EP0375722A1 - Procede d'obtention par voie chimique d'oligonucleotides marques et applications biologiques - Google Patents

Procede d'obtention par voie chimique d'oligonucleotides marques et applications biologiques

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Publication number
EP0375722A1
EP0375722A1 EP19880907715 EP88907715A EP0375722A1 EP 0375722 A1 EP0375722 A1 EP 0375722A1 EP 19880907715 EP19880907715 EP 19880907715 EP 88907715 A EP88907715 A EP 88907715A EP 0375722 A1 EP0375722 A1 EP 0375722A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
marker
oligonucleotides
substitution
cytosine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19880907715
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Tam Huynh Dinh
Sophie Le Brun
Jean Igolen
Nathalie Duchange
Mario Zakin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of EP0375722A1 publication Critical patent/EP0375722A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • BIOLOGICAL BRANDS AND APPLICATIONS BIOLOGICAL BRANDS AND APPLICATIONS.
  • the subject of the invention is a process for the chemical synthesis of labeled oligonucleotides and the biological applications of these oligonucleotides as cold probes.
  • kits for the enzymatic labeling of oligonucleotide probes with biotinylated triphosphate nucleotides are already marketed.
  • the detection of such biotinylated probes is done by enzymatic systems, such as peroxidase, alkaline phosphatase, or galactosidase, or colorimetric systems by fluorescence or chemiluminescence, coupled to streptavidin, protein of very high affinity for biotin.
  • the object of the invention is therefore to provide a process for obtaining oligonucleotides by chemical synthesis, allowing the incorporation of labeled motifs at one or more sites and this, in a determined manner.
  • motifs can be both nucleosides and nucleotides, and may include ribose and / or 2-deoxy-ribose as sugar.
  • the chemical synthesis method according to the invention is characterized by the following stages: - during the solid phase chemical synthesis of the oligonucleotide sequence to be constructed, there is incorporated in the place of one or more cytosines provided on the sequence , respectively one or more thymines whose position 4 is substituted by an activating group, the oligonucleotide sequence constructed is reacted with a compound of formula RAR 'in which R and R', are identical and represent a group -NH 2 , -SH or -OH, or R and R 'are different, one representing a group -NH 2 , SH or -OH, the other one group -NH-X, SX or -OX, in which X is a group capable of serving as a marker for the molecule; and
  • A represents an alkyl chain of approximately 4 to 20 carbon atoms, optionally comprising heteroatoms, such as 0, N or S; which leads to obtaining methyl-5-cytosine (s) with a substitution chain in position 4, instead of the activated thymine (s), and when the compound RAR 'does not contain a marker group, the following are introduced a marker group on the methyl-cytosine substitution chain.
  • the synthesis method according to the invention also has the advantage of leading to oligonucleotides in which the 5 'OH and 3' OH ends remain free. It is thus possible, for example, to insert them into biological vectors.
  • the step of incorporating thymine motifs activated at position 4 is carried out during the construction of the oligonucleotide sequence.
  • This sequence is constructed by successively coupling, from a first nucleotide, or nucleoside, attached to a solid support, the motifs of the sequence sought and by replacing, as desired, a cytosine motif with a thymine motif activated in position 4.
  • solid support covers any support which may remain insoluble in at least one specific medium capable of containing nucleic acids in solution.
  • supports can be used. These are, for example, organic polymers of silica or glass beads. These supports are advantageously treated beforehand (functionalization) in order to give them functional groups capable of being brought into play in a reaction for fixing a separate molecule, either directly or via an arm.
  • Such supports are commercially available. These are, for example, polyacrylmorpholide type gels, for example those sold under the designation "ENZACRYL K-2". Polyacrylamides, polystyrenes or cellulose will also be mentioned.
  • the coupling of nucleosides, or nucleotides is carried out pattern by pattern, or by groups of nucleotides.
  • For the constitution of the sequence use is advantageously made of known methods of extending nucleotide chains in solid phase, in particular the so-called phosphotriesters or phophoramidite methods. Techniques of this type are described for example in the Bibliographical references (1) to (6), given at the end of the description.
  • the condensation is carried out in the presence of a coupling agent, preferably used in excess.
  • the study of coupling yields shows that the condensation of activated thymidine units is not accompanied by a significant drop in the latter.
  • the activation of position 4 of the thymine comprises the fixing, on this vertex, of a heterocyclic derivative of the triazole, nitro-triazole or tetrazole, imidazole type.
  • a preferred activating group which makes it easy to have an activated thymine as desired, consists of the 1,2,4-triazolyl group. Its fixation on thymine is carried out by operating, for example, according to one of the techniques described in (7), (8) or (9).
  • the synthesized oligonucleotide sequence which contains, at the desired site (s), an activated thymine motif, is reacted with a compound of formula R-A-R '.
  • a bifunctional compound such as a diaminoalkane, a glycol or an ⁇ , ⁇ -aminoalcohol is used.
  • Suitable diaminoalkanes include ethylene diamine, diamino 1-6 hexane, diamino 1-10 decane or spermine.
