EA045950B1 - Модифицированные фитазы - Google Patents
Модифицированные фитазы Download PDFInfo
- Publication number
- EA045950B1 EA045950B1 EA202092569 EA045950B1 EA 045950 B1 EA045950 B1 EA 045950B1 EA 202092569 EA202092569 EA 202092569 EA 045950 B1 EA045950 B1 EA 045950B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid residue
- residue corresponding
- phytase
- Prior art date
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 claims description 199
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims description 195
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 117
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 100
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 26
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 26
- 102200090690 rs137852487 Human genes 0.000 claims description 21
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- 102220047503 rs587776496 Human genes 0.000 claims description 15
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 14
- 102220634429 Vacuolar protein-sorting-associated protein 36_K75Q_mutation Human genes 0.000 claims description 13
- 102220265087 rs1554817350 Human genes 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 102220635377 ATPase PAAT_T114N_mutation Human genes 0.000 claims description 6
- 102220498086 Lipoma-preferred partner_K75T_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 4
- 102220518102 DNA-directed RNA polymerases I and III subunit RPAC2_A73R_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 102220474981 Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic_Q79A_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 102220493247 Syntaxin-binding protein 1_S80P_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 3
- 102200155746 rs121918466 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102220578642 Chorion-specific transcription factor GCMb_K74M_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 102220473693 DNA repair protein RAD50_Q79L_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220608819 Huntingtin-associated protein 1_W37F_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 102220567353 Ornithine decarboxylase antizyme 1_K74D_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220643165 Polycystic kidney disease 2-like 1 protein_T39E_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102220100737 rs141577476 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220330190 rs1555797038 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220244365 rs561539546 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220261566 rs745740862 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220028975 rs398123345 Human genes 0.000 claims 1
- 102220115315 rs886039750 Human genes 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 42
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 6
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 6
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102220238200 rs1238996324 Human genes 0.000 description 2
- 102220045254 rs374739820 Human genes 0.000 description 2
- 102220045877 rs587782465 Human genes 0.000 description 2
- 102220320171 rs780178572 Human genes 0.000 description 2
- 102220240613 rs895976430 Human genes 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical group SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001006370 Actinobacillus suis Hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241001480566 Buttiauxella sp. Species 0.000 description 1
- -1 Ca 2+ Chemical class 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000580513 Citrobacter braakii Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000688187 Escherichia coli (strain K12) Phytase AppA Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102220594412 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain_A73E_mutation Human genes 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010011035 endodeoxyribonuclease DpnI Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000004318 erythorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 150000004001 inositols Chemical class 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 102220332475 rs1554776686 Human genes 0.000 description 1
- 102220122073 rs201643277 Human genes 0.000 description 1
- 102220059496 rs370769989 Human genes 0.000 description 1
- 102220278794 rs773109986 Human genes 0.000 description 1
- 102220097739 rs876659588 Human genes 0.000 description 1
- 102220103944 rs878854923 Human genes 0.000 description 1
- 102200128137 rs9905402 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к отрасли белковой инженерии, а именно к фитазе грамотрицательных бактерий, в частности к фитазе кишечной палочки, термостабильность которой повышается после введения одной либо нескольких дисульфидных связей.
Предыдущий уровень техники
Фитаза (Phytase), или мио-инозитол-гексафосфат-фосфогидролаза (myo-Inositol hexakisphosphate phosphohydrolase), относится к ортофосфорной-моноэфир фосфогидролазе, катализирует гидролиз фитиновой кислоты с образованием менее фосфорилированных производных инозитола и неорганического фосфата, в некоторых случаях может гидролизировать фитиновую кислоту до свободного инозитола. Фитиновая кислота в наибольших количествах присутствует в семенах зерновых культур, бобовых и маслосемян, где ее содержание может достигать 1-3%, что составляет 60-80% от общего количества фосфора растения, однако содержащийся в фитиновой кислоте фосфор не может усваиваться напрямую, требуя предварительного гидролиза в желудочно-кишечном тракте для высвобождения неорганического фосфата. Исследования показали, что моногастричные животные (свиньи, курицы, утки, гуси и пр.) ввиду недостатка фитазы очень слабо усваивают содержащийся в фитиновой кислоте фосфор. В то же время мощная электроотрицательность фитиновой кислоты приводит к тому, что ее соединение с двухвалентными или трехвалентными катионами, такими как Са2+, Zn2+, Fe2++ и пр., образует нерастворимые соли, препятствующие усвоению минеральных веществ в тонкой кишке. Помимо этого с белками, аминокислотами и жирными кислотами она образует комплексные соединения, оказывающие влияние на их усвоение, а ее комплексные соединения с пепсином, химотрипсином и трипсином снижают активность пищеварительных ферментов. Таким образом, добавление фитазы в корма для моногастричных животных способно повысить усваиваемость содержащегося в кормах фосфора, понизить содержание фосфора в экскрементах животных, а также повысить усвоение белков и энергетической ценности кормов.
Фитаза выступает в качестве добавки для кормов, предварительно добавляется в кормовое сырье, проходит высокотемпературную обработку (70-95°, время обработки 30-120 с), после чего полученный корм используется для кормления животных. В связи с этим для повышения эффективности фитазы необходимо повысить ее устойчивость к относительно высоким температурам, другими словами, добиться ее высокой термостабильности. Г лавными источниками фитазы для коммерческого использования являются Aspergillus niger (согласно описанию US 5436156), кишечная палочка (Escherichia coli, согласно описанию US 7432098), цитробактер (Citrobacter braakii, согласно описанию US 20100261259), бруцелла (Buttiauxella sp., согласно описанию US 8143046) и пр. Ввиду того, что данные фитазы происходят из разных источников, они обладают различными характеристиками устойчивости к температуре и кислоте. Нильсон (Nielsen) и др. провели сравнение характеристик фитаз для коммерческого использования (J Agric Food Chem. 2015, 63 (3): 943-50), по результатам которого наилучшие характеристики продемонстрировала фитаза, полученная из кишечной палочки. Описанный в тексте продукт фитазы кишечной палочки является мутантным, модифицированным с помощью белковой инженерии, и обладает более высокой термостабильностью. US 8540984, US 9765313, US 7432098 и US 8877478 описывают мутантную фитазу с улучшенной термостабильностью, полученную в результате отбора после случайного или сайтспецифического мутагенеза фитазы кишечной палочки, а в заявках на патенты US 20130017185 и US 20170240872 упоминается возможность повышения термостабильности фитазы путем введения в третичную структуру белка фитазы кишечной палочки определенных дисульфидных связей.
В данной отрасли есть необходимость представить больше типов термостабильной фитазы.
Содержание изобретения
Автор настоящего изобретения обнаружил, что достичь цели по улучшению термостабильности фитазы можно путем введения одной или нескольких дисульфидных связей в определенные положения последовательности аминокислот фитазы кишечной палочки дикого типа (например, фитазы, последовательность которой более чем на 85% идентична последовательности фитазы кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1) или мутантной фитазы кишечной палочки (например, фитазы, последовательность которой более чем на 75% идентична последовательности мутантной фитазы кишечной палочки, описанной в SEQ ID NO: 2).
В некоторых вариантах осуществления в определенные положения последовательности аминокислот мутантной фитазы кишечной палочки, последовательность которой более чем на 85% идентична фитазе кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1, вводится одна или несколько дисульфидных связей, представленных в табл. 1. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления в определенные положения последовательности аминокислот фитазы кишечной палочки, последовательность которой более чем на 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% либо 99% идентична фитазе кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO:1, вводится одна или несколько дисульфидных связей, представленных в табл. 1.
