EA044751B1 - Способ получения 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-n-[3-(трифторметил)фенил]бензамида - Google Patents

Description

Изобретение относится к области медицины и фармации, в частности к новому биологически активному синтетическому соединению - 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3-(трифторметил)фенил]бензамиду, обладающему противотуберкулезной активностью, которое может найти применение в качестве активной субстанции противотуберкулезного средства для лечения заболеваний, возбудителями которых являются микобактерии: туберкулез человека и крупного рогатого скота, проказа, микобактериозы [1].

Аналогами заявляемого соединения по назначению и профилю биологического действия являются противотуберкулезные препараты - изониазид, рифампицин, пиразинамид и этамбутол [2]. Противотуберкулезные препараты I ряда - изониазид, рифампицин, пиразинаид и этамбутол имеют ряд недостатков - микобактерии активно формируют к ним резистентность путем изменения уровня экспрессии собственных генов, поэтому с каждым годом их эффективность снижается, а количество лекарственно-устойчивых форм туберкулезной инфекции увеличивается. Генетическая основа резистентности микобактерий - наличие внехромосомных факторов устойчивости к лекарственным веществам - плазмид и транспозонов. Кроме того, противотуберкулезные препараты имеют ряд побочных действий, развитие которых зависит от препарата, формы его применения, дозы, длительности лечения и сочетания с другими лекарственными средствами. Нередко у пациентов на фоне лечения туберкулеза возникают нарушения функции органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, печени, почек, центральной и периферической нервной системы, иммунной системы, сердечно-сосудистой системы, системы кроветворения. Диспепсические расстройства в виде метеоризма, тошноты, рвоты, ухудшения аппетита и т.д. отмечаются у 23,5-44,9% пациентов. При этом у 81,2% пациентов с туберкулезом на фоне лечения возникают те либо иные нарушения кишечной абсорбции, у 97,2% пациентов после 2-3-месячной химиотерапии выявлены стойкие патологические сдвиги в микроэкологии кишечника, вплоть до глубокого дисбактериоза. Гепатотоксические реакции, сопровождавшиеся отклонениями от нормы биохимических показателей крови, а нередко и клиническими проявлениями лекарственного гепатита, по данным ряда авторов, наблюдались у 14,7-23,9% пациентов. Нарушение функции почек в процессе химиотерапии туберкулеза связано с повышением проницаемости клубочкового фильтра при одновременном снижении клубочковой фильтрации и изменении концентрационной и азотовыделительной функции. Нефротоксические реакции, возникшие на фоне химиотерапии туберкулеза, развивались у 7,2-21,1% пациентов. Нейротоксические побочные реакции проявляются симптомами поражения центральной и периферической нервной системы. Изменения в ЦНС часто возникают на ранних этапах химиотерапии и проявляются головной болью, головокружениями, расстройствами сна, эпиподобными припадками, депрессивным синдромом и т.д. При проведении химиотерапии реакции такого рода встречаются у 5,9-15,2% пациентов. Противотуберкулезные антибиотики (стрептомицин, канамицин, амикацин, капреомицин) оказывают токсическое влияние на VIII пару черепно-мозговых нервов, обуславливая нарушения слуха и вестибулярные расстройства. В процессе химиотерапии ототоксические реакции возникают у 3,1-12,9% пациентов. Нарушения периферической нервной системы в виде полиневритов, полинейропатий и связанные с ними парестезии конечностей, атаксии, мышечная слабость и т.д., выявлялись у 1,2-12,9% заболевших. Часть пациентов (1,5-8,3%) отмечали появление артропатий в процессе химиотерапии [3].

Задачей заявляемой группы изобретений является новое соединение из ряда синтетических производных бензамида, обладающего высокой противотуберкулезной активностью и низкой общей токсичностью, способ его получения и его применение в качестве антимикробного агента.

Поставленная задача решается новым химическим соединением - 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1карбонил]-№-[3-(трифторметил)фенил]бензамидом, который обладает высокой противотуберкулезной активностью и может быть использован для разработки нового оригинального противотуберкулезного лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающей заявляемое соединение.

В соответствии с изобретением описывается 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3(трифторметил)фенил]бензамид структурной формулы I обладающий противотуберкулезной активностью.

Также поставленная задача решается еще одним объектом заявляемой группы изобретений, а именно способом получения 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-Ы-[3-(трифторметил)фенил]бензамида, заключающимся в том, что изофталевую кислоту 1 обрабатывают оксалилхлоридом в тетрагидрофуране в присутствии диметилформамида, полученный изофталоил дихлорид 2 последовательно конденсируют с 3-(трифторметил)анилином 3 и 1-(2-фторбензоил)пиперазином 4 в тетрагидрофуране с добавлением эквимолярного количества триэтиламина и выделяют целевой продукт методом кристаллизации. Реакция протекает по следующей схеме.