  • the substitution of activated thymines with a diaminoalkane is carried out in an organic solvent such as pyridine, preferably with an excess of amine.
  • oligonucleotide sequences obtained, containing the substituted methyl-cytosine units are unhooked from the support on which they were fixed during their construction and are unlocked.
  • conventional methods of elimination are used protecting groups for bases and for phosphates used in solid phase synthesis.
  • the phosphate groups are more specifically unblocked using for example TMGPAO, then concentrated ammonia. Operating at room temperature, the TMGPAO is left to act for approximately 14 hours. The action of concentrated ammonia is advantageously carried out at a temperature above ambient, preferably of the order of 50 ° C. for approximately 2 to 7 hours, in particular approximately 5 hours.
  • the DNA fragments are then purified by passage through one or more ion exchange columns, then deprotected, for example using acetic acid and, preferably, again purified.
  • substitution chain does not contain a marker group
  • the oligonucleotide sequence, comprising the methylcytosine motif (s) substituted by a chain in position 4 is reacted with a group capable of serving as a marker for the molecule.
  • peptides usually used, mention will be made of peptides, haptens, colored or fluorescent groups such as rhodamine, fluorescein or dansyl, or even enzymes such as phosphatase or peroxidase.
  • Preferred markers are constituted by peptides, and are coupled with oligonucleotides comprising amino-terminated substitution chains.
  • Biotin is more especially used in activated form, for example in the form of a biotinyl-N-hydroxysuccinimide ester.
  • the biotinylation of amino oligonucleotides is preferably carried out by subjecting these oligonucleotides, in basic medium, to the action of biotin under activated form, in an organic solvent of the DMF type.
  • the oligonucleotides are thus more especially in solution in a buffer of pH from 8 to 10 approximately, preferably 9.
  • the reaction is advantageously carried out with an excess of activated biotin.
  • the oligonucleotide concentration is in a ratio of approximately 10 -3 / 1 relative to that of the activated biotin.
  • the reaction temperature does not exceed the ambient and can vary from approximately 0oC to 25oC. satisfactory results are obtained by maintaining the reaction mixture for 3 to 8 hours, preferably approximately 6 hours, at a temperature close to ambient, then from 8 to 20 hours, preferably approximately from 12 to 14 hours at a temperature close to from 0oC.
  • the labeled DNA fragments obtained according to the invention are purified for their biological applications.
  • the elimination of the salts formed during the synthesis is advantageously carried out using one or more columns of ion exchange resins or of Sephadex or Biogel.
  • DMTr T thymidine protected in 5 'by a group dimethoxytrityl and substituted in 3 'with a group of formula TPSNT: triisopropyl -2,4,6 benzene sulfonyl-3-nitro triazole -1,2,4, TMGPAO: pyridine-aldoximate-tetramethyl guanidine
  • DCCI dicyclohexyl carbodiimide
  • DCU dicyclohexyl urea
  • BNHS biotinyl N hydroxysuccinimide
  • TEAB triethyl bicarbonate 1:
  • Biot biotinyl
  • B (NH - (CH 2 ) 10 -NH-Biot) in position 4 of C *
  • This synthesis includes three stages:
  • a polyacrylamide type resin such as that sold under the brand Enzacryl K 2 is used as support, the thymidine substitution rate being 130 ⁇ mol per gram of support.
  • the rate of substitution of the support is evaluated by assaying in UV at 507 nm of the DMT cation released by acid treatment (2% benzene sulfonic acid) in a mixture.
  • CH 2 Cl 2 / CH 3 OH 70-30.
  • the nucleoside DMTr CA (6 eq) is âecyanoethylated with a mixture of triethylamine-pyridine-H 2 O: 1-3-1 (TPE) for 20 minutes, then activated with 18 eq. of TPSNT and coupled to the 5'OH function of the thymidine attached to the support.
  • the coupling yield was evaluated by UV dosage at 507 nm of the DMT cation released by treatment with benzene sulfonic acid. It is 100% for this first coupling.
  • the reaction medium is stored at room temperature for at least 2 days.
  • the resin is then wrung and then rinsed with pyridine to remove any trace of remaining diamine.
  • the amino sequences are then detached from the support and released by the conventional methods used in solid phase synthesis.
  • the oligonucleotides are released by adding 1.1 ml (1.1 mmol) of a solution of 1 M TMGPAO in a water-dioxane mixture: 1/1.
  • TMGPAO 1.1 mmol
  • the resin is then filtered, rinsed and the juice is concentrated and then deposited on a column of Dowex NH 4 + ® resin eluted with H 2 O.
  • the product is lyophilized, then purified at the DMTr stage by HPLC on a preparative Nucleosil ® column with a gradient from 5 to 25% or from 5 to 50% acetonitrile in a buffer of 10 M triethyl ammonium acetate in 20 minutes.
  • sequences are detritylated in 80% acetic acid in H 2 O for 20 minutes at room temperature.
  • the acid is then evaporated and then entrained by 2 or 3 co-evaporations with toluene.