В других вариантах осуществления в определенные положения последовательности аминокислот мутантной фитазы кишечной палочки, последовательность которой более чем на 75% идентична фитазе кишечной палочки мутированного типа, описанной в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:79 либо SEQ ID NO:99, вводится одна или несколько дисульфидных связей, представленных в табл. 1. В некото
- 1 045950 рых предпочтительных вариантах осуществления в определенные положения последовательности аминокислот мутантной фитазы кишечной палочки, последовательность которой более чем на 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична фитазе кишечной палочки мутированного типа, описанной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99, вводится одна или несколько дисульфидных связей, представленных в табл.1.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации, по меньшей мере, в одном из положений по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: 1, 25, 30, 36, 37, 38, 39, 46, 55, 60, 62, 65, 69, 70, 73, 74, 75, 76,
77, 79, 80, 85, 101, 108, 109, 111, 114, 116, 118, 120, 123, 126, 127, 133, 137, 138, 139, 141, 142, 146,151,
157, 159, 161, 173, 176, 178, 180, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 204, 211, 233, 235, 245, 253, 255,267,
276, 282, 283, 284, 286, 287, 288, 291, 295, 297, 311, 315, 317, 318, 327, 341, 354, 363, 367, 369, 370,380,
382, 383, 385, 391, 402, 408. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации по меньшей мере в одном из положений по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: 25, 46, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 114, 137, 142, 146, 159, 173, 204, 255, 282, 283, 284. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации по меньшей мере в одном из положений по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO:1: 25, 46, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 114, 137, 142, 146, 159, 173, 204, 255.
В некоторых конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации в следующих положениях по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: 46, 62, 73, 75, 146, 159, 204, 255. В некоторых других конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации в следующих положениях по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: 25, 46, 62, 70, 73, 75, 114, 137, 142, 146, 159, 255. В некоторых конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации в следующих положениях по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1,: 46, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 146, 159, 173, 255, 282, 283, 284. В некоторых других конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет мутации в следующих положениях по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO:1: 25, 46, 62, 70, 73, 74, 75, 114, 137, 142, 146, 159, 173, 255, 282, 283, 284.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет, по меньшей мере, одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: Q1S, Q1V, Q1N, A25F, Q30K, А36К, W37F, P38Y, T39D, W46E, I55V, H60S, H60Q, Q62W, R65H, D69N, G70E, А73Р, A73D, А73Е, K74D, К74Р, K74L, K74N, К75С, K75Q, G76T, С77А, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, S80P, I85V, A101L, С108А, A109D, А109Е, A109G, A109F, А109Р, THIS, T111D, T111Q, T114H, T116A, T118R, T118S, S120R, P123E, N126Y, P127V, P127L, C133A, N137V, N137E, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A,
N139H, T141R, T141E, T141G, T141A, D142R, S146E, S146R, S151P, G157R, G157Q, G157N, G157L,
G157A, R159Y, T161P, P173Y, P173S, N176P, N176K, C178A, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V,
E186A, S187P, C188A, S189T, N204C, V211W, G233E, G235Y, T245E, Q253V, Y255D, R267A, H282N,
P283G, P284T, K286F, Q287Y, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297T, G311S, E315G, E315S, N317L, W318Y, T327Y, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, S367F, N369P, T370P, A380P, A380R, A380T, C382A, E383S, R385S, R385V, R385T, C391A, E402R, E402T, E402D, E402P, E402N, C408A. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет, по меньшей мере, одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, К75С, K75Q, G76T, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, N204C, Y255D, H282N, P283G, Р284Т. В некоторых еще более предпочтительных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет по меньшей мере одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, К75С, K75Q, G76T, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, N204C, Y255D.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет, по меньшей мере, одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: W46E, Q62W, А73Р, К75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D. В некоторых других вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет, по меньшей мере, одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет по меньшей мере одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т. В некоторых других вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет по
- 2 045950 меньшей мере одну из следующих модификаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
В некоторых конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет следующие модификации по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: W46E, Q62W, А73Р, К75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D. В некоторых других конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет следующие модификации по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D. В некоторых конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет следующие модификации по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т. В некоторых других конкретных вариантах осуществления вышеуказанная фитаза кишечной палочки мутированного типа имеет следующие модификации по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1: A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
Говоря конкретно, автор настоящего изобретения обнаружил, что введение в последовательность фитазы кишечной палочки дикого типа, описанной в SEQ ID NO: 1, или последовательность фитаз кишечной палочки мутированных типов, описанных в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99, одной или нескольких дисульфидных связей, представленных в табл. 1, позволяет повысить ее термостабильность.
Таблица 1. Наименования и положения дисульфидных связей (нумерация положений аминокислот приведена в соответствии с нумерацией положений аминокислот SEQ ID NO: 1)
| Наименование | Положение |
| А | P34/Q174 |
| В | A56/G103 |
| С | Y57/L366 |
| D | Y61/L366 |
| Е | Q82/S296 |
| F | L128/D203 |
| G | V140/E262 |
| Н | Т156/Т191 |
| I | Е165/Т245 |
| J | Т191/А210 |
| К | S196/V211 |
| L | A264/G312 |
| М | Е315/А380 |
| N | G322/T356 |
| О | Q346/L393 |
| Р | Q349/M390 |
В некоторых вариантах осуществления вводимые в фитазу кишечной палочки дикого либо мутированного типов одна либо несколько дисульфидных связей должны выбираться, по меньшей мере, из одного из вышеуказанных (А), (В), (С), (D), (E), (J), (М) или (О), при этом (С) и (D) не должны выполняться одновременно.
В некоторых вариантах осуществления вводимая в фитазу кишечной палочки дикого либо мутированного типов одна дисульфидная связь должна выбираться из вышеуказанных (А), (В), (С), (D), (E), (J), (M) или (О).
В некоторых вариантах осуществления при введении в фитазу кишечной палочки дикого либо мутированного типов одновременно нескольких дисульфидных связей предпочтительно одновременное введение дисульфидных связей, указанных в (В)+(О), (с)+(О), (М)+(О), (B)+(D)+(O) или (D)+(M)+(O); еще более предпочтительно одновременное введение дисульфидных связей, указанных в (В)+(О) или (С)+(О).
Для целей настоящего изобретения понятие введение дисульфидных связей никоим образом не ограничивает способ их образования. К примеру, под введением дисульфидных связей может подразумеваться замена аминокислотных остатков в соответствующих положениях в последовательности фитазы, куда вводятся дисульфидные связи, на аминокислотные остатки, способные образовать дисульфидные связи (включая, к примеру, цистеиновые остатки Cys, гомоцистеиновые остатки Нсу и пр.); либо
- 3 045950 введение в соответствующем положении аминокислотных остатков, способных образовывать дисульфидные связи. Такая замена и/или введение может производиться, к примеру, общеизвестным в данной области методом сайт-направленного мутагенеза. Термин введение также включает образование вышеуказанных дисульфидных связей в результате естественной мутации одного либо нескольких аминокислотных остатков.
Для получения таких рекомбинантных мутантных образцов в качестве организма-носителя для экспрессии могут применяться бактерии, такие как кишечная палочка (Escherichia coli), грибы, такие как дрожжи (Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и пр.), мицелиальные грибы (такие как Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei и пр.), а также растения (такие как кукуруза, соевые бобы, пшеница и пр.).
Экспрессия и получение вышеописанных мутантных образцов могут быть реализованы уже известными техническими методами. В журнале Applied and Environmental Microbiology (2004, 3041-3046) описана экспрессия фитазы кишечной палочки и ее мутантного образца в кишечной палочке, в журнале Journal of Biotechnology 175 (2014, 1-6) описана экспрессия фитазы кишечной палочки и ее мутантного образца в Pichia, в патенте CN107353327 описана экспрессия фитазы и ее мутантного образца в Aspergillus niger.
Для получения вышеописанных мутаций возможно применение общепринятого сайтнаправленного мутагенеза к нуклеотидной последовательности образца дикого типа, также допустим синтез генов de novo. Активаторы и терминаторы вводятся в клетку организма-носителя, при благоприятных условиях культивирования происходит экспрессия. Вышеописанный метод является распространенным в данной области.
Под фитазой дикого типа понимается микроорганизм, существующий в естественных условиях, например, обнаруженная в естественной среде фитаза, экспрессирующая в клетке кишечной палочки.
Под мутантной либо мутированного типа понимается мутация одного или многих (нескольких) аминокислотных остатков с ферментативной активностью фитазы в одном или многих (нескольких) положениях, то есть замены, инерции и/или делеции полипептида. Под заменой подразумевается использование вместо одной аминокислоты в определенном положении другой аминокислоты; под делецией подразумевается исключение аминокислоты в определенном положении; под инерцией подразумевается добавление 1-5 аминокислот в соседнее положение к аминокислоте в определенном положении. Мутация фитазы дикого типа также подразумевает замену, инерцию либо делецию аминокислоты, по меньшей мере, в одном положении, предпочтительно произведение замены аминокислоты, по меньшей мере, в одном положении, как например, A25F, замена аланина в положении 25 фитазы дикого типа на фенилаланин.
