manchon Comme décrit dans les exemples, l'hydrogel présente de nombreux avantages il permet d'améliorer le glissement du ballonnet ce qui lui permet de passer par des artères fortement sténosées. De plus l'hydrogel est utilisable avec n'importe quel type de ballonnet d'angioplastie ce qui permet en particulier d'utiliser des ballonet à perfusion Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, les adénovirus selon l'invention sont administrés au moyen de ballonnets à perfusion, en particulier de cathéters à ballonnet à canaux ("channelled balloon angioplasty cathéter", Mansfield Médical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA). Ce dernier est constitué d'un ballonnet conventionnel recouvert d'une couche de 24 canaux perforés qui sont perfusés par un lumen indépendant à travers un orifice d'infusion supplémentaire. Ces ballonnets à perfusion qui permettent de maintenir un flux sanguin et ainsi de diminuer les risques d'ischémie du myocarde, lors du gonflement du ballonnet, permettent également de délivrer localement un médicament a pression normale, pendant un temps relativement long, plus de vingt minutes, qui est nécessaire pour une infection optimale.
Il est particulièrement intéressant d'utiliser un cathéter à ballonnet à perfusion enrobé d'hydrogel. Dans ce cas on cumule les avantages des deux c'est à dire ; la possibilité de garder le ballonnet gonflé pendant une période de temps plus longue tout en gardant les propriétés de glissement facilité et de site-spécificité de l'hydrogel. On obtient dans ce cas une efficacité d'infection optimale.
Les résultats présentés dans les exemples démontrent en effet l'efficacité de ce système pour le transfert percutané de gènes dans les parois artérielles.
Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif et du poloxamère. Plus spécifiquement, l'invention concerne une composition comprenant un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide, et du poloxamère. Le poloxamère 407 est un polyol biocompatible non toxique, il est disponible dans le commerce (BASF, Parsippany, NJ).
Une méthode de traitement de l'invention consiste donc avantageusement à introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant du poloxamère imbibé d'adénovirus recombinants. Le poloxamère peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale. Avantageusement, le poloxamère être introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, notamment lors de l'angioplastie, ce qui permet d'éviter tout traumatisme supplémentaire du à une nouvelle intervention au site d'angioplastie. De manière particulièrement avantageuse, le poloxamère imbibé est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet, protégé par un manchon. Le poloxamère présente essentiellement les mêmes avantages que l'hydrogel tout en ayant un viscosité moindre. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un cathéter à ballonnet à perfusion enrobé de poloxamère en particulier de cathéters à ballonnet à canaux Dans ce cas on cumule les avantages des deux c'est à dire , la possibilité de garder le ballonnet gonflé pendant une période de temps plus longue tout en gardant les propriétés de glissement facilité et de site-spécificité du poloxamère On obtient dans ce cas aussi une efficacité d'infection optimale
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs
Légende des figures
Figure 1 Représentation du vecteur pONT-tk Figure 2 Représentation du vecteur pRSV-tk
Figure 3 Effet cytotoxique de la combinaison ganciclovir/ Ad-LTR-tk sur cellules musculaires lisses en culture Figure 4 Réduction de la resténose par transfert adénoviral du gène tk et administration de ganciclovir
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc . sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T et al , "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y , 1982, Ausubel F M et al (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories) Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1_3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 210 (1985) 1350- 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzy . 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-LTR-TK portant le gène TK sous le contrôle du promoteur du LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV) (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un promoteur viral (promoteur LTR-RSV). Cet adénovirus a été construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-dll324 et le plasmide pRSVtk portant le "gène tk sous contrôle du promoteur RSV (exemple 1.3 ). Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.1 ), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur RSV (exemple 1.2.).
