EA032865B1 - НОВАЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СОЛЕВАЯ ФОРМА 3-(1,2,4-ТРИАЗОЛО[4,3-a]ПИРИДИН-3-ИЛЭТИНИЛ)-4-МЕТИЛ-N-(4-((4-МЕТИЛПИПЕРАЗИН-1-ИЛ)МЕТИЛ)-3-ТРИФТОРМЕТИЛФЕНИЛ)БЕНЗАМИДА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается профилактики и лечения заболеваний человека и животных, связанных с нарушением активности различных киназ, в частности Abl киназы, к примеру, таких заболеваний, как лейкемия, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз, острый лимфолейкоз, рак груди, немелкоклеточный рак лёгкого, гастроинтестинальные стромальные опухоли, рак яичников, лимфома, с помощью новой солевой формы 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида. Соль данного соединения с метансульфокислотойили её гидрат, сольват, а также полиморфные модификации, обладающие способностью ингибировать активность киназ, в частности Abl киназы. Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество соли по изобретению, к способу получения кристаллической соли по изобретению, а также к способу лечения онкологических заболеваний у субъекта.

Description

Изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине, а именно, к солевой форме соединения, а также к её кристаллическим (полиморфным) формам, обладающим улучшенными физико-химическими свойствами, а также высокой эффективностью и безопасностью по сравнению со свободным основанием.

Уровень техники

При изготовлении лекарственных препаратов важно, чтобы лекарственное вещество находилось в форме, удобной для его обработки и обращения с ним. Это важно не только с точки зрения получения коммерчески жизнеспособного производственного процесса, но также с точки зрения последующего производства фармацевтических препаратов, содержащих это активное соединение. Химическая стабильность, стабильность в твердом состоянии и стабильность при хранении активных ингредиентов также являются очень важными факторами. Лекарственное вещество и композиции, содержащие его, должны обладать способностью к эффективному хранению в течение приемлемых периодов времени, не проявляя значительного изменения в физико-химических характеристиках активного компонента, таких как химический состав, плотность, гигроскопичность и растворимость. В этом отношении использование аморфных форм вещества в качестве лекарственных веществ представляется нежелательным. Например, с такие формы вещества обладают нестабильными физико-химическими свойствами, такими как растворимость, гигроскопичность, сыпучесть, слёживаемость и другими. Таким образом, в производстве коммерчески жизнеспособных и фармацевтически приемлемых лекарственных композиций важно, по возможности, представлять лекарство в кристаллической и стабильной форме(ах).

Твердые вещества, включая фармацевтически активные соединения, часто имеют более чем одну кристаллическую форму; данное явление известно как полиморфизм. Полиморфизм имеет место, когда соединение кристаллизуется во множестве разных твердых фаз, которые отличаются кристаллической упаковкой. Обычно полиморфные модификации (полиморфы) имеют разные физические характеристики, включая растворимость и физическую и химическую стабильность. Различные твёрдые солевые формы одного и того же лекарственного вещества, и более того, различные полиморфы одной и той же твердой солевой формы, могут различаться по скорости высвобождения лекарственного средства, по стабильности твердого состояния солевой формы а также по пригодности для изготовления фармацевтического препарата.

Подбор подходящей солевой формы для соответствующего фармакологически активного вещества является важным моментом в доклинической фазе разработки лекарственного препарата. Изменение солевой формы действующего вещества лекарства является общераспространенным средством модификации его химических и биологических характеристик, не ведущим к модификации его структуры. Выбор конкретной солевой формы может глубоко повлиять на физико-химические свойства данного лекарства (например, скорость растворения, растворимость, устойчивость и гигроскопичность). Замена одной солевой формы в лекарстве на другую может изменить терапевтическую эффективность и/или безопасность применения, которые являются особо важными для оптимального состава лекарственной формы крупномасштабного производства. Тем не менее, отсутствует надежный способ точного прогнозирования, как повлияет изменение солевой формы активного вещества лекарства на безопасность его применения или его биологическую активность. Более того, даже исследование физико-химических свойств различных солевых форм активного вещества не позволяет однозначно идентифицировать солевые формы, обладающие желаемыми фармакокинетическими свойствами, эффективностью и безопасностью. Коротко говоря, не существует надежного способа предсказания влияния конкретных видов солей на поведение исходного соединения в лекарственных формах (Berge et al., Pharmaceutical Salts//Journal Pharm. Sci., 1977, Vol. 66, No. 1; Verbeeck et al. Generic substitution: The use of medicinal products containing different salts and implications for safety and efficacy//EP Journal Pharm. Sci, 28, 2006, 1-6).

Фармакокинетические параметры являются важнейшими характеристиками, определяющими пригодность твердой солевой формы (или конкретной полиморфной модификации) для использования в качестве лекарственного средства. Среднесуточная и максимальная концентрация лекарственного препарата в крови животных и человека может существенно зависеть от состава солевой формы и ее полиморфной модификации. Как правило, солевые формы вещества, обладающее большей растворимостью в воде позволяют достичь более высоких максимальных концентрация лекарственного препарата в крови и тканях экспериментальных животных и человека. Необходимо отметить, что повышение максимальных концентраций лекарственного препарата в крови животных как правило коррелирует с увеличением токсических эффектов, вызванных лекарственным препаратом. По этой причине изменение солевой формы вещества может привести к изменению профиля безопасности препарата.

Твердые солевые формы обычно являются предпочтительными для пероральных препаратов, поскольку именно они склонны к проявлению желаемых физических характеристик; и в случае основных лекарственных средств соли присоединения кислоты часто являются предпочтительной солевой формой. Как уже упоминалось выше, различные кислоты сильно различаются по их способности придавать желаемые свойства соответствующим солевым формам (такие как стабильность при хранении, легкость процесса получения и очистки, фармакокинетические параметры), и такие свойства не могут быть пред

- 1 032865 сказаны с достаточной точностью. Например, некоторые соли представляют собой твердые вещества при температуре окружающей среды, в то же время другие соли представляют собой жидкости, вязкие масла или смолы. Кроме того, некоторые солевые формы являются стабильными к воздействию тепла и света в экстремальных условиях, а другие легко разлагаются при гораздо более мягких условиях. Таким образом, разработка подходящей формы соли присоединения кислоты основного лекарственного средства для использования в фармацевтической композиции является крайне важным и далеко не всегда предсказуемым процессом.

Протеинкиназы являются важным семейством белков, участвующим в регуляции ключевых клеточных процессов, нарушение активности которых может приводить к различным заболеваниям. Перспективным подходом для терапии заболеваний, ассоциированных с нарушенной активностью протеинкиназ, является применение низкомолекулярных химических соединений для ингибирования их активности. Примерами таких ингибиторов, одобренных для применения в клинической практике, являются Иматиниб (Imatinib), Нилотиниб (Nilotinib), Дазатитниб (Dasatinib), Сунитиниб (Sunitinib), Сорафениб (Sorafenib), Лапатиниб (Lapatinib), Гефитиниб (Gefitinib), Эрлотиниб (Erlotinib), Кризотиниб (Crizotinib). Большое количество лекарственных кандидатов, ингибиторов киназ, находятся в настоящее время на стадии клинических испытаний или на стадии предклинической разработки.

BCR-ABL - гибридный белок (англ. fusion protein), продукт гибридного гена BCR-ABL1, формирующегося в результате реципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22 (филадельфийская хромосома). BCR-ABL является конститутивно активной тирозинкиназой, ответственной за онкогенную трансформацию клеток (онкобелком). Постоянная активность этой тирозинкиназы делает клетку способной делиться без воздействия факторов роста и вызывает её избыточную пролиферацию. BCR-ABL является ключевым патогенетический фактором развития подавляющего количества случаев хронического миелолейкоза и 20-50% случаев острого B-лимфобластного лейкоза взрослых. Таким образом, ингибирование киназной активности гибридного белка BCR-ABL является перспективной стратегией борьбы с различными онкологическими заболеваниями и в частности с хроническим миелолейкозом.

Ранее в патенте RU 247772 были описаны производные 1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридина и, в частности 3-(1,2,4-триазоло [4,3щ]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамид, обладающие эффективностью и селективностью в ингибировании активности Abl-киназы и ее мутантных форм, а также других терапевтически значимых киназ.

В ходе проведенных in vitro и in vivo исследований была показана потенциальная возможность применения этих соединений для лечения онкологических заболеваний, в частности лейкемии, острого миелолейкоза, хронического миелолейкоза, гепатоцеллюлярной карциномы, немелкоклеточного рака лёгкого и гастроинтестинальных стромальных опухолей у животных и человека.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка и создание новой солевой формы ингибитора киназ, в частности Abl киназы, содержащей фармакологически приемлемый противоион, обладающей кристалличностью, высокой растворимостью в воде, постоянством состава, легкостью масштабирования процесса получения и очистки и являющейся перспективной для применения в клинической практике для лечения заболеваний, связанных с нарушением активности различных киназ.

Техническим результатом данного изобретения является разработка и получение новой солевой формы ингибитора киназ, в частности Abl киназы, в том числе её новых полиморфных модификаций (кристаллических форм), характеризующихся высокой растворимостью в воде и высокой ингибирующей активностью по отношению к Abl киназе (и клинически важных мутантных форм этого фермента), высокой среднесуточной концентрацией, а также высоким значением параметра AUG, (площади под кривой концентрация-время) в крови животных и человека, обладающей благоприятным профилем безопасности и эффективной для лечения заболеваний, связанных с нарушением активности протеинкиназ, включая, но не ограничиваясь, лейкемию, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз, острый лимфолейкоз, рак груди, немелкоклеточный рак лёгкого, гастроинтестинальные стромальные опухоли, рак яичников, лимфому.

Техническим результатом настоящего изобретения также является разработка и получение солевой формы ингибитора киназ, характеризующейся легкостью масштабирования процесса получения и очистки, использованием малотоксичных растворителей, а также характеризующейся высокой чистотой получаемого продукта при минимальном использовании стадий очистки получаемого соединения.

- 2 032865

Указанный технический результат достигается путем получения соли метансульфокислоты и основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-К-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида

или её гидрата, сольвата, а также полиморфных модификаций, обладающих способностью ингибировать активность киназ, в частности Abl киназы.

Одним из предпочтительных вариантов воплощения изобретения является полиморфная модификация соли метансульфокислоты и основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, представляющая собой кристаллическую фазу со следующими параметрами элементарной ячейки, определенными методом порошковой рентгеновской дифракции при 25±5°C с использованием CuKa1 излучения при длине волны 1,5406 А, равными: а=51,46±0,05 А; b=7,81±0,05 А и c=7,63±0,05 А, β=108,9±0,1°, V=2898,9±0,5 А³; пространственная группа P2₁/n и характеристическими пиками в дебаеграмме с величинами углов дифракции (2θ)

Другим предпочтительным вариантом воплощения изобретения является полиморфная модификация соли метансульфокислоты и основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, представляющая собой кристаллическую фазу со следующими параметрами элементарной ячейки, определенными методом порошковой рентгеновской дифракции при 25±5°C с использованием CuKa1 излучения при длине волны 1,5406 А, равными а=13,77±0,05 А; b=8,09±0,05 А и c=30,83±0,05 А, β=117,8±0,1, V=3036,36±0,5 А³ и пространственной группой P2₁/c и характеристическими пиками в дебаеграмме с величинами углов дифракции (2θ)

Указанный технический результат достигается также посредством применения соли или её гидрата, сольвата, а также полиморфных модификаций по изобретению для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с активностью киназ человека или животных. Причем в некоторых вариантах воплощения изобретения киназа выбрана из группы, состоящей из рецепторных тирозинкиназ, нерецепторных протеинкиназ и серин/треонин-протеинкиназ, в частности ABL1, ABL2/ARG, BLK, DDR1, DDR2, EPHA2, EPHA8, EPHB2, FGR, FLT4/VEGFR3, FMS, FRK/PTK5, FYN, HCK, KDR/VEGFR2, LCK, LYN, LYN B, P38a/MAPK14, PDGFRa, PDGFRb, RAF1, RET, RIPK3, ZAK/MLTK (Mian et al., PF-114, a potent and selective inhibitor of native and mutated BCR/ABL is active against Philadelphia chromosome-positive (Ph+) leukemias harboring the T315I mutation// Leukemia, 2015, Vol. 29, No. 5).

Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с активностью киназ, и характеризующиеся тем, что они содержат эффективное количество соединения по изобретению и по меньшей мере одно вспомогательное вещество. В некоторых вариантах воплощениях изобретения вспомогательное вещество представляет собой фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент. Такие композиции предназначены для модулирования активности киназ, выбранных из группы, состоящей из рецепторных тирозинкиназ, нерецепторных протеинкиназ и серин/треонин-протеинкиназ, в частности Abl киназы, c-Src, Yes, Lyn, Lck, EGFR1 (Flt-1), VEGFR2, VEGFR3, PDGFR киназ.

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования каталитической активности киназы, включающий приведение указанной киназы в контакт с соединением по изобретению. Такой способ предназначен для модулирования активности киназ, выбранных из группы, состоящей из рецепторных тирозинкиназ, нерецепторных протеинкиназ и серин/треонин-протеинкиназ, в частности Abl киназы, c-Src, Yes, Lyn, Lck, EGFR1 (Flt-1), VEGFR2, VEGFIR3, PDGFR киназ.

