EA039897B1 - Применение ингибитора мек для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа - Google Patents

Применение ингибитора мек для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа Download PDF

Info

Publication number
EA039897B1
EA039897B1 EA201692303A EA201692303A EA039897B1 EA 039897 B1 EA039897 B1 EA 039897B1 EA 201692303 A EA201692303 A EA 201692303A EA 201692303 A EA201692303 A EA 201692303A EA 039897 B1 EA039897 B1 EA 039897B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
infection
inhibitor
cells
influenza
aureus
Prior art date
Application number
EA201692303A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201692303A1 (ru
Inventor
Кристина Эрхардт
Штефан Людвиг
Original Assignee
Атрива Терепьютикс Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Атрива Терепьютикс Гмбх filed Critical Атрива Терепьютикс Гмбх
Publication of EA201692303A1 publication Critical patent/EA201692303A1/ru
Publication of EA039897B1 publication Critical patent/EA039897B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению ингибитора МЕК для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию, опосредованную бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae, и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, где ингибитор МЕК выбран из группы, включающей CI-1040 и GDC-0973. Также предусмотрена композиция, содержащая такой ингибитор для применения в способе лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к применению ингибитора МЕК для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа. Также предусмотрена композиция, содержащая такой ингибитор, для применения при лечении коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа.
Предпосылки создания изобретения
Вирусы гриппа А являются возбудителем тяжелых респираторных заболеваний, которые приводят к значительной частоте осложнений и смертности. Большая часть летальных исходов во время инфекции вируса гриппа (IV) фактически является результатом вторичной пневмонии, вызванной различными бактериями, такими как Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae (Morens et al., 2008, Chertow et al., 2013). Наиболее острые проблемы в отношении бактериальной коинфекции заключаются в непредвиденном повышении патогенности (lwao et al., 2012, Paddock et al., 2012, Parker et al., 2012) и ограниченном наборе эффективных противоинфекционных средств против различных патогенов. Главными причинами неудовлетворительных результатов лечения являются высокая изменчивость вирусов гриппа и постоянное появление новых штаммов (Neumann et al., 2009, Taubenberger et al., 2010, Parry, 2013), определенные свойства бактериальных штаммов (Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Gillet et al., 2007, Shilo et al., 2011), а также быстрое развитие устойчивости как вирусов гриппа (Hayden et al., 1992, Bright et al., 2006, Pinto et al., 2006, De Clercq et al., 2007, Pinto et al, 2007), так и бактерий (Grundmann et al., 2006, Moran et al.,2006, Shilo et al., 2011) против доступных лекарственных средств/антибиотиков. Более того, характерным является то, что в настоящее время лечение коинфекций, вызванных вирусами гриппа и бактериями, не предоставляется возможным с применением одного соединения. Согласно настоящему изобретению данная проблема решается в том аспекте, что предлагается противовоспалительная стратегия против коинфекций, включающих бактериальную инфекцию, опосредованную бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae, и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, с применением одного лекарственного средства. Кроме того, согласно настоящему изобретению решается проблема быстрого развития устойчивости бактерий путем получения лекарственного средства, которое целенаправленно воздействует на клеточные факторы, а не на саму бактерию.
Сущность изобретения
Техническая задача решается при помощи отображенных в формуле изобретения вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, и проиллюстрированных в примерах и на фигурах.
Как было указано ранее, настоящее изобретение относится к применению ингибитора МЕК для лечения коинфекций, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа.
Несмотря на интенсивные исследования в прошлом веке, IV все еще представляет серьезную опасность для человечества. Сезонные вспышки заболевания, которые особенно опасны для лиц пожилого возраста и лиц с ослабленным иммунитетом, связаны с инфекциями, вызванными вирусами гриппа А или В.
В течение последних десятилетий наблюдается повышение частоты возникновения метициллинрезистентных штаммов S. aureus, вызывающие проблемы, особенно у младенцев и детей, которые одновременно были инфицированы IV (Iverson et al., 2011, Thorburn et al., 2012). Одной из основным проблем, возникающих при бактериальных коинфекциях, является непредвиденное и сильное повышение патогенности, которое, вероятно, обусловлено ускоренной экспрессией цитокина, что также приводит к повреждению тканей. В частности, при коинфекции, вызванной лейкоцидином Пантон-Валентина (PVL), экспрессируемым S. aureus, наблюдается тяжелое повреждение эпителия легкого, вызванное неконтролируемым высвобождением протеаз после опосредованного PVL уничтожения нейтрофилов (Gillet et al., 2007, Niemann et al., 2012). Бактериальные коинфекции обычно появляются в течение первых шести дней после инфекции IV, приводя к еще более быстрому развитию болезни, воспалению легких и повышению смертности (Iverson et al., 2011, Chertow et al., 2013). Однако в некоторых случаях бактериальная коинфекция возникает, когда, как кажется, вирусная инфекция уже устранена. Для лечения вирусных/бактериальных коинфекции существуют только ограниченные возможности.
Одна перспективная противовирусная стратегия для борьбы с гриппом основана на факте, что IV, будучи внутриклеточными патогенами, сильно зависят от клеточных сигнальных систем (Gong et al., 2009, Ludwig, 2009). IV приобрели способность захватывать клеточные факторы для своих собственных целей (Ludwig et al., 2003). Более того, IV способны подавлять врожденный иммунный ответ своих хозяев. С учетом этих зависимостей, клеточные функции, способствующие поддержанию вируса, являются наиболее перспективными кандидатами для нового противовирусного воздействия (Ludwig et al., 2003, Ludwig, 2011, Planz, 2013). В последние годы исследователи выявили, что подходящими мишенями в подходе к противовирусной терапии являются пути передачи сигнала в рамках сигнального каскада митоген-активируемых киназ
- 1 039897
Raf/MEK/ERK (Pleschka et al., 2001, Ludwig et al., 2004, Olschlager et al., 2004, Marjuki et al., 2006, Ludwig, 2009, Droebner et al., 2011), модуль IKK/NFkB (Pleschka et al., 2001, Wurzer et al., 2004, Marjuki et al., 2006, Mazur et al., 2007, Ludwig et al., 2008, Dudek et al., 2010, Droebner et al., 2011, Ehrhardt et al., 2013, Haasbach et al., 2013), сигнальный путь p38 (Borgeling et al., 2014), а также сигнальный путь PI3K (Ehrhardt et al., 2006, Ehrhardt et al., 2007a, Ehrhardt et al., 2007b, Ehrhardt et al., 2009, Eierhoff et al., 2010).
Целенаправленное воздействие на клеточные, а не вирусные факторы, предупреждает проблему устойчивости, поскольку патоген не может заменить утраченную клеточную функцию. Для некоторых клеточных факторов химические соединения являются доступными даже несмотря на то, что на ранней стадии некоторые из них уже прошли клиническое испытание или даже уже лицензированы. В отличие от репликации IV, деление S. aureus не зависит от клетки-хозяина. Новые антибактериальные альтернативные средства не нацелены на важные генные продукты, вырабатываемые патогеном, а ингибируют вирулентные факторы в ходе инфекции, вызванной S. aureus, без уничтожения бактерии или стимуляции иммунитета хозяина (Park et al., 2012). С помощью других стратегий предупреждают образование колоний S. aureus у человека в качестве хозяина (Park et al., 2012). Такие соединения также характеризуются более низкой способностью к индукции устойчивости. За последнее время накопились данные, что S. aureus также использует клеточные сигнальные пути для собственной выгоды во время инфекции (OviedoBoyso et al., 2011), однако такие клеточные факторы, способствующие поддержанию бактерий, до сих пор не были подробно охарактеризованы в качестве мишеней для антибактериальный терапии.
Неожиданного было обнаружено, что лекарственные средства против внутриклеточных сигнальных факторов, таких как NFkB, киназы МЕК или р38 MAP, которые, как было показано ранее, обладают противогриппозной активностью, также характеризуются активностью в отношении S. aureus и обеспечивают снижение титров как вирусов, так и бактерий в случае коинфекции. Таким образом, такие ингибиторы элементов пути передачи сигнала являются наиболее перспективными кандидатами для лечения вызванных IV или только S. aureus инфекций, однако, что наиболее важно, для лечения тяжелого гриппа с сопутствующей бактериальной коинфекпией.
В одном варианте осуществления ингибитор МЕК предназначен для лечения коинфекции в соответствии с настоящим изобретением, где бактериальная инфекция опосредована бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae.
В другом варианте осуществления ингибитор МЕК предназначен для лечения коинфекции в соответствии с настоящим изобретением, где инфекция вируса гриппа опосредована вирусом гриппа А или вирусом гриппа В, при этом предпочтительно вирус гриппа А представляет собой H1N1, H2N2, H3N2, H6N1, H7N7, H7N9, H9N2 H10N7, H10N8 или H5N1.
В дополнительных вариантах осуществления ингибитор МЕК предназначен для лечения коинфекции в соответствии с настоящим изобретением у позвоночного.
Также в настоящем изобретении предусмотрена композиция, содержащая ингибитор МЕК, для применения в способе лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию опосредованную бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae, и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, где ингибитор МЕК выбран из группы, включающей CI-1040 и GDC-0973. Предпочтительно композиция дополнительно содержит носитель.
Краткое описание графических материалов
На фигурах показано.
Фиг. 1 - шкала времени процедуры коинфицирования. Клетки инфицировали IV в течение 30 мин. Проводили коинфицирование с помощью S. aureus 6850, или клетки были подвергунты имитационной обработке. Внеклеточные бактерии лизировали и удаляли при обработке антибиотиком спустя 3 ч после инфицирования бактериями. После промывания в PBS клетки дополняли свежей средой (DMEM/INV) и инкубировали не более 18 ч после инфицирования вирусом.
Фиг. 2 - ингибитор МЕК U0126 обеспечивает снижение титров IV (A/Puerto Rico/8/34) и нагрузки S. aureus даже в случае коинфицирования. Эпителиальные клетки легкого человека высеивали в 6луночные планшеты (8х105 клеток/лунку) в 2 мл DMEM [10% FCS]. Спустя 16-20 ч после высеивания клетки промывали и инкубировали с PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] (500 мкл на 6 лунок) или PBS/BA, содержащем вирус гриппа A/Puerto Rico/8/34, при множественном инфицировании (MOI=0,1) при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (2 мл на 6 лунок) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,5) в присутствии 50 мкМ U0126 или DMSO (растворитель в качестве контроля). Спустя 3 ч после инфицирования бактериями, клетки обрабатывали антибиотиками для удаления внеклеточных бактерий. Следовательно клетки промывали PBS и затем инкубировали с
- 2 039897
DMEM/INV, содержащей антибиотики [2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], (1 мл на 6 лунок) в течение мин при 37°С. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей мкМ U0126 или DMSO и 0,333 мкг/мл трипсина (Invitrogen). После периода инкубации в течение дополнительных 14 ч при 37°С определяли титры IV и внутриклеточных бактерий, как описано в (Hrincius et al., 2010, Tuchscherr et al., 2011).
Титры IV представлены в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл (А, С), а титры S. aureus представлены в виде колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (B,D). Данные представляют средние значения ± SD трех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего двухвыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001). (Е) S. aureus в присутствии 50 мкМ U0126 приводит к снижению титров бактерий при инкубации в течение 18 ч в сравнении с обработкой бактерий с помощью DMSO. Определенное количество S. aureus 6850 суспензионной культуры разбавляли в DMEM/INV, дополненной 50 мкМ U0126 или DMSO, и инкубировали при 37°С в течение 18 ч. Бактерии разбавляли и определяли с применением серийного разведения на чашках с агаром. Данные представляют средние значения ± SD трех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего двухвыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001).
Фиг. 3 - ингибитор МЕК U0126 обеспечивает снижение титров IV (A/FPV/Bratislava/79) и нагрузки S. aureus даже в случае коинфицирования. Эпителиальные клетки легкого человека высеивали в 6-луночные планшеты (8x105 клеток/лунку) в 2 мл DMEM [10% FCS]. Спустя 16-20 ч после высеивания клетки промывали и инкубировали с PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] (500 мкл на 6 лунок) или PBS/BA, содержащем вирус гриппа A/FPV/Bratislava/79, при множественном инфицировании (MOI=0,001) при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (2 мл на 6 лунок) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,5) в присутствии 50 мкМ U0126 или DMSO (растворитель в качестве контроля). Спустя 3 ч после инфицирования бактериями, клетки обрабатывали антибиотиками для удаления внеклеточных бактерий. Следовательно клетки промывали PBS и затем инкубировали с DMEM/INV, содержащей антибиотики [2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], (1 мл на 6 лунок) в течение 20 мин при 37°С. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей 50 мкМ U0126 или DMSO. После периода инкубации в течение дополнительных 14 ч при 37°С определяли титры IV и внутриклеточных бактерий, как описано в (Hrincius et al., 2010; Tuchscherr et al., 2011). Титры IV представлены в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл (А, С), а титры S. aureus представлены в виде колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (В, D). Данные представляют средние значения ± SD двух независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего двухвыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001).
Фиг. 4 - ингибитор р38 SB202190 обеспечивает снижение титров IV и нагрузки S. aureus даже в случае коинфицирования. Эпителиальные клетки легкого человека высеивали в 6-луночные планшеты (8x10 клеток/лунку) в 2 мл DMEM [10% FCS]. Спустя 16-20 ч после высеивания клетки промывали и инкубировали с PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] (500 мкл на 6 лунок) или PBS/BA, содержащем вирус гриппа A/Puerto Rico/8/34, при множественном инфицировании (MOI=0,1) при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (2 мл на 6 лунок) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,5) в присутствии 10 мкМ SB202190 или DMSO (растворитель в качестве контроля). Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали антибиотиками для удаления внеклеточных бактерий. Следовательно клетки промывали PBS и затем инкубировали с DMEM/INV, содержащей антибиотики [2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], (1 мл на 6 лунок) в течение 20 мин при 37°С. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей 10 мкМ SB202190 или DMSO и 0,333 мкг/мл трипсина (Invitrogen). После периода инкубации в течение дополнительных 14 ч при 37°С определяли титры IV и внутриклеточных бактерий, как описано в (Hrincius et al., 2010; Tuchscherr et al., 2011). Титры IV представлены в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл (А, С), а титры S. aureus представлены в виде колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (В, D). Данные представляют средние значения ± SD трех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего двухвыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001).
