CN116531389B - Vs6766联合雷公藤红素的应用及药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了VS6766联合雷公藤红素的应用及药物组合物，涉及生物医药技术领域。与VS6766或Celastrol单独使用相比，VS6766与Celastrol联合使用，对抑制KRAS突变型肠癌细胞的增殖与存活发挥了协同增效作用，可同时有效抑制MAPK及mTOR通路的信号传导，发挥了协同抗肿瘤作用。VS6766和Celastrol既可以采用联合用药的方式，也可制成组合制剂，用于治疗KRAS突变型肠癌。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及VS6766联合雷公藤红素用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物中的应用及药物组合物。
背景技术
结直肠癌是全球第三大常见的癌症，且近年来发病倾向年轻化。RAS基因是人类肿瘤中最常见的致癌基因，其中85%为KRAS突变。约30%-50%的结直肠癌与KRAS突变有关，以KRAS G12V、G13D等突变最常见，然而KRAS突变型结直肠癌患者对EGFR抑制剂易产生耐药，生存期明显缩短，预后极差。目前针对KRAS突变型结直肠癌的临床治疗策略有限。
KRAS蛋白主要通过激活下游RAF-MEK-ERK（MAPK）、PI3K-AKT-mTOR通路进行信号传导，控制细胞增殖、凋亡、转移等。KRAS突变蛋白可持续激活下游MAPK、mTOR通路，导致肿瘤发生。因此，提供能够抑制其下游MAPK及mTOR通路的信号传导是靶向KRAS的重要治疗策略。
发明内容
本发明的目的之一在于提供VS6766联合雷公藤红素用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物中的应用。
在KRAS突变型结直肠癌细胞中，VS6766，其结构式如图1a所示，是一种新型的RAF/MEK双靶点抑制剂，VS6766可同时有效抑制pMEK、pERK的活性，是KRAS靶向药研究的新突破。VS6766可直接与MEK结合并形成稳定的RAF/MEK抑制性复合物，有效的抑制MAPK通路信号传导。结直肠癌细胞SW480（KRAS G12V）、HCT116（KRAS G13D）的VS6766半数抑制浓度（IC50）分别为46、277nM。然而VS6766治疗KRAS突变型结直肠癌的临床试验尚在进行中。且短时间内VS6766单药治疗可有效抑制MAPK通路的pMEK、pERK活性，但较长时间治疗仍存在pMEK、pERK反弹激活。ERK信号的反弹激活与mTOR等其他旁路激活有关，同时抑制mTOR通路的信号传导可能增强其疗效，但VS6766不能抑制mTOR的活性。
雷公藤红素（Celastrol），其结构式如图1b所示，是从我国传统中药雷公藤中提取出的天然活性药物。Celastrol可通过抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达和磷酸化激活，有效抑制HCT116（KRAS G13D）细胞增殖，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤活性。但受其理化性质所限，Celastrol的副作用较广泛，治疗窗口剂量较窄。
本发明的目的之二在于提供一种药物组合物。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供的VS6766联合雷公藤红素用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物中的应用。
第二方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括VS6766和雷公藤红素。
基于上述技术方案，本发明的VS6766联合雷公藤红素用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物中的应用及药物组合物至少具有如下有益效果：
本发明的应用是将RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766联合雷公藤红素用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物，该应用能够同时阻断KRAS下游的mTOR通路和MAPK通路的信号传导，具有协同抗肿瘤作用，对KRAS突变型结直肠癌细胞的增殖具有良好的抑制效果，且抑制效果明显优于单独使用VS6766或雷公藤红素。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为VS6766与Celastrol的分子结构式，其中，图1a为RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766的分子结构式，图1b为mTOR抑制剂Celastrol的分子结构式；
图2为VS6766与Celastrol的协同作用机理的示意图；
图3为VS6766联合Celastrol的CCK8细胞增殖实验结果图，其中，图3a为HCT116-KRAS G13D的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的CCK8细胞增殖结果图；图3b为SW480-KRAS G12V的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的CCK8细胞增殖结果图；图3c为SW620-KRAS G12V的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的CCK8细胞增殖结果图；