  • the reaction medium is in the form of a white suspension which is heated for half an hour at 50 ° C. and then kept for 20 hours with stirring at room temperature.
  • the precipitate of dicyclohexyl urea formed is filtered and the filtrate is stored for approximately 14 hours at 0 ° C.
  • the insoluble part of DCU formed is then filtered and the filtrate is concentrated.
  • BNHS is recrystallized from a large volume of isopropanol.
  • the probes are then purified by HPLC on an analytical or preparative Nucleosil ® column.
  • the oligonucleotides are exchanged in ammonium form on a Dowex column
  • Analytical nucleosil ® Analytical nucleosil ® .
  • Probes 2 and 3 are prepared by operating as indicated above.
  • Example 3 Disclosure of Dot Blots of biotinylated probes.
  • the probes are deposited at different concentrations (from 100 pmol to 0.5 fmol) on nitrocellulose and then fixed by passage in the oven at 80oC for 1 hour.
  • the filters are blocked with bovine serum albumin.
  • the first detection kit marketed 1 follows a 3-step protocol:
  • Amplified signals can be obtained thanks to the property of streptavidin to bind 4 molecules of biotin.
  • the second kit 2 is done in two stages:
  • Amounts of 50 fmol of DNA from biotinylated probes deposited on nitrocellulose have been revealed. Hybridization of the probes with DNA immobilized on nitrocellulose.
  • nitrocellulose filters Preparation of nitrocellulose filters.
  • the method of the invention makes it possible to obtain, by chemical means, oligonucleotides which can be used as probes for detecting complementary sequences of nucleic acids.
  • the detection limit with the streptavidin-alkaline phosphatase kit is around 15 fentomoles.
  • These probes are also of great interest for the separation of a complementary polynucleotide contained in a solution brought into contact with this supported molecule, the detection or separation being carried out under conditions allowing their mutual hybridization. Thanks to the formation of a double strand on the support, it is also possible to purify proteins giving rise to an interaction with a DNA fragment.
  • the inventors have found that when the marker group is introduced on the 5 'side, a duplex which is more stable to hybridization is obtained than when this group is on the 3' side.

Landscapes

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Abstract

Le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'on incorpore des thymidines activées en position 4, à la place de cytidines, dans une séquence d'oligonucléotides en cours de construction, qu'on fait réagir la séquence formée avec un composé bifonctionnel, puis qu'on fixe un marqueur sur la fonction restée libre.

Description

PROCEDE D'OBTENTION PAR VOIE CHIMIQUE D'OLIGONUCLEOTIDES
MARQUES ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES.
L'invention a pour objet un procédé de synthèse chimique d'oligonucléotides marqués et les applications biologiques de ces oligonucléotides comme sondes froides.
Elle vise plus spécialement la synthèse de fragments d'ADN, complémentaires de fragments d'ADN ou d'ARN de séquences connues, utilisables commme sondes d'hybridation, Pendant de nombreuses années, on a utilisé, pour la détection de séquences de gènes, des sondes marquées avec des radioisotopes, appelées sondes chaudes. Or si l'autoradiographie constitue une méthode assez sensible, cette technique s'avère longue, coûteuse et présente les défauts et les risques liés à la manipulation de produits radioactifs.
Au cours de ces cinq dernières années, on a vu se développer un intérêt croissant pour la recherche de méthodes de détection de séquences d'acides nucléiques mettant en jeu des sondes, dites sondes froides, ne comportant pas d'éléments radioactifs.
Ainsi, plusieurs kits de marquage enzymatique des sondes oligonucléotidiques par des nucléotides triphosphates biotinylés sont déjà commercialisés. La détection de telles sondes biotinylées se fait par des systèmes enzymatiques, tels que la peroxidase, la phosphatase alcaline, ou la galactosidase, ou des systèmes colorimétriques par fluorescence ou chimioluminescence, couplés à de la streptavidine, protéine de très forte affinité pour la biotine.
On conçoit l'intérêt de disposer, pour assurer des détections de grande sensibilité, de sondes de compositions définies, marquées de manière contrôlée, en des sites déterminés. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à développer une stratégie permettant d'améliorer la synthèse de sondes froides. Cette stratégie est basée sur l'incorporation, au cours de la construction de la séquence oligonucléotidique, de nucléosides modifiés, à la place des bases classiques dans la séquence. Les bases modifiées permettent alors d'introduire des chaînes de substitution sur lesquelles seront fixés les marqueurs, tout en gardant les mêmes possibilités de liaison hydrogène que les bases usuelles.
L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'obtention d'oligonucléotides par synthèse chimique, permettant l'incorporation de motifs marqués en un ou plusieurs sites et ce, de façon déterminée.
Dans la description et dans les revendications, les motifs de la séquence faisant l'objet du procédé de synthèse seront identifiés en désignant leur base.
Ces motifs peuvent être aussi bien des nucléosides que des nucléotides, et comporter comme sucre un ribose et/ou un déoxy-2 ribose.