Фиг. 5 - ингибитор NF-kappaB (NFkB) LG-ASA обеспечивает снижение титров IV и нагрузки S. aureus даже в случае коинфицирования. Эпителиальные клетки легкого человека высеивали в 6-луночные планшеты (8x10 клеток/лунку) в 2 мл DMEM [10% FCS]. Спустя 16-20 ч после высеивания клетки промывали и инкубировали с PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] (500 мкл на 6 лунок) или PBS/BA, содержащем вирус
- 3 039897 гриппа A/Puerto Rico/8/34, при множественном инфицировании (MOI=0,1) при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (2 мл на 6 лунок) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,5) в присутствии 5 мМ LG-ASA. Воду применяли в качестве контрольного растворителя. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями, клетки обрабатывали антибиотиками для удаления внеклеточных бактерий. Следовательно клетки промывали PBS и затем инкубировали с DMEM/INV, содержащей антибиотики [10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], (1 мл на 6 лунок) в течение 20 мин при 37°С. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей 5 мМ LG-ASA или воды и 0,333 мкг/мл трипсина (Invitrogen). После периода инкубации в течение дополнительных 14 ч при 37°С определяли титры IV и внутриклеточных бактерий, как описано в (Hrincius et al., 2010, Tuchscherr et al., 2011). Титры IV представлены в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл (А, С), а титры S. aureus представлены в виде колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (В, D). Данные представляют средние значения ± SD двух независимых экспериментов (титр вируса) и трех независимых экспериментов (титр бактерий) с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего двухвыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001).
Фиг. 6 - амифлю в качестве ингибитора вирусной нейраминидазы снижает уровень репликации IV, однако увеличивает нагрузку S. aureus.
Эпителиальные клетки легкого человека высеивали в 6-луночные планшеты (8x105 клеток/лунку) в 2 мл DMEM [10% FCS]. Спустя 16-20 ч после высеивания клетки промывали и инкубировали с PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] (500 мкл на 6 лунок) или PBS/BA, содержащем вирус гриппа A/FPV/Bratislava/79, при множественном инфицировании (MOI=0,1) при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (2 мл на 6 лунок) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,5) в присутствии 2 мкМ тамифлю или Hepes (растворитель в качестве контроля). Спустя 3 ч после инфицирования бактериями, клетки обрабатывали антибиотиками для удаления внеклеточных бактерий.
Следовательно клетки промывали PBS и затем инкубировали с DMEM/INV, содержащей антибиотики [2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], (1 мл на 6 лунок) в течение 20 мин при 37°С. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей 2 мкМ тамифлю или HEPES. После периода инкубации в течение дополнительных 14 ч при 37°С определяли титры IV и внутриклеточных бактерий, как описано в (Hrincius et al., 2010; Tuchscherr et al., 2011).
Фиг. 7 - титры внутриклеточных S. aureus 6850 снижаются при обработке LG-ASA. Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали с помощью 0,5 MOI S. aureus 6850 в DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] в течение 3 ч в присутствии (А, С) и в отсутствие (В, D) в указанных количествах LG-ASA. Через три часа после инфицирования включали промывание с антибиотиком с применением DMEMANV, содержащей антибиотики [2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], для удаления непоглощенных бактерий, а затем клетки дополняли DMEM/INV, содержащей указанные количества LG-ASA. Морфологию клетки наблюдали с помощью световой микроскопии (А, В), а количества поглощенных бактерий определяли с применением серийного разведения на чашках с агаром спустя 18 ч после инфицирования (С, D).
Фиг. 8 (табл. 2) - ингибиторы р38.
Фиг. 9 (табл. 3) - ингибиторы NFkB.
Фиг. 10 (табл. 4) - ингибиторы NFkB.
Фиг. 11 (табл. 5) - антибиотики.
Фиг. 12 - шкала времени процедуры коинфицирования in vitro. Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали вирусом гриппа A (IAV) в течение 30 мин при указанном множественном инфицировании (MOI), растворенном в PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS. После чего осуществляли инфицирование бактериями Staphylococcus aureus 6850 (S. aureus), или клетки были подвергунты имитационной обработке. Следовательно клетки дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л, HEPES] с S. aureus или без него, в дополнение к указанным количествам ингибитора (U0126 или Cl-1040) или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями включали промывание с антибиотиком [DMEM, 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина или 100 мкг/мл гентамицина, 20 мин] для удаления непоглощенных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли средой для инфицирования DMEM (0,2% ВА, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина) в присутствии или в отсутствие ингибитора и инкубировали не более 18 ч после инфицирования вирусом при 37°С.
Фиг. 13 - ингибирование сигнального пути MEK/ERK приводит к повышению выживаемости клеток после инфицирования одного типа или коинфицирования.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса птичьего гриппа
- 4 039897
A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) или штаммом вируса гриппа человека A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) при множественном инфицировании (MOI=0,01) (H7N7) или (MOI=0,5) (H3N2) при 37°С. Через 30 мин разбавленный вирус удаляли, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV (содержащей 1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ HEPES) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,1) в присутствии 50 мкМ U0126 или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали DMEM/FBS, содержащей 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина в течение 20 мин для удаления непоглощенных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли средой для инфицирования DMEM/BA (0,2% ВА, 1 мМ MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина), содержащей 50 мкМ U0126 или растворитель. После периода инкубации в течение 18 ч при 37°С наблюдали морфологию клетки с помощью световой микроскопии.
Фиг. 14 - ингибирование сигнального пути MEK/ERK приводит к снижению титров вируса при инфицировании одного типа и коинфицировании.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса птичьего гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (А, С) или штаммом вируса гриппа человека A/Wisconsm/67/2005 (H3N2) (В, D) при множественном инфицировании (MOI=0,01) (А, С) или (MOI=0,5) (В, D) при 37°С. Через 30 мин разбавленный вирус удаляли, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV (содержащей 1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ HEPES) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,1) в присутствии 50 мкМ U0126 или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями, клетки обрабатывали DMEM/FBS, содержащей 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, в течение 20 мин для удаления внеклеточных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли средой для инфицирования DMEM/BA (0,2% ВА, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина), содержащей 50 мкМ U0126 или растворитель. После периода инкубации в течение 18 ч при 37°С определяли титры вируса при помощи стандартного анализа бляшкообразования. Титры вируса представлены в виде бляшкообразующих единиц/мл (БОЕ/мл) на линейной (А, В) или логарифмической шкале (С, D). Данные представляют средние значения ± SD четырех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего одновыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01).
Фиг. 15 - ингибирование МЕК при введении U0126 приводит к уменьшению бактериального роста.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса птичьего гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) или штаммом вируса гриппа человека A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (А, С) при множественном инфицировании (MOI=0,01) (H7N7) или (MOI=0,5) (H3N2) при 37°С. Через 30 мин разбавленный вирус удаляли, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV (содержащей 1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ HEPES) с S. aureus 6850 или без него (MOI=0,1) (А) в присутствии 50 мкМ U0126 или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали DMEM/FBS, содержащей 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, в течение 20 мин (А, С) для удаления непоглощенных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли средой для инфицирования DMEM/BA (0,2% ВА, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина), содержащей 50 мкМ U0126 или растворитель. Количества поглощенных бактерий определяли с применением серийного разведения клеточных лизатов на чашках с агаром спустя 18 ч после инфицирования (А, С). Влияние U0126 на бактериальный рост анализировали при введении U0126, как указано, в ночную культуру S. aureus 6850 (100 КОЕ/мл). Через 16 ч серийные разведения высевали на чашки с агаром BHI (В, D). Титры бактерий представлены в виде колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) на линейной (А, В) или логарифмической шкале (С, D). Данные представляют средние значения ± SD четырех (А, С) или трех (В, D) независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего одновыборочного t-критерия (***р<0,001).
Фиг. 16 - Ингибирование сигнального пути MEK/ERK приводит к уменьшению количества вирусных белков и провоспалительных хемокинов.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса гриппа человека A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) при множественном инфицировании (MOI=5) при 37°С. Через 30 мин разбавленный вирус удаляли, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV (содержащей 1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ HEPES) с S. aureus 6850 или без него (MOI=50) в присутствии 50 мкМ U0126 или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали DMEM/FBS, содержащей 10% FBS, 100 мкг/мл гентамицина, в течение 30 мин для удаления внеклеточных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли средой для инфицирования DMEM/BA (0,2% ВА, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина), содержащей 50 мкМ U0126 или растворитель. После периода инкубации в течение 8 ч при 37°С анализировали уровни мРНК CCL3 и CCL5 при помощи qRT-PCR со специфическими праймерами (А, В). Экспрессию вирусного белка (РВ-1) и уровень фосфорилирования ERK-1/2, а также компоненты бактериальной клеточной стенки (PGN), определяли при помощи вестерн-блоттинга (С). Данные представляют собой предварительные результаты по трем биологическим образцам и двум техническим повторам в одном эксперименте.
- 5 039897
Фиг. 17 - введение U0126 приводит к снижению титров бактерий in vivo независимо от титров вируса.
Мышей 12-недельного возраста Balb/C инфицировали штаммом вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (PR8, H1N1) при 50 БОЕ в день 0 (анестезировали изофлураном). Начиная с дня 1 мышей ежедневно обрабатывали с помощью i.p. инъекции 30 мг/кг/день U0126 или растворителя в качестве контроля (10% DMSO, 30% кремофора EL, 60% PBS). В день 3 мышей инфицировали Staphylococcus aureus 6850 при 5*107 КОЕ под анестезией с помощью изофлурана и непосредственно обрабатывали U0126 или растворителем в качестве контроля. В день 4 легкие удаляли и гомогенизировали в PBS (0,1 г на 1000 мкл PBS). Для расчета титров бактерий серийные разведения гомогената высевали на чашки с агаром BHI. Для определения титров вируса проводили стандартный анализ бляшкообразования. Статистический анализ проводили с применением U-критерия Манна-Уитни (*р<0,05).
Фиг. 18 - специфический ингибитор МЕК CI-1040 обеспечивает снижение титров вируса при инфицировании одного типа и коинфицировании.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса птичьего гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (А, С) или штаммом вируса гриппа человека A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (В, D) при множественном инфицировании (MOI=0,01) при 37°С. Через 30 мин разбавленный вирус удаляли, клетки промывали PBS и дополняли средой для инфицирования DMEM/INV (содержащей 1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ HEPES) с 6850 S. Aureus или без него (MOI=0,1) в присутствии 10 мкМ CI1040 или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями, клетки обрабатывали DMEM/FBS, содержащей 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, в течение 20 мин для удаления внеклеточных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли средой для инфицирования DMEM/BA (0,2% ВА, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина), содержащей 10 мкМ CI-1040 или растворитель. После периода инкубации в течение 18 ч при 37°С определяли титры вируса при помощи стандартного анализа бляшкообразования. Титры вируса представлены в виде бляшкообразующих единиц/мл (БОЕ/мл) на линейной (А, В) или логарифмической шкале (С, D). Данные представляют средние значения двух независимых экспериментов с двумя биологическими образцами.
Фиг. 19 - введение CI-1040 оказывает ингибирующий эффект на бактериальный рост in vitro.
Влияние CI-1040 на бактериальный рост анализировали при введении CI-1040 в различных концентрациях (как указано) в ночную культуру S. aureus 6850 (100 КОЕ/мл). Через 16 ч серийные разведения высевали на чашки с агаром BHI (А, В). Титры бактерий представлены в виде колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) на линейной (А) или логарифмической шкале (В). Данные представляют собой предварительные данные с двумя биологическими образцами.
Фиг. 20 - обработка специфическим ингибитором МЕК кобиметинибом (GDC-0973) обеспечивает уменьшение патогенной нагрузки in vivo.
Мышей 8-недельного возраста Balb/C (5 на группу) инфицировали штаммом вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (PR8, H1N1) при 50 БОЕ в день 0 (анестезировали изофлураном). Спустя 6 ч после инфицирования вирусом мышей обрабатывали посредством перорального введения 10 мг/кг/день кобиметиниба или растворителем в качестве контроля (10% DMSO, 5% Tween 20, 85% PBS). Далее обработку проводили ежедневно. В день 3 мышей инфицировали Staphylococcus aureus 6850 при 5*107 КОЕ под анестезией с помощью изофлурана, а через 6 ч обрабатывали кобиметинибом или растворителем в качестве контроля. В день 4 легкие удаляли и гомогенизировали в PBS (0,1 г на 1000 мкл PBS). Для расчета титров бактерий серийные разведения гомогената высевали на чашки с агаром BHI. Для определения титров вируса проводили стандартный анализ бляшкообразования. Статистический анализ проводили с применением U-критерия Манна-Уитни.
Фиг. 21 - LG-ASA улучшает морфологию клетки при инфицировании вирусом гриппа A (IAV) и/или Staphylococcus aureus (S. aureus).
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса гриппа человека A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) при множественном инфицировании (MOI=0,1), растворенном в PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] при 37°С. После 30 мин инкубации, разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ/л HEPES] с S. aureus SH1000 или без него (MOI=0,1) в присутствии 5 мМ LG-ASA или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали антибиотиками [DMEM, 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, 20 мин] для удаления внеклеточных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей 5 мМ LG-ASA или растворителем. После периода инкубации в течение 18 ч при 37°С наблюдали морфологию клетки с помощью световой микроскопии.
Фиг. 22 - ингибитор NFkB LG-ASA обеспечивает снижение титров вируса гриппа и нагрузки S. aureus.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) инфицировали штаммом вируса гриппа A/Puerto
- 6 039897
Rico/8/34 (H1N1) при множественном инфицировании (MOI=0,1), растворенном в PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] при 37°С (А-Н). После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нМ/л HEPES] с S. aureus SH1000 или без него (MOI=50) (А, В), (MOI=0,01) (C-D), S. aureus 6850 (MOI=50) (E, F), (MOI=0,1) (G, Н) в присутствии 5 мМ LG-ASA или растворителя в качестве контроля. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали антибиотиками [DMEM, 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, 20 мин] для удаления внеклеточных бактерий. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей 5 мМ LG-ASA или растворителем. После периода инкубации в течение 8 ч (А, В, Е, F) или 18 ч (С, D, G, Н) при 37°С определяли титры IAV (А, С, Е, G) с помощью стандартных анализов бляшкообразования. Клетки лизировали посредством гипотонического шока и количества поглощенных бактерий (В, D, F, Н) определяли с применением серийного разведения на чашках с агаром. Данные представляют средние значения ± SD трех (А-Н) с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего одновыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01).