Изобретение также включает способ предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с активностью киназы в организме, включающий введение в указанный организм фармацевтической композиции по изобретению. Такое расстройство, связанное с активностью киназы, представляет собой онкологическое, хроническое воспалительное или другое заболевание, в частности лейкемию, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз, гепатоцеллюлярную карциному, немелкоклеточный рак лёгкого или гастроинтестинальную стромальную опухоль. В частных случаях воплощения изобретения организм представляет собой человека или животного. В некоторых вариантах воплощения изобретения животное представляет собой кошку, собаку или лошадь.

- 3 032865

Достижение указанного технического результата обеспечивается также за счет способа получения кристаллов соединений по изобретению, включающего следующие этапы:

a) введение раствора метансульфокислоты или ее гидрата в органическом растворителе в суспензию или раствор основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в органическом растворителе или смеси растворителей; введение раствора метансульфокислоты или ее гидрата может быть осуществлено как при комнатной температуре, так и при нагревании или охлаждении каждого из компонентов; также может быть использован обратный порядок смешивания реагентов;

b) кристаллизацию получившейся соли из раствора;

c) отделение кристаллов соли от растворителя.

В некоторых вариантах воплощения изобретения растворитель на стадии (a), используемый в качестве среды для суспендирования 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, представляет собой ацетон.

В частных случаях воплощения изобретения растворитель на стадии (a), используемый для приготовления раствора метансульфокислоты или ее гидрата представляет собой этанол.

В некоторых вариантах воплощения изобретения после стадии (c) дополнительно осуществляют перекристаллизацию соли.

В некоторых других частных случаях воплощения изобретения дополнительно применяют стадию инициирования образования кристаллов в случаях получения соли из растворов. Инициирование образования кристаллов может быть достигнуто путем внесения в раствор небольших количеств той же соли или другими способами.

В частных случаях дополнительно применяют стадию очистки основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-

a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида путем превращения его в соль серной, соляной, бензолсульфо-, 4-метилбензолсульфо-, 2метилбензолсульфо-, метансульфо-, лимонной, фосфорной, трифторуксусной, 4-нитробензолсульфо-, тетрафторборной, гексафторфосфорной или иной кислоты с последующим получением из этой соли основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида и повторным синтезом из этого основания соли с метансульфокислотой.

Свободное основание 3-(1,2,4-триазоло [4,3-a]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида известно и описано в патенте RU 247772.

Определения (термины).

Термин C, когда он используется со ссылкой на температуру, означает стоградусную шкалу или температурную шкалу Цельсия.

Термин IC50 означает концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование активности киназы.

Термин суспензия относится к твердому веществу, суспендированному в жидкой среде, обычно воде или органическом растворителе.

Термин модулирование в настоящем документе относится к изменению каталитической активности киназы. В частности, модулирование относится к активации или ингибированию каталитической активности киназы.

Термин полиморфная модификация относится к твердой фазе вещества, которая проявляется в нескольких отличающихся формах вследствие разного расположения и/или конформации молекул в кристаллической решетке. Полиморфные модификации обычно имеют разные химические и физические свойства. Кроме того, термин полиморфная модификация также относится к сольватам (т.е. кристаллическим формам, содержащим растворитель или воду) равно как и к разным несольватированным кристаллическим формам соединения.

Термин сольват используется для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение по изобретению и одну или более молекул фармацевтически приемлемого растворителя, например этанола. Термин гидрат используется, когда указанным растворителем является вода.

Термин картина порошковой рентгеновской дифракции или PXRD-картина относится к экспериментально наблюдаемой дифрактограмме или полученным из нее параметрам. Обычно картины порошковой рентгеновской дифракции характеризуются положением пика (абсцисс) и интенсивностью пика (ординат).

Термин интенсивность пика относится к относительной интенсивности сигнала на данной картине рентгеновской дифракции. Факторами, влияющими на относительную интенсивность пика, являются толщина образца и предпочтительная ориентация (т.е. распределение кристаллических частиц не является случайным).

Термин положения пика, как используется в настоящем описании, относится к положению рентгеновского рефлекса, измеренного и наблюдаемого в экспериментах порошковой дифракции. Положения пиков напрямую связаны с размерами элементарной ячейки. Пики, идентифицированные по их соответствующему положению, получают, исходя из картины дифракции для различных полиморфных форм солей 2,2-диметил-6-((4-((3,4,5-триметоксифенил)амино)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2Ы-пиридо[3,2

- 4 032865

b][1,4] оксазин-3 (4Н)-она.

Термин значение 2 тета или 2θ относится к положению пика в градусах, исходя из экспериментальных данных рентгеновской дифракции, и в основном представляет собой единицу измерения на оси абсцисс на картинах дифракции. В основном, экспериментальная установка требуется, если отраженные лучи преломляются, когда падающий луч образует угол тета (θ) с определенной плоскостью решетки, а отраженный луч будет регистрироваться при угле 2 тета (2θ). Следует понимать, что отсылка в данной заявке на специфические значения 2θ для специфической полиморфной формы предполагает значение 2θ в градусах, измеренные с использованием экспериментальных условий рентгеновской дифракции, раскрытых в настоящей заявке.

Термин аберрантная активность киназы в настоящем документе означает киназную активность, существенно отличающуюся от базового уровня активности этой киназы в клетках при отсутствии патологии. Аберрантная активность может быть вызвана изменением уровня экспрессии киназы, нарушением процессов, приводящих к активации киназы, дерегулированием путей деградации, а также другими факторами.

Термин вспомогательное вещество означает любое фармацевтически приемлемое вещество неорганического или органического происхождения, входящее в состав лекарственного препарата или используемое в процессе производства, изготовления лекарственного препарата для придания ему необходимых физико-химических свойств.

Термин AUC означает фармакокинетический параметр, характеризующий суммарную концентрацию лекарственного препарата в плазме крови в течение всего времени наблюдения. Математически определяется как интеграл от 0 до да функции концентрации препарата (фармакокинетической кривой) в плазме крови от времени и равен площади фигуры, ограниченной фармакокинетической кривой и осями координат.

Термины лечение, терапия охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) снижение, б) блокирование (приостановку) течения заболевания, в) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания, г) реверсирование заболевания или состояния, к которому данный термин применяется, или одного или более симптомов данного заболевания или состояния.

Термин профилактика, предотвращение охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у млекопитающих, предпочтительно у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится: а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется фигурами чертежей.

Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Способ терапевтического применения соединений.

Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Соединение по изобретению, или фармацевтическая композиция, содержащая соединение, может быть введено любым путем в организм пациента в количестве, эффективным для лечения или профилактики заболевания.

После смешения лекарственного препарата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных перорально, парентерально, местно и т.п.

Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, соединение может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема вещества (например, 1-30 дней).

- 5 032865

В том случае, когда соединение по изобретению используется как часть режима комбинированной терапии, доза каждого из компонентов комбинированной терапии вводится в течение требуемого периода лечения. Соединения, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.

Фармацевтические композиции.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединения по изобретению (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с соединением, составляющем суть данного изобретения, и которые не разрушают фармакологической активности этого соединения, и являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.

Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат соединения данного изобретения совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазочные материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определённого пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм орально, местно, пульмональным, например, в виде ингаляционного спрея, или внутрисосудистым способом, интраназально, подкожно, внутримышечно, а также инфузионным способом, в рекомендованных дозировках.

Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике.

При получении композиции, например в форме таблетки, активное начало смешивают с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, аравийская камедь, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналогичные соединения.

Таблетки можно покрыть сахарозой, целлюлозным производным или другими веществами, подходящими для нанесения оболочки. Таблетки могут быть получены различными способами, такими как непосредственное сжатие, сухое или влажное гранулирование или горячее сплавление в горячем состоянии.

Фармацевтическую композицию в форме желатиновой капсулы можно получить, смешивая активное начало с растворителем и заполняя полученной смесью мягкие или твердые капсулы.

Для введения парентеральным путем используются водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные растворы для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутиленгликоль.

- 6 032865

Примеры фармацевтических композиций.

Вещества, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для профилактики и/или лечения болезней человека или животных в виде следующих составов (под Веществом понимается активный ингредиент):

Таблетка I	мг/таблетка
Вещество....................................... Лактоза Ph. Eur...............................	50 223.75
Кроскармеллоза натрия................ Кукурузный крахмал ..................... Поливинилпироллидон (5% w/v паста) Стеарат магния..............................	6.0 15 2.25 3.0
Таблетка II	мг/таблетка
Вещество....................................... Лактоза Ph. Eur..............................	200 182.75
Кроскармеллоза натрия................ Кукурузный крахмал (5% w/v паста) Стеарат магния..............................	12.0 2.25 3.0
Капсула Вещество....................................... Лактоза Ph. Eur..............................	мг/капсула 10 488.5
Магнезия........................................	1.5
Состав для инъекций 1 Вещество....................................... 1М раствор гидроксида натрия..... 1М раствор соляной кислоты до pH Полиэтиленгликоль 400................ Вода для инъекций до 100%	(50 мг/мл) 5.0% w/v 15.0% w/v 7.6 4.5% w/v

Аэрозоль I Вещество....................................... Триолеат сорбитана...................... Т рихлорфторметан........................ Дихлордифторметан.....................	мг/мл 10 13.5 910.0 490.0
Мазь	мл
Вещество....................................... Этанол............................................	40 мг 300 рл
Вода............................................... 1 -додецилазациклогептанон.........	300 рл 50 рл

Пропиленгликоль до 1 мл

Данные составы могут быть приготовлены в соответствии со стандартными фармацевтическими методиками. Таблетки (I)-(II) могут быть покрыты кишечнорастворимой оболочкой с использованием, например, фталата ацетата целлюлозы. Аэрозольный состав (I) может быть использован в сочетании со стандартными диспенсерами; в качестве суспендирующего агента вместо триолеата сорбитана и соевого лецитина может быть использован моноолеат сорбитана, полуолеат сорбитана, полисорбат 80, олеат полиглицерина или олеиновая кислота,

- 7 032865

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - кристаллизация солей 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в масштабе 100 мг;

фиг. 2 - кристаллизация солей 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в масштабе 100 мг после добавления метил-трет-бутилового эфира;

фиг. 3 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке свободного основания 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец-НЛЬ-О-194-1 (полиморфная модификация I);

б) образец-НЛЬ-О-194-2 (полиморфная модификация II);

фиг. 4 - фотография кристаллов образца свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образецHAL-G-194-1, полиморфная модификация I), полученная методом поляризационной микроскопии;

фиг. 5 - спектр ядерного магнитного резонанса 'Н образца свободного основания 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец-НЛЬ-О-194-1 (полиморфная модификация I);

б) образец-НЛЬ-О-194-2 (полиморфная модификация II);

фиг. 6 - кривая ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) образца свободного основания 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-НЛЬ-О-194-1, полиморфная модификация I);

фиг. 7 - кривая ТГА (термогравиметрический анализ) образца свободного основания 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-НЛЬ-О-194-1, полиморфная модификация I);

фиг. 8 - гигроскопичность образца свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образецHAL-G-194-1, полиморфная модификация I) по данным гравиметрического влагопоглощения;

фиг. 9 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли хлороводородной кислоты и свободного основания 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец-НЛЬ-О-194-1 (свободное основание, полиморфная модификация I);

б) образец-НЛЬ-О-196-2 (полиморфная модификация I);

в) образец-НЛЬ-О-196-3 (полиморфная модификация II);

фиг. 10 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли хлороводородной кислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец-НЛЬ-О-196-2 (полиморфная модификация I);

б) образец-НЛЬ-О-196-3 (полиморфная модификация II);

фиг. 11 - кривая ТГА (термогравиметрический анализ) образца соли хлороводородной кислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-НЛЬ-О-196-2, полиморфная модификация I);

фиг. 12 - кривая ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) образца соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец- НЛЬ-О-196-2 (полиморфная модификация I);

б) образец-НЛЬ-О-194-3 (полиморфная модификация II);

фиг. 13 - гигроскопичность образца соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образец-НЛЬ-О-196-2. полиморфная модификация I) по данным гравиметрического влагопоглощения;

фиг. 14 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли серной кислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец - НЛЬ-О-196-6);

фиг. 15 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли серной кислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец - НЛЬ-О-196-6);

фиг. 16 - кривая ДСК (образца соли серной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образец-НЛЬ-О-196-6);

фиг. 17 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли бромоводородной кислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - НЛЬ-О-196-7 (полиморфная модификация I);

- 8 032865

б) образец - HAL-G-196-8 (полиморфная модификация II);

фиг. 18 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли бромоводородной кислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец-HAL-G-196-7 (полиморфная модификация I);

б) образец-HAL-G-196-8 (полиморфная модификация II);

фиг. 19 - кривая ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) образца соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-7 (полиморфная модификация I);

б) образец - HAL-G-196-8 (полиморфная модификация II);

фиг. 20 - кривая ТГА (термогравиметрический анализ) образца соли бромоводородной кислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]иридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-7, полиморфная модификация I);

фиг. 21 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли фосфорной кислоты и свободного основания 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - hAl-G-196-13;