图4为VS6766联合Celastrol的CCK8细胞增殖实验结果的协同指数结果图，其中，图4a为HCT116-KRAS G13D的结肠癌细胞的CCK8细胞增殖实验中VS6766联合Celastrol组三种不同药物浓度下协同指数（CI）图，图4b为SW480-KRAS G12V的结肠癌细胞的CCK8细胞增殖实验中VS6766联合Celastrol组三种不同药物浓度下协同指数（CI）图；图4c为SW620-KRAS G12V的结肠癌细胞的CCK8细胞增殖实验中VS6766联合Celastrol组三种不同药物浓度下协同指数（CI）图；
图5为VS6766联合Celastrol的克隆形成实验结果图，其中，图5a为HCT116-KRASG13D的结肠癌细胞在各组药物处理后的细胞克隆数量结果图，图5b为SW480-KRAS G12V的结肠癌细胞在各组药物处理后的细胞克隆数量结果图；图5c为SW620-KRAS G12V的结肠癌细胞在各组药物处理后的细胞克隆数量结果图；
图6为VS6766联合Celastrol的蛋白免疫印迹实验结果图，其中，图6a为HCT116-KRAS G13D的结肠癌细胞、SW480-KRAS G12V的结肠癌细胞和SW620-KRAS G12V的结肠癌细胞在各组药物处理后的蛋白免疫印迹结果图，图6b为SW620-KRAS G12V的结肠癌细胞在各组药物处理后随着时间延长的蛋白免疫印迹结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766联合雷公藤红素用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物中的应用。
具体实验如下：
1.本发明实验所涉及的肿瘤细胞及药物如下：
KRAS突变的人结肠癌细胞：HCT116（KRAS G13D）、SW480（KRAS G12V）和SW620（KRASG12V）（四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室）。
RAF/MEK双靶点抑制剂：VS6766（Selleckchem，美国）。
mTOR抑制剂：雷公藤红素（Celastrol，Selleckchem，美国）。
2.实验方法：
实验分组：
①对照组：使用DMSO（二甲基亚砜，Biofroxx，德国）处理细胞；
②VS6766组：单独使用VS6766处理细胞；
③Celastrol组：单独使用Celastrol处理细胞；
④VS6766联合Celastrol组：使用VS6766和Celastrol同时处理细胞。
VS6766和Celastrol使用时用DMSO分别配制成溶液，联合组使用2种溶液同时处理细胞。
以下对实验过程具体说明：
CCK8细胞增殖实验：
制备新鲜完全培养基用于细胞培养：DMEM培养基（Gibco，美国） +10%胎牛血清（Gibco，美国）。
收集对数生长期结肠癌细胞HCT116（KRAS G13D）、SW480（KRAS G12V）和SW620（KRAS G12V），分别均匀接种于96孔板（5000cells/孔，每孔100ul），每个药物浓度3个重复孔。37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后加入不同药物处理。
具体分组为：
①对照组：加入DMSO；
②VS6766组：分别加入浓度为0.05μM、0.1μM和0.2μM的VS6766；
③Celastrol组：分别加入浓度为1μM、2μM和4μM的Celastrol；
④VS6766+Celastrol组：加入浓度为0.05μM的VS6766和1μM的Celastrol、加入浓度为0.1μM的VS6766和2μM的Celastrol、加入浓度为0.2μM的VS6766和4μM的Celastrol（VS6766和Celastrol的摩尔比为1：20）。用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（100μL）。继续培养72h后，用无血清培养基（DMEM）按照10:1比例稀释CCK8试剂（Target Mol，美国），在每孔加入100ul稀释后的CCK8试剂，培养0.5-4小时后，酶标仪测定450nm吸光度，并运用Chou-Talalay公式计算协同指数（CI），CI<1说明两种药物具有协同增效作用。
克隆形成实验：
将对数生长期的结肠癌细胞HCT116（KRAS G13D）、SW480（KRAS G12V）和SW620（KRAS G12V）均匀接种于12孔板中（1×104cells/孔），细胞贴壁后再培养3-4天，待单个细胞形成4-5个细胞小集落后分组加药处理。
具体分组为：
①对照组：加入DMSO；
②VS6766组（即VS 组） ：HCT116细胞中加入浓度为4μM的VS6766。SW480细胞及SW620细胞中加入浓度为2μM的VS6766；
③Celastrol组（即 CE 组）：加入浓度为2μM的Celastrol；
④VS6766+Celastrol组 （即 VS+CE 组）：HCT116细胞中加入浓度为4μM的VS6766和2μM的Celastrol（VS6766和Celastrol的摩尔比为2:1），SW480细胞及SW620细胞中加入浓度为2μM的VS6766和2μM的Celastrol（VS6766和Celastrol的摩尔比为1:1）；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（1mL）。加入相应药物后继续培养5-10天，为维持药物浓度，每2-3天更换一次新鲜完全培养基及相应药物。集落形成后，采用多聚甲醛固定，结晶紫染色，观察细胞克隆数量。
