NO317720B1 - Anvendelse av en defektiv, rekombinant adenovirus for fremstilling av preparater mot restenose og aterosklerose - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av en defektiv, rekombinant adénovirus for fremstilling av preparater ment for behandling av resténose og aterosklerose.

Aterosklerose er en kompleks, polygenisk sykdom som defineres på det histologiske plan ved avsetning (lipid-eller fibrolipid plaquer) og andre blod-derivater på veggene i store arterier (aorta, coronær-atreriene, carotid). Disse plaquer, mer eller mindre kalsifi-sert alt efter prosessens fremskriden, kan føre til lesjoner og er forbundet med akkumulering i arteriene av fett-avsetninger i det vesentlige bestående av kolesterol-estere. Disse plaquer ledsages av en fortykning av arterieveggen med hypertrofi av den glatte muskel, opptreden av spumøse celler og akkumulering av fibrøst vev. Ateromatøs plaque er i klar relieff på veggen, noe som gir den en stenosant karakter som er ansvarlig for vaskulære okklusjoner ved atérom, trombose eller emboil som hyppig dukker opp hos pasientene. Disse leksjoner kan så føre til meget alvorlige, cardiovaskulære patolo-gier som infarkt, brå død, cardial-utilstrekkeligheter, cérébro-vaskulære tilfeller og så videre.

Siden 1977 er angioplasti-teknikken utviklet for å tillate en ikke-kirurgisk intervensjon på nivå med aterosklerose-plaque. Imidlertid resulterte en behandling av en atéroskløs lesjon ved angioplasti hyppig (opp til 50 % av de studerte tilfeller) i en konsekutiv resténose med mekanisk skade av arterieveggen. Et nøkkeltilfelle ved denne mekanis-men er proliferering og migrering av de vaskulære, glatte muskelceller (CMLV) i media mot intima, særlig på grunn av fravær av beskyttelse og/eller retro-kontroll som utøves av de endoteliale intimaceller.

Behandlingen av resténose ved administrering av et kjemisk eller proteinstoff som er i stand til å drepe de vaskulære glattmuskelceller har vært foreslått i den kjente teknikk. Således har solarenes derivater vært benyttet (March et al, 1993, "circulation", 87:184-191), innarbeidet via proliferative celler og derved gjort cellene følsomme overfor lys. På samme måte har visse cytotoksiner bestående av et fusjonsprotein mellom et plante-eller bakterietoksin-fragment og en vekst-faktor, også vært benyttet (Pickering et al., "J. Clin. Invest.", 1993,91:724-729 Biro et al., 1992, "Circ.Res.", 71:640-645; Casscells et al., "Proc.Natl.Acad. Sci.USA", 1992, 89:7159-7163). Imidlertid viser disse behand-linger tallrike mangler, for eksempel lav spesifisitet, midlere effektivitet, en vesentlig forsinket virkning og en potensiell toksisitet.

Foreliggende oppfinnelse bringer en fordelaktig løsning på dette problem.

Fordelene ved foreliggende oppfinnelse ligger særlig i den sterke kapasitet hos den beskrevne adénovirus til å infisere vaskulære glattmuskelceller under proliferering. Dette tillater å benytte relativt små mengder av aktiv bestanddel (rekombinant adénovirus) og tillater likeledes en virkning som er effektiv og meget hurtig på de steder som skal behandles. Disse adenoviruser er likeledes i stand til å uttrykke de innførte drepergener i store mengder, noe som gir en meget effektiv terapeutisk virkning. På grunn av den epi-somale karakter har videre adenovirusene en begrenset persistens i de proliferative celler og således en transitorisk virkning som perfekt er tilpasset den ønskede terapeutiske effekt. Til slutt har foreliggende søkere funnet eri spesielt fordelaktig administrerings-metode som med stor effektivitet tillater å infisere visse målceller som er essensielle for den søkte terapeutiske effekt.

En første gjenstand for oppfinnelsen er således anvendelsen av en defektiv, rekombinant adénovirus som bærer et drepergen for fremstilling av et farmasøytisk preparat, ment for behandling av resténose ved selektiv overføring av genet i glattmuskelcellene av den ateromatøse plaque.

En andre gjenstand for oppfinnelsen er anvendelsen av en defektiv adénovirus inneholdende et drepergen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for lokal administrering ved selektiv overføring av genet i glattmuskelcellen av den ateromatøse plaque for behandling av aterosklerose.

Som nevnt ovenfor mener man innenfor oppfinnelsens kontekst med drepergen ethvert gen hvis ekspresjonsprodukt gir den infiserte celle en sensibilitet mot et terapeutisk middel. Som eksempel kan man nevne genet for thymidinkinase hvis ekspresjonsprodukt gir mammifære celler en sensibilitet overfor visse terapeutiske midler som ganciclovir eller acyclovir, eller cytosin desaminase-genet hvis ekspresjon gir mammifære celler en sensibilitet for 5-fluor-cytosin (5-FC).

Thymidin-kinasen til virus av herpes simplex er i stand til å fosforylere nukleosidanalo-ger som acyklovir og ganciclovir. Disse modifiserte molekyler kan innarbeides i en DNA-kjede under forlengelse og dette har som konsekvens en stans i syntesen av DNA som medfører celledød (F.L.Moolten, "Cancer Res." 46 (1986) 5276). Denne strategi tillater således spesifikt å eliminere celler som uttrykker TK-genet. Da videre DNA-syntesen er målet for toksisiteten er det kun cellene under deling som påvirkes.

Aller helst benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen thymidin kinase-genet av humanherpesvirus (hTK HSV-1). Sekvensen for dette gen er beskrevet i litteraturen (se særlig McKnight et al., "Nucleic Acid. Res." 8 (1980) 5931). Det er likeledes mulig å benytte derivater av denne sekvens som oppviser en større spesifisitet for substratet eller en bedre kinase-aktivitet. Slike derivater kan særlig oppnås ved mutagenese på nivå med bindingssetet som beskrevet tidligere (Balasubramaniam et al., "J. Gen. Virol." 71

(1990) 2979; Munir et al., "JBC" 267 (1992) 6584).

