EA039000B1

EA039000B1 - Composition having antiviral effect

Info

Publication number: EA039000B1
Application number: EA201890653A
Authority: EA
Inventors: Рихард Аммер
Original assignee: Медице Арцнаймиттель Пюттер Гмбх Унд Ко. Кг.
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2016-09-16
Publication date: 2021-11-19
Also published as: UA123054C2; EP3349741A1; AR106057A1; WO2017046312A1; EA201890653A1; DE202016008745U1

Abstract

The invention relates to a pharmaceutical composition which comprises tyrothricine, benzalkonium chloride, and/or benzocaine for use in antiviral therapy or in the treatment of a viral infection.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеThe technical field to which the present invention relates

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей тиротрицин, хлорид бензалкония и/или бензокаин, для применения в противовирусной терапии или в лечении вирусной инфекции.The present invention relates to a pharmaceutical composition containing tyrothricin, benzalkonium chloride and / or benzocaine for use in antiviral therapy or in the treatment of viral infection.

Уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Вирусы и бактерии представляют собой патогены широко распространенного острого фарингита. Лекарственные средства для лечения этих заболеваний были доступны на рынке в течение десятилетий, как например леденцы от боли в горле доритрицин® Classic. Их обычно применяют с антисептическими и антибактериальными средствами, содержащимися в них, для клинически эффективного облегчения типичных симптомов фарингита, таких как боль при глотании и покраснение при фарингите.Viruses and bacteria are pathogens of widespread acute pharyngitis. Medicines for these conditions have been available on the market for decades, such as the Dorithricin® Classic sore throat lozenges. They are commonly used with the antiseptic and antibacterial agents they contain for clinically effective relief of typical pharyngitis symptoms such as pain on swallowing and redness with pharyngitis.

Тиротрицин представляет собой смесь различных эффективных против бактерий линейных и циклических полипептидов из групп грамицидинов и тироцидинов. Они образуются как эндотоксиноподобные молекулы анаэробной спорообразующей бактерией Bacillus aneurinolyticus (синоним Bacillus brevis). Спектр активности включает в основном грамположительные бактерии, но также некоторые грамотрицательные бактерии и различные типы грибков, такие как Candida albicans. Тиротрицин содержит 50-70% тироцидинов и 25-50% грамицидинов, которые вместе составляют по меньшей мере 85% активного ингредиента. Кроме того, встречаются небольшие количества других структурно родственных полипептидов.Tyrothricin is a mixture of various bacterially effective linear and cyclic polypeptides from the gramicidin and tyrocidin groups. They are formed as endotoxin-like molecules by the anaerobic spore-forming bacterium Bacillus aneurinolyticus (synonym for Bacillus brevis). The spectrum of activity includes mainly gram-positive bacteria, but also some gram-negative bacteria and various types of fungi such as Candida albicans. Tyrothricin contains 50-70% tyrocidins and 25-50% gramicidins, which together constitute at least 85% of the active ingredient. In addition, small amounts of other structurally related polypeptides are found.

Хлорид бензалкония представляет собой смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, алкильный фрагмент в которых состоит из С8-С18 цепей. Он оказывает общий дезинфицирующий и консервирующий эффект и является эффективным против бактерий, грибов, дрожжей и водорослей (даже против вирусов, но в меньшей степени).Benzalkonium chloride is a mixture of alkylbenzyldimethylammonium chlorides, the alkyl fragment of which consists of C8-C18 chains. It has a general disinfecting and preservative effect and is effective against bacteria, fungi, yeast and algae (even against viruses, but to a lesser extent).

Бензокаин (этиловый эфир 4-аминобензойной кислоты) представляет собой местный анестетик, и его в основном применяют для терапии локальной болезненности кожи и слизистой оболочки, как например, в ротовой полости и горле, а также в лекарственных препаратах против простудных заболеваний, противокашлевых препаратах, обезболивающих средствах, таких как растворы или леденцы от проблем с горлом, желудком и зубами, вяжущих средствах.Benzocaine (4-aminobenzoic acid ethyl ester) is a local anesthetic and is mainly used to treat local soreness of the skin and mucous membranes, such as in the mouth and throat, as well as in medicines for colds, antitussives, pain relievers. remedies such as solutions or lozenges for problems with the throat, stomach and teeth, astringents.