1.1. Construction du plasmide pONTtk
a) Construction du plasmide p7tkl Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1 131 paires de bases ( ATG 1 14-1 16 et codon stop TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage
Le fragment BglII-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus heφès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenovv puis inséré au site Smal du plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega) Les sites Smal et BglII sont détruits lors de cette étape, le site Ncol est conservé
Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl
b) Construction du plasmide pONTl
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence nécessaire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TPI du virus EBV Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8 La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al (Nature 310 (1984) 207) Ce fragment contient les séquences nécessaires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D Reisman & B Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol 6 pp 3838-3846) Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment Nrul(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TPI Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II SK pour générer le plasmide pONTl
c) Construction du plasmide pONTtk Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'heφès simplex (tk) clone dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 clone dans le plasmide pONTl
Pour construire ce plasmide, le fragment BamHI-XhoI de pONTl qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment Xhol-Clal de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clones aux sites BamHI (478) et Clal (4550) du plasmide pAd RSVbgal Le plasmide pAd RSVbGal contient, dans l'orientation 5'->3',
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E 1 A, - le gène codant pour la b-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324. Le plasmide pAd.RSVbGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné pONTtk.
1.2. Construction du plasmide pRSVtk Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.1.), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur RSV. Pour cela, le promoteur RSV a été isolé sous forme d'un fragment BamHI-SalI à partir du plasmide pAd.RSV.βgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626), puis clone aux sitesBamHI(478) et Sall(1700) du plasmide pONTtk. Le plasmide résultant a été désigné pRSVtk (figure 1).
1.3. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-RSV-tk
Le vecteur pRSVtk a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trcms les fonctions codées par les régions El (El A et El 1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-RSV-tk a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pRSVtk, selon le protocole suivant : le plasmide pRSVtk, linéarisé par Xmnl, et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co- transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 10* ° pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-RSV-tk peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol. Exemple 2 : Activité d'un adénovirus selon l'invention en présence de ganciclovir sur les cellules musculaires lisses en culture.
L'activité de l'adénovirus contenant le gène TK préparé dans l'exemple 1 a été contrôlée sur des modèles in vitro de cellules musculaires lisses Pour cela, les cellules musculaires lisses isolées à partir d'aorte de rat et de lapin ont été infectées par l'adénovirus recombinant Ad-RSV-tk, et incubées en présence de ganciclovir. L'effet de la combinaison Ad-RSV-tk/ganciclovir sur la viabilité cellulaire est ensuite confirmé par test colorimétrique MTT, 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide, selon la technique décrite par Mosman (J.Immunol.Meth 65 (1983) 55), ou de manière plus précise par comptage cellulaire
Brièvement, les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont mises en culture par digestion enzymatique d'aorte de lapin NZW selon une méthode adaptée de Chamley et al (Cell Tissue Res 177 • 503-522 1977) Les cellules sont maintenues en présence de 20% de sérum de veau foetal et utilisées pour l'ensemble des tests (cf. infra) avant le dixième passage Dans l'ensemble de nos expériences, les cellules musculaires lisses sont caractérisées par immunomarquage à l'aide d'anticoφs anti- αSM-actine (Sigma)
Afin de mesurer l'activité cytotoxique de la combinaison Ad-RSV- TK/ganciclovir, les CMLV d'aorte de lapin sont incubées en présence de l'adénovirus dilué dans du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF) Après environ une heure à 37°C en atmosphère humide, le milieu contenant la solution adénovirale est aspiré et remplacé par du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF) pour une période de 18 à 24 heures Différentes concentrations de ganciclovir sont alors ajoutées dans un milieu riche en SVF (10%) Quatre jours après l'addition du ganciclovir, les cellules sont dénombrées ( 100% de la viabilité cellulaire correspondant aux cellules non transduites par Ad-RSV-TK et non traitées par le ganciclovir)