б) образец - HAL-G-198-3 (после десольватации HAL-G-196-13);

фиг. 22 - спектр ядерного магнитного резонанса 'Н образца соли фосфорной кислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-13);

фиг. 23 - кривая ДСК образца соли фосфорной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образецHAL-G-196-13);

фиг. 24 - кривая ТГА образца соли фосфорной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образецHAL-G-196-13);

фиг. 25 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли винной кислоты и свободного основания 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-16;

б) образец - HAL-G-198-1 (после десольватации HAL-G-196-16);

фиг. 26 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли винной кислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-16);

фиг. 27 - кривая ДСК образца соли винной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-19616);

фиг. 28 - кривая ТГА образца соли винной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-19616);

фиг. 29 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-19;

б) образец - HAL-G-196-20;

в) образец - HAL-G-196-21;

фиг. 30 - фотография кристаллов образца соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образец - HAL-G-196-21), полученная методом поляризационной микроскопии;

фиг. 31 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-19);

фиг. 32 - кривая ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) образца соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-21);

фиг. 33 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-23;

б) образец - HAL-G-196-24;

- 9 032865 фиг. 34 - фотография кристаллов образца соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-a]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец - HAL-G-196-24), полученная методом поляризационной микроскопии;

фиг. 35 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец - HAL-G-196-24);

фиг. 36 - кривая ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) образца соли 4метилбензолсульфокислоты и 3-( 1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-24);

фиг. 37 - гигроскопичность образца соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образец - HAL-G-196-24) по данным гравиметрического влагопоглощения;

фиг. 38 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли яблочной кислоты и свободного основания 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - hAl-G-196-25;

б) образец - HAL-G-198-26;

фиг. 39 - спектр ядерного магнитного резонанса Ή образца соли яблочной кислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец-HAL-G-196-25);

фиг. 40 - кривая ДСК образца соли яблочной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образецHAL-G-196-25);

фиг. 41 - кривая ТГА образца соли яблочной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образецHAL-G-196-25);

фиг. 42 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли фумаровой кислоты и свободного основания 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-28;

б) образец - HAL-G-198-29;

фиг. 43 - спектр ядерного магнитного резонанса ¹Н образца соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (образец - HAL-G-196-29);

фиг. 44 - кривая ДСК образца соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-28;

б) образец - HAL-G-198-29;

фиг. 45 - кривая ТГА образца соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида:

а) образец - HAL-G-196-28;

б) образец - HAL-G-198-29;

фиг. 46 - фотография кристаллов образца соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (образец - HAL-G-196-29), полученная методом поляризационной микроскопии;

фиг. 47 - спектры ядерного магнитного резонанса ¹Н и ¹³С образца соли метансульфокислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I):

а) Ή-ЯМР спектр (Bruker DRX500,13400, 500,13 МГц, ДМСО-de);

б) ¹³С-ЯМР спектр (Bruker DRX500, 125,76 МГц, ДМСО-б₆);

фиг. 48 - спектры ядерного магнитного резонанса ¹Н и ¹³С образца соли метансульфокислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II):

а) Ή-ЯМР спектр (Bruker DRX500, 13, 500,13 МГц, ДМСО-de);

б) ¹³С-ЯМР спектр (Bruker DRX500, 13, 125,76 МГц, ДМСО-de);

фиг. 49 - картины дифракции рентгеновских лучей на порошке соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) полиморфная модификация I;

б) полиморфная модификация II;

фиг. 50 - общий вид независимой части элементарной ячейки соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4

- 10 032865 триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилиииеразин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида:

а) полиморфная модификация I;

б) полиморфная модификация II;

фиг. 51 - кинетика растворения свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида и полиморфных модификаций соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида;

фиг. 52 - средние концентрации 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в плазме крови мышей линии C57BL/6 после однократного перорального введения. Для каждой временной точки средние значения определены на основе индивидуальных данных полученных от трех животных:

а) пероральное введение свободного основания в дозе 50 мг/кг;

б) пероральное введение соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I) в дозе 59 мг/кг (50 мг/кг в пересчете на свободное основание).

Оптимизация солевой формы 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Для получения солевой формы с наилучшими физическими свойствами были синтезированы разные солевые формы 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида. Основными целями оптимизации солевой формы было получение солевой формы 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, содержащей фармакологически приемлемый противоион (предпочтительно анион) и обладающей следующими характеристиками: кристалличность, высокая растворимость в воде (более 10 г/л) и постоянный состав. Кроме того, процесс получения солевой формы должен быть легко масштабируемым и протекать в малотоксичных органических растворителях.

Получение различных солевых форм 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида проводилось в органических растворителях, обладающих полярностью и низкой токсичностью (классы 2 и 3). Противоионы выбирались исходя из фармакологической приемлемости и силы кислоты (ДМСО-0₆ не выше 5,0). Требование к силе кислоты обусловлено тем, что протонируемый атом азота 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида представляет собой основание с рКа ~ 6,4.

На первом этапе проводилось исследование растворимости исходного основания в выбранных органических растворителях. Максимальный объем растворителя для данного испытания был выбран равным 1,25 мл на 1 мг основания из соображений дальнейшего масштабирования процесса. Результаты исследования растворимости исходного основания в выбранных органических растворителях приведены в табл. 1. Для дальнейших исследований были выбраны низкотоксичные (класс 3), низкокипящие (Т_{кипения}<100°С) растворители обладающие высокой полярностью, и обеспечивающие растворимость не ниже 10 мг/мл.

На втором этапе исследования была предпринята попытка получения солей исходя из 100 мг основания 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида. Для этого этапа разработки отбирались такие пары растворитель/кислота, в которых происходило либо полное растворение образца в растворителе и выпадение осадка после прибавления кислоты, либо гомогенизация системы после прибавления кислоты и выпадение осадка после охлаждения системы до комнатной температуры. В большинстве случаев выпадение солей 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида происходило или непосредственно после добавления кислоты или после охлаждения раствора (см. фиг. 1). В случаях, когда после охлаждения раствора не наблюдалось образование осадка для инициирования кристаллизации к растворам соответствующих солей был добавлен метил-трет-бутиловый эфир (см. фиг. 2).

Таблица 1. Растворимость 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в различных растворителях

- 11 032865

Образец	Кол-во, мг	Растворитель	Объем р-теля, мл	Температ ура, С	Растворим ость (+/-)	Класс токсичности р-теля
HAL-G-194-2	4.6	Вода	4.0*	50	-	-
HAL-G-194-3	4.0	Метанол	0.1	50	+	II
HAL-G-194-4	4.7	Этанол	0.3	50	+	III
HAL-G-194-5	3.6	Изопропанол	0.4	50	+	III
HAL-G-194-6	3.6	н-Бутанол	0.2	50	+	III
HAL-G-194-7	3.5	Ацетонитрил	4.0*	50	-	II
HAL-G-194-8	3.6	Т етраги дрофу ран	0.1	50	+	III
HAL-G-194-9	3.7	2-метилтетрагидрофуран	0.6	50	+	-
HAL-G-194-10	3.9	Этилацетат	1.3	50	+	Ill
HAL-G-194-11	4.0	Изопропилацетат	4.0	50	-	III
HAL-G-194-12	3.4	Ацетон	0.3	50	+	III
HAL-G-194-13	4.8	Метилэтилкетон	0.4	50	+	III
HAL-G-194-14	4.1	М етил изобутил кетон	0.6	50	+	III
HAL-G-194-15	3.7	Дихлорметан	0.4	50	+	II
HAL-G-194-16	3.4	Толуол	4.0*	50	-	II
HAL-G-194-17	4.7	Диметил формам ид	0.1	КТ	+	II
HAL-G-194-18	3.7	N-метилпирролидон	0.1	КТ	+	II
HAL-G-194-19	3.8	Диметилсульфоксид	0.1	КТ	+	III
HAL-G-194-20	4.7	Метил -трет-бутил овый эфир	4.0*	50	-	III
HAL-G-194-21	3.3	Г ептан	4.0*	50	-	III
HAL-G-194-22	4.3	Циклогексан	4.0*	50	-	II
|<T — комнатная температура,
растворение не происходило.

Кристалличность всех полученных образцов была изучена методом порошковой рентгеновской дифрактометрии (с целью исследования кристалличности структуры). Дифрактограммы, были получены при 25°C (±5°C) и относительной влажности воздуха -70% на порошковом рентгеновском дифрактометре CubiX-Pro XRD (напряжение на аноде 45 kV, ток 40 mA), с детектором X'Celerator. Шаг съемки 0.02° 2θ, угловой диапазон 3-45° 2θ. Уточнение полученных дифрактограмм проводилось в программном пакете X'Pert HighScore Plus.

Исследования кристалличности образцов методом порошковой рентгеновской дифракции показали, что исследуемые образцы HAL-G-194-1, HAL-G-196-1, HAL-G-196-2, HAL-G-196-4, HAL-G-196-5, HALG-196-6, HAL-G-196-7, HAL-G-196-8, HAL-G-196-9, HAL-G-196-13, HAL-G-196-16, HAL-G-196-17, HAL-G-196-25, HAL-G-196-28, HAL-G-196-29, HAL-G-196-30, HAL-G-196-3, HAL-G-196-19,

HAL-G-196-20, HAL-G-196-21, HAL-G-196-23, HAL-G-196-24, HAL-G-196-26, HAL-G-196-35 представляли собой индивидуальные кристаллические фазы или смеси фаз (см. фиг. 1 и 2). Исследование растворимости указанных образцов было проведено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограммы были получены на приборе Agilent 1100 Series с колонкой Phenomenex Luna, 5 мкМ, 4,6x250 мм. Мобильная фаза (10 мМ KH₂PO₄ pH 3):ацетонитрил объемное соотношение 60:40. Скорость потока 1.0 мл/мин. Детекция проводилась на длине волны 254 нм. Время анализа 16 мин). Образцы были также исследованы методами: поляризационной микроскопии (Leica DMRB Polarized Microscope, разрешение 1600x1200) - для подтверждения кристалличности, ионной хроматографии - для подтверждения стехиометрического соотношения аниона и катиона, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и термогравиметрии (ТГА) - для подтверждения состава и исследования температурной стабильности образцов; ¹Н ЯМР (500 MHz Bruker AVANCE 500,13 МГц, растворитель ДМСО-d^ - для подтверждения структуры, оценки чистоты и содержания органических растворителей; гравиметрического влагопоглощения - для оценки гигроскопичности. ДСК проводили на приборе Mettler 822e DSC. Измерительную систему калибровали согласно норме ISO 11357-1 по параметрам фазовых переходов стандартных веществ (C₆H₁₂; Hg; бензойная кислота; Ga; KNO₃; In; Sn; Bi; CsCl; чистота 99,99%). Систематическая ошибка температурной калибровки (определена по In) составляет 0,1°. Образцы тестировали в стандартных алюминиевых ячейках в потоке искусственного воздуха в интервале температур 30-300°C при скорости нагревания 10°/мин. ТГА измерения проводили на ТГА анализаторе Mettler 851e SDTA/TGA, Прибор калибровали по точкам плавления стандартных веществ (Ag; Al; Bi; In; Sn; чистота 99.99%). Погрешность определения массы не превышает 0,1% (определено по стандарту CaC₂O₄-2H₂O). Эксперимент проводили в стандартном открытом алюминиевом контейнере в потоке искусственного воздуха в интервале температур 30-150°C при скорости нагревания 10°/мин. Материал не подвергали механической обработке перед измерениями во избежание дегидратации.

- 12 032865

Исследование физико-химических свойств свободного основания Э-ЦДА-триазолоЦА^пиридин3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I).

Образец HAL-G-194-1 свободного основания по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 3) является индивидуальной кристаллической фазой, что было так же подтверждено поляризационной микроскопией (см. фиг. 4). Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 5). Кажущаяся растворимость свободного основания в деионизированной воде была менее 1 мг/мл (см. табл. 2).

Таблица 2. Кажущаяся растворимость свободного основания и различных солевых форм 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида в воде

Образец	Кислота	Кристалличность (форма)	Масса, мг	Температура,	Объем воды мл	Кажущаяся растворимость, мг /мл
HAL-G-194-1	(свободное основание)	Форма I	4.6		4.0#	< 1
HAL-G-196-2	HCI	Форма I	4.4		0.15	>29
HAL-G-196-3	HCI	Форма II	4.3		1.25*	~3
HAL-G-196-6	H2SO4	Полукристаллический	4.5		4.0#	< 1
HAL-G-196-7	НВг	Форма I	4.6	КТ	1.0*	-5
HAL-G-196-8	НВг	Форма II	4.8		4.0#	< 1
HAL-G-196-20	Метансульфокислота	Кристаллический	4.6		0.1	>46
HAL-G-196-24	4-метил- бензолсульфокислота	Crystalline	4.9		4.0*	~1
HAL-G-196-29	Фумаровая	Crystalline	4.1		4.0#	< 1

КТ — комнатная температура, * - мутный раствор, # - растворение не произошло

Равновесная растворимость свободного основания в деионизированной воде составила примерно 2.3*10^-4 мг/мл по данным ВЭЖХ анализа (см. табл. 3).