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief disclosure of the present invention

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей тиротрицин, хлорид бензалкония и/или бензокаин, для применения в противовирусной терапии или в лечении вирусной инфекции. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления композиция содержит все три активных ингредиента в комбинации.The present invention relates to a pharmaceutical composition containing tyrothricin, benzalkonium chloride and / or benzocaine for use in antiviral therapy or in the treatment of viral infection. According to a preferred embodiment, the composition contains all three active ingredients in combination.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Фиг. 1-4 - выраженное в процентах ингибирование активности вирусов HR14, H1N1 и RSV растворами доритрицина® с разной степенью разведения.FIG. 1-4 - Percentage inhibition of HR14, H1N1 and RSV virus activity by dorithricin® solutions with varying degrees of dilution.

Фиг. 1 - синергичный противовирусный эффект всех 3 активных ингредиентов - тиротрицина, хлорида бензалкония и бензокаина в комбинации при возрастающей степени разведения. Синергичный эффект подтверждается при сравнении с фиг. 2-4.FIG. 1 - synergistic antiviral effect of all 3 active ingredients - tyrothricin, benzalkonium chloride and benzocaine in combination with an increasing degree of dilution. The synergistic effect is confirmed by comparison with FIG. 2-4.

Фиг. 2 - слабый противовирусный эффект тиротрицина отдельно при возрастающей степени разведения.FIG. 2 - weak antiviral effect of tyrothricin separately with an increasing degree of dilution.

Фиг. 3 - очень слабый противовирусный эффект хлорида бензалкония отдельно при возрастающей степени разведения.FIG. 3 - a very weak antiviral effect of benzalkonium chloride separately with an increasing degree of dilution.

Фиг. 4 - очень слабый противовирусный эффект бензокаина отдельно при возрастающей степени разведения.FIG. 4 - a very weak antiviral effect of benzocaine alone with an increasing degree of dilution.

Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention

В исследовании in vitro изучали дозозависимый противовирусный эффект вышеупомянутых активных веществ в отношении патогенных для человека вирусов RSV, HRV14 и H1N1. Данные этого исследования демонстрируют, что раствор, приготовленный из активных ингредиентов и доведенный до высокой физиологической концентрации активных ингредиентов, снижает вирусную активность на 68,4% (HRV14), 52,7% (H1N1) и 74,3% (RSV). Противовирусный эффект больше не мог выявляться только при очень высокой степени разведения активного ингредиента. Таким образом, фармацевтическая композиция, содержащая тиротрицин, хлорид бензалкония и бензокаин, характеризуется ярко выраженными, дозозависимыми и синергичными противовирусными свойствами в отношении вирусов RSV, HRV14 и H1N1.In an in vitro study, the dose-dependent antiviral effect of the aforementioned active substances against human pathogenic viruses RSV, HRV14 and H1N1 was studied. The data from this study demonstrate that a solution prepared from active ingredients and adjusted to a high physiological concentration of active ingredients reduces viral activity by 68.4% (HRV14), 52.7% (H1N1) and 74.3% (RSV). The antiviral effect could no longer be detected only at a very high dilution of the active ingredient. Thus, the pharmaceutical composition containing tyrothricin, benzalkonium chloride and benzocaine is characterized by pronounced, dose-dependent and synergistic antiviral properties against RSV, HRV14 and H1N1 viruses.

Это наблюдение является новым и неожиданным из-за активных ингредиентов: Тиротрицин относится к антибиотикам, действующим против бактерий, хлорид бензалкония и бензокаин относятся к аналгетикам, эффективным против боли (1-4).This observation is new and unexpected due to the active ingredients: Tyrothricin is an antibiotic against bacteria, benzalkonium chloride and benzocaine are an analgesic that is effective against pain (1-4).

