EA032860B1 - СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВПЧ-ИНДУЦИРОВАННЫХ ИНВАЗИВНЫХ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ ПОРАЖЕНИЙ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ FAM19A4 И hsa-miR124-2 В КАЧЕСТВЕ МАРКЁРОВ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области профилактики и медицинской диагностики рака. В частности, предложен способ выявления ВПЧ-индуцированных (индуцированных вирусом папилломы человека) предраковых поражений высокой степени и ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний, который включает определение гиперметилирования генов FAM19A4 и hsa-miR124-2 в клетках, причем такое гиперметилирование указывает на присутствие ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени и/или ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний. Кроме того, предложен набор компонентов для применения в способе выявления ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени или ВПЧ-индуцированных раковых заболеваний.

Description

Изобретение относится к области профилактики и медицинской диагностики рака и связано с молекулярными диагностическими маркёрами инвазивных раковых заболеваний, индуцируемых вирусом папилломы человека (ВПЧ), и предшествующих им поражений высокой степени, такими как агрессивный рак шейки матки и предраковые поражения шейки матки. В частности, настоящее изобретение относится к применению регуляторной геномной последовательности FAM19A4 в качестве маркёра для индуцируемых ВПЧ-ВР (вирусом папилломы человека высокого риска) предраковых состояний с высоким инвазивным потенциалом и инвазивных раковых заболеваний, индуцируемых ВПЧ-ВР.

Уровень техники

Рак шейки матки является третьим по распространенности видом рака у женщин в мире, и является причиной примерно 250000 смертей от рака в год.

Развитие плоскоклеточного рака шейки матки характеризуется последовательностью предраковых поражений, так называемой цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN), которая включает в себя три степени: слабая дисплазия (CIN1), умеренная дисплазия (CIN2) и тяжелая дисплазия/карцинома in situ (CIN3). CIN1 также называют поражением эпителия низкой степени (LSIL), a CIN2 и CIN3 - поражением эпителия высокой степени (HSIL). Для цервикальной аденокарциномы, установленным предшествующим поражением является аденокарцинома in situ (ACIS). В принципе, эти предраковые поражения являются обратимыми, однако чем более тяжелым является поражение, тем ниже вероятность спонтанной регрессии. Рак шейки матки считается предотвратимым заболеванием, так как предраковые стадии могут быть обнаружены при помощи эксфолиативной цитологии и при необходимости лечатся относительно легко, с незначительными побочными эффектами. Скрининг направлен на раннюю диагностику предраковых состояний высокой степени (т.е. CIN2/3 и аденокарцинома in situ), и излечимых раковых поражений, что позволяет снижать смертность от инвазивного рака шейки матки. Общая медицинская практика включает лечение всех женщин с морфологически подтвержденными CIN2, CIN3 и аденокарциномой in situ, для предотвращения развития рака шейки матки.

За последнее десятилетие было установлено, что возникновение рака шейки матки инициируется инфекцией вируса папилломы человека высокого риска (ВПЧ-ВР, hrHPV). Было показано, что экспрессия вирусных онкогенов E6 и E7, нарушающих сигнальные пути супрессии опухолей, а именно p53-^ra и Rb-путь, соответственно, необходима как для начала развития рака, так и для поддержания злокачественного фенотипа. Таким образом, тестирование на ВПЧ-ВР рассматривается как привлекательный инструмент первичного скрининга. Однако, в соответствии с многоступенчатым процессом возникновения рака, для превращения инфицированной ВПЧ-ВР вирусом клетки в клетку инвазивного рака требуются дополнительные изменения в геноме клетки-хозяина. Только у небольшой части женщин, инфицированных ВПЧ высокого риска, развиваются предраковые поражения шейки матки высокой степени (CIN2/3), и, если их не лечить, рак шейки матки. У большинства женщин с предраковыми поражениями шейки матки, поражения регрессируют спонтанно. Из женщин, которые участвуют в скрининге среди населения, около 5-6% имеют положительный тест на ВПЧ-ВР. Тем не менее, только 20% из них (1% из участвующих женщин) имеют стадию >CIN2/3. Таким образом, первичный скрининг путем тестирования на ВПЧ-ВР будет сопровождаться значительным количеством излишних процедур после теста и ненужной тревогой среди женщин, если нет возможности провести анализ мазков с поверхности шейки матки, на маркёры, позволяющие выделить среди ВПЧ-ВР-положительных женщин группы с риском >CIN2/3 и >аденоракциномы in situ.