- 1 044751

Заявляемый способ позволяет получать целевой продукт 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1карбонил]-N-[3-(трифторметил)фенил]бензамид формулы I с суммарным выходом 55-60% и хроматографической чистотой >98%. Исходные вещества являются коммерчески доступными реагентами. Прекурсор 1-(2-фторбензоил)пиперазин 5 получают из 2-фторбензойной кислоты и Вос-пиперазина.

Еще одним объектом заявляемой группы изобретений является применение 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3-(трифторметил)фенил]бензамида в качестве антимикробного агента, обладающего противотуберкулезной активностью. В соответствии с указанным применением 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3-(трифторметил)фенил]бензамид может быть использован для получения фармацевтической композиции, обладающей противотуберкулезной активностью и для создания на ее основе противотуберкулезного лекарственного препарата.

Противотуберкулезная активность заявляемого соединения оценивалась на:

непатогенном штамме Mycobacterium terrae 15755, который рекомендован для использования в качестве модельного для определения противотуберкулезной активности;

лекарственно-чувствительном штамме Mycobacterium tuberculosis - лабораторном референс-штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv;

клиническом штамме Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью к следующим противотуберкулезным лекарственным препаратам - изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид, амикацин, этионамид, моксифлоксацин, левофлоксацин и чувствительностью к линезолиду, клофазимину, бедаквилину и деламаниду.

Острую токсичность заявляемого соединения I оценивали при однократном внутрижелудочном введении в дозе 100, 500 и 2000 мг/кг клинически здоровым половозрелым мышам линии СВА обоего пола и клинически здоровым крысам линии Вистар обоего пола.

Возможность осуществления заявляемой группы изобретений подтверждается нижеприведенными примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Получение 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3-(трифторметил)фенил]бензамида (I).

К суспензии изофталевой кислоты 1 (6,36 г) в тетрагидрофуране (165 мл) добавляли диметилформамид (0,28 мл), затем смесь охлаждали на водно-ледяной бане и добавляли оксалилхлорид (6,87 мл, 2,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 2,5-3 ч при комнатной температуре. За протеканием реакции следили методом тонкослойной хроматографии. По завершении реакции растворитель упаривали в вакууме досуха, остаток соупаривали с хлороформом (3x30 мл). Полученный изофталоил дихлорид 2 вводили в следующую стадию конденсации.

К охлажденному на водно-ледяной бане до 0°С раствору 3-(трифторметил)анилина 3 (4,31 мл, 0,9 экв.) в тетрагидрофуране (200 мл) добавляли эквимолярное количество триэтиламина (4,79 мл), затем полученную смесь по каплям в атмосфере аргона добавляли к раствору хлорангидрида изофталевой кислоты 2 в тетрагидрофуране (11 мл). Протекание реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии. После полного исчезновения исходного амина в реакционную смесь добавляют раствор 1-(2-фторбензоил)пиперазина 5 (7,17 г) в тетрагидрофуране (100 мл) с эквимолярным количеством триэтиламина (4,79 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч до исчезновения по тонкослойной хроматографии азотсодержащего гетероциклического соединения 5. По завершении реакции к смеси добавляли двукратный объем воды, тетрагидрофуран упаривали при пониженном давлении. Водную фазу экстрагировали хлороформом (3x250 мл). Объединенные органические фракции сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали в вакууме досуха. Остаток хроматографировали на силикагеле, используя для элюции этилацетат. Фракции, содержащие продукт реакции I, объединяли, упаривали в вакууме досуха и остаток кристаллизовали из диэтилового эфира. Выход 57%, белый аморфный порошок, Т_пл=133-139°С. УФ-спектр (EtOH), X_max, нм: 256.

Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆) δ, м.д.: 10,63 с (1H, HN), 8,24 с (1H), 8,03-8,07 м (3Н), 7,59-7,67 м (3Н), 7,44-7,52 м (3Н), 7,30 уш.с. (2Н), 3,65-3,76 м (4Н), 3,28-3,46 м (4Н).

Спектр ЯМР ¹³С (ДМСО-66), δ, м.д., J, Гц: 168,5, 165,1, 164,2, 157,5 д (J=245,6), 139,7, 135,7, 134,5, 131,5 д (J=7,6), 130,21, 129,8, 129,3 д (J=31), 128,9, 128,8, 128,7, 126,2, 124,3, 124,1 д (J=272,3), 123,8, 123,5, 120,0, 116,4, 115,7 д (J=21).