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей тиротрицин, хлорид бензалкония и/или бензокаин, для применения в противовирусной терапии или в лечении вирусной инфекции.Thus, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing tyrothricin, benzalkonium chloride and / or benzocaine for use in antiviral therapy or in the treatment of viral infection.

Композиция согласно настоящему изобретению может включать в себя, состоять из или, по существу, содержать вышеупомянутые активные вещества. Выражение состоит, по сути, из означает, чтоThe composition according to the present invention may include, consist of, or substantially contain the aforementioned active substances. The expression consists, in fact, of means that

- 1 039000 фармацевтическая композиция содержит эти компоненты в качестве действующих ингредиентов. Тем не менее, она при этом может содержать один или несколько растворителей, вспомогательных веществ и- 1 039000 pharmaceutical composition contains these components as active ingredients. However, it may contain one or more solvents, excipients and

т.д., которые являются необходимыми для производства фармацевтической композиции, но не вносят вклад или не вносят значительный вклад в фармакологическую эффективность.etc., which are necessary for the production of a pharmaceutical composition, but do not contribute or significantly contribute to pharmacological efficacy.

Термин фармацевтическая композиция, который используется в данном документе, включает в себя, в частности, пероральные лекарственные формы, такие как твердые, полужидкие или жидкие композиции для перорального введения. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления композиция имеет форму таблетки, в частности, леденца или таблетки от боли в горле.The term pharmaceutical composition as used herein includes, in particular, oral dosage forms such as solid, semi-liquid or liquid compositions for oral administration. According to a preferred embodiment, the composition is in the form of a tablet, in particular a lozenge or a sore throat tablet.

Тем не менее, в качестве альтернативы, также возможны другие лекарственные формы, такие как твердые пероральные лекарственные формы, как например, порошки или капсулы. В этом случае ограниченные добавки стеарата магния или бегената кальция можно применять в качестве смазывающих средств, и крахмал можно применять в качестве ускорителей распада (разрыхлителя). В случае гранулирования можно применять водный раствор лактозы, этанол и подходящие концентрации крахмальных паст.However, alternatively, other dosage forms are also possible, such as solid oral dosage forms, such as powders or capsules. In this case, limited additions of magnesium stearate or calcium behenate can be used as lubricants and starch can be used as decomposition accelerators (disintegrant). In the case of granulation, an aqueous solution of lactose, ethanol and suitable concentrations of starch pastes can be used.

Общепринятые вспомогательные средства, применяемые в производстве леденцов от боли в горле, включают в себя сорбит (E 420), тальк, сложные эфиры жирных кислоты и сахарозы, дигидрат сахарината натрия, мятное масло, повидон 25 и кармеллозу натрия.Common adjuvants used in the manufacture of throat lozenges include sorbitol (E 420), talc, fatty acid sucrose esters, sodium saccharinate dihydrate, peppermint oil, povidone 25, and sodium carmellose.

В дополнение к пероральным лекарственным формам фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может включать в себя парентеральные формы, т.е. жидкие разбавленные растворы для инъекции и жидкие растворы для втирания, а также мази, суппозитории, глазные капли и назальные капли.In addition to oral dosage forms, the pharmaceutical composition of the present invention may include parenteral forms, i. E. liquid diluted solutions for injection and liquid solutions for rubbing in, as well as ointments, suppositories, eye drops and nasal drops.

В предпочтительной форме композицию применяют для лечения инфекции, вызванной риновирусами, вирусами гриппа и/или пневмовирусами.In a preferred form, the composition is used to treat an infection caused by rhinoviruses, influenza viruses and / or pneumoviruses.

В соответствии с вариантом осуществления фармацевтическую композицию применяют в способе лечения вирусной инфекции, причем вирусная инфекция вызвана HRV14 (риновирус человека типа 14), RSV (респираторно-синцитиальный вирус человека) и/или H1N1 (вирус гриппа A H1N1).According to an embodiment, the pharmaceutical composition is used in a method for treating a viral infection, the viral infection being caused by HRV14 (human rhinovirus type 14), RSV (human respiratory syncytial virus) and / or H1N1 (influenza A H1N1 virus).

