EA035954B1 - Композиции гетеро- и гомоферментативных видов молочнокислых бактерий для консервирования силоса с двойным эффектом - Google Patents
Композиции гетеро- и гомоферментативных видов молочнокислых бактерий для консервирования силоса с двойным эффектом Download PDFInfo
- Publication number
- EA035954B1 EA035954B1 EA201790311A EA201790311A EA035954B1 EA 035954 B1 EA035954 B1 EA 035954B1 EA 201790311 A EA201790311 A EA 201790311A EA 201790311 A EA201790311 A EA 201790311A EA 035954 B1 EA035954 B1 EA 035954B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- silage
- composition
- days
- lactic acid
- lactobacillus
- Prior art date
Links
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 160
- 239000004460 silage Substances 0.000 title claims abstract description 118
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 80
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 190
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 title 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000186679 Lactobacillus buchneri Species 0.000 claims description 58
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 54
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 claims description 14
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 claims description 13
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims description 12
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 claims description 6
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 claims description 5
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 claims description 5
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 claims description 5
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 7
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 22
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 63
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 62
- 241000894007 species Species 0.000 description 53
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 46
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 46
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 45
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 29
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 28
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 19
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 16
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 16
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 16
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 15
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 13
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 8
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 7
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 7
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 4
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 4
- 244000200882 Setaria barbata Species 0.000 description 4
- 235000001561 Setaria barbata Nutrition 0.000 description 4
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 4
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 4
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 235000013526 red clover Nutrition 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 3
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 description 3
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 3
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- JSPANIZMKMFECH-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate dihydrate Chemical compound O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O JSPANIZMKMFECH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;hydrate Chemical compound O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGIDLTISMCAULB-UHFFFAOYSA-N 3-methylvaleric acid Chemical compound CCC(C)CC(O)=O IGIDLTISMCAULB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 2
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-VRPWFDPXSA-N D-fructopyranose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001495410 Enterococcus sp. Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 2
- 241000178948 Lactococcus sp. Species 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N ammonia nh3 Chemical compound N.N XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 2
- 235000019784 crude fat Nutrition 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 229960002737 fructose Drugs 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 235000021485 packed food Nutrition 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 2
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N (2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-phosphonooxyhexanoic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(O)=O)OP(O)(O)=O NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- OBMBUODDCOAJQP-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-4-phenylquinoline Chemical compound C=12C=CC=CC2=NC(Cl)=CC=1C1=CC=CC=C1 OBMBUODDCOAJQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 description 1
- 241000193452 Clostridium tyrobutyricum Species 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000962469 Homo sapiens Transcription factor MafF Proteins 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 241001134659 Lactobacillus curvatus Species 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 1
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 1
- 241000186612 Lactobacillus sakei Species 0.000 description 1
- 241001627205 Leuconostoc sp. Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000202223 Oenococcus Species 0.000 description 1
- 241000746983 Phleum pratense Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 102100039187 Transcription factor MafF Human genes 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229930094280 aldehydo-D-xylose Natural products 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 238000004380 ashing Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-KLVWXMOXSA-N beta-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013066 combination product Substances 0.000 description 1
- 229940127555 combination product Drugs 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012676 herbal extract Substances 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004462 maize silage Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
- A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
- A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
- A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/157—Lactis
Abstract
Настоящее изобретение относится к силосному инокулянту, состоящему, по существу, из а) по меньшей мере одного вида или штамма облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий и б) по меньшей мере одного вида или штамма гомоферментативных бактерий, который (1) не уменьшает рост (а) и (2) быстро снижает pH без продуцирования избыточного количества молочной кислоты. Кроме того, изобретение относится к способу получения ферментированного кормового продукта, где указанный способ включает инокулирование растительного материала силосным инокулянтом по настоящему изобретению. Неожиданно было обнаружено, что этот силосный инокулянт является эффективным, даже если силос инкубировали только в течение периода вплоть до 2 или вплоть до 4 суток.
Description
Область изобретения
В настоящем изобретении предложены улучшенные композиции бактериальных инокулянтов, полезные, например, для получения и консервирования силоса. В определенных воплощениях композиции включают облигатный гетероферментативный вид (или его штамм), такой как Lactobacillus sp., и гомоферментативный вид (или его штамм), такой как Lactococcus sp. или Enterococcus sp. (или их штамм). Эти композиции полезны для получения ферментированного кормового продукта, такого как силос. Таким образом, в изобретении также предложены способы, включающие инокулирование растительного материала композициями бактериальных инокулянтов, раскрытых в данном описании. В некоторых воплощениях инокулированный материал является подходящим для применения после короткого периода инкубирования, такого как период инкубирования в 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 суток.
Предшествующий уровень техники
Силос представляет собой ферментированный растительный продукт, который можно использовать для кормления жвачных животных. Силос можно изготавливать из различных растительных материалов, которые хранят в анаэробных условиях для активирования анаэробной ферментации. Бактериальные инокулянты можно добавлять для активирования процесса ферментирования и/или улучшения силосного продукта. Силос консервируют путем установления анаэробных условий и путем быстрого снижения рН, ассоциированного с продуцированием органической кислоты природными бактериями или инокулированными молочнокислыми бактериями. Низкий рН ингибирует рост многих штаммов, вызывающих порчу, которые в противном случае могут приводить к потере большого количества питательных веществ.
Когда силос подвергается действию воздуха, например, когда силосный бункер, силосохранилище, кучу или рулон открывают с целью доступа к силосу для его использования, аэробные условия могут приводить к росту любых присутствующих в силосе аэробных штаммов, вызывающих порчу. Рост аэробных вызывающих порчу штаммов приводит к повышению температуры и большой потере питательных веществ.
Таким образом, как порча в начале процесса ферментирования, так и аэробная порча при отборе корма представляют собой источники значительных экономических потерь для фермеров.
Первое поколение бактериальных силосных инокулянтов включало облигатные гомоферментативные (например L. acidophilius, L. salivarius) и факультативные гетероферментативные (например L. plantarum) бактериальные виды, предназначенные для быстрого снижения рН для предупреждения роста вызывающих порчу штаммов, естественным образом присутствующих в растительном материале, таких как грамотрицательные Enterobacteraceae (например Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella) или грамположительные Clostridia (С. tyrobutyricum, С. perfringens, С. botulinum, С. sporogenes, С. butyricum). Предотвращение роста вызывающих порчу штаммов путем быстрого снижения рН уменьшало потери питательных веществ и часто в некоторой степени улучшало аэробную стабильность (Jatkauskas et al. (2013), Jatkauskas и Vrotniakiene (2013)).
Второе поколение бактериальных силосных инокулянтов фокусировалось на L. buchneri, облигатном гетероферментативном виде, который, как было обнаружено, является превосходным в плане предупреждения аэробной порчи аэробными вызывающими порчу видами при выемке корма, когда силосный бункер/куча подвергаются воздействию воздуха. Однако недостаток использования L. buchneri в качестве бактериального силосного инокулянта состоит в том, что он имеет более продолжительную лаг-фазу по сравнению с другими видами и на ранней стадии ферментирования продуцирование им уксусной кислоты и молочной кислоты не приводит к быстрому снижению рН по сравнению с облигатными гомоферментативными или факультативными гетероферментативными видами.
На фиг. 1 из Jatkauskas и Vrotniakiene (2013) показано, что только L. buchneri (P0) является лучшим по сравнению с другими протестированными продуктами в отношении аэробной стабильности, то есть времени, которое требуется для того, чтобы вызывающие порчу аэробные штаммы нагрели силосный бункер при повторном подвергании воздействию воздуха. Второй наилучший продукт для поддержания низкой температуры в течение многих часов представлял собой облигатный гетероферментативный/факультативный гетероферментативный/гомоферментативный комбинированный продукт, содержащий L. buchneri, L. plantarum, E. faecium, (P1), и следующими наилучшими продуктами были исключительно факультативные гетероферментативные/гомоферментативные продукты, содержащие L. plantarum, E. faecium, L. lactis с бензоатом натрия (Р2а) или без него (Р2Ь), факультативный гетероферментативный/гомоферментативный продукт, содержащий L. plantarum, E. faecium, L. lactis, (P3), и факультативный гетероферментативный продукт, содержащий два штамма L. plantarum, (P4). (Силос, который не был инокулирован, имел самую низкую аэробную стабильность.)
Таким образом, сохраняется потребность в улучшенных композициях бактериальных силосных инокулянтов.
Краткое изложение сущности изобретения
Предложены улучшенные композиции бактериальных инокулянтов, полезных, например, для получения и консервирования силоса. Также предложены способы, включающие инокулирование растительного материала композициями бактериальных инокулянтов, раскрытыми в данном описании.
В некоторых воплощениях предложены силосные инокулянты, состоящие, по существу, из (а) по
- 1 035954 меньшей мере одного вида облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий (или их штамма) и (б) по меньшей мере одного вида гомоферментативных бактерий (или их штамма), который (1) не уменьшает рост по меньшей мере одного вида или штамма облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий (а) и (2) быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты. В некоторых воплощениях по меньшей мере один вид облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий (или их штамм) представляет собой Leuconostoc sp. или Lactobacillus sp., выбранный из группы, состоящей из Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus reuteri (или их штамма). В некоторых воплощениях вид облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий (или их штамм) представляет собой Lactobacillus buchneri, депонированный как DSM 22501. В некоторых воплощениях по меньшей мере один вид или штамм гомоферментативных бактерий представляет собой Enterococcus, например Enterococcus faecium. В некоторых воплощениях по меньшей мере один вид или штамм гомоферментативных бактерий представляет собой Lactococcus, такой как Lactococcus lactis, такой как штамм, депонированный как DSM 11037. В конкретных воплощениях силосные инокулянты состоят, по существу, из Lactobacillus buchneri и Lactococcus.
В некоторых воплощениях предложены способы получения ферментированного кормового продукта, включающие инокулирование растительного материала силосным инокулянтом, как раскрыто в данном описании. В некоторых воплощениях растительный материал инкубируют с силосным инокулянтом в течение периода вплоть до 2 суток, или вплоть до 4 суток, или вплоть до 7 суток, или вплоть до 8 суток, или вплоть до 14 суток, или вплоть до 28 суток, или по меньшей мере 90 суток.
Подробное описание изобретения
Как отмечено выше, в настоящем изобретении предложены улучшенные композиции бактериальных инокулянтов, например для получения и консервирования силоса. В определенных воплощениях композиции содержат облигатный гетероферментативный вид (или его штамм), такой как Lactobacillus sp., и гомоферментативный вид (или его штамм), такой как Lactococcus sp. или Enterococcus sp. Композиции являются полезными в получении ферментированного кормового продукта, такого как силос. Таким образом, также предложены способы, включающие инокулирование растительного материала композициями бактериальных инокулянтов, раскрытых в данном описании. В некоторых воплощениях инокулированный материал является подходящим для использования после короткого периода инкубирования.
