EP0417152A1 - Neue cyclite aus streptomyceten, ihre herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Neue cyclite aus streptomyceten, ihre herstellung und ihre verwendung

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Publication number
EP0417152A1
EP0417152A1 EP19890906108 EP89906108A EP0417152A1 EP 0417152 A1 EP0417152 A1 EP 0417152A1 EP 19890906108 EP19890906108 EP 19890906108 EP 89906108 A EP89906108 A EP 89906108A EP 0417152 A1 EP0417152 A1 EP 0417152A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dsm
compound
group
nutrient solution
cyclites
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19890906108
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English (en)
French (fr)
Inventor
Susanne Grabley
Joachim Wink
Peter Hammann
Carlo Giani
Klaus HÜTTER
Axel Zeeck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Publication of EP0417152A1 publication Critical patent/EP0417152A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/587—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring
    • C07C49/703—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing hydroxy groups
    • C07C49/713—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing hydroxy groups a keto group being part of a six-membered ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N35/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical
    • A01N35/06—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical containing keto or thioketo groups as part of a ring, e.g. cyclohexanone, quinone; Derivatives thereof, e.g. ketals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/02—Saturated carboxylic acids or thio analogues thereof; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/385—Saturated compounds containing a keto group being part of a ring
    • C07C49/487—Saturated compounds containing a keto group being part of a ring containing hydroxy groups
    • C07C49/497—Saturated compounds containing a keto group being part of a ring containing hydroxy groups a keto group being part of a six-membered ring

Definitions

  • Cyclites are pseudosugars, i.e. Derivatives of saccharides in which the pyranoserine oxygen is replaced by a methylene group. These substances are potential glycosidase ether [H. Paulsen, Liebig's Analen der Chemie, p. 125 (1987)] or glyoxylase inhibitors [T.Takeushi, J. Antibiot. 28: 737 (1975)]. These substances are essentially synthesized by Streptomycetes in nature.
  • the invention thus relates to:
  • R 1 can be an oxo group or a hydroxy group
  • R 2 can be a methyl group or an acetoxymethyl group
  • R 3 and R 4 can be hydrogen or together a double bond
  • R 5 can be an oxo group or a hydroxyl group, except for the compounds in which
  • R 1 is an oxo group
  • R 2 is a methyl group
  • R 3 and R 4 are hydrogen and
  • the compound of general formula I is produced by different St reptomycete strains, which were deposited with the German Collection of Microorganisms with the numbers DSM 4351, DSM 4354 and DSM 4353 under the conditions of the Budapest Treaty.
  • Streptomyces DSM 4351 synthesizes the compound of the formula
  • R 1 is an oxo group
  • R 2 is a methyl group
  • R 3 and
  • R 4 together are a double bond and R 5 is a hydroxy group.
  • Streptomyces DSM 4354 produces the compound of the formula I in which R 1 is a hydroxyl group, R 2 is a methyl group or an acetoxymethyl group, R 3 and R 4 are together a double bond and R 5 is an oxo group.
  • Streptomyces DSM 4353 produces the compound of formula I in which R 1 is an oxo group, R 2 is a methyl group, R 3 and
  • R 4 is hydrogen and R 5 is a hydroxy group.
  • mutants and variants can also be used, provided they synthesize the compound of the general formula I.
  • Such mutants can be known in a manner known per se by physical means, for example radiation, such as with ultraviolet or X-rays, or chemical mutagens, for example ethyl methanesulfonate (EMS), N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine (MNNG) or 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone (MOB) can be generated.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine
  • MOB 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone
  • the nutrient solution can contain, for example, chlorides, carbonates, sulfates or phosphates of the alkali or alkaline earth metals, iron, zinc and manganese as additional inorganic salts.
  • the formation of the compound of general formula I proceeds particularly well in a nutrient solution, the oatmeal in concentrations of 0.5 to 6%. preferably 2 to 4%, soy flour in concentrations of 0.1 to 4%, preferably 0.5 to 2%. and contains trace elements, each based on the weight of the entire nutrient solution.
  • the fermentation is carried out aerobically, for example submerged with shaking or stirring in shake flasks or fermenters, optionally with the introduction of air or oxygen.
  • the fermentation can take place in a temperature range from about 18 to 40 ° C., preferably at about 25 to 30 ° C., in particular at 28 to 30 ° C.
  • the microorganism is cultivated under the conditions mentioned until the stationary phase is reached, about 60 to 120 hours, preferably 70 to 75 hours.
