EA047294B1 - Соединения и способы нацеливания на тау человека - Google Patents

Соединения и способы нацеливания на тау человека Download PDF

Info

Publication number
EA047294B1
EA047294B1 EA202192888 EA047294B1 EA 047294 B1 EA047294 B1 EA 047294B1 EA 202192888 EA202192888 EA 202192888 EA 047294 B1 EA047294 B1 EA 047294B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ser
antibody
thr
gly
val
Prior art date
Application number
EA202192888
Other languages
English (en)
Inventor
Сиюнь Чай
Цзиньбяо Чэнь
Джеффри Л. Дейдж
Дэвид Альберт Драйвер
Стивен Фишер Хинтон
Роберт Уильям II Сигель
Питер Эдвард Вайлланкур
Original Assignee
Эли Лилли Энд Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эли Лилли Энд Компани filed Critical Эли Лилли Энд Компани
Publication of EA047294B1 publication Critical patent/EA047294B1/ru

Links

Description

Изобретение относится к области медицины. Более конкретно, изобретение относится к соединениям, фармацевтическим композициям, диагностическим средствам и способам, которые включают антитело или его фрагмент, направленные против тау человека. Ожидается, что соединения и способы согласно изобретению будут полезны в области нейродегенеративных заболеваний, в частности таупатий, включая болезнь Альцгеймера (БА), прогрессирующий супрануклеарный паралич (PSP) и лобновисочную деменцию (FTD) и т.п., включая их лечение и относящуюся к этому диагностику.
Тау представляет собой аксональный белок, связывающий микротрубочки, экспрессирующийся как в центральной нервной системе (ЦНС), так и на периферии, что способствует сборке и стабильности микротрубочек. Известные изоформы тау человека экспрессируются в ЦНС и участвуют в аберрантном образовании и агрегации интранейрональных нейрофибриллярных клубков (NFT). При нейродегенеративных заболеваниях, таких как БА, плотность и нейроанатомическая локализация NFT в ЦНС коррелируют с тяжестью деменции, степенью потери нейронов и общим прогрессированием заболевания. При PSP также наблюдается формирование NFT в ЦНС, плотность которого также коррелирует со степенью тяжести потери нейронов.
БА представляет собой нейродегенеративное заболевание, характеризующееся деменцией, вызывающей проблемы с памятью, мышлением и поведением. По данным Ассоциации болезни Альцгеймера, около 5,6 миллиона американцев 65 лет и старше (т.е. примерно 1 из 10) страдают БА, и еще 200 000 американцев моложе 65 лет страдают БА. Ассоциация болезни Альцгеймера также отмечает ожидаемое увеличение числа американцев 65 лет и старше с БА более чем на 26% к 2025 году. Это представляет значительные расходы на здравоохранение; только в 2019 году непосредственные затраты на здравоохранение, связанные с БА, в Соединенных Штатах, по оценкам, достигнут 290 миллиардов долларов, и эта цифра не включает неоплачиваемые расходы на лиц, осуществляющих уход. Несмотря на значительное влияние БА на человека и здоровье, на сегодняшний день не существует утвержденных терапевтических средств, модифицирующих заболевание, для лечения БА, и такое лечение остается неудовлетворенной медицинской потребностью.
Кроме того, чтобы помочь в открытии и/или разработке лечения, модифицирующего заболевание, необходимы надежные и чувствительные средства диагностики БА. Утвержденным диагностическим вариантом применения для БА является Амивид™. Фтортауципир представляет собой диагностический вариант применения для БА, который в настоящее время рассматривается FDA. И Амивид™, и флортауципир являются радиоизотопными агентами для визуализации неврологических заболеваний, подходящими для обнаружения и определения стадии БА и других нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, недавно раскрыт диагностический анализ, нацеленный на фосфорилированный треонин по остатку 181 тау человека (hTau-pT181) (номер остатка на основе SEQ ID NO 1) в образцах пациентов. Однако диагностическому варианту применения hTau-pT181 не хватает чувствительности, необходимой для диагностического тестирования, такого как определение различных стадий БА у пациентов или прогноза пациента, в анализе крови, плазмы и спинномозговой жидкости (CSF). Таким образом, необходима диагностика, применимая для тестирования с использованием крови, плазмы и/или спинномозговой жидкости, которая предлагает менее дорогой и менее инвазивный вариант диагностики, а также является чувствительной и надежной. Предпочтительно, такая диагностика будет способна идентифицировать и/или дифференцировать пациентов с БА (например, на основе стадии БА или прогноза). Такая диагностика также предпочтительно будет способна идентифицировать и/или различать эффективные терапевтические ответы. В вариантах реализации такая диагностика также предпочтительно будет способна идентифицировать и/или дифференцировать пациентов, нуждающихся в дальнейшей диагностической оценке, например, пациентов, для которых подходит нейрологическая визуализация, такая как фтортауципир и/или амивид.
Соответственно, в одном из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены антитела и их фармацевтические композиции, направленные против тау человека, фосфорилированного по остатку треонина 217 (номер остатка на основе SEQ ID NO 1) (hTau-pT217), а также способы и диагностические варианты применения с применением таких антител и фармацевтических композиций. Кроме того, согласно варианту реализации настоящего раскрытия, предложены антитела и их фармацевтические композиции, которые нацелены против изоформ тау человека, экспрессируемого в ЦНС (например, распознающие изоформы, экспрессируемые в ЦНС, и не распознающие изоформы тау человека, экспрессируемые исключительно вне ЦНС).
Согласно некоторым вариантам реализации предложены антитела, которые специфично связывают hTau-pT217. В более конкретных вариантах реализации предложены антитела, которые связывают эпитопную область тау человека, содержащую фосфорилированный треонин по остатку 217 SEQ ID NO 1, причем такие антитела не связывают тау человека, если треонин по остатку 217 SEQ ID NO 1 не фосфорилирован. В еще более конкретных вариантах реализации настоящего раскрытия такие антитела содержат вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем LCDR1 имеет аминокислотную последовательность
- 1 047294
SEQ ID NO: 13, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах реализации LCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12. Согласно некоторым вариантам реализации антител, предложенных в настоящем раскрытии, LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации антител, предложенных в настоящем раскрытии, LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых других вариантах реализации LCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, и HCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. В некоторых других вариантах реализации LCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, и HCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.
Согласно вариантам реализации настоящего раскрытия предложены антитела, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС (например, известные изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС), и такие антитела не связывают изоформы тау человека, экспрессируемые исключительно в областях за пределами ЦНС, включая периферическую нервную систему. Согласно конкретным вариантам реализации такие антитела, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, связывают эпитопную область тау человека, содержащую остатки 124 (глутамин) и 125 (аланин) SEQ ID NO: 1. В конкретных вариантах реализации такие антитела содержат вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации LCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22. Согласно некоторым вариантам реализации антител, предложенных в настоящем раскрытии, LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых других вариантах реализации LCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17, и HCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19.
Согласно некоторым вариантам реализации антитела согласно настоящему раскрытию могут быть гуманизированными. В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему раскрытию содержат тяжелую цепь IgG4. В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему раскрытию содержат легкую каппа-цепь. Согласно другим вариантам реализации в настоящем раскрытии предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело согласно настоящему раскрытию и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
Согласно другим вариантам реализации в настоящем раскрытии предложен способ лечения нейродегенеративного заболевания, содержащий введение пациенту, который в этом нуждается, эффективного количества антитела или его фармацевтической композиции согласно настоящему раскрытию. В некоторых таких вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию. В еще
- 2 047294 более конкретных вариантах реализации таупатия представляет собой одну из следующих форм: БА, PSP и FTD.
Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем раскрытии предложено антитело или его фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию для применения в терапии. Кроме того, антитело или его фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию предназначены для применения для лечения нейродегенеративного заболевания. В некоторых таких вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию. В некоторых более конкретных вариантах реализации таупатия выбрана из группы, состоящей из БА, PSP и FTD.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего раскрытия, антитело или его фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию предназначены для применения для получения лекарственного средства для лечения нейродегенеративного заболевания. В некоторых таких вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию. В еще более конкретных вариантах реализации таупатия выбрана из группы, состоящей из БА, PSP и FTD.
Согласно другим вариантам реализации настоящего раскрытия предложен способ обнаружения hTau-pT217 в образце пациента. Такие способы включают стадии приведения образца пациента в контакт с антителом согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает hTau-pT217, и обнаружения сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт.
Согласно вариантам реализации предложен способ обнаружения только изоформ тау человека, экспрессируемых в ЦНС. Такие способы включают стадии приведения образца пациента в контакт с антителом согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемого в ЦНС (т.е., и которые не связывают изоформы тау человека, экспрессируемые исключительно вне ЦНС), и обнаружения сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт.
Согласно некоторым вариантам реализации предложен способ количественного определения hTaupT217 в образце пациента. Такие способы включают стадии приведения образца пациента в контакт с антителом согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает hTau-pT217, и обнаружения сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт. В некоторых вариантах реализации такие способы дополнительно содержат стадии приведения контрольного стандарта в контакт с антителом и обнаружения сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт с контрольным стандартом.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ количественного определения hTau-pT217 в образце пациента. Такие способы включают стадии приведения образца пациента в контакт с антителом согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает hTau-pT217, и приведения образца пациента в контакт с антителом по настоящему раскрытию, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, при этом указанные антитела не связывают перекрывающиеся области эпитопа антитела и одного из антител, содержащих обнаруживаемую метку; обнаружения сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой, при образовании комплекса, содержащего антитела и hTau-pT217; приведения контрольного стандарта в контакт с антителами; и обнаружения сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой при образовании комплекса, содержащего антитела и контрольный стандарт.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего раскрытия предложен способ диагностики пациента как одного или более из: (i) страдающего нейродегенеративным заболеванием; (ii) подверженного риску нейродегенеративного заболевания; (iii) нуждающегося в лечении нейродегенеративного заболевания; (iv) страдающего БА стадии I, II, III, IV, V или VI по Braak; или (v) нуждающегося в нейрологической визуализации. Согласно таким вариантам реализации такие способы включают стадии приведения образца пациента в контакт с антителом согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает hTau-pT217, и обнаружения связывания между антителом и hTau-pT217 в образце пациента. В некоторых таких вариантах реализации способ дополнительно включает стадию диагностики пациента как одного из: (i) страдающего нейродегенеративным заболеванием; (ii) подверженного риску нейродегенеративного заболевания; (iii) нуждающегося в лечении нейродегенеративного заболевания; (iv) страдающего БА стадии I, II, III, IV, V или VI по Braak; или (v) нуждающегося в нейрологической визуализации, если уровень hTau-pT217, обнаруживаемый в образце пациента, превышает референсный уровень.
В некоторых вариантах реализации настоящего раскрытия, предложен способ диагностики и лечения нейродегенеративного заболевания у пациента. Согласно таким вариантам реализации указанные способы включают стадии приведения образца пациента в контакт с антителом согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает hTau-pT217, обнаружения связывания между антителом и hTau-pT217 в образце пациента; диагностики пациента с нейродегенеративным заболеванием; и введения терапевтически эффективного количества антитела против тау человека пациенту, которому проведена диагностика. В некоторых вариантах реализации стадия диагностики включает диагностику пациента как страдающего нейродегенеративным заболеванием, когда присутствие hTau-pT217 в образце пациента превышает референсный уровень.
Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно настоящему раскрытию такие способы дополнительно включают стадию количественного определения hTau-pT217 в образце пациента. В
- 3 047294 таких вариантах реализации стадия количественного определения hTau-pT217 содержит количественное определение hTau-pT217 в образце пациента относительно референсного стандарта.
Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно настоящему раскрытию образец пациента представляет собой образец крови, плазмы, сыворотки или CSF.
Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно настоящему раскрытию, способы дополнительно включают стадию приведения образца пациента в контакт с антителом, которое специфично связывает hTau-pT217, и вторым антителом, причем указанное второе антитело специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС. В некоторых таких способах одно из указанного антитела или второго антитела содержит обнаруживаемую метку, и указанная стадия обнаружения содержит обнаружение сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой, при образовании комплекса, включающего антитело, второе антитело и hTau-pT217. Согласно некоторым таким вариантам реализации одно из антитела и второго антитела иммобилизовано на субстрате. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему раскрытию стадии приведения образца пациента в контакт с антителом и приведения образца пациента в контакт со вторым антителом происходят одновременно. Согласно некоторым более конкретным вариантам реализации второе антитело содержит антитело согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, как описано в настоящем документе.
В настоящем документе антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, содержащую 2 HC и 2 LC, связанные дисульфидными связями. Аминоконцевая часть каждой LC и HC содержит вариабельную область из примерно 100-120 аминокислот, в первую очередь отвечающую за распознавание антигена содержащимися в ней CDR. CDR перемежаются с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая LCVR и HCVR состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDR LC обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а 3 CDR HC обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. CDR содержат большую часть остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. На функциональную способность антитела связывать определенный антиген в значительной степени влияют шесть CDR. Назначение аминокислот доменам CDR в областях LCVR и HCVR антител согласно настоящему изобретению основано на хорошо известном соглашении нумерации по Кабат (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)), и конвенции по нумерации по Норсу (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)).
LC, согласно некоторым вариантам реализации настоящего раскрытия, классифицируются как каппа или лямбда, каждая из которых характеризуется определенной константной областью, известной в данной области техники. HC, согласно некоторым вариантам реализации настоящего раскрытия, классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации антитела включают HC IgG, которые можно дополнительно разделить на подклассы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Карбоксиконцевая часть каждой HC определяет константную область, в первую очередь ответственную за эффекторную функцию. В конкретном варианте реализации, антитела согласно настоящему изобретению имеют одну или более модификаций в константной области каждой HC, которые снижают эффекторную функцию.
Антитела согласно настоящему изобретению представляют собой моноклональные антитела. Моноклональные антитела представляют собой антитела, полученные из единственной копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не способ, с помощью которого их получают. Моноклональные антитела могут быть получены, например, с помощью гибридомных технологий, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий, например, CDR-трансплантации, или комбинаций таких или других технологий, известных в данной области техники.
Способы получения и очистки антител хорошо известны в данной области техники и могут быть найдены, например, в Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y., chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2. Например, мышей или кроликов можно иммунизировать посредством hTau-pT217, и полученные антитела можно выделить, очистить и определить аминокислотные последовательности с применением обычных способов, хорошо известных в данной области техники. Аналогичным образом можно проводить скрининг фаговой библиотеки, посредством чего тысячи Fab-фрагментов проверяют на взаимодействие с hTau-pT217, и полученные в результате взаимодействующие молекулы могут быть выделены, очищены, и аминокислотные последовательности могут быть определены с использованием общепринятых способов, хорошо известных в данной области техники, с помощью которых могут быть сконструированы исходные антитела. Варианты реализации антител согласно настоящему изобретению включают антитела, сконструированные так, чтобы они содержали одну или более человеческих каркасных областей, окружающих CDR, происходящие из нечеловеческого антитела. Каркасные последовательности зародышевой линии челове
- 4 047294 ка можно получить, например, в ImMunoGeneTics (INGT) через их веб-сайт, http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351.
В конкретных вариантах реализации настоящего изобретения, антитело или нуклеиновая кислота, кодирующая его, предложена в выделенной форме. В настоящем документе термин выделенный относится к белку, пептиду или нуклеиновой кислоте, который(ая) свободен(на) или практически свободен(на) от других макромолекулярных частиц, обнаруженных в клеточной среде.
Антитела, предложенные в настоящем раскрытии, можно применять при лечении пациентов. Более конкретно, варианты реализации антител согласно настоящему изобретению могут быть подходящими для лечения нейродегенеративных заболеваний или расстройств, включая таупатии, включая БА, PSP и FTD. Хотя антитела согласно настоящему изобретению могут быть подходящими для лечения БА, PSP и FTD, такие антитела также могут быть подходящими для лечения других нейродегенеративных заболеваний, особенно тех, которые связаны с патологией тау, такой как образование NFT. Как используется в настоящем документе взаимозаменяемо, лечение и/или процесс лечения и/или лечить предназначены для обозначения всех процессов, в которых может происходить замедление, прерывание, купирование, контроль, остановка или изменение прогрессирования расстройства, описанного в настоящем документе, но не обязательно указывает на полное устранение всех симптомов расстройства. Лечение включает введение антитела согласно настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния у человека, который бы получил пользу от уменьшения распространения по меньшей мере одного из образования агрегатов тау, образования NFT и потери нейронов, и включает: (a) подавление дальнейшего прогрессирования заболевания, т.е. прекращение его развития; и (b) облегчение заболевания, т.е. вызов регрессии заболевания или расстройства или ослабления его симптомов или осложнений.
Как используется в настоящем документе взаимозаменяемо, термин пациент, субъект и индивид относится к человеку. В некоторых вариантах реализации пациент дополнительно характеризуется заболеванием, расстройством или состоянием (например, нейродегенеративным расстройством), который получил бы пользу от уменьшения распространения по меньшей мере одного из образования агрегатов тау, образования нейрофибриллярных клубков и потери нейронов. В другом варианте реализации пациент дополнительно характеризуется как подверженный риску развития нейродегенеративного расстройства, заболевания или состояния, который получил бы пользу от уменьшения распространения по меньшей мере одного из образования агрегатов тау, образования NFT и потери нейронов.
В настоящем документе термин специфично связывает hTau-pT217 относится к взаимодействию антитела с эпитопной областью тау человека, содержащей фосфорилированный треонин по остатку 217 SEQ ID NO: 1. Такое связывание зависит от фосфорилирования треонина по остатку 217 SEQ ID NO: 1. Следует понимать, что существуют известные варианты или изоформы тау человека, например, полученные в результате вариантов сплайсинга. Также понятно, что такие известные варианты могут приводить к измененной нумерации некоторых аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1, включая фосфорилированный треонин, как это предусмотрено в настоящем документе со ссылкой на последовательность тау человека, как указано в SEQ ID NO: 1.
В настоящем документе термин специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС относится к взаимодействию антитела согласно настоящему раскрытию с эпитопной областью, общей или присутствующей в изоформах тау человека, экспрессируемых в ЦНС, и такая эпитопная область не присутствует в изоформах человеческого тау, экспрессируемых исключительно вне ЦНС. Антитела, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, не связывают изоформы тау человека, экспрессируемые исключительно вне ЦНС (например, изоформы, экспрессируемые только в других областях организма, таких как периферическая нервная система). Согласно некоторым вариантам реализации антитела, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, связывают или распознают эпитопную область изоформ тау человека, экспрессируемого в ЦНС, содержащую глутамин по остатку 124 (Q124) и аланин по остатку 125 (A125), номер остатка указан относительно SEQ ID NO: 1. Следует понимать, что существуют известные варианты или изоформы тау человека, например, полученные в результате вариантов сплайсинга, и что такие варианты могут приводить к измененной нумерации некоторых аминокислотных остатков относительно SEQ ID NO: 1, включая глутамин и аланин, как они представлены в настоящем документе со ссылкой на последовательность тау человека, приведенную в SEQ ID NO: 1.
Термин эпитопная область, как применяется в настоящем документе, относится к дискретным трехмерным сайтам антигена, которые распознаются, полностью или частично, антителами согласно настоящему изобретению. Аминокислоты эпитопной области образуют химически активные поверхностные группировки тау человека и образуют специфическую трехмерную структуру тау человека и могут обеспечивать определенные характеристики заряда. Конформационные и неконформационные / линейные эпитопы можно различить тем, что связывание с конформационными эпитопными областями теряется в присутствии денатурирующих растворителей, тогда как с линейными эпитопными областями нет.
Антитело согласно настоящему изобретению может быть включено в фармацевтическую компози
- 5 047294 цию, которая может быть приготовлена способами, хорошо известными в данной области техники, и содержит антитело согласно данному изобретению, и один или большее количество фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей) (например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012, в котором представлен сборник методов приготовления, общеизвестных практикующим специалистам). Подходящие носители для фармацевтических композиций включают в себя любой материал, который в комбинации с антителом согласно настящему изобретению сохраняет активность молекулы и не вступает в реакцию с иммунной системой пациента. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело согласно настоящему изобретению, может быть введена пациенту с риском, или проявлением, заболеваний или расстройств, как описано в настоящем документе, парентеральными путями (например, подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным или трансдермальным). Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит эффективное или терапевтически эффективное количество, которые используются в настоящем документе взаимозаменяемо, антитела согласно настоящему изобретению. Эффективное количество относится к количеству, необходимому (в дозах и в течение периодов времени и с целями введения) для достижения желаемого терапевтического результата. Эффективное количество антитела может изменяться в зависимости от таких факторов как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивида, и способности антитела вызывать целевой ответ у индивида. Эффективным количеством является также количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела согласно настоящему изобретению перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. Термин процент гомологии, упоминаемый в настоящем раскрытии, в контексте двух или более аминокислотных последовательностей относится к двум или более последовательностям, имеющим определенный процент одинаковых аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия при измерениии с использованием алгоритма сравнения последовательностей (например, BLASTP и BLASTN или других алгоритмов, доступных специалистам) или путем визуального осмотра. В зависимости от применения процент гомологии может существовать в пределах области сравниваемой последовательности, например, по функциональному домену, или, в качестве альтернативы, существовать по всей длине двух сравниваемых последовательностей. В качестве примера процент гомологии последовательности можно сравнить с референсной последовательностью. Например, при использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемая и референсная последовательности могут быть введены в компьютер (и координаты подпоследовательности могут быть дополнительно обозначены, если необходимо, вместе с параметрами программы алгоритма последовательности). Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности или гомологии последовательностей для исследуемых последовательностей относительно референсных последовательностей на основе заданных параметров программы. Примеры алгоритмов выравнивания и/или гомологии последовательностей доступны в Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA (в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), или путем визуального осмотра (см. в целом Ausubel et al., ниже). Одним из примеров алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST находится в открытом доступе через Национальный центр биотехнологической информации (www.ncbi. nlm. nih. gov/).
Используемый в настоящем документе термин образец пациента относится к образцу человека. Неограничивающие источники образца для применения в настоящем изобретении включают кровь, плазму, сыворотку и спинномозговую жидкость (CSF). Кроме того, образец может также относиться к лимфатической жидкости, биопсийным аспиратам, асциту, жидкостным экстрактам, твердым тканям, внешним участкам кожи, дыхательным, назальным, кишечным и мочеполовым трактам, слезам, слюне, молоку, опухолям, органам, культурам клеток и/или составляющим культуры клеток.
Настоящее раскрытие также относится к способам клинической диагностики, прогноза или тераностики субъекта, выполняемым медицинским работником с использованием раскрытых в настоящем документе способов. Способы, описанные в настоящем документе, может, например, осуществлять индивидуум, медицинский работник или третья сторона, например поставщик услуг, который интерпретирует информацию от субъекта. Как объясняется в настоящем документе, медицинский работник может начать или изменить лечение после получения информации, касающейся диагностического способа согласно настоящему раскрытию. Например, медицинский работник может порекомендовать терапию, изменение терапии или дополнительную диагностическую оценку (например, нейрологическую визуализацию).
Антитела против тау-белка согласно настоящему изобретению, которые специфично связывают hTau-pT217, можно применять для выделения, обнаружения и/или количественного определения hTauРТ217с помощью таких методов, как аффинная хроматография, иммунопреципитация, иммуногистохимия или анализ на основе ELISA. Такой анализ можно применять для обнаружения и/или оценки количества и/или паттернов экспрессии hTau-pT217 в диагностических, прогностических или тераностических целях для мониторинга уровней полипептидов, например, в сыворотке, плазме, крови или CSF в рамках
- 6 047294 процедуры клинического исследования, например, для определения эффективности данной схемы лечения.