Det er likeledes mulig å benytte cytosin désaminase-genet hvis ekspresjonsproduktet gir mammifere celler en sensibilitet for 5-fluorcytosin (5-FC). Cytosin désaminase er i stand til å katalysere désamineringen av cytosin til uracil. Celler som uttrykker dette gen er således i stand til å omdanne 5-fluorcytosin (5-FC) til 5-fluor-uracil (5-FU) som er en toksisk metabolitt. Sekvensen for dette gen er beskrevet i litteraturen (Anderson et al. "Arch. Microbiol." 152 (1989) 115).

Mer generelt kan ethvert gen som er i stand til å gi infiserte celler en sensibilitet for et terapeutisk middel, benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen. Thymidin kinase-genet er en spesielt fordelaktig utførelsesform.

For konstruksjon av adenoviruser for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan man benytte forskjellige cérotyper. Det eksisterer således tallrike cérotyper av adenoviruser hvis

struktur og egenskaper varierer noe. Blant cérotypene foretrekker man imidlertid innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte human adenoviruser av typen 2 eller 5 (Ad 2 eller Ad 5) eller adenoviruser av animalsk opprinnelse (se FR 93 05954). Blant adenovirusene av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen skal særlig nevnes adenoviruser av canin-, bovin-, murin- (se for eksempel Mavl, Beard et al., "Virology" 75 (1990) 81)-, ovin-, porcin-, aviar- eller også simienne (for eksempel SAV)-oppirnnelse. Fortrinnsvis er adenovirusen av animalsk opprinnelse en canin-adenovirus og aller helst en CAV2-adenovirus [for eksempel stamme manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)]. Fortrinnsvis benytter man, innenfor oppfinnelsens ramme, adenoviruser av human eller canin opprinnelse eller en blanding derav.

Som antydet ovenfor er adenovirusene defektive, det vil si at de ikke er i stand til repli-kering på autonom måte i målcellen. Videre er fortrinnsvis genet El og minst et av genene E2, E4, L1-L5 ikke funksjonelle i genomet i adenovirusen. Det angjeldende virale gen kan gjøres ikke-funksjonelt ved en hvilken som helst kjent teknikk og særlig ved total supresjon, substitusjon, partiell delesjon eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener. Slike modifikasjoner kan oppnås in vitro (på isolert DNA) eller in situ, for eksempel ved hjelp av genetiske teknikker, eller ved behandling med mutagene midler.

Aller helst benyttes en defektiv adénovirus som er gjort ikke-funksjonell ved en total eller partiell delesjon av området El og en delesjon i området E4. Området E4 omfatter 7 lesefaser. Delesjonen i området E4 kan være transkomplementert ved nærvær, i celle-linjen som tjener for multiplikering av virusen, enten ganske enkelt av lesefasen ORF6 eller lesefasene ORF6 og ORF6/7.

Adenoviruser som er foretrukne ifølge oppfinnelsen velges blant:

rekombinante, defektive adenoviruser AE1, AE4 omfattende en delesjon av hele

eller en del av området El og en delesjon av hele eller en del av området E4; defektiv, rekombinant adénovirus AE1, ORF3", ORF6", omfattende en delesjon av hele eller en del av området El og nukleotidene 34801-34329 og 34115-33126 i

området E4;

defektiv, rekombinant adénovirus AE1, AE4, ORFl<+> omfattende en delesjon av hele eller en del av området El og en delesjon i området E4 bortsett fra lesefasen ORF1. Mer spesielt gjennomføres to delesjoner, den ene der ekstremiteten 5' ligger i lesefasen ORF7 og der ekstremiteten 3<1> ligger i lesefasen ORF6, den andre der ekstremiteten 5' ligger i lesefasen ORF3 og der ekstremiteten 3' ligger i lesefasen ORF1 eller i promoter-området av E4.

For eksempel dekker en delesjon nukleotidene 33093-33695 og en delesjon dekker nukleotidene 34634-35355.

defektiv, rekombinant adénovirus AE1, AE4 omfatter en delesjon av hele eller en del av området El og en delesjon som omfatter hele området E4 valgt for eksempel blant de følgende delesjoner: nukleotidene 32720-35835, eller 33466-35355, eller 33093-35355.

Konstruksjonen av disse vektorer er beskrevet i patentene FR 9500749 og FR 9506532.

De defektive, rekombinante adenoviruser kan fremstilles ved en hvilken som helst kjent teknikk (Levero et al., "Gene" 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, "EMBO J." 3

(1984) 2917). Spesielt kan de fremstilles ved homolog rekombinering mellom en adénovirus og et plasmid som blant annet bærer drepergenet. Den homologe rekombinering skjer efter ko-transfektering av adenovirusen og plasmidet i en egnet cellelinje. Den benyttede cellelinje må fortrinnsvis være (i) transformerbar ved elementene og (ii) om-fatte sekvenser som er i stand til å komplementere delen av genomet av den defektive adénovirus, fortrinnsvis i integrert form for å unngå risiki for rekombinering. Som eksempel på cellelinje kan nevnes human embryonyrelinjen 293 (Graham et al., "J. Gen. Virol." 36 (1977) 59) særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en adénovirus Ad5 (12 %). Konstruksjonsstrategjene for vektorer avledet fra adenoviruser er likeledes beskrevet i FR 93 05954 og FR 93 08596.

Til slutt blir de multipliserte adenoviruser gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien, som vist i eksemplene.

Fortrinnsvis blir, i adenovirusene, drepergenet plassert under kontroll av en promoter som tillater dets ekspresjon i de infiserte celler. Det kan dreie seg om den egentlige

promoter for drepergenet, en heterolog promoter eller en syntetisk promoter. Særlig kan det dreie seg om promotere som stammer fra eucaryotiske eller virale gener. Det kan for eksempel dreie seg om promotersekvenser fra genomet av cellen man ønsker å infisere. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av en virus, der-iblant den benyttede virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterne EIA, MLP, CMV, LTR-RSV og så videre. Videre kan ekspresjonssekvensen modifise-res ved tilsetning av sekvenser for aktivering, regulering eller som tillater en vevspesi-fikk ekspresjon. Det kan videre være særlig interessant å benytte aktive ekspresjonssig-naler som er spesifikke eller overveiende i vaskulære glattmuskelceller slik at drepergenet ikke uttrykker og ikke utøver sin virkning når virusen effektivt har infisert en vasku-lær glattmuskelcelle. Blant promotere som spesifikt eller hovedsaklig er aktive i vaskulære glattmuskelceller skal særlig nevnes a-actin-orimiteren av glatt muskel.