Масс-спектр, (МН⁺): 500,1.

- 2 044751

Пример 2.

Определение противотуберкулезной активности с помощью метода разведений в плотной питательной среде в чашках Петри на штамме Mycobacterium terrae 15755.

Определение противотуберкулезной активности 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3(трифторметил)фенил]бензамида проводили на штамме Mycobacterium terrae 15755. Данный штамм является непатогенным и рекомендован для использования в качестве модельного для определения противотуберкулезной активности [4]. Использовали метод разведений в плотной питательной среде в чашках Петри. Для оценки противотуберкулезной активности использовали визуальную оценку роста Mycobacterium terrae в плотной питательной среде в чашках Петри. Исходный раствор изучаемого соединения готовили в диметилсульфоксиде (ДМСО), который затем добавляли в питательную среду Миддлбрука 7Н9 с глицерином (Middlebrook 7H9 Broth with Glycerol). Для получения требуемых концентраций изучаемого соединения для исследования - 200, 150 и 100 мкг/мл нужно было смешивать исходный раствор изучаемого соединения с питательной средой в разных соотношениях. Для получения концентрации изучаемого соединения 200 мкг/мл исходный раствор изучаемого соединения в ДМСО объемом 2 мл с концентрацией 2000 мкг/мл смешивали с питательной средой Миддлбрука 7Н9 с глицерином объемом 18 мл, т.е. в объемном соотношении 1:9. Для получения концентрации изучаемого соединения 150 мкг/мл исходный раствор изучаемого соединения в ДМСО объемом 2 мл с концентрацией 1500 мкг/мл смешивали с питательной средой Миддлбрука 7Н9 с глицерином объемом 18 мл, то есть в объемном соотношении 1:9. Для получения концентрации изучаемого соединения 100 мкг/мл исходный раствор изучаемого соединения в ДМСО объемом 1 мл с концентрацией 2000 мкг/мл смешивали с питательной средой Миддлбрука 7Н9 с глицерином объемом 19 мл, то есть в объемном соотношении 1:19. Затем культуру микобактерий высевали во все анализируемые растворы. Кроме того, выполняли два контрольных опыта. Первый контрольный опыт выполняли для контроля влияния растворителя - для этого использовали ДМСО в таком же количестве, как и в образцах с максимальной концентрацией анализируемого вещества (200 мкг/мл) - объемом 2 мл, который добавляли в питательную среду Миддлбрука 7Н9 с глицерином объемом 18 мл, затем культуру микобактерий высевали в анализируемый раствор. Второй контрольный опыт выполнялся для контроля роста культуры, поэтому не содержал никаких добавок. Культуру микобактерий высевали в питательную среду Миддлбрука 7Н9 с глицерином объемом 20 мл. Все образцы выдерживали в термостате при 37°С в течение трех недель. Для оценки противотуберкулезной активности определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) (мкг/мл), которая соответствует такой концентрации анализируемого вещества, при которой роста микобактерий в чашке Петри не наблюдалось. В параллельных экспериментах в качестве эталонов использовали рифампицин, изониазид и этамбутол, которые обладают противотуберкулезным действием и используются для лечения туберкулеза. Эксперимент был выполнен в девяти повторностях для концентрации 200 мкг/мл, в трех повторностях для концентрации 150 мкг/мл и в девяти повторностях для концентрации 100 мкг/мл.

В результате была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК), в которой 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1 -карбонил] -М-[3-(трифторметил)фенил] бензамид полностью подавляет рост микобактерий во всех девяти экспериментах - 200 мкг/мл. Рифампицин, который используется в настоящее время для лечения туберкулеза и является препаратом первого ряда, в нашем эксперименте в концентрации 200 мкг/мл полностью подавляет рост микобактерий. Изониазид, который используется в настоящее время для лечения туберкулеза и является препаратом первого ряда, в нашем эксперименте в концентрации 50 мкг/мл полностью подавляет рост микобактерий и этамбутол, который используется в настоящее время для лечения туберкулеза и является препаратом первого ряда, в нашем эксперименте в концентрации 25 мкг/мл полностью подавляет рост микобактерий [5].

Пример 3.