Антитела против тау-белка согласно настоящему раскрытию, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, можно применять для выделения и/или обнаружения изоформ тау человека, экспрессируемых в ЦНС (за исключением изоформ тау человека, экспрессируемых исключительно вне ЦНС) такими методами, как аффинная хроматография, иммунопреципитация, иммуногистохимия или анализ на основе ELISA. Такой анализ можно применять для обнаружения и/или оценки количества и/или паттернов экспрессии изоформ тау человека, экспрессируемого в ЦНС, в диагностических, прогностических или тераностических целях для мониторинга уровней полипептидов, например, в сыворотке, плазме, крови или CSF в рамках процедуры клинического исследования, например, для определения эффективности данной схемы лечения. Как понятно из данной области техники, антитело согласно настоящему изобретению может быть связано с обнаруживаемым веществом или меткой для облегчения его обнаружения. Примеры обнаруживаемых веществ или меток включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, хемилюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлороназиниламин флуоресцеин (dichlorotnazinylamine fluorescein), дансилхлорид или фикоэритин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин, рутений и экворин, и примеры подходящего радиоактивного материала включают 125I, 131I, 35S или 3H. Антитела согласно настоящему изобретению также могут быть подходящими для фармакогеномного анализа. Такие варианты реализации можно применять для идентификации индивидуумов, которым могут получать пользу от определенных или модифицированных методов лечения и/или мониторинга эффективности существующих режимов лечения.
Уровни или измерения hTau-pT217, как обеспечивается анализами согласно настоящему изобретению, могут быть абсолютными значениями (например, концентрацией в биологическом образце) или относительными значениями (например, концентрацией по сравнению с референсом). В настоящем документе hTau-pT217 называется повышенным в образце пациента, если способ обнаружения hTaupT217 указывает, что уровень или концентрация hTau-pT217 в образце пациента выше референсного значения. Наоборот, hTau-pT217 называется пониженным в образце пациента, если уровень hTaupT217 или концентрация hTau-pT217 в образце пациента ниже референсного значения, или, например, значения hTau-pT217, измеренного в предыдущем образце пациента.
В настоящем документе референсное значение относится к известной или приблизительной концентрации hTau-pT217, связанной с определенным состоянием. Уровни концентрации в референсном значении могут быть абсолютным или относительным количеством, диапазоном количества или минимальным количеством, средним количеством и/или медианным количеством hTau-pT217. Референсное значение также может служить базовым уровнем hTau-pT217, с которым сравнивают образец пациента.
Контрольный стандарт в настоящем документе относится к образцу, который можно использовать для сравнения результатов, полученных на образце пациента в способах согласно настоящему изобретению. Контрольные стандарты могут представлять собой клетки, кровь, плазму, спинномозговую жидкость, ткань или известные концентрации белка, добавленные в среду. Уровни концентрации в контрольном стандарте могут быть абсолютным или относительным количеством, диапазоном количества или минимальным количеством, средним количеством и/или медианным количеством hTau-pT217. Контрольный стандарт также может служить базовым уровнем hTau-pT217, с которым сравнивают образец пациента. Контрольный стандарт может включать значение концентрации от того же пациента или известный нормальный референс hTau-pT217. Кроме того, в некоторых вариантах реализации контрольный стандарт может экспрессировать концентрации hTau-pT217 в форме стандартной кривой.
В настоящем документе термин захватывающее антитело относится к антителу, которое будет связывать hTau-pT217. В таких вариантах реализации захватывающее антитело способно связывать и захватывать hTau-pT217, например, специфично связывать hTau-pT217 (например, не связывать тау человека, если треонин по остатку 217 SEQ ID NO: 1 не фосфорилирован) в образце пациента в подходящих условиях, так что комплекс захватывающее антитело-hTau-pT217 можно отделить от остальной части образца. В некоторых вариантах реализации захватывающее антитело может представлять собой антитело, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС (например, которые могут включать hTau, фосфорилированный по треонину по остатку 217), и антитело, которое специфично связывает hTau-pT217, используется в качестве второго (или детектирующего) антитела. В некоторых вариантах реализации захватывающее антитело иммобилизовано. В некоторых вариантах реализации детектирующее антитело мечено обнаруживаемой меткой. В некоторых вариантах реализации захватывающее антитело иммобилизовано в сэндвич-иммуноанализе, и захватывающее или первое антитело специфично связывает эпитопную область тау человека, содержащую фосфорилированный
- 7 047294 треонин по остатку 217 SEQ ID NO: 1. В таких сэндвич-иммуноанализах также применяют детектирующее (или второе) антитело. Согласно некоторым вариантам реализации, детектирующее или второе антитело может специфично связываться с захватывающим антителом и может быть помечено обнаруживаемой меткой. В некоторых вариантах реализации детектирующее или второе антитело специфично связывает hTau-pT217, уже связанным или захваченным захватывающим или первым антителом. В таких вариантах реализации детектирующее антитело связывает hTau-pT217 на второй эпитопной области, которое не перекрывается с первым или захватывающим антителом и может быть помечено обнаруживаемой меткой. В некоторых таких вариантах реализации второе антитело представляет собой антитело согласно настоящему изобретению, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС.
В настоящем документе термин обнаруживаемая метка представляет собой фрагмент, композицию или методику, которые можно применять для обнаружения образования комплекса между антителом согласно настоящему изобретению, которое специфично связывает hTau-pT217 и hTau-pT217. Согласно некоторым вариантам реализации обнаруживаемая метка может быть конъюгирована с антителом (либо захватывающим, либо детектирующим, в зависимости от обстоятельств) прямо или косвенно. Примеры вариантов реализации обнаруживаемых меток включают биотин; радиоизотопы; флуорофоры или другие флуоресцентные фрагменты; и ферментативные фрагменты.
Термин диагноз или диагностика, используемый в настоящем документе взаимозаменяемо, относится к способам, с помощью которых квалифицированный специалист может оценить и/или определить вероятность (возможность) того, страдает ли пациент данным заболеванием или состоянием. В случае настоящего изобретения диагностика пациента включает использование результатов анализа настоящего изобретения для идентификации или диагностики неврологического расстройства, такого как БА, PSP или FTD, а также для идентификации пациента, например, в отношении наличия или возникновения неврологического заболевания или расстройства, или в отношении потребности в лечении, или в отношении эффективности лечения пациента с неврологическим заболеванием. Согласно настоящему изобретению диагноз может быть основан на комбинации других клинических признаков, как их понимает специалист в области здравоохранения, для постановки диагноза. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, диагностические варианты применения согласно настоящему изобретению могут использоваться для диагностики пациента как описано для БА стадии I, II, III, IV, V или VI по Break. Стадии AD по Break известны в данной области техники и описаны в Break, et al., (2006) Acta Neuropathol 112(4): 389-404.
Примеры
Антитела против hTau-pT217
Антитела против hTau-pT217 или антитела, которые специфично связывают hTau-pT217, по настоящему раскрытию получают с применением методологии гибридомы (например, как впервые описано в Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)). Вкратце, в качестве примера кролика иммунизируют пептидом, включающим фосфорилированный треонин и четыре или более N-концевых и С-концевых аминокислот, таких как треонин, как представлено в SEQ ID NO: 1 (пример пептида, который можно использовать при иммунизации, представлен в SEQ ID NO: 26). Лимфоциты, способные продуцировать антитела, связывающие hTau-pT217, выделяют и сливают с линией клеток миеломы с использованием подходящего агента слияния для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Гибридомы засевают и выращивают в подходящей культуральной среде (предпочтительно содержащей одно или более веществ, ингибирующих выживание неслитых миеломных клеток). Затем определяют специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомами, с помощью анализа связывания in vitro (например, иммунопреципитации, радиоиммуноанализа (РИА) или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)) с использованием как hTau-pT217, так и рекомбинантного тау, не фосфорилированного по треонину по остатку 217 (номер приведен на основе SEQ ID NO: 1). Идентифицируют антитела, которые специфично связывают hTaupT217 (например, и не связывают тау человека, не фосфорилированный по остатку 217, нумерация на основе SEQ ID NO: 1). Предпочтительные гибридомы можно субклонировать с помощью процедур ограниченного разведения и выращивать стандартными способами, включая in vivo как асцитные опухоли у животных (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Моноклональные антитела, секретируемые гибридомами (и/или субклонами), очищают в соответствии с обычными процедурами, такими как, например, аффинная хроматография (например, белок A или белок G-сефароза) или ионообменная хроматография, гидроксилапатитовая хроматография, гель-электрофорез, диализ или тому подобное.
кДНК, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению, секвенируют с использованием общепринятых процедур. Приведенное в качестве примера антитело кролика против hTau-pT217 (mAb A), полученное в соответствии с процедурами, по существу, как описано в настоящем документе, содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 2 и легкую цепь SEQ ID NO: 4. Определяющие комплементарность участки (CDR) или вариабельные области секвенированных антител могут быть использованы для преобразования в химерные или гуманизированные антитела и/или преобразованы в другие формы IgG мле
- 8 047294 копитающих. Например, клон может быть преобразован в химерное антитело IgG мыши, такое как приведенное в качестве примера химерное антитело против hTau-pT217 вариабельной области кролика, константной области IgG мыши (mAb B), имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 6 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 7 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 8 и легкую цепь SEQ ID NO: 9. Затем можно повторно оценить специфичность связывания. Последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, можно клонировать и сконструировать в вектор экспрессии GS (глутамин синтетаза). Затем сконструированный вектор экспрессии иммуноглобулина может быть стабильно трансфицирован в клетки CHO. Специалист в данной области техники поймет, что экспрессия антител в млекопитающих приведет к гликозилированию, обычно по высококонсервативным сайтам Nгликозилирования в области Fc. Стабильные клоны могут быть проверены на экспрессию антитела, специфично связывающегося с hTau-pT217. Положительные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для продукции антител в биореакторах. Среда, в которую было секретировано антитело, может быть очищена обычными способами. Например, среда может быть удобным образом нанесена на FF колонку с белком A или G с сефарозой, которая была уравновешена совместимым буфером, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор. Колонку промывают для удаления неспецифических связывающих компонентов. Связанное антитело элюируют, например, градиентом pH, и фракции антитела обнаруживают, например, с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, и затем объединяют. Антитело может быть сконцентрировано и/или стерильно отфильтровано с использованием обычных методик. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены обычными методами, включая эксклюзионную, гидрофобного взаимодействия, ионообменную или гидроксиапатитную хроматографию. Продукт может быть немедленно заморожен, например, при -70°C, или может быть лиофилизирован.
Антитела, специфичные для изоформ hTau, экспрессируемых только в ЦНС
Антитела согласно настоящему изобретению, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, могут быть получены с использованием методологии гибридомы (например, как впервые описано в Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)). Вкратце, в качестве примера, млекопитающее, не являющееся человеком (например, мышь или кролик), может быть иммунизировано посредством тау человека (например, hTau, представленным SEQ ID NO: 1), или его пептидом, который включает глутамин по остатку 124 и аланин по остатку 125, нумерация представлена SEQ ID NO: 1. Лимфоциты, способные продуцировать антитела, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, могут быть выделены и слиты с линией клеток миеломы с использованием подходящего агента слияния для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Гибрид омы могут быть засеяны и выращены в подходящей культуральной среде (предпочтительно содержащей одно или более веществ, ингибирующих выживание неслитых миеломных клеток). Затем определяют специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомами, с помощью анализа связывания in vitro (например, иммунопреципитации, радиоиммуноанализа (РИА) или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)) против изоформ тау человека, экспрессируемого в ЦНС (например, пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1) и/или периферически экспрессируемых изоформ тау человека (например, пептида, имеющего последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, который не включает глутамин в остатке 124 рядом с аланином в остатке 125, как представлено SEQ ID NO: 1). Антитела, которые специфично связывают изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС (например, и не связывают периферически экспрессируемый тау человека), могут быть идентифицированы. Предпочтительные гибридомы можно субклонировать с помощью процедур ограниченного разведения и выращивать стандартными способами, включая in vivo как асцитные опухоли у животных (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59103 (Academic Press, 1986)). Моноклональные антитела, секретируемые гибридомами (и/или субклонами), могут быть очищены в соответствии с обычными процедурами, такими как, например, аффинная хроматография (например, белок A или белок G-сефароза) или ионообменная хроматография, гидроксилапатитовая хроматография, гель-электрофорез, диализ или тому подобное.