I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen benyttes en defektiv, rekombinant adénovirus omfattende et drepergen under kontroll av en viral promoter, fortrinnsvis valgt blant LTR-RSV eller den tidlige CMV-promoter.

Ifølge en annen fordelaktig utførelsesform dreier det seg om en promoter som er aktiv spesifikt eller hovedsaklig i vaskulære glattmuskelceller.

Det er funnet en metode som er særlig effektiv for behandling av resténose. For ytterligere å øke effektiviteten og spesifisiteten ved behandlingen har foreliggende oppfinnere kommet frem til en metode som tillater en lokal administrering av rekombinante adenoviruser på nivå med de seter som skal behandles. Mer spesielt er denne metode basert på anvendelse av en angioplastiblære omgitt av en hydrofil film (for eksempel en hydrogel) som er dynket med adenovirusen og som så kan applikeres på nøyaktig måte på det setet som skal behandles og som tillater en lokal og effektiv frigjøring av adénovirus på nivå med cellene som skal behandles.

Videre har foreliggende oppfinnere vist at denne administreirngsmetode i friske arterier tillater å infisere en høy prosentandel celler med media (opp til 9,6 %), noe som er det mest logiske mål for prevensjon av resténose.

På en meget fordelaktig måte har foreliggende søkere også vist at virusen og frem-gangsmåten tillater en effektiv og selektiv overføring av gener i en ateromatøs arterie. Mer spesielt har foreliggende søkere for første gang vist evnen til adenoviruser til å overføre et terapeutisk gen på effektiv måte i en ateromatøs arterie. Dette er meget vesentlig fordi den terapeutiske effektivitet ved behandling av resténose går via demonst-rasjon av evnen til å overføre det terapeutiske gen, i friske celler, og med egnet effektivitet, under fysiopatologiske betingelser. De ateromatøse arterier karakteriseres ved nærvær på intima-nivået av (i) avsetninger av ekstracellulær matrise, (ii) flytende avsetninger i det vesentlige bestående av spumøse celler av makrofagisk type og (iii) glattmuskelceller under proliferering.

De nedenfor angitte resultater viser at virusene som anvendes ifølge oppfinnelsen, i disse ateromatøse celler, tillater en mindre infeksjonsprosentandel men med meget større spesifisitet (tatt i betraktning nærværet av celler av makrofagisk type i det tilfellet der de makrofagiske celler ikke transduseres) og ledsages av en vesentlig terapeutisk effektivitet. Resultatene som oppnås viser likeledes en meget selektiv overføring av adenovirusen i målcellene, det vil si glattmuskelcellene under proliferering. På hele cellepopula-sjonen som er tilstede på nivå med den ateromatøse sone er mer enn 95 % av de infiserte celler vaskulære glattmuskelceller. Således blir de makrofagiske celler som er tilstede på nivå med intima ikke infisert i det hele tatt (ingen infisert, makrofagisk celle har vært påvist). Når det dreier seg om glattmuskelceller under proliferering (i néointima) tillater behandlingen å infisere en prosentandel som ligger under 1 % (for eksempel 0,2 %). Dette er godt under de resultater som er beskrevet tidligere i friske arterier eller arterier som oppviser lesjoner i veggen men som ikke representerer den fysiopatologiske situa-sjon med retenose (endotelial abrasjon i en sunn arterie). Foreliggende oppfinnere har likeledes vist at infeksjon av denne lave prosentandel celler ikke desto mindre tillater en vesentlig terapeutisk effekt, påvist særlig ved måling av lysåpningen. Dette resultat er særlig overraskende og implikerer eksistensen av en indusert, cytotoksisk effekt

("bystander"-effekt) in vivo. Foreliggende oppfinnelse beskriver således for første gang en metode som tillater selektiv overføring av gener i vaskulære glatte muskelceller under proliferering i en ateromatøs arterie, omfattende administrering til arterien av en defektiv, rekombinant adénovirus omfattende genet, ved hjelp av en angioplasti-blærekateter. Uttrykket selektiv overføring implikerer en overføring i det vesentlige i de vaskulære glattmuskelceller under proliferering og ikke overføring til de omgivende,

makrofagiske celler. Denne metode tillater behandling av retenose ved overføring av et drepergen som TK-genet med etterfølgende behandling for eksempel med gancyklovier eller acyklovier. Denne behandlingsmetode karakteriseres videre ved en in vivo indusert toksisitet.

Ifølge oppfinnelsen oppnår man et farmasøytisk preparat som omfatter en defektiv, rekombinant adénovirus og en hydrogel. Mer spesielt oppnår man et preparat omfattende en defektiv, rekombinant adénovirus som bærer et drepergen, og en hydrogel. Hydrogelen som benyttes kan fremstilles fra en hvilken som helst biokompatibel og ikke cytotoksisk (homo eller hetero)-polymer. Slike polymerer er for eksempel beskrevet i WO 93/08845. Visse av disse, særlig de som oppnås fra etylen- og/eller propylenoksyd, er kommersielt tilgjengelige.

Behandlingsmetoden som her beskrives består således fordelaktig i, på nivå med det sete som skal behandles, å innføre et preparat omfattende en hydrogel som er fylt opp

med rekombinante adenoviruser. Hydrogelen kan avsettes direkte på overflaten av vevet som skal behandles, for eksempel under en kirurgisk intervensjon. Fortrinnsvis innføres hydrogelen til setet som skal behandles ved hjelp av en kateter, for eksempel et ballong-kateter, særlig under angioplasti, noe som tillater å unngå enhver ytterligere traumatis-me på grunn av en ny intervensjon på angioplasti-setet. På spesielt fordelaktig måte blir den virusfylte hydrogel innført på punktet for setet som skal behandles ved hjelp av en blærekateter, beskyttet av en mansjett. Som beskrevet i eksemplene oppviser hydrogelen tallrike fordeler: den tillater å forbedre glidningen av blæren, noe som tillater å føre den via sterkt forkalkede arterier. Videre er hydrogelen anvendelig med en hvilken som helst type angioplastiballong eller -blære, noe som særlig tillater å benytte perfusjonsballonger. Ved en spesielt foretrukken utførelsesform blir således adenovirusene som anvendes ifølge oppfinnelsen administrert ved hjelp av perfusjonsballonger, særlig ballong angioplasti-kateteret med kanaler ("channelled balloon angioplasty cathéter", Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA). Disse sistnevnte består av en konvensjonell ballong som er dekket av et sjikt på 24 perforerte kanaler som er perfusert med en uavhengig lumen gjennom en supplementer infusjonsmunning. Disse

perfusjonsballonger som tillater å opprettholde en blodstrøm og derved å redusere risiki for myocardisk ischemi under oppblåsing av ballongen, tillater likeledes lokalt å avgi et medikament under normalt trykk over et relativt langt tidsrom, mer enn 20 minutter, noe som er nødvendig for en optimal infeksjon.