Фиг. 23 - ингибитор NFkB LG-ASA обеспечивает снижение титров вируса гриппа и нагрузки S. aureus.
На этой фигуре представлены данные, полученные другим способом, как на фиг. 22. В частности, необработанные контроли в каждом эксперименте произвольно приравнивали к 100% и затем рассчитывали средние значения. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего одновыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01).
Фиг. 24 - Ингибирование сигнального пути NFkB приводит к снижению поглощения бактерий.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) предварительно инкубировали с 5 мМ (A-D) и 10 мМ (С, D) LG-ASA в течение 4 ч, а затем инфицировали S. aureus 6850 (MOI=50) (А, В) в течение 30-120 мин и USA 300 (MOI=5) (С, D) в течение 120 мин в присутствии и в отсутствие указанных количеств LG-ASA, растворенных в DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES]. Спустя 30-120 мин после инфицирования включали промывание с антибиотиком [DMEM, 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, 20 мин] для удаления непоглощенных бактерий. Клетки трижды промывали PBS и лизировали посредством гипотонического шока. Количества поглощенных бактерий определяли с применением серийного разведения на чашках с агаром (A-D). Данные (А, С) представляют средние значения ± SD трех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. На фиг. 24 В, D необработанные контроли в каждом эксперименте произвольно приравнивали к 100% и затем рассчитывали средние значения. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего одно выборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001).
Фиг. 25 - стимуляция сигнального пути NFkB приводит к повышению поглощения бактерий.
Эпителиальные клетки легкого человека (А549) предварительно инкубировали с 5 мМ LG-ASA и 2,5 нг/мл TNF-альфа в течение 4 ч, а затем инфицировали (А) S. aureus 6850 или (В) S. aureus USA300 (MOI=5) в течение 120 мин в присутствии и в отсутствие указанных количеств LG-ASA и TNF-альфа, растворенных в DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (А). Спустя 120 мин после инфицирования включали промывание с антибиотиком [DMEM, 10% FBS, 2 мкг/мл лизостафина, 20 мин] для удаления непоглощенных бактерий. Клетки трижды промывали PBS и лизировали посредством гипотонического шока. Количества поглощенных бактерий определяли с применением серийного разведения на чашках с агаром (А) спустя 120 мин после инфицирования. (А) Данные представляют средние значения ± SD четырех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, а затем с помощью критерия множественного сравнения (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001). (В) Данные представляют средние значения ± SD трех независимых экспериментов с тремя биологическими образцами, при этом необработанные контроли в каждом эксперименте произвольно приравнивали к 100% и затем рассчитывали средние значения.
Фиг. 26 - обработка коинфицированных IAV/S. aureus мышей с помощью LG-ASA приводит к повышению выживаемости и снижению потери веса тела.
(A) мышей BALB/c (4 мыши на группу) инфицировали вирусом гриппа A/Puerto Rico/8/34 при 50 БОЕ в день 0. В день 6 после инфицирования вирусом гриппа мышей дополнительно инфицировали S aureus 6850 при 108 КОЕ. В день 7 после инфицирования вирусом гриппа коинфицированных мышей обрабатывали с помощью LG-ASA (1 моль, 10 мин) один раз в день посредством ингаляции. Выживаемость контролировали в течение 14 дней.
В то время как (4/4) (черная линия) необработанные коинфицированные мыши умирали через 1 день после коинфицирования, (2/4) обработанные с помощью LG-ASA коинфицированные мыши выживали (серая линия).
(В) показаны результаты двух независимых экспериментов. Мышей Balb/C 9-недельного возраста (4 мыши на группу) инфицировали штаммом вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 при 50 БОЕ утром в день
- 7 039897 (анестезировали изофлураном). Спустя 6 ч после инфицирования вирусом мышей взвешивали и обрабатывали Н2О в виде аэрозоля или 1М LG-ASA в ингаляционной камере в течение 10 мин. Такую обработку также проводили в день 1, 2 и 3 в то же время, что и в день 0. Утром в день 3 мышей инфицировали Staphylococcus aureus 6850 при 5*107 КОЕ под анестезией с помощью изофлурана. В день 4 мышей взвешивали в последний раз. Статистический анализ проводили с применением U-критерия МаннаУитни (*р<0,05).
Подробное описание настоящего изобретения и предпочтительного варианта осуществления
Следующее описание включает в себя информацию, которая может быть полезна для понимания настоящего изобретения. Не является признанием то, что любая информация, предусмотренная в настоящем документе, является предшествующим уровнем техники или имеет отношение к недавно заявленным изобретениям, или что любая публикация, упоминаемая прямо или косвенно, является предшествующим уровнем техники.
Ранее было указано, что настоящее изобретение относится к применению ингибитора МЕК для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа.
Используемый в настоящем документе ингибитор МЕК также может быть назван ингибитором киназы митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК). Известно, что в сигнальном пути МАРК, киназа киназы МАРК (МАРККК) активирует киназу МАРК (МАРКК), которая, в свою очередь, активирует МАРК, которая передает сигнал, например, транскрипционному фактору, или другим киназам, или эффекторному белку/белку-переносчику сигнала; см., например, фиг. 1 у Fremin and Meloche (Fremin and Meloche (2010), J. Hematol. Oncol. 11;3:8). Ингибиторы МЕК по настоящему изобретению предпочтительно ингибируют МЕК 1/2 у субъекта, такого как млекопитающее или птица, как описано в настоящем документе. Однако, может быть и так, что ингибитор МЕК по настоящему изобретению ингибирует не только МЕК, предпочтительно МЕК1/2, но также и вышерасположенную от нее киназу (т.е. МАРККК), тем самым осуществляя двойное ингибирование. Не вдаваясь в теорию, PLX-4032 может быть таким двойным ингибитором. Следовательно ингибитор МЕК по настоящему изобретению в предпочтительном аспекте может быть двойным ингибитором, ингибируя, таким образом, МЕК, предпочтительно МЕК 1/2 и соответствующую вышерасположенную МАРККК. МЕК 1/2 представляет собой МАРКК в сигнальном пути Ras/Raf, где при этом Ras/Raf действует как МАРККК, a ERK1/2 действует как МАРК.
Ингибитор МЕК может представлять собой малую молекулу, большую молекулу, пептид, олигонуклеотид и т.п. Ингибитор МЕК может быть белком, или его фрагментом, или молекулой нуклеиновой кислоты. Также выражение ингибитор МЕК включает фармацевтически приемлемую соль ингибитора МЕК.
Определение того, является ли соединение ингибитором МЕК, или не является таковым, находится в пределах квалификации рядового специалиста в данной области. В одном варианте осуществления ингибиторы МЕК выбраны из группы, включающей соединения/ингибиторы, перечисленные в таблице 1.
Ингибиторы MEK по настоящему изобретению выбраны предпочтительно из U0126, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, CI-1040, PD0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059, PD184352 ARRY-438162 и PF-3644022, предпочтительно AZD8330, GSK-1120212, U0126, GDC-0973, CI-1040, PD0325901, ARRY-438162, PF-3644022 и AZD6244 и наиболее предпочтительно U0126, CI-1040, GDC-0973 (кобиметиниба), AZD8330, GSK-1120212, наиболее предпочтительно U0126, GDC-0973, CI-1040, AZD8330 и GSK-1120212.
Некоторые из таких ингибиторов дополнительно описаны ниже в таб. 1.
- 8 039897
Таблица 1. Ингибиторы МЕК
О А II 1 н F'''’A ό..... 1 Структурная формула I CI-1040 2-(2-хлор-4-йодфениламино)-М(циклопропилметокси)-3,4дифторбензамид
о О о /=\ ΖΙ -π ΖΙ Структурная формула II PD0325901 (К)-Н-(2,3-дигидроксипропокси)- 3,4-дифтор-2-(2-фтор-4-йодфениламино)бензамид
А. VaAsAa-a/^ / J Структурная формула III AZD6244 6-(4-бром-2-хлорфениламино)-
7-φτορ-Ν-(2-гидро ксиэтокси)-3- метил- ЗН-бензо[с1]имидазол-5-карбоксамид
F ,—НО 0 )= \ *—X/—HW А /—1 NH O^f Структурная формула IV GDC-0973 [3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4йодфенил)амино] фенил] [3-гидрокси-3-[(28)-2-пиперидинил]- 1 -азетидинил]метанон
He'S Vy° О ΝΗ н F 'ДО; F Структурная формула V RDEA-119 (8)-М-(3,4-дифтор-2-(2-фтор-4йодфенил-амино)-6-метоксифенил)1-(2,3- дигидроксипропил)циклопропан-1 сульфонамид
гху . О IN — O^'n Структурная формула VI GSK-1120212 N-(3 -(3 -циклопропил-5-(2-фтор-4йодфениламино)- 6,8-диметил-2,4,7-триоксо-3,4,6,7тетрагидропиридо [4,3-с1]пиримидин- 1(2Н)ил)фенил)ацетамид
- 9 039897
F H Y'qW·™ о Структурная формула VII AZD8330 2-(2-фтор-4-йодфениламино)-Х- (2-гидроксиэтокси)-1,5-диметил-6оксо- 1,6-дигидропиридин-З -карбоксамид
о xxXxa v Структурная формула VIII RO5126766 C20H16FN5O5S
‘^0 0 γ/ Η A Ισ· τ Структурная формула IX RO4987655 C20H19F3IN3O5
Fxy HO e Ν ^Ο 1 Структурная формула X ТАК-733 (R)-3 -(2,3 - дигидроксипропил)-6фтор-5- (2-фтор-4-йодфениламино)-8- метилпиридо [2,3-й]пиримидин-4,7(ЗН,8Н)-дион
- 10 039897
Также предпочтительным является выбор из PLX-4032, AZD6244, AZD8330, GDC-0973, RDEA119, GSK1120212, RO51267766, RO4987655, TAK-733 и AS703026. Еще более предпочтительно они выбраны из AZD6244, AZD8330, GSK1120212 и PLX-4032 или из PD-0325901, AZD-6244, AZD-8330 и RDEA-119. Такие ингибиторы МЕК известны из уровня техники и, например, описаны в табл.1 у Fremin and Meloche (2010), J. Hematol. Oncol. 11;3:8.
Более подробная информация по некоторым из таких ингибиторов можно получить из Arthur and Ley (2013) Mitogen-activated protein kinases in innate immunity; Nature Reviews Immunology 13,679692(2013).
Действительно, как показано в прилагаемых примерах, ингибиторы MEK U0126 и CI-1040, раскрытые в настоящем документе, демонстрируют эффект в случае коинфекции, а также в случае только бактериальной инфекции.
Ингибитор киназы р38 MAP хорошо известен из уровня техники. Выражения ингибитор р38, ингибитор киназы р38 и ингибитор киназы р38 MAP используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В контексте настоящего изобретения ингибитор киназы р38 MAP ингибирует киназу р38 MAP. Предпочтительно ингибитор киназы р38 MAP ингибирует одну из изоформ киназы р38 MAP, предпочтительно одну из четырех изоформ (α, β, γ или δ) киназы р38 MAP, предпочтительно αизоформу, более предпочтительно он ингибирует любую комбинацию из двух изоформ киназы р38 MAP, еще более предпочтительно он ингибирует любую комбинацию из трех изоформ киназы р38 MAP и наиболее предпочтительно он ингибирует все изоформы из изоформ α, β, γ и δ киназы р38 MAP. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы р38 MAP ингибирует изоформу р38, которая вовлечена в воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, деструктивные поражения костей, пролиферативные нарушения, инфекционные заболевания, вирусные заболевания или нейродегенеративные заболевания. Как сообщается, α-изоформа киназы р38 MAP вовлечена в воспаление, пролиферацию, дифференциацию и апоптоз, при этом биологические функции р38 β, р38 δ и р38 γ все еще не до конца понятны. Соответственно, согласно настоящему документу предпочтительно ингибитор киназы р38 MAP ингибирует α-изоформу.
Ингибитор киназы р38 MAP может представлять собой малую молекулу, большую молекулу, пептид, олигонуклеотид и т.п. Ингибитор киназы р38 MAP может быть белком или его фрагментом или мо- 11 039897 лекулой нуклеиновой кислоты. Также выражение ингибитор р38 включает фармацевтически приемлемую соль ингибитора 38.
Определение того, является ли соединение ингибитором киназы р38, или не является таковым, находится в пределах квалификации рядового специалиста в данной области.
Существует множество примеров ингибиторов р38 в уровне техники. В патентах США № 5965583, 6040320, 6147096, 6214830, 6469174, 6521655 раскрыты соединения, которые являются ингибиторами р38. В патентах США № 6410540, 6476031 и 6448257 также раскрыты соединения, которые являются ингибиторами р38. Аналогично, в патентах США № 6410540, 6479507 и 6509361 раскрыты соединения, которые заявляются как ингибиторы р38. В опубликованных заявках на патент США № 20020198214 и 20020132843 раскрыты соединения, указанные как ингибиторы р38. Другой ингибитор киназы р38 MAP представляет собой BIRB 796 BS (1-(5-трет-бутил-2-n-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-[4-(2-морфолин-4-илэтокси)-нафталин-1-ил]-мочевина); см. Branger (2002), J. Immunol. 168:4070-4077 или US 6319921 для рассмотрения дополнительных ингибиторов киназы р39 MAP.
Другие ингибиторы киназы р38 MAP представляют собой AMG 548 (Amgen), BIRB 796 (Boehringer Ingelheim), VX 702 (Vertex/Kissei), SCIO 469, SCIO 323 (Scios Inc.), SB 681323 (GlaxoSmithKline), PH797804 (Pfizer) и Org-48762-0 (Organon NV); см., например, Lee and Dominguez in Curr Med Chem. 2005;12(25):2979-2994 и Dominguez in Curr Opin Drag Discov Devel. 2005 Jul;8(4):421-430.
Согласно настоящему изобретению ингибитор может оказывать свое регуляторное влияние выше или ниже по сигнальному пути относительно киназы р38 MAP или непосредственно на киназу р38 MAP, при этом последний способ действия является предпочтительным. Примеры ингибитора, регулирующего активность киназы р38 MAP, включают такие, где ингибитор может снижать уровень транскрипции и/или трансляции киназы р38 MAP, может снижать уровень или ингибировать посттрансляционную модификацию, и/или перемещение в клетке киназы р38 MAP, или может сокращать время полужизни киназы р38 MAP. Ингибитор может также обратимо или необратимо связывать киназу р38 MAP, ингибировать ее активацию, инактивировать ее ферментативную активность или иным образом нарушать ее взаимодействие с нижерасположенными субстратами.