Определения
Применение терминов в единственном числе в контексте описания данного изобретения (особенно в контексте следующей далее формулы изобретения) следует понимать как охватывающее и единственное и множественное число, если здесь не указано иное или это очевидно не противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий и включающий следует понимать как неограничивающие термины (то есть как обозначающие включающий, но не ограниченный этим,) если не указано иное. Перечисление диапазонов величин здесь предназначено служить только как сокращенный способ ссылки индивидуально на каждую отдельную величину, попадающую в этот диапазон, если в описании не указано иное, и каждая отдельная величина включена в данное описание как если бы она была отдельно указана в описании. Все стадии способов, раскрытых в описании, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если здесь не указано иное или это очевидно не противоречит контексту. Применение любого или всех примеров или иллюстративного языка (например, такой как), предложенных в описании, предназначено только для того, чтобы лучше осветить данное изобретение и не накладывает ограничения на объем данного изобретения, если не заявлено иное. Никакое выражение в данном описании не следует понимать как указывающее на какой-либо незаявленный элемент как существенный для осуществления изобретения.
Молочнокислые бактерии включают такие рода как Lactococcus spp., Enterococcus spp., Oenococcus spp., Pediococcus spp., Streptococcus spp., Leuconostoc spp и Lactobacillus spp. Их можно разделить на три подгруппы: облигатные гетероферментативные, факультативные гетероферментативные и гомоферментативные. Молочнокислые бактерии рода Lactobacillus могут быль либо факультативными гетероферментативными, либо гомоферментативными в зависимости от вида (Vandamme et al., 1996).
Облигатные гетероферментативные молочнокислые бактерии ферментируют гексозы в молочную кислоту, уксусную кислоту, этанол и углекислый газ посредством фосфоглюконатного пути. Примерами видов облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий являются Leuconostoc и Lactobacillus, такие как Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri.
Факультативные гетероферментативные молочнокислые бактерии дополнительно могут ферментировать пентозы в молочную кислоту, уксусную кислоту, муравьиную кислоту и этанол, когда количество глюкозы ограничено. Примерами факультативных гетероферментативных молочнокислых бактерий являются Pediococcus spp., Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei.
Гомоферментативные молочнокислые бактерии определяют как бактерии, которые разлагают главным образом гексозы посредством пути Эмбдена-Мейергофа в молочную кислоту. Примерами гомоферментативных молочнокислых бактерий являются Lactococcus spp., Enterococcus spp. и Lactobacillus, такие как Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus salivarius.
- 2 035954
Многие продукты на рынке комбинируют факультативные гетероферментативные/гомоферментативные виды с высокой продукцией молочной кислоты с L. buchneri. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что эта комбинация бактерий не позволяет достичь наилучшей возможной аэробной стабильности (то есть не способствуют поддержанию температуры окружающей среды при выемке корма). Не желая быть связанными теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что эта комбинация бактерий уменьшает рост L. buchneri и/или продуцирует большие количества молочной кислоты, которую могут потреблять аэробные вызывающие порчу штаммы, вследствие чего начинается порча силоса под воздействием воздуха. В соответствии с некоторыми воплощениями инокулянты, раскрытые в данном описании, решают эту проблему путем комбинирования облигатных гетероферментативных видов (например L. buchneri) с видами бактерий, которые быстро снижают рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты (например Lactococcus и Enterococcus). Такие выбранные гомоферментативные виды не препятствуют положительному действию облигатных гетероферментативных видов или по меньшей мере только в значительно меньшей степени препятствуют ему.
Таким образом, в некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен силосный инокулянт, состоящий, по существу, по меньшей мере из одного вида облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий и по меньшей мере одного вида гомоферментативных бактерий, который предпочтительно не уменьшает рост этого вида облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий и который предпочтительно быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты.
Под выражением состоящий, по существу, из понимают, что силосный инокулянт содержит только определенные бактерии в качестве активных компонентов и не содержит другого(других) активного(активных) компонента(ов), такого(таких) как какие-либо другие бактерии, ферменты, органические кислоты, бензоат натрия, нитрат натрия или гексамин. Инокулянт, как раскрыто в данном описании, который состоит, по существу, из определенных бактерий, не включает Lactobacillus plantarum.
Под выражением по меньшей мере один понимают, что композиция инокулянта может содержать один, два, три, четыре, пять или даже больше разных видов облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий и один, два, три, четыре, пять или даже больше разных видов гомоферментативных бактерий.
В определенных воплощениях вид или штамм гомоферментативных бактерий не уменьшает рост вида или штамма облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий. Это свойство можно протестировать путем выращивания штаммов гомоферментативных бактерий и штаммов облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий в течение ночи в среде Ман-Рогоза-Шарп (MRS) при 37°С, делая посев штрихом как видов или штаммов гомоферментативных бактерий, так и видов или штаммов облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий, которые подлежат тестированию, на одну и ту же чашку с агаром MRS и, по существу, в одно и то же время, а затем инкубируя чашку с агаром в анаэробных условиях при 37°С в течение ночи. Если рост облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий ингибирован по меньшей мере на 5 мм, значит тестируемый гомоферментативный вид или штамм не обладает этим желаемым свойством. Если силосный инокулянт включает более чем один вид или штамм облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий или более чем один вид или штамм гомоферментативных бактерий, могут быть протестированы все релевантные комбинации.
Путем такого тестирования было обнаружено, что низин-продуцирующие штаммы гомоферментативного вида Lactobacillus lactis, такие как L. lactis NCIMB 30117 и L. lactis АТСС 11454, ингибировали L. buchneri DSM 22501, в то время как штаммы L. lactis DSM 11037 и Е. faecium DSM 16656, которые не продуцируют низин, не ингибируют L. buchneri DSM 22501.
Не будучи связанными теорией, эти результаты свидетельствуют о том, что только низинпродуцирующие гомоферментативные штаммы вида Lactobacillus lactis ингибируют облигатный гетероферментативный вид или штамм и что бактериоцин-продуцирующие гомоферментативные виды или штаммы, которые не продуцируют низин, не ингибируют облигатный гетероферментативный вид или штамм. Соответственно требование о том, чтобы по меньшей мере один вид или штамм гомоферментативных бактерий не уменьшал рост по меньшей мере одного вида облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий, может быть выполнено, если этот вид или штамм гомоферментативных бактерий не продуцирует низин. Таким образом, в определенных воплощениях гомоферментативный вид или штамм представляет собой бактериоцин-продуцирующий гомоферментативный вид или штамм, который не продуцирует низин, хотя прямым скринингом, как подчеркнуто выше, можно идентифицировать другие штаммы, которые проявляют это свойство. В определенных воплощениях изобретение относится к силосному инокулянту, состоящему, по существу, по меньшей мере из одного вида облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий (или их штамма) и по меньшей мере одного вида гомоферментативных бактерий (или их штамма), который (1) не продуцирует низин и (2) быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты.
В определенных воплощениях вид или штамм гомоферментативных бактерий быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты. Как отмечено выше, быстрое снижение
- 3 035954 рН может ингибировать порчу на ранних стадиях производства силоса путем ингибирования роста вызывающих порчу микроорганизмов, таких как Clostridia, Enterobacteriaceae, дрожжи и плесени. Вызывающие порчу микроорганизмы могут приводить к потере питательных веществ, росту патогенных микроорганизмов и посторонним привкусам, которые делают силос менее приятным для животных, таких как жвачные животные, для которых он служит кормом.
При использовании в данном описании вид или штамм, который быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты определен как вид или штамм, который продуцирует не более чем 3 мг/мл молочной кислоты после 24-часового инокулирования на водяной бане при 30°С пробирки, содержащей 150000 КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл штамма в 10 мл стерильной силосной среды, полученной посредством смешивания 5 г/л дрожжевого экстракта (Oxoid L21), 5 г/л нейтрализованного соевого пептона (Oxoid LP0044C), 0,8 г/л растворимого крахмала (Merck 1252), 0,08 г/л дигидрата сульфата марганца (II) (Sigma M-1114), 0,037 г/л янтарной кислоты (assay lab), 0,069 г/л моногидрата лимонной кислоты и 0,14 L-яблочной кислоты (Merck 244) в 900 мл воды Milli Q до растворения, подводя рН до 6,3, разливания в миникультуральные флаконы и автоклавирования при 121°С в течение 15 мин, и затем добавления 100 мл стерильного профильтрованного сахарного раствора, содержащего 56 г/л D(-)-фрукmозы (Merck 4007), 32 г/л моногидрата D(+)-глюкозы (Merck 8342), 20 г/л О(+)-ксилозы (Merck 8689), 20 г/л L+)-арабинозы (Aldrich A9, 190-6) и 32 г/л сахарозы (Merck 7651).
Согласно одному воплощению силосный инокулянт включает по меньшей мере один вид или штамм облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий, который представляет собой вид Leuconostoc или Lactobacillus, выбранный из группы, состоящей из Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus reuteri. В определенном воплощении вид или штамм облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий представляет собой Lactobacillus buchneri. Примерами Lactobacillus buchneri, которые рассматриваются как полезные в настоящем изобретении, являются L. buchneri KKP 907, L. buchneri DSM 22963, L. buchneri NCIMB 40788, L. buchneri NCIMB 30139, L. buchneri DSM 16774, L. Buchneri DSM 22963, L. buchneri DSM 12856. В определенных воплощениях Lactobacillus buchneri представляет собой штамм Lactobacillus buchneri, депонированный как DSM 22501.
В некоторых воплощениях силосный инокулянт включает по меньшей мере один вид или штамм бактерий, который быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты, который представляет собой Enterococcus, такой как Enterococcus faecium. Примеры Enterococci, которые рассматриваются как полезные в настоящем изобретении, представляют собой Е. faecium NCIMB 10415, Е. faecium CNCM I-3236, Е.faecium BIO 34 и Е. faecium DSM 16573.
В других воплощениях силосный инокулянт включает по меньшей мере один бактериальный вид или штамм, который быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты, который представляет собой Lactococcus, такой как Lactococcus lactis. В определенных воплощениях Lactococcus lactis представляет собой штамм, депонированный как DSM 11037.
Таким образом, в некоторых воплощениях силосный инокулянт состоит, по существу, из штамма Lactobacillus buchneri и штамма Enterococcus, который не уменьшает рост вида (или штамма) облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий и который быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты. В других воплощениях силосный инокулянт состоит, по существу, из штамма Lactobacillus buchneri и штамма Lactococcus, который не уменьшает рост вида (или штамма) облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий и который быстро снижает рН без продуцирования избыточного количества молочной кислоты.
В настоящем изобретении также предложены способы получения ферментированного кормового продукта, такого как силос, включающие инокулирование растительного материала бактериальным силосным инокулянтом, как он раскрыт в данном описании. Неожиданно было обнаружено, что силосные инокулянты, раскрытые в данном описании, способны обеспечивать очень быстрый эффект. То есть материал, инокулированный бактериальным силосным инокулянтом, как описано, может быть подходящим для использования после короткого периода инкубирования, такого как период инкубирования продолжительностью только 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 суток. Таким образом, в некоторых воплощениях способ включает инкубирование растительного материала с силосным инокулянтом, как раскрыто в данном описании, в течение периода вплоть до 2 суток или вплоть до 4 суток перед воздействием на силос воздуха, как, например, при открывании силосного бункера. Однако растительный материал также можно инкубировать в течение более длительного периода, как, например, вплоть до 7 суток, вплоть до 8 суток, вплоть до 14 суток или вплоть до 28 суток или даже дольше, такого как период по меньшей мере 60 суток или по меньшей мере 90 суток, где последнее представляет собой общепринятый период тестирования действия силосных инокулянтов.