Одна доза фармацевтической композиции предпочтительно содержит приблизительно 0,5 мг тиротрицина, приблизительно 1,0 мг хлорида бензалкония и/или приблизительно 1,5 мг бензокаина и одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. В этом контексте термин приблизительно означает диапазон отклонений, составляющий ±50%, предпочтительно ±20%, наиболее предпочтительно ±10% относительно массы активного вещества, приведенной выше.One dose of the pharmaceutical composition preferably contains about 0.5 mg of tyrothricin, about 1.0 mg of benzalkonium chloride and / or about 1.5 mg of benzocaine, and one or more pharmaceutically acceptable excipients. In this context, the term “approximately” means a range of deviations of ± 50%, preferably ± 20%, most preferably ± 10%, based on the weight of the active substance given above.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят в суточной дозе, составляющей примерно 2-4 мг тиротрицина, 4-8 мг хлорида бензалкония и 6-12 мг бензокаина.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a daily dose of about 2-4 mg tyrothricin, 4-8 mg benzalkonium chloride and 6-12 mg benzocaine.

Настоящее изобретение далее будет объяснено с учетом следующих рабочих примеров, в которых объясняются эффекты композиции согласно настоящему изобретению.The present invention will be further explained in light of the following working examples, which explain the effects of the composition according to the present invention.

Рабочие примерыWorking examples

1) Введение/1. Introduction/

Вирусы и бактерии представляют собой патогены широко распространенного острого фарингита. Это заболевание, также известное как катаральный фарингит, представляет собой воспаление слизистой оболочки глотки и нижележащих глоточных структур, которое сопровождается типичными симптомами, представляющими собой боль при глотании, царапанье, жжение, сухость в горле и покраснение слизистой оболочки глотки (1).Viruses and bacteria are pathogens of widespread acute pharyngitis. This disease, also known as pharyngitis catarrh, is an inflammation of the pharyngeal mucosa and underlying pharyngeal structures accompanied by typical symptoms of pain on swallowing, scratching, burning, dry throat, and redness of the pharyngeal mucosa (1).

Острый фарингит требует преимущественно симптоматического лечения для облегчения боли. Терапию антибиотиками назначают реже, и ее следует использовать только у 10-15% пациентов, пораженных стрептококкальным фарингитом (1-3), или в случаях, когда нужно предупредить отдаленное последствие, такое как геморрагическая лихорадка. Таблетки от боли в горле, такие как доритрицин®, как уже неоднократно было доказано, являются успешными с клинической точки зрения при симптоматическом лечении (4). Комбинация антибактериальных и аналгезирующих средств: тиротрицина, хлорида бензалкония и бензокаина, содержащихся в нем, эффективно ослабляет типичные симптомы фарингита (4).Acute pharyngitis requires predominantly symptomatic treatment for pain relief. Antibiotic therapy is prescribed less frequently and should be used only in 10-15% of patients with streptococcal pharyngitis (1-3), or in cases where a long-term consequence, such as hemorrhagic fever, needs to be prevented. Sore throat tablets such as Dorithricin® have been proven clinically to be clinically successful in symptomatic treatment (4). The combination of antibacterial and analgesic agents: tyrothricine, benzalkonium chloride and benzocaine contained in it, effectively relieves the typical symptoms of pharyngitis (4).

Интересно, что отдельные компоненты этой комбинации не только действуют против бактерий, но, как описано авторами настоящего изобретения в данном документе, они также активны против вирусов. Находится под вопросом, обладает ли комбинация содержащихся в доритрицине® активных ингредиентов противовирусным эффектом в совокупности. С учетом этого, исследование, представленное ниже, проводили с целью изучения дозозависимого противовирусного эффекта таблеток от боли в горле доритрицин® Classic в отношении патогенных для человека вирусов in vitro.Interestingly, the individual components of this combination not only act against bacteria, but, as described by the present inventors herein, they are also active against viruses. It is questionable whether the combination of active ingredients in Dorithricin® has an antiviral effect in the aggregate. With this in mind, the study presented below was carried out in order to study the dose-dependent antiviral effect of tablets for sore throat Dorithricin® Classic against viruses pathogenic to humans in vitro.