Важной задачей является снижение процента ВПЧ-положительных женщин до тех, которые имеют клинически значимые поражения. Один способ предполагает использовать цитологию в качестве вторичного теста (так называемой сортировки) для женщин с положительными результатами на ВПЧ-ВР. Однако, в этом способе остается значительное количество положительных на ВПЧ-ВР женщин с нормальной цитологией (3,5% женщин, проходящих скрининг), среди которых 10% имеют или могут достичь стадии >CIN3. Кроме того, цитологический анализ неприменим для самостоятельно взятых цервикально-вагинальных мазков, которые можно взять дома, так как они не являются показательными для цитологического состояния шейки матки. Другой способ - ВПЧ 16/18 генотипирование. Но в этом способе остаются женщины с типами, отличными от ВПЧ 16/18, которые, хотя и в меньшей степени, для которых также существует риск развития стадий >CIN2/3 и >аденокарциномы in situ. Таким образом, существует необходимость в дополнительных или альтернативных инструментах сортировки больных для определения ВПЧ-ВР-положительных женщин на женщин с и без >CIN2/3 и >аденокарцинмы in situ.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения нашли способ определения ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени и ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний, причем указанный способ включает детекцию гиперметилирования в гене и hsa-miR124-2 и FAM19A4 в клетке, при этом такое гиперметилирование указывает на наличие ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени и/или ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний. Предпочтительно, в таком способе указанное ВПЧ-индуцированные предраковые состояния или ВПЧ-индуцированная инвазивная карцинома - это предраковые поражения шейки матки высокой степени или инвазивный рак шей

- 1 032860 ки матки, более предпочтительно ВПЧ-индуцированный инвазивный рак высокого риска.

В предпочтительном варианте реализации изобретения гиперметилирование детектируют в CpGбогатых последовательностях, как указано на фиг. 1 и 2.

Изобретение также связано со способом, указанным выше, в котором указанное гиперметилирование - это повышенное метилирование CpG-богатого промотора и/или геномных последовательностей FAM19A4 и hsa-miR124-2 в исследуемых клетках, по сравнению с нормой.

В предпочтительном варианте реализации изобретения определение (гипер)метилирования осуществляют с использованием чувствительной к метилированию рестрикционной эндонуклеазы, выбранной из группы, состоящей из рестриктаз BssHII, MspI, NotI и HpaII. В альтернативном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, обнаружение (гипер)метилирования осуществляется при помощи специфичной к метилированию ПЦР, которая основана на бисульфитной модификации ДНК, с последующими специфическими ПЦР-реакциями, нацеленными на CpG-богатые последовательности. Предпочтительно в таком способе используют нуклеотидный зонд или праймер, который связывается с нуклеиновой кислотой, как показано на фиг. 1 или 2, и предпочтительней, если указанный нуклеотидный зонд или праймер имеет детектируемую метку.

В другом варианте реализации изобретения нуклеотидный зонд имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

а) полинуклеотидной последовательности, способной к гибридизации в жестких условиях с последовательностью FAM19A4, показанной на фиг. 2;

б) полинуклеотида, характеризующегося по меньшей мере 70% идентичностью с полинуклеотидом а);

в) полинуклеотида, комплементарного к полинуклеотиду а); и

г) полинуклеотида, содержащего по меньшей мере 15 нуклеотидных оснований из а) или б).

Кроме того, предпочтительным в настоящем способе является комбинированное определение метилирования FAM19A4 и hsa-miR-124-2.

Изобретение также включает в себя набор компонентов для применения в способе выявления ВПЧиндуцированных предраковых поражений высокой степени или ВПЧ-индуцированной инвазивной карциномы, причем данный набор включает средство для выявления метилирования FAM19A4 и hsa-miR124-2, причем указанное средство содержит зонды и/или праймеры, специфичные для нуклеотидной последовательности FAM19A4 на фиг. 2, и средство для выявления инфекции ВПЧ, причем указанное средство содержит зонды и праймеры, специфичные для ВПЧ.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана 5'-регуляторная область PRDM14, кодирующая последовательность, CpGбогатая часть первой интронной последовательности и транскрибируемые 3'-некодирующие последовательности. Начало транскрипции показано жирным шрифтом, кодирующая последовательность показана прописными буквами. Промоторная последовательность длиной 1000 п.о. и интрон 1, каждый из которых содержит CpG-богатые последовательности, показаны строчными буквами

На фиг. 2 показана 5'-регуляторная область FAM19A4, кодирующая последовательность, CpGбогатая часть первой интронной последовательности и транскрибируемые 3'-некодирующие последовательности. Начало транскрипции показано жирным шрифтом, кодирующая последовательность показана прописными буквами. Промоторная последовательность длиной 1000 п. о. и интрон 1, каждый из которых содержит CpG-богатые последовательности, показаны строчными буквами.