Как отмечено выше, в определенных воплощениях бактериальные силосные инокулянты, раскрытые в описании, могут достигать быстрого снижения рН в начале процесса силосования, в то же время поддерживая высокую аэробную стабильность при выемке силоса. То есть бактериальные силосные инокулянты, раскрытые в описании, могут осуществлять быстрое начальное ферментирование, которое уменьшает потерю сухого вещества (DM) и порчу на ранней стадии ферментирования, а также могут
- 4 035954 обеспечивать аэробную стабильность, которая является такой же или сравнимой с таковой при инокулировании только облигатным гетероферментативным штаммом, таким как L. buchneri. Таким образом, описанные здесь инокулянты обеспечивают достижение лучшей аэробной стабильности, чем продукты, содержащие только гомоферментативные или/и факультативные гетероферментативные штаммы, хотя их аэробная стабильность может быть не такой хорошей как таковая, достигаемая с помощью только облигатного гетероферментативного L. buchneri.
Депонированные штаммы
Штамм Lactobacillus plantarum был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7б, D-38124 Braunschweig) с номером доступа DSM 16568, с датой депонирования 13 июля 2004 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Депонирование было проведено в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Штамм Lactobacillus buchneri был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7б, D-38124 Braunschweig) с номером доступа DSM 22501, с датой депонирования 22 апреля 2009 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Депонирование было проведено в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Штамм Enterococcus faecium был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7б, D-38124 Braunschweig) с номером доступа DSM 22502, с датой депонирования 22 апреля 2009 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Депонирование было проведено в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Для описанных выше депонированных микроорганизмов применимы следующие дополнительные указания:
в отношении соответствующих патентных ведомств соответствующих указанных государств заявители требуют, чтобы образец депонированных микроорганизмов, определенных выше, был доступен только для эксперта, назначенного по запросу вплоть до даты, на которую будет выдан патент, или даты, когда заявка будет отклонена, или отозвана, или признана отозванной.
Штамм Lactobacillus lactis DSM 11037 был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7б, D-38124 Braunschweig) 26 июня 1996 года Chr. Hansen A/S, Denmark, и ссылка на него имеется в выданном патенте ЕР 928333.
Воплощения настоящего изобретения описаны ниже посредством неограничивающих примеров.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1а.
Снижение на протяжении 48 ч рН стерильной силосной среды, инокулированной композицией 1 (Δ), композицией 2 (□), композицией 3 (ο), композицией 4 (◊) и композицией 5 (Χ). Стартовое инокулирование составляло 150000 КОЕ/мл, поддерживали температуру 30°С, n равно 1.
Фиг. 1б.
Концентрация молочной кислоты в мг/мл на протяжении 48 ч в стерильной силосной среде, инокулированной композицией 1 (Δ), композицией 2 (□), композицией 3 (ο), композицией 4 (◊) и композицией 5 (Χ). Стартовое инокулирование составляло 150000 КОЕ/мл, поддерживали температуру 30°С, n равно 1.
Фиг. 1в.
Концентрация уксусной кислоты в мг/мл на протяжении 48 ч в стерильной силосной среде, инокулированной композицией 1 (Δ), композицией 2 (□), композицией 3 (ο), композицией 4 (◊) и композицией 5 (Χ). Стартовое инокулирование составляло 150000 КОЕ/мл, поддерживали температуру 30°С, n равно 1.
Фиг. 2.
Снижение на протяжении 72 ч рН стерильной силосной среды, инокулированной композицией 2 (□), композицией 4 (◊) и композицией 6 \ Стартовое инокулирование составляло 150000 КОЕ/мл, поддерживали температуру 30°С.
Фиг. 3.
Соотношение уксусная кислота/молочная кислота у кукурузы, собранной в 2011 году в Дании (мини-силосохранилище 1) и либо не инокулированной (белые столбики), либо инокулированной композицией 4 (серые столбики) или композицией 7 (черные столбики). Вакуумированные пакеты минисилосохранилища хранили при 25°С до вскрытия через 7, 28, 61 и 88 суток.
Фиг. 4.
Аэробная стабильность кукурузы, собранной в 2012 году в Дании (мини-силосохранилище 2) и либо не инокулированной (1—1), либо инокулированной композицией 4 (◊) или композицией 5 (Χ). На оси х приведено время (ч) и на оси y приведена температура (°С). Пунктирная черная линия показывает температуру окружающей среды, тогда как пунктирная серая линия показывает температуру окружающей среды +3°С.
- 5 035954
Фиг. 5.
рН мини-силосохранилища с кукурузным силосом урожая 2012 года (мини-силосохранилище 2) после семи суток аэробной нагрузки, включая SEM от четырех наблюдений. Либо без инокуляции (белый столбик), либо инокулированный композицией 4 (серый столбик) или композицией 5 (заполненный точками столбик).
Фиг. 6.
Аэробная стабильность кукурузы, собранной в 2013 году в Дании (мини-силосохранилище 3) и либо не инокулированной ( 1—1 \ либо инокулированной композицией 2 (□) или композицией 4 (◊). На оси х приведено время (ч) и на оси у приведена температура (°С). Пунктирная черная линия показывает температуру окружающей среды, тогда как пунктирная серая линия показывает температуру окружающей среды +3°С.
Фиг. 7.
Аэробная стабильность корма из красной кукурузы урожая 2013 года (мини-силосохранилище 4) и либо не инокулированного 1 1 \ либо инокулированного композицией 2 (□), композицией 4 (◊) и композицией 7 (△). На оси x приведено время (ч) и на оси у приведена температура (°С). Пунктирная черная линия показывает температуру окружающей среды. Пунктирная серая линия показывает температуру окружающей среды +3°С.
Фиг. 8.
Аэробная стабильность корма из смеси красный клевер:тимофеевка луговая: овсяница урожая 2013 года (мини-силосохранилище 5) и либо не инокулированного —'), либо инокулированного композицией 2 (□), композицией 4 (◊), композицией 7 . На оси x приведено время (ч) и на оси у приведена температура (°С). Пунктирная черная линия показывает температуру окружающей среды, тогда как пунктирная серая линия показывает температуру окружающей среды +3°С.
Фиг. 9а.
Аэробная стабильность (часы) кукурузного силоса (мини-силосохранилище 6а) после 7 и 14 суток ферментирования с последующими 7 сутками аэробной нагрузки (7+7 и 14+7 соответственно), и либо не инокулированного (белый), либо инокулированного композицией 4 (серый) или композицией 7 (черный).
Фиг. 9б.
Аэробная стабильность (часы) кукурузного силоса (мини-силосохранилище 6б) после 2, 4 и 8 суток ферментирования с последующими 7 сутками аэробной нагрузки (2+7, 4+7 и 8+7 соответственно), и либо не инокулированного (белый), или инокулированного композицией 4 (серый).
Фиг. 10.
Количество дрожжей (КОЕ/г) в кукурузном силосе (мини-силосохранилище 6а) после 2, 7 и 14 суток ферментирования, и либо не инокулированного (белый), либо инокулированного композицией 4 (серый) или композицией 7 (черный).
Фиг. 11.
Изменение рН в кукурузном силосе (мини-силосохранилище 6а) после 2, 7 и 14 суток ферментирования, либо не инокулированном (белый), либо инокулированном композицией 4 (серый) или композицией 7 (черный).
Фиг. 12.
Суммарная продукция газа на протяжении 162 ч в кукурузе урожая 2014 года (минисилосохранилище 7а), и либо не инокулированной (серые квадраты), или инокулированной композицией 4 (черные круги). На оси х представлено время (ч) и на оси у представлен объем в мл/г свежего корма.
Фиг. 13.
Разница в продуцировании газа между контролем и кукурузой, инокулированной композицией 4 (мини-силосохранилище 7б). На оси x представлено время (ч), и на оси у представлена разница в объеме в мл/г свежего корма.
Фиг. 14.
Потеря массы в процентах упакованной под вакуумом кукурузы урожая 2014 года через 162 ч (мини-силосохранилище 7б) и либо не инокулированной (белый), либо инокулированной композицией 4 (серый) или композицией 7 (черный).
Фиг. 15.
Разница в образовании газа в упакованной под вакуумом кукурузе урожая 2014 года после 6 суток ферментирования. Упакованные под вакуумом пакеты с кормом либо без инокуляции (левая сторона фотографии), либо инокулированным композицией 4 (150000 КОЕ/г кукурузы, правая сторона фотографии).
Примеры
Пример 1. Стерильные периодические культуры in vitro.
Отдельные штаммы гомоферментативных и гетероферментативных молочнокислых бактерий и комбинированные продукты тестировали в двух независимых экспериментальных постановках с исполь
- 6 035954 зованием стерильной силосной среды, содержащей несколько различных источников углеводов для моделирования углеводного состава травы. рН и содержание органических кислот измеряли с течением времени. Среда содержала 5 г/л дрожжевого экстракта (Oxoid L21), 5 г/л нейтрализованного соевого пептона (Oxoid LP0044C), 0,8 г/л растворимого крахмала (Merck 1252), 0,08 г/л дигидрата сульфата марганца (II) (Sigma M-1114), 0,037 г/л янтарной кислоты (assay lab), 0,069 г/л моногидрата лимонной кислоты и 0,14 L-яблочной кислоты (Merck 244), которые смешивали в 900 мл воды Milli Q до растворения. Подводили рН до 6,3, разливали в миникультуральные флаконы и автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. После автоклавирования добавляли 100 мл стерильного профильтрованного сахарного раствора, содержащего 56 г/л D(-)-фруктозы (Merck 4007), 32 г/л D(+)-глюкозы моногидрата (Merck 8342), 20 г/л D(+)-ксилозы (Merck 8689), 20 г/л L(+)-арабинозы (Aldrich A9, 190-6) и 32 г/л сахарозы (Merck 7651), для получения конечной силосной среды. В обоих экспериментах, 1 и 2, применяли стерильную силосную среду и инокулировали несколькими различными композициями инокулянтов, представленными в табл. 1.
Таблица 1. Композиции штаммов, используемых в двух исследованиях периодической культуры in vitro
| № ком- позиции | Эксперимент | Штаммы бактерий | Процентное соотношение | КОЕ/мл |
| 1 | 1 | L. plantarum DSM 16568 | 100 | 150000 |
| 2 | 1, 2 | L. buchneri DSM 22501 | 100 | 150000 |
| 3 | 1 | L. lactisOSM 11037 | 100 | 150000 |
| 4 | 1, 2 | L. buchneriVSM 22501 L. lactisOSMnWl | 50 50 | 150000 |
| 5 | 1 | L. buchneri DSM 22501 L. lactisVSMAWyi L plantarum DSM 16568 | 70 20 10 | 150000 |
| 6 | 2 | L. buchneri DSM 22501 L. plantarum DSM 16568 | 50 50 | 150000 |
Эксперимент 1.