D'une manière générale, il est fait référence à la synthèse d'oligodésoxynucléotides mais il va de soi que le procédé de l'invention couvre également la synthèse des oligoribonucléotides correspondants.
Le procédé de synthèse par voie chimique selon l'invention est caractérisé par les étapes suivantes : - on incorpore, lors de la synthèse chimique en phase solide de la séquence oligonucléotidique à construire, à la place d'une ou plusieurs cytosines prévues sur la séquence, respectivement une ou plusieurs thymines dont la position 4 est substituée par un groupe activateur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique construite avec un composé de formule R-A-R' dans laquelle R et R', sont identiques et représentent un groupe -NH2, -SH ou -OH, ou R et R' sont différents, l'un représentant un groupe -NH2, SH ou -OH, l'autre un groupe -NH-X, S-X ou -O-X, dans lequel X est un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule ; et
A représente une chaîne alcoyle de 4 à 20 atomes de carbone environ, comportant le cas échéant des hétéroatomes, tels que 0, N ou S ; ce qui conduit à l'obtention de méthyl-5-cytosine(s) avec une chaîne de substitution en position 4, à la place de la ou des thymines activées, et lorsque le composé R-A-R' ne renferme pas de groupe marqueur, on introduit un groupement marqueur sur la chaîne de substitution des méthyl-cytosines.
On observera que le remplacement d'une cytidine par une thymidine activée permet de mettre en place, dans la séquence en construction, le motif destiné à être marqué. Les produits obtenus sont donc parfaite- ment définis en ce qui concerne leur structure et leurs substitutions et ce, contrairement aux oligonucléotides marqués obtenus par les synthèses enzymatiques classiques dans lesquels les nucléotides sont incorporés de façon non contrôlable à partir d'un primer. De plus, le motif incorporé peut être substitué avec une grande souplesse par des chaînes de structures variées, ce qui permet de fixer divers marqueurs et d'obtenir à partir d'une seule séquence activée plusieurs sondes comportant des chaînes différentes ou des marqueurs différents.
Le procédé de synthèse selon l'invention présente également l'intérêt de conduire à des oligonucléotides dans lesquels les extrémités 5' OH et 3' OH restent libres. Il est ainsi possible, par exemple, de les insérer dans des vecteurs biologiques.
Un autre avantage de ce procédé réside dans la possibilité de son automatisation permettant une construction rapide, à faible coût, de grandes quantités de fragments d'ADN. L'étape d'incorporation des motifs thymine activés en position 4 est effectuée au cours de la construction de la séquence oligonucléotidique. Cette séquence est construite en couplant successivement, à partir d'un premier nucléotide, ou nucléoside, fixé sur un support solide, les motifs de la séquence recherchée et en remplaçant, comme souhaité, un motif cytosine par un motif thymine activé en position 4.
L'expression "support solide" recouvre tout support qui peut rester insoluble dans au moins un milieu déterminé susceptible de contenir des acides nucléiques en solution. De nombreux supports peuvent être utilisés. Il s'agit par exemple de polymères organiques de silice ou de billes de verre. Ces supports sont avantageusement traités au préalable (fonctionnalisation) afin de leur conférer des groupements fonctionnels susceptibles d'être mis en jeu dans une réaction de fixation d'une molécule distincte, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras. Des supports de ce type sont disponibles dans le commerce. Il s'agit par exemple des gels de type polyâcrylmorpholide, par exemple ceux commercialisés sous la désignation "ENZACRYL K-2". On citera également les polyacrylamides, polystyrènes ou cellulose.
Le couplage des nucléosides, ou des nucléotides, est effectué motif par motif, ou par groupes de nucléotides. Pour la constitution de la séquence, on a avantageusement recours aux méthodes connues d'allongement de chaînes de nucléotides en phase solide, en particulier les méthodes dites aux phosphotriesters ou aux phophoramidites. Des techniques de ce type sont décrites par exemple dans les références bibliographiques (1) à (6), données en fin de description. La condensation est effectuée en présence d'un agent de couplage, de préférence utilisé en excès. L'étude des rendements de couplage montre que la condensation de motifs thymidine activés ne s'accompagne pas d'une baisse sigificative de ces derniers. L'activation de la position 4 de la thymine comprend la fixation, sur ce sommet, d'un dérivé hétérocyclique du type triazole, nitro-triazole ou tétrazole, imidazole. Un groupe activateur préféré, permettant de disposer aisément d'une thymine activée comme souhaité, est constitué par le groupe 1,2,4-triazolyle. Sa fixation sur la thymine est réalisée en opérant, par exemple, selon l'une des techiques décrites dans (7), (8) ou (9).
D ' autres modes d'activation du sommet 4 des thymines peuvent être utilisés, par exemple à l'aide d'un chlorure d'acide, selon les techniques décrites dans (10) et (11).