Четыре изоформы киназы р38 MAP имеют высокую степень гомологии последовательностей. Альфа и бета изоформы киназы р38 MAP являются близкородственными, в то время как гамма и дельта изоформы являются более отличными. Учитывая высокую степень структурного сходства, не удивительно, что определенные соединения, способные ингибировать одну изоформу киназы р38 MAP, часто могут ингибировать другие изоформы киназы MAP. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы р38 MAP, который является специфическим для α-изоформы киназы, характеризуется по меньшей мере тремя категориями структурных признаков, которые теоретически допускают специфическое ингибирование изоформ.
Избирательное связывание ингибитора-кандидата киназы р38 MAP может быть определено с помощью ряда способов. Гены различных изоформ киназы р38 MAP известны из уровня техники. Рядовой специалист в данной области может легко клонировать и экспрессировать различные изоформы киназы, выделить их и затем провести исследования по связыванию с соединениями-кандидатами для определения характеристик связывания изоформ. Такие серии экспериментов были проведены для α-изоформы киназы р38 MAP, и они представлены в патенте США № 6617324 В1.
Другой анализ избирательности в отношении киназы описан в Mihara (2008), Br. J.Pharmacol. 154(1): 153-164.
Более подробная информация по некоторым из таких ингибиторов можно получить из Arthur and Ley (2013) Mitogen-activated protein kinases in innate immunity; Nature Reviews Immunology 13,679692(2013).
NFkB (ядерный фактор энхансера гена легкой цепи каппа активированных В-клеток) является белковым комплексом, который управляет транскрипцией ДНК. NFkB обнаружен почти во всех типах клеток животных и вовлечен в клеточные ответы на стимулы, такие как стресс, цитокины, свободные радикалы, ультрафиолетовое излучение, окисленные ЛПНП и бактериальные или вирусные антигены. Транскрипционные комплексы NFkB у позвоночных могут находится в виде любых из множества гомо- и гетеродимеров, образованных субъединицами р50 (NFkBI), p52 (NFkB2), c-Rel, RelA (р65) и RelB (Gilmore TD. (2006) Oncogene 25: 6680-6684). Такие комплексы связываются с регуляторными участками ДНК, называемыми кВ-участками, как правило, для активации экспрессии конкретного гена-мишени. В большинстве типов клеток димеры NFkB находятся в цитоплазме в неактивной форме за счет связывания с любым из нескольких белков-ингибиторов IkB (IkB α, β, ε, γ, р105 и р100). В ответ на широкий спектр стимулов 1кВ быстро фосфорилируется, присоединяет убиквитин и разрушается с помощью протеасомы. Затем освобожденный димер NFkB перемещается в ядро, где он может модулировать экспрессию конкретного гена.
Фосфорилирование и разрушение IkB имеет большое значение для регуляции комплексов NFkB, что опосредуется комплексом киназы IkB (IKK), содержащим две киназные субъединицы, IKKa и IKKe, и связанный регуляторный белок, подобный каркасному белку, называемый NEMO (он же IKKy) (Gil- 12 039897 more and Herscovich (2006) Inhibitors of NFkB signaling: 785 and counting Oncogene. 25, 6887-6899). Следует отметить, что, как показано в качестве примера в примере 3 настоящего изобретения, сигнальный путь
NFkB также имеет важное значение для поглощения бактерий (таких как S. aureus) в клетки.
Согласно настоящему изобретению ингибитор может оказывать свое регуляторное влияние выше или ниже по сигнальному пути относительно NFkB или непосредственно на NFkB, при этом последний способ действия является предпочтительным. Примеры ингибиторов, регулирующих активность NFkB, включают такие, где ингибитор может снижать уровень транскрипции и/или трансляции NFkB или может сокращать время полужизни NFkB. Ингибитор может также обратимо или необратимо связывать NFkB, ингибировать его активацию, инактивировать его активность или иным образом нарушать его взаимодействие с нижерасположенными мишенями, такими как гены-мишени. Также ингибитор NFkB может ингибировать протеинкиназы, такие как молекулы, которые ингибируют фосфорилирование IkBa посредством, например, ингибирования IKK. Соединения, которые обладают такой активностью, представляют собой SC-893, BMS-345541, которые могут выступать в качестве эталонных соединений. Также ингибитор NFkB может ингибировать протеинфосфатазы, или ингибировать протеасому, или убиквитинирование. Примеры таких ингибиторов NFkB, которые могут также выступать в качестве эталонных соединений, включают ингибиторы тирозиновой протеинфосфатазы, боронат, бортезомиб, NPI-0052. В качестве альтернативы, ингибитор NFkB может блокировать транслокацию в ядро NFkB или его связывание с ДНК. Примеры таких ингибиторов включают такие, которые могут также выступать в качестве эталонных соединений, SN50, дегидроксиметилэпоксихиномицин и имитаторы NFkB ODN. Дополнительную информацию по ингибитору NFkB МОЖНО получить из Gupta et al. (2010) (Gupta et al. (2010) Inhibiting NFkB activation by small molecules as a therapeutic strategy. Biochim Biophys Acta. 1799(10-12): 775-787).
Ингибитор NFkB может представлять собой малую молекулу, большую молекулу, пептид, олигонуклеотид и т.п. Ингибитор NFkB может быть белком, или его фрагментом, или молекулой нуклеиновой кислоты. Также выражение ингибитор NFkB включает фармацевтически приемлемую соль ингибитора NFkB. В ОДНОМ варианте осуществления ингибитор NFkB выбран из группы, включающей ингибиторы/молекулы, перечисленные в таблицах 3 и 4 на фиг. 9 и 10. В другом варианте осуществления ингибитор NFkB выбран из группы, включающей ингибиторы/молекулы, перечисленные в табл. 3 на фиг. 9. В другом варианте осуществления ингибитор NFkB выбран из группы, включающей ингибиторы/молекулы, перечисленные в табл. 4 на фиг. 10.
Вместе с выражением SC75741 или SC75741 (и производные) в дополнение к SC75741 в настоящем изобретении также предусмотрены производные SC75741.
В целом специалист в данной области знает как выяснить, является ли соединение ингибитором МЕК, ингибитором р38 и/или ингибитором NFkB. Дополнительным примером того, как можно определить, является соединение ингибитором МЕК и/или ингибитором р38, будет выделение белка МЕК и/или р38 NFkB. Белок может быть выделен из клеток, где белок МЕК и/или р38 экспрессируется естественным образом или где он сверхэкспрессируется в результате трансфекции олигонуклеотида или при инфицировании вирусом, который управляет экспрессией белка МЕК и/или р38. Дополнительно белок МЕК и/или р38 может также быть экспрессирован рекомбинантно. После выделения белка рядовой специалист в данной области может измерить активность киназы в присутствии или в отсутствие потенциального ингибитора МЕК и/или р38. Если киназная активность ниже в присутствии предполагаемого ингибитора, чем в его отсутствие, значит ингибитор представляет собой ингибитор МЕК и/или р38 соответственно.
Если воздействие на МЕК и/или р38 непосредственное, ингибитор должен характеризоваться значением IC50 приблизительно 5 мкМ или меньше, предпочтительно 500 нМ или меньше, более предпочтительно 100 нМ или меньше. В сходном варианте осуществления ингибитор должен характеризоваться значением IC50 в отношении р38-а изоформы, которое предпочтительно по меньшей мере в десять раз меньше, чем значение, наблюдаемое при исследовании того же ингибитора в отношении других изоформ киназы р38 MAP, в этом же или в сравнительном анализе. Следует отметить, что значения IC50 зависит от анализа и могут изменяться от определения к определению. Важнее учитывать относительные соотношения значений IC50 для соединений, а не сами точные значения.
IC50 представляет собой концентрацию соединения, которая ингибирует фермент на 50% относительно активности, измеренной в отсутствие ингибитора.
Значения IC50 рассчитывают с применением концентрации ингибитора, которая вызывает снижение на 50% по сравнению с контролем. Значения IC50 зависят от анализа и будут варьировать от измерения к измерению. В связи с этим, значения IC50 представляют собой относительные значения. Значения, определенные для конкретного ингибитора, должны быть сравнены в целом, а не на абсолютной основе.
Образцы или анализы, включающие киназу MAP и/или МАРК, которые обрабатывают потенциальным активатором, ингибитором или модулятором, сравнивают с контрольными образцами без ингибитора, активатора или модулятора для исследования степени ингибирования. Контрольные образцы (необ- 13 039897 работанные ингибиторами) могут быть определены как значение относительной активности киназы MAP и/или МАРК, составляющее 100%. Ингибирование киназы MAP и/или МАРК достигается, когда значение киназной активности MAP и/или МАРК относительно контроля составляет приблизительно 80%, необязательно 50% или 25-0%. Активация киназы MAP и/или МАРК достигается, когда значения киназной активности MAP относительно контроля составляет 110%, необязательно 150%, необязательно 200500% или выше 1000-3000%. Иллюстративные анализы активности связывания MAP киназы в соответствии с настоящим изобретением представляют собой блот-анализ киназы MAP и/или МАРК с применением лиганда (Aymerich et al., Invest Opthalmol Vis Sci. 42:3287-93, 2001); анализ киназы MAP и/или МАРК с применением колонки для аффинной хроматографии (Alberdi et al., J Biol Chem. 274:31605-12, 1999) и анализ связывания киназы MAP и/или МАРК с лигандом (Alberdi et al., J Biol Chem. 274:31605-12, 1999). Каждая включена посредством ссылки в полном объеме.
Также избирательность ингибиторов может быть измерена с помощью анализа киназной избирательности, что описано в Mihara (2008), Br. J. Pharmacol. 154(1):153-164.
В случае ингибитора NFkB можно измерять, например, генные продукты (белки) генов-мишеней NFkB в необработанной контрольной клетке и сравнивать экспрессию этих продуктов генов-мишеней с клеткой, которая была обработана ингибитором NFkB. Некоторые гены-мишени описаны в Oeckinghaus and Ghosh (2009) The NF-kB Family of Transcription Factors and Its Regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. Oct 2009; 1(4): a000034.
Уровень экспрессии снижается, когда клетки обрабатывают ингибитором. С помощью других стратегий можно выявлять разрушение IkBa вместе с накоплением р-р65 и транслокацией в ядро NFkB посредством вестерн-блоттинга. Также взаимодействия NFkB с ДНК клеток, необработанных ингибитором, по сравнению с клетками, которые были обработаны ингибитором, можно анализировать с применением анализа изменения электрофоретической подвижности (EMSA).
Ингибирующие свойства молекулы можно также анализировать путем сравнения ее действия с эталонным соединением. Эталонное соединение, упоминаемое в настоящем документе, означают соединение, которое можно использовать в качестве положительного контроля для определения того, характеризуется ли молекула свойствами ингибитора МЕК, ингибитора р38 и/или свойств ингибитора NFkB. Таким образом, также любой из ингибиторов, перечисленных в настоящем документе, может быть использован в качестве эталонного соединения. Возможный тест может представлять собой тест, в котором клетки, например, стимулированные для активации сигнального пути МЕК, р38 и или NFkB, обрабатывают эталонным соединением, а параллельно, например в другой лунке, обрабатывают соединением, представляющим интерес.
Ингибиторы в соответствии с настоящим изобретением могут применяться в способе лечения и/или профилактики. Таким образом, выражение осуществление лечения или лечение включает введение ингибитора МЕК, ингибитора р38 и/или ингибитора NFkB, предпочтительно в форме лекарственного средства, субъекту, страдающему от коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, в целях уменьшения интенсивности или смягчения симптомов. Аналогично, выражение включает введение ингибитора МЕК, ингибитора р38 и/или ингибитора NFkB, предпочтительно в форме лекарственного средства, субъекту, страдающему от бактериальной инфекции, в целях уменьшения интенсивности или смягчения симптомов.
Кроме того, выражение профилактика, используемое в настоящем документе, относится к любой медицинской процедуре или процедуре, связанной с общественным здравоохранением, цель которой заключается в предупреждении заболевания. Используемые в настоящем документе выражения предупреждать, предупреждение и предупреждающий относятся к уменьшению риска возникновения или развития определенного состояния, а именно коинфекции, включающей инфекцию, вызванную вирусом гриппа, и бактериальную инфекцию или только бактериальную инфекцию. Также под профилактикой подразумевается уменьшение или ингибирование повторной коинфекции, включающей инфекцию, вызванную вирусом гриппа, и бактериальную инфекцию или только бактериальную инфекцию.
Ингибиторы в соответствии с настоящим изобретением являются эффективными для лечения коинфекции. Выражение коинфекция, используемое в настоящем документе, включает инфекцию, вызванную вирусом гриппа, и бактериальную инфекцию. Такая коинфекция может иметь место при одновременном инфицировании хозяина, например субъекта и/или отдельной клетки бактерией и вирусом гриппа. Также может быть, что хозяин, например субъект и/или клетка, одновременно инфицированы одной или более вирусными частицами и одной или более бактериями. Однако такое коинфицирование может также происходить последовательно. В таком случае, сначала происходит инфицирование одной или более вирусными частицами, а через некоторое время тот же хозяин и/или клетка инфицируются одной или более бактериями, или наоборот. Промежутком времени между двумя инфекциями может быть промежуток времени, составляющий максимум 14 дней, 13 дней, 12 дней, 11 дней, 10 дней, 9 дней, 8 дней, 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня, 1 день, 12 ч, 6 ч, 3 , 1,5 ч или минимум 30 мин.
Такая ситуация также может иметь место в случае суперинфекции, при которой вторая инфекция перекрывается с более ранней, в частности вызванной различными микробными агентами экзогенного
- 14 039897 или эндогенного происхождения, которые являются устойчивыми к лечению, применяемому против первой инфекции.
При коинфекции, инфекция, вызванная вирусом гриппа, может быть опосредована вирусом гриппа А или вирусом гриппа В, предпочтительно вирус гриппа А представляет собой H1N1, H2N2, H3N2, H6N1, H7N7, H7N9, H9N2 H10N7, H10N8 или H5N1. В одном варианте осуществления вирус гриппа А представляет собой H1N1. В других вариантах осуществления вирус гриппа А представляет собой H3N2, H5N1 и H7N9. В дополнительных вариантах осуществления вирус гриппа А представляет собой H3N2, H5N1, H1N1 и H7N9.