Под (В)+(О), В+О либо п. (В) + п. (О) понимается модификация фитазы дикого либо мутированного типа путем введения двух дисульфидных связей, а именно образование одной дисульфидной связи между двумя положениями, описанными в пункте (В), и второй - между двумя положениями, описанными в пункте (О). Аналогичную интерпретацию имеет описание в изобретении пунктов со знаком +: п. (С) + п. (О), п. (М) + п. (О), п. (В) + п. (D) + п. (О) и п. (D) + п. (М) + п. (О).
Под определением идентичность последовательности подразумевается сравнение последовательностей и, в случае необходимости, восполнение недостающей последовательности с целью достижения максимального процента совпадения последовательностей при условии, что никакие консервативные замены не рассматриваются в качестве совпадающей части последовательности, и процентное соотношение аминокислотных остатков в полученной последовательности совпадает с аминокислотным остатком определенной пептидной или полипептидной последовательности. Сравнение последовательностей и измерение процентного совпадения аминокислотных последовательностей могут осуществляться множеством способов в пределах данной технической области, к примеру, с помощью общедоступных программных продуктов BLAST, BLAST-2, ALIGN либо Megalign (DNASTAR). Технический персонал данной области может определить подходящие параметры измеряемых соотношений, в том числе любые алгоритмы расчетов, необходимые для получения максимального процентного соотношения всей длины сравниваемых последовательностей.
Основываясь на данном открытии, настоящая заявка предлагает следующие технические решения.
1. Термостабильная фитаза, отличающаяся тем, что в последовательность аминокислот фитазы Escherichia coli (кишечной палочки) дикого либо мутированного типа вводится по меньшей мере одна введенная дисульфидная связь; последовательность аминокислот фитазы кишечной палочки дикого типа представлена в SEQ ID NO: 1; фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит мутацию, по меньшей мере, в одном положении по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1; при этом, а введенная дисульфидная связь выбрана из следующих:
(A) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 34 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 174 в SEQ ID NO: 1;
(B) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 56 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 103 в SEQ ID NO: 1;
- 4 045950 (C) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 57 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 366 в SEQ ID NO: 1;
(D) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 61 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 366 в SEQ ID NO: 1;
(E) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 82 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 296 в SEQ ID NO: 1;
(F) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 128 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 203 в SEQ ID NO: 1;
(G) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 140 в SEQ ID NO:1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 262 в SEQ ID NO:1;
(Н) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 156 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 191 в SEQ ID NO: 1;
(I) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 165 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 245 в SEQ ID NO: 1;
(J) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 191 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 210 в SEQ ID NO: 1;
(K) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 196 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 211 в SEQ ID NO: 1;
(L) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 264 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 312 в SEQ ID NO: 1;
(М) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 315 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 380 в SEQ ID NO: 1;
(N) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 322 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 356 в SEQ ID NO: 1;
(О) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 346 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 393 в SEQ ID NO: 1;
(Р) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 349 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 390 в SEQ ID NO: 1;
при условии, что пункты (С) и (D) не выполняются одновременно;
пункты (Н) и (J) не выполняются одновременно.
2. Термостабильная фитаза по п.1, при этом фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит мутацию, по меньшей мере, в одном из следующих положений по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1: 1, 25, 30, 36, 37, 38, 39, 46, 55, 60, 62, 65, 69, 70,
73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 85, 101, 108, 109, 111, 114, 116, 118, 120, 123, 126, 127, 133, 137, 138, 139,141,
142, 146, 151, 157, 159, 161, 173, 176, 178, 180, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 204, 211, 233, 235,245,
253, 255, 267, 276, 282, 283, 284, 286, 287, 288, 291, 295, 297, 311, 315, 317, 318, 327, 341, 354, 363,367,
369, 370, 380, 382, 383, 385, 391, 402, 408.
3. Термостабильная фитаза по п.2, при этом фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит, по меньшей мере, одну из следующих мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1: Q1S, Q1V, Q1N, A25F, Q30K, А36К, W37F, P38Y, T39D, W46E, I55V, H60S, H60Q, Q62W, R65H, D69N, G70E, А73Р, A73D, А73Е, K74D, К74Р, K74L, K74N, К75С, K75Q, G76T, С77А, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, S80P, I85V, A101L, d08A, A109D, А109Е, A109G, A109F, А109Р, THIS, T111D, T111Q, T114H, T116A, T118R, T118S, S120R, P123E, N126Y, P127V, P127L, С133А, N137V, N137E, N137S, N137P, A138V, А138Н, A138D, А138Р, N139P, N139A, N139H, T141R,
Т141Е, T141G, Т141А, D142R, S146E, S146R, S151P, G157R, G157Q, G157N, G157L, G157A, R159Y,
Т161Р, P173Y, P173S, N176P, N176K, С178А, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, Е186А, S187P, С188А, S189T, N204C, V211W, G233E, G235Y, Т245Е, Q253V, Y255D, R267A, H282N, P283G, Р284Т, K286F, Q287Y, А288Е, A288R, A288V, V291I, T295I, V297T, G311S, E315G, E315S, N317L, W318Y,
T327Y, L341Y, L341V, F354Y, К363А, K363L, S367F, N369P, Т370Р, А380Р, A380R, А380Т, С382А,
E383S, R385S, R385V, R385T, С391А, E402R, Е402Т, E402D, Е402Р, E402N, С408А.
4. Термостабильная фитаза по п.3, при этом фитаза кишечной палочки мутированного типа содер
- 5 045950 жит любую из следующих комбинаций мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1:
W46E, Q62W, А73Р, К75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D;
A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D;
W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т; и
A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
5. Термостабильная фитаза по п.4, при этом фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит любую из следующих комбинаций мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1:
W46E, Q62W, А73Р, К75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D;
A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D и W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
6. Термостабильная фитаза по п.3, при этом последовательность аминокислот фитазы кишечной палочки мутированного типа представлена в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99.
7. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-6, при этом дисульфидная связь выбрана по меньшей мере из одной из (А), (В), (С), (D), (E), (J), (М) либо (О), при условии, что (С) и (D) не выполняются од новременно.
8. Термостабильная фитаза по п.7, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет не менее чем двум или трем из следующих пунктов: (А), (В), (С), (D), (Е), (J), (M) и (О), при условии, что (С) и (D) не выполняются одновременно.
9. Термостабильная фитаза по п.7, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (А), (В), (С), (Е), (J) или (М).
10. Термостабильная фитаза по п.7, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет, по меньшей мере, пункту (D) или пункту (О).
11. Термостабильная фитаза по п.10, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пункту (D).
12. Термостабильная фитаза по п.10, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пункту (О).
13. Термостабильная фитаза по п.7, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В) и (О); (С) и (О); (D) и (О); (М) и (О); (В), (D) и (О); или (D), (М) и (О).
14. Термостабильная фитаза по п.13, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В) и (О).
15. Термостабильная фитаза по п.13, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (С) и (О).
16. Термостабильная фитаза по п.13, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (М) и (О).
17. Термостабильная фитаза по п.13, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В), (D) и (О).
18. Термостабильная фитаза по п.13, при этом последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (D), (М) и (О).
19. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-18, содержащая по меньшей мере одну введенную дисульфидную связь, при этом дисульфидная связь выбрана из следующих:
(i) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 31 в SEQ ID NO:1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 176 в SEQ ID NO: 1;
(ii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 31 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 177 в SEQ ID NO: 1;
(iii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 52 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 99 в SEQ ID NO: 1;
(iv) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 59 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 100 в SEQ ID NO: 1;
(v) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 91 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 46 в SEQ ID NO: 1;
(vi) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 141 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 200 в SEQ ID NO: 1;
(vii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 162 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 248 в SEQ ID NO: 1;
(viii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим поло
- 6 045950 жению 205 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 257 в SEQ ID NO: 1;
при условии, что пункты (i) и (ii) не выполняются одновременно.
20. Термостабильная фитаза по п.1, при этом термостабильная фитаза включает любую из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NOs: 4-40, SEQ ID NOs: 80-88 и SEQ ID NOs: 100108.
21. Термостабильная фитаза по любому из предыдущих пунктов, при этом термостабильная фитаза получена из Pichia либо Aspergillus niger посредством гетерологической экспрессии.