По 10 мл силосной среды, инокулированной различными композициями инокулянтов из табл. 1, распределяли в каждую из одиннадцати стерильных пробирок и выдерживали на водяной бане при 30°С. Через 0, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 14, 24 и 48 ч отбирали образцы на анализ летучей органической кислоты (VFA) и молочной кислоты и рН. рН контролировали с использованием ручного рН-метра, в то время как летучие органические кислоты анализировали путем ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) (Dionex).
Эксперимент 2.
Эксперимент 2 был подобен эксперименту 1 в отношении стерильной силосной среды, уровня инокуляции и температуры. В качестве инокулянтов использовали композиции 2, 4 и 6. Использовали автоматический рН-метр и уксусную кислоту, молочную кислоту и муравьиную кислоту измеряли посредством ВЭЖХ (Dionex) через 72 ч.
Результаты.
Результаты экспериментов 1 и 2, демонстрирующие эффекты различных композиций инокулянтов в отношении рН и содержания органических кислот, представлены на фиг. 1а, б, в и фиг. 2, а также в табл. 2.
На фиг. 1а показано изменение рН с течением времени в эксперименте 1. Композиция 2 снижала рН очень медленно. Композиция 1 и композиция 3 снижали рН значительно быстрее, и через 14 ч рН был ниже 5,0, в то время как композиция 2 все еще имела рН выше 6,0. Композиция 4 снижала рН так же быстро, как композиция 3. Композиция 5 давала кривую рН, очень похожую на кривую для композиции 1.
На фиг. 1б показана концентрация молочной кислоты с течением времени в эксперименте 1. Через 24 ч композиция 1 продуцировала значительно больше молочной кислоты по сравнению с композицией 2, композицией 3 или композицией 4. Через 48 ч концентрация молочной кислоты в случае композиции 1 составила более чем 8 мг/мл против 4 мг/мл или ниже с композицией 2, композицией 3 или композицией 4. Композиция 5 давала концентрацию молочной кислоты, очень близкую к таковой для композиции 1.
На фиг. 1в показана концентрация уксусной кислоты с течением времени в эксперименте 1. Через 48 ч композиция 2 имела концентрацию уксусной кислоты более 2 мг/мл, в то время как композиция 1 и композиция 3 продуцировали менее чем 0,5 мг/мл уксусной кислоты. Композиция 4 продуцировала 1 мг/мл уксусной кислоты через 48 ч, в то время как композиция 5 имела результатом концентрацию менее чем 0,5 мг/мл.
На фиг. 2 показано изменение рН с течением времени в эксперименте 2. Снова композиция 2 снижала рН очень медленно. Композиция 4 снижала рН значительно быстрее, и через 15 ч рН был ниже 4,5, в то время как композиция 6 все еще имела рН выше 6,0. Композиция 6 приводила к немного более медленному падению рН по сравнению с композицией 4. Однако снижение рН продолжалось быстро, и рН был ниже 4,0 уже через 18 ч. Через 72 ч рН композиции 2 и композиции 4 достигал 3,6 и 3,7 соответст
- 7 035954 венно, в то время как рН композиции 6 становился ниже 3,2.
Таблица 2. Продуцирование органических кислот инокулированной стерильной силосной средой через 72 ч (эксперимент 2)
| № Композиции | Бактриальные штаммы | % | Муравьиная кислота (мг/мл) | Уксусная кислота (мг/мл) | Молочная кислота (мг/мл) |
| 2 | L. buchneri DSM 22501 | 100 | 0,012 | 2,895 | 4,077 |
| 4 | L. buchneri DSM 22501 L. lactis DSM 11037 | 50 50 | 0,447 | 1,760 | 3,488 |
| 6 | L. buchneri DSM 22501 L. plantarum DSM 16568 | 50 50 | 0,014 | 0,554 | 10,777 |
Как видно из табл. 2, продуцирование уксусной кислоты было сильно снижено у композиции 6, которая содержит L. buchneri DSM 22501 и L. plantarum DSM 16568, в отличие от композиции 4, которая содержит L. buchneri DSM 22501 и L. lactis DSM 11037. Композиция 6 также демонстрировала высокую концентрацию молочной кислоты через 72 ч. Композиция 4 не только имела значительно более высокую концентрацию уксусной кислоты по сравнению с композицией 6, но также она имела высокую концентрацию муравьиной кислоты.
Пример 2. Аэробная стабильность в мини-силосохранилищах.
Мини-силосохранилища 1,2 и 3 - урожай кукурузы 2011, 2012 и 2013 годов, Дания.
Эксперименты с пятью различными мини-силосохранилищами были проведены для тестирования различных композиций разных силосных инокулянтов. Три эксперимента были проведены в Дании с кукурузой, собранной на трех различных фермах в 2011 году (мини-силосохранилище 1), 2012 году (мини-силосохранилище 2) и 2013 году (мини-силосохранилище 3), и два эксперимента были проведены в Литве в 2013 году с использованием кукурузы и газонной смеси красный клевер:тимофеевка луговая:овсяница (60:30:10) (мини-силосохранилища 4 и 5). Обзор использованных инокулянтов и дозы внесения представлены в табл. 3.
Таблица 3. Композиции штаммов, использованных в исследованиях мини-силосохранилищ
| № Композиции | № мини- силосохранилища | Корм | Бактриальные штаммы | Процентное со- держание | КОЕ/г корма |
| Без добавок | 1, 2, 3, 4, 6, 7а, 76 5 | Кукуруза Трава/Клевер | 0 | ||
| 2 | 3,4 5 | Кукуруза Трава/клевер | L. buchneri DSM 22501 | 100 | 150000 |
| 4 | К 2, 3, 4, 6, 7а, 76 5 | Кукуруза Трава/клевер | L. buchneri DSM 22501 L. lactis | 50 50 | 150000 |
| 5 | 2 | Кукуруза | L. buchneri DSM 22501 L. lactis DSM 11037 L. plantarum DSM 16568 | 70 20 10 | 150000 |
| 7 | 1,4 5,6 | Кукуруза Трава/клевер | L. buchneri DSM 22501 E. faecium DSM 22502 L. plantarum DSM 16568 | 50 30 20 | 150000 |
Для мини-силосохранилища 1 кукурузу собирали в Юго-Западной Ютландии. Время транспортировки в лабораторию составило 4 ч. Затем кукурузу хранили в течение ночи на открытом воздухе, после чего ее замораживали при -20°С. Ко времени инокулирования кукурузу размораживали в течение 1-2 ч и затем хранили в холодильнике при 4-5°С. Инокулянты суспендировали в водопроводной воде и помещали во флаконы с разбрызгивателем. Целевая дозировка для каждой обработки составила 150000 КОЕ/г кукурузы, и количество, необходимое для достижения целевой дозировки инокулюма, рассчитывали на основании фактической активности композиций. 1000 г кукурузы отвешивали в пластиковый пакет понемногу за раз так, чтобы инокулянт можно было гомогенно разбрызгать на кукурузу. Затем пакет встряхивали для того, чтобы обеспечить равномерное распределение инокулюма в пакете. Затем 1000 г иноку
- 8 035954 лированной кукурузы распределяли в пять пакетов из алюминиевой фольги (alubag) по 200 г в каждый для каждого момента времени (7, 28, 61 и 88 суток). Упакованные под вакуумом пакеты из алюминиевой фольги хранили при 25°С.
Пять пакетов из алюминиевой фольги на обработку открывали в различные моменты времени. Затем образцы исследовали на содержание низкомолекулярных органических кислот.
Для мини-силосохранилища 2 свежий урожай кукурузы собирали с фермы в центральной Зеландии, Дания, и транспортировали прямо в лабораторию. Пять различных обработок, перечисленных в табл. 3, а также контрольную группу тестировали в постановке мини-силосохранилища. Инокулянты суспендировали в водопроводной воде и помещали во флаконы с разбрызгивателем. Целевая дозировка для каждой обработки составила 150000 КОЕ/г кукурузы, и количество, необходимое для достижения целевой дозировки инокулюма, рассчитывали на основании фактической активности продуктов. 1000 г кукурузы отвешивали в пакет понемногу за раз, так чтобы инокулянт можно было гомогенно разбрызгать на кукурузу. После встряхивания пакета для того, чтобы обеспечить равномерное распределение инокулянта, пакет упаковывали под вакуумом. Четыре пакета для каждой обработки приготавливали и хранили при 25°С для дальнейшего анализа через три месяца. Через три месяца проводили исследование аэробной стабильности с использованием силоса, который хранили в вакуумированных пакетах. Силос расфасовывали в контейнеры (пластиковые бутылки, открытые сверху с отверстием в дне) с сенсором температуры, расположенным в середине, помещенным в лунку в полистироле, покрытые большой пластиковой тарелкой, и хранили при комнатной температуре. Температуру каждого индивидуального образца после экспозиции на воздухе контролировали в течение периода 7 суток.
Для мини-силосохранилища 3 свежий урожай кукурузы собирали с фермы в северо-восточной Зеландии. Процедура была такой же, как описано для мини-силосохранилища 2, за исключением того, что исследование аэробной стабильности проводили только через две недели.
Результаты мини-силосохранилищ 1, 2 и 3.
Соотношения уксусной кислоты и молочной кислоты в силосе мини-силосохранилища 1 в различные моменты времени показаны на фиг. 3. Соотношение уксусной кислоты и молочной кислоты выше в неинокулированном контроле по сравнению с композицией 7 через семь суток и через 28 суток. Однако через 88 суток композиция 7 имеет высокое соотношение уксусной кислоты к молочной кислоте по сравнению с контролем. Композиция 4 имеет высокое соотношение уксусной кислоты к молочной кислоте с седьмых суток, которое повышается с течением времени. Средний рН всех образцов был ниже 4,0 во все моменты времени.
Результаты мини-силосохранилища 2 показаны на фиг. 4. Можно видеть, что температура неинокулированного контрольного силоса была более чем на 3°С выше температуры окружающей среды через 78 ч, в то время как композиция 5 давала повышение более чем на 3°С выше температуры окружающей среды через 96 ч. Композиция 4 поддерживала кукурузный силос в стабильном состоянии в течение всех 162 ч измерения. Как показано на фиг. 5, через 162 ч рН в контроле составлял в среднем 6,74, в то время как силос, обработанный композицией 5, имел средний рН 5,67, а силос, обработанный композицией 4, имел рН в среднем 4,05.
Для мини-силосохранилища 3 хранившийся в вакуумированом пакете силос, открытый после хранения, который не был инокулирован, был нестабилен через 93 ч, в то время как силос, инокулированный композицией 2, был стабилен в течение всего периода в 160 ч, а силос, инокулированный композицией 4, был стабилен в течение 129 ч (фиг. 6).
Мини-силосохранилища 4 и 5 - кукуруза и трава/клевер урожая 2013 года, Литва.
Для мини-силосохранилища 4 кукурузу (Zea mays L.) собирали в фазе восковой спелости созревания зерна. Концентрация сухого вещества (DM) кукурузы составила 38,85%, и концентрация водорастворимых углеводов составила 2,54%. Кукурузу разрубали с помощью силосоуборочного комбайна в условиях фермы на куски примерно 2 см длиной.