Настоящее изобретение также относится к бактериальной инфекции, которая может иметь место в условиях коинфекции, описанной выше, или может иметь место в качестве единственной инфекции, присутствующей у хозяина, например у субъекта и/или в клетке. Бактериальная инфекция может быть опосредована любой бактерией, предпочтительно она опосредована бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales и/или Pasteurellaceae.
В других вариантах осуществления бактериальная инфекция опосредована бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcus, предпочтительно Staphylococcus aureus, чувствительный к метициллину и устойчивый в отношении метициллина Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, экспрессирующий лейкоцидин Пантона-Валентина (PVL)и/или Streptococcaceae, предпочтительно Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes или Streptococcus pneumonia, Legionella, предпочтительно Legionella pneumophila, Pseudomonas, предпочтительно Pseudomonas uaerginosa, Chlamydophila, предпочтительно Chlamydophila pneumonia, Mycoplasma, предпочтительно Mycoplasma pneumonia, Klebsiella, предпочтительно Klebsiella pneumonia, Moraxella, предпочтительно Moraxella catarrhalis и/или Haemophilus, предпочтительно Haemophilius influenza. Предпочтительно бактерия выбрана из группы, включающей Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia или Haemophilius influenza. Наиболее предпочтительно бактерия представляет собой Staphylococcus aureus.
В настоящем изобретении также предусматривается, что ингибиторы можно комбинировать друг с другом. Таким образом, в одном варианте осуществления ингибитор МЕК комбинируют с другим ингибитором МЕК, ингибитором р38 и/или ингибитором NFkB. В соответствии с вышесказанным выражение другой ингибитор используется для разъяснения того, что например, один ингибитор МЕК можно также комбинировать с другим ингибитором МЕК, при этом такие два ингибитора МЕК не являются одинаковыми. Например, ингибитор MEK CI-1040 можно комбинировать с ингибитором МЕК GDC-0973. Это аналогичным образом относится к ингибиторам р38 и NFkB.
В целом, ингибитор, целенаправленно воздействующий на вирус гриппа, представляет собой любой ингибитор или лекарственное средство, эффективное при терапии гриппа. Различные вещества, как известно, являются эффективными в подавлении инфекции, вызванной вирусом гриппа. Среди них, например, ингибиторы нейраминидазы, соединения, целенаправленно воздействующие на белок, являющийся ионным каналом (М2), и соединения, целенаправленно воздействующие на полимеразную или эндонуклеазную активность посредством нарушения функции компонента вирусного полимеразного комплекса РВ1, РВ2, РА или NP. В настоящем изобретении также предусмотрены фармацевтически приемлемые соли данных ингибиторов.
Ингибитор нейраминидазы представляет собой противовирусное лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на вирус гриппа, которое действует путем блокирования функции вирусного белка нейраминидазы, предупреждая таким образом связывание вируса с клеткой, которая является мишенью для инфицирования, и/или предупреждая репродукцию вируса путем отпочкования от клеткихозяина, поскольку новообразованные вирусы не могут отпочковываться от клетки, в которой они реплицировались. Также предусмотрены фармацевтически приемлемые соли ингибитора нейраминидазы. Предпочтительными ингибиторами нейраминидазы являются озельтамивир, занамивир, перамивир или фармацевтически приемлемая соль любого из данных веществ, такая как озельтамивира фосфат, озельтамивира карбоксилат и т.д. Наиболее предпочтительными ингибиторами нейраминидазы являются озельтамивира фосфат, занамивир, озельтамивир или перамивир.
Соединения, целенаправленно воздействующие на белок, являющийся ионным каналом (М2), представляют собой, например, амантадин и/или римантадин, в то время как соединения, целенаправленно воздействующие на полимеразную или эндонуклеазную активность посредством нарушения функции компонента вирусного полимеразного комплекса РВ1, РВ2, РА или NP, представляют собой, например, блокатор NP нуклеозин или ингибитор полимеразы Т-705.
В качестве альтернативы или в дополнение, ингибитор МЕК, ингибитор р38 и/или ингибитор NFkB МОЖНО комбинировать с одним или более ингибиторами, целенаправленно воздействующими на бактерию. Ингибитором, целенаправленно воздействующим на бактерию, может быть любой ингибитор, эффективный в подавлении бактериальной инфекции. Предпочтительным ингибитором, хорошо известным специалисту в данной области, является антибиотик. Предпочтительные антибиотики можно найти в табл. 5 (фиг. 11). Таким образом, в одном варианте осуществления антибиотик выбран из группы, вклю- 15 039897 чающей антибиотики, перечисленные в табл. 5 (фиг. 11). В дополнительном варианте осуществления антибиотик выбран из группы, включающей класс антибиотиков, перечисленных в табл. 5 (фиг. 11). В другом варианте осуществления антибиотик выбран из группы, включающей генерические названия антибиотиков, перечисленных в табл. 5 (фиг. 11). Более предпочтительными являются антибиотики, выбранные из гентамицина, рифампицина, лизостафина, эритромицина, левофлоксацина, ванкомицина, тейкопланина, пенициллина и оксациллина.
Субъект, которого можно лечить с помощью ингибиторов или комбинаций ингибиторов в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представляет собой позвоночное. В контексте настоящего изобретения выражение субъект подразумевает индивидуума, который нуждается в лечение коинфекции или бактериальной инфекции отдельно. Предпочтительно субъектом является пациент, страдающий от коинфекции, или отдельно бактериальной инфекции, или подвержен риску их возникновения. Предпочтительно пациентом является позвоночное, более предпочтительно млекопитающее. Млекопитающие включают без ограничения сельскохозяйственных животных, животных, используемых в спорте, домашних животных, приматов, мышей и крыс. Предпочтительно млекопитающим является человек, собака, кошка, корова, свинья, мышь, крыса и т.д., особенно предпочтительным является человек. В некоторых вариантах осуществления субъектом является субъект-человек, возраст которого необязательно составляет более 1 года и менее 14 лет; от 50 до 65 лет или старше 65 лет. В других вариантах осуществления субъектом является субъект-человек, который выбран из группы, включающей субъектов, которым по меньшей мере 50 лет, субъектов, которые нуждаются в постоянном медицинском уходе, субъектов, которые имеют хронические нарушения со стороны легких или сердечно-сосудистой системы, субъектов, которые нуждались в постоянном медицинском наблюдении или госпитализации в течение предыдущего года в связи с хроническими метаболическими заболеваниями, почечной дисфункцией, гемоглобинопатией или ослаблением иммунной системы, субъектов в возрасте менее 14 лет, субъектов в возрасте от 6 месяцев до 18 лет, которые получают длительную терапию аспирином, и женщин, которые будут находится во втором или третьем триместре беременности в сезон гриппа.
В способе по настоящему изобретению ингибитор МЕК, ингибитор р38 или ингибитор NFkB, а также ингибитор, целенаправленно воздействующий на вирус гриппа, и ингибитор, целенаправленно воздействующий на бактерию, можно вводить перорально, внутривенно, интраплеврально, внутримышечно, местно или с помощью ингаляции. Предпочтительно ингибитор МЕК вводят посредством назальной ингаляции или перорально.
Настоящее изобретение также предусматривает композицию. Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей ингибитор МЕК, для применения в способе лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию, опосредованную бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae, и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, где ингибитор МЕК выбран из группы, включающей CI-1040 и GdC-0973.
Композиция, содержащая ингибитор МЕК, ингибитор р38 и/или ингибитор NFkB И дополнительно, в конечном виде, один или более ингибиторов, целенаправленно воздействующих на бактерию, и/или один или более ингибиторов, целенаправленно воздействующих на вирус гриппа, может представлять собой фармацевтическую композицию. Предпочтительно такие композиции дополнительно содержат носитель, предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может находится в форме суспензий или таблеток для перорального введения; назальных спреев, стерильных препаратов для инъекций (внутривенных, интраплевральных, внутримышечных), например, в виде стерильных инъекционных водных или масляных суспензий или суппозиториев. При пероральном введении в виде суспензии данные композиции получают в соответствии с методиками, доступными в области получения фармацевтических составов, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу для придания объема, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве супендирующего средства, метилцеллюлозу в качестве загустителя и подсластители/ароматизаторы, известные в данной области техники. В виде таблеток с быстрым высвобождением данные композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, дикальция фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие наполнители, связующие вещества, сухие наполнители, разрыхлители, разбавители и смазывающие средства, известные из уровня техники.
Инъекционные растворы или суспензии могут быть составлены согласно известным в данной области техники методикам с применением нетоксичных, приемлемых для парентерального введения разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия, или подходящих диспергирующих или увлажняющих и суспендирующих средств, таких как стерильные, мягкие, нелетучие масла, в том числе синтетические моно- или диглицериды, и жирные кислоты, в том числе олеиновая кислота.
Ингибитор или ингибиторы предпочтительно вводят в терапевтически эффективном количестве.
Фармацевтическую композицию для применения по настоящему изобретению и содержащую ингибитор МЕК, вводят пациенту, которым является млекопитающее или птица. Примеры подходящих млекопитающих включают без ограничения мышь, крысу, корову, козу, овцу, свинью, собаку, кошку, ло- 16 039897 шадь, морскую свинку, представителя семейства псовых, хомяка, норку, тюленя, кита, верблюда, шимпанзе, макака-резуса и человека, при этом человек является предпочтительным. Примеры подходящих птиц включают без ограничения, например, индюка, курицу, гуся, утку, чирка, крякву, скворца, шилохвоста, чайку, лебедя, цесарку или водоплавающую птицу. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения представлены пациенты-люди.
Терапевтически эффективное количество каждого активного соединения/ингибитора может варьировать в зависимости от факторов, включающих без ограничения активность применяемого соединения, стабильность активного соединения в организме пациента, тяжесть состояний, которые необходимо облегчить, общий вес тела пациента, подлежащего лечению, путь введения, легкость абсорбции, распределения в организме и выделения из организма активного соединения, возраст и чувствительность пациента, подлежащего лечению, нежелательные явления и т.п., что будет очевидно специалисту в данной области. Вводимое количество можно корректировать, поскольку со временем различные факторы изменяются.
Ингибиторы, способы и пути применения, описанные в настоящем документе, применимы как для лечения человека, так и для применения в ветеринарии. Соединения, описанные в настоящем документе, в частности ингибитор МЕК, ингибитор р38 и/или ингибитор NFkB И необязательно один или более ингибиторов, целенаправленно воздействующих на вирус гриппа, и/или один или более ингибиторов, целенаправленно воздействующих на бактерию, обладающие необходимой терапевтической активностью, можно вводить субъекту в физиологически приемлемом носителе, как описано в настоящем документе. В зависимости от способа введения, соединения могут быть составлены различными способами, что обсуждается ниже. Концентрация терапевтически активного соединения при составлении может варьировать от приблизительно 0,1 до 100 вес.%. Средства можно вводить отдельно или в комбинации с другими лекарственными препаратами.
Фармацевтические соединения в способе по настоящему изобретению можно вводить в любых подходящих стандартных лекарственных формах. Подходящие составы для перорального применения могут быть в форме таблеток, капсул, суспензии, сиропа, жевательной резинки, облатки, эликсира и т.п. Фармацевтически приемлемые носители, такие как связующие вещества, вспомогательные вещества, смазывающие средства и подсластители или ароматизаторы могут быть включены в фармацевтические композиции для перорального применения. При необходимости также могут быть включены традиционные средства для модификации вкуса, цвета и конфигурации конкретных форм.
Для инъекционных составов фармацевтические композиции могут находиться в форме лиофилизированного порошка в смеси с подходящими наполнителями в подходящих ампуле или флаконе. Перед применением в клинике лекарственные препараты можно восстанавливать путем растворения лиофилизированного порошка в подходящей системе растворителей с получением композиции, подходящей для внутривенной или внутримышечной инъекции.
Культивируемая клетка или культивируемые клетки представляет собой/представляют собой клетку/клетки, которая/которые находится/находятся не в ее/их естественной среде, например в растение или животном. Предпочтительно культивируемая клетка может представлять собой первичную культуру клеток, которая включает клетки, извлеченные из их естественной среды, или клеточную линию. Предпочтительно культивируемые клетки представляют собой эпителиальные клетки легкого человека. Предпочтительно культивируемые клетки высеивают при плотности приблизительно 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 10x105, 11x105, наиболее предпочтительно 8x10 клеток в 0,5 мл, 1 мл, 1,5 мл, 2 мл, 2,5 мл, 3 мл, 3,5 мл, 4 мл среды, такой как DMEM. Наиболее предпочтительной является плотность 8x105 клеток в 2 мл DMEM.
Такие культивируемые клетки инфицируют вирусом и бактерией или, в других вариантах осуществления, отдельно бактерией. Как уже было описано выше, коинфицирование может происходить последовательно или одновременно. Например, культивируемые клетки могут быть инфицированы сначала вирусом гриппа, а спустя 30 мин бактерией/бактериями. Также возможно дополнительное добавление антибиотика в культуру спустя 3 ч, для удаления внеклеточных бактерий. В таком случае антибиотик затем снова вымывают. В других вариантах осуществления клетки инфицируют только бактерией.
Выражение приведение в контакт, используемое в настоящем документе, относится к приведению клетки, содержащей вирус гриппа и бактерию, в пространственном отношении, в непосредственную близость с ингибитором МЕК, ингибитором р38 и/или ингибитором NFkB. Это может означать, например, что ингибитор применяют в среде, в которой культивируемые клетки распределены с помощью пипетки.
После приведения в контакт, если ингибитор является активным, вирусная инфекция, а также бактериальная инфекция, подавляется. В некоторых вариантах осуществления, опять-таки, ингибитор в соответствии с настоящим изобретением применяется для подавления только бактериальной инфекции в отсутствие инфекции, вызванной вирусом гриппа.
В одном варианте осуществления подавление вирусной инфекции представляет собой уменьшение числа бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, а подавление бактериальной инфекции представляет собой уменьшение числа колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Бляшкообразующие единицы (БОЕ)/мл
- 17 039897 представляет собой показатель числа частиц, способных формировать бляшки на единицу объема, таких как вирусные частицы. Он является функциональным показателем, а не показателем абсолютного количества частиц: вирусные частицы, которые является неполноценными, или которые не в состоянии инфицировать их клетку-мишень, не будут образовывать бляшки и, таким образом, не будут учтены. Например, раствор вируса гриппа с концентрацией 1000 БОЕ/мкл указывает на то, что 1 мкл раствора содержит достаточно вирусных частиц для образования 1000 инфекционных бляшек в клеточном монослое. В случае настоящего изобретения клеточная культура, обработанная ингибитором, демонстрирует уменьшение числа бляшкообразующих единиц в культуре после обработки, при сравнении с культурой перед обработкой ингибитором в соответствии с настоящим изобретением.