22. Термостабильная фитаза по любому из предыдущих пунктов, при этом аминокислотные остатки, способные к формированию дисульфидных связей, являются цистеиновыми либо гомоцистеиновыми остатками.
23. Пполинуклеотид, кодирующий термостабильную фитазу по любму из пп.1-22.
24. Полинуклеотид по п.23, кодирующий последовательность которого кодон-оптимизирована для экспрессии в Pichia либо Aspergillus niger.
25. Полинуклеотид по п.23, включающий любую из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NOs: 41-77, SEQ ID NOs: 90-98 и SEQ ID NOs: 110-118.
26. Клетка организма-носителя, включающая полинуклеотид по любому из пп.23-25.
27. Клетка организма-носителя по п.26, при этом данная клетка организма-носителя является грибковой, бактериальной либо растительной клеткой.
28. Клетка организма-носителя по п.27, при этом данная клетка является дрожжевой клеткой либо клеткой мицелиальных грибов.
29. Клетка организма-носителя по п.28, при этом данная клетка является клеткой Pichia либо Aspergillus niger.
30. Способ повышения термостабильности фитазы, включающий модификацию последовательности аминокислот либо кодирующей нуклеотидной последовательности в интересующей фитазе, в результате чего из выбранной последовательности аминокислот фитазы по меньшей мере в одном из следующих пунктов (А)-(Р) может образоваться дисульфидная связь между аминокислотными остатками в двух положениях:
(A) положение, соответствующее положению 34 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 174 в SEQ ID NO: 1;
(B) положение, соответствующее положению 56 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 103 в SEQ ID NO: 1;
(C) положение, соответствующее положению 57 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 366 в SEQ ID NO: 1;
(D) положение, соответствующее положению 61 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 366 в SEQ ID NO: 1;
(E) положение, соответствующее положению 82 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 296 в SEQ ID NO: 1;
(F) положение, соответствующее положению 128 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 203 в SEQ ID NO: 1;
(G) положение, соответствующее положению 140 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 262 в SEQ ID NO: 1;
(Н) положение, соответствующее положению 156 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 191 в SEQ ID NO: 1;
(I) положение, соответствующее положению 165 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 245 в SEQ ID NO: 1;
(J) положение, соответствующее положению 191 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 210 в SEQ ID NO: 1;
(K) положение, соответствующее положению 196 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 211 в SEQ ID NO: 1;
(L) положение, соответствующее положению 264 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 312 в SEQ ID NO: 1;
(М) положение, соответствующее положению 315 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 380 в SEQ ID NO: 1;
(N) положение, соответствующее положению 322 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 356 в SEQ ID NO: 1;
(О) положение, соответствующее положению 346 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 393 в SEQ ID NO: 1;
(Р) положение, соответствующее положению 349 в SEQ ID NO: 1, и положение, соответствующее положению 390 в SEQ ID NO: 1;
при условии, что пункты (С) и (D) не выбираются одновременно;
- 7 045950 пункты (Н) и (J) не выбираются одновременно.
31. Способ по п.30, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в интересующей фитазе по меньшей мере в одном из пунктов (А), (В), (С), (D), (E), (J), (M) или (О) может образоваться дисульфидная связь между аминокислотными остатками в двух положениях, при условии что (С) и (D) не выбираются одновременно.
32. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из выбранных из последовательности аминокислот в более двух, трех пунктах из: (А), (В), (С), (D), (E), (J), (М) и (О), может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях, при условии что (С) и (D) не выбираются одновременно.
33. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (А), (В), (С), (Е), (J) или (М) может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
34. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот, по меньшей мере, в (D) или (О) может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
35. Способ по п.34, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (D) может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
36. Способ по п.34, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (О) может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
37. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (В) и (О) по отдельности может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
38. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (С) и (О) по отдельности может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
39. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (М) и (О) по отдельности может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
40. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (В), (D) и (О) по отдельности может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
41. Способ по п.31, при этом модификация приводит к тому, что из последовательности аминокислот в (D), (М) и (О) по отдельности может образоваться дисульфидная связь между остатками аминокислот в двух положениях.
42. Способ по любому из пп.30-41, при этом интересующая фитаза получена из кишечной палочки, а также имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере, на 75% идентичную последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99.
43. Способ по п.42, при этом интересующая фитаза является фитазой кишечной палочки дикого типа и предпочтительно имеет последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1.
44. Способ по п.42, при этом интересующая фитаза является фитазой кишечной палочки мутированного типа и предпочтительно имеет последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99.
45. Способ по любому из пп.30-44, при этом модифицированная фитаза включает последовательность аминокислот, выбранную из следующих комбинаций, либо ее кодирующая нуклеиновая кислота включает код, выбранный из нуклеотидных последовательностей следующих последовательностей аминокислот: SEQ ID NOs: 4-40, SEQ ID NOs: 80-88 и SEQ ID NOs: 100-108.
46. Способ по любому из пп.30-45, при этом данный способ включает в себя получение фитазы с модифицированной последовательностью аминокислот, а также ее размещение в среде, допускающей образование дисульфидных связей.
47. Способ по п.46, при этом получаемая фитаза с модифицированной последовательностью аминокислот включает экспрессию кодирующего данную фитазу полинуклеотида в клетке организманосителя.
48. Способ по п.47, при этом клетка организма-носителя является грибковой клеткой, предпочтительно дрожжевой клеткой либо клеткой мицелиальных грибов, наиболее предпочтительно клеткой Pichia либо Aspergillus niger.
Полезный эффект настоящего изобретения
Настоящее изобретение предлагает введение в фитазу либо ее мутантную форму одной или нескольких дисульфидных связей, в частности нескольких дисульфидных связей одновременно.
Настоящее изобретение заключается в введении в фитазу дикого либо мутированного типа по меньшей мере одной дисульфидной связи, что приводит к повышению остаточной активности в 2-9 раз по сравнению с фитазой дикого типа. Таким образом, техническое решение настоящего изобретения по
- 8 045950 зволяет повысить ферментативную активность фитазы, особенно в отношении термостабильности, стабильности при выпаривании и гранулировании, которые значительно превосходят характеристики существующих на сегодняшний день фитаз дикого либо мутированного типов; характеристика ее термостабильности значительно превышает в том числе и термостабильность существующих на сегодняшний день модифицированных образцов с введенной дисульфидной связью.
Описание изображений
Фиг. 1 - плазмидный профиль pPIC9K-WT;
фиг. 2 - сравнение результатов измерения термостабильности образцов дикого типа и мутантного типа, модифицированного путем введения дисульфидной связи.
фиг. 3 - сравнение результатов измерения термостабильности образцов АРРА-М1 и мутантного типа.
фиг. 4 - сравнение результатов измерения термостабильности образцов APPAan-WT и мутантного типа.
фиг. 5 - сравнение результатов измерения термостабильности образцов АРРА-М2 и мутантного типа.
Конкретные варианты осуществления
Вариант осуществления 1. Создание мутантной формы с введением дисульфидной связи, экспрессия в Pichia образцов дикого и мутированного типов.
Имеется публикация 3D структуры фитазы кишечной палочки (см. Lim D et al., Nat Struct Biol. 2000, 7(2): 108-13). На основании 3D структуры, описанной в документе PDB ID 1DKO, проект предлагает введение следующих дисульфидных связей.
| Наименование | Положение |
| А | P34C/Q174C |
| В | A56C/G103C |
| С | Y57C/L366C |
| D | Y61C/L366C |
| Е | Q82C/S296C |
| F | L128C/D203C |
| G | V140C/E262C |
| Н | Т156С/Т191С |
| I | Е165С/Т245С |
| J | Т191С/А210С |
| К | S196C/V211C |
| L | A264C/G312C |
| М | Е315С/А380С |
| N | G322C/T356C |
| О | Q346C/L393C |
| Р | Q349C/M390C |
| Q | T33C/L170C |
| R | I55C/A99C |
| S | A268C/N309C |
| т | I85C/G97C |
| и | Р123С/Т130С |
| V | А226С/М360С |
| W | W243C/P324C |
| X | W347C/M390C |
| Y | I348C/F396C |
Последовательность аминокислот в фитазе дикого типа представлена в SEQ ID NO: 1, нуклеотидная последовательность экспрессии в Pichia представлена в SEQ ID NO: 78. В качестве вектора экспрессии выступает pPIC9K, в качестве сигнального пептида используется альфа-фактор Saccharomyces cerevisiae, экспрессионная плазмида фитазы дикого типа pPIC9K-WT показана на фиг. 1.