Таблица 3. Равновесная растворимость свободного основания и различных солевых форм 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в воде

Солевая форма	Шифр образца	Масса, мг	Кол-во воды, мл	Кристалличность	pH	Растворимость, мг/мл
начальная	через 24 часа
Свободное основание	HAL-G-194-1	18.113	0.6	Крист.	Крист.	5.3	2.3 х 10'4
Г идрохлорид	HAL-G-196-3	21.939	0.6	Форма II	Аморфный	4.0	37.1
Мезилат	HAL-G-196-20	19.912	0.2	Крист.	Растворение	3.6	> 100
Тозилат	HAL-G-196-24	15.631	0.6	Крист.	Крист.	3.5	2.2
Фумарат	HAL-G-196-29	18.960	0.6	Крист.	Крист.	4.2	7.4 х 10'3

Результаты тестирования образцов методами ДСК и ТГА представлены на фиг. 6 и 7. ДСК анализ образца свободного основания показал, что образец не подвергается изменениям при нагревании до 198°C, плавление свободного основания происходит при 211°C (см. фиг. 6). В ходе ТГА анализа не было обнаружено потери массы образца (см. фиг. 7). Исследование гигроскопичности образца свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида показало, что при относительной влажности воздуха 90% образец адсорбирует менее трех массовых процентов воды (см. фиг. 8). Содержание посторонних примесей остается постоянным при хранении образца в течение семи дней при температуре 60°C (см. табл. 4).

Таблица 4. Стабильность свободного основания и различных солевых форм 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-

трифторметилс	>енил)бензамида (7 дней при Т=60°С)
Солевая форма	Шифр образца	Масса, мг	Относительная площадь пика, начальная, %	Относительная площадь пика, через 7 суток, %	Кристалличность
начальная	через 7 суток
Свободное основание	HAL-G-194-1	12.7	99.7	99.7	Форма 1	Форма 1
Г идрохлорид	HAL-G-196-20	10.0	99.7	99.7	Крист.	Крист.
Мезилат	HAL-G-196-24	8.8	99.8	99.9	Крист.	Крист.
Тозилат	HAL-G-196-3	9.5	99.9	99.9	Форма II	Форма II
Фумарат	HAL-G-196-29	12.2	99.8	99.9	Крист.	Крист.

- 13 032865

Изучение стабильности полиморфной модификации свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида при суспендировании в среде растворителя (ацетон) в течение 6 дней показало, что кристаллическая структура образца HAL-G-194-1 изменяется (см. фиг. 3, табл. 5). Структура и чистота полученного образца была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 5).

Таблица 5. Стабильность полиморфных модификаций свободного основания и различных солевых форм 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (суспендирование в ацетоне в течение 6 дней)

Солевая форма	Шифр образца	Масса, мг	Кол-во ацетона, мл	Температура	Кристалличность
начальная	через 6 суток
Свободное основание	HAL-G-194-1	36.5			Форма I	Форма II
Г идрохлорид	HAL-G-200-9	22.5	0.3	Комнатная	Форма II	Форма II
Мезилат	HAL-G-200-10	20.8	Крист.	Крист.
Тозилат	HAL-G-196-21	19.4			Крист.	Крист.
Фумарат	HAL-G-196-30	19.0			Крист.	Крист.

Исследование физико-химических свойств соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазии-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I).

Образец HAL-G-196-2 соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-ц]пиридин-3илэтинил)-4-метил-^(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный в среде тетрагидрофурана (ТГФ), по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 9) является индивидуальной кристаллической фазой. Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образце соли хлороводородной кислоты и свободного основания, полученном в среде этанола (образец HAL-G-196-1). Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 10). Необходимо отметить, что ¹Н ЯМР спектр образцов HAL-G-196-1 и HAL-G-196-2 содержит сигналы остаточных растворителей. Стехиометрическое соотношение аниона и катиона, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монохлорида. В результате ДСК анализа (см. фиг. 11) было обнаружено два эндотермических перехода - первый из них ^=139^) соответствует потере растворителя, а второй (Т=180^о0) - плавлению образца. В ходе ТГА анализа было обнаружено уменьшение массы образца на 3,6%, что, по-видимому, вызвано потерей остаточных количеств растворителя (см. фиг. 12). В ходе исследования гигроскопичности образца было показано, что образец HAL-G-196-2 предположительно является дигидратом, так как десорбируют и сорбирует воду, в количестве, соответствующем дигидрату (см. фиг. 13). Дальнейшие исследования образца были признаны нецелесообразными.

Исследование физико-химических свойств соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II).

Образец HAL-G-196-3 соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-ц]пиридин-3илэтинил)-4-метил-^(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный в среде ацетона после добавления метил-трет-бутиллового эфира (МТБЭ), по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 9) является индивидуальной кристаллической фазой отличной от кристаллической фазы образцов HAL-G-196-1 и HAL-G-196-2. Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 10). Стехиометрическое соотношение аниона и катиона, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монохлорида. В результате ДСК анализа (см. фиг. 11) было обнаружен один эндотермический переход (Т 190 C) соответствующей плавлению образца. В ходе ТГА анализа не было обнаружено потери массы образца. Кажущаяся растворимость образца HAL-G-196-3 в деионизированной воде составила около 3 мг/мл (см. табл. 2). Равновесная растворимость соли хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II) в деионизированной воде составила примерно 37,1 мг/мл по данным ВЭЖХ анализа (см. табл. 3). В ходе исследования гигроскопичности образца было показано, что образец HAL-G-196-3 адсорбирует менее 8 мас.% воды при относительной влажности воздуха 90% (см. фиг. 13). Содержание посторонних примесей остается постоянным при хранении образца в течение семи дней при температуре 60°C (см. табл. 4). Изучение стабильности образца HAL-G-196-3 при суспендировании в среде растворителя (ацетон) в течение 6 дней показало, что кристаллическая структура образца HAL-G-196-3 остается неизменной (см. табл. 5). Таким образом, соль хлороводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-ц]пиридин-3-илэтинил)4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида по своим физикохимических свойствам удовлетворяла целям, поставленным при оптимизации солевой формы.

- 14 032865

Исследование физико-химических свойств соли серной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида.

Образец HAL-G-196-6 соли серной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный в среде ацетона, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 14) содержит смесь кристаллических фаз, так как диффузный характер пиков и невозможность установить и описать дифрактограммы с использованием отражений фазы с одной элементарной ячейкой свидетельствовали о наличии нескольких кристаллических фаз и возможно значительной доли аморфной фазы в исследуемом образце. Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 15). Необходимо отметить, что 'И ЯМР спектр образца HAL-G-196-6 содержит сигналы остаточного растворителя. Стехиометрическое соотношение аниона и катиона, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование моносульфата. В результате ДСК анализа (см. фиг. 16) был обнаружен единственный эндотермический переход, соответствующей, по-видимому, потере растворителя. Отсутствие явного эндотермического перехода, соответствующего плавлению вещества, свидетельствует о значительной доли аморфной фазы в исследуемом образце. Кажущаяся растворимость соли серной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила около 1 мг/мл (см. табл. 2). Дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными ввиду низкой растворимости данной соли.

Исследование физико-химических свойств соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I).

Образец HAL-G-196-7 соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде этанола, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 17) является индивидуальной кристаллической фазой. Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 18). ¹Н ЯМР спектр образца HAL-G-196-7 содержит сигналы остаточного растворителя. Стехиометрическое соотношение аниона и катиона, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монобромида. В результате ДСК анализа (см. фиг. 19) было обнаружено два эндотермических перехода - первый из них (Т=129°С) соответствует потере растворителя, а второй (Т=190°С) - плавлению образца. В ходе ТГА анализа было обнаружено уменьшение массы образца на 1,7%, что по-видимому, вызвано потерей остаточных количеств растворителя (см. фиг. 20). Кажущаяся растворимость соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила около 5 мг/мл (см. табл. 2). Исследование гигроскопичности образца показало, что при относительной влажности воздуха 90% образец адсорбирует более десяти массовых процентов воды и расплываются на воздухе. По этой причине дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными.

Исследование физико-химических свойств соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II).

Образец HAL-G-196-8 соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде тетрагидрофурана (ТГФ), по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 17) является индивидуальной кристаллической фазой. Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образце соли бромоводородной кислоты и свободного основания, полученном кристаллизацией из ацетона (образец HAL-G-196-9). Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 18). ¹Н ЯМР спектр образцов HAL-G-196-8 и HAL-G-196-9 содержат сигналы остаточных растворителей. Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образцах HAL-G-196-8 и HALG-196-9, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монобромида. В результате ДСК анализа (см. фиг. 19) был обнаружен эндотермический переход (Т=224°С) соответствующий плавлению образца. В ходе ТГА анализа не было обнаружено потери массы образца. Кажущаяся растворимость соли бромоводородной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилЫ-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила менее 1 мг/мл (см. табл. 2). Дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными ввиду низкой растворимости данной соли.

Исследование физико-химических свойств соли фосфорной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Образец HAL-G-196-13 соли фосфорной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде этанола по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 21) является индивидуальной кристаллической фазой. Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопией (см. фиг. 22). ¹Н ЯМР спектр образца HAL-G-196-13 содержит сигналы остаточного растворите

- 15 032865 ля. Стехиометрическое соотношение аниона и катиона, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование дигидрофосфата. В результате ДСК анализа (см. фиг. 23) было обнаружено два эндотермических перехода - первый из них (Т=131°С) соответствует потере растворителя, а второй (Т=235°С) - плавлению образца. В результате ТГА анализа было обнаружено уменьшение массы образца на 3%, что, по-видимому, вызвано потерей остаточных количеств растворителя (см. фиг. 24). Повидимому, образец HAL-G-196-13 является сольватом, содержащим этанол в кристаллической структуре, что было подтверждено данными порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 21). Дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными ввиду содержания растворителя в кристаллической структуре данной соли.

Исследование физико-химических свойств соли винной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин3 -илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида.

Образец HAL-G-196-16 соли винной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде этанола, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 25) является индивидуальной кристаллической фазой. Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образце соли винной кислоты и свободного основания, полученном кристаллизацией в среде ТГФ (образец HAL-G-196-17). Структура соединения была подтверждена методом 'Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 26). 'Н ЯМР спектр образцов HAL-G-196-8 и HAL-G-196-9 содержат сигналы остаточных растворителей. Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образцах HAL-G-196-16 и HAL-G-196-17, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монотартрата для каждого из образцов. В результате ДСК анализа (см. фиг. 27) был одни обнаружен эндотермический переход (Т=161°С) соответствующей потере растворителя и плавлению образца. В результате ТГА анализа образца HAL-G-196-16 было обнаружено уменьшение массы образца на 0,8% в температурном диапазоне 30-100°С и затем еще дополнительная потеря массы в 0,7% в температурном диапазоне 130-170°С, что по-видимому, вызвано частичным разложением образца (см. фиг. 28). По-видимому, образец HAL-G-196-16 является сольватом, содержащим этанол в кристаллической структуре, что было подтверждено данными порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 25). Дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными ввиду содержания растворителя в кристаллической структуре данной соли.

Исследование физико-химических свойств соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Образец HAL-G-196-21 соли метансульфокислоты кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде ацетона, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 29) является индивидуальной кристаллической фазой, что было так же подтверждено поляризационной микроскопией (см. фиг. 30). Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образцах соли метансульфокислоты и свободного основания, полученных кристаллизацией в среде ТГФ (образец HAL-G-196-20) и этанола (образец HAL-G-196-19). Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 31). Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образцах HAL-G-196-19, HAL-G-19620 и HAL-G-196-21, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование мономезилата для каждого из образцов. В результате ДСК анализа данных образцов (см. фиг. 32) был обнаружен один эндотермический переход (Т=220°С) соответствующий плавлению образца. В ходе ТГА анализа не было обнаружено потери массы образца. Исследование гигроскопичности образца соли метансульфокислоты кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида показало, что при относительной влажности воздуха 90% образец адсорбирует менее двух массовых процентов воды. Кажущаяся растворимость свободного основания в деионизированной воде составила более 46 мг/мл (см. табл. 2). Равновесная растворимость соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила более 100 мг/мл по данным ВЭЖХ анализа (см. табл. 3). Содержание посторонних примесей остается постоянным при хранении образца в течение семи дней при температуре 60°С (см. табл. 4). Изучения стабильности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида под действием обработки растворителем (ацетоном) в течение 6 дней показало, что кристаллическая структура образца остается неизменной (см. табл. 5). Таким образом, соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида по своим физико-химических свойствам удовлетворяла целям, поставленным при оптимизации солевой формы.

Исследование физико-химических свойств соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Х-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида.

Образец HAL-G-196-24 соли 4-метилбензолсульфокислоты кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде ацетона, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см.