Определение противотуберкулезной активности с помощью модифицированного метода пропорций в жидкой питательной среде Миддлбрук 7Н9 с использованием автоматизированной системы ВАСТЕС™ MGIT™ 960 на лекарственно-чувствительном штамме Mycobacterium tuberculosis - лабораторном референс-штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv NCTC 7416 (АТСС 9360) и на клиническом штамме Mycobacterium tuberculosis NRLB-21 с множественной лекарственной устойчивостью к следующим противотуберкулезным лекарственным препаратам - изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид, амикацин, этионамид, моксифлоксацин, левофлоксацин и чувствительностью к линезолиду, клофазимину, бедаквилину и деламаниду

Определение чувствительности микобактерий к исследуемому соединению выполняли с помощью модифицированного метода пропорций в жидкой питательной среде Миддлбрук 7Н9 с использованием автоматизированной системы ВАСТЕС™ MGIT™ 960 (Becton Dickinson, USA). Принцип работы автоматизированной системы заключается в сравнении скорости роста микобактерий в контрольной пробирке и в пробирке с исследуемым соединением. Основным компонентом автоматизированной системы является пробирка MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube - Пробирка-индикатор роста микобактерий) с флуоресцентным индикатором роста - бескислородным флуорохромом - трис-4,7-дифенил-1,10-фенантролин пентагидратом хлорида рутения, который находится под силиконом на дне пробирки и ингибируется

- 3 044751 высокими концентрациями кислорода, растворенного в среде. Во время роста микобактерии активно поглощают свободный кислород внутри пробирки, выделяя углекислый газ. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома. То есть рост микобактерий вызывает усиление флюоресценции. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС™ MGIT™ 960. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU - growth units). Значение GU=400 является максимальным и означает активный рост микобактерий, такое значение фиксируется прибором в контрольной пробирке, в которую засевают 105-106 колониеобразующих единиц (КОЕ) микобактиерий на 1 мл среды и не добавляют противотуберкулезное соединение. Соответственно, значение GU=0 является минимальным, означает отсутствие роста микобактерий и свидетельствует о том, что исследуемое противотуберкулезное соединение полностью подавляет рост микобактерий. Пробирки MGIT инкубируются при температуре 37°С. Степень флюоресценции каждой пробирки регистрируется прибором автоматически каждые 60 минут. В системе используется обогащенная жидкая питательная среда Миддлбрук 7Н9.

Отбор и подготовка лабораторных штаммов микобактерий туберкулеза для проведения исследования.

Из лабораторной коллекции государственного учреждения Республиканский научно-практический центр пульмонологии и фтизиатрии для проведения исследования было отобрано два штамма:

штамм лекарственно-чувствительных Mycobacterium tuberculosis (ЛЧ-МБТ) - лабораторный референс-штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv NCTC 7416 (АТСС 9360);

клинический штамм Mycobacterium tuberculosis NRLB-21 с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-МБТ) к противотуберкулезным лекарственным препаратам (ПТЛП) - изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид, амикацин, этионамид, моксифлоксацин, левофлоксацин и чувствительностью к линезолиду, клофазимину, бедаквилину и деламаниду. Клинический штамм был выделен в 2021 году из мокроты впервые выявленных больных до начала проведения ими противотуберкулезной терапии.

Приготовление и посев суспензии исследуемых штаммов микобактерий из плотной среды.

Добавляли 4 мл бульона Миддлбрука 7Н9 в стерильную пробирку 16,5x128 мм с крышкой. Пробирка содержала 8-10 стеклянных шариков. Затем собирали стерильной петлей как можно больше колоний с продолжительностью роста на плотной питательной среде 7 дней с момента появления видимого роста, стараясь не собирать плотную среду. Растворяли колонии в бульоне Миддлбрука 7Н9. Проводили контроль мутности суспензии - параметр мутность был в норме, выше 1,0 по стандарту Макфарланда. Затем встряхивали суспензию в плотно закрытой пробирке на устройстве Вортекс в течение 3 мин, чтобы разрушить крупные хлопья бактериальной массы, после чего суспензия отстаивалась в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливали в другую стерильную пробирку 16,5x128 мм с крышкой (не переливая осадок) и давали ей отстояться еще 15 мин. Однородную надосадочную жидкость, без хлопьев опять слили в третью стерильную пробирку 16,5x128 мм. Установили мутность суспензии, она оказалась равной 0,5 по стандарту Макфарланда (1,5x108 КОЕ/мл) путем визуального сравнения со стандартом мутности Макфарланда 0,5. Оптическую плотность контролировали с помощью нефелометра. Затем разбавили 1 мл суспензии с мутностью 0,5 по стандарту Макфарланда 4 мл стерильного физиологического раствора (разбавление 1:5).