В целях создания указанных в приведенной выше таблице мутантных форм были по отдельности сконструированы праймеры для ПЦР, представленные в таблице ниже.
- 9 045950
| Наименование дисульфидной связи | Положение дисульфидной связи | Праймер |
| А | P34C/Q174C | А-Fl GATGTCACCtgtGACGCTTGGCCAACCTGGA- F2 AACTTCCCAtgtTCAAACTTGTGCTTGAAG A-Rl CCAAGCGTCacaGGTGACATCTTGCATAAG A-R2 CAAGTTTGAacaTGGGAAGTTAAGAACTCT |
| В | A56C/G103C | В-Fl GAGCTCATTtgtTACTTGGGTCACTACCAA B-F2 TTCGCCGCCtgtCTTGCTCCTGACTGTGCC B-Rl ACCCAAGTAacaAATGAGCTCACCACCTCT B-R2 AGGAGCAAGacaGGCGGCGAAGGCTTCACC |
| С | T57C/L366C | С-Fl CTCATTGCTtgtTTGGGTCACTACCAAAGAC- F2 AAGACTCCAtgtTCTTTGAACACGCCTCCA C-R1 GTGACCC AAacaAGCAATGAGCTCACCACC C-R2 GTTCAAAGAacaTGGAGTCTTGTCTCTCAT |
| D | T61C/L366C | D-Fl TTGGGTCACtgtCAAAGACAGCGTCTTGTT D-F2 AAGACTCCAtgtTCTTTGAACACGCCTCCA D-Rl CTGTCTttgacaGTGACCCAAGTAAGCAAT |
| D-R2 GTTCAAAGAacaTGGAGTCTTGTCTCTCAT | ||
| Е | Q82C/S296C | E-F1 CAATCTGGTtgtGTAGCTATTATTGCTGAC E-F2 TTGCCCACTtgtGTCTTGTTCATTGCCGGT E-R1 AATAGCTACacaACCAGATTGTGGACAACC E-R2 GAACAAGACacaAGTGGGCAAGGTAACACC |
| F | L128C/D203C | F-Fl TTCAACCCTtgtAAGACTGGTGTTTGCCA F-F2 GTCTCCGCCtgtAACGTCTCTTTGACCGGTF-Rl ACCAGTCTTacaAGGGTTGAACAATGGATC F-R2 AGAGACGTTacaGGCGGAGACCTTCAACTC |
| G | V140C/E262C | G-Fl aacGCTAACtgtACTGACGCTATCTTGTCC G-F2 AGAACTCCAtgtGTTGCTAGATCCAGAGCC G-Rl AGCGTCAGTacaGTTAGCGTTGTCCAATTG G-R2 TCTAGCAAcacATGGAGTTCTCTGCAGCAA |
| Н | Т156С/Т191С | Η-Fl GCTGACTTCtgtGGTCACAGACAGACTGCC H-F2 TGTTCCTTGtgtCAAGCATTACCATCTGAGH- R1 tctGTGACCacaGAAGTCAGCAATGGATCC H-R2 TAATGCTTGacaCAAGGAACAGGATTCGTC |
| I | Е165С/Т245С | I-Fl GCCTTCAGAtgtTTGGAAAGAGTTCTTAAC I-F2 CAATGGAACtgtTTGTTGTCCTTGCACAAC I-Rl TCTTTCCAAacaTCTGAAGGCAGTCTGTCT I-R2 GGACAACAAacaGTTCCATTGGTGAGAGTC |
| J | Т191С/А210С | J-Fl TGTTCCTTGtgtCAAGCATTACCATCTGAG J-F2 TTGACCGGTtgtGTCAGCTTGGCTTCCATG J-Rl TAATGCTTGacaCAAGGAACAGGATTCGTC J-R2 |
- 10 045950
| CAAGCTGACacaACCGGTCAAAGAGACGT | ||
| к | S196C/V211C | К-Fl GCATTACCAtgtGAGTTGAAGGTCTCCGCC K-F2 ACCGGTGCTtgtAGCTTGGCTTCCATGTTG K-Rl CTTCAACTCacaTGGTAATGCTTGAGTCAA K-R2 AGCCAAGCTacaAGCACCGGTCAAAGAGAC |
| L | A264C/G312C | L-F1 CC AGAGgTTtgtAGATCCAGAGCC ACCCCA L-F2 AATCTCGGCtgtGCTTTGGAGTTGAACTGG L-Rl TCTGGATCTacaAAcCTCTGGAGTTCTCTG L-R2 CTCCAAAGCacaGCCGAGATTTGCCAAGTT |
| Μ | E315C/A38OC | M-F1 GGTGCTTTGtgtTTG A ACTGG ACTCTTCCT M-F2 TTGACCTTGtgtGGATGTGAAGAGAGAAAT M-Rl CCAGTTCAAacaCAAAGCACCGCCGAGATT M-R2 TTCACATCCacaCAAGGTCAATTTGACTTC |
| Ν | G322C/T356C | N-Fl ACTCTTCCTtgtCAACCTGATAACACTCCA N-F2 GTCTTCCAAtgtTTGCAGCAGATGAGAGAC N-Rl ATCAGGTTGacaAGGAAGAGTCCAGTTCAA N-R2 CTGCTGCAAacaTTGGAAGACCAACGAAAC |
| 0 | Q346C/L393C | Ο-Fl GATAACTCTtgtTGGATTCAGGTTTCGTTG O-F2 ATGTGTTCCtgtGCTGGTTTCACTCAAATC O-Rl CTGAATCCAacaAGAGTTATCAGATAGTCT O-R2 GAAACCAGCacaGGAACACATACCCTGAGC |
| Ρ | Q349C/M390C | Р-Fl CAATGGATTtglGTTTCGTTGGTCTTCCAA P-F2 GCTCAGGGTtgtTGTTCCTTGGCTGGTTTC P-Rl CAACGAAACacaAATCCATTGAGAGTTATC P-R2 CAAGGAACAacaACCCTGAGCATTTCTCTC |
| Q | T33C/L17OC | Q-Fl CAAGATGTCtgtCCAGACGCTTGGCCAACC Q-F2 GAAAGAGTTtgtAACTTCCCACAAtcaAAC |
- 11 045950
| Q-Rl AGCGTCTGGacaGACATCTTGCATAAGTTG Q-R2 TGGGAAGTTacaAACTCTTTCCAACTCTCT | ||
| R | I55C/A99C | R-F1 GGTGAGCTCtgtGCTTACTTGGGTCACTAC R-F2 ACAGGTGAAtgtTTCGCCGCCGGTCTTGCT R-Rl CAAGTAAGCacaGAGCTCACCACCTCTAGG R-R2 GGCGGCGAAacaTTCACCTGTCTTACGGGT |
| S | A268C/N309C | S -F1 AGATCC AG AtgtACCCC ATT GTTGG ACTTG S-F2 AACTTGGCAtgtCTCGGCGGTGCTTTGGAG S-Rl CAATGGGGTacaTCTGGATCTAGCAAcCTC S-R2 ACCGCCGAGacaTGCCAAGTTAGTATCGTG |
| Т | I85C/G97C | T-Fl CAAGTAGCTtgtATTGCTGACGTCGACGAA T-F2 CGTAAGACAtgtGAAGCCTTCGCCGCCGGT T-Rl GTCAGCAATacaAGCTACTTGACCAGATTG T-R2 GAAGGCTTCACaTGTCTTACGGGTTCTTTC |
| и | Р123С/Т130С | U-Fl TCTCCAGATtgtTTGTTCAACCCTTTGAAG U-F2 CCTTTGAAGtgtGGTGTTTGCCAATTGGAC U-Rl GTTGAACAAacaATCTGGAGAAGAAGTGTC U-R2 GCAAACACCacaCTTCAAAGGGTTGAACAA |
| V | А226С/М360С | V-Fl CTGCAACAAtgtCAAGGTATGCCTGAGCCA V-F2 TTGCAGCAGtgtAGAGACAAGACTCCACTG V-R1 CATACCTTGAcaTTGTTGCAGAAGAAAGAT V-R2 CTTGTCTCTacaCTGCTGCAAAGTTTGGAA |
| W | W243C/P324C | W-F1 TCTCACCAATGtAACACCTTGTTGTCCTTG W-F2 CCTGGTCAAtgtGATAACACTCCACCAGGT W-R1 CA AGGTGTTacaTTGGTGAGAGTCGGTGAT W-R2 AGTGTTATCacaTTGACCAGGAAGAGTCCA |
| X | W347C/M390C | X-Fl AACTCTCAAtgtATTCAGGTTTCGTTGGTC X-F2 GCTCAGGGTtgtTGTTCCTTGGCTGGTTTC |
| Y | I348C/F396C | X-Rl AACCTGAATaCATTGAGAGTTATCAGATAG X-R2 CAAGGAACAacaACCCTGAGCATTTCTCTC Y-Fl TCTCAATGGtgtCAGGTTTCGTTGGTCTTC Y-F2 TTGGCTGGTtgtACTCAAATCGTTAACGAA Y-R1 CGAAACCTGacaCC ATTGAGAGTTATCAGA Y-R2 GATTTGAGTacaACCAGCCAAGGAACACAT |
Для введения 25 дисульфидных связей A-Y в качестве матрицы выбирается плазмида pPIC9K-WT, в качестве пары для введения используются F1/R2 и F2/R1, отдельно проводится две ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы Phusion® High-Fidelity DNA (New England Biolabs, номер товара M0530L) в соответствии с описанием, приведенным в руководстве по ее применению. После завершения амплификации для расщепления матрицы применяется эндонуклеаза DpnI (New England Biolabs), после чего с помощью Gibson Assembly® Master Mix Kit (New England Biolabs, номер товара Е2611) производится рекомбинация участков, в результате секвенирования подтверждается факт получения мутантной плазмиды. Согласно вышеприведенной таблице наименований дисульфидных связей мутантным плазмидам присваиваются наименования от рР1С9К-А до pPIC9K-Y.