кДНК, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению, могут быть секвенированы с использованием общепринятых процедур. Типичное антитело мыши согласно настоящему раскрытию, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС (mAb C), полученные в соответствии с процедурами, по существу, как описано в настоящем документе, включает тяжелую цепь SEQ ID NO: 16 и легкую цепь SEQ ID NO: 18. Определяющие комплементарность участки (CDR) или вариабельные области секвенированных антител могут быть использованы для преобразования в химерные или гуманизированные антитела и/или преобразованы в другие формы IgG млекопитающих и экспрессированы в составляющих клетках-хозяевах, таких как клетки CHO.
Кинетика связывания и аффинность
Анализ интерферометрии биослоя (BLI), измеренный с помощью прибора Octet Red96®, доступного от ForteBio (с использованием HBS-EP + рабочий буфер (GE Healthcare, 10 мМ Hepes pH 7,4 + 150 мМ NaCl + 3 мМ ЭДТА + 0,05% поверхностно-активного вещества P20)) при 25°C), используют для измерения связывания антитела по настоящему изобретению, которое специфично связывается с hTau-pT217, с
- 9 047294 рекомбинантным белком hTau-pT217, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Если не указано иное, все реагенты и материалы поставляются ForteBio (Freemont, CA). Биосенсор белка A используют для иммобилизации представляющего интерес антитела для анализа. Примеры образцов антител согласно настоящему изобретению (mAb A) готовят в концентрации 5 мкг/мл путем разбавления в рабочем буфере. Рекомбинантный белок hTau-pT217 готовят в концентрациях 300, 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,24, 0,4115 и 0 (холостой) нМ путем разбавления в рабочем буфере. Каждый анализ состоит из: (1) сбора образцов антител на биосенсорах в течение 240 секунд; (2) установление базового уровня путем инкубации загруженных антителами биосенсоров с рабочим буфером в течение 60 секунд; (3) инкубирование загруженных антителами биосенсоров с серийно разведенным рекомбинантным белком hTaupT217 в течение 300 секунд для мониторинга фазы ассоциации; (4) возврат биосенсора в рабочий буфер для контроля фазы диссоциации.
Данные связывания обрабатывают с использованием стандартного двойного контроля и подгонки к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения Data Analysis v9.0 для определения скорости ассоциации ((kon, M-1c-1 ед.) и скорости диссоциации (koff, с-1 ед.). Константа равновесной диссоциации (KD) рассчитывается из соотношения KD= koff/kon, и выражается в молярных единицах. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Данные связывания BLI с рекомбинантным hTau-pT217
Пример антитела коп (М^с'1 ед.) koff (М^с-1 ед.) Kd* (нМ)
mAb А 3,39Е+05 2,36Е-04 6,95Е-10
^Результаты KD считают относительными, так как результаты не нормализованы на влияние авидности.
Специфичность связывания с hTau-pT217
Специфичность представленных в качестве примеров антител согласно настоящему изобретению, которые специфично связывают hTau-pT217 (mAb A и mAb B), определяют с применением синтетических пептидов с использованием анализа BLI, измеренного с помощью прибора Octet Red96®, доступного от ForteBio (с использованием HBS-EP + рабочий буфер (GE Healthcare, 10 мМ Hepes pH 7,4 + 150 мМ NaCl + 3 мМ ЭДТА + 0,05% поверхностно-активного вещества P20)) при 25°C). Меченые N-концевым биотином пептиды SEQ ID NO: 26, с фосфорилированным треонином по остатку 7 и без него, иммобилизованы на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio). Пептиды инкубируют с IgG mAb A и mAb B, разведенными до 5 мкг/мл в рабочем буфере, в течение 300 секунд с последующей диссоциацией в течение 300 секунд. Данные связывания определяют с использованием программного обеспечения для оценки Data Analysis v9.0. Сигнал связывания (нм) для каждого пептида в конце диссоциации представлен в табл. 2.
Таблица 2
Данные BLI по связыванию mAb A и mAb B с рекомбинантным hTau с pT217 и без него
Пример антитела фосфорилированный треонин (нм ед) нефосфорилированный треонин (нм ед)
mAb А 4,4178 -0,0024
mAb В 4,7715 0,3389
Иммуноанализ hTau-pT217
Иммуноанализы для измерения hTau-pT217 в плазме предназначены для измерения связанных с заболеванием различий у пациентов с БА. В качестве примера иммуноанализ согласно настоящему раскрытию проводят на планшете с маленькими пятнами стрептавидина с использованием платформы Meso Scale Discovery (MSD). Либо mAb A, либо mAb B используют в качестве захватывающего антитела и биотинилируют. Второе антитело SULFO-TAG, такое как mAb C (антитело согласно настоящему изобретению, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС), используют в качестве детектирующего антитела. Антитела конъюгируют с су.тьфо-\1 IS-биотином (Thermo Scientific, номер по каталогу: 21329) или MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester (MSD, номер по каталогу: R91AO-1) в соответствии с протоколом производителя. Анализ калибруют с использованием рекомбинантного белка тау (4R2N, NCBI tau v2), который фосфорилируют in vitro с использованием реакции с киназой-3 гликогенсинтазы и характеризуют масс-спектрометрией. Образец размораживают на мокром льду, кратковременно встряхивают, и плазму разбавляют 1:4 в буфере для образцов: для mAb A (фосфатно-солевой буфер (PBS), 0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,5% Tween20, 5 мМ EDTA, 5 мМ EGTA); для mAb 2 50 мМ HEPES, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 5 мМ EGTA, 1% Triton X-100, 1% MSD Blocker A, 2% PEG) с добавлением Гетерофильного блокирующего реагента 1 до концентрации 200 мкг/мл (Scantibodies Inc, каталожный номер: 3KC533). Раствор для разведения калибратора получают путем смешивания буфера для образцов 50/50 с заменителем сыворотки Knock-Out (Gibco, 10828-010).
Планшеты, покрытые стрептавидином (MSD, L45SA) MSD, блокируют в течение 1 часа при комнатной температуре 200 мкл 3% BSA в PBS при 650 об/мин встряхивании на шейкере для планшетов.
- 10 047294
Планшеты трижды промывают 200 мкл промывочного буфера (PBS + 0,05% Tween 20) и 25 мкл биотинилированного захватывающего антитела (mAb A) при 0,464 мкг/мл (разбавленный в DPBS + 0,1% BSA + 0,05% Tween20, плюс 2% ПЭГ для mAb 2), добавленного для планшетов с hTau-pT217, и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре при 650 об/мин встряхивании на шейкере для планшетов. Планшеты снова трижды промывают 200 мкл промывочного буфера и 50 мкл разбавленного калибратора или образца, добавленного в планшет, и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре при 650 об/мин встряхивании на шейкере для планшетов. Затем планшеты трижды промывают 200 мкл промывочного буфера, и добавляют 25 мкл SULFO-меченного детектирующего антитела (mAb C) в концентрации 0,25 мкг/мл (разбавленного в MSD Diluent 35, плюс 2% PEG для mAb 2) для планшетов с hTaupT217, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре при 650 об/мин встряхивании на шейкере для планшетов. Планшеты в последний раз промывают 200 мкл промывочного буфера и 150 мкл буфера для считывания 2X MSD Read Buffer T с поверхностно-активным веществом (MSD, R92TC), добавляемого в каждый планшет, и считывают на MSD SQ120 в течение 10 минут после добавления буфера для считывания. Результаты рассчитывают программным обеспечением MSD с использованием 4PL, 1/y2 стандартной кривой для интерполяции с использованием уравнения: Y = b1 + ((b2 - b1) / (1 + (x / Ьз)Ь4>>.
Иммуноанализ hTau-pT217 в качестве прогностического анализа для нейрологической визуализации
Уровни hTau-pT217 и hTau-pT181 оценивают в крови субъектов, участвующих в клинических испытаниях БА. Иммуноанализ hTau-pT217, как описано в настоящем документе, используют для оценки hTau-pT217 в плазме субъектов с БА из двух исследований (исследование 1: N = 42; исследование 2: N185). Кроме того, иммуноанализ hTau-pT181, ранее описанный в данной области, используют для измерения hTau-pT181 у тех же пациентов. Все пациенты имеют тау позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), измеренную с помощью нейрологической визуализации флортауципира. Образцы получали в течение двух уникальных клинических испытаний, в том числе и на базовом уровне, и хранили при -80°C для будущего исследования биомаркеров. Флортауципир SUVR определяют в представляющей интерес неокортикальной области относительно референсного сигнала в белом веществе. Корреляции SUVR флортауципира и pTau в плазме (pT181 и pT217, соответственно) оценивают с помощью корреляций рангового порядка Спирмена. При анализе кривых соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) используются модели логистической регрессии, включающие возраст и пол в качестве ковариант и пороговое значение положительности флортауципира SUVR >1,1. Базовый уровень pTau, предсказывающий будущее когнитивное снижение, оценивают с использованием моделей со смешанными эффектами, оценивающих pTau по квартилям.
Иммуноанализ hTau-pT217 показывает статистически значимую более высокую корреляцию с Фтортауципир ПЭТ в обоих исследованиях (значение p<0,05), как показано в табл. 3.
Таблица 3
Корреляция иммуноанализов hTau-pT217 и hTau-pT181 с Фтортауципир ПЭТ
Иммуноанализ hTau-pT217 Иммуноанализ hTau-pT181
Исследование 1 0,783 0,332
Исследование 2 0,463 0,308
Площадь под ROC для положительности фтортауципира показывает более высокие значения для hTau-pT217 по сравнению с hTau-pT181 в обоих исследованиях (исследование 1: 0,88 относительно 0,79; исследование 2: 0.83 относительно 0,81 соответственно). Кроме того, модели смешанных эффектов hTaupT271 по квартилям показывают значительное увеличение снижения когнитивных функций. Как показывают результаты настоящего примера, иммуноанализы hTau-pT217 согласно настоящему раскрытию могут опредеять субъектов, подходящих для нейрологической визуализации и подверженных риску снижения когнитивных функций вследствие нейродегенеративного заболевания, и показывает значительное улучшение по сравнению с иммуноанализом hTau-pT181.
Иммуноанализ hTau-pT217 как диагностический индикатор БА и прогрессирования заболевания
Уровни hTau-pT217 в CSF с использованием описанного иммуноанализа оценивают и сравнивают с оценками иммуноанализа hTau-pT181. Вкратце, образцы CSF пожилых людей без нарушений (CU, n = 65); пациентов с легкими нарушениями когнитивной функции вследствие БА (MCI-AD, n = 29); с деменцией вследствие БА (n = 43) и другими нейродегенеративными расстройствами (n = 57) из шведского исследования BioFINDER оценивали с помощью иммуноанализов с hTau-pT217 и hTau-p181. Сто восемьдесят четыре участника прошли 18Е-Позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) с фтортауципиром. Поглощение 18Е-Фтортауципираколичественно определяли в заранее определенных областях, связанных с патологией тау при БА, включая стадии I-II, III-IV и V-VI по Braak, а также в нижней височной
- 11 047294 извилине.
У пациентов с CU как иммуноанализ hTau-pT217, так и иммуноанализ hTau-pT181 коррелируют с 18Е-Фтортауципир при I-II стадии по Braak; у пациентов с БА как иммуноанализ hTau-pT217, так и иммуноанализ hTau-pT181 коррелируют в областях на стадиях III-IV и V-VI по Брааку; у пациентов с MCI hTau-pT217 коррелирует с 1^-Фтортауципир в областях I-II, на стадиях по Braak III-IV и V-VI, тогда как hTau-pT181 коррелирует только в области на стадии I-II по Braak. Важно отметить, что корреляции между региональными 1^-Фтортауципир и hTau-pT217 иммуноанализами показывает статистически значимое улучшение (p<0,001-0,016) по сравнению с корреляцией между иммуноанализом на hTau-pT181 и 18Е-Фтортауципир во всех трех диагностических группах (CU, MCI и БА) и во всех областях (стадии по Braak I-II, III-IV и V-VI).