Следующей стадией был посев микобактерий в жидкую питательную среду для тестирования чувствительности микобактерий к изучаемым нами соединениям в автоматизированной системе ВАСТЕС™ MGIT™ 960 для автоматической детекции роста микобактерий [6]. В пробирку MGIT с 7,0 мл питательной жидкой среды Миддлбрук 7Н9, соблюдая правила асептики, добавляли 0,8 мл обогатительной ростовой добавки ВАСТЕС MGIT OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза) и вносили 0,5 мл суспензии микобактерий, с целью получить равную величину колониеобразующих единиц возбудителя в одном миллилитре среды (КОЕ/мл, приблизительно 105-10⁶). Таким образом, общий объем засеянной среды составлял 8,3 мл. Затем в пробирку вносили 0,1 мл раствора исследуемого соединения. Каждую пробирку плотно закрывали крышкой и тщательно перемешивали смесь.

Приготовление растворов исследуемых соединений.

Для исследования концентрации 200 мкг/мл исследуемое соединение растворяли в ДМСО в концентрации 16,8 мг/мл (исходный раствор), стерилизовали пропусканием через 0,22 мкм фильтр Миллипор. Требуемую конечную концентрацию (200 мкг/мл) получали при добавлении 0,1 мл исходного раствора в пробирку MGIT со средой, добавкой и суспензией микроорганизмов (конечный объем был равен 8,4 мл).

Для исследования концентрации 100 мкг/мл исследуемое соединение растворяли в ДМСО в концентрации 8,4 мг/мл (исходный раствор), стерилизовали пропусканием через 0,22 мкм фильтр Millipore. Требуемую конечную концентрацию (100 мкг/мл) получали при добавлении 0,1 мл исходного раствора в пробирку MGIT со средой, добавкой и суспензией микроорганизмов (конечный объем был равен 8,4 мл).

Каждую концентрацию и отдельно растворитель (ДМСО) исследовали в триплетах.

- 4 044751

Эксперимент считается завершенным, когда единица роста (GU) в контрольной пробирке достигает своего максимального значения 400 (в течение 4-13 дней). Когда в автоматизированной системе ВАСТЕС™ MGIT™ 960 зафиксировано максимальное значение единицы роста, равное 400 в контрольной пробирке, системой автоматически фиксируются показатели единицы роста в пробирках с исследуемыми соединениями.

Изобретение поясняется фигурами:

фиг. 1 - противотуберкулезная активность 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3(трифторметил)фенил]бензамида в концентрациях 100 мкг/мл и 200 мкг/мл и растворителя ДМСО в чистом виде в отношении лабораторного референс-штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv;

фиг. 2 - противотуберкулезная активность 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3(трифторметил)фенил]бензамида в концентрациях 100 мкг/мл и 200 мкг/мл и растворителя ДМСО в чистом виде в отношении клинического штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

В каждой из трех пробирок MGIT, в которые добавляли ДМСО, прибором был зафиксирован показатель единиц роста GU=400, что означает рост микобактерий в присутствии ДМСО и свидетельствует о том, что растворитель не подавляет рост лабораторного референс-штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Система ВАСТЕС™ MGIT™ 960 зафиксировала результаты в первой и во второй пробирке через 9 суток 21 ч, а в третьей пробирке - через 9 суток 23 ч (фиг. 1).

В каждой из трех пробирок MGIT, в которые добавляли ДМСО, прибором был зафиксирован показатель единиц роста GU = 400, что означает рост микобактерий в присутствии ДМСО и свидетельствует о том, что растворитель не подавляет рост клинического штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. Система ВАСТЕС™ MGIT™ 960 зафиксировала результаты в первой пробирке через 9 суток 10 ч, во второй пробирке - через 9 суток 13 ч, в третьей пробирке - через 9 суток 14 ч (фиг. 2).

Согласно проведенным исследованиям 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3(трифторметил)фенил]бензамид в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляет рост лабораторного референс-штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv и клинического штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. При этом во всех экспериментах контроль и растворитель (ДМСО) демонстрировали максимальный показатель единицы роста 400 GU, что свидетельствует о том, что условия проведения эксперимента обеспечивают хороший рост исследуемых микобактерий и растворитель ДМСО не ингибирует рост микобактерий.

Пример 4.

Оценка острой токсичности 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-К-[3-(трифторметил)фенил]бензамида при однократном внутрижелудочном введении лабораторным мышам и крысам

Токсикометрию проводили с учетом половозрастных особенностей животных - на 48 клинически здоровых мышах обоего пола массой 20-22 г линии СВА и на 48 клинически здоровых крысах обоего пола массой 200-220 г линии Вистар. Для оценки острой токсичности сформировали опытные и контрольные группы мышей и крыс (n= 6) согласно схеме, указанной в табл. 1.