Det er spesielt interessant å benytte en perfusjonsballongkateter som er omgitt av en hydrogel. I dette tilfellet oppnår man fordelene fra begge utførelsesformer, nemlig muligheten for å beholde den oppblåste ballong i et lengre tidsrom mens man bevarer gli-de-egenskapene og setet spesifisiteten for hydrogelen. Man oppnår i dette tilfellet en optimal infeksjonseffektivitet.

De resultater som er vist i eksemplene viser således effektiviteten for dette system for perkutan overføring av gener i arterie-veggene.

Videre oppnås et farmasøytisk preparat som omfatter en defektiv, rekombinant adénovirus og poloxamer. Mer spesielt oppnår man et preparat omfattende en defektiv, rekombinant adénovirus som bærer et drepergen, og poloxamer. Poloxamer 407 er en ikke-toksisk, biokompatibel polyol som er kommersielt tilgjengelig (BASF, Parsippany, NJ).

En behandlingsmetode omfatter fordelaktig, på behandlingssetet, å innføre et preparat omfattende poloxamer som er fylt opp med rekombinante adenoviruser. Poloxamerer kan avsettes direkte på overflaten av vevet som skal behandles, for eksempel under en kirurgisk intervensjon. Fortrinnsvis blir poloxamer innført på punktet som skal behandles ved hjelp av en kateter, for eksempel en ballongkateter, særlig under angioplasti, noe som tillater å unngå enhver ytterligere trauma på grunn av en ny intervensjon på angioplasti-setet. Spesielt fordelaktig blir poloxamer med rekombinanate adenoviruser innført på setet som skal behandles ved hjelp av en ballongkateter, beskyttet med en mansjett. Polyxameren oppviser i det vesentlige de samme fordeler som hydrogelen men har dog en lavere viskositet.

Det er spesielt interessant å benytte et perfusjonsballongkateter som er omhyllet av po-lyxamer og særlig kanalballong-katetere. I dette tilfellet oppnår man fordeler fra begge utførelsesformer, nemlig muligheten for å bevare den oppblåste ballong over et lengre tidsrom og muligheten for å bevare de forbedrede glideegenskaper og poloxamerens setespesifisitet. Man oppnår også i dette tilfellet en optimal infeksjonseffektivitet.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende eksempler og under henvisning til de ledsagende figurer der: Figur 1 viser vektoren pONT-tk; Figur 2 viser vektoren pRSV-tk; Figur 3 illustrerer cytotoksisiteten for kombinasjonen ganciclovir/Ad-LTR-tk på glattmuskelceller i kultur; og Figur 4 viser reduksjonen av resténose ved adénoviral-overføring av tk-genet og administrering av ganciclovir.

Generelle molekylbiologiske teknikker

De klassiske metoder som benyttes i molekylærbiologien som preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumklorid-gradient, elektroforese på agarose- eller akrylamid-gel, rensing av DNA-fragmenter ved elektroelue-ring, ekstrahering av proteiner med fenol eller fenol-kloroform, precipitering av DNA i saltmedium med etanol eller isopropanol, transformering i Escherichia coli, og så videre, er alle kjente for fagmannen og utførlig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plasmidene av typen pBR322, pUC og fagene fra M13-serien er kommersielt tilgjengelige (Bethesda Research Laboratories).

For ligaturene kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse ved elektroforese på agarose- eller akrylamid-gel, ekstrahering med fenol eller med en blanding av fenol og kloroform, precipiteres fra etanol og deretter inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fag T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Oppfyllingen av de proeminente 5'ender kan gjennomføres med Klenow-rfagmentet av DNA-polymerase I av E.coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Destrueringen av de proeminente 3'ender gjennomføres i nærvær av DNA polymerase av fagen T4 (Biolabs) som anvendes i henhold til fabrikantens anbefalinger. Destrueringen av de proeminente 5'ender gjennomføres ved en behandling med Sl-nuklease.

Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligonukleotider kan gjennomføres i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al. ["Nucleic Acids Res." 13 (1985)

8749-8764] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham.

Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene ved den teknikk som kalles PCR ["Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., "Science" 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., "Meth.Enzym." 155, (1987) 335-350] kan gjennom-føres under anvendelse av en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til produsentens spesifikasjoner.

Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utviklet av Sanger et al. ["Proc.Natl. Acad.Sci." USA, 74 (1977) 5463-5467] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham.

Oppfinnelsen skal illustreres nærmere ved de følgende eksempler:

Eksempel 1

Konstruksjon av vektoren Ad-LTR-TK som bærer genet TK under kontroll av promoteren av LTR av sarcom-virusen av Rous (LTR-RSV) (figur 1).

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en rekombinant adénovirus som bærer

thymidin kinase-genet av herpes simplex-virusen (tk) under kontroll av en viral promoter (promoter LTR-RSV). Denne adénovirus er konstruert ved homolog rekombinering mellom defektiv adénovirus Ad-dll324 og plasmidet pRSVtk som bærer tk-genet under kontroll av RSV-promoteren (eksempel 1.3). Dette plasmid er konstruert fra plasmid pONTtk (eksempel 1.1.), ved substitusjon av den transaktivable promoter med EBNA1, med RSV-promoteren (eksempel 1.2.).

1.1. Konstruksjon av plasmid pONTtk

a) Konstruksjon av plasmid p7tkl

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av plasmid p7tkl som inneholder den åpne

lesefase av tk-genet med 1131 basepar ATG 114-116 og codon-stopp TGA 1242-1244), innskutt i et kloningsmultisete.