Для экспрессии фитазы и мутантных форм выполняются действия в отношении Pichia GS115 и плазмиды, описанные в руководстве по применению Pichia expression kit (Invitrogen). Подробный порядок действий следующий: после 48-часового культивирования при температуре 30°С штаммов Pichia GS115 в культурной среде YPD (1% экстракт дрожжей, 2% белка, 2% глюкозы и 1,5% агара) отбирается и клонируется в жидкую питательную среду 4 mL YPD (1% экстракт дрожжей, 2% белка, 2% глюкозы), культивируется на 200 об/мин в течение 12 ч при температуре 30°С, после чего переносится в колбу Эрленмейера с жидкой питательной средой 30mL YPD и культивируется в течение 4-5 ч при температуре 30°С на 220 об/мин. Когда показатель OD600 достигнет 1,1-1,3, осуществляется 2-минутное центрифугирование культурной среды при 4° на 9000 об/мин. 4 мл бактериальной массы раздельно собирается в стерилизационные трубки ЕР, аккуратно удаляется надосадочная жидкость, с помощью стерилизационной
- 12 045950 фильтровальной бумаги абсорбируется оставшаяся надосадочная жидкость, после чего с помощью предварительно охлаждённой 1 мл стерильной воды осуществляется повторное суспендирование бактериальной массы, а также 2-минутное центрифугирование при температуре 4°С на 9000 об/мин и удаление надосадочной жидкости. Затем происходит повторение вышеописанных шагов, с помощью предварительно охлажденного 1 мл сорбитола (lmol/L) производится повторное суспендирование бактериальной массы, после чего проводится двухминутное центрифугирование при температуре 4°С на 9000 об/мин, удаление надосадочной жидкости, повторное суспендирование бактериальной массы в 100-150 мкл предварительно охлажденного сорбитола (lmol/L), на данном этапе изготовление компетентного препарата завершено. С помощью BglII осуществляется линеаризация экспрессионной плазмиды pPIC9K-WT и оставшихся 25 мутантных форм дисульфидных связей, линеаризованные фрагменты после очистки и сбора трансформируются способом электропорации в вышеописанную компетенцию Pichia GS115, смесь равномерно распределяется на панели MD, инверсивно культивируется в течение 2-3 дней при температуре 30°С, все колонии бактерии смываются с панели стерилизованной водой, после чего наносятся на панель YPD (0,58 мг/мл) с различной плотностью содержания генетицина и производится отбор мультикопийных трансформантов. Рекомбинантные штаммы Pichia, отобранные с панели MD, имеют наименования: APPA-WT и АРРА-А, АРРА-В, АРРА-С, APPA-D, АРРА-Е, APPA-F, APPA-G, АРРА-Н, APPA-I, APPA-J, АРРА-К, APPA-L, АРРА-М, APPA-N, АРРА-О, АРРА-Р, APPA-Q, APPA-R, APPA-S, АРРА-Т, APPA-U, APPA-V, APPA-W, АРРА-Х и APPA-Y. Вышеописанные полученные клоны раздельно переносятся в питательную среду BMGY и культивируются в шейкере в течение 24 ч при температуре 30°С на 250 об/мин, после чего переносятся в питательную среду BMMY и продолжают культивироваться при температуре 30°С на 250 об/мин с ежедневным добавлением 0,5% метанола, после индуцированной экспрессии на протяжении 120 ч проводится 10-минутное центрифугирование на 9000-12000 об/мин в целях удаления бактериальной массы и получения ферментированной надосадочной жидкости, содержащей фитазу APPA-WT и ее 25 мутантных форм. Результаты SDS-PAGE показали, что мутантные формы APPA-S, АРРА-Х и APPA-Y не экспрессировали, остальные 22 мутантные формы экспрессировали.
Вариант осуществления 2. Измерение термостабильности
Ферментативная активность фитазы определяется согласно документу GBT 18634-2009. 23 образца, полученных согласно варианту осуществления 1, разбавляют водой до 100 ед/мл. 9 мл воды отдельно предварительно нагревается в колориметрической пробирке 25 мл на водяной бане при постоянной температуре 80°С, с помощью пипетки отбирается по 1 мл образца фитазы, быстро помещается в соответствующие пробирки, осуществляется быстрое 3-минутное перемешивание смешивателем. Образцы быстро охлаждаются до комнатной температуры, разбавляются водой, измеряется остаточная активность каждого из образцов. Измеряется степень сохранения ферментативной активности после обработки при различных температурах (ферментативная активность до термической обработки принимается за 100%), показатели термостабильности показаны в табл. 2. Некоторые мутантные формы продемонстрировали хорошую термостабильность, наилучшую термостабильность продемонстрировали образцы АРРА-В, АРРА-С, APPA-D, АРРА-М, АРРА-0 и АРРА-Р, по сравнению с АРРА остаточная активность повысилась на 20-25%, примерно в 3-4 раза. Вышеописанные результаты показывают, что введение дисульфидных связей оказывает значительное влияние на мутантные формы, часть образцов оказались в том числе не способными к обычной экспрессии, к примеру APPA-S, АРРА-Х и APPA-Y. Введение некоторых дисульфидных связей привело к снижению термостабильности, к примеру APPA-Q и APPA-V, которые продемонстрировали термостабильность значительно ниже по сравнению с фитазой дикого типа. Часть дисульфидных связей оказались благоприятными для стабильности структуры фермента, к примеру формы с АРРА-А по АРРА-Р способны повысить термостабильность образцов дикого типа.