Таблица 1. Схема внутрижеудочного введения 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-К-[3(трифторметил)фенил]бензамида мышам и крысам для определения острой токсичности

№ группы	Доза, мг/кг
Мыши	Крысы
1	100	100
2	500	500
3	2000	2000
4(контроль)	Равный объем воды очищенной	Равный объем воды очищенной

Исследуемое соединение вводили однократно внутрижелудочно в виде суспензии в следующих дозировках: 100, 500 и 2000 мг/кг живой массы.

С момента введения исследуемого соединения за животными наблюдали в течение 14 суток. В первые сутки животные находились под непрерывным контролем. Начиная со вторых суток, осмотр животных проводили 2 раза в сутки до завершения опыта. Для оценки картины интоксикации с регулярной периодичностью фиксировали общее состояние животных, поведенческие реакции, положение тела в пространстве, двигательную активность, нервно-мышечное возбуждение, состояние кожи и шерсти, цвет видимых слизистых оболочек, размер зрачка, аппетит, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания, цвет мочи, потребление корма, потребление воды, реакции на раздражители (тактильные, болевые, звуковые и световые), время возникновения и характер интоксикации, ее тяжесть и обратимость. Кроме того, оценивали динамику массы тела - взвешивание животных осуществляли до начала эксперимента, а затем на второй, седьмой и четырнадцатый день. По истечении 14 дней животных подвергли эвтаназии, провели вскрытие животных опытных и контрольных групп, после чего осуществляли визуальный осмотр, макроскопический анализ внутренних органов и определяли массу сле- 5 044751 дующих органов: сердце, печень, легкие, селезенка и почки. Проводили сравнение показателей массы тела и массы внутренних органов опытных и контрольных групп. Данные, полученные на самках и самцах, учитывались и анализировались раздельно. Статистический анализ полученных экспериментальных данных и построение диаграмм размаха проводили с использованием компьютерной программы Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Различия считали статистически значимыми с вероятностью не менее 95 % (р<0,05).

Результаты эксперимента на мышах.

Установлено статистически значимое увеличение массы тела мышей обоего пола на протяжении эксперимента. Во всех опытных группах и в контрольной группе р=0,028 (критерий Уилкоксона). Масса тела мышей на протяжении эксперимента увеличилась следующим образом: у мышей-самцов группы № 1 в среднем на 3,3 г; у мышей-самцов группы № 2 в среднем на 3,7 г; у мышей-самцов группы № 3 в среднем на 3,6 г; у мышей-самцов группы № 4 (контрольной) в среднем на 3,7 г; у мышейсамок группы № 1 в среднем на 3,3 г; у мышей-самок группы №2 в среднем на 3,7 г; у мышей-самок группы № 3 в среднем на 3,5 г; у мышей-самок группы №4 (контрольной) в среднем на 3,7 г.

По окончании эксперимента после забоя животных определяли массу стресс-компетентных органов мышей - сердца, печени, легких, селезенки и почек (табл. 2).

Таблица 2. Показатели массы сердца, печени, легких, селезенки и почек (г, Me (Q1-Q3)) мышей опытных и контрольной групп

Орган	Масса органа, г	Н-критерий КраскелаУоллиса
Группа 1 (100 мг/кг)	Группа 2 (500 мг/кг)	Группа 3 (2000 мг/кг)	Группа 4 (контроль) вола
Мыши-самцы
Сердце	0,825 (0,82 0,85)	0,805 (0,78 - 0,82)	0,865 (0,84 0,88)	0,86 (0,85 0,88)	Н= 14,52; df=3, р=0,0023
Печень	1,1 (1,1 - 1,1)	1,1 (1,0- 1,1)	1,1 (1,1 - 1,2)	1,1 (1,0-1,2)	Н= 3,067; df=3, р=0,3815
Легкие	0,22 (0,19 -0,23)	0,22 (0,19-0,24)	0,235 (0,220,27)	0,255 (0,23 0,27)	Н= 5,532; df=3, р=0,1367
Селезенка	0,18(0,18-0,19)	0,185 (0,18- 0,19)	0,19(0,180,20)	0,215 (0,21 0,22)	Н= 13,474; df=3, р=0,0014
Почки	0,365 (0,36 0,39)	0,375 (0,38-0,38)	0,395 (0,370,40)	0,39 (0,39 0,39)	Н= 7,406; df=3, р=0,06
Мыши-самки
Сердце	0,895 (0,88 0,93)	0,94 (0,93 - 0,95)	0,895 (0,89 0,92)	0,92 (0,91 0,93)	Н= 3,849; df=3, р=0,2783
Печень	1,1 (1,1 - 1,1)	1,15 (1,1 - 1,2)	1,1 (1,1 - 1,1)	1,15 (1,ΙΟΙ,20)	Н= 4,476; df=3, р=0,2145
Легкие	0,245 (0,24 0,27)	0,265 (0,25-0,27)	0,265 (0,25 0,28)	0,28 (0,27 0,28)	Н= 3,754; df=3, р=0,2893
Селезенка	0,18(0,18-0,19)	0,195 (0,19-0,20)	0,22 (0,21 0,23)	0,22 (0,22 0,23)	Н= 16,264; df=3, р=0,001
Почки	0,39 (0,39 - 0,39)	0,395 (0,39-0,40)	0,40 (0,39 0,41)	0,40 (0,39 0,40)	Н= 5,121; df=3, р=0,1632