На фиг. 3 показано, что экспрессия мРНК PRDM14 в раковых клетках шейки матки SiHa, может повышаться после обработки ингибитором метилирования ДНК (DAC). Обработку раковых клеток шейки матки SiHa осуществляли с использованием ингибитора метилирования 2'-деокси-5'-азацитидина (5'-аза или DAC) в концентрациях 0,2 и 5 мкМ. Другие виды обработки представляли собой ФБР и этанол (EtOH). Все виды обработки проводили в двух повторах. Контролями являлись референсная РНК человека и -RT контроль (без добавления обратной транскриптазы к реакционной смеси кДНК).

Фиг. 4. Эффекты эктопической экспрессии PRDM14 в клетках SiHa, CaSki и 93VU147T. (A) процент GFP⁺ клеток снижается в PRDM14-трансфецированных клетках, по сравнению с контрольными клетками (с пустым вектором), 24, 48 и 72 ч после трансфекции. (B), анализ окрашенных аннексином V и PI клеток методом проточной цитометрии показывает увеличение как ранних (AnnexinV⁺/PI^-), так и поздних (AnnexinV⁺/PI⁺) апоптотических клеток в клеточной популяции, экспрессирующей PRDM14.

Фиг. 5. Диаграммы распределения уровней PRDM14 и FAM19A4, полученные методом количественной специфической к метилированию ПЦР образцов ткани шейки матки. На оси у представлены уровни метилированной ДНК; на оси х сгруппированы образцы для каждой стадии заболевания и гистотипа. Уровень метилирования PRDM14 и FAM19A4 увеличивается со стадией заболевания и выявляется практически во всех SCC и AdCA. Значительные различия в уровнях метилирования наблюдаются между категориями заболеваний.

Фиг. 6. Уровни метилирования PRDM14 и FAM19A4 из ВПЧ-ВР-положительных образцов ткани

- 2 032860 органов головы и шеи (HNSCC: плоскоклеточная карцинома головы и шеи). Уровни метилирования значительно увеличены при карциноме по сравнению с контрольной группой.

Подробное описание изобретения

Термин ВПЧ-индуцированный инвазивный рак (раковое заболевание) относится к карциноме, вызванной ВПЧ высокого риска, которая поражает окружающие ткани. Это понятие включает в себя все ВПЧ-индуцированные гистотипы карцином, т.е. плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы, аденосквамозные (железисто-плоскоклеточные) карциномы и нейроэндокринные карциномы соответствующих органов, таких как шейка матки, ротовая полость, ротоглотка, анус, прямая кишка, половой член, вульва, влагалище, и т.д. Особенно это относится к плоскоклеточной карциноме головы и шеи (HNSCC), плоскоклеточной карциноме шейки матки и аденокарциноме шейки матки.

Термин инвазивный рак шейки матки относится к карциноме шейки матки, поражающей окружающие ткани. Это понятие включает в себя все гистотипы карциномы, т.е. плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы, аденосквамозные карциномы и нейроэндокринные карциномы.

Термины предраковое поражение и предшествующее поражение относятся к стадии многоступенчатого развития рака, с очень высокой вероятностью перерождения в карциному. На основании представлений классической морфологии врач-диагност не может предсказать для отдельных пациентов, какие из этих поражений будут прогрессировать или регрессировать. Данный патент относится к способу, который позволяет предсказать инвазивный рак или предшествующее поражение высокой степени.

Термин предраковые поражения шейки матки высокой степени относится к стадии многоступенчатого развития рака шейки матки с очень высокой вероятностью перерождения в карциному шейки матки.

Термин способная к специфической гибридизации с относится к последовательности нуклеиновой кислоты, способной специфически связываться с комплементарной нуклеотидной последовательностью с образованием нуклеотидного дуплекса.