Для мини-силосохранилища 5 смесь трава-клевер, содержащую травосмесь из 60% красного клевера, 30% тимофеевки луговой и 10% овсяницы, собирали и высушивали до содержания сухого вещества 32,8%. Эту кормовую смесь называют смесью трава/клевер. Содержание водорастворимых углеводов составило 20,3 г/кг DM (2,03% свежего корма). Смесь трава/клевер разрубали с помощью силосоуборочного комбайна в условиях фермы на куски 2-3 см длиной.
Для мини-силосохранилища 4 и мини-силосохранилища 5 пять репрезентативных образцов (более 500 г каждый) брали для анализа питательной ценности обоих кормов и обработки. Корма транспортировали в полиэтиленовом пакете в лабораторию. Лабораторные эксперименты начинали в пределах 0,5 ч от подготовки культур. 500 г репрезентативного образца подвядшей и нарубленной травы брали на анализы питательной ценности, буферной емкости, нитратного и микробного состава. В испытаниях кукурузного корма и корма трава/клевер использовали одни и те же силосные инокулянты и процедуру.
Силосный инокулянт суспендировали в дистиллированной воде непосредственно перед его применением, применяя дозу такую, как описано в табл. 3. Для каждой обработки проводили пять повторов. Дозировки продуктов рассчитывали в соответствии с дозами, указанными в табл. 3, и реальной концентрацией бактерий в продуктах. При разведении продуктов использовали воду без хлора. Такой же объем
- 9 035954 дистиллированной воды использовали вместо суспензии в контрольной обработке (для самопроизвольной ферментации). После инокулирования в 3 л стеклянные банки помещали 1,80-1,84 кг свежей культуры, что эквивалентно 1 кг DM на объем 5 л. Банки закрывали крышками через 15 мин после заполнения. Газ, образующийся во время ферментации, во время эксперимента выпускали через воздушный клапан. Через 90 суток хранения в стеклянных банках при постоянной температуре 20°С проводили химический и микробный анализы.
Для измерения аэробной стабильности силосов контролировали температуру внутри силоса в течение 10 суток. Для этого термопару вставляли в срединную точку силосных образцов, которые помещали в открытые полистирольные коробки. В верхней части и в дне коробок имелось отверстие диаметром 2 см для обеспечения доступа воздуха и выхода СО2. В центр силосной массы помещали датчик через отверстие в крышке коробки, которое открывало доступ воздуха к силосу. На эти силосы не оказывали никакого воздействия на протяжении периода записи температур. Коробки держали при постоянной комнатной температуре (примерно 20°С). Температуру окружающей среды и температуру каждого силоса записывали каждые 6 ч с помощью регистрирующего устройства. Температуру окружающей среды в помещении измеряли с использованием пустой контрольной коробки. Аэробную стабильность силосов изучали путем расчета разницы между температурой силоса и температуры окружающей среды в помещении. Аэробная порча была отмечена на сутки (или часы), когда начиналось устойчивое повышение температуры более чем на 3°С выше температуры окружающей среды.
Таблица 4. Аналитические методы
| Параметры качества | Объект | Короткое описание или сущность метода, ссылка |
| Сухое вещество (DM) | Трава* Силос** | Высушивали в печи при 67°С в течение 24 ч, оставляли на ночь до достижения комнатной влажности, пропускали через 1 мм сито и далее высушивали при 105°С до постоянной массы |
| Неочищенный белок | * | Kjeldahl-AOAC 984.13. Используют 10,5 г катализатора. С Block Digestion и Tecator Kjeltec system 1002 Distiling Unit |
| Неочищенный жир | Экстракция с помощью Soxtec System c использованием петролейного эфира 40-600C. Остаток неочищенного жира определяли гравиметрически после высушивания | |
| Неочищенные волокна | >5 * | С Fibercap (Foss Tecator), используя обработку серной кислотой и гидроксидом Na |
| Кислотнодетергентная клетчатка (ADF) | * | ANKOM А200 технология фильтровальных пакетиков (ТФП) |
| Нейтральнодетергентная клетчатка (NDF) | >!< | А200 технология фильтровальных пакетиков (ТФП) |
| Водорастворимые углеводы (WSC) | С использованием анализа антроновой реакции (MAFF, 1986) из экстрактов травы или силоса, полученных при вымачивании свежей травы или силоса в воде | |
| Сырая зола | ** | АОАС Method 942.05. Са - АОАС 968.08 сухое озоление, метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии, Р - спектрофотометрический молибдованадофос-фатный (Molybdovanadophosphate) метод |
| Буферная емкость | >!< | Согласно Playne и McDonald (1966), выражали как миллиэквивалент (mequiv) щелочи, требуемой для изменения pH с 4 до 6 на 100 г сухого вещества |
| Нитраты | >!< | Травяные экстракты, полученные при вымачивании свежей травы в воде, анализировали с использованием селективного электрода для нитрат-иона |
| Молочная кислота | ** | В водном экстракте из свежего силоса в соответствии со стандартными способами (Naumann и Bassler, 1997) |
| Уксусная кислота | s-г | |
| Масляная кислота | >< | |
| Аммиачный N | Дистилляция - АОАС 941.04 | |
| pH через 3, 90 и 97 | sj< * | Экстракты силоса, полученного при вымачивании |
- 10 035954
| суток pH перед силосованием | свежей травы в воде, анализировали с использованием ThermoOrion Posi-pHlo SympHony Electrode и Thermo Orion 410 meter | |
| Потеря массы (потери DM) | ** | Оценивали путем измерения разницы массы силоса до и после силосования |
| Дрожжи и плесени | $ | LSTISO 21527-2:2008 |
| Молочнокислые бактерии | >!< | ISO 15214:1998 |
| Клостридии*** | ISO 7937:2004 |
* Пять образцов травы для анализа были собраны непосредственно после опрыскивания и во время заполнения силосов * *Образцы силоса для каждого силоса в каждом варианте (включая контроль) были взяты через 90 суток хранения * * *Если было более чем 1500 КОЕ/г клостридий в свежем корме, проводили анализ силоса на клостридии
Концентрации VFA (летучих жирных кислот), молочной кислоты и низших спиртов определяли путем газо-жидкостной хроматографии водных силосных экстрактов, полученных путем вымачивания 30 г свежего силоса в 150 мл деионизированной воды в течение 16 ч при 40°С в запаянном контейнере с последующим предварительным фильтрованием через 3 мкМ фильтровальную бумагу. Деионизированную воду (3 мл) внутреннего стандартного раствора (0,5 г 3-метил-н-валериановой кислоты в 1000 мл 0,15 моль 1-1 щавелевой кислоты) добавляли к 1 мл фильтрата, полученного как описано выше, и раствор фильтровали через 0,45 мкМ полиэфирсульфоновую мембрану в пробирку для хроматографического образца для анализа. В газо-жидкостном хроматографе GC -2010 SHIMADZU использовали капиллярную колонку с широким просветом (Stabilwax®-DA 30 м, 0,53 мм, ID, 0,5 мкм) в соответствии с официально принятыми методами газовой хроматографии и биохимического анализатора. Аммонийный азот (NH3-N) определяли путем дистилляции - АОАС 941.04.
Результаты мини-силосохранилищ 4 и 5.
Результаты для кукурузного мини-силосохранилища 4 показаны в табл. 5. Все три инокулированных кукурузных силоса имели существенно (Р>0,05) более низкий рН по сравнению с контролем через 3 суток анаэробного ферментирования. Композиция 4 и композиция 7 имели существенно меньшую потерю DM (%/кг), существенно меньшую (Р<0,05) фракцию N-NH3 (%/кг общего N) и существенно (Р<0,05) более высокую концентрацию молочной кислоты (%/кг DM) по сравнению с композицией 2 и контролем. Инокулирование кукурузы композицией 2 и композицией 4 приводило к существенно (Р<0,05) более высоким концентрациям уксусной кислоты (%/кг DM) и пропионовой кислоты (%/кг DM) по сравнению с композицией 7 и контролем. Все инокулированные кукурузные силосы имели более низкое содержание дрожжей и плесени (log КОЕ/г) по сравнению с контролем.
Как можно увидеть на фиг. 7, аэробная экспозиция в течение 10 суток приводила к повышению температуры более чем на 3°С выше температуры окружающей среды через 66 ч для неинокулированного контрольного силоса, в то время как композиция 7 приводила к подъему более чем на 3°С выше температуры окружающей среды через 178 ч, что представляло собой существенно (Р<0,05) более длительный промежуток времени по сравнению с контролем и существенно (Р<0,05) более короткий промежуток времени по сравнению с композициями 2 и 4. Через 240 ч аэробной экспозиции рН в контроле составил 8,29, в то время как композиция 7 имела рН 5,66, что было существенно (Р<0,05) ниже по сравнению с контролем.
- 11 035954
Таблица 5. Действие различных композиций на переменные ферментирования и микробный состав засилосованной кукурузы
| Контроль | Композиция 2 (процентное содержание) | Композиция 4 (процентное содержание) | Композиция 7 (процентное содержание) | |
| L. buchneri DSM 22501 | 100 | 50 | 50 | |
| Л. /acZ/.sDSM 11037 | 50 | |||
| E./aecnzwDSM 22502 | 30 | |||
| L. plantarum DSM 16568 | 20 | |||
| Измерение после 3 суток анаэробного ферментирования | ||||
| pH через 3 суток | 4,36 | 4,18° | 4,17° | 4,14° |
| Измерение после 90 суток анаэробного ферментирования | ||||
| pH через 90 суток | 4,04а | 3,91° | 3,92° | 3,90° |
| DM, %/кг desiledj | 36,69а | 37,52° | 37,62° | 37,77° |
| Потеря DM, %/кг | 6,74а | 4,42° | 3,90в | 3,43в |
| Фракция N-NH3, %/кг общего N | 5,18а | 4,38б | 3,92Б | 3,83 е |
| Молочная кислота, %/кг DM | 2,78а | 3,01а | 3,47Б | 4,06° |
| Уксусная кислота, %/кг DM | 1,11в | 2,83а | 2,68а | 1,72б |
| Масляная кислота, %/кг DM | 0,034а | 0,008° | 0,006° | 0,004° |
| Пропионовая кислота, %/кг DM | 0,0126 | 0,028а | 0,026 | 0,0126 |
| Спирты, %/кг DM | 1,00а | 0,62° | 0,50Б | 0,49в |
| Дрожжи (log КОЕ/г) | 3,93а | 1,04° | 1,26Б | 1,56е |
| Плесени (log КОЕ/г) | 3,00а | 1,0° | 1,16° | 1,25в |
| Измерение после 10 суток аэробной экспозиции | ||||
| pH после теста аэробной стабильности | 8,29а | 4,44б | 4,396 | 5,66е |
| Аэробная стабильность, часы | 66,06 | 240,0а | 240,0а | 177,6е |
Разные буквы в строке показывают статистически значимое различие (Р<0,05) Не было вытекания в силосах при открывании *Сухое вещество с поправкой на летучие компоненты
Результаты по мини-силосохранилищу 5 с использованием смеси трава/клевер показаны в табл. 6. Все три инокулированных силоса трава/клевер имели существенно (Р>0,05) более низкий рН по сравнению с контролем через 3 суток анаэробного ферментирования. Композиция 4 и композиция 7 имели существенно (Р<0,05) меньшую потерю DM (%/кг). В то время как весь инокулированный силос трава/клевер имел существенно (Р<0,05) меньшую фракцию N-NH3 (%/кг общего N) по сравнению с контролем и существенно (Р<0,05) более высокую концентрацию молочной кислоты (%/кг DM), чем в контроле, инокулирование кукурузы композицией 4 приводило к существенно (Р<0,05) более высокой концентрации уксусной кислоты (%/кг DM) по сравнению с композицией 7 и контролем. Все инокулированные силосы трава/клевер имели более низкое количество дрожжей и плесени (log КОЕ/г) по сравнению с контролем.