Возможное уменьшение количества бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл анализируют следующим образом. Сначала культивируемые клетки, коинфицированные вирусом гриппа и бактерией, анализируют на предмет их способности формировать бляшкообразующие единицы (БОЕ)/мл путем, например, отсасывания некоторого количества клеток из чашки Петри и высеивания их на чашках для подсчета бактериальных бляшек, которые будут формироваться. Данный результат затем сравнивают с числом бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, сформированных клетками той же культуры, после применения ингибитора. Если число бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл уменьшается после обработки ингибитором по сравнению с числом, полученным перед применением ингибитора, имеет место уменьшение числа бляшкообразующих единиц.
Колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл используют для оценки числа жизнеспособных бактерий в образце. Существуют различные способы. Например, для получения колониеобразующих единиц образец (например, культивируемые клетки в маленьком объеме) рассредотачивают по поверхности чашки с питательным агаром и высушивают перед инкубацией для подсчета. Жизнеспособную бактерию определяют по способности размножаться путем бинарного деление в контролируемых условиях. Визуальное появление колонии в клеточной культуре требует значительного роста - при подсчете колоний неясно, возникла колония из одной клетки или 1000 клеток. Следовательно результаты записываются как (КОЕ)/мл (колониеобразующих единиц на миллилитр) для жидкостей и КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм) для сухих веществ для исключения этой неопределенности (вместо клеток/мл или клеток/г).
Колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл можно анализировать следующим образом. Сначала культивируемые клетки, коинфицированные вирусом гриппа и бактерией или отдельно бактерией, анализируют на предмет их способности формировать колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл путем, например, отсасывания некоторого количества клеток из чашки Петри и высеивания их на чашках для подсчета. Данный результат затем сравнивают с числом колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл, сформированных клетками той же культуры, после применения ингибитора. Если число колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл уменьшается по сравнению с числом, полученным перед применением ингибитора, имеет место уменьшение.
В целом специалист в данной области знаком с этими хорошо известными методиками анализа бактериальных и вирусных инфекций. Как можно измерить бляшкообразующие единицы (БОЕ)/мл и колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл дополнительно описано в литературе (Tuchscherr, L. et al. (2011). Переключение фенотипа Staphylococcus aureus: эффективная стратегия при бактериальной инфекции, позволяющая избежать иммунный ответ хозяина и закрепить хроническую инфекцию (EMBO molecular medicine 3, 129-141 and Hrincius, E.R et al. (2010) CRK adaptor protein expression is required for efficient replication of avian influenza A viruses and controls JNK mediated apoptotic responses. Cellular microbiology 12, 831-843).
Следует отметить, что используемые в настоящем документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на реагент включает один или более таких различных реагентов, а ссылка на способ включает ссылку на соответствующие стадии и способы, известные рядовому специалисту в данной области, которые могут быть изменены или заменены на способы, описанные в настоящем документе.
Все публикации и патенты, цитируемые в настоящем раскрытии, включены посредством ссылки в их полном объеме. В тех случаях, когда материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не соответствует настоящему описанию, настоящее описание будет заменять любой такой материал.
Если не указано иное, выражение по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящиеся к каждому элементу ряда. Специалисту в данной области будет понятно, или он сможет определить, с применением лишь рутинных экспериментов, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.
Во всем настоящем описании и следующей за ним формуле изобретения, если по контексту не требуется иное, слово содержать и его варианты, такие как содержит и содержащий, следует понимать как подразумевающие включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий. При использовании в настоящем документе выражение содержащий можно заменить выражением
- 18 039897 включающий или иногда, при использовании в настоящем документе, выражением имеющий.
При использовании в настоящем документе, выражение включающий исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не определенные элементом пункта формулы изобретения. При использовании в настоящем документе состоящий главным образом из не исключает материалы или стадии, которые не оказывают значительного влияния на основные и новые признаки пункта формулы изобретения.
В каждом конкретном случае в настоящем документе любое из выражений содержащий, состоящий главным образом из и состоящий из можно заменить любым из двух других выражений.
Некоторые документы цитированы по всему тексту настоящего описания. Каждый из документов, цитируемых в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), выше или ниже, включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Ничто в настоящем документе не должно подразумевать признание того, что настоящее изобретение не может быть датировано задним числом настоящего раскрытия в соответствии с предшествующим изобретением.
Примеры
В следующих примерах проиллюстрировано настоящее изобретение. Эти примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения. Данные примеры включены в целях иллюстрации, а настоящее изобретение ограничено только формулой изобретения.
Пример 1.
В последние годы непрерывно возрастает потребность в дополнительных и альтернативных терапевтических стратегиях, помимо вакцинации или лечения традиционными противовирусными средствами против IV (блокаторами нейраминидазы и М2) и традиционными антибиотиками против S. aureus. В настоящее время для противовирусного воздействия было идентифицировано несколько клеточных факторов в качестве потенциальных мишеней. В отличие от этого, знания о роли клеточных факторов в бактериальной инфекции и, в частности, в качестве мишеней для антибактериального лечения, либо путем уменьшения количества бактерий и/или начала экспрессии активированного цитокина, является недостаточно понятным, еще больше в присутствии коинфекции IV.
Был разработан протокол инфицирования, который позволяет определить (1) титры вирусного потомства и (2) титры внутриклеточных бактерий, а также (3) изменения иммунологических защитных механизмов в присутствии или в отсутствие потенциальных противоинфекционных средств при коинфицировании IV и S. aureus. В первоначальном подходе исследовали эффект ингибитора МЕК (U0126=50 мкМ), ингибитора р38 (SB202190 = 10 мкМ) и ингибитора NFkB (LASAG=5 мМ), в сравнении с растворителем в качестве контроля, в отношении инфекции, вызванной IV и S. aureus, в случае инфицирования одного типа или коинфицирования. В качестве контроля применяли ингибитор вирусной нейраминидазы озельтамивир (тамифлю) (2 мкМ) в сравнении с Hepes. Для инфицирования вирусом применяли вирус гриппа человека A/Puerto Rico/8134 (H1N1) или вирус птичьего гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7), а для инфицирования бактериями применяли штамм S. aureus 6850. Процедура инфицирования (фиг. 1):
Эпителиальные клетки легкого человека высеивали в 6-луночные планшеты (8x105 клеток/лунку) в 2 мл DMEM [10% FCS]. Спустя 16-20 ч после высеивания клетки промывали и инкубировали с PBS/BA [0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина] (500 мкл на 6 лунок) или PBS/BA, содержащем вирус при указанном множественном инфицировании (MOI) при 37°С. После 30 мин инкубации разбавленный вирус отсасывали, клетки промывали PBS и дополняли средой для заражения DMEM/INV [1% альбумина сыворотки человека, 25 нмоль/л HEPES] (2 мл на 6 лунок) с бактериями или без них при указанном MOI, в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения. Спустя 3 ч после инфицирования бактериями клетки обрабатывали антибиотиками для удаления внеклеточных бактерий. Следовательно клетки промывали PBS и затем инкубировали с DMEM/INV, содержащей антибиотики [2 мкг/мл лизостафина (Sigma)], (1 мл на 6 лунок) в течение 20 мин при 37°С. После дополнительного промывания PBS клетки дополняли DMEM/INV, содержащей тестируемое вещество, и инкубировали в течение указанного времени при 37°С. В случае A/Puerto Rico/8/34, DMEM/INV дополнительно дополняли 0,333 мкг/мл трипсина (Invitrogen). Определение титров IV и внутриклеточных бактерий осуществляли, как описано в (Hrincius et al., 2010, Tuchscherr et al., 2011).
Титры IV представлены в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, а титры S. aureus представлены в виде колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Данные представляют средние значения ± SD трех независимых экспериментов с двумя биологическими образцами. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего двухвыборочного t-критерия (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001).
В случае коинфекции присутствие S. aureus влияет на репликацию IV, а присутствие IV влияет на количество внутриклеточных S. aureus соответственно, что связано с изменениями врожденных иммунных ответов, а также механизмами аутофагии и апоптоза. Тем не менее, авторы настоящего изобретения наблюдали, согласно ожиданием, ингибирующие эффекты U0126 (фиг. 2, 3), SB202190 (фиг. 4) и LGASA (фиг. 5) в отношении репликации IV. Что интересно, титры вирусов также снижались при лечении такими ингибиторами в присутствии S. aureus. Кроме того, авторы настоящего изобретения были прият- 19 039897 но удивлены, когда количества внутриклеточных S. aureus уменьшались в присутствии U0126, SB202190 или LG-ASA независимо от отсутствия или присутствия IV.
Другое удивительное наблюдение касается репликации бактерий в присутствии U0126 (50 мкМ). В случае, когда S. aureus культивировали в течение ночи при 37°С в DMEM/INV без живых клеток, титры бактерий были уже снижены, однако в той же степени, что и при инфицировании клеток, что указывает на зависимость бактерий от клеточного фактора (фиг. 2 Е).
В качестве контроля исследовали титры вирусов и количества внутриклеточных бактерий при применении ингибитора вирусной нейраминидазы озельтамивира (тамифлю) (фиг. 6). В то время как титры IV значительно снижались в отсутствие или в присутствии S. aureus, количества внутриклеточных бактерий наоборот увеличивались.
Полученные результаты демонстрируют больший потенциал веществ, целенаправленно воздействующих на клеточные факторы, в качестве противоинфекционных средств против коинфекции, вызванной IV и S. aureus, по сравнению с веществами против самого патогена.
Пример 2.
В дополнительных экспериментах исследовали эффект ингибитора МЕК U0126, CI-1040 и кобиметиниба (GDC-0973), по сравнению с растворителем в качестве контроля, в отношении инфекции, вызванной вирусом гриппа A (IAV) и S. aureus 6850, в случае инфицирования одного типа или коинфицирования.
Процедура коинфицирования представлена на фиг. 12. Для исследования жизнеспособности эпителиальных клеток легкого человека в условиях данного эксперимента, морфологию клеток наблюдали с помощью световой микроскопии (фиг. 13) через 18 ч после инфицирования, что является моментом времени, при котором определяли патогенную нагрузку (фиг. 14).
Как видно из фиг. 13, инфицирование только S. aureus 6850 (6850), штаммами вируса гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) или A/Wisconsm/67/2005 (H3N2), а также коинфицирование, приводили к незначительному, но четко выявляемому повреждению клеток. В присутствии U0126 (50 мкМ) клеточный слой выглядел гораздо меньше поврежденным.
Определяли эффект ингибитора МЕК U0126 (50 мкМ) в отношении репликации вируса гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) или A/Wisconsm/67/2005 (H3N2), по сравнению с растворителем в качестве контроля, в эпителиальных клетках легкого человека в случае инфицирования одного типа или коинфицирования (фиг. 14).
Ингибирование сигнального пути MEK/ERK приводит к значительному снижению титров вируса при инфицировании подтипами IAV H7N7 и H3N2 в случае инфицирования одного типа (фиг. 14). Титры вируса также снижались в случае коинфекции в присутствии U0126 до значительных уровней в коинфицированных H7N7/S. Aureus клетках (фиг. 14).
Кроме того, анализировали эффект ингибитора МЕК U0126 (50 мкМ) в отношении поглощенного S. aureus 6850 (фиг. 15 А, С). В условиях данного эксперимента титры бактерий лишь незначительно снижались в присутствии ингибитора.
Для дальнейшего исследования эффекта U0126 в отношении бактериального роста, в целом, ночную культуру S. aureus 6850 без клеток дополняли различными количествами U0126 (10 мкМ и 50 мкМ) или растворителем (фиг. 15 В, D). Бактериальный рост ингибировали в присутствии U0126 в зависимости от концентрации, по сравнению с растворителем в качестве контроля (фиг. 15 B, D).
Поскольку экспрессия провоспалительных цитокинов и хемокинов способствует тяжелому воспалению и повреждению тканей, синтез мРНК соответствующих хемокинов, таких как CCL3, также известный как воспалительный белок макрофагов 1α (MIP1a) и CCL5, также известный как RANTES, анализировали при помощи qRT-PCR в эксперименте с инфицированием в присутствии или в отсутствие U0126 (50 мкМ) (фиг. 16 А, В). Синтез мРНК CCL3, индуцируемый IAV, уровень которого повышался в присутствии S. aureus 6850, в присутствии U0126 снижался. Подобным образом, синтез CCL5 мРНК, индуцируемый IAV, уровень которого повышался в присутствии S. aureus, в присутствии U0126 (50 мкМ) снижался.
С помощью вестерн-блоттинга с применением фосфоспецифических антител к ERK1/2 подтвердили ингибирующий эффект U0126 в отношении сигнального пути MEK/ERK (фиг. 16 С). Кроме того, наблюдали снижение уровня синтеза вирусного белка (РВ1) при ингибировании сигнального пути MEK/ERK.
Для подтверждения антипатогенного потенциала U0126 на мышиной модели in vivo, мышей, инфицированных вирусом гриппа, оставляли необработанными или ежедневно обрабатывали U0126 и подвергали суперинфицированию с помощью S. aureus 6850 (фиг. 17). Введение U0126 приводило к снижению титров бактерий in vivo независимо от титров вируса. Отсутствие снижения титров вируса можно объяснить поздним введением U0126 в момент времени, когда титры вируса уже снижаются во время инфекции. Вышеупомянутые эксперименты указывают на то, что ингибитор оказывает более значительный ингибирующий эффект в случае его введения перед инфицированием вирусом гриппа. Тем не менее, титры бактерий значительно снижались в случае применения U0126.
- 20 039897
В других подходах определяли эффект ингибитора МЕК CI-1040 (10 мкМ) в отношении репликации вируса гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) или A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), по сравнению с растворителем в качестве контроля, в эпителиальных клетках легкого человека в случае инфицирования одного типа или коинфицирования (фиг. 18).
Ингибирование сигнального пути MEK/ERK посредством CI-1040 приводит к снижению титров вируса при инфицировании подтипами IAV H7N7 и H1N1 в случае инфицирования одного типа и коинфицирования (фиг. 18).