2) Материалы и способы.2) Materials and methods.

Таблетки доритрицин® (MEDICE, Изерлон, Германия) в растворе исследовали в разных степенях разведения в отношении вирусов, которые вызывают инфекции дыхательных путей у людей. Одна таблетка содержит 0,5 мг тиротрицина, 1,0 мг хлорида бензалкония и 1,5 мг бензокаина. Оценивали следующие вирусы: риновирус человека типа 14 (HRV14, РНК-вирус без оболочки), респираторносинцитиальный вирус (RSV, парамиксовирус, РНК-вирус без оболочки) и вирус гриппа A H1N1 (FluA,Dorithricin® tablets (MEDICE, Iserlohn, Germany) in solution have been investigated at varying dilutions for viruses that cause respiratory tract infections in humans. One tablet contains 0.5 mg of tyrothricin, 1.0 mg of benzalkonium chloride and 1.5 mg of benzocaine. The following viruses were evaluated: human rhinovirus type 14 (HRV14, non-enveloped RNA virus), respiratory syncytial virus (RSV, paramyxovirus, non-enveloped RNA virus) and influenza A H1N1 virus (FluA,

- 2 039000- 2 039000

H1N1, ортомиксовирус, РНК-вирус с оболочкой).H1N1, orthomyxovirus, enveloped RNA virus).

Для получения исследуемого раствора таблетку доритрицина® сначала измельчали, а затем растворяли в 1 мл диметилсульфоксида (DMSO), разводили дистиллированной водой 1:100 и стерилизовали (с помощью фильтра с размером ячеек 0,45 мкм). Серию разведений фильтрата с рН, доведенным до 7,4, готовили поэтапно с кратностью разведения log2 или log10 с использованием полной питательной среды. Растворитель, приготовленный в соответствии с описанной процедурой (DMSO), использовали в качестве контроля с растворителем.To obtain the test solution, the dorithricin® tablet was first crushed and then dissolved in 1 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), diluted 1: 100 with distilled water, and sterilized (using a filter with a mesh size of 0.45 μm). A series of dilutions of the filtrate, adjusted to pH 7.4, was prepared in stages with a dilution factor of log2 or log10 using complete culture medium. The solvent prepared according to the described procedure (DMSO) was used as a control with the solvent.

С целью исключения артефактов, обусловленных эффектами исследуемых растворов в отношении клеток для исследования противовирусной активности, которые снижают жизнеспособность и метаболизм, исследуемые растворы вначале подвергали исследованию жизнеспособности в клеточной культуре. В параллельных подходах исследуемые растворы на всех этапах разведения, также как и контроль с растворителем добавляли к растущим чувствительным к вирусам HeLa, MDCK и HEp-2 клеткам и культивировали в общей сложности в течение 3 суток (HeLa, MDCK) или 6 суток (HEp-2) при 37°С и 5% СО₂. В качестве дополнительного контроля только клетки, культивируемые со средой для культивирования клеток, включали в клеточную культуру.In order to exclude artifacts caused by the effects of the investigated solutions on cells for the study of antiviral activity, which reduce the viability and metabolism, the investigated solutions were first subjected to the study of viability in cell culture. In parallel approaches, the test solutions at all stages of dilution, as well as control with a solvent, were added to growing cells susceptible to HeLa, MDCK, and HEp-2 viruses and cultured for a total of 3 days (HeLa, MDCK) or 6 days (HEp- 2) at 37 ° C and 5% CO ₂ . As an additional control, only cells cultured with cell culture medium were included in cell culture.