  • Cultivation is advantageously carried out in several stages, ie one or more precultures are first prepared in a liquid nutrient medium, which are then inoculated into the actual production medium, the main culture, for example in a volume ratio of 1:10.
  • the preculture is obtained, for example, by inoculating a spilled mycelium in a nutrient solution and allowing it to grow for about 48 to 72 hours.
  • the exported mycelium can be obtained by using the Let the strain grow on a solid or liquid culture medium, for example yeast-malt agar, for about 7 days.
  • the course of the fermentation can be monitored on the basis of the pH value of the culture or the mycelium volume, by thin-layer chromatography or by testing the biological activity.
  • the cyclites of the general formula I are isolated from the culture medium by known methods, taking into account the chemical, physical and biological properties of the products.
  • the cyclites of the general formula I are present in the mycelium or in the culture broth. They can be extracted from the unfiltered culture broth with an organic solvent which is immiscible or only slightly miscible with water, such as chloroform or ethyl acetate.
  • an organic solvent which is immiscible or only slightly miscible with water, such as chloroform or ethyl acetate.
  • it is advantageous to separate the culture broth from the mycelium for example by centrifuging or filtering, preferably with the addition of
  • the compound of general formula I can then be isolated from the supernatant or filtrate, expediently in the slightly acidic to neutral pH range, preferably at pH 6 to 7.
  • organic solvents which are poorly or immiscible with water, in particular chlorinated hydrocarbon such as chloroform or methylene chloride or esters such as ethyl acetate or acetone.
  • chlorinated hydrocarbon such as chloroform or methylene chloride or esters such as ethyl acetate or acetone.
  • the extracts if appropriate after evaporation and taking up in a polar organic solvent, are freed from strongly lipophilic constituents by precipitation with a non-polar solvent, advantageously a hydrocarbon such as petroleum ether, which can make up to about 80% of the total extract.
  • the cyclites can be isolated from the residue by chromatography.
  • the cyclites can also be obtained from the adsorber resins by adsorption onto commercially available resins Culture broth are isolated. It has also proven advantageous to dry the fermenter content mentioned, for example by spray drying or freeze drying.
  • the cyclites of the general formula I are oily and readily soluble in methanol, acetone, DMSO, dioxane and chloroform, but little in water and not in alkanes.
  • the substances are stable in the solid state and also as a solution in the pH range from 3 to 9, in particular from 5 to 8.
  • the growth-regulating effect can be shown particularly well on dicotyledonous plants such as cress.
  • a) Preparation of a spore suspension of a producer strain 100 ml nutrient solution (4 g yeast extract, 10 g malt extract, 4 g glucose, 1 1 tap water, pH before sterilization 7.3) in a 500 ml Erlenmeyer flask are inoculated with the strain and 72 Incubated for hours at 27 ° C and 120 rpm on the rotating shaker. Subsequently, 20 ml of culture liquid in a 500 ml Erlenmeyer flask with the nutrient medium of the above composition, to which 20 g of agar / 1 was added for solidification, are uniform distributed and decanted. The cultures are incubated at 27 ° C for 10 to 14 days. The spores of a flask formed after this time are washed off with 500 ml of deionized water, which contains a drop of a commercially available nonionic surfactant, used immediately or kept at -22 ° C.
  • a 10 1 fermenter is operated under the following conditions:
  • Ventilation 4 1 air / min.
  • the foam development can be suppressed by repeatedly adding a few drops of ethanolic polyol solution.
  • the yields are approx. 20 mg / 1.
  • the culture broth is filtered with the addition of 2% Celite as a filter aid.
  • the mycelium is extracted with acetone, the organic phase is evaporated and the aqueous residue is extracted with ethyl acetate.
  • the culture filtrate is dried and dissolved in MeOH.
  • the crude product is chromatographed on a silica gel column (silica gel 60, Macherey-Nagel) with ethyl acetate / hexane (1: 2; v: v).

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Description

Beschreibung
Neue Cyclite aus Streptomyceten, ihre Herstellung und ihre Verwendung
Cyclite sind Pseudozucker, d.h. Derivate von Sacchariden, bei denen der Pyranoseringsauerstoff durch eine Methylengruppe ersetzt ist. Diese Stoffe sind potentielle Glycosidaseheramer [H. Paulsen, Liebig's Analen der Chemie, S. 125 (1987)] oder Glyoxylaseinhibitoren [T.Takeushi, J. Antibiot. 28, 737 (1975)]. Diese Stoffe werden in der Natur im wesentlichen von Streptomyceten synthetisiert.