- 16 032865 фиг. 33) является индивидуальной кристаллической фазой, что было так же подтверждено поляризационной микроскопией (см. фиг. 34). Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образцах соли 4-метилбензолсульфокислоты и свободного основания, полученных кристаллизацией в среде ТГФ (образец HAL-G-196-23). Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 35). Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образцах HAL-G-196-23 и HAL-G-196-24, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монотозилата для каждого из образцов. В результате ДСК анализа образца HAL-G-196-24 (см. фиг. 36) был обнаружен одни эндотермический переход (Т=184°С) соответствующей плавлению образца. В результате ТГА анализа не было обнаружено потери массы образца. Исследование гигроскопичности образца показано, что при относительной влажности воздуха 90% образец HAL-G-196-24 адсорбирует менее четырех массовых процентов воды (см. фиг. 37). Кажущаяся растворимость свободного основания в деионизированной воде составила менее 1 мг/мл (см. табл. 2). Равновесная растворимость соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила 2,2 мг/мл по данным ВЭЖХ анализа (см. табл. 3). Содержание посторонних примесей остается постоянным при хранении образца в течение семи дней при температуре 60°С (см. табл. 4). Изучения стабильности соли 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-И-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида под действием обработки растворителем (ацетоном) в течение 6 дней показало, что кристаллическая структура образца остается неизменной (см. табл. 5). Таким образом, соль 4-метилбензолсульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида по своим физико-химических свойствам удовлетворяла целям, поставленным при оптимизации солевой формы.

Исследование физико-химических свойств соли яблочной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Образец HAL-G-196-25 соли яблочной кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде этанола, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 38) является индивидуальной кристаллической фазой. Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образцах соли яблочной кислоты и свободного основания, полученном кристаллизацией в среде ТГФ (образец HAL-G-196-26). Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 39). Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образцах HAL-G-196-19, HAL-G-196-25 и HAL-G-196-26, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование мономалата для каждого из образцов. ¹Н ЯМР спектр образца HAL-G-196-25 содержит сигналы остаточного растворителя. В результате ДСК анализа (см. фиг. 40) было обнаружено два эндотермических перехода - первый из них (Т=128°С) соответствует потере растворителя и плавлению образца, а второй (Т=205°С) последующему разложению образца. В результате ТГА анализа было обнаружено уменьшение массы образца на 2% в температурном диапазоне 80-130°С, что, по-видимому, вызвано потерей остаточных количеств растворителя при плавлении соли (см. фиг. 41). Последующая потеря массы, по-видимому, связана с разложением расплавленного образца. На основании проведенных исследований было сделано предположение, что образец HAL-G-196-25 представляет собой сольват. Дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными ввиду содержания растворителя в кристаллической структуре данной соли.

Исследование физико-химических свойств соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (монофумарат).

Образец HAL-G-196-28 соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, полученный в среде этанола, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 42) является индивидуальной кристаллической фазой. Структура соединения была подтверждена методом ¹Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 43). Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образце HAL-G-196-28, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование монофумарата. ¹Н ЯМР спектр образца HALG-196-28 содержит остаточные сигналы растворителя. В результате ДСК анализа (см. фиг. 44) был обнаружен один эндотермический переход (Т=148°С) соответствующий потере растворителя и плавлению соли, которое возможно сопровождается частичным разложением образца. В результате ТГА анализа было обнаружено уменьшение массы образца на 3,5% в температурном диапазоне 95-170°С, что, повидимому, вызвано потерей остаточных количеств растворителя при плавлении соли (см. фиг. 45). На основании проведенных исследований было сделано предположение, что образец HAL-G-196-28 представляет собой сольват. Дальнейшие исследования образца были признаны не целесообразными ввиду содержания растворителя в кристаллической структуре данной соли.

- 17 032865

Исследование физико-химических свойств соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-М-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида(геми-фумарат).

Образец HAL-G-196-29 соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида, полученный кристаллизацией в среде ТГФ, по данным порошковой рентгеновской дифракции (см. фиг. 42) является индивидуальной кристаллической фазой, что было так же подтверждено поляризационной микроскопией (см. фиг. 46). Та же кристаллическая фаза была обнаружена в образцах соли фумаровой кислоты и свободного основания, полученном кристаллизацией в среде ацетона (образец HAL-G-196-30). Структура соединения была подтверждена методом 'Н ЯМР спектроскопии (см. фиг. 43). Стехиометрическое соотношение аниона и катиона в образцах HAL-G-196-29 и HAL-G-196-30, определенное методом ионной хроматографии, подтверждает образование геми-фумарата. В результате ДСК анализа образца HAL-G-196-29 (см. фиг. 44) был обнаружен одни эндотермический переход (Т=244°С) соответствующей плавлению образца. В результате ТГА анализа было обнаружено уменьшение массы образца примерно на 1%, что, по-видимому, вызвано потерей остаточных количеств растворителя (см. фиг. 45). Исследование гигроскопичности образца соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилИ-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида показано, что при относительной влажности воздуха 90% образец адсорбирует менее четырех массовых процентов воды. Кажущаяся растворимость соли фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила менее 1 мг/мл (см. табл. 2). Равновесная растворимость соли фумаровой и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в деионизированной воде составила 7,4*10^-3 мг/мл по данным ВЭЖХ анализа (см. табл. 3). Содержание посторонних примесей остается постоянным при хранении образца в течение семи дней при температуре 60°С (см. табл. 4). Изучение стабильности соли соли фумаровой и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида под действием обработки растворителем (ацетоном) в течение 6 дней показало, что кристаллическая структура образца остается неизменной (см. табл. 5). Таким образом, соль фумаровой кислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида по своим физико-химических свойствам удовлетворяла целям, поставленным при оптимизации солевой формы.

Результаты оптимизация солевой формы 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Таким образом, в ходе проведенных исследований по оптимизации солевой формы 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида было изучено более 50 образцов различных солевых форм, содержащих 12 противоионов и полученных с использованием 4 различных растворителей. На основании проведенных исследований было показано, что соли четырех кислот (хлороводородной кислоты, метансульфокислоты, 4-метилбензолсульфокислоты и фумаровой кислоты) обладают благоприятными физикохимическими свойствами, т.е. обладают кристалличностью, высокой растворимостью в воде по сравнению со свободным основанием, а также высокой чистотой при получении и температурной стабильностью. Кроме того, данные соли могут быть получены в малотоксичных органических растворителях, по легко масштабируемой методике и содержат фармакологически приемлемый анион.

Однако указанные соли существенно различаются по растворимости в воде: например, растворимость соли фумаровой кислоты (7,4*10^-3 мг/мл) сопоставима с растворимостью свободного основания (2,3*10^-4 мг/мл); растворимость солей 4-метилбензолсульфокислоты (2,4 мг/мл), хлороводородной кислоты (37,1 мг/мл) и метансульфокислоты (более 100 мг/мл) более чем в 10000 раз превосходит растворимость 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида в форме свободного основания. При этом только соль метансульфокислоты может быть получена кристаллизацией из ацетона или этанола без добавления метил-третбутилового эфира или дополнительного охлаждения раствора ниже комнатной температуры.

Таким образом, на основании проведенного исследования было установлено, что предпочтительной кристаллической солевой формой 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, которая может быть получена в малотоксичных органических растворителях, по легко масштабируемой методике и содержащей фармакологически приемлемый анион, обладающей кристалличностью, высокой растворимостью в воде, является соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Получение и характеризация полиморфных модификаций соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида.

- 18 032865

Примеры

С целью дальнейшего изучения соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида была разработана методика ее получения. В ходе разработки методики было обнаружено, что соль метансульфокислоты и 3-( 1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида может существовать в двух полиморфных модификациях. Обнаруженные нами различия в образовании этих фаз сводятся к тому, что в некоторых случаях получения мезилата 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида в ацетоне, не происходит самопроизвольного образования осадка. В результате соль выкристаллизовывается из более концентрированного раствора. Однако нужно заметить, что в этом случае так же может образовываться смесь фаз или любая индивидуальная фаза. Обе полиморфные модификации были подвергнуты анализу методом порошковой рентгеновской дифрактометрии с целью исследования кристалличности структуры. Дифрактограммы образцов соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида были получены при 25°C (±5°C) и относительной влажности воздуха ~70% на порошковом рентгеновском дифрактометре Bruker D8 Advance в геометрии Брэгг-Брентано (напряжение на аноде 40 кВ, ток 40 мА), оснащенном никелевым фильтром (излучение CuKa1, длина волны = 1,5406 А) и позиционно-чувствительным детектором LynxEye, шаг съемки 0.02° 2θ, угловой диапазон 4-65° 2θ. Уточнение полученных дифрактограмм проводилось в программном пакете Bruker TOPAS5.

Синтез 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)3 -трифторметилфенил)бензамида.

К перемешиваемому раствору ацетиленового производного (43,6 г, 0,105 моль) и 3-бром[1,2,4]триазоло[4,3-а]пиридина (19,8 г, 0.1 моль) в 350 мл безводного, дегазированного ДМФА прибавляют 14,6 мл (0,105 моль) безводного, дегазированного триэтиламина, тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (11,5 г, 0,01 моль, 10 мол.%) и йодида меди(1) (1,9 г, 0,01 моль, 10 мол.%). Реакционную смесь повторно дегазируют и перемешивают в атмосфере аргона при 80°C в течение 12 ч. Растворитель частично удаляют в вакууме (при температуре 50-60°C) до объема реакционной смеси около 200 мл. К реакционной смеси прибавляют 10% раствор гидроксида натрия (400 мл) и разбавляют водой до 3-4 л. Осадок отфильтровывают, промывают водой (5*200 мл), растворяют в 2 л 20% этанола в дихлорметане, прибавляют сульфат натрия, силикагель и активированный уголь. Полученную смесь перемешивают 30 мин и фильтруют через слой целита. Дихлорметан удаляют в вакууме, к остатку прибавляют воду, осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом, сушат, растворяют в этаноле и обрабатывают модифицированным силикагелем в течение 12 ч при 60°C (трижды). Этанол удаляют в вакууме и сушат. Выход: ~50%.

Синтез соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I).

Суспензию 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метил-пиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (53,2 г, 0,10 моль) в ацетоне (1050 мл, из расчета 20 мл на грамм) нагревают до кипения и при энергичном перемешивании кипятят 10 мин. Затем прибавляют одной порцией, не прекращая нагревания и перемешивания, свежеприготовленный (непосредственно перед прибавлением) раствор метансульфокислоты (10,1 г, 0,105 моль) в 200 мл этанола (количество этанола рассчитывается так, чтобы полученный раствор имел концентрацию 0,5 моль/л). Реакционную смесь кипятят в течение 15 мин, после чего охлаждают до 20°C со скоростью приблизительно 10°CM, после чего оставляют на 12 ч при температуре 10°C для кристаллизации и созревания осадка. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ацетоном (3*150 мл) и сушат в шкафу при температуре 60°C до постоянной массы. Выход: 85-90%.

Спектр ЯМР ^!Н (500 МГц, DMSO-d₆): 2.36-2.45 (м, 1Н, Н_{пиперазин}), 2.41 (с, 3Н, Me), 2.67 (с, 3Н, Me), 2.86 (с, 3Н, Me), 2.94 (д, J=11.2 Гц, 1Н, Нпиперазин), 3.08 (т, J=10.7 Гц, 1Н, Нпиперазин), 2.94 (д, J=10.7 Гц, 1Н, Нпиперазин), 4.06 (C, 2Н, C Г 7.24 (т, J=6.8 Гц, 1Н, Н^), 7.53-7.63 (м, 2Н, Н^), 7.73 (д, J=8.6 Гц,

1Н, Н(аром.)), 7.96 (д, J=9.2 Гц, 1Н, Н^), 8.03 (дд, J1=8.6 Гц, J₂=1.6 Гц, 1Н, Н^), 8.12 (д, J=8.6 Гц, 1Н, Н(аром.)), 8.25 (с, 1Н, Н(аром.)), 8.40 (C, 1Н, Н(аром.)), 8.65 (д, J=6.8 1Н, Н(аром.)), 10.60 (C, 1Н, Х11_:..).

Масс-спектр, m/z: 533,2263.

Спектры ЯМР 'Н и ¹³С соли метансульфокислоты и основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I) приведены на фиг. 47.

Синтез соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метиппиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II).

Суспензию 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (17,73 г, 0,033 моль) в 350 мл ацетона нагревают до кипения и при энергичном перемешивании кипятят 10 мин. Затем прибавляют одной порцией, не прекращая нагревания и перемешивания, свежеприготовленный (непосредственно перед прибавлением) раствор метансульфокислоты (3,36 г, 0,035 моль) в 70 мл этанола. Реакционную смесь кипятят в течение 15 мин,

- 19 032865 после чего охлаждают до 20°C, при этом образования осадка не происходит. Раствор упаривают при пониженном давлении до половины начального объема и оставляют на сутки при температуре 20-25°C. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ацетоном (3*150 мл) и сушат в шкафу при температуре 45°C до постоянной массы. Выход: 85-90%.

Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO-d₆): 2.35-2.43 (м, 1H, Н_{пиперазин}), 2.41 (с, 3H, Me), 2.66 (с, 3H, Me), 2.87 (с, 3H, Me), 2.95 (д, J=11.3 Гц, 1H, Нпиперазин), 3.10 (т, J=10.5 Гц, 1H, Нпиперазин), 2.94 (д, J=10.5 Гц, 1H, Нпиперазин), 4.05 (с, 2H, С^бетил)), 7.26 (т, J=6.9 Гц, 1H, H^h.)), 7.52-7.61 (м, 2H, H_(apoM.₎), 7.73 (д, J=8.6 Гц, 1H, Наром.)), 7.96 (д, J=9.1 Гц, 1H, H^m.)), 8.03 (дд, J1=8.6 Гц, J₂=1.6 Гц, 1H, И^м.)), 8.12 (д, J=8.6 Гц, 1H, Паром.)), 8.27 (с, 1H, H^m.)), 8.41 (с, 1H, H^cm.)), 8.65 (д, J=6.9 1H, H^m.)), 10.62 (с, 1H, N11._1λΙΙΗ).