Термин CIN3 поражение поздних стадий используется для гистотипированного поражения CIN3 с длительной предшествующей инфекцией ВПЧ-ВР, приводящей к значительно большим изменениям числа копий ДНК. Соответственно, это подкатегория поражений CIN3 представляет собой более тяжелую стадию заболевания с повышенным риском развития рака.

Комлемент или комплементарная последовательность представляет собой последовательность нуклеотидов, которая образует дуплекс, связанный водородной связью с другой нуклеотидной последовательностью в соответствии с правилами спаренных оснований Уотсона-Крика. Например, комплементарной последовательностью для 5'-AAGGCT-3' является '3'-TTCCGA-5'.

Термин жесткие условия гибридизации относится к условиям гибридизации, которые влияют на стабильность гибридов, например, температура, концентрация соли, pH, концентрация формамида и т.п. Эти условия эмпирически оптимизированы для максимизации специфического связывания и минимизации неспецифического связывания праймера или зонда с нуклеотидной последовательностью-мишенью. Используемые термины относятся к условиям, в которых зонд или праймер будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, в детектируемо большей степени, чем с другими последовательностями (например, не менее чем в 2 раза больше). Жесткие условия зависят от последовательности и различаются в разных условиях. Более длинные последовательности специфично гибридизуются при более высоких температурах. Обычно жесткие условия выбираются примерно на 5°C ниже, чем точка плавления (Тпл) для конкретной последовательности при определенной ионной силе раствора и значении pH. Тпл представляет собой температуру (при определенной ионной силе раствора и pH), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с идеально подобранным зондом или праймером. Обычно жесткие условия подбираются таким образом, что концентрация соли составляет меньше 1,0 М иона Na, обычно приблизительно от 0,01 до 1,0 М концентрации иона Na (или других солей), значения pH от 7,0 до 8,3, а температура не менее 30°C для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и не менее 60°C для длинных зондов или праймеров (например, более чем 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Пример условий низкой жесткости или условий пониженной жесткости включают гибридизацию с использованием буферного раствора 30% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 2* буфере SSC при 40°C. Пример условий высокой жесткости означают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 0.1^XSSC буфере при 60°C. Процедуры гибридизации хорошо известны в данной области и описаны в работе Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994.

Термин олигонуклеотид относится к короткой последовательности нуклеотидных мономеров (обычно от 6 до 100 нуклеотидов), соединенных фосфорными связями (например, фосфодиэфирной, алкил- и арил-фосфатной, фосфоротиоатной) или нефосфорными связями (например, пептидной, сульфаматной и др.). Олигонуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, имеющие модифицированные основания (например, 5-метил цитозин) и модифицированные сахарные группы (например, 2'O-метил рибозил, 2'-О-метоксиэтил рибозил, 2'-фторорибозил, 2'-аминорибозил, и т.п.). Олигонуклеотидами могут быть природные или синтетические молекулы двух- и одноцепочечной ДНК и двух- и одно

- 3 032860 цепочечной РНК кольцевой, разветвленной или линейной формы, причем указанные олигонуклеотиды могут иметь домены, способные образовывать стабильные вторичные структуры (например, структуры стебель-петля и петля-стебель-петля).

Термин праймер, используемый здесь, означает олигонуклеотид, способный связываться с мишенью амплификации, обеспечивая возможность присоединения ДНК-полимеразы, и таким образом служит точкой инициации синтеза ДНК в условиях, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймер а, являющегося комплементарным для нуклеотидной цепи, т.е. в присутствии нуклеотидов и агента полимеризации, такого как ДНК-полимераза, при подходящих значениях температуры и pH. Для максимальной эффективности амплификации праймер предпочтительно должен быть одноцепочечным. В предпочтительном варианте праймер является олигодезоксирибонуклеотидом. Праймер должен быть достаточно длинным, чтобы начать синтез удлинения цепи в присутствии агента полимеризации. Точные длины праймеров зависят от многих факторов, включая температуру и источник праймера. Пара двунаправленных праймеров в настоящем тексте относится к одному прямому и одному обратному праймеру, обычно используемым в области амплификации ДНК, например, в амплификации путем полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Термин зонд относится к одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, которая распознает комплементарную последовательность в исследуемой нуклеотидной последовательностимишени или производной от нее кДНК и образует с ней дуплекс за счет водородных связей.