Umezawa et al. beschreiben in The Journal of Antibiotics
[ 27, 579 (197-4)] ein Hydroxymethyltrihydroxycyclohexanon mit einem Drehwert [α]2 D 0 von -168°, das von Streptomyces filiplnensis in das Kulturfiltrat ausgeschieden wird. Eine Verbindung mit der gleichen Strukturformel, allerdings ohne Angabe eines Drehwertes, wird in der japanischen Patentanmeldung Sho-49(=1974)-54587 beschrieben. Dort wird ebenfalls erwähnt, daß diese Verbindung das Pflanzenwachstum beeinflußt.
Keller-Schierlein et al. [Helvetica Chimica Acta 69 , 1829 (1986)7 haben aus Streptomyces albus ein Methyltrihydroxycyclohexanon mit einem Drehwert von [α]2 D 0 = -106° (in Methanol) isoliert, allerdings wurde diesem Produkt keine die physiologische Aktivität von Pflanzen beeinflussende Eigenschaften zugeordnet.
Aus Streptomyceten konnten, wie im folgenden beschrieben, weitere Cyclite mit pharmakologischer und überraschend guter wachstumsregulatorischer Wirkung bei Pflanzen isoliert werden. ie Erfindung betrifft somit:
1. Die Verbindung der allgemeinen Formel I,
in der unabhängig voneinander
R1 eine Oxogruppe oder eine Hydroxygruppe, R2 eine Methylgruppe oder eine Acetoxymethylgruppe, R3 und R4 Wasserstoff oder gemeinsam eine Doppelbindung und R5 eine Oxogruppe oder eine Hydroxygruppe sein können, ausgenommen die Verbindungen, in der
R1 eine Oxogruppe, R2 eine Methylgruppe,
R3 und R4 Wasserstoff und
R5 eine Hydroxygruppe ist und die den Drehwert [α]2 D 0 = -106° (in Methanol, c=0,45) hat.
2. Ein Verfahren zur Herstellung der unter 1 charakterisierten Verbindung der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Stamm der Gattung Streptomyces in einer Nährlösung kultiviert wird bis sich die genannte Verbindung in der Nährlösung anhäuft.
3. Die Verwendung der unter 1 charakterisierten Verbindung der allgemeinen Formel I als wachstumsregulierender Stoff. Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung in den Ansprüchen definiert.
Die Verbindung der allgemeinen Formel I wird von unterschiedlichen St reptomyceten-Stämmen hergestellt, die jeweils bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen mit den Nummern DSM 4351, DSM 4354 und DSM 4353 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt wurden.
Streptomyces DSM 4351 synthetisiert die Verbindung der Formel
I. in der R1 eine Oxogruppe, R2 eine Methylgruppe, R3 und
R4 gemeinsam eine Doppelbindung sowie R5 eine Hydroxygruppe sind.
Streptomyces DSM 4354 stellt die Verbindung der Formel I her, in der R1 eine Hydroxygruppe, R2 eine Methylgruppe oder eine Acetoxymethylgruppe, R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung sowie R5 eine Oxogruppe sind.
Streptomyces DSM 4353 produziert die Verbindung der Formel I, in der R1 eine Oxogruppe, R2 eine Methylgruppe, R3 und
R4 Wasserstoff sowie R5 eine Hydroxygruppe sind.
Die erfindungsgemäß verwendeten Streptomyceten-Stämme können wie folgt charakterisiert werden:
DSM 4351 DSM 4354 DSM 4353
Sporenfarbe: Grau Grau Grau Sporenkette: gerade bis gerade bis enge Spirale gewellt gewellt
Sporenoberfläche: glatt glatt glatt Melanin: + + + Pigmentbildung :
Substratmycel: Endo: - - -
Exo: - - - Luftmycel: Endo - - -
Exo: - - - Zucker- und Zuckeralkoholverwertung: Arabinose,
Xylose,
Rhamnose,
Raffinose,
Mannit,
Inositol,
Fructose,
Saccharose
Anstelle der genannten Stämme können auch jeweils deren Mutanten und Varianten eingesetzt werden, sofern sie die Verbindung der allgemeinen Formel I synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'- nitro-N-nitroso-guanidin (MNNG) oder 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon (MOB) erzeugt werden.
Als bevorzugte Kohlenstoffquelle für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glucose, Lactose oder Mannit, sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt. Als bevorzugte stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der
Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Außerdem kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink und Mangan als zusätzliche anorganische Salze enthalten.