La combinaison Ad-RSV-TK ganciclovir induit un effet cytotoxique vis-à-vis des CMLV de lapin (cf Figure 3) Cette cytotoxicité varie en fonction de la concentration de ganciclovir et de la multiplicité d'infection d' Ad-RSV-TK. Dans nos conditions expérimentales i e quatre jours d'incubation en présence de 10% SVF, la combinaison Ad-RSV-TK (M O I 1000)/ganciclovir (25 μM) entraîne une cytolyse totale Dans ces conditions expérimentales où une forte multiplicité d'infection permet de transduire la majorité des cellules, la CI50 est 0,3 μM A faible multiplicité d'infection (M O I 10), la CI50 est inférieure à 5 μM Ainsi, les concentrations de ganciclovir actives in vitro, sur CML, sont compatibles avec une utilisation thérapeutique. En effet, chez les patients traités pour infection virale par une dose non toxique de ganciclovir, il est possible d'atteindre des concentrations plasmatiques supérieure à 15 μM (Paul et Dummer, Am.J.Med.Sci. 4 : 272-277, 1992). En outre, cette étude in vitro démontre qu'il est possible d'induire un effet cytotoxique majeur en dépit d'un faible pourcentage de transduction par l'adénovirus Ad-RSV-TK. La présence de la protéine HSV-TK a été mise en évidence par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticoφs monoclonaux spécifiques de HSV- TK (anticoφs monoclonal 4C8, Yale University). Dans les CMLV de lapin (et humaines) traitées par Ad-RSV-TK, la localisation de la protéine TK est cytoplasmique mais également nucléaire. Nous avons ainsi montré que l'utilisation d'une multiplicité d'infection de 10 est associée à une transduction de moins de 5% des CMLV. De manière générale, à multiplicité d'infection équivalente, le pourcentage de cellules transduites par Ad-RSV-TK est similaire à celui obtenu à l'aide d'un adénovirus contrôle codant pour la β-galactosidase (ex. : plus de 90% de cellules transduites à multiplicité d'infection 1000). Ces données démontrent donc que la transduction de moins de 5% de CMLV entraine une cytotoxicité importante en présence d'une concentration optimale de ganciclovir (cf. figure 3 : baisse de 80% de la viabilité cellulaire à 25 μM). L'immunodétection de la protéine HSV-TK illustre donc l'importance de l'effet "bystander" observé sur les CMLV traitées par la combinaison Ad-RSV-TK/ganciclovir. Cet effet "bystander" peut avoir sa contrepartie in vivo. En particulier, ces données suggèrent fortement qu'un transfert limité d'adénovirus Ad-RSV-TK, notamment dans une artère pathologique, peut aboutir à une réduction significative de la masse néointimale, riche en CML et responsable de la resténose chez le patient.
D'autre part, l'effet cytolytique est sélectif puisque ni le simple traitement par ganciclovir ni la transduction par Ad-RSV-TK per se n'est associé à une mort cellulaire. La cytotoxicité de l'association Ad-RSV-TK/ganciclovir a été confirmée par le test colorimétrique MTT. Enfin, des résultats similaires, à savoir une toxicité sélective en présence de ganciclovir et d'adénovirus, ont été observés sur culture primaire de cellules musculaires lisses humaines.
Ces données mettent donc en évidence le blocage efficace de la prolifération de CMLV in vitro par Ad-RSV-TK. Exemple 3 : Transfert artériel d'un adénovirus recombinant par voie percutanée
Cet exemple décrit la mise au point d'une technique particulièrement efficace pour le transfert de gènes par voie percutanée Cette technique repose sur l'utilisation d'un cathéter à ballonet à hydrogel Les résultats présentés montrent que, de manière tout à fait avantageuse, cette technique permet d'infecter efficacement certaines populations cellulaires provilégiées, notamment pour le traitement de la resténose
Cet exemple a été réalisé au moyen d'un adénovirus recombinant défectif comprenant le gène de la β-galactosidase d'E coli sous le contrôle du promoteur du RSV-RSV et d'un signal de localisation nucléaire La construction de cet adénovirus a été décrite notamment dans Stratford-Perricaudet et al , (J Clin Invest 90 (1992) 626)
Les expériences ont été réalisées sur des lapins blancs de Nouvelle Zélande anesthésiés à l'acépromazine et maintenus sous pentobarbital Le transfert de gène a été effectué au niveau de l'artère iliaque externe
L'adénovirus Ad-RSV β-Gal (1-2 1010 pfu dans 100 μl de tampon phosphate) a été déposé sur un cathéter à ballonnet préalablement enduit d'hydrogel (Hydroplus, Mansfield Médical, Boston Scientific Corp , Watertown, MA) (Riessen et al , Hum Gène Ther 4 (1993) 749) Le cathéter utilisé est un cathéter à ballonnet de 2 cm de longueur, et de diamètre compris entre 2,5 et 3 mm Le cathéter a ensuite été introduit, en utilisant un manchon protecteur, dans l'artère fémorale droite Une pression de une atmosphère a ensuite été appliquée, puis le cathéter a été dirigé jusqu'à l'artère iliaque externe où une pression de 6 atmosphère a alors été appliquée au ballonnet pendant 30 minutes Cette expérience a été réalisée sur 27 lapins 3 à 28 jours après l'administration, les animaux ont été sacrifiés par overdose de pentobarbital