Метилирование ДНК является биохимическим процессом, который имеет важное значение для нормального развития у высших организмов. Оно предполагает присоединение метильной группы в 5 положении пиримидинового кольца цитозина или к азоту в положении 6 пуринового кольца аденина. Метилирование ДНК в положении 5 цитозина имеет специфический эффект снижения генной экспрессии и было обнаружено у всех исследованных позвоночных. В соматических тканях взрослых метилирование ДНК обычно происходит в динуклеотиде CpG.

Используя широкую карту метилирования ДНК генома в выяснили, что ген, кодирующий белок цинковые пальцы 14 с доменом PR (далее PRDM14; номер в Genbank NM 024504.2) и ген, кодирующий член A4 семейства со схожими последовательностями 19 (хемокин (мотив C-C)-подобные) (называемый далее FAM19A4; номер в Genbank NM 001005527.2) являются мишенями метилирования ДНК в первичных кератиноцитах после экспрессии вирусных онкогенов (HPV16E6E7), и что это метилирование PRDM14 и FAM19A4 промотора является важным фактором, определяющим канцерогенез, индуцируемый ВПЧ-ВР. Геномные и регуляторные последовательности PRDM14 и FAM19A4 представляют собой ценные маркёры для диагностики инвазивного рака шейки матки и предшествующих ему поражений высокой степени. Кроме того, настоящее изобретение подходит для диагностики не только рака шейки матки, но и других раковых заболеваний, вызванных ВПЧ-ВР, и предшествующих им предраковых поражений высокой степени.

Рак шейки матки связан почти исключительно с инфекцией вирусом папилломы человека (ВПЧ). Вирусы папилломы человека, представляют собой группу из более чем 100 типов вирусов, определенных путем анализа последовательностей ДНК. Разные ВПЧ вызывают различные заболевания кожи и слизистых оболочек. ВПЧ делятся на типы низкого и высокого риска, в зависимости от их способности вызывать злокачественные изменения в инфицированных клетках. Типы ВПЧ низкого риска, такие как 1, 2, 4, 6, 11, 13 и 32, ассоциированы в основном с доброкачественными поражениями или обычными бородавками, в то время как типы ВПЧ высокого риска, такие, как 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, и 68 связаны в основном с предраковыми и злокачественными эпителиальными поражениями. Эти ВПЧ высокого риска вызывают новообразования, обычно плоские и практически незаметные, по сравнению с бородавками, вызванными ВПЧ низкого риска, например, ВПЧ-6 и ВПЧ-11. Было обнаружено, что типы ВПЧ высокого риска вызывают инвазивную карциному шейки матки, а также инвазивные карциномы других областей аногенитального тракта и/или области головы и шеи. Таким образом, настоящее изобретение подходит не только для диагностики инвазивного рака шейки матки и предшествующих ему стадий, ассоциированных с FAM19A4, но и других инвазивных раковых заболеваний и предшествующих им стадий, индуцируемых ВПЧ, в частности ВПЧ высокого риска. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу оценки риска любых ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени или инвазивного рака.

Весьма подходящими ВПЧ-индуцированными предраковыми поражениями и инвазивными видами рака в контексте настоящего изобретения являются предраковые поражения шейки матки и инвазивный рак шейки матки, а также предраковые поражения и инвазивные раковые заболевания, вызванные ВПЧ высокого риска, других тканей, таких как ткани полости рта, ротоглотки, ануса, прямой кишки, полового члена, вульвы, влагалища и т.д.

Исследуемая клетка может быть (пре)неопластической клеткой, пролиферирующей клеткой шейки матки или любой другой клеткой, в которой нужно определить присутствие ВПЧ-индуцированного предракового поражения с риском развития рака или ВПЧ-индуцированного инвазивного рака.

Ген PRDM14, кодирующий ядерный белок с молекулярной массой 64 кДа, первоначально был определен как важный регулятор в поддержании эмбриональных стволовых клеток человека, которые уча