Вариант осуществления 3. Введение дисульфидных связей в мутантные формы и измерение их стабильности
Nov9X является мутантной формой фитазы дикого типа с превосходным показателем термостабильности (согласно описанию US 7432098), модифицированной путем введения 8 мутаций в форму дикого типа, конкретная последовательность описана в SEQ ID NO: 2. На основе Nov9X проводится последующая мутация, последовательность которой описана в SEQ ID NO: 3, с наименованием АРРА-М1, которая позволяет дополнительно повысить ее термостабильность. Определяется способность мутантных форм дисульфидных связей, описанных в варианте осуществления 1, развиваться в мутантной фитазе и повышать ее термостабильность. Согласно варианту осуществления 1 в АРРА-М1 вводятся дисульфидные связи D, О, а также комбинации В+О, С+О, D+O, М+О, B+D+O и D+M+O, мутантные формы последовательно именуются APPA-M1-D, АРРА- М1-О, АРРА-М1-ВО, АРРА-М1-СО, APPA-M1-DO, АРРАМ1-МО, APPA-M1-BDO и APPA-M1-DMO. Одновременно согласно описаниям US 20170240872 и US 20130017185 в АРРА-М1 вводятся две наиболее благоприятные из каждого варианта осуществления мутантные дисульфидные связи, далее соответственно именуемые US 20170240872-A, US2 0170240872-B, US 20130017185-B и US 20130017185-C. Для экспрессии каждого мутанта используются Pichia, после чего согласно описанному в варианте осуществления 2 способу определяется термостабильность, образцы с разными параметрами инкубируются в течение 3 мин при температуре 85°. Результат показан на
- 13 045950 фиг. 3, дисульфидные связи D и О продемонстрировали повышение термостабильности в мутантных формах, при этом введение дисульфидной связи О в АРРА-М1 привело к значительному повышению термостабильности по сравнению с образцом дикого типа APPA-WT, диапазон повышения достигает 35,5%. При комбинированном введении АРРА-М1-СО и APPA-M1-DO была продемонстрирована аналогичная АРРА-М1-О термостабильность. Другие комбинации мутаций, такие как АРРА-М1-ВО, АРРАM1-MO, APPA-M1-BDO и APPA-M1-DMO, показали еще выше термостабильность, наивысший показатель остаточной активности фермента 77,2% продемонстрировала АРРА-М1-ВО, превысившая показатель АРРА-М1 в 2-2,5 раза, что свидетельствует о явной термостабильности и позволяет прогнозировать благоприятное воздействие на кормовые гранулы. Вышепредставленные результаты показывают, что подходящие комбинации позволяют получить более термостабильные мутации. Измеренная данным способом стабильность US 20170240872-А и US 20170240872-B превысила АРРА-М1 на 1,1-8,7%, стабильность US 20130017185-B и US 20130017185-C - на 5,0-14,8%. Очевидно, что предложенное автором изобретения введение дисульфидных связей продемонстрировало более эффективный результат.
Вариант осуществления 4. Экспрессия в Aspergillus niger фитазы кишечной палочки дикого типа и мутантной фитазы с введенной дисульфидной связью
Согласно описанию из патента CN 107353327 осуществляется экспрессия фитазы кишечной палочки дикого типа (SEQ ID NO:1) и мутированного типа (с А по Р), фитаза дикого типа именуется APPAanWT, мутантная фитаза именуется соответственно в порядке от APPAan-А до APPAan-Р. После получения надосадочной жидкости из шейкера в соответствии с вариантом осуществления 2 производится измерение термостабильности, образцы с разными параметрами инкубируются в течение 3 мин при температуре 85°. Результат показан на фиг. 4. Нами обнаружено, что при экспрессии в Aspergillus niger фитаза дикого типа продемонстрировала большую стабильность, чем при экспрессии в Pichia, что вероятно обусловлено различной конфигурацией гликозилирования. Эксперимент также показал, что мутант APPAanР не экспрессирует, мутант APPAan-G продемонстрировал практически аналогичную WT термостабильность, а термостабильность APPAan-Н заметно снизилась. Остальные 13 мутаций продемонстрировали очевидное повышение характеристик стабильности в диапазоне от 5 до 20,5%. В то же время нами было обнаружено, что диапазон повышения термостабильности отличается от диапазона мутаций при экспрессии в Pichia. Вышепредставленные результаты показывают, что 16 мутантных форм экспрессируют, по меньшей мере, в одной клетке-носителе и значительно повышают стабильность по сравнению с образцом дикого типа, а введение вышеописанных подходящих комбинаций сульфидных связей позволяет получить мутацию с еще более высокой термостабильностью.
Вариант осуществления 5. Результаты измерений термостабильности мутантной фитазы с введенными дисульфидными связями
Nov9X является мутантной формой фитазы дикого типа с превосходным показателем термостабильности (согласно описанию US 7432098), модифицированной путем введения 8 мутаций в форму дикого типа, конкретная последовательность описана в SEQ ID NO: 2. В последовательность Nov9X согласно документальным материалам (Improving specific activity and thermostability of Escherichia coli phytase by structure - based rational design) продолжается введение сайтов гликозилирования в последовательности, описываемой SEQ ID NO: 79, полученный образец именуется АРРА-М2, у которого происходит дальнейшее повышение термостабильности. Определяется способность мутантных форм дисульфидных связей, описанных в варианте осуществления 1, развиваться в мутантной фитазе АРРА-М2 и повышать ее термостабильность. В соответствии со способом варианта осуществления 1 в АРРА-М2 вводятся дисульфидные связи В, С, D, М, О и комбинации дисульфидных связей В+O, D+O, М+O, С+O, полученные мутанты соответственно именуются АРРА-М2-В, АРРА-М2-С, APPA-M2-D, АРРА-М2-М, АРРА-М2-О, АРРА-М2-ВО, APPA-M2-DO, АРРА-М2-МО и АРРА-М2-СО, последовательность аминокислот в каждой мутантной форме определяется согласно SEQ ID NOs: 80-88, соответствующая нуклеотидная последовательность определяется согласно SEQ ID NOs: 90-98. Для экспрессии мутаций используется Aspergillus niger, после чего проводятся измерения термостабильности в соответствии со способом варианта осуществления 2. Результат показан на фиг. 5, все использованные в эксперименте дисульфидные связи значительно повысили термостабильность мутантных образцов, наилучший результат продемонстрировала связь С+O, ферментативная активность которой после термоустойчивой обработки составила 84,5%, что говорит о высокой термостабильности и позволяет прогнозировать благоприятное воздействие на кормовые гранулы. Вышепредставленные результаты показывают, что подходящие комбинации позволяют создать более термостабильные мутации. Вышеприведенные результаты также показывают, что предложенное автором изобретения введение дисульфидных связей в последовательность мутантной фитазы по-прежнему исключительно эффективно.
Автор изобретения также попробовал продолжить введение сайтов гликозилирования в последовательность Nov9X, данная последовательность описана SEQ ID NO: 99, с наименованием АРРА-М3, которая также способна повышать термостабильность. Согласно варианту осуществления 1 в АРРА-М3 вводятся дисульфидные связи В, С, D, М, О и комбинации В+О, D+O, М+О, С+О, полученные мутанты соответственно именуются АРРА-М3-В, АРРА-М3-С, APPA-M3-D, АРРА-М3-М, АРРА-М3-О, АРРА-М3ВО, APPA-M3-DO, АРРА-М3-МО и АРРА-М3-СО, последовательность аминокислот каждого мутанта
-
Claims (29)
- определяется согласно SEQ ID NOs: 100-108, а соответствующая нуклеотидная последовательность SEQ ID NOs: 110-118. Для экспрессии мутантов используется Aspergillus niger, измерения стабильности проводятся в соответствии с вариантом осуществления 2. Было обнаружено, что мутант с введенной дисульфидной связью, как и АММА-М2, имеет хорошие показатели термостабильности и также позволяет прогнозировать благоприятное воздействие на кормовые гранулы.Различные модификации и варианты описанных способов в настоящем изобретении очевидны для специалистов в данной области техники и не выходят за рамки настоящего изобретения. Несмотря на то, что в настоящем изобретении приводятся обобщенные описания частных вариантов осуществления, следует понимать, что область защиты заявленного настоящего изобретения никоим образом не ограничивается данными конкретными предпочтительными вариантами осуществления. Фактически, различные очевидные для специалистов в данной области мутации и модификации фитазы дикого типа, используемые для достижения технических эффектов настоящего изобретения, включаются в объем формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Термостабильная фитаза, отличающаяся тем, что в последовательность аминокислот фитазы Escherichia coli (кишечной палочки) дикого либо мутированного типа вводится по меньшей мере одна введенная дисульфидная связь;где последовательность аминокислот фитазы кишечной палочки дикого типа представлена в SEQ ID NO: 1;где фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит последовательность аминокислот, более чем на 75% идентичную SEQ ID NO: 2, и фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит мутацию в каждом из положений 46, 62, 73, 75, 146, 159 и 255 по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, при этом, введенная дисульфидная связь выбрана из следующих:(A) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 34 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 174 в SEQ ID NO: 1;(B) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 56 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 103 в SEQ ID NO: 1;(C) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 57 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 366 в SEQ ID NO: 1;(D) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 61 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 366 в SEQ ID NO: 1;(E) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 82 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 296 в SEQ ID NO: 1;(F) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 128 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 203 в SEQ ID NO: 1;(G) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 140 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 262 в SEQ ID NO: 1;(Н) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 156 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 191 в SEQ ID NO: 1;(I) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 165 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 245 в SEQ ID NO: 1;(J) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 191 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 210 в SEQ ID NO: 1;(K) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 196 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 211 в SEQ ID NO: 1;(L) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 264 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 312 в SEQ ID NO: 1;(М) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 315 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 380 в SEQ ID NO: 1;(N) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 322 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 356 в SEQ ID NO: 1;- 15 045950 (О) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 346 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 393 в SEQ ID NO: 1;(Р) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 349 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 390 в SEQ ID NO: 1;при условии, что пункты (С) и (D) не выполняются одновременно;пункты (Н) и (J) не выполняются одновременно.