Коэффициенты корреляции иммуноанализа hTau-pT217 показывают постоянно более высокие, статистически значимые (все p<0,001) значения по сравнению с иммуноанализом hTau-pT181 для 18FФтортауципир во всех областях: hTau-pT217 (0,698-0,752) по сравнению с hTau-pT181 (0,572-0,706). Кроме того, иммуноанализ hTau-pT217 доказывает статистически значимый (p<0,001) более точный прогностический фактор патологического статуса 1^-Фтортауципира во всех областях (hTau-pT217: AUC 0,890-0,929; иммуноанализ hTau-pT181: AUC 0,859-0,904). Кроме того, иммуноанализ hTau-pT217 демонстрирует статистически значимое (p = 0,026) улучшение результатов по сравнению с иммуноанализом hTau-pT181 в различении БА от нейродегенеративного заболевания, не связанного с БА (hTau-pT217: AUC 0,943; hTau-pT181: AUC 0,914). Эти результаты показывают, что иммуноанализ hTau-pT217 коррелирует с нейрологической визуализацией 1^-Фтортауципира и позволяет дифференцировать БА от других неврологических расстройств и стадий, а также показывает значительное улучшение по сравнению с иммуноанализом на hTau-pT181.
Иммуноанализ hTau-pT217 связан с Tau PET SUVr
В литературе показано, что тау ПЭТ SUVr связан с патологией тау. Иммуноанализ hTau-pT217, как раскрыто в настоящем документе, коррелирует с Tau PET SUVr в исследовании, в котором измеряют hTau-pT217 в плазме, сыворотке и CSF пациентов с легкой степенью БА. Вкратце, 190 субъектам был выполнен иммуноанализ hTau-pT217 в плазме на исходном уровне. Из этих 190 субъектов 185 пациентам были выполнены тесты Tau PET SUVr. Данные анализировали с использованием критерия Спирмена, и значимая корреляция наблюдается с критерием спирмена ρ=0,49 и нескорректированным значением p<0,001. Кроме того, у 187 субъектов hTau-pT217 был определен в сыворотке на исходном уровне. Из этих 187 субъектов для 182 были выполнены анализы Tau PET SUVr. Данные анализировали с использованием критерия Спирмена, и значимая корреляция наблюдается с критерием спирмена ρ=0,41, нескорректированное значение p<0,001. Кроме того, у 86 субъектов hTau-pT217 был определен в CSF на исходном уровне. Из 86 субъектов для 29 были выполнены анализы Tau PET SUVr. Данные анализировали с использованием критерия Спирмена, и значимая корреляция наблюдается с критерием спирмена ρ=0,70, нескорректированное значение p <0,001.Результаты подтверждают использование уровней pTau217, измеренных в CSF, плазме или сыворотке, для выявления патологии тау.
Иммуноанализ hTau-pT217 связан с умеренным когнитивным статусом БА
Средние значения hTau-pT217 в плазме, сыворотке и CSF субъектов с легкой степенью БА рассчитывают согласно иммуноанализу, как описано выше. Результаты каждой матрицы представлены в табл. 4.
Таблица 4
Средние значения hTau-pT217 в плазме, сыворотке и CSF субъектов с легкой степенью БА
Жидкость Среднее ско N
Плазма 14,2 6,2 190
Сыворотка 13,4 6,2 187
CSF 684,9 531,1 86
Иммуноанализ hTau-pT217, как раскрыто в настоящем документе, связан с когнитивным статусом пациентов с легкой степенью БА (на основе краткого обследования психического состояния, MMSE) и изменением от исходного уровня по сравнению с плацебо для MMSE. hTau-pT217 оценивают с помощью иммуноанализа в плазме, сыворотке и CSF пациентов с легкой степенью БА. Вкратце, для каждой из матриц (плазма, сыворотка и CSF), субъектов, имеющих измерения hTau-pT217 (как описано в настоящем документе) и оценку MMSE на исходном уровне, а также изменения от оценок исходного уровня, оценивают на предмет значимости с помощью критерия Спирмена. Иммуноанализ hTau-pT217 показывает статистически значимую связь как с когнитивным статусом, так и с изменением от исходного уровня в плазме и сыворотке (количество образцов CSF слишком мало для статистической значимости, но данные показали такую связь, что с увеличением количества образцов, таких как оцениваемые образцы сыворотки и плазмы, ожидается, что CSF будет иметь статистически значимые связи для MMSE и изменений MMSE от исходного уровня). Результаты представлены в табл. 5.
- 12 047294
Таблица 5
Оценки иммуноанализа hTau-pT217 в плазме, сыворотке и CSF с MMSE и изменением MMSE от исходных значений у субъектов с легкой степенью БА
Переменная (X) Переменная (Y) Спирмен p Вероятность>|р| N
Исходный балл MMSE LoglO CSF* pTau217 -0,16 l,71E-01 78
Изменение MMSE по сравнению с исходным уровнем (только плацебо) LoglO CSF* pTau217 -0,25 l,48E-01 35
Исходный балл MMSE LoglO Плазма pTau217 -0,19 9,41E-03 187
Изменение MMSE от исходного уровня (только плацебо) LoglO Плазма pTau217 -0,43 3,27E-05 89
Исходный балл MMSE LoglO Сыворотка pTau217 -0,17 2,17E-02 184
Изменение MMSE от исходного уровня (только плацебо) LoglO Сыворотка pTau217 -0,32 ЗД1Е-ОЗ 86
* не считается статистически значимым вследствие небольшого размера выборки образцов пациентов, оцениваемых на предмет изменения MMSE от исходного уровня.
Эти результаты демонстрируют перекрестную связь hTau-pT217 с показателем когнитивных функций, MMSE, и демонстрируют полезность hTau-pT217 для определения риска снижения когнитивных функций в будущем.
Иммунонализ hTau-pT217 связан с амилоидным статусом
Иммуноанализ hTau-pT217, описанный в настоящем документе, связан с амилоидным статусом. Вкратце, образцы плазмы от четырех различных групп пациентов с известной БА и амилоидным статусом (на основе нейрологической визуализации ПЭТ) оценивают на наличие связи с hTau-pT217: (i) здоровый пожилой амилоид-положительный человек (CU-A+); (ii) здоровый пожилой амилоидотрицательный человек (CU-A-); (iii) пожилой амилоид-положительный человек с БА (AD-A+); и (iv) клинически здоровый молодой человек (CUY-A-). Образцы из каждой группы анализировали с помощью иммуноанализа hTau-pT217, как описано в настоящем документе. Результаты приведены в табл. 6.
Таблица 6 hTau-pT217, связанный с БА и амилоидным статусом
Г руппа Среднее ско N
Болезнь Альцгеймера - амилоид-положительный И,4 6,9 14
Клинически здоровые пожилые люди - амилоидположительные 6,7 1,9 14
Клинически здоровые пожилые люди - амилоидотрицательные 3,6 1,4 16
Клинически здоровые молодые люди - амилоидотрицательные 3,6 1,3 10
Оценка иммуноанализа hTau-pT217 для идентификации амилоид-положительных субъектов определяется путем оценки результатов, представленных в таблице 6 для отдельных групп, с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в табл. 7.
- 13 047294
Таблица 7 t-критерий Стьюдента средней разницы hTau-pT217 в плазме, связанной с БА и амилоидным статусом
Уровень 1 Уровень 2 Разница Std Err Dif рзначение
Болезнь Альцгеймера амилоидположительный Клинически здоровые пожилые люди амилоид-отрицательные 7,8 1,4 4,60Е-06
Болезнь Альцгеймера амилоидположительный Клинически здоровые молодые люди амилоид-отрицательные 7,8 1,6 4,67Е-05
Болезнь Альцгеймера амилоидположительный Клинически здоровые пожилые люди амилоидположительные 4,7 1,4 1,05Е-02
Клинически здоровые пожилые люди амилоидположительные Клинически здоровые пожилые люди амилоид-отрицательные 3,2 1,4 1Д7Е-01
Как показано в табл. 6 и 7, среднее значение для группы AD-A+ составляет 11,4 пг/мл и в три раза выше, чем для группы CU-A-, соответствующей по возрасту, на уровне 3,6, что приводит к нескорректированному значению p 4,60E-06. Анализ кривых соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) также используется для оценки чувствительности и специфичности для hTau-pT217 при идентификации амилоид-положительных субъектов. Площадь под кривой ROC составляет 0,94, как показано на фигуре.
Приведенные в настоящем документе данные демонстрируют, что анализы hTau-pT217 согласно настоящему раскрытию способны идентифицировать амилоид-положительных субъектов; служат диагностическим средством для БА и определения когнитивного статуса субъектов по отношению к БА; выявляют субъектов с риском БА и/или на самых ранних стадиях БА; и служат диагностикой прогрессирования БА. Данные также демонстрируют, что анализы hTau-pT217 согласно настоящему раскрытию коррелируют с нейрологической визуализацией, являются функциональными в матрицах сыворотки, плазмы и CSF и превосходят известный анализ hTau-pT181.
Примеры вариантов реализации настоящего раскрытия:
1. Антитело, которое специфично связывает тау человека, фосфорилированный по треонину по остатку 217 SEQ ID NO: 1 (hTau-pT217).
2. Антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, при этом LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
3. Антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, при этом LCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.
4. Антитело по вариантам реализации 2 или 3, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранные из:
a. LCVR, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и HCVR, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и
b. LCVR, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и HCVR, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
5. Антитело по вариантам реализации 2 или 3, содержащее вариабельную область легкой цепи
- 14 047294 (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранные из:
a. LCVR, имеющей аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, и HCVR, имеющей аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3; и
b. LCVR, имеющей аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, и HCVR, имеющей аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6:
6. Антитело по любому из вариантов реализации 1-5, отличающееся тем, что указанное антитело является гуманизированным.
7. Антитело по любому из вариантов реализации 1-6, отличающееся тем, что указанное антитело содержит тяжелую цепь IgG4.
8. Антитело по любому из вариантов реализации 1-7, отличающееся тем, что указанное антитело содержит легкую каппа-цепь.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из вариантов реализации 1-8 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
10. Антитело, которое специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС.
11. Антитело по варианту реализации 10, отличающееся тем, что указанное антитело связывает эпитопную область тау человека, содержащую глутамин по остатку 124 и аланин по остатку 125 SEQ ID NO: 1.
12. Антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, при этом LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
13. Антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, при этом LCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22.
14. Антитело по вариантам реализации 12 или 13, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.
15. Антитело по вариантам реализации 12 или 13, содержащее вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющиую аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19.
16. Антитело по любому из вариантов реализации 10-15, отличающееся тем, что указанное антитело является гуманизированным.
17. Антитело по любому из вариантов реализации 10-16, отличающееся тем, что указанное антитело содержит тяжелую цепь IgG4.
18. Антитело по любому из вариантов реализации 10-17, отличающееся тем, что указанное антитело содержит легкую каппа-цепь.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из вариантов реализации 10-18 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
20. Способ лечения нейродегенеративного заболевания, содержащий введение пациенту, который в этом нуждается, эффективного количества антитела или его фармацевтической композиции, по любому из вариантов реализации 1-19.
21. Способ по варианту реализации 20, отличающийся тем, что указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию.
22. Способ по варианту реализации 21, отличающийся тем, что таупатия представляет собой одно из БА, PSP и FTD.
- 15 047294
23. Антитело или его фармацевтическая композиция по любому из вариантов реализации 1-19 для применения в терапии.
24. Антитело или его фармацевтическая композиция по любому из вариантов реализации 1-19 для применения для лечения нейродегенеративного заболевания.
25. Антитело или его фармацевтическая композиция по варианту реализации 24, причем указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию.