Die Bildung der Verbindung der allgemeinen Formel I verläuft besondes gut in einer Nährlösung, die Haferflocken in Konzentrationen von 0,5 bis 6 % . bevorzugt 2 bis 4 % , Sojamehl in Konzentrationen von 0,1 bis 4 % , bevorzugt 0,5 bis 2 % . sowie Spurenelemente enthält, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.
Die Fermentation erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann in einem Temperaturbereich von etwa 18 bis 40°C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 30°C, insbesondere bei 28 bis 30°C erfolgen. Man kultiviert den Mikroorganismus unter den genannten Bedingungen bis die stationäre Phase erreicht ist, etwa 60 bis 120 Stunden, bevorzugt 70 bis 75 Stunden.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1:10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispielsweise, indem man ein versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 48 bis 72 Stunden wachsen läßt. Das versporte Mycel kann erhalten werden, indem man den Stamm etwa 7 Tage auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar, wachsen läßt.
Der Fermentationsverlauf kann anhand des pH-Wertes der Kultur oder des Mycelvolumens, durch Dünnschichtchromatographie oder Ausprüfen der biologischen Aktivität überwacht werden.
Die Isolierung der Cyclite der allgemeinen Formel I aus dem Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Die Cyclite der allgemeinen Formel I liegen im Mycel bzw. in der Kulturbrühe vor. Sie können aus der unfiltrierten Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren organischen Lösemittel, wie Chloroform oder Ethylacetat, extrahiert werden. Da sie sich jedoch nur zu einem geringen Teil im Mycel befinden, ist es vorteilhaft, die Kulturbrühe vom Mycel zu trennen, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren, vorzugsweise unter Zugabe von
Filterhilfsmitteln. Die Verbindung der allgemeinen Formel I kann dann aus dem Überstand bzw. Filtrat isoliert werden, zweckmäßig im leicht sauren bis neutralen pH-Bereich, vorzugsweise bei pH 6 bis 7. Dazu kann man mit Wasser wenig oder nicht mischbare organische Lösemittel verwenden, insbesondere chlorierte Kohlenwasserstoff, wie Chloroform oder Methylenchlorid oder Ester wie Ethylacetat oder Aceton. Die Extrakte werden, gegebenenfalls nach Eindampfen und Aufnehmen in einem polaren organischen Lösemittel, durch Fällen mit einem unpolaren Lösemittel, zweckmäßig einem Kohlenwasserstoff wie Petrolether, von stark lipophilen Bestandteilen befreit, die bis zu etwa 80 % des Gesamtextraktes ausmachen können. Aus dem Rückstand können die Cyclite durch Chromatographie isoliert werden.
Anstelle einer Extraktion können die Cyclite auch durch Adsorption an handelsüblichen Adsorberharzen aus der Kulturbrühe isoliert werden. Es hat sich ebenfalls als günstig erwiesen, den genannten Fermenterinhalt zu trocknen, beispielsweise durch Sprühtrocknen oder Gefriertrocknen.
Zur Isolierung der reinen Cyclite können die üblichen Verfahrensschritte Verwendung finden, wie Chromatographie, Gelfiltration oder Fällung aus ihren Lösungen in geeigneten organischen Lösemitteln. Besonders bewährt hat sich eine Chromatographie an Kieselgel, wobei als Laufmittel eine Mischung aus Essigester und Hexan in einem Volumenverhältnis von beispielsweise 1:2 Verwendung findet.
Die Cyclite der allgemeinen Formel I sind ölig und gut in Methanol, Aceton, DMSO, Dioxan und Chloroform löslich, jedoch wenig in Wasser und nicht in Alkanen. Die Substanzen sind im festen Zustand wie auch als Lösung im pH-Bereich von 3 bis 9, insbesondere von 5 bis 8, stabil. Die wachstumsregulierende Wirkung kann besonders gut an zweikeimblättrigen Pflanzen wie Kresse gezeigt werden.