Dans la deuxième étape du procédé de l'invention, on fait réagir la séquence oligonucléotidique synthétisée, qui renferme, au(x) site(s) souhaité(s), un motif thymine activé, avec un composé de formule R-A-R'. On utilise avantageusement un composé bifonctionnel tel qu'un diaminoalcane, un glycol ou un α, ω-aminoalcool. Des diaminoalcanes appropriés comprennent l'éthylène-diamine, le diamino 1-6 hexane, le diamino 1-10 décane ou la spermine.
La substitution des thymines activées par un diaminoalcane est réalisée dans un solvant organique tel que la pyridine, de préférence avec un excès d'aminé.
Les séquences oligonucléotidiques obtenues, renfermant les motifs méthyl-cytosine substitués sont décrochées du support sur lequel elles étaient fixées durant leur construction et sont débloquées. On utilise avantageusement les méthodes classiques d'élimination des groupes protecteurs des bases et des phosphates mises en oeuvre en synthèse en phase solide.
Les groupes phosphates sont plus spécialement débloqués en utilisant par exemple du TMGPAO, puis de l'ammoniaque concentré. En opérant à température ambiante, on laisse agir le TMGPAO durant environ 14 heures. L'action de l'ammoniaque concentrée est réalisée avantageusement à une température supérieure à l'ambiante, de préférence de l'ordre de 50ºC durant 2 à 7 heures environ, notamment 5 heures environ.
Les fragments d'ADN sont ensuite purifiés par passage sur une ou plusieurs colonnes échangeuses d'ions, puis déprotégés, par exemple à l'aide d'acide acétique et, de préférence, à nouveau purifiés. Lorsque la chaîne de substitution ne comporte pas de groupe marqueur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique, comportant le ou les motifs méthylcytosine substitués par une chaîne en position 4, avec un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule.
Parmi les groupes habituellement utilisés, on citera les peptides, les haptènes, des groupement colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, le fluorescéine ou le dansyl, ou encore des enzymes telles que la phosphatase ou la peroxydase.
Des marqueurs préférés sont constitués par des peptides, et sont couplés avec des oligonucléotides comportant des chaînes de substitution à terminaison amino. La biotine est plus spécialement utilisée sous forme activée, par exemple sous forme d'ester de biotinyl-N-hydroxysuccinimide.
La biotinylation des oligonucléotides aminés est réalisée, de préférence, en soumettant ces oligonucléotides, en milieu basique, à l'action de la biotine sous fαrme activée, dans un solvant organique du type DMF.
Les oligonucléotides sont ainsi plus spécialement en solution dans un tampon de pH de 8 à 10 environ, de préférence de 9.
La réaction est réalisée avantageusement avec un excès de biotine activée.
La concentration en oligonucléotide est dans un rapport de 10-3/1 environ par rapport à celle de la biotine activée. La température de la réaction ne dépasse pas l'ambiante et peut varier d'environ 0ºC à 25ºC. des résultats satisfaisants sont obtenus en maintenant le mélange réactionnel de 3 à 8 heures, de préférence environ 6 heures, à une température voisine de l'ambiante, puis de 8 à 20 heures, de préférence environ de 12 à 14 heures à une température voisine de 0ºC.
Les fragments d'ADN marqués obtenus selon l'invention sont purifiés en vue de leurs applications biologiques.
L'élimination des sels formés lors de la synthèse est avantageusement réalisée à l'aide d'une ou plusieurs colonnes de résines échangeuse d'ions ou de Séphadex ou Biogel.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent relatifs à la préparation de sondes d'ADN biotinylées utilisées pour la détection du gène clone de l'antithrombine III.
Les abréviations utilisées dans les exemples présentent les significations suivantes : tT : 2'-désoxythymidine substituée par un groupe 1,2,4-triazole en position 4,
DMTr : diméthoxytrityle,
DMTrT : thymidine protégée en 5' par un groupe diméthoxytrityle et substituée en 3' par un groupe de formule TPSNT : triisopropyl -2,4,6 benzène sulfonyl nitro-3 triazole -1,2,4, TMGPAO : pyridine-aldoximate-tétraméthyl guanidine DCCI : dicyclohexyl carbodiimide DCU : dicyclohexyl urée BNHS : biotinyl N hydroxysuccinimide TEAB : bicarbonate de triéthyl ammnonium Exemple 1 :
Synthèse de sondes biotinylees complémentaires d'un fragment d'ADN-c de l'antithrombine III humaine (ou AT III).
Des expériences précédentes des inventeurs ont permis d'isoler, à l'aide de sondes marquées enzymatiquement en 5' au 32P, de l'ADN-c de l'AT III inséré dans des plasmides.
Ces ADN-c ont été séquences et la séquence de l'ARN-m correspondant à été décrite. Connaissant cette séquence, les trois sondes biotinylees suivantes ont été synthétisées manuellement, en phase solide, par la méthode au phosphotriester :
sonde 1 3'TAC TAC ATG GTC CTT C*(B)5, (5'Biot) sonde 2 3'TAC TAC*(B) ATG GTC CTT C5' (3'Biot) sonde 3 3'TAC TAC*(B) ATG GTC CTT C* (B)5' (5',3' Biot)
C* = 5 méthyl, 2'-déoxycytidine ;
Biot = biotinyle ; B = (NH -(CH2)10-NH-Biot) en position 4 de C*
Cette synthèse comprend trois étapes :
1) La synthèse chimique d'une séquence d'ADN triazolée,
2) la substitution des groupements 1,2,4-triazolyl des T pas de la décanediamine, 3) la biotinylation des séquences d'ADN aminées.