26. Антитело или его фармацевтическая композиция по варианту реализации 25, причем указанная таупатия выбрана из группы, состоящей из БА, PSP и FTD.
27. Антитело или его фармацевтическая композиция по любому из вариантов реализации 1-19 для применения для получения лекарственного средства для лечения нейродегенеративного заболевания.
28. Антитело или его фармацевтическая композиция по варианту реализации 27, причем указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию.
29. Антитело или его фармацевтическая композиция по варианту реализации 28, причем указанная таупатия выбрана из группы, состоящей из БА, PSP и FTD.
30. Способ обнаружения hTau-pT217 в образце пациента, включающий следующие стадии:
приведение образца пациента в контакт с антителом любого из вариантов реализации 1-8; и обнаружение сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт.
31. Способ количественного определения hTau-pT217 в образце пациента, включающий следующие стадии:
приведение образца пациента в контакт с антителом любого из вариантов реализации 1-8; и обнаружение сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт.
32. Способ по варианту реализации 31, дополнительно содержащий стадии приведения контрольного стандарта в контакт с антителом и обнаружения сигнала, обеспечиваемого указанной стадией приведения в контакт с контрольным стандартом.
33. Способ количественного определения hTau-pT217 в образце пациента, включающий следующие стадии: приведение образца пациента в контакт с антителом по вариантам реализации 1-8; приведение образца пациента в контакт со вторым антителом, причем второе антитело представляет собой антитело согласно вариантам реализации 10-18, и одно из антитела и второго антитела содержит обнаруживаемую метку; обнаружение сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой при образовании комплекса, содержащего антитело, второе антитело и hTau-pT217; приведение контрольного стандарта в контакт с антителом; приведение контрольного стандарта в контакт со вторым антителом, одним из антитела и второго антитела, содержащего обнаруживаемую метку; и обнаружение сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой при образовании комплекса, включающего антитело, второе антитело и контрольный стандарт.
34. Способ диагностики пациента как одного или более из: (i) страдающего нейродегенеративным заболеванием; (ii) подверженного риску нейродегенеративного заболевания; (ш) нуждающегося в лечении нейродегенеративного заболевания; или (iv) нуждающегося в нейрологической визуализации, содержащей стадии: приведение образца пациента в контакт с антителом любого из вариантов реализации 1-8; и обнаружение связывания между антителом и hTau-pT217 в образце пациента.
35. Способ по варианту реализации 34, дополнительно включающий стадию диагностики пациента как одного из: (i) страдающего нейродегенеративным заболеванием; (ii) подверженного риску нейродегенеративного заболевания; (ш) нуждающегося в лечении нейродегенеративного заболевания; или (iv) нуждающегося в нейрологической визуализации, если уровень hTau-pT217, обнаруживаемый в образце пациента, превышает референсный уровень.
36. Способ диагностики и лечения нейродегенеративного заболевания у пациента, при этом указанный способ включает стадии: приведение образца пациента в контакт с антителом по любому из вариантов реализации 1-8; обнаружение связывания между антителом и hTau-pT217 в образце пациента; диагностика пациента с нейродегенеративным заболеванием; и введение терапевтически эффективного количества антитела против тау человека пациенту, которому проведена диагностика.
37. Способ по варианту реализации 36, согласно которому указанная стадия диагностики включает диагностику пациента как страдающего нейродегенеративным заболеванием, когда присутствие hTaupT217 в образце пациента превышает референсный уровень.
38. Способ по любому из вариантов реализации 31-37, дополнительно содержащий стадию количественного определения hTau-pT217 в образце пациента.
39. Способ по варианту реализации 38, отличающийся тем, что указанная стадия количественного определения hTau-pT217 содержит количественное определение hTau-pT217 в образце пациента относительно референсного стандарта.
40. Способ по любому из вариантов реализации 30-39, отличающийся тем, что образец пациента представляет собой образец крови, плазмы, сыворотки или спинномозговой жидкости (CSF).
41. Способ по любому из вариантов реализации 30-32 и 34-40, дополнительно включающий стадию приведения образца пациента в контакт со вторым антителом, при этом указанное второе антитело связывается с эпитопной областью hTau-pT217, которая не перекрывается с антителом.
- 16 047294
42. Способ по варианту реализации 41, отличающийся тем, что одно из указанного антитела или второго антитела содержит обнаруживаемую метку, и указанная стадия обнаружения содержит обнаружение сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой, при образовании комплекса, включающего антитело, второе антитело и hTau-pT217.
43. Способ по любому из вариантов реализации 41-42, отличающийся тем, что одно из указанного антитела и второго антитела иммобилизовано на субстрате.
44. Способ по любому из вариантов реализации 30-43, отличающийся тем, что указанные стадии приведения образца пациента в контакт с указанным антителом и приведения образца пациента в контакт со вторым антителом происходят одновременно.
45. Способ по любому из вариантов реализации 32 и 41-44, отличающийся тем, что второе антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и причем HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
46. Способ по любому из вариантов реализации 33 и 41-44, отличающийся тем, что второе антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем LCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23, LCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22.
47. Способ по любому из вариантов реализации 46-47, отличающийся тем, что второе антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.
48. Способ по любому из вариантов реализации 46-47, отличающийся тем, что второе антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем указанная LCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19, и HCVR имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17.
49. Способ образования комплекса между первым антителом, вторым антителом и тау человека, экспрессируемым в ЦНС и фосфорилированным по треонину по остатку 217 SEQ ID NO: 1, при этом указанный способ включает: приведение образца пациента в контакт с первым антителом, при этом первое антитело представляет собой антитело по одному из вариантов реализации 1-8; и приведение образца пациента в контакт со вторым антителом, при этом второе антитело представляет собой антитело по одному из вариантов реализации 10-18.
50. Анализ для обнаружения тау человека, экспрессированного в ЦНС и фосфорилированного по треонину по остатку 217 SEQ ID NO: 1, отличающийся тем, что указанный анализ включает: антитело по одному из вариантов реализации 1-8; и антитело по одному из вариантов реализации 10-18.
51. Анализ по варианту реализации 50, отличающийся тем, что одно из антител содержит обнаруживаемую метку.
- 17 047294
Перечень последовательностей SEQ ID NO: 1 (hTau-pT217)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSE EPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDE AAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAK TPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSP SSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKD NIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKI GSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSST GSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL
SEQ ID NO: 2 (НС приведенного в качестве примера антитела кролика против hTau-pT217)
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLSPSWYGVHWVRQAPGKGLEWIGVLRAGSHTYY AGWAKGRFAISKTSTTVALKITSPTTEDTAIYFCGSVGRGIWGPGTLVTVSLGQPKAPSV FPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSV VSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQD WLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGF YPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHE ALHNHYTQKSISRSPGK
- 18 047294
SEQ ID NO: 3 (HCVR приведенного в качестве примера антитела кролика против hTau-pT217)
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLSPSWYGVHWVRQAPGKGLEWIGVLRAGSHTYY
AGWAKGRFAISKTSTTVALKITSPTTEDTAIYFCGSVGRGIWGPGTLVTVSL
SEQ ID NO: 4 (LC приведенного в качестве примера антитела кролика против hTau-pT217)
AQVLTQTASPVSATVGGTVTINCQASLAVYNNNYLAWYQQKPGQPPKRLIYLASSLSSG VSSHFKGSGSGTQFTLTISDVQADDAATYFCQGSYDCTIADCVAFGGGTEVVVKGDPVA PTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADNT YNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
SEQ ID NO: 5 (LCVR приведенного в качестве примера антитела кролика против hTau-pT217)
AQVLTQTASPVSATVGGTVTINCQASLAVYNNNYLAWYQQKPGQPPKRLIYLASSLSSG VSSHFKGSGSGTQFTLTISDVQADDAATYFCQGSYDCTIADCVAFGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 6 (HCVR приведенного в качестве примера химерного антитела против hTau-pT217)
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLSPSWYGVHWVRQAPGKGLEWIGVLRAGSHTYY AGWAKGRFAISKTSTTVALKITSPTTEDTAIYFCGSVGRGIWGPGTLVTVSL
SEQ ID NO: 7 (НС приведенного в качестве примера химерного антитела против hTau-pT217)
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLSPSWYGVHWVRQAPGKGLEWIGVLRAGSHTYY AGWAKGRFAISKTSTTVALKITSPTTEDTAIYFCGSVGRGIWGPGTLVTVSLAKTTPPSV YPLAPGS AAQTNSMVTLGCLVKGYFPEP VT VTWNSGSLS SGVHTFP AVLQ SDLYTLS S S VTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQ DWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMIT DFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVL HEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 8 (LCVR приведенного в качестве примера химерного антитела против hTau-pT217)
AQVLTQTASPVSATVGGTVTINCQASLAVYNNNYLAWYQQKPGQPPKRLIYLASSLSSG VSSHFKGSGSGTQFTLTISDVQADDAATYFCQGSYDCTIADCVAFGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 9 (LC приведенного в качестве примера химерного антитела против hTau-pT217)
- 19 047294
AQ VLTQT ASP VS ATVGGTVTINCQ ASLAVYNNNYL AW YQQKPGQPPKRLIYLAS SLS SG VSSHFKGSGSGTQFTLTISDVQADDAATYFCQGSYDCTIADCVAFGGGTEVVVKRADA APTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO: 10 (приведенная в качестве примера HCDR1)
GLSPSWYGVH
SEQ ID NO: 11 (приведенная в качестве примера HCDR2)
VLRAGSHTYYAGWAKG
SEQ ID NO: 12 (приведенная в качестве примера HCDR3)
VGRGI
SEQ ID NO: 13 (приведенная в качестве примера LCDR1)
QASLAVYNNNYLA
SEQ ID NO: 14 (приведенная в качестве примера LCDR2)
LASSLSS
SEQ ID NO: 15 (приведенная в качестве примера LCDR3)
LASSLSS
SEQ ID NO: 16 (НС приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSPYYWSWIRQPPDKGLEWIGEINWSGDTN YNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARSFDRWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFI FPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRV VSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKK QVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO: 17 (HCVR приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSPYYWSWIRQPPDKGLEWIGEINWSGDTN YNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARSFDRWGQGTLVTVSS
- 20 047294
SEQ ID NO: 18 (LC приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYFAWYQQKPGQAPRLLIYGVSRRAFGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGASLITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 19 (LCVR приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYFAWYQQKPGQAPRLLIYGVSRRAFGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGASLITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 20 (HCDR1 приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
AVYGGSFSPYYWS
SEQ ID NO: 21 (HCDR2 приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
EINWSGDTN
SEQ ID NO: 22 (HCDR3 приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
ARSFDR
SEQ ID NO: 23 (LCDR1 приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
RASQSVRSNYFA
SEQ ID NO: 24 (LCDR2 приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
YGVSRRAF
SEQ ID NO: 25 (LCDR3 приведенного в качестве примера антитела, связывающего тау человека, экспрессируемый только в ЦНС)
QQYGASLIT
SEQ ID NO: 26 (приведенный в качестве примера пептид для иммунизации)
RTPSLPTPPTR где T у остатка 7 фосфорилирован
SEQ ID NO: 27 (приведенный в качестве примера пептид для иммунизации)
AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQT PTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPE GTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQEPESGKVVQEGFLREPGPP
GLSHQLMSGMPGAPLLPEGPREATRQP SGTGPEDTEGGRHAPELLKHQ LLGDLHQEGPPLKGAGGKE RPGSKEEVDEDRDVDESSPQ DSPPSKASPA QDGRPPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPVDFLSKVSTEIPASEPDGPSVG RAKGQDAPLEFTFHVEITPNVQKEQAHSEEHLGRAAFPGAPGEGPEARGP SLGEDTKEAD LPEPSEKQPAAAPRGKPVSRVPQLKARMVS KSKDGTGSDD
ККАКТ STRS SAKTLKNRPCLSPKHPTPGS SDPLIQP S SPAVCPEPPS SPKYVS SVT SRTG SSGAKEMKLKGADGKTKIAT PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPP
APKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTP SLPTPPTREP
KKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGG KVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKC GSLGNIHHKPG GGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGG NKKIETHKLTFR ENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDT
SPRHLSNVS STGSIDMVD SPQLATLADEVS ASLAKQGL
- 21 047294