Fragmentet Bglll-Ncol inneholdende genet av thymidin kinase (tk) av herpes simplex-virus type 1 ble isolert fra plasmid pHSV-106 (markedsført av Gibco BRL), reparert ved innvirkning av klenow-rfagmentet og derefter innskutt ved Smal-setet av plasmidet pGEM7zf(+) (markedsført av Promega). Setene Smal og BgHI destrueres under dette

trinn, sete Ncol bevares.

Det oppnådde plasmid betegnes som p7tkl.

b) Konstruksjon av plasmid pONTl.

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av et plasmid inneholdende en chimér promoter bestående av en sekvens som er nødvendig for transaktivering med antigen EBNA1 og promoteren TP1 av virus EBV.

Fragmentet EcoRI(7315)-SmaI(8191) av virus EBV isoleres fra stammen B95-8. Den totale sekvens for virus EBV er beskrevet av Baer et al. ("Nature" 310 (1984) 207). Dette fragment inneholder de sekvenser som er nødvendig for trans-aktivering med det nukleære angi-gen 1 (EBNAl)(D.Reisman & B. Sugden, 1986, "Molecular and Cellular Biology", vol. 6, sidene 3838-3846). Dette fragment fusjoneres deretter til fragment Nrul(166 24I)-PstI(166 559) av EBV B95-8 (sete Pstl er digerert med polymerase T4), inneholdende promoteren TP1. Den chimére promoter som oppnås på denne måte sky-tes deretter inn i kloningsmultisetet av plasmid pBluepring II SK for å oppnå plasmidet pONTl.

c) Konstruksjon av plasmid pONTtk.

Plasmidet pONTtk omfatter genet av thymidin kinase av herpes simplex-virus (tk) klonet inn i plasmid p7tkl, under kontroll av den chimére promoter EBNA1-RE/TP1 som er klonet inn i plasmid pONTl.

For å konstruere dette plasmid blir fragmentet BamHI-XhoI av pONTl som inneholder den chimére promoter, transaktivert med EBNA-1 og EBNA-2, og fragmentet Xhol-Clal av p7tkl som inneholder den åpne lesefase av tk, klonet til setene BamHI (478) og Clal (4550) av plasmid pAd.RSVbgal. Plasmidet pAd.RSVbGal inneholder, i retning 5'->3',

fragmentet PvuII som tilsvarer den venstre ende av adenovirusen Ad5 omfattende: sekvensen ITR, replikasjonsopprinnelsen, enkapsideringssignalene og forsterkeren

EIA;

genet som koder for 6-galactosidase under kontroll av promoteren RSV (av virusen

av Rous-sarcomet),

et andre fragment av genomet av adénovirus Ad5 som tillater homolog rekombine-

ring mellom plasmidet pAd.RSVbGal og adenovirusen dl 324. Plasmidet pAd.RSVbGal er beskrevet av Stratford-Perricaudet et al. i "J.Clin. Invest." 90

(1992) 626).

Alle kloningssetene bevares. Det oppnådde plasmid kalles pONTtk.

1.2. Konstruksjon av plasmid pRSVtk.

Dette plasmid konstrueres fra plasmid pONTtk (eksempel 1.1.) ved substitusjon av den med EBNAl-transaktivable promoter, med RSV-promoteren. For dette formål blir RSV-promoteren isolert i form av et BamHI-Sall-fragment fra plasmid p.Ad.RSV.Bgal (Stratford-Perricaudet et al., "J.Clin.Invest." 90 (1992) 626), derefter klonet til setene BamHI(478) og Sall(1700) av plasmid pONTtk. Det resulterende plasmid kalles pRSVtk (figur 1).

1.3. Konstruksjon av den rekombinante adénovirus Ad-RSV-tk.

Vektoren pRSVtk lineariseres og ko-transfekteres med en defisient adénoviral vektor, i hjelpercellene (linje 293) som i trans bærer funksjonene som kodes av områdene E2 (El A og El IB) av adenovirusene.

Mer spesielt blir adenovirusen Ad-RSV-tk oppnådd ved homolog rekombinering in vivo mellom den mutante adénovirus Ad-dll324 (Thimmappaya et al., "Cell" 31 (1982) 543) og vektoren pRSVtk, i henhold til følgende protokoll: plasmidet pRSVtk, linearisert med XmnI, og adenovirusen Ad-dl 1324, linearisert med enzym Clal, ko-transfekteres i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat for å tillate homolog rekombinering. De således oppnådde, rekombinante adenoviruser seleksjoneres ved rensing på plaque. Etter isolering blir DNA fra den rekombinante adénovirus forsterket i cellelinje 293, noe som fører til en kultur-supernatant inneholdende ikke-renset, defektiv, rekombinant adénovirus med en titer på ca. 10^ pfu/ml.

De virale partikler renses derefter ved sentrifugering i en ceciumkloird-gradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al. i "Virology" 52 (1973) 456). Adenovirusen Ad-RSV-tk kan bevares ved -80°C i 20 %-ig glycerol.

Eksempel 2:

Aktivering av en adénovirus ifølge oppfinnelsen i nærvær av ganciclovirs på glattmuskel-celler i kultur.

Aktiviteten til adenovirusen inneholdende genet TK, fremstilt i eksempel 1, kontrolleres på in vitro-modeller av glattmuskel-celler. For dette formål blir glattmuskel-cellene isolert fra rotte- og canin-aorta og infektert med rekombinant adénovirus Ad-RSV-tk og derefter inkubert i nærvær av ganciclovir. Virkningen av kombinasjonen Ad-RSV-tk/ganciclovir på cellenes levedyktighet bekreftes derefter ved den kolorimetriske MTT-test, 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazoliumbromid, i henhold til den teknikk som er beskrevet av Mosman i ("J.Immunol.Meth." 65 (1983) 55), eller mer nøyaktig ved celle-telling.

Kort sagt blir de vaskulære glattmuskel-celler (CMLV) bragt i kultur ved enzymatisk fermentering av aorta fra NZW-kaniner i henhold til en metode som er tilpasset av Chamley et al., ("Cell Tissue Res." 177: 503-522 1977). Cellene holdes i nærvær av 20 %-ig foetal-kalveserum og benyttes for alle prøvene (jfr. infra) før den tiende passasje. Under alle de her beskrevne forsøk karakteriseres glattmuskelcellene ved immunomar-kering ved hjelp av anti-aSM-actine antistoffer (Sigma).