Ces étapes sont réalisées comme suit pour synthétiser la sonde 1 :
1) Synthèse chimique d'une séquences d'ADN triazolée :
On utilise comme support une résine du type polyacrylamide telle que celle commercialisée sous la marque Enzacryl K2 dont le taux de substitution en thymidine est de 130 μmoles par gramme de support.
Le taux de substitution du support, c'est-à-dire la quantité du premier nucleoside fixé au support, est évalué par dosage en UV à 507 nm du cation DMT libéré par traitement acide (acide benzène sulfonique à 2 %) dans un mélange CH2Cl2/CH3OH : 70-30.
. Synthèse des motifs tT selon le schéma 1 :
Schéma 1
4g de thymidine entièrement protégée DMTrT (5,07 mmoles) sont coévaporés dans la pyridine avec 1,4g (20,3 mmoles) de 1,2,4-triazole.
Le résidu est dissous dans 25 ml de pyridine distillée et le ballon est placé dans un bain de glace. 2,5g (10,14 mmoles) d'o-chlorophényl phosphodi- chloridate sont ajoutés et le milieu reactionnel est soumis à agitation pendant 10 minutes à 0ºC, puis 48 heures à température ambiante.
Après évaporation à sec, le résidu est repris par du CH2Cl2, lavé au NaHCO3 concentré, rincé à 1'H20 jusqu'à pH neutre, séché sur Na2SO4, filtré puis évaporé.
Le produit est dissous dans un minimum de CH2Cl2 et reprécipité trois fois dans l'éther de pétrole. Après plusieurs purifications sur colonnes de silice et sur colonne de Séphadex LH2OR, on obtient 1,7g de DMTr(t)T (Rdt = 40 %)
Chromatographie en couche mince (CH2Cl2, MeOH:95-5) Rf = 0,48. . Synthèse de la séquence d'ADN triazolée : 120 mg de support DMTrT soit 15,5 μmoles sont détritylés par de l'acide benzène sulfonique (ABS) à 2
%. Le nucleoside DMTrCA (6 éq) est âecyanoéthylé par un mélange de triéthylamine-pyridine-H2O:1-3-1 (TPE) pendant 20 minutes, puis activé par 18 éq. de TPSNT et couplé sur la fonction 5'OH de la thymidine fixée sur le support.
Le rendement du couplage a été évalué par dosage en UV à 507 nm du cation DMT libéré par traitement avec l'acide benzène sulfonique. Il est de 100 % pour ce premier couplage.
Les rendements des couplages des nucléosides suivants sont : DMTrCAT (59 % ) ; DMTrGTA (65 % ) ; DMTrCTG (86 %) ; DMTrTTC (93 %) .
2) Substitution des groupements 1,2,4 triazolyl des tT présentes dans les séquences par de la décanediamine selon le schéma 2 suivant :
schéma 2
61 mg de résine (7,9 μmoles) sont mis en suspension dans 610 μl (10 éq) d'une solution 120 mM de décanediamine dans la pyridine.
Le milieu reactionnel est conservé à température ambiante pendant au moins 2 jours. La résine est alors essorée puis rincée à la pyridine pour éliminer toute trace de diamine restante.
Les séquences aminées sont alors décrochées du support et débloquées par les méthodes classiques utilisées en synthèse en phase solide. Les oligonucléotides sont débloqués par addition de 1,1 ml (1,1 mmoles) d'une solution de TMGPAO 1 M dans un mélange eau-dioxane : 1/1. On utilise 10 éq. de TMGPAO par phosphate à débloquer ; soit pour la séquence d'ADN ci-dessus 150 éq. de TMGPAO 1 M. Après une nuit à température ambiante, le milieu reactionnel est évaporé à sec.
On ajoute 3 ml d'ammoniaque concentrée (20 % ) et l'on chauffe à 50ºC pendant 5 heures.
La résine est alors filtrée, rincée et le jus est concentré puis déposé sur une colonne de résine Dowex NH4 +® éluée avec H2O. Le produit est lyophilisé, puis purifié au stade DMTr par HPLC sur une colonne Nucléosil ® préparative avec un gradient de 5 à 25 % ou de 5 à 50 % d'acétonitrile dans un tampon d'acétate de triéthyl ammonium 10 M en 20 minutes.
Les séquences sont détritylées dans de l'acide acétique à 80 % dans H2O pendant 20 minutes à température ambiante. L'acide est alors évaporé puis entraîné par 2 ou 3 coévaporations au toluène.
Le résidu est dissous dans H2O, lavé à l'éther éthylique puis concentré.