蛋白免疫印迹实验：
将对数生长期的结肠癌细胞HCT116（KRAS G13D）、SW480（KRAS G12V）和SW620（KRAS G12V）分别均匀接种于6孔板中，分别加入不同药物进行处理（每组2个孔，分别培养24h，120h）。
具体分组为：
①对照组：加入DMSO；
②VS6766组：加入浓度为0.05μM的VS6766；
③Celastrol组：加入浓度为0.1μM的Celastrol；
④VS6766+Celastrol组：加入浓度为0.05μM的VS6766和0.1μM的Celastrol（VS6766与Celastrol的摩尔比为1:2）；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（2mL）。
各组如上述加入相应药物后，每组中2个孔的药物处理时间不同，即分别培养24h、120h，每2-3天更换新鲜培养基以维持药物浓度。在相应时间点分别提取细胞总蛋白，进行蛋白免疫印迹实验，检测MAPK通路主要蛋白pMEK（S218/S222，Abcam）、pERK（Erk1（pT202/pY204）+Erk2（pT185/pY187），Abcam），和PI3K通路主要蛋白pAKT（S473，ABclonal）、pmTOR（S2448， Abcam）及GAPDH（Santa Cruz）的表达水平。
3.实验结果：
如图3和图4所示，图3为VS6766联合Celastrol的CCK8细胞增殖实验结果图。CCK8是检测细胞增殖的实验，用于检测药物处理对活细胞的数量的影响。协同指数（combinedindex，CI）可判断两种药物的协同性，CI=1表示相加作用，CI>1表示拮抗作用，CI<1表示协同作用， 其中：0.8≤CI<0.9为低度协同作用，0.6≤CI<0.8为中度协同作用，0.4≤CI<0.6为高度协同作用，0.2≤CI<0.4为强协同作用。由图3可知：单药VS6766组和单药Celastrol组均可有效抑制KRAS突变型肠癌细胞增殖，而VS6766+Celastrol组的相对细胞增殖比例均显著低于VS6766单药组和Celastrol单药组，且如图4所示，VS6766+Celastrol组的CI值均小于1，说明VS6766+Celastrol联合组对于抑制KRAS突变型结肠癌细胞的增殖具有协同增效作用。更进一步，两药的CI指数位于0.5与0.8之间，说明VS6766联合Celastrol具有中度协同作用。VS6766与 Celastrol 的协同作用机理请参照图 2所示。
图5为VS6766联合Celastrol的克隆形成实验结果图。克隆形成是评估单个细胞经药物处理后存活、增殖并形成克隆的能力。由图5可知：单药VS6766组和单药Celastrol组均可有效抑制KRAS突变型肠癌细胞增殖与存活；而VS6766+Celastrol联合组的细胞克隆数均明显少于VS6766单药组和Celastrol单药组。说明VS6766+Celastrol联合使用可更显著地抑制KRAS突变型肠癌细胞增殖与存活。
图6为VS6766联合Celastrol的蛋白免疫印迹实验结果图。KRAS通过磷酸化激活MAPK通路关键激酶pMEK、pERK和mTOR通路关键激酶pAKT、pmTOR等来传导致癌信号。由图6a图可知，在KRAS突变型肠癌细胞中，VS6766单药可有效抑制pMEK、pERK活性，但对pAKT、pmTOR的抑制作用较弱；Celastrol单药可部分抑制pAKT、pmTOR活性，但对pMEK、pERK的抑制作用较弱；VS6766+Celastrol联合组可同时抑制MAPK通路（pMEK、pERK）活性和mTOR通路（pAKT、pmTOR）活性，在SW620细胞中联合组的抑制效果更显著。由图6b图可知，短时间VS6766单药治疗可有效抑制pMEK、pERK活性，但较长时间VS6766单药治疗存在pERK反弹激活；Celastrol单药组对pMEK、pERK活性的抑制作用较弱；而VS6766+Celastrol联合组可部分逆转长时间VS6766作用下诱导的pERK反弹。WB结果与CCK8、克隆形成实验的结果一致。
综上，与VS6766或Celastrol单独使用相比，VS6766与Celastrol联合使用，对抑制KRAS突变型肠癌细胞的增殖与存活发挥了协同增效作用，可同时有效抑制MAPK及mTOR通路的信号传导。
本发明研究表明RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766和mTOR抑制剂Celastrol对KRAS突变型肠癌细胞的增殖具有良好的抑制作用，效果显著优于单独使用VS6766或Celastrol，发挥了协同抗肿瘤作用。因此，VS6766和Celastrol既可以采用联合用药的方式，也可制成组合制剂，用于治疗KRAS突变型肠癌。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (1)
1.VS6766联合雷公藤红素作为仅有的活性成分用于制备治疗KRAS突变型结直肠癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物中所述VS6766和所述雷公藤红素的摩尔比为1:2或1:20或者1:1或2:1，所述VS6766的结构式为，所述雷公藤红素的结构式为/>。
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