Оценку возможных эффектов в отношении снижения жизнеспособности осуществляли на 1, 2, 3 и 6 сутки после введения вещества с использованием МТТ-теста. Обработанные клетки инкубировали с раствором МТТ в течение 45 мин (HEp-2, HeLa) и 60 мин, соответственно. Восстановление желтого красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия бромида (МТТ), содержащегося в растворе, до голубовато-фиолетового формазана может осуществляться только интактными живыми клетками, и оно является доказательством жизнеспособности клеток. После солюбилизации кристаллов формазана в 1% DMSO оптическую плотность супернатантов из клеточной культуры определяли фотометрически при длине волны 570 нм. Более высокая оптическая плотность указывает на большее количество жизнеспособных клеток. Более того, возможное изменение морфологии клеток оценивали с помощью микроскопии на 3 сутки (HeLa, MDCK) и сутки 6 (HEp-2) после добавления вещества. Значения OD исследуемых образцов для каждого подхода нормализовали к значениям OD у необработанных контролей, которое определяли как 100% жизнеспособность, и соответствующим образом выражали в виде процентов. Таким образом, можно определить среднюю ингибирующую концентрацию (IC₅₀) для образцов из нескольких параллелей в виде кривых зависимости доза-эффект для исследуемых образцов до концентрации, которая не показывала какого-либо ухудшения жизнеспособности клеток, вызванного исследуемым веществом и, следовательно, была подходящей для применения в исследованиях противовирусной активности.Evaluation of possible effects in terms of reducing viability was carried out on days 1, 2, 3 and 6 after the introduction of the substance using the MTT test. The treated cells were incubated with MTT solution for 45 min (HEp-2, HeLa) and 60 min, respectively. Reduction of the yellow dye 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) contained in the solution to bluish-violet formazan can only be carried out by intact living cells, and it is proof of viability cells. After solubilization of formazan crystals in 1% DMSO, the optical density of cell culture supernatants was determined photometrically at a wavelength of 570 nm. Higher optical density indicates more viable cells. Moreover, a possible change in cell morphology was assessed by microscopy on day 3 (HeLa, MDCK) and day 6 (HEp-2) after the addition of the substance. The OD values of the test samples for each approach were normalized to the OD values of the untreated controls, which was defined as 100% viability, and expressed as a percentage accordingly. Thus, it is possible to determine the mean inhibitory concentration (IC ₅₀ ) for samples from several parallels in the form of dose-response curves for the test samples to a concentration that did not show any deterioration in cell viability caused by the test substance and, therefore, was suitable for applications in studies of antiviral activity.

После исследований жизнеспособности исследовали противовирусную активность в отношении HRV14, FluA и RSV. Чувствительные к вирусам клетки инфицировали соответствующими вирусами в средней инфицирующей дозе (MOI) от 0,0004 до 0,0008 (HeLa инфицировали HRV14; MDCK инфицировали FluA; HEp-2 инфицировали RSV). Инфицированные вирусом клетки обрабатывали спустя 1 ч после инфицирования исследуемыми растворами в физиологических концентрациях веществ в полупроницаемом агарозном супернатанте. На 2 сутки (FluA), 3 сутки (HRV14) и 5 сутки (RSV) в соответствии с подходом исследования вирусные бляшки (бляшкообразующие единицы/мл; PFU/мл), образованные в слое клеток, подсчитывали с использованием считывающей системы AID EliSpot (Autoimmun Diagnostika GmbH, Штрасберг, Германия) и оценивали в виде процента ингибирования относительно количества бляшек, определенного как полное инфицирование вирусом в контрольном подходе, который не предусматривает добавление какого-либо активного ингредиента.After the viability studies, the antiviral activity against HRV14, FluA and RSV was investigated. Virus-sensitive cells were infected with the corresponding viruses at an average infectious dose (MOI) of 0.0004 to 0.0008 (HeLa was infected with HRV14; MDCK was infected with FluA; HEp-2 was infected with RSV). The cells infected with the virus were treated 1 h after infection with the test solutions at physiological concentrations of substances in a semipermeable agarose supernatant. On day 2 (FluA), day 3 (HRV14) and day 5 (RSV) according to the assay approach, the viral plaques (plaque-forming units / ml; PFU / ml) formed in the cell layer were counted using the EliSpot AID reading system (Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Germany) and was evaluated as percent inhibition relative to the number of plaques, defined as complete virus infection in a control approach that does not involve the addition of any active ingredient.