Согласно данным табл. 2, видно, что статистически значимые отличия у мышей-самцов всех групп выявлены в массе сердца и селезенки (р<0,05), но величина массы сердца и селезенки во всех опытных группах находится в пределах нормы. В массе печени, легких и почек у мышей-самцов всех групп отличия были статистически незначимы (р>0,05).

У мышей-самок всех групп статистически значимые отличия выявлены в массе селезенки (р<0,05), но величина массы селезенки во всех опытных группах находится в пределах нормы. В массе сердца, печени, легких и почек у мышей-самок всех групп отличия были статистически незначимы (р>0,05).

В каждой из опытных групп мышей обоего пола на 2-, 7- и 14-й день эксперимента не наблюдалось статистически значимое изменение массы тела по сравнению с контрольной группой (табл. 3) (р>0,05).

Результаты эксперимента на крысах.

Установлено статистически значимое увеличение массы тела крыс обоего пола на протяжении эксперимента. Во всех опытных группах и в контрольной группе р=0,028 (критерий Уилкоксона). Масса тела крыс на протяжении эксперимента увеличилась следующим образом: у крыс-самцов группы № 1 в среднем на 24,0 г; у крыс-самцов группы № 2 в среднем на 24,0 г; у крыс-самцов группы № 3 в среднем на 23,3 г; у крыс-самцов группы № 4 (контрольной) в среднем на 24,1 г; у крыссамок группы № 1 в среднем на 24,5 г; у крыс-самок группы № 2 в среднем на 23,3 г; у крыс-самок группы № 3 в среднем на 23,7 г; у крыс-самок группы № 4 (контрольной) в среднем на 23,7 г. В каждой из опытных групп крыс обоего пола на 2-, 7- и 14-й день эксперимента не наблюдалось статистически значимое изменение массы тела по сравнению с контрольной группой (р>0,05), кроме крыс-самцов группы № 2 - у них на 2-, 7- и 14-й день эксперимента наблюдалось статистически значимое увеличение массы тела по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

По окончании эксперимента после забоя животных определяли массу стресс-компетентных органов

- 6 044751 крыс - сердца, печени, легких, селезенки и почек (табл. 3).

Таблица 3. Показатели массы сердца, печени, легких, селезенки и почек (г, Me (Q1-Q3)) крыс опытных и контрольной групп

Орган	Масса органа, г	Н-критерий КраскелаУоллиса
	Группа 1 (100 мг/кг)	Группа 2 (500 мг/кг)	Группа 3 (2000 мг/кг)	Группа 4 (контроль) вола
Крысы-самцы
Сердце	1,0 (0,9 - 1,0)	0,9 (0,9 - 0,9)	1,0(1,0-1,0)	1,0(1,0-1,0)	Н= 10,0625; df=3, р=0,018
Печень	8,0 (7,9-8,1)	7,9 (7,9 - 7,9)	8,0 (7,9 - 8,0)	7,9 (7,9 - 8,0)	Н= 5,92; df=3, р=0,1156
Легкие	1,7(1,6-1,7)	1,6(1,6-1,7)	1,7(1,7-1,8)	1,7(1,7-1,7)	Н= 14,52; df=3, р=0,0023
Селезенка	1,1 (1,1 - 1,2)	1,05(1,0-1,1)	1,0(1,0-1,1)	1,1 (1,0-1,1)	Н=3,31; df=3, р=0,3463
Почки	2,05 (2,0-2,1)	1,95(1,9-2,1)	2,0(2,0-2,1)	2,0(1,9-2,0)	Н= 1,824; df=3, р=0,6097
Крысы-самки
Сердце	1,05(1,0- 1,1)	1,0(1,0-1,0)	1,0(1,0-1,1)	1,0(1,0-1,1)	Н= 1,438; df=3, р=0,6968
Печень	8,4 (8,4 - 8,5)	8,4 (8,3 - 8,4)	8,0 (8,0-8,1)	8,0 (7,9-8,1)	Н= 18,227; df=3, р=0,0004
Легкие	1,8 (1,8-1,8)	1,7(1,7-1,8)	1,7(1,6-1,7)	1,75(1,71,8)	Н= 6,953; df=3, р=0,0734
Селезенка	1,25(1,2- 1,3)	1,15 (1,1 - 1,2)	1,1 (1,0-1,1)	1,1 (1,1 - 1,2)	Н= 10,938; df=3, р=0,0121
Почки	2,1 (2,1-2,2)	2,05 (2,0-2,1)	2,0(1,9-2,1)	2,0 (2,0 - 2,0)	Н= 10,364; df=3, р=0,0157