Les produits, entièrement déprotégés, sont à nouveau purifiés par HPLC sur une colonne Nucléosil ® préparative, puis vérifiés sur une colonne Nucléosil® analytique.
3) Biotinylation des séquences d'ADN aminées : Synthèse de l'ester de biotinyl , N-hydroxysuccinimide : (B.N.H.S.)
Le protocole utilisé a été décrit par BAYER et WILCHEK dans Methods in Enzymol. (1974), 34, 265-7. A une solution de 250 mg de biotine (1 mmole) dans 3 ml de
DMF passé sur alumine sont ajoutés 150 mg (1,3 éq.) de
N-hydroxysuccinimide et 412 mg (2 éq.) de DCCI.
Le milieu reactionnel se présente sous forme d'une suspension blanche qui est chauffée une demi-heure à 50ºC puis gardée 20 heures sous agitation à température ambiante.
Le précipité de dicyclohexyl urée formé est filtré et le filtrat est entreposé environ 14 heures à 0ºC. La partie insoluble de DCU formée est ensuite filtrée et le filtrat est concentré . Le BNHS est recristallisé dans un grand volume d'isopropanol.
271 mg de produit sont obtenus, soit un rendement d'estérification de 77,6 % . . Biotinylation des sondes aminées selon le schéma 3 suivant :
1 DO de sonde aminée est disssoute dans un mélange de 200 μl d'H2O et de 100 μl de tampon NaHCO3 pH
9. 1 mg (2,93 μmoles) d'ester de biotinyl, N-hydroxysuccinimide sont ajoutés dans 40 μl de DMF. Après 6 heures à température ambiante et une nuit à 0ºC, le DMF est évaporé et le produit est déposé sur une colonne de
Séphadex G10® éluée avec un tampon de TEAB 0,05 M.
Les sondas sont ensuite purifiées par HPLC sur colonne Nucléosil® analytique ou préparative.
En fin de purification, les oligonucléotides sont échangea sous forme ammonium sur une colonne Dowex
50 W NH + ®, puis vérifiés par HPLC sur colonne
Nucléosil® analytique.
Les rendements de biotinylation sont de 21 % à
23 % ; 5' Biot = 3,18 DO. Exemple 2 :
On prépare les sondes 2 et 3 en opérant comme indiqué ci-dessus.
Sonde 2 3' NH2 = 5,23 D0 3' Biot = 1,124 DO
Rdt = 21,5 % Sonde 3 5' 3' NH2 = 1 D0 5' 3' Biot = 0,228 DO
Rdt = 22,8 %
Exemple 3 : Révélation de Dot Blots de sondes biotinylees.
Les sondes décrites ci-dessus ont été utilisées pour éprouver l'efficacité de deux kits de détection de l'ADN biotinylé commercialisés par la société BRL :
1. Products for Nucleic Acid Détection, réf. 8239 SA
2. Blu GENE™, réf. 8279 SA. La très forte affinité de la biotine pour les protéines avidine ou streptavidine est à la base de la mise au point de ces deux méthodes de détection enzymatique.
Les premières révélations ont été faites sur des dot blots de sondes biotinylees.
Les sondes sont déposées à différentes concentrations (de 100 pmoles à 0,5 fmole)sur de la nitrocellulose puis fixées par passage au four à 80ºC pendant 1 heure. Les filtres sont bloqués par de l'albumine de sérum bovine à. 3 % dans un tampon 0,1 M tris-HCl (pH 7,5 ; 0,15 M NaCl à 55ºC pendant 2 heures.
Suivant le kit de détection employé, la révélation se fait en deux ou trois étapes. Le premier kit de détection commercialisé 1 suit un protocole en 3 étapes :
1. couplage avec la streptavidine ;
2. couplage avec la phosphate alcaline biotinylée; 3. réaction enzymatique colorée avec le nitroblue tetrazolium (NBT) et le 5 bromo-4-chloro-3- indonyl phosphate (BCIP).
Des signaux amplifiés peuvent être obtenus grâce à la propriété de la streptavidine de lier 4 molécules de biotine.
Le second kit 2 se fait en deux étapes :
1. couplage avec la streptavidine-phosphatase alcaline,
2. réaction enzymatique colorée avec le NBT et le BCIP.
L'intensité des révélations est appréciée visuellement.
Chaque révélation de sondes biotinylees synthétiques est menée en parallèle avec la révélation d'ADN biotinylé enzymatiquement, fourni par BRL, et déposé à différentes concentrations sur de la nitrocellulose, ce qui permet d'éprouver la sensibilité de chaque détection d'ADN.
Des quantités de 50 fmoles d'ADN de sondes biotinylees déposées sur de la nitrocellulose ont été révélées. Hybridation des sondes avec de l'ADN immobilisé sur nitrocellulose.