В дополнение к контролю с вирусом и отрицательному контролю противовирусный активный ингредиент виразола® рибавирин, который представляет собой противовирусное средство против РНКвирусов, использовали в качестве внутреннего лабораторного контроля для проверки процедуры исследования, описанной выше. Эффективность эталонных веществ подтверждали в тестовой системе. Все контроли подвергали воздействию всех условий культивирования для анализов противовирусной активности.In addition to the virus control and negative control, the antiviral active ingredient virazole® ribavirin, which is an anti-RNAvirus antiviral, was used as an internal laboratory control to validate the test procedure described above. The effectiveness of the reference substances was confirmed in a test system. All controls were exposed to all culture conditions for antiviral activity assays.

3) Результаты.3) Results.

Для исследования противовирусной активности использовали исследуемые растворы с концентрациями активных ингредиентов, соответствующими степени разведения таблетки доритрицина®, составляющей 1:400 или выше (см. таблицу). С этими концентрациями активных средств не было выявлено эффектов в отношении снижения жизнеспособности на используемых HeLa, MDCK и HEp2 клетках в исследовании жизнеспособности.To study the antiviral activity, the test solutions were used with concentrations of active ingredients corresponding to the dilution ratio of the dorithricin® tablet, equal to 1: 400 or higher (see table). With these active agent concentrations, no viability-reducing effects were observed on the HeLa, MDCK and HEp2 cells used in the viability study.

В результате комбинация активных ингредиентов доритрицина® в разведении 1:100 и 1:400, показывала сравнимый противовирусный эффект и значительно уменьшала количество бляшек РНК-вирусов HRV14, H1N1 и RSV на 97 и 68, 53 и 74%, соответственно. Этот эффект в отношении образования бляшек снижался с повышением степени разведения. Только при высоких степенях разведения эффект уже не выявлялся: для HRV14 от 1:3200, для RSV от 1:6400 и для H1N1 от 1:64000. Относительный ингибирующий эффект, зависящий от степени разведения доритрицина®, показан на фиг. 1.As a result, the combination of the active ingredients dorithricin® at a dilution of 1: 100 and 1: 400 showed a comparable antiviral effect and significantly reduced the number of RNA viruses HRV14, H1N1 and RSV plaques by 97 and 68, 53 and 74%, respectively. This effect on plaque formation decreased with increasing dilution. Only at high dilutions, the effect was no longer detected: for HRV14 from 1: 3200, for RSV from 1: 6400 and for H1N1 from 1: 64000. The relative inhibitory effect depending on the dilution of Dorithricin® is shown in FIG. one.

- 3 039000- 3 039000

Синергичный эффект 3 активных веществ доказывается такой же серией экспериментов с отдельными веществами, которые показывают лишь очень слабую противовирусную активность при разведении 1:100 (фиг. 2, 3, 4).The synergistic effect of the 3 active substances is proved by the same series of experiments with individual substances, which show only very weak antiviral activity at a dilution of 1: 100 (Fig. 2, 3, 4).

Рибавирин (RIBA), используемый для контроля, показывал уменьшение количества вирусных бляшек, составляющее 53% у HRV14 (RIBA 10 мкг/мл), 96% у FluA (RIBA 3 мкг/мл) и 97% у RSV (RIBA 1 мкг/мл).Ribavirin (RIBA) used as a control showed a 53% reduction in viral plaque in HRV14 (RIBA 10 μg / ml), 96% in FluA (RIBA 3 μg / ml) and 97% in RSV (RIBA 1 μg / ml) ).

Лежащий в основе механизм действия изучался в дополнительных экспериментах. Оценивали, основывается ли он на синергичном эффекте, и какой из трех компонентов оказывает главное воздействие на какие вирусы.The underlying mechanism of action has been studied in additional experiments. It was evaluated whether it is based on a synergistic effect, and which of the three components has the main effect on which viruses.