- 4 032860 ствуют в самообновлении и дифференцировке (Chia и др., Nature 2010, 468: 316-320). PRDM14 описан как белок, действующий как онкогенный фактор в лимфоидных новообразованиях человека (Dettman и др. Oncogene 2011, 30: 2859-73.), а также при раке молочной железы (Nishikawa и др. Cancer Res 2007, 67: 9649-57). Кроме того, метилирование промотора PRDM14 было обнаружено в раковых клетках молочной железы (Nishikawa и др. Cancer Res 2007, 67: 9649-57). Ген FAM19A4, кодирующий секретируемый белок с молекулярной массой 16 кДа, первоначально был определен путем секвенирования кДНК человека (Strausberg и др., PNAS, 2002, 99 (26): 16899-903). Этот ген является представителем семейства TAFA, которое состоит из пяти высокогомологичных генов, кодирующих небольшие секретируемые белки. Эти белки содержат консервативные остатки цистеина в определенных положениях, и имеют отдаленное родство с белком MIP-1 альфа, представителем семейства CC-хемокинов. Белки TAFA преимущественно экспрессируются в определенных участках мозга, считается, что они являются специфическими хемокинами или нейрокинами мозга, которые действуют как регуляторы иммунных и нервных клеток (Tom Tang и др., Genomics 2004, 83(4):727-34). Для данного гена были обнаружены варианты транскриптов, образующиеся в результаты альтернативного сплайсинга. Связь с раком не была описана.

Авторами настоящего изобретения установлено, что метилирование CpG-богатых участков PRDM14 и FAM19A4, таких как промотор и первый интрон обоих генов, является частым событием в карциномах шейки матки, включая плоскоклеточную карциному, аденосквамозную карциному, аденокарциному и гистотипы нейроэндокринной карциномы, и предшествующие им поражения высокой степени. Исследования in vitro показали функциональное участие инактивации PRDM14 в развитии рака шейки матки, поскольку гиперэкспрессия PRDM14 в клеточных линиях рака шейки матки SiHa и CaSki, содержащих ВПЧ 16, приводила к апоптозу. Это указывает на то, что PRDM14 функционирует как генсупрессор опухоли при раке шейки матки, что является особенно примечательным в связи с тем, что ранее была описана онкогенная функция данного белка в лимфоидных новообразованиях и раковых клетках молочной железы (Dettman и др., Oncogene 2011, 30: 2859-73; Nishikawa и др. Cancer Res 2007, 67: 9649-57). Точная функция FAM19A4 до сих пор не установлена.

Наиболее интересно, что авторы настоящего изобретения показали, что гиперметилирование промотора PRDM14 и FAM19A4 (и интронных последовательностей) может быть обнаружено в образцах соскобов шейки матки, и что указанное гиперметилирование позволяет предсказывать присутствия поражения CIN высокой степени или инвазивной карциномы. Кроме того, метилирование промотора PRDM14 и FAM19A4 может быть обнаружено в образцах ткани шейки матки и вагинальных образцах, собранных пациентами самостоятельно, и было установлено, что это метилирование ассоциировано с присутствием поражения CIN высокой степени или инвазивного рака шейки матки.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени и ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний, причем указанный способ включает выявление гиперметилирования в гене FAM19A4 и hsa-miR124-2 в клетке, и при этом такое гиперметилирование указывает на присутствие ВПЧ-индуцированного предракового поражения высокой степени с инвазивным потенциалом и ВПЧ-индуцированного инвазивного рака.

Исследуемая клетка субъекта может включать клетку из образца клеток слизистой оболочки, такого как образец клеток шейки матки, а также других тканей, например, полости рта, ротоглотки, пениса, вульвы, ануса, прямой кишки и др., где определяют предраковое поражение или рак, ассоциированный с ВПЧ. Все данные образцы могут использоваться в качестве образца в способе настоящего изобретения. В предпочтительном варианте в качестве исследуемых клеток используют образец клеток шейки матки пациентов. Клетки шейки матки могут, например, быть представлены в виде гистологических или цитологических образцов. Цитологические образцы включают обычные мазки с поверхности шейки матки, а также тонкослойные препараты образцов шейки матки, цервикально-вагинальные или вагинальные образцы, собранные самостоятельно.

Способ настоящего изобретения в особенности подходит для выявления предраковых поражений высокой степени и инвазивных раковых заболеваний, индуцируемых ВПЧ высокого риска. Способ обнаружения ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени с высоким инвазивным потенциалом и ВПЧ-индуцированного инвазивного рака может включать анализ промотора и первого интрона FAM19A4 и hsa-miR124-2.

На фиг. 1 показана CpG-богатая область промотора и CpG-богатая последовательность первого интрона гена PRDM14, а также кодирующая последовательность и транскрибируемая 3'-некодирующая последовательность.

На фиг. 2 показана CpG-богатая область промотора, часть CpG-богатой последовательности первого интрона гена FAM19A4, а также кодирующая последовательность и транскрибируемая 3'некодирующая последовательность.