Transfert et expression du gène dans la paroi artérielle
Les artères des animaux sacrifiés ont été isolées, et l'expression de la β- galactosidase a été détectée par coloration en présence de X-gal selon la technique de
Sanes et al (EMBO J 5 (1986) 3133) Pour chaque animal, deux segments artériels au moins ont été soit montés sur OCT (Laboratoires Miles Inc , IL) pour des expériences de cryosection, ou enduit de paraffine, coupés en sections de 6 μm et contrecolorés à l'hématoxyline et l'éosine. L'expression a été considérée comme positive seulement lorsqu'une coloration bleu foncé était observée dans le noyau. Les résultats obtenus montrent clairement que les artères des animaux infectés présentent une coloration bleu caractéristique de la βgal. Une analyse microscopique révèle qu'il n'y a pas d'endothélium intact résiduel, mais que la continuité de la lamina élastique interne est préservée. L'analyse microscopique montre également que les cellules de la média ont été infectées par les adénovirus et expriment le gène transféré. Plus précisément, alors que dans le cas d'une administration par cathéter à double ballonnets, 0,4% seulement des cellules de la média ont été infectées, 9,6% le sont en utilisant un cathéter à ballonnet enduit d'hydrogel (voir analyse moφhométrique ci-après). De plus, les 9,6 % sont calculés par rapport à l'épaisseur totale de la média mais dans les couches superficielles de la média, 100% des cellules sont infectées. Ces résultats sont bien supérieurs à ceux obtenus avec les cathéters à double ballonnets, ou par transfert de gène nu ou au moyen de liposomes Ces expériences démontrent combien les adénovirus peuvent constituer un vecteur particulièrement avantageux pour l'administration de gènes suicides en vue du traitement de la resténose.
Analyse moφhométrique
L'efficacité de transfert a été déterminée sur 7 lapins traités. Tous ces animaux ont reçu 5.10^ pfu d'adénovirus pour infecter un segment artériel de 2 cm de longueur, de telle sorte que la multiplicité d'infection est similaire pour chaque animal. Pour chaque artère iliaque transfectée, deux segments sériés de 5 mm de longueur ont été prélevés de la zone cible et, pour chaque segment, au moins trois sections au hasard ont été examinées au microscope optique après coloration au X-gal. Sur chaque section, l'efficacité de transfert a été déterminée par le rapport des cellules de la média colorées sur le nombre total des cellules de la média. Au total, plus de 30.10^ cellules provenant des artères infectées par les adénovirus (48 sections) ont été comptées. Le pourcentage moyen de cellules de la média infectées est de 4.02%, avec des valeurs pouvant atteindre 9,6%». Dans le cas d'un transfert par cathéter à double ballonnet, le pourcentage moyen est seulement de 0, 18%.
Cinétique d'expression Pour déterminer la durée de l'expression du gène transféré par les adénovirus selon l'invention, une étude de l'expression de la β-gal a été réalisée au cours du temps sur 20 lapins traités soit par cathéter à double ballonnet (10 animaux), soit par cathéter à ballonnet imbibé d'hydrogel (10 animaux). Pour chaque groupe, 2 animaux ont été sacrifiés au jour 3, 7, 14, 21 et 28 L'expression a été détectée par examens macroscopique et microscopique d'artères colorées au X-gal comme décrit plus haut. Les résultats obtenus montrent, pour chaque groupe, une expression stable pendant 14 jours, suivie d'une baisse à 21 jours. Aucune expression n'est détectée à 28 jours. La même cinétique à pu être mise en évidence dans une artère pathologique dans le modèle de lapin athéromateux Ces résultats confirment l'effet transitoire des vecteurs de l'invention, particulièrement avantageux et adapté au traitement de la resténose notamment au niveau des parois athéromateuses
Sélectivité du transfert et de l'expression au niveau des parois artérielles
Afin de contrôler la dissémination possibles à d'autres tissus des adénovirus injectés, dans tous les animaux sacrifiés 3 jours après l'injection, des échantillons de tissu provenant du foie, cerveau, testicules, coeur, poumon, rein, et muscle squelettique, ainsi qu'un segment artériel adjacent au site traité ont été prélevés immédiatement après le sacrifice. Sur chaque échantillon, le transfert et l'expression du gène ont été mis en évidence par PCR (au moyen de sondes dirigées contre le gène codant pour la protéine IX de l'adénovirus et contre le gène lacZ) et histochimie. Les résultats obtenus montrent que aucun des échantillons prélevés à partir des animaux traités par cathéter à ballonnets enduits d'hydrogel, ne présente de coloration dans les tissus testés De la même manière, aucune présence de virus n'a pu être détectée par PCR dans les échantillons testés, même en utilisant un protocole optimisé et très sensible de 45 cycles d'amplifications
Ces résultats démontrent l'efficacité du mode d'administration selon l'invention pour délivrer de manière très locale les gènes thérapeutiques.