Концентрации в мкг/мл активных ингредиентов, используемых в исследовании противовирусной активности и относя_________щихся к составляющим доритрицина®__________Concentrations in μg / ml of active ingredients used in the study of antiviral activity and referring to _________ as constituents of dorithricin® __________

Концентрации активного средства [мкг/мл] Concentration of active agent [μg / ml] Степень разведения доритрицина® Dorithricin® dilution rate 1:400 1: 400 1:800 1: 800 1:1600 1: 1600 1:3200 1: 3200 1:6400 1: 6400 1:64000 1: 64000 Ингредиенты доритрицина® Dorithricin® Ingredients Тиротрицин Tyrothricin 1,25 1.25 0,62 0.62 0,31 0.31 0,16 0.16 0,08 0.08 0,008 0.008 Хлорид бензалкония Benzalkonium chloride 2,5 2.5 1,25 1.25 0,62 0.62 0,31 0.31 0,16 0.16 0,016 0.016 Бензокаин Benzocaine 3,8 3.8 1,9 1.9 0,95 0.95 0,48 0.48 0,24 0.24 0,024 0.024

4) Вывод.4) Conclusion.

В дополнение к известным антибактериальным и обезболивающим эффектам фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также характеризуется ярко выраженными, дозозависимыми и синергичными противовирусными свойствами в отношении вирусов RSV, HRV14 и H1N1.In addition to the known antibacterial and analgesic effects, the pharmaceutical composition according to the present invention is also characterized by pronounced, dose-dependent and synergistic antiviral properties against RSV, HRV14 and H1N1 viruses.

5) Литература.5) Literature.

(1) Posfay-Barbe КМ. Infections in pediatrics: old and new diseases. Swiss MedWkly 2012;142:wl3654.(1) Posfay-Barbe KM. Infections in pediatrics: old and new diseases. Swiss MedWkly 2012; 142: wl3654.

(2) Bisno AL, Gerber MA, Gwaltney JM, Jr., Kaplan EL, Schwartz RH. Practice guidelines for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis. Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2002 Jul 15;35(2): 113-25.(2) Bisno AL, Gerber MA, Gwaltney JM, Jr., Kaplan EL, Schwartz RH. Practice guidelines for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis. Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2002 Jul 15; 35 (2): 113-25.

(3) Shulman ST, Bisno AL, Clegg HW, Gerber MA, Kaplan EL, Lee G, et al. Clinical practice guideline for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: 2012 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2012 Nov 15;55(10): 1279-82.(3) Shulman ST, Bisno AL, Clegg HW, Gerber MA, Kaplan EL, Lee G, et al. Clinical practice guideline for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: 2012 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2012 Nov 15; 55 (10): 1279-82.

(4) Scholten T, Pautler M, Kober G. Dorithricin bei akuter Pharyngitis. Deutsche Apothekerzeitung 2005; 145(1):93-4.(4) Scholten T, Pautler M, Kober G. Dorithricin bei akuter Pharyngitis. Deutsche Apothekerzeitung 2005; 145 (1): 93-4.

Claims

1. The use of a pharmaceutical composition containing tyrothricin, benzalkonium chloride and benzocaine in antiviral therapy or in the treatment of a viral infection.

2. The use of a pharmaceutical composition according to claim 1 for the treatment of a viral infection, the viral infection being caused by rhinoviruses, influenza viruses and / or pneumoviruses.

3. The use of a pharmaceutical composition according to claim 1 or 2 for the treatment of a viral infection, the viral infection being caused by HRV14 (human rhinovirus type 14), RSV (human respiratory syncytial virus) and / or H1N1 (influenza A H1N1 virus).

4. The use of a pharmaceutical composition according to one or more of the preceding claims, wherein the pharmaceutical composition contains about 0.5 mg of tyrothricin, about 1.0 mg of benzalkonium chloride, about 1.5 mg of benzocaine in a single dose and one or more pharmaceutically acceptable excipients , for the treatment of a viral infection.

5. The use of a pharmaceutical composition according to one or more of the preceding claims, wherein the pharmaceutical composition is a sore throat tablet.

6. The use of a pharmaceutical composition according to one or more of the preceding claims for the treatment of a viral infection, said composition being administered in a daily dose of about 2-4 mg tyrothricin, 4-8 mg benzalkonium chloride and 6-12 mg benzocaine.