Согласно данным табл. 3, видно, что статистически значимые отличия у крыс-самцов всех групп выявлены в массе сердца и легких (р<0,05), но величина массы сердца и легких во всех опытных группах находится в пределах нормы. В массе печени, селезенки и почек у крыс-самцов всех групп отличия были статистически незначимы (р>0,05).

У крыс-самок всех групп статистически значимые отличия выявлены в массе печени, селезенки и почек (р<0,05), но величина массы печени, селезенки и почек во всех опытных группах находится в пределах нормы. В массе сердца и легких у крыс-самок всех групп отличия были статистически незначимы (р>0,05).

При оценке острой токсичности не было отмечено ранней и отдаленной гибели экспериментальных животных, получавших 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-N-[3-(трифторметил)фенил]бензамид, поэтому определение уровня LD₅₀ не представляется возможным. В связи с этим LD₅₀ составляет более 2000 мг/кг. Таким образом, 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-№[3-(трифторметил)фенил]бензамид является практически нетоксичным соединением - относится к 5-му классу токсичности по модифицированной классификации Организации экономического содействия и развития (OECD) и согласно гармонизированной системе классификации опасности и маркировки химической продукции (GHS) относится к 5-му классу токсичности - т.е. обладает относительно низкой острой токсичностью. LD₅₀ 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-У-[3-(трифторметил)фенил]бензамида значительно выше, чем LD₅₀ препарата I ряда для лечения туберкулеза изониазида (LD₅₀ изониазида составляет 170 мг/кг при внутрижелудочном введении мышам [7]), что характеризует 3-[4-(2фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-№-[3-(трифторметил)фенил]бензамид как значительно менее токсичное соединение.

Источники информации.

1. Шульгина М.В. и др. Патогенные и условно-патогенные микобактерии. - 2018.

2. Клиническое руководство по диагностике и лечению туберкулеза и его лекарственно-устойчивых форм / Е.М. Скрягина и др. - Минск, 2017. - 140 с.

3. Вольф С.Б. Нежелательные побочные реакции на химиотерапию туберкулеза // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2016. - №. 3 (55). - С. 141-146.

4. Griffiths P.A., Babb J.R., Fraise A.P. Mycobacterium terrae: a potential surrogate for Mycobacterium tuberculosis in a standard disinfectant test // Journal of Hospital Infection. - 1998. -Vol. 38, No. 3.- P. 183-192.

5. Antimycobacterial properties of 5H-[1,3,4]thiadiazolo[2,3b]quinazolin-5-one derivatives / O.G. Sechko et al. // Revista Farmaceutica a Moldovei. - 2020. - No 1-4. - P. 27-29.

6. Siddiqi S.H., Rusch-Gerdes S. MGIT™ procedure manual for BACTEC™ MGIT 960™ ТВ System // Geneva, Switzerland: Foundation for innovative new diagnostics. - 2006.

7. Brennan, P.J. Isoniazid / P.J. Brennan, D.B. Young // Tuberculosis (Edinb). - 2008. -Vol. 88. - No. 2. P. 112-116.

Claims (2)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Способ получения фенил] бензамида формулы I
2. 3 - [4-(2-фторбензоил)пиперазин-1 -карбонил] -N - [3 -(трифторметил)о F

   I заключающийся в том, что изофталевую кислоту обрабатывают оксалилхлоридом в тетрагидрофуране в присутствии диметилформамида, полученный изофталоил дихлорид последовательно конденсируют в одной колбе с 3-(трифторметил)анилином и 1-(2-фторбензоил)пиперазином в тетрагидрофуране с добавлением эквимолярного количества триэтиламина и выделяют целевой продукт методом кристаллизации.