. Préparation des filtres de nitrocellulose. De l'ADN plasmidique cible dans lequel sont insérés 1.6 kb correspondant à l'ADN-c de l'AT III et de l'ADN contrôle de pBR 322 ont été déposés sur nitrocellulose : ces ADNs préalablement linéarisés par l'enzyme de restiction HindIII ont été dilués de 2 en 2 pour obtenir une gamme de concentrations variant de 10 μg à 0,01 μg, dénaturés par chauffage 10 minutes à 100ºC et additionnés de 0,5 M NaOH 20 minutes à température du laboratoire puis neutralisés dans la glace avec 0,3 M HCl, 0,3 M NaCl, 0,15 M Tris HCl pH 8, 0,1 M citrate de sodium. 7,5 μl de chaque dilution ont été déposés sur nitrocellulose. Les filtres ont été séchés 1 heure à l'air libre, puis 2 heures au four à 80ºC. . Hybridation
Des filtres de nitrocellulose ont été préhybridés 2 heures à 37ºC en 6 x NET (1 x NET = 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris HCl, pH 7,5, 0,001 M EDTA), 5 x Denhardt's (100 Denhardt's 0,02 % sérum albumine bovine, 0,02 % polyvinyl pyrolidone, 0,02 % ficoll), 5 % sulfate de dextran , 0,1 % SDS et 100 μg par ml d'ADN soniqué de sperme de saumon. L'hybridation a été effectuée 20 heures à 37ºC dans la même solution contenant soit 10 cpm par ml de sonde marquée en 5' au [32P] par la polynucléotide kinase, soit 100 ng par ml de sonde biotinylée. Les filtres ont été lavés 3 fois 15 minutes en
6SSC à 4ºC et 1 fois 5 minutes à 40ºC puis soumis à une autoradiographie ou à une réaction colorée.
Le procédé de l'invention permet d'obtenir, par voie chimique, des oligonucléotides utilisables comme sondes de détection de séquences complémentaires d'acides nucléiques. On notera à cet égard que la limite de détection avec le kit streptavidine-phosphatase alcaline est de l'ordre de 15 fentomoles. Ces sondes revêtent également un grand intérêt pour la séparation d'un polynucléotide complémentaire contenu dans une solution amenée au contact de cette molécule supportée, la détection ou la séparation étant mise en oeuvre dans des conditions autorisant leur hybridation mutuelle. Grâce à la formation d'un double brin sur le support il est également possible de purifier des protéines donnant lieu à une interaction avec un fragment d'ADN.
Les inventeurs ont constaté que lorsqu'on in- troduit le groupement marqueur du côté 5', on obtient un duplex plus stable à l'hybridation que lorsque ce groupement se trouve du côté 3'.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention par voie chimique, d'oligonucléotidides marqués, caractérisé par les étapes suivantes : on incorpore, lors de la synthèse chimique en phase solide de la séquence d'oligonucléotides à construire, à la place des cytosines prévues sur la séquence, respectivement une ou plusieurs thymines dont la position 4 est substituée par un groupe activateur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique construite avec un composé de formule R-A-R' dans laquelle
R et R', sont identiques et représentent un groupe
-NH2, -SH ou -OH, ou R et R' sont différents, l'un représentant un groupe -NH2, -SH ou -OH, l'autre un groupe -NH-X, -SX ou -O-X, dans lequel X est un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule ; et
A représente une chaîne alcoyle de 4 à 20 atomes de carbone environ, comportant le cas échéant des hétéroatomes, tels que O, N ou S ; ce qui conduit à l'obtention de méthyl-5-cytosine(s) avec une chaîne de substitution en position 4, à la place de la ou des thymines activées, et lorsque le composé R-A-R' ne renferme pas de groupe marqueur, on introduit un groupement marqueur sur la chaîne de substitution des méthyl-cytosines. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation de la position 4 de la thymine comprend la fixation sur ce sommet d'un dérivé hétérocyclique du type triazole, en particulier 1,
2,4-triazole, nitro-triazole ou tetrazole, imidazole ou encore d'un chlorure d'acide.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le couplage des nucléosides ou des nucléotides pour la construction de la chaîne est effectuée motif par motif ou par blocs de nucléotides, après fixation d'un motif sur un support solide.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé R-A-R' est un diaminoalcane, en particulier le diamino 1-10 décane, un glycol ou un α, ω-aminoalcool.
5. Procédé selon la revendication 4 , caractérisé en ce que en ce que la substitution des thymines activées par un diaminoalcane est réalisée dans un solvant organique tel que la pyridine, de préférence avec un excès d'aminé.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les oligonucléotides comportant les motifs méthyl-cytosines avec une chaîne de substitution en position 4 sont décrochés du support, puis débloqués et soumis à une ou plusieurs types de purification.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on fait réagir la séquence d'oligonucléotide renfermant le ou les motifs méthyl-cytosines substitués avec un ou plusieurs groupes capable de servir de marqueur pour la molécule.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe marqueur est choisi parmi les peptides, les haptènes, des groupement colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, le fluoresceine ou le dansyl, ou encore des enzymes telles que la phosphatase alcaline ou la peroxydase.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe marqueur est la biotine.
10. Application des oligonucléotides obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
9, en tant que sondes froides de détection de séquences complémentaires d'acides nucléiques.
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