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ <120> СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ НАЦЕЛИВАНИЯ НА ТАУ ЧЕЛОВЕКА <130> X22196_WO <150> 62/855,331 <151> 2019-05-31 <160>27 <170> PatentIn версия 3.5 <210>1 <211>441 <212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая последовательность < 400>1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala 1 5 1015
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met 20 2530
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro 35 4045
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 50 5560
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu 65 7075
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr 85 9095
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr
100 105110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met
115 120125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys
130 135140
Gly
His
Leu
Ser
Val 80
Glu
Pro
Val
Gly
- 22 047294
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr 145 150
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr 165
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser
180 185
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly
195 200
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
210 215
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro
225 230
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro 245
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn
260 265
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys
275 280
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile
290 295
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
305 310
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
325
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
340 345
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
355 360
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
370 375
Arg Gly Ala Ala Pro Pro
155 160
Ile Pro Ala Lys Thr Pro
175
Glu Pro Pro Lys Ser Gly
190
Pro Gly Thr Pro Gly Ser
205
Pro Thr Arg Glu Pro Lys
220
Ser Pro Ser Ser Ala Lys
235 240
Pro Asp Leu Lys Asn Val
255
Lys His Gln Pro Gly Gly
270
Asp Leu Ser Asn Val Gln
285
His Val Pro Gly Gly Gly
300
Leu Ser Lys Val Thr Ser
315 320
Lys Pro Gly Gly Gly Gln
335
Lys Asp Arg Val Gln Ser
350
Val Pro Gly Gly Gly Asn 365
Arg Glu Asn Ala Lys Ala
380
- 23 047294
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
385 390 395
Ser Pro Val Val Ser
400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val
405 410
Ser Ser Thr Gly Ser
415
Ile Asp Met Val Asp
420
Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys 435
Gln Gly Leu
440 <210> 2 <211> 433 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 2
Gln Ser Val
Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val 20
Ser Gly Leu Ser Pro Ser Trp Tyr Gly
30
Val His
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45
Val Leu Arg Ala Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys Gly 50 55 60
Arg Phe Ala Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Ser Val Gly 85 90 95
Arg Gly Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr
115 120 125
- 24 047294
Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
130 135
Cys Leu Val
Lys Gly Tyr Leu Pro
140
Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val
145 150 155 160
Arg Thr Phe Pro
Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val
Ser Val 180
Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val
185 190
Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200
Thr Val Ala Pro Ser
205
Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
210 215 220
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
225 230 235 240
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp
245 250 255
Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr
260 265 270
Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val
275 280 285
Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu
290 295 300
Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
305 310 315 320
Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr
325 330 335
Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr
340 345 350
Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu
355 360 365
- 25 047294
Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
370 375
Tyr Lys
Thr Thr Pro Ala Val
380
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro
385 390 395
Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His
405 410 415
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro
420 425 430
Leu
Thr 400
Glu
Gly
Lys <210> 3 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 3
Gln Ser Val 1
Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val 20
Ser Gly Leu Ser Pro Ser Trp Tyr
30
Val His
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Val
Leu Arg Ala Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys 50 55 60
Arg Phe Ala Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Lys Ile 65 70 75
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Ser Val 85 90 95
Pro
Gly
Gly
Gly
Thr 80
Gly
Arg Gly Ile
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105
Thr Val Ser Leu
110 <210> 4 <211> 217
- 26 047294 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательн <220>
<223> Синтетическая последовательн <400> 4
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser 1 5
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala 20 25
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
40
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Leu Ser
55
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe 65 70
Gln Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe 85
Thr Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly
100 105
Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val
115 120
Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr
130 135
Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp 145 150
Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr 165
Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185
Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val
195 200
Val Ser Ala Thr Val Gly
Leu Ala Val Tyr Asn Asn 30
Gly Gln Pro Pro Lys Arg 45
Gly Val Ser Ser His Phe 60
Leu Thr Ile Ser Asp Val 75 80
Gln Gly Ser Tyr Asp Cys 95
Gly Thr Glu Val Val Val
110
Ile Phe Pro Pro Ala Ala
125
Val Cys Val Ala Asn Lys
140
Val Asp Gly Thr Thr Gln
155 160
Gln Asn Ser Ala Asp Asn
175
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn
190
Gln Gly Thr Thr Ser Val
205
- 27 047294
Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210215 <210>5 <211>113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>5
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala 15
Ser Pro Val Ser Ala Thr Val Gly
1015
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln 20
Ala Ser Leu Ala Val Tyr Asn Asn 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
40
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Leu
55
Ser Ser Gly Val Ser Ser His Phe 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln 65 70
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
80
Gln Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr 85
Phe Cys Gln Gly Ser Tyr Asp Cys
95
Thr Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe 100
Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
105 110
Lys <210> 6 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 6
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val 1 5 10
Thr Pro Gly Thr Pro 15
- 28 047294
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu
25
Ser Pro Ser Trp Tyr Gly 30
Val His
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45
Val
Leu Arg Ala Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys Gly 50 55 60
Arg Phe Ala Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90
Gly Ser Val Gly
Arg Gly Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105
Ser Leu
110 <210> 7 <211> 434 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 7
Gln Ser Val 1
Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val
10
Thr Pro Gly Thr Pro
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Pro Ser Trp Tyr Gly 20 2530
Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
4045
Val Leu Arg Ala Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys Gly 50 5560
Arg Phe Ala Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Lys Ile Thr 65 70 7580
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Ser Val Gly 85 9095
Arg Gly Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Ala Lys
100 105110
- 29 047294
Thr Thr Pro Pro Ser
115
Val Tyr Pro Leu Ala
120
Pro Gly Ser Ala Ala
125
Thr Asn Ser Met Val
130
Thr Leu Gly Cys Leu
135
Val Lys Gly Tyr Phe
140
Glu Pro Val Thr Val 145
Thr Trp Asn Ser Gly 150
Ser Leu Ser Ser Gly 155
His Thr Phe Pro Ala
165
Val Leu Gln Ser Asp
170
Leu Tyr Thr Leu Ser
175
Ser Val Thr Val Pro
180
Ser Ser Thr Trp Pro
185
Ser Glu Thr Val Thr
190
Asn Val Ala His Pro
195
Ala Ser Ser Thr Lys 200
Val Asp Lys Lys Ile
205
Pro Arg Asp Cys Gly
210
Cys Lys Pro Cys Ile
215
Cys Thr Val Pro Glu
220
Ser Ser Val Phe Ile 225
Phe Pro Pro Lys Pro 230
Lys Asp Val Leu Thr 235
Thr Leu Thr Pro Lys
245
Val Thr Cys Val Val
250
Val Asp Ile Ser Lys
255
Asp Pro Glu Val Gln
260
Phe Ser Trp Phe Val
265
Asp Asp Val Glu Val
270
Thr Ala Gln Thr Gln
275
Pro Arg Glu Glu Gln
280
Phe Asn Ser Thr Phe
285
Ser Val Ser Glu Leu
290
Pro Ile Met His Gln
295
Asp Trp Leu Asn Gly 300
Glu Phe Lys Cys Arg 305
Val Asn Ser Ala Ala 310
Phe Pro Ala Pro Ile 315
Lys Thr Ile Ser Lys
325
Thr Lys Gly Arg Pro
330
Lys Ala Pro Gln Val
335
Thr Ile Pro Pro Pro
340
Lys Glu Gln Met Ala
345
Lys Asp Lys Val Ser
350
Gln
Pro
Val 160
Ser
Cys
Val
Val
Ile 240
Asp
His
Arg
Lys
Glu 320
Tyr
Leu
- 30 047294
Thr Cys Met Ile Thr 355
Asp Phe Phe Pro Glu 360
Asp Ile Thr Val Glu 365
Gln Trp Asn Gly Gln 370
Pro Ala Glu Asn Tyr
375
Lys Asn Thr Gln Pro
380
Met Asp Thr Asp Gly 385
Ser Tyr Phe Val Tyr 390
Ser Lys Leu Asn Val 395
Lys Ser Asn Trp Glu
405
Ala Gly Asn Thr Phe
410
Thr Cys Ser Val Leu
415
Glu Gly Leu His Asn
420
His His Thr Glu Lys
425
Ser Leu Ser His Ser
430
Trp
Ile
Gln 400
His
Pro
Gly Lys <210> 8 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>8
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Thr Val 1 5 1015
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Leu Ala Val Tyr Asn 20 2530
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys 35 4045
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Gly Val Ser Ser His
5560
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp 65 7075
Gln Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Ser Tyr Asp 85 9095
Gly
Asn
Arg
Phe
Val 80
Cys
- 31 047294
Thr Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly
100 105
Lys <210> 9 <211> 220 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательн <220>
<223> Синтетическая последовательн <400> 9
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser 1 5
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala 20 25
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
40
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Leu Ser
55
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe 65 70
Gln Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe 85
Thr Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly
100 105
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
115 120
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
130 135
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys 145 150
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp 165
Gly Thr Glu Val Val Val
110
Val Ser Ala Thr Val Gly
Leu Ala Val Tyr Asn Asn 30
Gly Gln Pro Pro Lys Arg 45
Gly Val Ser Ser His Phe 60
Leu Thr Ile Ser Asp Val 75 80
Gln Gly Ser Tyr Asp Cys 95
Gly Thr Glu Val Val Val
110
Ile Phe Pro Pro Ser Ser
125
Val Cys Phe Leu Asn Asn
140
Lys Ile Asp Gly Ser Glu
155 160
Asp Gln Asp Ser Lys Asp
175
- 32 047294
Ser Thr Tyr Ser Met
Ser Ser Thr
180
Leu Thr 185
Leu Thr Lys Asp Glu
190
Tyr
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His
195 200
Lys Thr Ser 205
Thr
Ser Pro Ile Val Lys
210
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
215 220 <210> 10 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 10
Gly Leu Ser Pro Ser Trp Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 11
Val Leu Arg Ala Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys 1 5 10 15
Gly <210> 12 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 12
Val Gly Arg Gly Ile 1 5 <210> 13 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 33 047294 <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>13
Gln Ala Ser Leu Ala Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ala 1 510 <210>14 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>14
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser <210>15 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>15
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser <210>16 <211>443 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser 1 5 10 15
Glu
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val 20
Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Pro
30
Tyr
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro
40
Pro Asp
Lys Gly Leu Glu Trp 45
Ile
- 34 047294
Gly
Ser 65
Asn
Arg
Ala
Ser
Phe 145
Gly
Leu
Tyr
Arg
Cys 225
Pro
Cys
Trp
Glu Ile Asn Trp Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser
Leu Ser Ser Val Thr
Ser Phe Asp Arg Trp 100
Ser Thr Lys Gly Pro
115
Thr Ser Glu Ser Thr 130
Pro Glu Pro Val Thr