Масс-спектр, m/z: 533,2268.

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соли метансульфокислоты и основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II) приведены на фиг. 48.

Исследование кристалличности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I).

Образец соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-М-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I) представляет собой индивидуальную кристаллическую фазу со следующими параметрами элементарной ячейки: а=51,46±0,05 А; Ь=7,81±0,05А и е=7,63±0,05А, β=108,9±0,1°, V=2898,9±0,5 А³. Пространственная группа P2₁/n. Объем независимой части отвечал одной формульной единице (см. фиг. 49а). Положения и интенсивности характеристических, визуально различимых пиков в дебаеграмме образца представлены в табл. 6. Общий вид независимой части элементарной ячейки соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-М-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида в полиморфной модификации I представлена на фиг. 50а.

Таблица 6. Положения и интенсивности характеристических, визуально различимых пиков в дебаеграмме образца гидрата соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-М(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I)

Положение пика (2Θ)	Относительная интенсивность	Положение пика (2Θ)	Относительная интенсивность	Положение пика (2Θ)	Относительная интенсивность
1	2	3	4	5	6
3,6	10,9	25,4	68,6	40,2	3,7
7,2	8,0	25,9	17,9	40,5	1,2
10,8	4,6	26,0	14,0	40,9	0,7
11,4	9,0	26,2	11,3	41,9	3,8
11,8	19,3	26,4	4,2	42,2	2,2
12,5	8,9	26,7	14,3	42,4	2,3
12,9	1,3	27,1	41,9	42,7	1,5
13,4	7,3	28,0	2,1	44,0	0,6
14,5	42,8	28,0	2,1	44,5	1,8
14,9	4,4	28,4	7,2	45,8	1,7
16,2	19,2	29,2	3,2	46,9	2,4
16,5	9,9	30,0	2,6	47,2	1,4
16,9	66,7	30,4	1,7	47,6	1,4
17,2	42,2	31,4	3,3	47,9	1,3
17,4	30,3	31,6	1,6	48,3	2,6
17,8	7,3	32,1	2,8	48,8	1,8
18,1	6,3	32,5	1,5	49,4	1,1
18,4	13,0	33,0	5,4	50,3	1,7
18,7	100,0	33,3	5,4	51,1	0,9
19,3	1,4	33,6	1,8	51,4	2,0

- 20 032865

19,7	4,2	34,2	1,9	52,2	0,9
20,3	2,8	34,5	2,4	52,5	1,3
20,8	49,7	34,9	1,3	53,5	1,2
21,4	9,4	35,4	4,7	53,9	1,5
21,8	1,6	35,8	0,9	54,4	0,6
22,7	17,3	36,1	1,8	54,8	0,9
22,8	14,4	36,3	3,5	55,0	0,8
23,0	25,4	36,7	5,7	55,4	1,0
23,2	17,0	37,1	3,5	55,9	1,2
23,4	12,3	37,9	0,6	56,2	0,8
23,6	4,2	38,4	2,5	56,4	0,9
23,8	2,5	38,7	1,1	57,2	1,3
24,1	11,3	38,9	1,8	59,4	0,9
24,5	7,9	39,4	1,6

Интенсивности представляют собой высоты (с поправкой на фон) пиков. Положения отвечают максимумам на дифрактограмме, а не расчетным положениям отражений.

Исследование кристалличности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II).

Исследования кристалличности образца соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II) методом порошковой порошковой рентгеновской дифракции показали, что образец представляет собой индивидуальную кристаллическую фазу со следующими параметрами элементарной ячейки: a=13,77±0,05 A; b=8,09±0,05 А и c=30,83±0,05 А, β=117.8±0,1, V=3036,36 ±0,5 А³ и пространственной группой P2₁/c (см. фиг. 49б). Положения и интенсивности характеристических, визуально различимых пиков в дебаеграмме образца соли представлены в табл. 7. Общий вид независимой части элементарной ячейки соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в полиморфной модификации II представлена на фиг. 50б.

- 21 032865

Таблица 7. Положения и интенсивности характеристических, визуально различимых пиков в дебаеграмме образца гидрата соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация II)

Положение пика (2Θ)	Относительная интенсивность	Положение пика (2Θ)	Относительная интенсивность	Положение пика (2Θ)	Относительная интенсивность
1	2	3	4	5	6
6.5	1.8	29.6	8.3	43.1	2.9
7.1	8.4	29.7	4.1	43.5	1.3
7.3	8.3	30.1	10.3	43.8	1.2
11.4	4.6	30.4	2.9	44.0	1.0
11.6	11.1	30.9	1.1	44.2	0.9
11.8	19.1	31.1	2.2	44.6	0.9
12.7	10.7	31.3	1.2	45.0	1.9
12.9	9.3	31.8	0.7	45.4	1.4
13.1	12.7	31.9	0.6	45.6	1.3
14.2	20.2	32.1	4.2	45.7	1.6
14.3	4.4	32.4	3.3	45.8	1.7
14.6	22.2	32.5	1.8	46.1	2.0
15.9	0.6	32.8	1.2	46.4	1.0
16.9	17.0	33.0	0.9	46.8	1.3
17.2	19.7	33.6	1.9	47.0	1.5
17.4	63.5	33.8	0.8	47.4	1.9
17.6	32.6	34.2	1.4	47.6	1.4
18.1	19.7	34.4	1.5	47.8	0.7
18.3	10.4	34.5	2.3	48.1	1.7
18.5	4.5	34.8	3.4	48.3	1.1
19.4	29.9	35.0	3.3	48.6	1.0
19.7	32.9	35.2	1.2	48.9	1.5
20.6	3.6	35.4	0.8	49.2	0.9
20.8	7.8	35.7	2.6	49.4	0.7
21.2	100.0	35.8	3.5	49.6	1.5
21.6	12.0	36.2	0.8	49.9	0.4
22.0	40.8	36.5	4.0	50.1	0.5
22.3	1.3	37.0	3.1	50.3	0.6
22.5	10.6	37.1	1.6	50.6	0.6
22.6	31.6	37.2	1.3	51.0	0.4
22.9	4.2	37.4	1.2	51.5	0.8
23.2	21.5	37.6	1.3	51.8	0.5
23.4	8.3	37.9	1.8	52.1	0.6
23.5	2.0	38.1	0.5	52.7	1.5 '
23.6	2.0	38.4	0.9	53.0	1.2
23.8	12.1	38.7	1.8	53.4	1.0
24.1	2.0	38.9	1.0	53.5	1.1
24.6	2.0	39.4	1.8	53.6	1.2
24.9	9.3	39.7	1.8	53.9	1.0
25.1	7.0	39.8	1.5	54.2	1.4
25.4	3.4	40.1	1.8	54.5	1.2

25.6	8.0	40.3	0.4	54.7	1.3
25.9	26.7	40.6	0.8	54.9	1.1
26.1	18.8	40.7	1.2	55.2	1.3
26.4	1.8	41.0	0.9	55.8	0.6
26.6	14.5	41.2	1.7	56.3	0.6
26.9	2.1	41.3	1.7	56.5	0.8
27.3	0.7	41.6	0.6	56.7	0.7
27.4	1.7	41.9	1.0	57.0	0.6
28.3	5.8	41.9	1.0	57.5	0.4
28.7	2.1	42.1	0.4	57.8	0.4
28.8	9.3	42.5	2.4	58.1	0.4
29.0	1.1	42.8	3.3

Интенсивности представляют собой высоты (с поправкой на фон) пиков. Положения отвечают максимумам на дифрактограмме, а не расчетным положениям отражений.

- 22 032865

Исследование кинетики растворения свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида и полиморфных модификаций соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида.

В ходе дальнейшего изучения свойств полиморфных модификаций соли метансульфокислоты и 3(1,2,4-триазоло [4,3-a]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида была исследована кинетика растворения свободного основания и двух синтезированных полиморфных модификаций солевой формы. Исследование кинетики растворения проводили на аппарате Вращающаяся корзинка объем среды растворения - 700 мл, температура -37±1°C. Скорость вращения лопастных мешалок - 100 об/мин. Скорость растворения исследуемого образца рассчитывали как среднее из шести повторов. В качестве среды растворения для полиморфных модификаций соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида использовали дистиллированную воду, а для свободного основания раствор 12,2 мл метансульфокислоты в 500 мл воды. Для растворения использовались навески содержащие 100 мг 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида или 118 мг соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3щ]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида (100 мг в пересчете на свободное основание). Через 780 мин (13 ч) после начала эксперимента было проведено измерение pH полученных растворов. Раствор полученный при растворении свободного основания имел более кислый pH (4,02) по сравнению с растворами полученными при растворении полиморфных модификаций соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (5,04 - для полиморфной модификации I и 4,95 - для полиморфной модификации II).

Результаты исследования кинетики растворения приведены на фиг. 51. Как видно из приведенных данных 95% 3-(1,2,4-триазоло [4,3щ]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)3-трифторметилфенил)бензамида, содержащегося в образцах соли метансульфокислоты и 3-( 1,2,4триазоло [4,3щ]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамид переходит в раствор менее чем за 1 мин, а полное растворение соли происходит менее чем за 4 мин. В то же время при растворении свободного основание за 780 мин (13 ч) не удалось добиться 90% растворения свободного основания в растворе, содержащем 12,2 мл метансульфокислоты.

Таким образом, на основании проведенных исследований по синтезу и определению кристаллической структуры соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида было показано, что данное соединение может существовать как минимум в двух полиморфных модификациях, каждая из которых может быть получена в малотоксичных органических растворителях, по легко масштабируемой методике и содержит фармакологически приемлемый анион, обладает кристалличностью, высокой растворимостью в воде. Химическая структура катиона в обеих полиморфных модификациях совпадает и соответствует катиону 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида, оба соединения представляют собой соли метансульфокислоты и содержат протонированную форму 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида и мезилатанион. Протонирование 3(1,2,4-триазоло [4,3щ]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метил-пиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида в обеих полиморфных модификациях идет по атому азота пиперазинового цикла, несущего на себе метильную группу. Обе полиморфные модификации не содержат молекул растворителя. Отличия в строении полиморфных модификаций наблюдаются главным образом во взаимном расположении ароматического гетероцикла относительно остальной молекулы (см. фиг. 50).

Исследование фармакокинетических характеристик свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3щ]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида.

Для анализа применимости солевой формы 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метилИ-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в качестве лекарственного препарата было проведено исследование ее фармакокинетических параметров. Поскольку полиморфные модификации соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида обладают значительно лучшей кинетикой растворения по сравнению со свободным основанием, можно ожидать, что фармакокинетические параметры свободного основания и соли будут существенно различаться. Максимальная (C_max) и средняя (AUC_t/t) концентрации вещества в плазме крови животных для большинства соединений коррелирует с растворимостью солевой формы, использованной для введения вещества экспериментальным животным; а время достижения максимальная концентрация вещества (T_max) в плазме крови, как правило, находится в обратной зависимости от скорости растворения использованных солевых форм. Таким образом, на основании изучения физико-химических свойств можно было бы ожидать, что максимальная (C_max) и сред- 23 032865 няя (AUC_t/t) концентрации 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в плазме крови животных будут выше, а время достижения максимальная концентрация (T_max) - ниже, при введении животным соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида по сравнению с введением свободного основания.

Была изучена фармакокинетика 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида после однократного перорального введения свободного основания в дозе 50 мг/кг и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I) в дозе 59 мг/кг (50мг/кг в пересчете на свободное основание) мышам линии C57BL/6 в дозе 50 мг/кг. Результаты исследования приведены на фиг. 52 и в табл. 8 и 9.

Таблица 8. Основные фармакокинетические параметры 23-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида при введении в виде свободного основания мышам линии C57BL/6 в дозе 50 мг/кг

Tl/2	Tmax	Стах	AUCo-24	AUCq.24/24	AUC0.
(ч)	(ч)	(нг/мл)	(нгч/мл)	(нг/мл)	(нг-ч/мл)
2.4	2	1490	10856	452	10868

Для каждой временной точки средние значения определены на основе индивидуальных данных полученных от трех животных.

Таблица 9. Основные фармакокинетические параметры 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида при введении в виде соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I)* мышам линии C57BL/6 в дозе 59 мг/кг (50 мг/кг в пересчете на свободное основание)

т1/2	Tmax	Стах	AUCq-24	AUC0.24/24	AUCo-
(ч)	(ч)	(нг/мл)	(нгч/мл)	(нг/мл)	(нгч/мл)
3.8	4	1099	11933	497	12103
Примечание: При введении солевой форы в виде полиморфной модификации II не было обнаружено статистически достоверных отличий по всем исследованным фармакокинетическим параметрам (р<0,05)

Для каждой временной точки средние значения определены на основе индивидуальных данных полученных от трех животных.