Exemple 4 : Transfert artériel de l'adénovirus Ad-RSV-TK.
Cet exemple démontre les propriétés de l'adénovirus-TK de l'invention pour le traitement de la resténose par transfert sélectif dans une artère athéromateuse. Modèle animal :
L'efficacité du transfert artériel a été évaluée dans un modèle de resténose chez le lapin blanc de Nouvelle Zélande. Les lapins ont été préalablement soumis à un régime riche en cholestérol ( 1 %) pendant deux semaines. L'artère iliaque a été abrasée à l'aide d'un ballonnet de latex (4F) par cinq inflations successives. Les animaux ont de nouveau été soumis à un régime hypercholestérolémiant pendant six semaines. Le transfert artériel a été effectué par voie percutanée, selon la procédure précédemment décrite, au niveau de l'artère lésée. L'adénovirus Ad-RSV-TK (4.10^ pfi dans 40 μl de tampon phosphate) a donc été déposé sur un cathéter à ballonnet préalablement enduit d'hydrogel (Hydroplus, Mansfield Médical, Boston Scientific Coφ., Watertown, MA) (Riessen et al., Hum. Gène Ther. 4 (1993) 749). Le cathéter utilisé est un cathéter à ballonnet de 2 cm de longueur, et de diamètre de 2,5 mm.
Basé sur une lésion double, consécutive à l'abrasion et l'angioplastie, ce modèle de resténose, et non pas uniquement de sténose, permet d'évaluer l'efficacité du transfert adénoviral d'un gène suicide dans une artère athéromateuse.
A la lumière des données expérimentales in vitro et afin de vérifier la sélectivité du traitement par Ad-RSV-TK, les animaux ont été divisés en deux groupes, traités ou non par ganciclovir. Le traitement par ganciclovir a été prolongé pendant cinq jours (du deuxième au septième jour suivant l'angioplastie) à raison de
2x25 mg/kg/jour.
Analyse moφhométrique :
Six semaines après l'angioplastie, les animaux ont été sacrifiés par pentabarbital, les artères iliaques fixées et prélevées en vue de l'analyse moφhométrique. Les contours de la lumière ainsi que des limitantes élastiques internes/externes ont été évalués après coloration à l'orcéine/hématoxyline. Au total, six blocs ont été analysées par artère, dont 4 compris dans la zone d'angioplastie et deux immédiatement en amont et en aval de cette zone. Pour chaque bloc, trois sections adjacentes ont été analysées. Brièvement, différents paramètres tels que le diamètre luminal, le rapport intima/média ont été calculés. Les échantillons pour lesquels ces contours n'ont pu être mis en évidence, en raison d'une rupture de la limitante élastique interne ou d'une occlusion thrombotique, ont été exclus.
L'analyse moφhométrique met en évidence un rapport intima/média élevé dans le groupe contrôle ayant été soumis au transfert adénoviral par angioplastie mais non traité par ganciclovir (5,73 +/- 0,81, n=3). La sévérité de la lésion permet donc d'évaluer l'efficacité d'un traitement par transfert de gène sur une artère pathologique. En outre, ainsi que le montre l'étude immunohistochimique, les lésions induites dans ce modèle animal sont riches en macrophages mais également riches en cellules musculaires lisses qui constituent le cible thérapeutique du transfert génique. L'ensemble de ces données soulignent l'intérêt du modèle utilisé qui ne repose pas sur une simple abrasion endothéliale au niveau d'une artère saine et par conséquent mime, du moins partiellement, la pathologie de la resténose post-angioplastie chez l'homme. L'analyse moφhométrique montre que le rapport intima/média est réduit de 42% (p<0.05) dans le groupe d'animaux soumis à la combinaison Ad-RSV- TK/ganciclovir (3,30 +/- 1,26, n=6). La réduction significative de ce paramètre démontre que le transfert local du gène TK par adénovirus recombinant, en association avec l'administration de ganciclovir, constitue une approche thérapeutique prometteuse comme traitement préventif de la resténose post-angioplastie.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose.
2. Utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose par transfert sélectif dudit gène dans les cellules musculaires lisses de la plaque athéromateuse.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le gène suicide est choisi parmi le gène de la thymidine kinase et le gène de la cytosine désaminase.
4. Utilisation selon la revendication lou 2 caractérisée en ce que le gène suicide est le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (HSV-1 TK).
5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le gène suicide est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées.
6. Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs viraux, de préférence le promoteur LTR-RSV et CMV.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et le gène suicide.
8. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène suicide, et dans lequel le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel. 9 Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène suicide, et dans lequel le gène El et le gène E4 est rendu non fonctionnel
10 Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène suicide, et dans lequel tout ou partie des régions El et E4 sont délétées
1 1 Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine humaine, choisi de préférence parmi les sérotypes Ad2 et Ad5
12 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine animale, choisi de préférence parmi les adénovirus canins
13 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que l'adénovirus est imbibé dans un hydrogel
14 Utilisation selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'hydrogel est dépose sur un cathéter à ballonet
15 Utilisation selon la revendication 1 1 caractérisée en ce que l'adénovirus est administré par l'intermédiaire d'un cathéter à ballonet de type cathéter à perfusion
16 Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'adénovirus est administré par l'intermédiaire d'un cathéter de type cathéter à ballonnet à canaux
17 Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'adénovirus perfusé par l'intermédiaire d'un cathéter de type cathéter à ballonnet à perfusion est imbibé dans un hydrogel
18 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que l'adénovirus est imbibé dans du poloxamère 19 Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'adénovirus perfusé par l'intermédiaire d'un cathéter de type cathéter à ballonnet à perfusion est imbibé dans du poloxamère
20 Composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif imbibé dans un hydrogel
21 Composition pharmaceutique selon la revendication 20 caractérisée en ce que l'adénovirus recombinant défectif comporte un gène suicide
22 Dispositif pour l'administration de gènes par voie percutanée caractérisé en ce qu'il comprend un cathéter à ballonet enduit d'un hydrogel, l'hydrogel étant imbibé d'un adénovirus recombinant défectif comportant le dit gène
23 Dispositif selon la revendication 22 caractérisée en ce que l'administration de gènes est réalisée de manière sélective au niveau de la plaque athéromateuse
24 Dispositif selon la revendication 23 caractérisée en ce que l'administration de gènes est réalisée de manière sélective au niveau des cellules musculaires lisses
25 Dispositif selon la revendication 24 caractérisée en ce que lors de l'administration de gènes celle-ci se fait avec une sélectivité supérieure à 95%
26 Dispositif selon les revendications 23 à 25 caractérisée en ce que l'administration de gènes est suivie d'un traitement au ganciclovir
27 Dispositif selon la revendication 26 caractérisée en ce que le pourcentage de cellules infectées est supérieur ou égal à 0 2%
28 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration de gènes par voie percutanée au moyen d'un cathéter à ballonet enduit d'un hydrogel, l'hydrogel étant imbibé d'un adénovirus recombinant défectif comportant le dit gène 29 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 28 caractérisée en ce que l'administration de gènes se fait de manière sélective au niveau de la plaque athéromateuse
30 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 29 caractérisée en ce que l'administration de gènes se fait de manière sélective au niveau des cellules musculaires lisses
31 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'administration de gènes se fait avec une sélectivité supérieure à 95%
32 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 31 caractérisée en ce que l'administration de gènes suicide TK est suivie d'un traitement au ganciclovir
33 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 32 caractérisée en ce qu'elle induit un effet "bystander"
34 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 33 caractérisée en ce que cet effet bystander induit permet une efficacité thérapeutique même avec un faible pourcentage de cellules infectées
35 Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 34 caractérisée en ce que le pourcentage de cellules infectées est supérieur ou égal à 02%
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