For å måle den cytotoksiske aktivitet for kombinasjonen Ad-RSV-TK/ganciclovir blir CMLV-fra canin-aorta inkubert i nærvær av adenoviruser, fortynnet i dyrkingsmedium (DMEM, 0,5 SVF). Efter ca. 1 time ved 37°C i fuktig atmosfære blir mediet inneholdende den adénovirale oppløsning beluftet og erstattet med dyrkingsmedium (DMEM, 0,5 % SVF) i en periode på 18 til 24 timer. Forskjellige konsentrasjoner av ganciclovir tilsettes derefter i et SVC-rikt (10 %) medium. 4 dager efter tilsetningen av ganciclovir blir cellene tellet (100 % cellulær levedyktighet tilsvarer celler som ikke er transdusert med Ad-RSV-TK og ikke behandlet med ganciclovir).

Kombinasjonen Ad-RSV-TK/ganciclovir induserer en cytotoksisk effekt vis-å-vis canin CMLV (se figur 3). Denne cytotoksisitet varierer som funksjon av konsentrasjonen av ganciclovir og multiplisiteten av infeksjon av Ad-RSV-TK. Under oppfinnernes eksperimentelle betingelser, det vil si 4 dagers inkubering av 10 % SVF, medfører kombinasjonen Ad-RSV-TK (M.O.1.1000)/ganciclovir (25 um) en total cytolyse. Under disse eksperimentelle betingelser der en sterk infeksjonsmultiplisitet tillater å transdusere mesteparten av cellene, er CI50-verdien 0,3 nm. Ved lav infeksjonsmultiplisitet (M.O.I.

10) er CI50-verdien under 5 um. Således er konsentrasjonene av ganciclovir som er aktive in vitro, på CML, kompatible med en terapeutisk anvendelse. Hos pasienter som behandles for viral inveksjon med en ikke-toksisk dose av ganciclovir er det således mulig å komme opp i plasmatiske konsentrasjoner på over 15 um (Paul et Dummer, "Am.J.Med.Sci." 4: 272-277; 1992).

Videre viser dette studium in vitro at det er mulig å indusere en vesentlig cytotoksisk

effekt på tross av en lav prosentvis transduksjon med adénovirus Ad-RSV-TK. Nærværet av proteinet HSV-TK er påvist ved indirekte immunofluorescens ved hjelp av HSV-TK-spesifikke, monoklonale antistoffer (monoklonalt antistoff 4C8, Yale University). I canin- (og human-) CMLV som er behandlet med Ar-RSV-TK, er lokaliseringen av proteinet TK cytoplasmisk men også nukleært. Det er således vist at anvendelsen av en infeksjonsmultiplisitet på 10 er forbundet med en transduksjon på mindre enn 5 % av CMLV. Generelt er, ved ekvivalent infeksjonsmultiplisitet, prosentandelen celler som transduseres med Ad-RSV-TK, tulsvarende det som oppnås ved hjelp av en kontroll-adenovirus som koder for B-galactosidase (eksempel: mer enn 90 % celler transdueres ved infeksjonsmultiplisitet 1000).

Disse verdier viser således at en transduksjon på mindre enn 5 % av CMLV medfører en vesentlig cytotoksisitet i nærvær av en optimal konsentrasjon av ganciclovir (jfr. figur 3: en reduksjon på 80 % av den cellulære levedyktighet ved 25 um). Immunodetekteringen av proteinet HSV-TK viser således viktigheten av den observerte "bystander"-effekt på CMLV som er behandlet ved kombinasjonen Ad-RSV-TK/ganciclovir. Denne "bystan-der"-effekt kan ha sin motpart in vivo. Særlig antyder disse verdier sterkt at en begrenset overføring av Ad-RSV-TK-adenovirus, særlig en patologisk arterie, kan føre til en signifikant reduksjon av den neo-intimale masse, rik på CML og ansvarlig for resténose hos pasienten.

På den annen side er den cytolytiske effekt selektiv fordi verken enkel behandling med ganciclovir eller transduksjon med Ad-RSV-TK per se forbindes med noen celledød. Cytotoksisiteten for kombinasjonen Ad-RSV-TK:ganciclovir er bekreftet ved den kolorimetriske MTT-test.

Til slutt er det observert tilsvarende resultater, nemlig en selektiv toksisitet i nærvær av ganciclovir og adénovirus, på primærkulturer av humane glattmuskelceller.

Dette viser således klart den effektive blokkering av prolifereringen av CMLV in vitro med Ad-RSV-TK.

Eksempel 3:

Arteriell overføring av en rekombinant adénovirus ad percutanvei.

Dette eksempel beskriver anvendelse av en teknikk som er spesielt effektiv for overfø-ring av gener ad percutan vei. Denne teknikk er basert på anvendelsen av et hydrogel-ballong-kateter. De presenterte resultater viser at denne teknikk, på meget fordelaktig måte, tillater effektivt å infektere visse foretrukne cellulære populasjoner, særlig for behandling av resténose.

Dette eksempel gjennomføres ved hjelp av en defektiv, rekombinant adénovirus, omfattende genet av fi-galactosidase av E.coli. under kontroll av promoteren av RSV-RSV og et nukleært lokaliseringssignal. Konstruksjonen for denne adénovirus er beskrevet særlig av Stratford-Perricaudet et al. i ("J.Clin.Invest." 90 (1992) 626).

Disse forsøk ble gjennomført på hvite New-Zealand-kaniner som var anestetisert med acépromacin og holdt under pentobarbital. Overføringen av genet ble gjennomført på nivå med den eksterne ilia-arterie.

Adenovirusen Ad-RSV.B-Gal (1-2.10<10> pfu i 10 ul fosfat buffer) ble anbragt på et ballong-kateter som på forhånd var belagt med hydrogel (Hydroplus, Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA)(Riessen et al., "Hum.Gene. Ther." 4 (1993) 749). Det benyttede kateter var et ballong-kateter med lengde 2 cm og en diameter mellom 2,5 og 3,5 mm. Kateteret ble så innført under anvendelse av en beskyttelsesman-sjett, i den høyre femoral-arterie. Det ble derefter lagt på et trykk på en atmosfære hvor-efter kateteret ble dirigert til den eksterne ilia arterie der det så ble lagt på et trykk på 6 atmosfærer på ballongen i 30 minutter. Dette forsøk ble gjennomført på 27 kaniner. 3 til 28 dager efter administrering ble dyrene avlivet ved en overdose av pentobarbital.