В результате исследования фармакокинетики неожиданно оказалось, что при введении свободного основания максимальная концентрации 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (C_max=1490 нг/мл) в плазме крови животных более чем на треть превышает максимальную концентрацию (C_max=1099 нг/мл), обнаруженную после введения солевой формы. Более того, несмотря на существенное превосходство солевой формы над свободным основанием по скорости растворения, время достижения максимальной концентрации (T_max) для солевой формы в два раза выше чем для сводобного основания. Важно подчеркнуть, что несмотря на меньшую максимальную концентрацию 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в плазме крови после перорального введения солевой формы, введение солевой формы обеспечивает несколько большие значения средней (AUCt/t) концентрации вещества.

Таким образом, в результате исследования фармакокинетических параметров свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида неожиданно оказалось, что их фармакокинетические профили существенно различаются. Указанные различия фармакокинетических параметров, по-видимому, не могут быть надежно предсказаны исходя из данных оптимизации солевой формы на основе существующего уровня техники. При этом указанные различия потенциально могут изменить терапевтическую эффективность, безопасность применения и/или другие свойства лекарственного кандидата. Для дальнейшей оценки пригодности разработанной солевой формы 3-(1,2,4-триазоло[4,3a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида были проведены исследования острой токсичности и эффективности свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

- 24 032865

Исследование безопасности свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида в экспериментах по изучению острой токсичности соединений.

С целью исследования безопасности применения свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида были проведены исследования острой токсичности указанных веществ.

Исследование острой токсичности свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3илэтинил)-4-метил-К-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида и его соли с метансульфокислотой проводили с использованием самцов мышей линии CD-1 возрастом 2-3 месяца. Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по 6 животных. В исследование были включены аналогичные по численности группы контрольных животных, которым вводили эквивалентные объемы растворителя - 0,5% водного раствора метилцеллюлозы. Период последующего наблюдения составлял 28 суток. Анализ показателя выживаемости экспериментальных мышей позволил провести пробит-анализ и установить летальные дозы исследуемых препаратов. Результаты исследования острой токсичности и рассчитанные полулетальные дозы для свободного основания и соли метансульфокислоты приведены в табл. 10.

Таблица 10. Летальные дозы 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида при введении в виде свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (полиморфная модификация I) мышам самцам

	Доза без наблюдаемых эффектов, мг/кг	ЛДю, мг/кг	ЛДбо. мг/кг	ЛДэо> мг/кг
Свободное основание (3-(1,2,4триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамид)	160	504	677 1 55	850
Соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-М-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида	400 (338*)	600 (508*)	14001200 (11861169*)	2200 (1864*)
	* В скобках приведены доз, в пересчете на свободное основание

Как видно из приведенных данных полулетальные дозы (ЛД₅₀ - дозы, вызывающие гибель половины животных испытуемой группы) для соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3илэтинил)-4-метил-К-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида примерно в двое превосходят полулетальные дозы для свободного основания. Аналогичный, но более выраженный эффект наблюдается для доз, вызывающих гибель 90% животных из испытуемой группы (см. табл. 10). Введение 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида, как в виде свободного основания, так и в виде солевой формы вызывало схожие признаки интоксикации животных: одышка, гиподинамия, взъерошенная шерсть, диарея, вздутие живота, у некоторых животных - очаговая аллопеция; однако при введении вещества в виде соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида доза, не приводящая к развитию наблюдаемых эффектов была в два раза выше.

Таким образом, в результате исследования безопасности применения свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида неожиданно оказалось, что применение солевой формы характеризуется существенно большей безопасностью применения, что выражается в увеличении дозы 3(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида (в пересчете на свободное основание), которая при введении в организм экспериментальных животных не вызывает наблюдаемых эффектов, а также почти в двукратном увеличении полулетальной дозы солевой формы по сравнению со свободным основанием. Благоприятный профиль безопасности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4метил-К-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида делает данную солевую форму более перспективным лекарственным кандидатом по сравнению с свободным основанием.

Исследование эффективности свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло[4,3-a]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида в модели BCR/ABL-индуцированного хронического миелолейкоза.

- 25 032865

С целью оценки эффективности применения свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилФ(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида для лечения хронического миелолейкоза (ХМЛ) были выполнены исследования активности соединений в модели BCR/ABL-индуцированного ХМЛ-подобного заболевания у мышей. В исследовании использовали мышей линии C57BL/6N, получивших сублетальную дозу радиации с внутривенной трансплантацией донорских 8еа1+ клеток костного мозга, экспрессирующих р185T315I^bcr/abl за счет ретровирусной трансдукции. Лечение начинали на 11-й день после трансплантации клеток экспрессирующих р 185-Т31 5i^bcr/abl

Была изучена эффективность терапии 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилФ(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамидом при пероральном введении в виде свободного основания и соли метансульфокислоты. Результаты изучения влияния перорального введения свободного основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилФ(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида (в дозе 50 мг/кг), соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилФ(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида (в дозах 8,5; 21; 34 и 50 мг/кг в пересчете на свободное основание) на среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных приведены в табл. 11.

Как видно из приведённых данных, введение 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, как в форме свободного основания, так и в виде солевой формы, приводит к увеличению средней продолжительности жизни животных. При этом при введении соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метилФ(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида наблюдается выраженная зависимость средней продолжительности жизни мышей от дозы солевой формы. Введение соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилФ(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в дозе 40 мг/кг (34 мг/кг в пересчете на свободное основание) оказывает такой же терапевтический эффект, как и введение 50 мг/кг свободного основания. Введение соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в дозе 59 мг/кг (50 мг/кг в пересчете на свободное основание) обеспечивает почти двукратное увеличение продолжительности жизни животных по сравнению с контрольной группой. По данному показателю эффективность солевой формы превосходит эффективность свободного основания.

Таблица 11. Влияние свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилФ(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида на среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных в модели BCR/ABLиндуцированного хронического миелолейкоза

Исследуемое вещество	Доза, мг/кг	Средняя продолжительность жизни, ДНИ
Контроль (растворитель)	0	55,0 ±6,3
Свободное основание 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-М-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамид	50	93,0 ±6,1
Соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло[4,3-а]пиридин-3-ил этинил )-4-метилЫ-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметил-фенил)бензамида	10(8,5)	65,5 ±6,7
25 (21)	73,9 ±7,1
40 (34)	90,3 ±6,9
59 (50)	104,5 ±5,2
* В скобках приведены значения в пересчете на свободное основание

Таким образом, в результате исследования эффективности применения свободного основания и соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида неожиданно оказалось, что применение солевой формы характеризуется большей эффективностью применения, что выражается в достоверно большей средней продолжительности жизни животных в группе, получавшей солевую форму препарата, по сравнению с группой, получавшей эквивалентную дозу свободного основания. Таким образом, более высокая эффективность соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метилФ(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида делают данную солевую форму более перспективным лекарственным кандидатом по сравнению с свободным основанием.

Исследование биологической активности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Биологическая активность соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метилФ(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида, а также её кристаллических форм, являющихся предметом настоящего изобретения, была изучена в разных экспе

- 26 032865 риментах.

Исследование влияния соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-И-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида на ферментативную активность киназ человека.

Соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-И-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в наномолярном диапазоне концентраций ингибирует тирозинкиназу Bcr-Abl, включая клинически важные мутантные формы этого фермента. Результаты экспериментов по ингибированию киназ Bcr-Abl суммированы в табл. 12. Концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) Bcr-Abl дикого типа для соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-К-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3трифторметилфенил)бензамида составляла 0,49-3,1 нМ (по результатам 3 независимых экспериментов). IC₅₀ Bcr-Abl с мутацией T315I составила 0,78-21 нМ (по результатам 3 независимых экспериментов). Таблица 12. Влияние соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метилК-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида на ферментативную активность тирозинкиназы Bcr-Abl, включая клинически важные мутантные формы этого фермента

Киназа	IC50, нМ	Киназа	IC50, нМ
Всг-АЫ	0,49-3,1*	Всг-АЫ (Н396Р)	1,0
Всг-АЫ (T315I)	0,78-21*	Bcr-Abl (М351Т)	2,8
Bcr-Abl (Е255К)	9,5	Bcr-Abl (Q252H)	12
Bcr-Abl (F317I)	2,0	Всг-АЫ (Y253F)	4,1
Всг-АЫ (G250E)	7,4

В концентрации 100 нМ соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)4-метил-К-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида значимо (ингибирование более чем на 50%) ингибировала активность следующих тирозинкиназ человека из 337 протестированных: ABL1, ABL2/ARG, BLK, DDR1, DDR2, EPHA2, EPHA8, EPHB2, FGR, FLT4/VEGFR3, FMS, FRK/PTK5, FYN, HCK, KDR/VEGFR2, LCK, LYN, LYN B, P38a/MAPK14, PDGFRa, PDGFRb, RAF1, RET, RIPK3, ZAK/MLTK. При этом более чем на 90% ингибировалась активность следующих киназ ABL1, ABL2/ARG, DDR1, DDR2, FMS, FRK/PTK5, LCK, LYN, LYN В, PDGFRa, RET.

Исследование цитотоксичности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида относительно различных опухолевых клеточных линий.

Соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида проявляет цитотоксичность в отношении незрелых лимфоидных клеток в модели Ph+ ХМЛ и Ph+ острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), включая клетки с мутацией T315I. Так, в эксперименте препарат проявлял цитотоксичность в отношении клеток человеческих опухолей линий K562 (IC₅₀ 8 нМ), KCL-22 (IC₅₀ 9 нМ), BV-173 (IC₅₀ 5нМ), представляющих собой модель Ph+ ХМЛ, а также Tom-1 (IC₅₀ 5нМ), SupB15 (IC₅₀ 50нМ), представляющих собой модель Ph+ ОЛЛ.

Также соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида проявляла цитотоксичность в отношении модельных опухолевых клеточных линий, полученных ретровирусной трансдукцией мышиной гематопоэтической линии BaF3 геном BCR-ABL или его мутантными формами [1]: BaF3/BCR-ABL (IC₅₀ 5 нМ), BaF3/BCR-ABL Y253F (IC50 25 нМ), BaF3/BCR-ABL E255K (IC50 25 нМ), BaF3/BCR-ABL F317L (IC50 250 нМ), BaF3/BCR-ABL T315I (IC50 75 нМ).

Также соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида проявляла цитотоксичность в отношении опухолевых клеточных линий человека, включая, но не ограничиваясь, линии острого лимфобластного лейкоза (CCRF-CEM), рака груди (MDA-MB-468), рака яичников (SKOV-3), лимфом (SR, EL4).

Исследование эффективности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в ксенографтной модели хронического лейкоза.

В исследовании с ксенографтной моделью на бестимусных мышах с подкожным вживлением клеток линии K562 оценивали эффекты введения соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Л-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в дозах 25 и 40 мг/кг (21 и 34 мг/кг в пересчете на свободное основание соответственно) в день на размеры опухоли. Терапия начиналась по достижении объема опухоли 500 мм³, длительность терапии составляла 14 дней, а длительность наблюдения - 240 дней. Введение препарата в дозе 25 мг/кг в день привело к уменьшению размера опухоли до не измеряемого уровня с последующим ростом опухоли после 35 дня наблюдения. Введение препарата в дозе 40 мг/кг привела к исчезновению опухоли без рецидива на протяжении всех 240 дней наблюдения за мышами.

- 27 032865

Исследование эффективности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в модели острого лейкоза.

В исследовании эффективности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в модели острого лейкоза для индукции патологии были использованы клетки костного мозга, полученные от мышей линии C57BL/6N с индуцированным острым лейкозом. Клетки были введены в хвостовую вену животных, получивших сублетальную дозу радиации. Терапия была начата спустя 5 дней после индукции патологии и продолжалась в течение двух недель. В результате исследования было показано, что введение препарата в дозе 40 мг/кг (34 мг/кг в пересчете на свободное основание) приводит к увеличению средней продолжительности жизни животных более чем на 25% по сравнению с контрольной группой, не получавшей терапию.

Исследование эффективности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в модели солидных опухолей кишечника.

В исследовании эффективности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в модели солидных опухолей кишечника для индукции патологии были использованы клетки линии HCT116. Клетки в количестве 200 мкл (2.5*10⁷ клеток/мл) были введены подкожно в правый бок самок бестимусных мышей (SCID). По достижении опухолью объема 200 мм³ мыши были рандомизированы по объему опухоли и разделены на контрольную и терапевтическую группу. Введение соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида в дозе 25 мг/кг (21 мг/кг в пересчете на свободное основание) было начато на следующий день после рандомизации и продолжалось в течение 20 дней. Для определения эффективности ингибирования роста опухоли по окончании лечения (20 дней) рассчитывалось отношение среднего объема для терапевтической/контрольной групп (%T/C). В результате исследования было показано, что введение препарата в дозе 25 мг/кг приводит практически к полной остановке роста опухоли (T/C<35%).

Исследование эффективности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в модели немелкоклеточного рака легкого.

Для исследований использовались самцы бестимусных мышей. Клетки A549 в количестве 1*10⁷ вводились в составе 0,2 мл раствора Матригеля (BD Ρ1ι;·ιπηίηβοη) в левую ногу мыши под кетаминксилазиновой анестезией. Через неделю после введения клеток мыши были разделены на терапевтическую и контрольную группу и рандомизированы по размеру опухоли. Введение соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида в дозе 25 мг/кг (21 мг/кг в пересчете на свободное основание) было начато на следующий день после рандомизации и продолжалось в течение 20 дней. Для определения эффективности ингибирования роста опухоли по окончании лечения рассчитывалось отношение среднего объема для терапевтической/контрольной групп (%T/C). В результате исследования было показано, что введение препарата в дозе 25 мг/кг приводит практически к полной остановке роста опухоли (T/C<35%).