Для дальнейшего исследования эффекта CI-1040 в отношении бактериального роста, в целом, ночную культуру S. aureus 6850 дополняли различными количествами CI-1040 (1 мкМ и 10 мкМ) или растворителем (фиг. 19 А, В). Бактериальный рост незначительно был ингибирован в присутствии CI-1040 в зависимости от концентрации, по сравнению с растворителем в качестве контроля (фиг. 19 А, В).
Для подтверждения антипатогенного потенциала другого ингибитора МЕК, тестировали кобиметиниб на мышиной модели in vivo, мышей, инфицированных вирусом гриппа, оставляли необработанными или ежедневно обрабатывали кобиметинибом и подвергали суперинфицированию с помощью S. aureus 6850 (фиг. 20). Введение кобиметиниба приводило к незначительному, но четко выявляемому снижению титров вируса и бактерий in vivo. Поскольку недавно было показано, что максимальная переносимая доза кобиметиниба составляет 30 мг/кг/день. Таким образом, ингибирующий эффект можно улучшить с помощью более высоких дозировок, по сравнению с применяемыми в данном эксперименте (10 мг/кг/день), которые были значительно ниже максимальной переносимой дозы.
В заключение, полученные результаты демонстрируют различные ингибиторы МЕК в качестве потенциальных веществ против IAV/S. aureus.
Пример 3.
В дополнительных экспериментах исследовали эффект ингибитора NFkB LG-ASA (LASAG) в отношении инфекции, вызванной вирусом гриппа A (IAV) и S. aureus 6850, в случае инфицирования одного типа или коинфицирования.
Процедура коинфицирования представлена на фиг. 21 (в верхней части). Для исследования жизнеспособности эпителиальных клеток легкого человека после инфицирования в отсутствие и в присутствии LG-ASA (5 мМ), наблюдали морфологию клеток с помощью световой микроскопии через 18 ч после инфицирования (фиг. 21). В то время как инфицирование с помощью IAV и/или S. aureus в отсутствие LGASA (левая секция) приводила к разрушению клеток, в присутствии LG-ASA (правая секция) морфология клетки улучшалась.
Эффект ингибитора NFkB LG-ASA (5 мМ) в отношении репликации вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) определяли в эпителиальных клетках легкого человека в случае инфицирования одного типа или коинфицирования (фиг. 22, 23) через 8 ч (фиг. 22, 23 А, В, Е, F) и через 18 ч (фиг. 22, 23 С, D, G, Н) после инфицирования. Для инфицирования применяли два разных штамма S. aureus: (a) S. aureus SH1000 (фиг. 22, 2з A-D) и (b) S. aureus 6850 (фиг. 22, 23 E-H).
В то время как уровень репликации IAV снижался в присутствии LG-ASA через 8 и 18 ч после инфицирования, снижение титров бактерий наблюдалось только через 18 ч после инфицирования. На фиг. 22 результаты представлены на линейной шкале. Для более наглядного представления ингибирующего эффекта LG-ASA в отношении патогена, необработанные контроли из трех независимых экспериментов произвольно приравнивали к 100%, данные представлены средними значениями (фиг. 23).
Поскольку LG-ASA добавляли непосредственно во время инфицирования бактериями, такие результаты демонстрировали очень ранний эффект в отношении поглощения бактерий, которое стимулировали во время непрерывного высвобождения и нового бактериального поглощения.
Совсем недавно было показано, что NFkB необходим для фагоцитоза S. aureus моноцитами (Zhu et al., 2014; Exp.Cell Res. 1;327(2):256-63). Основываясь на этих фактах и собственных наблюдениях, авторы настоящего изобретения хотели узнать, предотвращает ли LG-ASA поглощение бактерий. За 4 ч до инфицирования бактериями эпителиальные клетки легкого человека предварительно обрабатывали и определяли поглощенные бактерии не более чем через два часа после инфицирования. Чтобы обеспечить выявление только поглощенных бактерий, непоглощенные бактерии удаляли с помощью промывания с антибиотиком перед лизисом клеток. Данные свидетельствуют о зависимом от времени поглощении S. aureus 6850, которое блокируется в присутствии LG-ASA (фиг. 24 А, В). Зависимый от концентрации ингибирующий эффект LG-ASA может быть дополнительно продемонстрирован на бактериальном штамме S. aureus USA300 (фиг. 24 С, D). Для более наглядного представления ингибирующего эффекта LG-ASA в отношении патогена, что показано на фиг. 24 А, С, необработанные контроли из трех независимых экспериментов произвольно приравнивали к 100%, данные представлены средними значениями (фиг. 24 В, D).
Для подтверждения важности опосредованной NFkB передачи сигнала для поглощения S. aureus, NFkB индуцировали с помощью стимуляции TNF-α за 4 ч до инфицирования. Активация NFkB приводила к усилению поглощения S. aureus 6850 и S. aureus USA300. В качестве контроля, индуцированную TNF-α активацию одновременно блокировали с помощью LG-ASA, что приводило к ингибированию
- 21 039897 поглощения бактерий, стимулированного TNF-α, как и ожидалось (фиг. 25).
Для подтверждения антипатогенного потенциала LG-ASA на мышиной модели in vivo тестировали различные условия коинфицирования в присутствии и в отсутствие LG-ASA.
Как видно на фиг. 26, обработка мышей, коинфицированных IAV/S. aureus, с помощью LG-ASA приводит к повышению выживаемости (фиг. 26 А) и уменьшению потери веса тела (фиг. 26 В).
В заключение, полученные результаты демонстрируют, что ингибиторы NFkB, такие как LG-ASA, действуют как вещества против IAV/S. aureus in vitro и in vivo.
Список литературы.
Borgeling, Y., Schmolke, Μ., Viemann, D., Nordhoff, C., Roth, J. and Ludwig, S. (2014). Inhibition of 38 mitogen-activated protein kinase impairs influenza virusinduced primary and secondary host gene responses and protects mice from lethal H5N1 infection. The Journal of biological chemistry 289, 13-27.
Chertow, D.S. and Memoli, M.J. (2013). Bacterial coinfection in influenza: a · rand rounds review. JAMA: the 'oumal of the American Medical Association 309, 275-282.
Droebner, K., Pleschka, S., Ludwig, S. and Planz, 0. (2011). Antiviral activity of the MEK-inhibitor U0126 against pandemic HlNlv and highly pathogenic avian influenza virus in vitro and in vivo. Antiviral research 92, 195-203.
Dudek, S.E., Luig, C., Pauli, E.K., Schubert, U. and Ludwig, S. (2010). The clinically approved proteasome inhibitor PS-341 efficiently blocks influenza A virus and vesicular stomatitis virus propagation by establishing an antiviral state. Journal of virology 84, 9439-9451,
Ehrhardt, C. and Ludwig, S. (2009). A new player in a deadly game: influenza viruses and the PI3K/Akt signalling pathway. Cellular microbiology 11, 863-871.
Ehrhardt, C., Marjuki, H., Wolff, T., Numberg, B., Planz, 0., Pleschka, S. and Ludwig, S. (2006). Bivalent role of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) during influenza virus infection and host cell defence. Cellular microbiology 8, 1336-1348.
Ehrhardt, C., Ruckle, A., Hrincius, E.R., Haasbach, E., Anhlan, D., Ahmann, K., et al. (2013). The NF-kappaB inhibitor SC75741 efficiently blocks influenza virus propagation and confers a high barrier for development of viral resistance. Cellular microbiology 15, 1198-1211.
- 22 039897
Ehrhardt, C., Wolff, T. and Ludwig, S. (2007a). Activation of phosphatidylinositol 3kinase signaling by the nonstructural NS1 protein is not conserved among type A and
В influenza viruses. Journal of virology 81, 12097-12100.
Ehrhardt, C., Wolff, T., Pleschka, S., Planz, 0., Beermann, W., Bode, J.G., et al. (2007b). Influenza A virus NS1 protein activates the PI3K/Akt pathway to mediate antiapoptotic signaling responses. Journal of virology 81, 3058-3067.
Eierhoff, T., Hrincius, ER., Rescher, U., Ludwig, S. and Ehrhardt, C. (2010). The epidermal growth factor receptor (EGFR) promotes uptake of influenza A viruses (IAV) into host cells. PLoS pathogens 6, el001099.
Gillet, Y., Vanhems, P., Lina, G., Bes, M., Vandenesch, F., Floret, D. and Etienne, J. (2007). Factors predicting mortality in necrotizing communityacquired pneumonia caused by Staphylococcus aureus containing Panton-Valentine leukocidin. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 45, 315-321.
Gong, J., Fang, EL, Li, M., Liu, Y., Yang, K., Liu, Y. and Xu, W. (2009). Potential targets and their relevant inhibitors in anti-influenza fields. Current medicinal chemistry 16, 3716-3739.
Grundmaim, H., Aires-de-Sousa, M., Boyce, J. and Tiemersma, E. (2006). Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat. Lancet 368, 874-885.
Haasbach, E., Reiling, S.J., Ehrhardt, C., Droebner, K., Ruckle, A., Hrincius, E.R., et al. (2013). The NF-kappaB inhibitor SC75741 protects mice against highly pathogenic avian influenza A virus. Antiviral research 99, 336-344.
- 23 039897
Hayden, F. (2009). Developing new antiviral agents for influenza treatment: what does the future hold? Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious
Diseases Society of America 48 Suppl 1, S3-13.
Hayden, F.G. and Hay, A.J. (1992). Emergence and transmission of influenza A viruses resistant to amantadine and rimantadine. Current topics in microbiology and immunology 176, 119-130.
Iverson, A.R., Boyd, K.L., McAuley, J.L., Piano, L.R., Hart, M.E. and McCullers, J.A. (2011). Influenza virus primes mice for pneumonia from Staphylococcus aureus. The Journal of infectious diseases 203, 880- 888.'
Iwao, Y., Ishii, R., Tomita, Y., Shibuya, Y., Takano, T., Hung, W.C., et al. (2012). The emerging ST8 methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone in the community in Japan: associated infections, genetic diversity, and comparative genomics. J Infect Chemother 18, 228-240.
Lee, LT., Lee, C.W., Tung, W. 1-1., Wang, S.W., Lin, C.C., Shu, J.C. and Yang, C.M. (2010). Cooperation of TLR2 with MyD88, PI3K, and Rad in lipoteichoic acidInduced cPLA2/COX-2-dependent airway inflammatory responses. The American journal of pathology 176, 1671-1684.
Ludwig, S. (2009). Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. The Journal of antimicrobial chemotherapy 64, 1-4.
Ludwig, S. (2011). Disruption of virus-host cell interactions and cell signaling pathways as an anti-viral approach against influenza virus infections. Biological chemistry 392, 837-847.
Ludwig, S. and Planz, 0. (2008). Influenza viruses and the NF-kappaB signaling pathway - towards a novel concept of antiviral therapy. Biological chemistry 389, 1307-1312.
- 24 039897
Ludwig, S., Planz, 0., Pleschka, S. and Wolff, T. (2003). Influenza-virus induced signaling cascades: targets for antiviral therapy? Trends in molecular medicine 9, 4652.
Ludwig, S., Wolff, T., Ehrhardt, C., Wurzer, W.J., Reinhardt, J., Planz, 0. and Pleschka, S. (2004). MEK inhibition impairs influenza В virus propagation without emergence of resistant variants. FEBS letters 561,37-43.
Marjuki, H., Alam, M.L, Ehrhardt, C., Wagner, R., Planz, 0., Klenk, H.D., et al. (2006). Membrane accumulation of influenza A virus hemagglutinin triggers nuclear export of the viral genome via protein kinase Calphamediated activation of ERK signaling. The Journal of biological chemistry
281, 16707-16715.
Mazur, 1., Wurzer, W.J., Ehrhardt, C., Pleschka, S., Puthavathana, P., Silberzahn, T., et al. (2007). Acetylsalicylic acid (ASA) blocks influenza virus propagation via its NFkappaB-inhibiting activity. Cellular microbiology 9, 1683-1694.
Moran, G.J., Krishnadasan, A., Gorwitz, R.J., Fosheim, G.E., McDougal, L.K., Carey, R.B., et al. (2006). Methicillin-resistant S. aureus infections among patients in the emergency department. The New England Journal of medicine 355, 666-674.
Morens, D.M., Taubenberger, J.K. and Fauci, A.S. (2008). Predominantrote of bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: implications for pandemic influenza preparedness. The Journal of infectious diseases 198, 962-970.
Neumann, G., Noda, T. and Kawaoka, Y. (2009). Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature 459, 931-939.
Niemann, S., Ehrhardt, C., Medina, E., Wamking, K., Tuchscherr, L., Heitmann, V., et al. (2012). Combined action of influenza virus and Staphylococcus aureus pantonvalentine leukocidin provokes severe lung epithelium damage. The Journal of infectious diseases 206, 1138-1148.
- 25 039897
Olschlager, V., Pleschka, S., Fischer, T., Rziha, H.J., Wurzer, W., Stitz, L., et al.
(2004). Lung-specific expression of active Raf kinase resuits in increased mortality of influenza A virus-infected mice. Oncogene 23, 6639-6646.
Oviedo-Boyso, J., Cortes-Vieyra, R., Huante-Mendoza, A., Yu, H.B., Valdez-Alarcon, J.J., Bravo-Patino, A., et al. (2011). The phosphoinositide-3-kinase-Akt signaling pathway is important for Staphylococcus aureus internalization by endothelial cells. Infection and immunity 79, 4569-4577.
Paddock, C.D., Liu, L., Denison, A.M., Bartlett, J.H., Holman, R.C., Deleon-Carnes, M., et al. (2012). Myocardial injury and bacterial pneumonia contribute to the pathogenesis of fatal Influenza В Virus infection. The Journal of infectious diseases 205, 895-905.
Park, B. and Liu, G.Y. (2012). Targeting the host-pathogen interface for treatment of Staphylococcus aureus infection. Seminars in immunopathology 34, 299-315.
Parker, D. and Prince, A. (2012). Immunopathogenesis of Staphylococcus aureus pulmonary infection. Seminars in immunopathology 34, 281-297.
Parry, J. (2013). H7N9 avian flu infects humans for the first time. Bmj 346, f2151.
Pinto, L.H. and Lamb, R.A. (2006). The М2 proton channels of influenza A and В viruses. The Journal of biological chemistry 281, 8997-9000.