Overføring op ekspresjon av genet i arterieveggen

Arterien fra de avlivede dyr ble isolert og ekspresjonen av fl-galactosidase ble detektert ved farving i nærvær av X-gal i henhold til teknikken ifølge Sanes et al. ("EMBO J." 5

(1986) 3133). For hvert dyr ble minst to arterie-segmenter montert på OCT (Laboratoi-res Miles Inc.; IL) for cryoseksjonsforsøk, eller nedsenket i parafin, skåret i snitt på 6

(im og kontrafarvet med hematoxylin og eosin. Ekspresjonen ble ansett som positiv kun når en mørk blå farve ble observert i kjernen. De oppnådde resultater viser klart at arteriene av de infiserte dyr oppviser en blåfarving som er karakteristisk for J3-gal. En mik-

roskopisk analyse viser at det ikke er tilstede noe intakt rest-endotelium men at den indre, elastiske lamina-kontinuitet er bevart. Den mikroskopiske analyse viser likeledes at mediacellene er infisert av adenoviruser og uttrykker det overførte gen. Nærmere be-stemt og men kun 0,4 % av mediacellene infiseres når det benyttes administrering med et dobbeltballong-kateter, infiseres 9,6 % under anvendelse av et ballong-kateter med hydrogel (se den følgende morfometriske analyse). Videre er disse 9,6 % beregnet i forhold til den totale tykkelse av mediet men i mediets overflatesjikt er 100 % av cellene infisert. Disse resultater er klart overlegne de som oppnås med dobbeltballongkate-tere, eller ved overføring av det nakne gen eller ved hjelp av liposomer. Disse forsøk viser hvordan adenovirusen kan utgjøre en særlig fordelaktig vektor for administrering av drepergener med henblikk på behandling av resténose.

Morfometrisk analyse

Effektiviteten ved overføringen bestemmes på 7 behandlede kaniner. Alle dyrene mot-tok 5 x 10^ pfu adénovirus for å infisere et arteriesegment med en lengde på 2 cm slik at infeksjonsmultiplisiteten er lik for hvert dyr. For hver transfekterte ilia-arterie ble det tatt ut to segmenter i serie med lengde 5 mm fra målsonen og fra hvert segment under-søkte man minst tre vilkårlige seksjoner ved optisk mikroskopi etter farving med X-gal. For hver seksjon bestemte man overføringseffektiviteten ved forholdet mellom farvede mediaceller og det totale antall mediaceller. Til sammen ble det tellet mer enn 30 x 10^ celler fra arterier som var infektert med adenoviruser (48 seksjoner). Den midlere prosentandel celler av infektert media var 4,02 % med verdier som kunne gå helt opp i 9,6 %. I det tilfellet overføringen skjedde med dobbeltballong-kateter var den midlere prosentandel 0,18.

Kinetisk ekspresjon

For å bestemme varigheten av ekspresjonen av genet som ble overført med adenoviruser som anvendes ifølge oppfinnelsen, ble det gjennomført et studium på ekspresjonen av 6-gal med tiden på 20 kaniner som var behandlet enten med dobbeltballong-kateter (10 dyr) eller med hydrogelbehandlet ballong-kateter (10 dyr). For hver gruppe ble to dyr avlivet på dagene 3,7,14, 21 og 28. Ekspresjonen detekteres ved makroskopisk og mik-roskopisk undersøkelse av X-gal-farvede arterier som beskrevet ovenfor. De oppnådde resultater viser for hver gruppe en ekspresjon som er stabil i 14 dager fulgt av en reduksjon efter 21 dager. Ingen ekspresjon detekteres ved dag 28. Den samme kinetikk har kunnet påvises i en patologisk arterie i ateromatøs kanin-modell. Disse resultater be-krefter transitorie-virkningen av oppfinnelsens vektorer, særlig fordelaktig og brukbar ved behandling av resténose, særlig på nivå med ateromatøse vegger. Overførin<g>sselektivitet og ekspresjon på nivå med arterieveggene For å kontrollere disseminasjonen som er mulig på andre vev med inj ekt erte adenoviruser tok man fra alle de avlivede dyr, tre dager efter injeksjonen, prøver av vev fra lever, hjerne, testikler, hjerte, lunge, nyre og skjelett-muskel, samt et arterie-segment nær det behandlede sete, umiddelbart efter avlivning. På hver prøve påviste man overføring og ekspresjon av genet ved PCR (ved hjelp av sonder rettet mot genet som koder for pro-tein 9 av adenovirusen og mot genet lacZ) og ved histokjemi. De oppnådde resultater viser at ingen av prøvene som ble tatt fra dyr som var behandlet med hydrogelbehandlet ballong-kateter oppviste noen farving i de prøvede vev. På samme måte kunne intet nærvær av virus påvises ved PCR i de undersøkte prøver, selv under anvendelse av en optimalisert og meget følsom protokoll på 45 forsterkningscykler.

Disse resultater viser effektiviteten for administreirngsmåten ifølge oppfinnelsen for på meget lokal måte å avgi terapeutiske gener.

Eksempel 4:

Arteriell overføring av adenovirusen Ad-RSV-TK.

Dette eksempel viser egenskapene til adénovirus TK som anvendes ifølge oppfinnelsen for behandling av resténose ved selektiv overføring i en ateromatøs arterie.

Dyremodell:

Den arterielle overføringseffektivitet bedømmes i en restenosemodell hos hvite New-Zealand-kaniner. Kaninene ble på forhånd underkastet en kolesterol-rik (1 %) diett i 2 uker. Ilia-arterien ble revet opp ved hjelp av en latex-ballong (4F) ved fem suksessive oppblåsninger. Dyrene ble på ny underkastet en hyperkolesterolemisk diett i 6 uker. Arterie-overføringen ble gjennomført på perkutan måte i henhold til den tidligere beskrevne metode på nivå med den lésérte arterie. Adenovirusen Ad-RSV-TK (4 x IO<9 >pfu i 40 ul fosfatbuffer ble avsatt på et ballong-kateter som på forhånd var behandlet med hydrogel (Hydroplus, Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA) (Riessen et al., "Hum.Gene.Ther." 4 (1993) 749). Det benyttede kateter var et kateter med lengde 2 cm og diameter 2,5 mm.