Углубленное исследование фармакокинетики соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3 -идэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида.

В процессе изучения фармакокинетики соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида у крыс и собак было установлено, что препарат обладает высокой биодоступностью при пероральном введении: биодоступность у собак F=45,9-66,1% в диапазоне доз от 2 до 22 мг/кг (от 2 до 19 мг/кг в пересчете на свободное основание), у крыс F=13,8-59,5% в диапазоне доз от 5 до 80 мг/кг (от 4,2 до 68 мг/кг в пересчете на свободное основание).

Всасывание соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№ (4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида при пероральном введении мышам в диапазоне доз от 5 до 50 мг/кг проходило, достигая соответствующих максимальных концентраций от 82 нг/мл до 1099 нг/мл за 2-4 ч. Площадь под кривой концентрация-время (AUC) при этом линейно менялась во всем диапазоне доз от 5 до 50 мг/кг от 372 до 12104 нг-ч/мл. Всасывание препарата при пероральном введении в форме мезилата крысам в диапазоне доз от 5 до 80 мг/кг проходило, достигая соответствующих максимальных концентраций от 72 до 1250 нг/мл за 2,3-5,3 ч. AUC при этом линейно менялась во всем диапазоне доз от 5 до 80 мг/кг от 430 до 21124 нг-ч/мл. 3-(1,2,4-Триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида относительно медленно всасывается из ЖКТ после введения соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида собакам в диапазоне доз от 2 до 45 мг/кг, достигая максимальной концентрации в диапазоне от 31,8 до 224 нг/мл через 3-8,5 ч. AUC при этом линейно менялась в диапазоне доз от 2 до 22 мг/кг от 420 до

- 28 032865

5480 нг-ч/мл и не менялась при дальнейшем повышении дозы до 45 мг/кг (5173 нг-ч/мл).

-(1,2,4-Триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамид достаточно медленно выводится из системного кровотока; периоды полувыведения составляют у собак около 7 ч, около 3 ч для крыс и мышей. Клиренс при внутривенном пути введения является довольно высоким - 2,12 л/ч/кг для собак, 1,61 л/ч/кг для крыс. Большой кажущийся объем распределения (Vd=14,1 л/кг для собак, 6,16 л/кг для крыс) свидетельствует об интенсивном распределении препарата по тканям.

Исследование распределения препарата по тканям в крысах выявило высокие концентрации соединения в легких (примерно 71-кратное превышение экспозиции в сравнении с плазмой крови), селезенке (45-кратное превышение), почках (34-кратное превышение), костном мозге (27-кратное превышение), печени (21-кратное превышение). Экспозиция 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в головном мозге составила примерно 20% от экспозиции в плазме крови.

Метаболизм 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида происходит с участием изоформы цитохрома P450 CYP3A4 и без участия изоформ цитохрома P450: CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, как показали исследования на ферментных препаратах цитохромов. Исследование метаболизма 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида в гепатоцитах крыс, собак и человека выявило образование схожих профилей метаболитов, среди которых были идентифицированы два конъюгата с глутатионом, N-дезметилпроизводное, N-оксид. В плазме крови крыс и собак был идентифицирован также продукт гидролиза 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида по амидной связи, являющийся карбоновой кислотой. Количественное определение указанных метаболитов в плазме крови животных оказало, что площадь под кривой концентрация-время во всех случаях не превышает 10% от экспозиции основного вещества.

Исследования безопасности соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.

Препарат 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамид (в форме мезилата) прошел обширные доклинические исследования оценки безопасности, в том числе действие препарата на ионный канал hERG, токсичность препарата после однократного и повторного введения, исследование аллергенности и иммунотоксичности.

Препарат 3 -(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамид (0,1-10 μΜ) в форме мезилата ингибировал калиевый канал hERG со значением IC₅₀ равным 7,8 мкМ.

Результаты проведенных исследований острой токсичности показали, что величина ЛД1₀ соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1 ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида для мышей равна 800 мг/кг (678 мг/кг в пересчете на свободное основание) а для крыс равна 2000 мг/кг (1695 мг/кг в пересчете на свободное основание). МПД препарата при однократном введении собакам составила 45 мг/кг (38 мг/кг в пересчете на свободное основание).

МПД соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида для крыс при ежедневном внутрижелудочном введении в течение 28 дней по результатам 2 отдельных исследований составила 50-73 мг/кг (4262 мг/кг в пересчете на свободное основание), что соответствовало C_m3x 661±289 нг/мл и AUC₂₄ 8596±2209 нг-ч/мл в день 28 (для дозы 50 мг/кг).

Для выявления аллергизирующих свойств были использованы следующие методики: оценка анафилактогенной активности на моделях общей системной анафилаксии и активной кожной анафилаксии в морских свинках; оценка реакции гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) и реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на морских свинках при эпикутанном и конъюнктивальном нанесении препарата; оценка реакции ГЗТ на мышах; изучение реакции воспаления на конканавалин A на мышах; определение количества эозинофилов в крови, оценка влияния на фагоцитарную активность нейтрофилов (HCT-тест), постановка реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) на модели реакции ГЗТ у морских свинок при внутрикожном введении препарата. В ходе исследований было показано, что соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида не проявляет аллергенной активностью в указанных моделях.

В ходе исследований иммунотоксического действия соли метансульфокислоты и 3-(1,2,4триазоло [4,3-а]пиридин-3 -илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3 трифторметилфенил)бензамида было показано, что однократное внутрижелудочное введение препарата мышам не влияло на уровень гемагглютининов и гемолизинов в крови у животных в сравнении с контрольными группами. Курсовое внутрижелудочное введение (в течение 21 дня) препарата мышам не влияло на уровень гемагглютининов и гемолизинов в крови мышей, не оказывало действия на реакцию

- 29 032865 гиперчувствительности замедленного типа, не влияло на формирование реакции розеткообразования и не изменяло фагоцитарной активности нейтрофилов, выделенных из крови. Таким образом проведенные исследования показали, что соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида не оказывает иммунотоксического действия.

Результаты исследований генотоксичности в теста Эймса, в тесте соматического мозаицизма DrosoрЫ1а melanogaster и в тест-системе тесте учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей показали, что соль метансульфокислоты и 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида не обладает генотоксичными свойствами во всех использованных моделях и дозах (концентрациях).

Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути изобретения.

Claims (21)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. (1) проведение реакции в растворе между 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамидом и метансульфокислотой с образованием раствора соли 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата; и (2) концентрирование раствора соли 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата в смеси ацетон:этанол соотношении 5:1 v/v и последующее охлаждение раствора до 20-25°C для получения кристаллической соли.

   (1) проведение реакции в растворе между 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамидом и метансульфокислотой с образованием раствора соли 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата; и (2) охлаждение раствора соли 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата в смеси ацетон:этанол в соотношении 5:1 v/v до температуры примерно 10°C для получения кристаллической соли.

   1. Соль метансульфокислоты и основания 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Н(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида.
2. 2. Соль по п.1, представляющая собой мономезилат 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида.
3. 3. Кристаллическая соль мономезилата 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида.
4. 4. Соль по п.3, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, такой как изображено на фиг. 29 и полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения.
5. 5. Соль по п.3, где соль характеризуется ДСК кривой, имеющей эндотермический переход при 220°С.
6. 6. Соль по п.3, где соль мономезилата 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида представляет собой полиморфную модификацию I и характеризуется моноклинной кристаллической решеткой с пространственной группой P2i/n, с параметрами элементарной ячейки а=51,46±0,05 A; b=7,81±0,05 A; c=7,63±0,05 А и β=108,9±0,1° и объёмом элементарной ячейки V=2898,9±0,5 А³, определенными методом порошковой рентгеновской дифракции при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения.
7. 7. Соль по п.6, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения и содержащей, как минимум, один, два, три или четыре пика с относительной интенсивностью примерно 20% или выше, при углах дифракции (2θ), выбранных из 16,9; 17,2; 18,7 и/или 20,8.
8. 8. Соль по п.7, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения и содержащей пики при углах дифракции (2θ) 16,9; 17,2; 18,7 и 20,8; каждый с относительной интенсивностью примерно 20% или выше.
9. 9. Соль по п.6, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения и содержащей пик при угле дифракции (2θ) 18,7, имеющий максимальную относительную интенсивность.
10. 10. Соль по п.6, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, такой как изображено на фиг. 49A и полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения.
11. 11. Соль по п.6, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения и содержащей набор пиков, как приведено в табл. 6.
12. 12. Соль по п.3, где соль мономезилата 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида представляет собой полиморфную модификацию II и характеризуется моноклинной кристаллической решеткой с пространственной группой P2₁/c, с параметрами элементарной ячейки а=13,77±0,05 A; b=8,09±0,05 А и с=30,83±0,05 А и β=117,8±0,1° и объёмом элементарной ячейки V=3036,36±0,5 А³, определенными методом порошковой рентгеновской дифракции при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения.
13. 13. Соль по п.12, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения и содержащей, как минимум, один, два, три, четыре, пять, шесть или семь пиков с относительной интенсивностью примерно 20% или выше при углах дифракции (2θ), выбранных из 17,4; 17,6; 19,4; 19,7; 21,2; 22,0 и 22,6.
14. 14. Соль по п.13, где соль характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, полученной при 25±5°С с использованием СиКа1 излучения и содержащей пик при угле дифракции (2θ) 21,2 как имеющий максимальную относительную интенсивность.

    - 30 032865
15. 15. Способ получения полиморфной модификации I кристаллической соли 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата по п.6 включающий:
16. 16. Кристаллическая соль 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата полиморфной модификации I, полученная способом по п.15.
17. 17. Способ получения полиморфной модификации II кристаллической соли 3-(1,2,4-триазоло[4,3а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-трифторметилфенил)бензамида мономезилата по п.12 включающий:
18. 18. Кристаллическая соль 3-(1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин-3-илэтинил)-4-метил-№-(4-((4метилпиперазин- 1 -ил)метил)-3 -трифторметилфенил)бензамида мономезилата полиморфной модификации II, полученная способом по п.17.
19. 19. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью в отношении Всг-ЛЬ1 киназы или её мутантных форм, содержащая соль по любому из пп.1-14, 16 или 18 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
20. 20. Способ лечения онкологического заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества соли по любому из пп.1-14, 16 или 18.
21. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что онкологическое заболевание представляет собой острый лимфобластный лейкоз, хронический миелолейкоз, гепатоцеллюлярную карциному, немелкоклеточный рак легкого или гастроинтестинальную стромальную опухоль.

    Образец Масса образца, мг .......................... . Растворитель Объем растворителя, мл Кислота Кол-во эквивалентов кислоты Объем Раствора кислоты, мл Температура, °C Выпадение осадка после Метод выделения Выход, мг Кристалличность прибавления кислоты (+/-) после охлаждения (+/-) HAL-G-196-1 101,13 этанол 4,5 HCI 1,05 0,405 60 - + Фильтрация 61,4 Крист, I HAL-G-196-2 100,02 ТГФ 2,0 HCI 1,05 0,405 60 - + Фильтрация 71,6 Крист, I HAL-G-196-3 101,18 ацетон 10,0 HCI 1,05 0,405 50 - - - - - HAL-G-196-4 102,64 этанол 4,5 H₂SO₄ 1,05 0,405 60 + + Фильтрация 44,7 Полу-крист HAL-G-196-5 102,04 ТГФ 2,0 H₂SO₄ 1,05 0,405 60 + Масло Упаривание - Полу-крист HAL-G-196-6 103,78 ацетон 10,0 H₂SO₄ 1,05 0,410 50 + + Фильтрация 96,8 Полу-крист HAL-G-196-7 101,08 этанол 4,5 HBr 1,05 0,405 60 - + Фильтрация 90,6 Крист, I HAL-G-196-8 104,11 ТГФ 2,0 HBr 1,05 0,415 60 + + Фильтрация 92,2 Крист, II HAL-G-196-9 100,66 ацетон 10,0 HBr 1,05 0,405 50 - + Фильтрация 78,5 Крист, II HAL-G-196- 10 98,76 этанол 4,5 Лимонная 1,05 0,395 60 - + Фильтрация 56,2 Аморфный HAL-G-196- 11 103,18 ТГФ 2,0 Лимонная 1,05 0,410 60 + + Фильтрация 88,0 Аморфный HAL-G-196- 12 101,25 ацетон 10,0 Лимонная 1,05 0,405 50 + + Фильтрация 97,6 Аморфный HAL-G-196- 13 101,22 этанол 4,5 Фосфорная 1,05 0,400 60 + + Фильтрация 100,5 Крист HAL-G-196- 14 98,30 ТГФ 2,0 Фосфорная 1,05 0,400 60 - Масло Упаривание - Аморфный HAL-G-196- 15 98,33 ацетон 10,0 Фосфорная 1,05 0,400 50 + + Фильтрация 58,2 Аморфный