150
Val His Thr Phe Pro
165
Ser Ser Val Val Thr
180
Thr Cys Asn Val Asp
195
Val Glu Pro Arg Gly 210
Pro Ala Pro Asn Leu
230
Lys Ile Lys Asp Val
245
Val Val Val Asp Val
260
Phe Val Asn Asn Val
275
Leu Asp Thr Ser Lys
Asn Gln Phe Ser Leu
Ala Ala Asp Thr Ala
Val Tyr Tyr Cys Ala
Gly Gln Gly Thr Leu
105
Ser Val Phe Pro Leu
120
Ala Ala Leu Gly Cys 135
Val Ser Trp Asn Ser
155
Ala Val Leu Gln Ser
170
Val Pro Ser Ser Ser
185
His Lys Pro Ser Asn
200
Pro Thr Ile Lys Pro 215
Leu Gly Gly Pro Ser
235
Leu Met Ile Ser Leu
250
Ser Glu Asp Asp Pro
265
Glu Val His Thr Ala
280
Val Thr Val Ser Ser
110
Ala Pro Cys Ser Arg
125
Leu Val Lys Asp Tyr 140
Gly Ala Leu Thr Ser
160
Ser Gly Leu Tyr Ser
175
Leu Gly Thr Lys Thr
190
Thr Lys Val Asp Lys
205
Cys Pro Pro Cys Lys 220
Val Phe Ile Phe Pro
240
Ser Pro Ile Val Thr
255
Asp Val Gln Ile Ser
270
Gln Thr Gln Thr His
285
- 35 047294
Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
290 295
Ser Ala Leu Pro 300
Gln His Gln Asp Trp Met
305 310
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
315
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro 325
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro
330 335
Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp
355 360 365
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr
370 375 380
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395
Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu
405 410 415
Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
Ile
Asn 320
Lys
Glu
Phe
Glu
Tyr 400
Arg
His
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
435 440 <210> 17 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser 1 5 10 15
Thr Leu
Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Pro
25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Asp Lys 35 40
Gly Leu Glu Trp 45
Glu
Tyr
Ile
- 36 047294
Gly Glu Ile Asn Trp Ser Gly Asp
55
Thr Asn
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ser Phe Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110 <210> 18 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
25
Ser Val Arg Ser Asn 30
Tyr Phe Ala
Trp Tyr Gln Gln Lys 40
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45
Ile Tyr Gly Val Ser Arg Arg Ala Phe Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 7580
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ala Ser Leu 85 9095
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120125
- 37 047294
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
130 135
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
180 185
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
195 200
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 <210> 19 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательн <220>
<223> Синтетическая последовательн <400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly 1 5
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 20 25
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Ile Tyr Gly Val Ser Arg Arg Ala Phe
55
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
100 105
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
140
Leu Gln Ser Gly Asn Ser
155 160
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
175
Tyr Glu Lys His Lys Val
190
Ser Ser Pro Val Thr Lys
205
Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15
Gln Ser Val Arg Ser Asn 30
Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45
Ile Pro Asp Arg Phe Ser 60
Thr Ile Ser Arg Leu Glu 75 80
Gln Tyr Gly Ala Ser Leu 95
Ile Lys
- 38 047294
<210> 20
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность
<400> 20
Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Pro Tyr Tyr Trp Ser 1 510
<210> 21
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность
<400> 21
Glu Ile Asn Trp Ser Gly Asp Thr Asn
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность
<400> 22
Ala Arg Ser Phe Asp Arg 15 <210>23 <211>12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>23
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Tyr Phe Ala
510 <210>24 <211>8
- 39 047294 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>24
Tyr Gly Val Ser Arg Arg Ala Phe <210>25 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400>25
Gln Gln Tyr Gly Ala Ser Leu Ile Thr 15 <210>26 <211>11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <220>
<221>
<222>
<223>
MISC_FEATURE (7) . . (7) где T по остатку 7 фосфорилирован <400>
Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 510 <210>27 <211>757 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность <400> 27
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr 1 5 10 15
- 40 047294
Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln
25
Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly
40
Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu
55
Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp
70
Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala
Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala
100 105
Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
115 120
Lys Val Val Gln Glu Gly Phe Leu Arg
130 135
Ser His Gln Leu Met Ser Gly Met Pro
145 150
Gly Pro Arg Glu Ala Thr Arg Gln Pro 165
Thr Glu Gly Gly Arg His Ala Pro Glu
180 185
Gly Asp Leu His Gln Glu Gly Pro Pro
195 200
Glu Arg Pro Gly Ser Lys Glu Glu Val
210 215
Glu Ser Ser Pro Gln Asp Ser Pro Pro
225 230
Asp Gly Arg Pro Pro Gln Thr Ala Ala 245
Gly Tyr Thr Met His Gln 30
Lys Glu Ser Pro Leu Gln 45
Gly Ser Glu Thr Ser Asp 60
Thr Ala Pro Leu Val Asp 75 80
Gln Pro His Thr Glu Ile
Ile Gly Asp Thr Pro Ser
110
Gln Glu Pro Glu Ser Gly 125
Pro Gly Pro Pro Gly Leu
140
Ala Pro Leu Leu Pro Glu
155 160
Gly Thr Gly Pro Glu Asp
175
Leu Lys His Gln Leu Leu
190
Lys Gly Ala Gly Gly Lys
205
Glu Asp Arg Asp Val Asp
220
Lys Ala Ser Pro Ala Gln
235 240
Glu Ala Thr Ser Ile Pro
255
- 41 047294
Gly Phe Pro Ala Glu Gly Ala
260
Ile
Pro Leu Pro Val Asp Phe Leu
265 270
Lys Val Ser Thr Glu Ile Pro Ala Ser Glu Pro Asp Gly Pro Ser
275 280 285
Gly Arg Ala Lys
290
Gly Gln Asp Ala Pro Leu Glu Phe Thr Phe His
295 300
Glu Ile Thr Pro Asn Val Gln Lys Glu Gln Ala His Ser Glu Glu
305 310 315
Leu Gly Arg Ala Ala Phe Pro Gly Ala Pro Gly Glu Gly Pro Glu
325 330 335
Arg Gly Pro Ser Leu Gly Glu Asp Thr Lys Glu Ala Asp Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Glu Lys Gln Pro Ala Ala Ala Pro Arg Gly Lys Pro Val
355 360 365
Arg Val Pro Gln Leu Lys Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp
370 375 380
Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Thr Ser Thr Arg Ser Ser
385 390 395
Lys Thr Leu Lys Asn Arg Pro Cys Leu Ser Pro Lys His Pro Thr
405 410 415
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ile Gln Pro Ser Ser Pro Ala Val Cys
420 425 430
Glu Pro Pro Ser Ser Pro Lys Tyr Val Ser Ser Val Thr Ser Arg
435 440 445
Gly Ser Ser Gly Ala Lys Glu Met Lys Leu Lys Gly Ala Asp Gly
450 455 460
Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys
465 470 475
Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro
485 490 495
Ser
Val
Val
His 320
Ala
Glu
Ser
Gly
Ala 400
Pro
Pro
Thr
Lys
Gly 480
Lys
- 42 047294
Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys
500 505
Ser Gly Asp Arg Ser Gly
510
Tyr
Ser
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr
515 520 525
Pro
Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val
530 535 540
Val Arg Thr Pro Pro Lys
545 550
Ser Pro Ser Ser Ala Lys
Ser Arg Leu Gln
555
560
Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
565 570
Lys Ser Lys
575
Ile
Gly
Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln
580 585 590
Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly
595 600 605
Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile
610 615 620
Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser
625 630 635 640
Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys
645 650 655
Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser
660 665 670
Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu
675 680 685
Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His
690 695 700
Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser
705 710 715 720
Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
725 730 735
-

Claims (8)

  1. Asp
    Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu
    740 745 750
    Ala Lys Gln Gly Leu 755
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ обнаружения hTau-pT217 в образце пациента, включающий стадии:
    приведения образца пациента в контакт с антителом, которое специфично связывает тау человека, фосфорилированный по треонину по остатку 217 SEQ ID NO: 1 (hTau-pT217);
    приведения образца пациента в контакт со вторым антителом, при этом указанное второе антитело связывается с эпитопной областью hTau-pT217, которая не перекрывается с антителом; и обнаружения связывания указанного антитела с hTau-pT217, при этом второе антитело специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, и при этом второе антитело связывает эпитопную область тау человека, содержащую глутамин по остатку 124 и аланин по остатку 125 SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию количественного определения hTau-pT217 в образце пациента.
  3. 3. Способ диагностики пациента как одного или более из: (i) страдающего нейродегенеративным заболеванием; (ii) подверженного риску нейродегенеративного заболевания; (iii) нуждающегося в лечении нейродегенеративного заболевания; или (iv) нуждающегося в нейрологической визуализации, включающей стадии:
    приведения образца пациента в контакт с антителом, которое специфично связывает hTau-p217;
    приведения образца пациента в контакт со вторым антителом, при этом указанное второе антитело связывается с эпитопной областью hTau-pT217, которая не перекрывается с антителом;
    обнаружения связывания между антителом и hTau-pT217 в образце пациента; и диагностику пациента как одного из: (i) страдающего нейродегенеративным заболеванием; (ii) подверженного риску нейродегенеративного заболевания; (iii) нуждающегося в лечении нейродегенеративного заболевания; или (iv) нуждающегося в нейрологической визуализации, если уровень hTau-pT217, обнаруживаемый в образце пациента, превышает референсный уровень, при этом второе антитело специфично связывает изоформы тау человека, экспрессируемые в ЦНС, и при этом второе антитело связывает эпитопную область тау человека, содержащую глутамин по остатку 124 и аланин по остатку 125 SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Способ по п.3, дополнительно включающий стадию диагностики пациента как страдающего нейродегенеративным заболеванием, при этом нейродегенеративное заболевание представляет собой таупатию.
  5. 5. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанная таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (БА), прогрессирующего супрануклеарного паралича (PSP) и лобно-височной деменции (FTD).
  6. 6. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что образец пациента представляет собой один из образца крови, плазмы, сыворотки или спинномозговой жидкости (CSF).
  7. 7. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что одно из указанного антитела или второго антитела содержит обнаруживаемую метку, и указанная стадия обнаружения содержит обнаружение сигнала, обеспечиваемого обнаруживаемой меткой, при образовании комплекса, содержащего антитело, второе антитело и hTau-pT217.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанное антитело, которое специфично связывает hTau-pT217, содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR содержит участки CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем аминокислотные последовательности CDR выбраны из:
    (a) LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; или (b) LCDR1 имеет аминокислотную последовательность с, по меньшей мере, 95% гомологичностью
    -
EA202192888 2019-05-31 2020-05-22 Соединения и способы нацеливания на тау человека EA047294B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/855,331 2019-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA047294B1 true EA047294B1 (ru) 2024-06-27

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7544911B2 (ja) ヒトタウを標的とする化合物および方法
JP7080899B2 (ja) 同じヒト対象に由来する少なくとも２つの試料に対して早期バイオマーカーを使用する、外傷性脳損傷の超急性の診断及び決定の一助となるための方法
AU2018378971A1 (en) Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (TBI), using glial fibrillary acidic protein (GFAP) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 (UCH-L1)
MXPA03009744A (es) Proceso para el diagnostico diferencial de demencia de alzheimer, y dispositivo para este.
JP2017512056A (ja) ヒト・タウに結合する抗体および該抗体を使用してヒト・タウを定量するためのアッセイ
JP5415946B2 (ja) 新規な動脈硬化性疾患マーカー
CN102713633A (zh) 用于β-淀粉样肽的改进检测的方法和试剂
JP2021517239A (ja) 神経変性を検出するためのアッセイ
JP2022513481A (ja) 抗アルファ－シヌクレイン抗体およびその使用
JP7554305B2 (ja) インターロイキン－１９を標的とする化合物および方法
JP2022547993A (ja) 診断のための新規分子
JP2019528239A (ja) 変形性関節症を診断するためのコムペプチドおよびそれに対する抗体
JP5924752B2 (ja) 抗汗抗原モノクローナル抗体
WO2007055340A1 (ja) Ｐｔｘ３高感度測定法
JP7036751B2 (ja) アポトーシスのモニタリングのための、ガンマ－グルタミル－ｌ－イプシロン－リジンに特異的なモノクローナル抗体
EA047294B1 (ru) Соединения и способы нацеливания на тау человека
US20220260593A1 (en) Targets and methods of diagnosing, monitoring and treating frontotemporal dementia
TW202217316A (zh) 用於偵測ｔａｕ蛋白病或類澱粉蛋白生成疾病的基於血液之檢定
JP2014122788A (ja) アルカデインペプチド切断物による認知症又はアルツハイマー病の診断方法又は予後予測方法
EA045911B1 (ru) АНТИТЕЛА К ПИРОГЛУТАМАТ-β-АМИЛОИДУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
JPWO2012032766A1 (ja) 血中可溶型ｇｐｖｉを用いたアルツハイマー病の診断方法