Beispiele:
1. Fermentation der Produzentenstämme DSM 4351, DSM 4354 und DSM 4353
a) Herstellung einer Sporensuspension eines Produzentenstammes: 100 ml Nährlösung (4 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt, 4 g Glucose, 1 1 Leitungswasser, pH-Wert vor dem Sterilisieren 7,3) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm beimpft und 72 Stunden bei 27°C und 120 UpM auf der rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden der oben genannten Zusammensetzung, dem 20 g Agar/1 zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 14 Tage bei 27°C inkubiert. Die nach dieser Zeit entstandenen Sporen eines Kolbens werden mit 500 ml entionisiertem Wasser, das einen Tropfen eines handelsüblichen nichtionischen Tensids enthält, abgeschwemmt, sofort weiterverwendet oder bei -22°C aufbewahrt.
b) Herstellung einer Kultur bzw. Vorkultur eines Produzentenstammen im Erlenmeyerkolben:
Ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2 % Fleischmehl, 10 % Malzextrakt, 1 % Calciumcarbonat und Wasser ad 100 % (pH 7.2 vor dem Autoklavieren) wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gezogenen Kultur oder mit 0,2 ml Sporensuspension angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 120 UpM und 27°C inkubiert. Die maximale Produktion des gewünschten Stoffes ist nach 72 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 und 100 1 Fermentern genügt eine 48 Stunden alte Submerskultur (5 % ) aus der gleichen Nährlösung.
c) Herstellung der Cyclite:
Ein 10 1 Fermenter wird unter folgenden Bedingungen betrieben:
Nährmedium: 2 % Haferflocken
0,5 % Sojamehl 0,25 % Spurenelemente
Spurenelemente: 3 g/1 CaCl.2H2O
1 g/1 FeC6O7H
0,2 g/1 MnSO4
0,1 g/1 ZnCl2
0,025 g/1 CuSO4.5H2O
0,02 g/1 Na2B4O7.10H2O
0,004 g/1 CoCl2
0,01 g/1 Na2MoO4.2H2O
pH 7,2 Inkubationszeit: 72 Stunden
Inkubationstemperatur: 30°C
Rührergeschwindigkeit : 250 UpM
Belüftung: 4 1 Luft/Min.
Durch wiederholte Zugabe weniger Tropfen ethanolischer Polyollösung kann die Schaumentwicklung unterdrückt werden, Das Produktionsmaximum wird nach ca. 70 Stunden (pH = 5,3) erreicht. Die Ausbeuten liegen bei ca. 20 mg/1.
2. Isolierung der Cyclite
Nach der Fermentation der Produzentenstämme wird die Kulturbrühe unter Zusatz von 2 % Celite als Filterhilfsmittel filtriert. Das Mycel wird mit Aceton extrahiert, die organische Phase eingedampft und der wäßrige Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Kulturfiltrat wird getrocknet und in MeOH gelöst. Das Rohprodukt wird an einer Kieselgelsäule (Kieselgel 60, Macherey-Nagel) mit Essigester/Hexan (1:2; v:v) chromatographiert.
3. Charakterisierung der Cyclite
a) Charakterisierung der Verbindung:
Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60, F254
- Chloroform-Methanol (9:l;v:v): Rf 0,30
- n-Butanol-Essigsäure-Wasser, obere Phase (4:1:5; v:v:v) Rf 0,47
EI-MS (70 eV): m/e = 160 (M+2H); 140 (M-H2O) entsprechend C7H10O4 (158.16) IR (KBr): 3200-3600, 1715, 1680, 1640 cm-1
UV (Methanol): λmax (log ε) = 242 (3,47) nm 1H-NMR (200 MHz, d6-DSMO): δ = 1,70 (t, 3H, J ≈ 1 Hz, 2-CH3); 3,71 (ddd, 1H, J = 8,0/4,5/~5 Hz, 4-H); 4,23 (dd, 1H, J = 8,0/5,0 Hz); 4,34 (breit, 1H); 4,91 (d, 1H, J ≈ 4 Hz, tauscht aus, OH); 5,04 (d, 1H, J ≈ 5 Hz, tauscht aus, 4-OH); 5,37 (d, 1H, J ≈ 5,0 Hz, tauscht aus, OH); 6,65 (d, breit, 1H, J = 4,5 Hz, 3-H) ppm.
13C-NMR (50,3 MHz, d6-DMSO): δ = 14,8 q (2-CH3); 67,6 d; 75,3 d; 76,4 d; 131,8 s (C-2); 145,3 d (C-3); 199,1 s (C-1) ppm.