Определение метилирования проводят на нуклеиновой кислоте, такой как ДНК. Используемыми реагентами обычно являются нуклеиновокислотный зонд (ДНК) или (ПЦР-) праймер или рестрикционная эндонуклеаза, предпочтительно чувствительная к метелированию рестриктаза для обнаружения присутствия метильных групп в исследуемой клеточной ДНК.

- 5 032860

Детектирование исследуемого клеточного компонента можно осуществлять непосредственно in situ или он может быть выделен из других клеточных компонентов обычными способами, известными специалистам в данной области, до связывания с реагентом (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. 1995. 4th edition, John Wiley and Sons; A Laboratory Guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis, Krieg (ed.), 1996, Wiley-Liss; Molecular Cloning: A laboratory manual, J. Sambrook, E.F. Fritsch. 1989. 3 Vols, 2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Поскольку настоящее изобретение демонстрирует, что PRDM14 функционирует как ген-супрессор опухолей, и что сниженный уровень транскрипции PRDM14 может быть увеличен путем ингибирования метилирования ДНК, часто желательно определять непосредственно, гиперметилирован ли ген PRDM14. Аналогично, также желательно определять непосредственно, гиперметилирован ли ген FAM19A4. В частности, цитозин-богатые области, называемые CpG-островки расположенные главным образом в 5'регуляторных участках генов, в норме не метилированы. Термин гиперметилирование включает в себя любое метилирование цитозина в положении, которое в норме не метилировано в последовательности гена PRDM14 или FAM19A4 (например, промотор, первый экзон и первый интрон гена PRDM14 или FAM19A4, см. фиг. 1 и фиг. 2 соответственно). Метилирование ДНК может быть определено с помощью следующих анализов, используемых в научных исследованиях в настоящее время: специфическая к метилированию ПЦР (MSP), которая основана на химической реакции бисульфита натрия с ДНК, в результате которой неметилированный цитозин CpG динуклеотидов преобразуется в урацил или UpG, с последующей традиционной ПЦР. Однако метилированные цитозины в этом процессе не подвергаются преобразованию, и праймеры подбирают таким образом, чтобы они перекрывали интересующий участок CpG, что позволяет определить статус метилирования, как метилированный либо неметилированный.

Бисульфитное секвенирование полного генома, также известное как BS-Seq, которое представляет собой высокопроизводительный геномный анализ метилирования ДНК. Он основан на указанном выше преобразовании в присутствии бисульфита натрия геномной ДНК, которую затем секвенируют на платформе секвенирования нового поколения. Полученные последовательности затем вновь выравнивают с референсным геномом для определения состояния метилирования динуклеотидов CpG на основе несовпадений, причиной которых является превращение неметилированных цитозинов в урацил.

Анализ HELP, который основан на дифференциальной способности рестрикционных ферментов распознавать и расщеплять метилированные и неметилированные CpG участки ДНК.

Анализ ChIP-on-chip, который основан на способности коммерчески разработанных антител связываться с ассоциированными с метилированием ДНК белками, такими как MeCP2.

Сканирование генома по профилю рестрикции, сложный и в настоящее время редко используемый анализ, основанный на дифференциальном распознавании метилированных и неметилированных CpG участков ферментами рестрикции; анализ близок к концепции анализа HELP.

Иммунопреципитация метилированных ДНК (MeDIP), аналогична иммунопреципитации хроматина, иммунопреципитация используется для выделения метилированных фрагментов ДНК и использования их в методах детекции ДНК, таких как ДНК-микрочипы (MeDIP-chip) или секвенирование ДНК (MeDIP-seq).

Пиросеквенирование, обработанной бисульфитом ДНК. Это секвенирование ампликона, синтезированного при помощи нормального прямого праймера и биотинилированного обратного праймера. Пиросеквенатор анализирует пробы путем денатурации ДНК и добавления в смесь нуклеотидов по одному в соответствии с последовательностью, заданной пользователем. Если есть несовпадение, его регистрируют и отмечают процент ДНК, для которых присутствует это несовпадение. Это дает пользователю процент метилирования на CpG-островок.

Анализ молекулярного гашения света для определения активности ДНК-аденинметилтрансферазы анализ, который опирается на специфичность рестриктазы DpnI в отношении полностью метилированных (аденин метилированных) сайтов GATC в олигонуклеотиде, меченном флуорофором и гасителем. Аденинметилтрансфераза метилирует олигонуклеотид, что делает его субстратом для DpnI. Разрезание олигонуклеотида рестриктазой DpnI приводит к увеличению флуоресценции.