Basert på en dobbelt-leksjon som følge av avrivning og angioplasti, tillot denne restenose-modell og ikke bare stenose, å bedømme effektiviteten til adénoviral overføring av et drepergen i en ateromatøs arterie.

I lys av de oppnådde forsøksresultater in vitro og for å verifisere selektiviteten ved behandling med Ad-RSV-TK ble dyrene delt i to grupper der den ene gruppe ble underkastet behandling med ganciclovir. Behandlingen med ganciclovir ble forlenget i fem dager (fra den annen til syvende dag efter angioplasti) i en mengde av 2 x 25 mg/kg/dag.

Morfometrisk analyse:

Seks uker efter angioplasti ble dyrene avlivet med pentabarbital, ilia-arteriene ble fiksert og tatt ut med henblikk på morfometrisk analyse. Lysåpningene samt de indre/ytre elastiske grenser ble bedømt efter farving med orcéin/hématoxylin. Til sammen ble 6 blok-ker analyser pr. arterie, derav 4 fra angioplasti-sonen og 2 umiddelbart oppstrøms og nedstrøms denne sone. For hver blokk ble tre naboseksjoner analysert. Kort sagt beregnet man forskjellige parametre som lysdiameter og intima/media-forholdet. Prøvene for hvilke disse konturer ikke kunne bestemmes på grunn av brudd i den indre, elastiske begrensning, eller en trombotisk okklusjon, ble ekskludert.

Den morfometriske analyse påviste et forhøyet forhold intima/media, for kontrollgrup-pen som var underkastet adénoviral overføring ved angioplasti men ikke behandlet med ganciclovir (5,73 +/- 0,81, n = 3). Alvoret ved lesjonen tillot således å bedømme effektiviteten for en behandling med overføring av genet på en patologisk arterie. Videre er, slik det immunohistokjemiske studium viser, lesjonene som induseres i denne dyremodell rike på makrofager men likeledes rike på glattmuskelceller som utgjør det terapeutiske mål for gen-overføringen. Totaliteten av disse resultater understreker betydningen av den benyttede modell som ikke hviler på en enkel endotelial abrasjon på nivå med en sunn arterie og som konsekvent i det minste partielt gjengir patologien hos post-angioplasti-restenose hos mennesker.

Den morfometriske analyse viser at intima:media-forholdet reduseres med 42 %

(p<0,05) i dyregruppen som underkastes behandling med kombinasjonen Ad-RSV-TK/ganciclovir (3,30 +/-1,26, n = 6). Den signifikante reduksjon av denne parameter viser at den lokale overføring av genet TK med rekombinant adénovirus i forbindelse med administrering av ganciclovir, utgjør en lovende terapeutisk vei for preventiv behandling av postangioplasti-restenose.

Claims (21)

1. Anvendelse av en defektiv, rekombinant adénovirus som bærer et drepergen for fremstilling av et farmasøytisk preparat, ment for behandling av resténose ved selektiv over-føring av genet i glattmuskelcellene av den ateromatøse plaque.

2. Anvendelse ifølge krav 1 av et drepergen valgt blant genet av thymidin kinase og genet av cytosin désaminase.

3. Anvendelse ifølge krav 1 av et drepergen i form av genet av thymidin kinase av human herpesvirus (HSV-1 TK).

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav av drepergenet under kontroll av en promoter som tillater dets ekspresjon i de infiserte celler.

5. Anvendelse ifølge krav 4 av en promoter valgt blant virale promotere og fortrinnsvis LTR-RSV- og CMV-promoteren.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav av en adénovirus omfattende rrR'ene, en sekvens som tillater enkapsidering samt drepergenet.

7. Anvendelse ifølge krav 6 av den adénovirus omfattende 1'1'R'ene, en sekvens som tillater enkapsidering, drepergenet og der genet El og minst et av genene E2, E4, L1-L5 er ikke-funksjonelt.

8. Anvendelse ifølge krav 7 av en adénovirus omfattende ITR'ene, en sekvens som tillater enkapsidering, drepergen og der genet El og genet E4 er gjort ikke-funksjonelt.

9. Anvendelse ifølge krav 8 av en adénovirus omfattende ITR'ene, en sekvens som tillater enkapsideringen, drepergenet og der hele eller en del av regionene El og E4 er deletert.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav av en adénovirus av human opprinnelse, fortrinnsvis valgt blant cérotypene Ad2 og Ad5.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 av en adénovirus av animalsk opprinnelse, fortrinnsvis valgt blant canin-adenoviruser.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11 av en adénovirus som er tatt opp i en hydrogel.

13. Anvendelse ifølge krav 12 av en hydrogel avsatt på et ballong-kateter.

14. Anvendelse ifølge krav 10 av en adénovirus for administrering ved hjelp av et ballong-kateter av typen perfusjonskateter.

15. Anvendelse ifølge krav 14 av en adénovirus for administrering ved hjelp av et ballong-kateter av typen kanal-ballong-kateter.

16. Anvendelse ifølge krav 14 av en adénovirus forperfusjon ved hjelp av et kateter av typen perfusjonsballong-kateter, der adenovirusen er tatt opp i en hydrogel.

17. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11 av en adénovirus tatt opp i poloxamer.

18. Anvendelse ifølge krav 14 av adenoviruser for per fusjon ved hjelp av et kateter av typen perfusjonsballong-kateter, med adenovirusen tatt opp i poloxamer.

19. Anvendelse av en defektiv adénovirus inneholdende et drepergen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for lokal administrering ved selektiv overføring av genet i glattmuskelcellen av den ateromatøse plaque for behandling av aterosklerose.

20. Anvendelse ifølge krav 19 av et preparat omfattende en defektiv adénovirus impregnert i en hydrogel eller poloxamer.

21. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 20 for lokaladministrering av et drepergen mot ateromatøs plaque ved bruk av et ballongkateter belagt med en hydrogel der hydrogelen er impregnert med en defektiv, rekombinant adénovirus inneholdende drepergenet.