- 12 035954
Как можно видеть на фиг. 8, аэробная экспозиция в течение 10 суток приводила к повышению температуры неинокулированного контрольного силоса более чем на 3°С выше температуры окружающей среды через 91 ч, в то время как композиция 7 приводила к подъему температуры более чем на 3°С выше температуры окружающей среды через 169 ч. Композиция 4 приводила к подъему температуры более чем на 3°С через 191 ч, и композиция 2 давала такое же повышение через 214 ч. Через 240 ч аэробной экспозиции рН в контроле составил 7,93, в то время как рН композиции 7 составил 5,41, рН композиции 4 составил 5,35, и рН композиции 2 был самым низким и составил 4,93.
Таблица 6. Действие различных композиций на переменные ферментирования и микробный состав силоса красный клевер: тимофеевка луговая: овсяница
| Обработка | Контроль | Композиция 2 (процентное содержание) | Композиция 4 (процентное содержание) | Композиция 7 (процентное содержание) |
| L. buchneri DSM 22501 | 100 | 50 | 50 | |
| L. lactis DSM 11037 | 50 | |||
| E faecium DSM 22502 | 30 | |||
| L. plantarum DSM 16568 | 20 | |||
| Измерение после 3 суток анаэробного ферментирования | ||||
| pH через 3 суток | 4,75 3 | 4,39° | 4,40° | 4,34 в |
| Измерение после 90 суток анаэробного ферментирования | ||||
| pH через 90 суток | 4,38а | 4,20° | 4,17° | 4,12 Б |
| DM, %/кг desiledf | 30,49 а | 31,19° | 31,45 0 | 31,64Б |
| Потеря DM, %/кг | 7,90 а | 6,20° | 4,94 Б | 4,23 Б |
| Фракция Ν-ΝΉ3, %/кг общего N | 5,38 а | 4,05 6 | 3,79 6 | 3,57 в |
| Молочная кислота, %/кг DM | 4,55 а | 6,28 в | 5,34 6 | 5,89 в |
| Уксусная кислота, %/кг DM | 2,42 а | 2,38 6 | 3,59 6 | 2,01 Б |
| Масляная кислота, %/кг DM | 0,24 а | 0,01 6 | 0,02 6 | 0,01 6 |
| Пропионовая | 0,02 а | 0,02 Б | 0,03 а | 0,02а |
| кислота, %/кг DM | ||||
| Спирты, %/кг DM | 0,94 а | 0,71 в | 0,82° | 0,69 в |
| Дрожжи (log КОЕ/г) | 3,21 а | 1,00° | 1,16° | 1,65 в |
| Плесени (log КОЕ/г) | 3,03 а | 1,00° | 1,32 в | 1,34 в |
| Измерение после 10 суток аэробной экспозиции | ||||
| pH после теста аэробной стабильности | 7,93 а | 4,93 6 | 5,35 Б | 5,41 Б |
| Аэробная стабильность, часы | 91,20 а | 213,606 | 190,8 Б | 169,20 Б |
Разные буквы в строке показывают статистически значимое различие (Р<0,05)
Не было вытекания в силосах при открывании *Сухое вещество с поправкой на летучие компоненты
Мини-силосохранилище 6а - урожай кукурузы 2014, США.
Для мини-силосохранилища 6а кукурузу собирали в Делаваре, США, при примерно 35%-ном содержании DM в целом растении. Композиции 4 и 7 растворяли в деионизированной воде и наносили на пять 20 кг пачек свеженарубленного кукурузного корма на обработку для получения верных повторов. Корм из каждой пачки силосовали в 7,6 л силосных ведрах и закрывали пластиковыми крышками с кольцевыми уплотняющими прокладками.
Всего было приготовлено 5 образцов в сутки 0 (свежий материал) и 5 ведер на обработку для каждого интервала ферментирования (сутки 2, 7 и 14). Ведра были заполнены примерно 6 кг свежего корма для достижения конечной плотности упаковки 0,208-0,266 кг DM/л. Ведра хранили при 22±1°С и открывали через 2, 7 и 14 суток силосования.
Для определения аэробной стабильности 2 кг репрезентативного образца из каждого силоса помещали в чистое ведро (без упаковывания) и регистрирующее устройство помещали в геометрический центр кормовой массы. Регистрирующие устройства были установлены так, чтобы они записывали температуру каждые 10 минут и брали среднее за час. Ведра сверху закрывали марлей для предупреждения избыточного высушивания и оставляли инкубироваться в помещении при 22±1°С. Температуру окружающей среды в помещении измеряли и записывали одновременно. Аэробную стабильность определяли
- 13 035954 как промежуток времени до того, как температура силосной массы повышалась на 3°С выше стабильной базовой линии после экспозиции на воздухе.
Результаты мини-силосохранилища 6а.
Результаты мини-силосохранилища 6а показаны на фиг. 10 и 11 и в табл. 7а.
Таблица 7а. Действие различных композиций на рН и содержание дрожжей при открывании после различных периодов ферментирования и на аэробную стабильность на протяжении периода в 7 суток аэробной нагрузки
| Сутки 0 | Контроль | Композиция 4 | Композиция 7 |
| pH | 5,75 | 5,73 | 5,80 |
| При открывании после 2 суток ферментирования | |||
| pH | 3,92 | 3,91 | 3,90 |
| Дрожжи, КОЕ/г | 524807 | 467735 | 891251 |
| При открывании после 7 суток ферментирования | |||
| pH | 3,62 | 3,62 | 3,64 |
| Дрожжи, КОЕ/г | 144543 | 186208 | 151356 |
| После 7 суток ферментирования и 7 суток аэробной нагрузки | |||
| Аэробная стабильность, ч | 41 | 44 | 41 |
| При открывании после 14 суток ферментирования | |||
| pH | 3,63 | 3,61 | 3,63 |
| Дрожжи, КОЕ/г | 6918 | 1445 | 1819 |
| После14 суток ферментирования и 7 суток аэробной нарузки | |||
| Аэробная стабильность, ч | 57 | 66 | 63 |
Мини-силосохранилище 6б-урожай кукурузы 2014 года, Литва.
Для мини-силосохранилища 6б кукурузу собирали в Литве при содержании DM в целом растении примерно 35%. Композицию 4 растворяли в деионизированной воде и применяли 150000 КОЕ/г корма на пачку свеженарубленного кукурузного корма для получения истинных повторов. Корм из этой пачки так же, как и пачки необработанного контроля, силосовали в 3 л стеклянных банках, запечатанных кольцевыми уплотняющими прокладками.
Всего было приготовлено 5 образцов в сутки 0 (свежий материал) и 5 стеклянных банок на обработку для каждого интервала ферментирования (сутки 2, 4 и 8). В банки помещали примерно 1 кг свежего корма для достижения конечной плотности упаковки 0,208-0,266 кг DM/л. Стеклянные банки хранили при (20±1°С) и открывали после 2, 4 и 8 суток анаэробной ферментирования.
Аэробная стабильность.
Аэробную стабильность определяли путем контролирования повышения температуры в силосах, хранящихся в емкостях-термосах из ПВХ (поливинлхлорид) (1300 мл) при температуре окружающей среды 20±1°С (комнатная температура, зафиксированная во время эксперимента, фиг. 9а).
Аэробную порчу отмечали по часам до тех пор, пока температура силоса не достигала 3°С выше температуры окружающей среды (табл. 7б и фиг. 9б).
Результаты мини-силосохранилища 6б.
Таблица 7б. Влияние композиции 4 на аэробную стабильность
| Контроль | Композиция 4 | |
| 2 суток анаэробного ферментирования и 7 суток аэробной нагрузки | ||
| Аэробная стабильность, ч | 30 | 48 |
| 4 суток анаэробного ферментирования и 7 суток аэробной нагрузки | ||
| Аэробная стабильность, ч | 40 | 50 |
| 8 суток анаэробного ферментирования и 7 суток аэробной нагрузки | ||
| Аэробная стабильность, ч | 68 | 97 |
Увеличение времени анаэробного ферментирования увеличивало стабильность как контрольного силоса, так и кукурузного силоса, инокулированного композицией 4. Следует отметить, однако, что инокулирование композицией 4 позволяло сохранить кукурузный силос стабильным на 18 ч дольше, чем в контроле после только двух суток анаэробного ферментирования, и что различие между контролем и композицией 4 продолжает быть существенным (10 и 29 ч соответственно) при ферментировании в течение 4 суток или 8 суток до аэробной нагрузки.
Мини-силосохранилища 7а, 7б и 7в - урожай кукурузы 2014 года, Дания.
Для мини-силосохранилища 7а свежий урожай кукурузы (28,6% DM) собирали с фермы в Северной Зеландии, Дания, и транспортировали прямо в лабораторию. Эту кукурузу использовали для проверки действия композиции 4 относительно контроля с использованием 1,8 л стеклянных банок с автоматиче
- 14 035954 скими клапанами для отведения газа (www.ANKOM.com). В стеклянные банки помещали в среднем по 746 г свежесобранной кукурузы, которую либо инокулировали 150000 КОЕ/г композиции 4 (n=5), либо инокулировали таким же количеством водопроводной воды (n=5) в качестве контроля.
Банки хранили при комнатной температуре приблизительно при 21°С. Образование газа измеряли с 10-минутным интервалом автоматически, и газ выпускали также автоматически при достижении 1,5 фунта/кв. дюйм (10,3 кПа). Аккумулированный газ конвертировали в мл/г свежего корма (объем=Р (давление в фунт/кв. дюйм) х С (объем банки)/среднее атмосферное давление, записанное от 0 до 162 ч х весь образец корма (масса свежего образца)). Образование газа измеряли в течение 162 ч (фиг. 12), и разница между контролем и кукурузой, обработанной композицией 4, показана на фиг. 13.
Для мини-силосохранилища 7б один кг такой же кукурузы, как в мини-силосохранилище 7а, использовали в те же сутки, упаковывали с вакуумированием путем удаления 90% воздуха и запечатывали. Использовали пять пакетов на обработку либо без инокулирования (белый столбик), либо с композицией 4 (150000 КОЕ/г кукурузы, серый столбик) или композицией 7 (150000 КОЕ/г кукурузы, столбик, заполненный точками). Через 162 ч пакеты открывали, газ выпускали и измеряли потерю массы (фиг. 14).
Для мини-силосохранилища в такую же кукурузу, как в мини-силосохранилище 7а, использовали после того, как ее хранили в холодильнике при -18°С. После этого корм размораживали и образцы по 1 кг упаковывали с вакуумированием путем удаления 90% воздуха и запечатывали. Упакованные под вакуумом пакеты корма либо без инокулянта, либо с композицией 4 (150000 КОЕ/г кукурузы) оставляли на открытом воздухе при температуре окружающей среды для моделирования реальных условий вне помещения и для того, чтобы исследовать образование газа после 6 суток ферментирования (фиг. 15).