[ a] 2 D 0 (c=1, Methanol) -132°
Charakterisierung der Verbindung
Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60, F254
- Chloroform-Methanol (9:1, v:v): Rf 0,30
- n-Butanol-Essigsäure-Wasser, obere Phase (4:1:5; v:v:v): Rf 0,50
EI-MS (70 eV): m/e = 160 (M+, 9 % ) ; 124 (11 %) ; 100 (6 % ) , 88 (36 % ) ; 87 (57 % ) ; 73 (100 % ) entsprechend C7H12O4 (160,17)
IR (Film): 3200-3500, 1720 cm-1 1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 1,03 (d, 3H, J = 6,5 Hz, 2-CH3); 1,42 (dt, 1H, J = 13,8/13,7/2,2 Hz, 3-Ha); 2,12 (ddd, 1H, J = 13,8/5,7/3,7 Hz, 3-Hb); 2,93 (ddq, 1H, J = 13,7/6,5/5,7 Hz, 2-H); 3,48 (dd, 1H, J = 10/3 Hz, 5-H); 4,12 (ddd, 1H, J = 3/3/3 Hz, 4-H); 4,43 (d, 1H, J = 10 Hz, 6-H) ppm.
13C-NMR (50,3 MHz, CDC13): δ = 13,2 q (CH3); 36,4 t (C-3); 36,7 d (C-2); 68,3 d; 77,1 d; 78,2 d; 210,5 s (C-1) ppm.
[α]2 D 0 (c=0.497, Methanol) + 93º
Charakterisierung der Verbindung
Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60, F254
- Chloroform-Methanol (9:1, v:v): Rf 0,22
- n-Butanol-Essigsäure-Wasser, obere Phase (4:1:5; v:v:v): Rf 0,64
EI-MS (70 eV): m/e = 156 (C7H8O4, M+-C2H2O-H2O); 138 (22 %); 96 (66 %); 68 (36 %); 43 (100 %).
IR (Film): 3360, 2920, 2850, 1735, 1680 cm-1
1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 2,15 (s, 3H, 9-H3); 3,67 (dd, 1H, J = 8,4/11 Hz, 5-H); 4,08 (d, 1H, J = 11 Hz); 4,45 (d, breit, 1H, J = 8,4/1 Hz); 4,98 (m, 2H, 7-H2); 6,04 (dd, 1H, J = 1,8/1 Hz, 2-H) ppm.
13 C-NMR (50,3 MHz, CD3OD): δ = 20,6 q; 63,7 t; 73,4 d; 78,0 d; 79,3 d; 122,5 d; 161,5 s; 172,0 s; 199,2 s ppm. [α]20 (c=1, Methanol) -34º D
Charakterisierung der Verbindung
Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60 F254
- Chloroform-Methanol (9:1, v:v): Rf 0,17
- n-Butanol-Essigsäure-Wasser, obere Phase (4:1:5; v:v:v) Rf 0,54
EI-MS (70 eV): m/e = 140 (C7H8O3, M-H2O); 98 (100 % ).
IR (Film): 3460, 2930, 2850, 1670 cm-1
1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 2,09 (s, breit, 3H, CH3); 3,58 (dd, 1H, J = 11,2/8,8 Hz, 5-H); 4,01 (d, 1H, J = 11,2 Hz); 4,25 (d, 1H, J = 8,8 Hz); 5,96 (s, breit, 1H, 2-H) ppm
13C-NMR (50,3 MHz, CD3OD): δ = 20,1 q; 75,2 d; 78,1 d; 79,2 d; 125,7 d; 165,7 s; 199,4 s ppm.
[α]2 D 0 (c=1, Methanol) -48°

Claims

Patentansprüche :
1 . Ve rbindung de r allgemeinen Formel I ,
in der unabhängig voneinander
R1 eine Oxogruppe oder eine Hydroxygruppe, R2 eine Methylgruppe oder eine Acetoxymethylgruppe, R3 und R4 Wasserstoff oder gemeinsam eine Doppelbindung und
R5 eine Oxogruppe oder eine Hydroxygruppe sind, ausgenommen die Verbindung, in der
R1 eine Oxogruppe, R2 eine Methylgruppe, R3 und R4 Wasserstoff und
R5 eine Hydroxygruppe ist und die den Drehwert [α]20 -106° D
(Methanol, c=0,45) hat.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Streptomycetenstämme
DSM 4351, DSM 4354 und DSM 4353 kultiviert werden bis sich die genannte Verbindung in der Nährlösung anhäuft.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung Haferflocken in Konzentrationen von 0,5 bis 6 % und Sojamehl in Konzentrationen von 0,1 bis 4 % , jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung, enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung 2 bis 4 % Haferflocken und 0,5 bis 2 % Sojamehl enthält.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einem Temperaturbereich von 18 bis 40°C erfolgt.
6. Die Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 als wachstumsregulierender Stoff.
7. Streptomyces DSM 4351, DSM 4354 und DSM 4353 sowie deren Mutanten und Varianten, sofern sie die Verbindung nach Anspruch 1 produzieren.
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