- 2. Термостабильная фитаза по п.1, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит мутации W46E, Q62W, А73Р, K75C/Q, S146E, R159Y и Y255D, и необязательно дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из A25F, G70E, K74N, G76T, Т114Н, N137V, D142R, P173S, N204C, H282N, P283G и Р284Т, по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1.
- 3. Термостабильная фитаза по п.2, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1: Q1S, Q1V, Q1N, A25F, Q30K, А36К, W37F, P38Y, T39D, I55V, H60S, H60Q, R65H, D69N, G70E, K74D, К74Р, K74L, K74N, G76T, С77А, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, S80P, 185V, A101L, d08A, A109D, А109Е, A109G, A109F, А109Р, THIS, T111D, T111Q, T114H, T116A, T118R, T118S, S120R, P123E, N126Y, P127V, P127L, C133A, N137V, N137E, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141R, T141E,T141G, T141A, D142R, S151P, G157R, G157Q, G157N, G157L, G157A, T161P, P173Y, P173S, N176P,N176K, C178A, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S187P, C188A, S189T, N204C, V211W,G233E, G235Y, T245E, Q253V, R267A, H282N, P283G, P284T, K286F, Q287Y, A288E, A288R, A288V,V291I, T295I, V297T, G311S, E315G, E315S, N317L, W318Y, T327Y, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, S367F, N369P, T370P, A380P, A380R, A380T, C382A, E383S, R385S, R385V, R385T, C391A, E402R, E402T, E402D, E402P, E402N, C408A.
- 4. Термостабильная фитаза по п.3, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит любую из следующих комбинаций мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1:W46E, Q62W, А73Р, К75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D;A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D;W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т и A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
- 5. Термостабильная фитаза по п.4, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит любую из следующих комбинаций мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1:W46E, Q62W, А73Р, К75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D;A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D иW46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
- 6. Термостабильная фитаза по п.3, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот фитазы кишечной палочки мутированного типа представлена в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99.
- 7. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что дисульфидная связь выбрана, по меньшей мере, из одной из (А), (В), (С), (D), (J), (М) либо (О), при условии, что (С) и (D) не выполняются одновременно.
- 8. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет не менее чем двум или трем из следующих пунктов: (А), (В), (С), (D), (E), (J), (M) и (О), при условии, что (С) и (D) не выполняются одновременно.
- 9. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (А), (В), (С), (Е), (J) или (М).
- 10. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет, по меньшей мере, пункту (D) или пункту (О).
- 11. Термостабильная фитаза по п.10, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пункту (D).
- 12. Термостабильная фитаза по п.10, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пункту (О).
- 13. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В) и (О); (С) и (О); (D) и (О); (М) и (О); (В), (D) и (О) или (D), (М) и (О).
- 14. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удо- 16 045950 влетворяет пунктам (В) и (О).
- 15. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (С) и (О).
- 16. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (М) и (О).
- 17. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В), (D) и (О).
- 18. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (D), (М) и (О).
- 19. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-18, содержащая по меньшей мере одну введенную дисульфидную связь, отличающаяся тем, что дисульфидная связь выбрана из следующих:(i) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 31 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 176 в SEQ ID NO: 1;(ii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 31 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 177 в SEQ ID NO: 1;(iii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 52 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 99 в SEQ ID NO: 1;(iv) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 59 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 100 в SEQ ID NO: 1;(v) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 91 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 46 в SEQ ID NO: 1;(vi) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 141 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 200 в SEQ ID NO: 1;(vii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 162 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 248 в SEQ ID NO: 1;(viii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 205 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 257 в SEQ ID NO: 1;при условии, что пункты (i) и (ii) не выполняются одновременно.
- 20. Термостабильная фитаза по п.1, отличающаяся тем, что термостабильная фитаза включает любую из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NOs: 4-40, SEQ ID NOs: 80-88 и SEQ ID NOs: 100-108.
- 21. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-20, отличающаяся тем, что термостабильная фитаза получена из Pichia либо Aspergillus niger посредством гетерологической экспрессии.
- 22. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-21, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки, способные к формированию дисульфидных связей, являются цистеиновыми либо гомоцистеиновыми остатками.
- 23. Полинуклеотид, отличающийся тем, что он кодирует термостабильную фитазу по любому из пп.1-22.
- 24. Полинуклеотид по п.23, отличающийся тем, что его кодирующая последовательность кодоноптимизирована для экспрессии в Pichia либо Aspergillus niger.
- 25. Полинуклеотид по п.23, отличающийся тем, что он включает в себя любую из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NOs: 41-77, SEQ ID NOs: 90-98 и SEQ ID NOs: 100-118.
- 26. Клетка организма-носителя, отличающаяся тем, что она включает в себя полинуклеотид по любому из пп.23-25.
- 27. Клетка организма-носителя по п.26, отличающаяся тем, что данная клетка организма-носителя является грибковой, бактериальной либо растительной клеткой.
- 28. Клетка организма-носителя по п.27, отличающаяся тем, что данная клетка является дрожжевой клеткой либо клеткой мицелиальных грибов.
- 29. Клетка организма-носителя по п.28, отличающаяся тем, что данная клетка является клеткой Pichia либо Aspergillus niger.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810540167.5 | 2018-05-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045950B1 true EA045950B1 (ru) | 2024-01-22 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11739336B2 (en) | Phytase mutants | |
| CN112204136B (zh) | 植酸酶突变体 | |
| CA2209617C (en) | Animal feed additives comprising xylanase | |
| US5405769A (en) | Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase | |
| US11214776B2 (en) | Phytase mutant | |
| JP5340138B2 (ja) | 新規なフィターゼのクローニング及び発現 | |
| CA2812617C (en) | Pepsin-resistant alpha-amylases for use in feed supplement for monogastric animals | |
| CN109576244B (zh) | 一种新型脂肪酶及其制备与应用 | |
| CN106635941B (zh) | 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其功能验证 | |
| EA045950B1 (ru) | Модифицированные фитазы | |
| CN113025593B (zh) | 一种亲本植酸酶变体 | |
| CN110656100A (zh) | 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因 | |
| WO2014082513A1 (zh) | 脂肪酶及其用途 | |
| JP5053999B2 (ja) | ペニシリウム・フニクロサムのａｂｆＢ−２遺伝子 | |
| Xuan et al. | Cloning and over Expression of an Aspergillus niger XP Phytase Gene (phyA) in Pichia pastoris | |
| CN117535273B (zh) | 温敏型碱性蛋白酶变体及其应用 | |
| CN114540326B (zh) | 一种镰刀菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用 | |
| JP5048651B2 (ja) | ペニシリウム・フニクロサムのａｂｆＢ−１遺伝子 | |
| TWI427147B (zh) | 具耐熱性之小枯草桿菌木聚醣酶 | |
| CN114736886A (zh) | 植酸酶突变体及其制备方法 | |
| CN116829701A (zh) | 耐热性蛋白质谷氨酰胺酶 | |
| SHAFIQUE et al. | Production of alkaline protease from Aspergillus oryzae via static liquid surface culture technique and its potential application as a detergent additive | |
| CN104694406B (zh) | 德氏有孢圆酵母的植酸酶基因多位点突变株及其应用 | |
| CN114634942A (zh) | 一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用 | |
| KR101219518B1 (ko) | 내열성，광범위 ｐＨ，고활성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 ｓｐ．ＨＰＬ-００３ 균주，이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법 |