Результаты мини-силосохранилищ 7а, 7б и 7в.
Очень раннее (первые 48 ч) образование газа в силосе связано с эпифитными аэробными микроорганизмами из семейства Enterobacteriaceae (например Е. coli, Salmonella, Klebsiella и так далее). Образование газа имеет отношение к потере силосом питательных веществ. Инокулирование кукурузы композицией 4 имело результатом меньшее образование газа по сравнению с неинокулированной кукурузой (фиг. 12). Разница в образовании газа увеличивалась от 10 до 116 ч, где она была максимальной с разницей в 0,17 мл газа на 1 г кукурузы (фиг. 13).
В упакованной под вакуумом кукурузе потерю питательных веществ можно оценивать путем взвешивания пакетов. Композиция 4 давала меньшую потерю массы по сравнению с контролем, а также по сравнению с композицией 7 (фиг. 14).
В реальных условиях многие фермеры знают по опыту, что их силосные бункеры имеют тенденцию раздуваться после запечатывания. Как показано на фиг. 15, различие в выработке газа в отсутствии инокуляции (левая сторона) и при инокулировании композицией 4 (правая сторона) можно легко определить визуально.
Обсуждение
Известно, что уксусная кислота, продуцируемая L. buchneri, является важной кислотой для борьбы с ростом аэробных штаммов, вызывающих порчу, на выходе, где силос открыт для контакта с кислородом. Однако рост L. buchneri имеет длительную лаг-фазу, и снижение рН с применением L. buchneri происходит очень медленно. Для решения этой задачи L. buchneri комбинировали с видом бактерий с высокой продукцией молочной кислоты, таким как L. plantarum. Однако комбинация штаммов с высокой продукцией молочной кислоты может препятствовать эффективному действию L. buchneri на аэробную стабильность. Это явление показано в мини-силосохранилище 2, где композиция 5, содержащая 70% L. buchneri DSM 22501, 10% L. plantarum DSM 16568, 20% L. lactis DSM 11037, приводила к образованию значительно менее стабильного силоса по сравнению с композицией 4, которая содержала только штамм с низкой продукцией молочной кислоты (50% L. lactis DSM 11037), комбинированный с L. buchneri DSM 22501 (50%), фиг. 4.
Композиция 4 приводила к быстрому и высокому конечному уровню рН по сравнению с другими комбинациями с видом с высокой продукцией молочной кислоты. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы изобретения полагают, что в композиции 4 L. buchneri DSM 22501 все еще был способен продолжать рост и/или быть метаболически активным, как видно по высокому уровню уксусной кислоты (фиг. 1в). Высокое соотношение уксусная кислота/молочная кислота композиции 4 также видно в минисилосохранилище 1 (фиг. 3). Дополнительно высокое соотношение уксусная кислота/молочная кислота на ранней стадии анаэробного ферментирования очевидно оказывало положительное действие на аэробную стабильность в мини-силосохранилище 3, которое открывали только после короткого периода (2 недели) анаэробного ферментирования.
Эти результаты также показывают, что потеря DM, важный показатель качества корма, была так же низока для композиции 4, как для продуктов, содержащих штаммы с высокой продукцией молочной кислоты (смотри мини-силос 4 и мини-силос 5), в то время как композиция 4 также давала высокий уровень продукции уксусной кислоты. Высокий уровень уксусной кислоты давал очень стабильный силос (фиг. 4, 5, 6 и 7), который во всех трех случаях с мини-силосохранилищами (пример 2) был выше по сравнению с другими композициями с L. buchneri DSM 22501 (композиции 5 и 7), где был включен L.
- 15 035954 plantarum DSM 16568, штамм с высокой продукцией молочной кислоты.
Как показано на фиг. 9а, композиция 4 увеличивала аэробную стабильность по сравнению с необработанным контролем после короткого периода ферментирования в 7 суток или 14 суток. Кроме того и очень неожиданно, композиция 4 также продемонстрировала лучшую аэробную стабильность, чем положительный контроль (композиция 7) в оба периода времени.
Как показано на фиг. 9б, композиция 4 увеличивала аэробную стабильность по сравнению с необработанным контролем после 8 суток ферментации с последующими 7 сутками аэробной нагрузки. Кроме того и очень неожиданно, композиция 4 увеличивала аэробную стабильность по сравнению с необработанным контролем даже после очень короткого периода ферментирования продолжительностью только 2 суток или 4 суток.
Как показано на фиг. 10, наблюдали общеизвестную картину уменьшения количества дрожжей как функции от увеличенного времени ферментирования. Однако неожиданно уменьшение количества дрожжей было более значительным при использовании композиции 4 как по сравнению с отрицательным, так и по сравнению с положительным контролем (композиция 7), как после 2, так и после 14 суток ферментирования.
Неожиданно, как показано на фиг. 11, уровень рН при использовании композиции 4 был снижен до такого же уровня, как в положительном контроле (композиция 7), несмотря на отсутствие Lactobacillus plantarum в композиции 4.
Следовательно, эти эксперименты показывают, что силосный инокулянт, состоящий, по существу, из факультативного гетероферментативного L. buchneri и только гомоферментативных штаммов, позволяет достичь хорошего качества корма с улучшенной аэробной стабильностью даже для силосов, открытых после лишь короткого периода анаэробного ферментирования.
Список литературы.
Jatkauskas, J. and V. Vrotniakiene, “Evaluation of fermentation parameters, microbiological composition and aerobic stability of grass and whole crop maize silages treated with microbial inoculants Zemdirbyste-Agriculture., 2013, Vol. 100, No. 2, pp. 143-150
Jatkauskas, J. et al. (2013), The effects of three silage inoculants on aerobic stability in grass, clover-grass, lucerne and maize silages, Agricultural and Food Science, 2013, 22, 137144
Vandamme, B. et al, Polyphasic Taxonomy, a Consensus Approach to Bacterial
Systematics, Microbiological Reviews, 1996, Vo31. 60, No. 2, 407-438
Claims (19)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Силосный инокулянт, который в качестве активных компонентов содержит только:(а) облигатные гетероферментативные молочнокислые бактерии по меньшей мере одного из видов Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus reuteri;(б) гомоферментативные молочнокислые бактерии по меньшей мере одного из видов Enterococcus и Lactococcus, которые не уменьшают рост (а) при их совместном инкубировании с растительным материалом и которые при этом быстро снижают рН, продуцируя молочную кислоту в количестве, при котором бактерии (а) остаются метаболически активными.
- 2. Силосный инокулянт по п.1, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus buchneri и Enterococcus и/или Lactococcus.
- 3. Силосный инокулянт по п.1 или 2, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus buchneri и Lactococcus.
- 4. Силосный инокулянт по любому из пп.1-3, где Lactococcus представляет собой Lactococcus lactis.
- 5. Силосный инокулянт по п.4, где Lactococcus lactis представляет собой штамм, депонированный как DSM 11037.
- 6. Силосный инокулянт по любому из пп.1-5, где Lactobacillus buchneri представляет собой штамм Lactobacillus buchneri, депонированный как DSM 22501.
- 7. Силосный инокулянт по любому из пп.1, 2 или 4-6, где Enterococcus представляет собой Enterococcus faecium.
- 8. Силосный инокулянт по п.1 который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus brevis и Enterococcus.
- 9. Силосный инокулянт по п.1, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus brevis и Lactococcus.
- 10. Силосный инокулянт по п.1, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus fermentum и Enterococcus.- 16 035954
- 11. Силосный инокулянт по п.1, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus fermentum и Lactococcus.
- 12. Силосный инокулянт по п.1, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus reuteri и Enterococcus.
- 13. Силосный инокулянт по п.1, который в качестве активных компонентов содержит только Lactobacillus reuteri и Lactococcus.
- 14. Способ получения ферментированного кормового продукта, включащий инокулирование растительного материала силосным инокулянтом по любому из пп.1-13.
- 15. Способ по п.14, где растительный материал инокулируют силосным инокулянтом и инкубируют в течение периода вплоть до 4 суток.
- 16. Способ по п.14, где растительный материал инокулируют силосным инокулянтом и инкубируют в течение периода вплоть до 7 суток.
- 17. Способ по п.14, где растительный материал инокулируют силосным инокулянтом и инкубируют в течение периода вплоть до 14 суток.
- 18. Способ по п. 14, где растительный материал инокулируют силосным инокулянтом и инкубируют в течение периода вплоть до 28 суток.