Pinto, L.H. and Lamb, R.A. (2007). Controlling influenza virus replication by inhibiting its proton channel. Molecular bioSystems 3, 18-23.
Planz, 0. (2013). Development of cellular signaling pathway inhibitors as new antivirals against influenza. Antiviral research 98, 457-468.
Pleschka, S., Wolff, T., Ehrhardt, C., Hobom, G., Planz, 0., Rapp, U.R. and Ludwig, S. (2001). Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade. Nature cell biology 3, 301-305.
- 26 039897
Shilo, N. and Quach, C. (2011). Pulmonary infections and community associated methicillin resistant Staphylococcus aureus: a dangerous mix? Paediatric respiratory reviews 12, 182-189.
Taubenberger, J.K, and Kash, J.C. (2010). Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic formation. Cell host & microbe 7, 440-451.
Thorburn, K. and Riordan, A. (2012). Pulmonary bacterial coinfection in infants and children with viral respiratory infection. Expert review of antiinfective therapy 10, 909-916.
Wurzer, W.J., Ehrhardt, C., Pleschka, S., Berberich-Siebelt, F., Wolff, T., Walczak, H., et al. (2004). NF-kappaB-dependent induction of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and Fas/FasL is crucial for efficient influenza virus propagation. The Journal of biological chemistry 279, 30931-30937.
Zhu F, Yue W, Wang Y. The nuclear factor kappa В (NF-кВ) activation is required for phagocytosis of staphylococcus aureus by RAW 264.7 cells. Exp Cell Res. 2014 Oct l;327(2):256-63.

Claims (6)

1. Применение ингибитора МЕК для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию, опосредованную бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae, и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, где ингибитор МЕК выбран из группы, включающей CI1040 и GDC-0973.
2. Применение по п.1, где бактериальная инфекция опосредована Staphylococcus Aureus или Streptococcus pneumoniae.
3. Применение по п.1 или 2, где инфекция, вызванная вирусом гриппа, опосредована вирусом гриппа А или вирусом гриппа В.
4. Применение по п.3, где вирус гриппа А представляет собой H1N1, H2N2, H3N2, H6N1, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, H10N8 или H5N1.
5. Применение по любому из пп.1-4 у позвоночного.
6. Композиция, содержащая ингибитор МЕК, для применения в способе лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию, опосредованную бактерией, выбранной из группы, включающей Staphylococcaceae и/или Streptococcaceae, и инфекцию, вызванную вирусом гриппа, где ингибитор МЕК выбран из группы, включающей CI-1040 и GDC-0973.
EA201692303A 2014-05-16 2015-05-18 Применение ингибитора мек для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа EA039897B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LU92455 2014-05-16
PCT/IB2015/053644 WO2015173788A1 (en) 2014-05-16 2015-05-18 Novel anti-infective strategy against influenza virus and s. aureus coinfections

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201692303A1 EA201692303A1 (ru) 2017-03-31
EA039897B1 true EA039897B1 (ru) 2022-03-24

Family

ID=50980349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201692303A EA039897B1 (ru) 2014-05-16 2015-05-18 Применение ингибитора мек для лечения коинфекции, включающей бактериальную инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гриппа

Country Status (10)

Country Link
US (3) US10456440B2 (ru)
EP (2) EP3142658B1 (ru)
JP (2) JP6818676B2 (ru)
KR (1) KR102405136B1 (ru)
CN (3) CN113398271A (ru)
AU (3) AU2015260765B2 (ru)
BR (1) BR112016026556A8 (ru)
CA (1) CA2949004A1 (ru)
EA (1) EA039897B1 (ru)
WO (1) WO2015173788A1 (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2949004A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Atriva Therapeutics Gmbh Novel anti-infective strategy against influenza virus and s. aureus coinfections
AU2016396042A1 (en) * 2016-03-01 2018-09-20 Versitech Limited Compositions and methods for treatment of influenza virus
GB201611712D0 (en) 2016-07-02 2016-08-17 Hvivo Services Ltd Methods and compounds for the treatment or prevention of severe or persistent influenza
WO2018009896A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Metastat, Inc. Methods and compositions for anticancer therapies that target mena protein isoforms kinases
AU2018209164B2 (en) 2017-01-17 2021-11-04 Heparegenix Gmbh Protein kinase inhibitors for promoting liver regeneration or reducing or preventing hepatocyte death
HUE055738T2 (hu) * 2017-10-17 2021-12-28 Atriva Therapeutics Gmbh Új MEK-inhibitor vírus- és baktérium-fertõzések kezelésére
GB201718285D0 (en) 2017-11-03 2017-12-20 Discuva Ltd Antibacterial Compounds
GB201721793D0 (en) 2017-12-22 2018-02-07 Hvivo Services Ltd Methods and compunds for the treatment or prevention of hypercytokinemia and severe influenza
CA3118461A1 (en) * 2018-11-02 2020-05-07 University Of Maryland, Baltimore Inhibitors of type 3 secretion system and antibiotic therapy
CN110063954B (zh) * 2019-04-10 2021-08-06 华中农业大学 Fhpi在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用
LU101183B1 (en) 2019-04-16 2020-10-16 Atriva Therapeutics Gmbh Novel mek-inhibitor for the treatment of viral and bacterial infections
CN110292593A (zh) * 2019-08-05 2019-10-01 广州呼吸健康研究院 厚朴在制备抗流感药物上的应用
JP2022546424A (ja) 2019-08-27 2022-11-04 アトリバ セラピューティクス ゲーエムベーハー Ｍｅｋ阻害剤とキャップ依存性エンドヌクレアーゼ阻害剤との組み合わせ
EP4041212A1 (en) 2019-10-08 2022-08-17 Atriva Therapeutics GmbH Mek inhibitors for the treatment of hantavirus infections
CN110859845B (zh) * 2019-12-10 2021-02-02 南京医科大学 丹参酮类化合物的应用
KR102641463B1 (ko) * 2020-08-18 2024-02-27 한국생명공학연구원 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료를 위한 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
CN112552189A (zh) * 2020-11-10 2021-03-26 中国海洋大学 一种盐酸金刚烷胺与白藜芦醇的药物共晶及其制备方法
WO2023084489A1 (en) * 2021-11-15 2023-05-19 Pfizer Inc. Methods of treating coronavirus disease 2019
WO2023170187A1 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Technische Universität München INHIBITION OF INTRACELLULAR PATHOGEN UPTAKE BY INHIBITORS OF THE IKK-α/NIK COMPLEX
KR20240087518A (ko) 2022-12-01 2024-06-19 서울여자대학교 산학협력단 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법
CN116531389B (zh) * 2023-07-04 2023-10-20 四川大学华西医院 Vs6766联合雷公藤红素的应用及药物组合物
CN117105810B (zh) * 2023-10-23 2024-02-09 中国农业大学 一种具有广谱抗菌活性的化合物及其抗菌组合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030232998A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-18 Board Of Trustees Of Michigan State University NF-kB inhibitors and uses threreof
JP2007055983A (ja) * 2005-08-26 2007-03-08 Tokyo Univ Of Science 細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤
US20120017892A1 (en) * 2008-01-14 2012-01-26 Activaero Gmbh Use of salt of an acetylsalicylic acid for the treatment of viral infections

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1028954B1 (en) 1997-04-24 2003-07-02 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
US6514977B1 (en) 1997-05-22 2003-02-04 G.D. Searle & Company Substituted pyrazoles as p38 kinase inhibitors
JP2002515915A (ja) 1997-06-30 2002-05-28 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 炎症性疾患の治療で有用な２−置換イミダゾール類
KR100378937B1 (ko) 1997-10-20 2003-05-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 바이사이클릭 키나아제 억제제
CA2321559A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted pyrrolobenzimidazoles for treating inflammatory diseases
US6448257B1 (en) 1998-05-22 2002-09-10 Scios, Inc. Compounds and methods to treat cardiac failure and other disorders
US6184226B1 (en) 1998-08-28 2001-02-06 Scios Inc. Quinazoline derivatives as inhibitors of P-38 α
US6410540B1 (en) 1998-08-28 2002-06-25 Scios, Inc. Inhibitors of p38-αkinase
UA73492C2 (en) 1999-01-19 2005-08-15 Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
US6509361B1 (en) 1999-05-12 2003-01-21 Pharmacia Corporation 1,5-Diaryl substituted pyrazoles as p38 kinase inhibitors
EP1353905B1 (en) 2000-11-20 2007-01-10 Scios Inc. Piperidine/piperazine-type inhibitors of p38 kinase
WO2002074242A2 (en) 2001-03-16 2002-09-26 Tyler Curiel Inhibition of toxoplasma gondii) replication by pyridinylimidazoles
EA028605B1 (ru) 2012-10-08 2017-12-29 Атрива Терапьютикс Гмбх Комбинация озельтамивира и ингибитора mek для лечения вирусных заболеваний
CA2949004A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Atriva Therapeutics Gmbh Novel anti-infective strategy against influenza virus and s. aureus coinfections

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030232998A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-18 Board Of Trustees Of Michigan State University NF-kB inhibitors and uses threreof
JP2007055983A (ja) * 2005-08-26 2007-03-08 Tokyo Univ Of Science 細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤
US20120017892A1 (en) * 2008-01-14 2012-01-26 Activaero Gmbh Use of salt of an acetylsalicylic acid for the treatment of viral infections

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGICAL ABSTRACTS, 16 November 2002, Philadelphia, PA, US; BAKKER FRANK; BURGER RENATE; GUENTHER ANDREAS; GRAMATZKI MARTIN: "MEK1/2 Inhibitor U0126 Blocks Activation of the JAK/STAT Pathway in Malignant Plasma Cell Tumors." XP002734329 *
Kyros Ipaktchi ET AL: "Topical p38 MAPK Inhibition Reduces Bacterial Growth on Burn Wounds in an in vivo Burn Model NIH Public Access INTRODUCTION", 1 July 2008 (2098-07-01), pages 1-14, XP055160894, Retrieved from the Internet: URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articl es/PMC2000830/pdf/nihms27502.pdf [retrieved on 2015-01-09] 4th paragraph on page 2; 3rd paragraph on page 5; paragraph bridging page 6 and 7 *
LOEFFLER BETTINA; NIEMANN SILKE; EHRHARDT CHRISTINA; HORN DAGMAR; LANCKOHR CHRISTIAN; LINA GERARD; LUDWIG STEPHAN; PETERS GEORG: "Pathogenesis of Staphylococcus aureus necrotizing pneumonia: the role of PVL and an influenza coinfection", EXPERT REVIEW OF ANTI-INFECTIVE THERAPY, FUTURE DRUGS, LONDON, GB, vol. 11, no. 10, 1 October 2013 (2013-10-01), GB , pages 1041 - 1051, XP009181895, ISSN: 1478-7210, DOI: 10.1586/14787210.2013.827891 *
LUDWIG, S. WOLFF, T. EHRHARDT, C. WURZER, W.J. REINHARDT, J. PLANZ, O. PLESCHKA, S.: "MEK inhibition impairs influenza B virus propagation without emergence of resistant variants", FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 561, no. 1-3, 12 March 2004 (2004-03-12), NL , pages 37 - 43, XP004495449, ISSN: 0014-5793, DOI: 10.1016/S0014-5793(04)00108-5 *
MUNIYAPPA, H. DAS, K.C.: "Activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) by widely used specific p38 MAPK inhibitors SB202190 and SB203580: A MLK-3-MKK7-dependent mechanism", CELLULAR SIGNALLING., ELSEVIER SCIENCE LTD., GB, vol. 20, no. 4, 8 December 2007 (2007-12-08), GB , pages 675 - 683, XP022486417, ISSN: 0898-6568, DOI: 10.1016/j.cellsig.2007.12.003 *
TÓTH L.; MUSZBEK L.; KOMáROMI I.: "Mechanism of the irreversible inhibition of human cyclooxygenase-1 by aspirin as predicted by QM/MM calculations", JOURNAL OF MOLECULAR GRAPHICS AND MODELLING, ELSEVIER SCIENCE, NEW YORK, NY, US, vol. 40, 9 January 2013 (2013-01-09), US , pages 99 - 109, XP028981038, ISSN: 1093-3263, DOI: 10.1016/j.jmgm.2012.12.013 *
Y. BORGELING, M. SCHMOLKE, D. VIEMANN, C. NORDHOFF, J. ROTH, S. LUDWIG: "Inhibition of p38 Mitogen-activated Protein Kinase Impairs Influenza Virus-induced Primary and Secondary Host Gene Responses and Protects Mice from Lethal H5N1 Infection", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 289, no. 1, 3 January 2014 (2014-01-03), pages 13 - 27, XP055161048, ISSN: 00219258, DOI: 10.1074/jbc.M113.469239 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220096590A1 (en) 2022-03-31
EP3142658B1 (en) 2020-01-15
CN107073123A (zh) 2017-08-18
US10456440B2 (en) 2019-10-29
US20170080045A1 (en) 2017-03-23
CN113398271A (zh) 2021-09-17
BR112016026556A2 (pt) 2017-08-15
EP3708156A1 (en) 2020-09-16
BR112016026556A8 (pt) 2021-07-06
EP3142658A1 (en) 2017-03-22
WO2015173788A1 (en) 2015-11-19
CN116942832A (zh) 2023-10-27
KR102405136B1 (ko) 2022-06-07
JP2017515910A (ja) 2017-06-15
US11135263B2 (en) 2021-10-05
JP2021059592A (ja) 2021-04-15
AU2022268364A1 (en) 2022-12-15
AU2015260765B2 (en) 2020-08-13
AU2020256326B2 (en) 2022-12-08
AU2015260765A1 (en) 2016-12-01
CA2949004A1 (en) 2015-11-19
KR20170005110A (ko) 2017-01-11
EA201692303A1 (ru) 2017-03-31
US20200101130A1 (en) 2020-04-02
AU2020256326A1 (en) 2020-11-12
JP6818676B2 (ja) 2021-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11135263B2 (en) Novel-anti-infective strategy against influenza virus and S. aureus coinfections
CN111479566B (zh) 用于治疗病毒和细菌感染的新mek抑制剂
Almutairi et al. RGS10 reduces lethal influenza infection and associated lung inflammation in mice
JP2022529343A (ja) ウイルス感染および細菌感染の治療のための新規ｍｅｋ阻害剤
US11433080B2 (en) Antiviral treatment
EA042391B1 (ru) Новый ингибитор mek для лечения вирусных и бактериальных инфекций