- 19. Способ по п.14, где растительный материал инокулируют силосным инокулянтом и инкубируют в течение периода вплоть до 90 суток.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14182628.9A EP2989899B1 (en) | 2014-08-28 | 2014-08-28 | Compositions of hetero- and homofermentative lactic acid bacterial species for dual purpose silage preservation |
| EP14188993 | 2014-10-15 | ||
| DKPA201400652 | 2014-11-10 | ||
| US201562156999P | 2015-05-05 | 2015-05-05 | |
| PCT/EP2015/069627 WO2016030456A1 (en) | 2014-08-28 | 2015-08-27 | Improved compositions of hetero- and homofermentative lactic acid bacterial species for dual purpose silage preservation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201790311A1 EA201790311A1 (ru) | 2017-08-31 |
| EA035954B1 true EA035954B1 (ru) | 2020-09-04 |
Family
ID=55398785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790311A EA035954B1 (ru) | 2014-08-28 | 2015-08-27 | Композиции гетеро- и гомоферментативных видов молочнокислых бактерий для консервирования силоса с двойным эффектом |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11160294B2 (ru) |
| EP (1) | EP3185696B1 (ru) |
| CN (2) | CN107223017B (ru) |
| BR (1) | BR112017003137B1 (ru) |
| CA (1) | CA2957854C (ru) |
| CY (1) | CY1122461T1 (ru) |
| DK (1) | DK3185696T3 (ru) |
| EA (1) | EA035954B1 (ru) |
| ES (1) | ES2765409T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20200038T1 (ru) |
| HU (1) | HUE047956T2 (ru) |
| LT (1) | LT3185696T (ru) |
| PL (1) | PL3185696T3 (ru) |
| PT (1) | PT3185696T (ru) |
| RS (1) | RS59813B1 (ru) |
| SI (1) | SI3185696T1 (ru) |
| WO (1) | WO2016030456A1 (ru) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6807160B2 (ja) * | 2016-03-15 | 2021-01-06 | 雪印種苗株式会社 | サイレージ調製用乳酸菌及びサイレージ調製用添加剤 |
| CN106635911A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-10 | 中粮生物科技（北京）有限公司 | 一种复合菌种发酵剂及青贮饲料的制备方法 |
| CN109306327A (zh) * | 2017-07-27 | 2019-02-05 | 内蒙古蒙正牧康实业有限公司 | 玉米粒鲜贮发酵菌剂及鲜贮发酵工艺 |
| CN109430540A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-03-08 | 齐鲁工业大学 | 一种藜麦青贮饲料的制备方法 |
| CN110150488A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-23 | 中科元生生物技术(天津)有限公司 | 一种猪用饲料添加剂及其制备方法和应用 |
| KR20230044134A (ko) * | 2020-07-26 | 2023-04-03 | 로커스 아이피 컴퍼니 엘엘씨 | 신규 사일리지 첨가제 조성물 |
| CN112553103B (zh) * | 2020-10-10 | 2022-09-20 | 重庆市畜牧科学院 | 牛鞭草青贮乳酸菌添加剂及其制备方法 |
| CN114908018B (zh) * | 2022-05-31 | 2023-03-10 | 四川农业大学 | 一种短乳杆菌及其在青贮中的应用 |
| CN116024122A (zh) * | 2022-09-16 | 2023-04-28 | 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 | 一种罗伊氏乳杆菌在制备青贮饲料中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008073841A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Lactobacillus buchneri strain ln1297 and its use to improve aerobic stability of silage |
| WO2014170233A2 (en) * | 2013-04-18 | 2014-10-23 | Chr. Hansen A/S | Method for improving milk quality in milk-producing animals |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ250858A (en) | 1993-12-27 | 1995-08-28 | Hayashibara Biochem Lab | Alkali-treated bagasse, its fermentation and use as animal feed |
| TW323222B (ru) | 1993-12-27 | 1997-12-21 | Hayashibara Biochem Lab | |
| DE19917715A1 (de) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Danisco A S Kopenhagen Koebenh | Neuartige Schutzkulturen und deren Verwendung bei der Konservierung von Lebensmitteln |
| JP2001299230A (ja) | 2000-04-27 | 2001-10-30 | Korin Korea Co Ltd | 飼料添加物およびその製造方法 |
| US6403084B1 (en) | 2000-11-03 | 2002-06-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Mixed cultures for improved fermentation and aerobic stability of silage |
| EP2325295A3 (en) | 2005-09-12 | 2013-05-29 | Vrije Universiteit Brussel | Cacao starter cultures and fermentation method |
| US20090028992A1 (en) | 2006-12-11 | 2009-01-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Lactobacillus buchneri strain LN1286 and its use to improve aerobic stability of silage |
| AU2009281683B2 (en) | 2008-07-21 | 2014-07-24 | Erber Aktiengesellschaft | Method for treating food silage for ruminants and food silage additive |
| EP2245944A1 (fr) | 2009-04-30 | 2010-11-03 | Danisco A/S | Procédé pour améliorer la digestibilité et l'assimilabilité des céréales et/ou des fibres chez un animal herbivore monogastrique |
| EP2228067B1 (de) | 2010-02-22 | 2013-12-11 | LR Health & Beauty Systems GmbH | Probiotische Zusammensetzung und deren Verwendung |
-
2015
- 2015-08-27 LT LTEP15767097.7T patent/LT3185696T/lt unknown
- 2015-08-27 PL PL15767097T patent/PL3185696T3/pl unknown
- 2015-08-27 CN CN201580047684.3A patent/CN107223017B/zh active Active
- 2015-08-27 CA CA2957854A patent/CA2957854C/en active Active
- 2015-08-27 WO PCT/EP2015/069627 patent/WO2016030456A1/en active Application Filing
- 2015-08-27 EP EP15767097.7A patent/EP3185696B1/en active Active
- 2015-08-27 US US14/838,024 patent/US11160294B2/en active Active
- 2015-08-27 BR BR112017003137-0A patent/BR112017003137B1/pt active IP Right Grant
- 2015-08-27 SI SI201531062T patent/SI3185696T1/sl unknown
- 2015-08-27 RS RS20200008A patent/RS59813B1/sr unknown
- 2015-08-27 DK DK15767097.7T patent/DK3185696T3/da active
- 2015-08-27 HU HUE15767097A patent/HUE047956T2/hu unknown
- 2015-08-27 CN CN202110238815.3A patent/CN112753866A/zh active Pending
- 2015-08-27 ES ES15767097T patent/ES2765409T3/es active Active
- 2015-08-27 PT PT157670977T patent/PT3185696T/pt unknown
- 2015-08-27 EA EA201790311A patent/EA035954B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2020
- 2020-01-08 CY CY20201100010T patent/CY1122461T1/el unknown
- 2020-01-09 HR HRP20200038TT patent/HRP20200038T1/hr unknown
-
2021
- 2021-10-27 US US17/512,592 patent/US20220117268A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008073841A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Lactobacillus buchneri strain ln1297 and its use to improve aerobic stability of silage |
| WO2014170233A2 (en) * | 2013-04-18 | 2014-10-23 | Chr. Hansen A/S | Method for improving milk quality in milk-producing animals |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| H ZAHIRODDINI, BAAH J., MCALLISTER T.A.: "Effects of Microbial Inoculants on the Fermentation, Nutrient Retention, and Aerobic Stability of Barley Silage", ASIAN-AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES, vol. 19, no. 10, 1 October 2006 (2006-10-01), pages 1429 - 1436, XP055171970, DOI: 10.5713/ajas.2006.1429 * |
| JAAKKOLA S., SAARISALO E., HEIKKILAE T: "Aerobic stability and fermentation quality of round bale silage treated with inoculans or propionic acid", GRASSLAND IN A CHANGING WORLD. PROCEEDINGS OF THE 23RD GENERAL MEETING OF THE EUROPEAN GRASSLAND FEDERATION, KIEL, GERMANY, 29TH AUGUST - 2ND SEPTEMBER 2010, 29 August 2010 (2010-08-29) - 2 September 2010 (2010-09-02), pages 503 - 505, XP009182847, ISBN: 978-3-86944-021-7 * |
| JONAS JATKAUSKAS, VILMA VROTNIAKIENE, CHRISTER OHLSSON, BENTE LUND: "The effects of three silage inoculants on aerobic stability in grass, clover-grass, lucerne and maize silages", AGRICULTURAL AND FOOD SCIENCE, MTT AGRIFOOD RESEARCH FINLAND, FINLAND, vol. 22, no. 1, 1 January 2013 (2013-01-01), Finland, pages 137 - 144, XP002736545, ISSN: 1795-1895 * |
| JONAS JATKAUSKAS, VROTNIAKIENE VILMA: "Evaluation of fermentation parameters, microbiological composition and aerobic stability of grass and whole crop maize silages treated with microbial inoculants", ZEMDIRBYSTE-AGRICULTURE, vol. 100, no. 2, 28 June 2013 (2013-06-28), pages 143 - 150, XP055172296, ISSN: 13923196, DOI: 10.13080/z-a.2013.100.018 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3185696A1 (en) | 2017-07-05 |
| HUE047956T2 (hu) | 2020-05-28 |
| SI3185696T1 (sl) | 2020-03-31 |
| CN112753866A (zh) | 2021-05-07 |
| BR112017003137A2 (pt) | 2017-11-28 |
| PT3185696T (pt) | 2020-01-21 |
| EA201790311A1 (ru) | 2017-08-31 |
| US11160294B2 (en) | 2021-11-02 |
| CA2957854A1 (en) | 2016-03-03 |
| RS59813B1 (sr) | 2020-02-28 |
| CN107223017A (zh) | 2017-09-29 |
| CN107223017B (zh) | 2021-03-19 |
| BR112017003137A8 (pt) | 2022-07-19 |
| PL3185696T3 (pl) | 2020-05-18 |
| CY1122461T1 (el) | 2021-01-27 |
| EP3185696B1 (en) | 2019-10-23 |
| BR112017003137B1 (pt) | 2023-01-17 |
| ES2765409T3 (es) | 2020-06-09 |
| US20220117268A1 (en) | 2022-04-21 |
| CA2957854C (en) | 2021-06-08 |
| WO2016030456A1 (en) | 2016-03-03 |
| DK3185696T3 (da) | 2020-01-27 |
| LT3185696T (lt) | 2020-01-27 |
| US20160058034A1 (en) | 2016-03-03 |
| HRP20200038T1 (hr) | 2020-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220117268A1 (en) | Compositions of hetero- and homofermentative lactic acid bacterial species for dual purpose silage preservation | |
| Ellis et al. | The effect of lactic acid bacteria included as a probiotic or silage inoculant on in vitro rumen digestibility, total gas and methane production | |
| Jatkauskas et al. | The effects of three silage inoculants on aerobic stability in grass, clover-grass, lucerne and maize silages | |
| Gallo et al. | Effect of inoculation with Lactobacillus buchneri LB1819 and Lactococcus lactis O224 on fermentation and mycotoxin production in maize silage compacted at different densities | |
| CA2938052C (en) | Rapid acting lactobacillus strains and their use to improve aerobic stability of silage | |
| RU2336705C2 (ru) | Способ производства ферментированного пищевого продукта, штамм pediococcus acidilactici dsm 10313 - продуцент бактериоцина, его применение и содержащий его пищевой продукт | |
| EP3431580B1 (en) | Lactic acid bacteria for silage preparation and additive for silage preparation | |
| Borcakli et al. | Changes in chemical and microbiological composition of two varieties of olive during fermentation | |
| CN107047978A (zh) | 一种植物乳杆菌及其在制备青贮饲料中的应用 | |
| Winters et al. | Degradation of fructans by epiphytic and inoculant lactic acid bacteria during ensilage of grass | |
| Jatkauskas et al. | The effects of silage inoculants on the fermentation and aerobic stability of legume-grass silage. | |
| Jatkauskas et al. | Evaluation of fermentation parameters, microbiological composition and aerobic stability of grass and whole crop maize silages treated with microbial inoculants. | |
| Ferrero et al. | Effects of a mixture of monopropionine and monobutyrin on the fermentation quality and aerobic stability of whole crop maize silage | |
| DK2989899T3 (en) | Compositions of hetero- and homofermentative lactic acid bacteria species for dual purpose silage preservation | |
| Pauly et al. | The effect of mechanical forage treatments on the growth of Clostridium tyrobutyricum and Listeria monocytogenes in grass silage | |
| Jatkauskas et al. | Effect of inoculants of different composition on the quality of rye silages harvested at different stages of maturity | |
| Tjandraatmadja et al. | Fermentation patterns of forage sorghum ensiled under different environmental conditions | |
| Wahyuni et al. | Chemical and microbiological characteristics of cocoa beans from Pidie district, Aceh province, Indonesia | |
| CN109943505A (zh) | 一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂 | |
| Jatkauskas et al. | The influence of application of a biological additive on the fermentation and nutritive value of lucerne silage. | |
| Adesokan et al. | Influence of lactic starters on sensory properties and shelf life of Wara Nigerian (unripened) soft cheese | |
| Obinna-Echem et al. | Fermentation and antimicrobial characteristics of Lactobacillus plantarum and Candida tropicalis from Nigerian fermented maize (akamu) | |
| Jatkauskas et al. | Effect of ensiling red clover-ryegrass using blends of homo-and heterofermentative lactic acid bacteria on fermentation characteristics, aerobic stability and hygienic parameters | |
| Jatkauskas et al. | Effect of different conditions to forage before ensiling and use of a lactic acid bacteria-based additive on the fermentation and aerobic stability of maize silage. | |
| Stoškus et al. | The effect of the bacterial inoculant on the ensiled lucerne fermentation characteristics, microbial population and the aerobic stability in the mini-silos. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM KG TJ TM |