Метил чувствительный Саузерн-блот анализ, аналогичен анализу HELP, хотя использует методики метода Саузерн-блот для исследования ген-специфических различий в метилировании с использованием рестрикционного расщепления. Этот метод используется для оценки локального метилирования рядом с участком связывания зонда.

В предпочтительном варианте гиперметилирование может определяться при помощи обработки полинуклеотидов (генов) PRDM14 или FAM19A4 эндонуклеазами рестрикции и анализа методом Саузернблот. Может быть использована любая рестриктаза, сайт распознавания которой включает участок CG и которая ингибируется при метилировании C. Чувствительные к метилированию эндонуклеазы рестрикции, такие как BssHII, MspI, NotI или HpaII, используемые по отдельности или в комбинации, являются примерами таких эндонуклеаз. Другие чувствительные к метилированию эндонуклеазы рестрикции известны специалистам в данной области.

Альтернативным предпочтительным способом исследования метилированных последовательностей является специфическая к метилированию ПЦР, которая также основана на бисульфитной модификации

- 6 032860

ДНК, с последующими специфическими ПЦР - реакциями, нацеленными на CpG-богатые последовательности.

Для осуществления настоящего изобретения нуклеотидный зонд, специфический для PRDM14 или FAM19A4, может быть использован для определения присутствия полинуклеотида PRDM14 или FAM19A4 (с использованием нуклеотидного зонда) в биологических жидкостях или тканях. Олигонуклеотидные праймеры, основанные на любой области кодирующей области последовательности и регуляторной области последовательности PRDM14 или FAM19A4, пригодны для амплификации ДНК, например, путем ПЦР.

При использовании ПЦР-праймеров, нуклеотидных зондов или эндонуклеаз рестрикции, анализируют 5'-регуляторную область, первую интронную последовательность и кодирующую последовательность PRDM14 или FAM19A4 (как указано на фиг. 1 и 2 соответственно).

Могут быть использованы любые образцы, содержащие детектируемое количество полинуклеотида PRDM14 или FAM19A4. Предпочтительные образцы для анализа в соответствии со способами настоящего изобретения, включают такие образцы как соскобы (с поверхности шейки матки или влагалища), смывы или мазки с шейки матки и влагалища и/или биопсию (шейки матки) и т.п. Хотя субъектом может быть любое млекопитающее, предпочтительно субъектом является человек.

Диагностические способы обнаружения нарушений включают способы, в которых образец для исследования содержит клеточный препарат из ткани шейки матки или другой ткани. В предпочтительном варианте такие образцы представлены в виде мазков или в виде других цитологических образцов.

Образец клеток или ткани, полученный от млекопитающего, предпочтительно человека, подвергают соответствующей предварительной обработке чтобы обеспечить контакт между клеточной ДНК исследуемых клеток, содержащейся в указанном образце, с реагентом для детектирования PRDM14 или FAM19A4 и изменения метилирования гена PRDM14 или FAM19A4 по сравнению с нормальными клетками. Образцы могут быть установлены на соответствующей подложке, позволяющей наблюдать отдельные клетки. Примерами известных подложек могут быть стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, полиуретан, дополнительно покрытые слоями, улучшающими клеточную адгезию и иммобилизацию образца, такими как поли-Ь-лизин или силан. Цервикальные мазки или биоптаты, например, могут быть приготовлены как для теста Папаниколау (PAP) или для любой его модификации, известной специалисту в данной области, и могут быть зафиксированы с помощью процедур, обеспечивающих надлежащий доступ реагента к компоненту-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения цитологические образцы представлены в форме обычных мазков или тонкослойных препаратов клеток шейки матки или цитологических образцов в жидкой основе или любых других видов препаратов, известных специалистам в данной области. Если требуется хранение образцов, при рутинных процедурах используют забуференный формалин для фиксации с последующей закладкой в парафин, который обеспечивает хорошее сохранение внутренней структуры ткани. Для обеспечения иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного окрашивания, должна быть обеспечена доступность и открытость антигенов материала образца. Один из способов обеспечения доступности антигенов поперечно сшитых формальдегидом белков включает обработку образца протеолитическими ферментами. Этот способ приводит к (частичному) расщеплению материала, в результате чего обеспечивается доступ антител к фрагментам исходных белков.

В одном из вариантов реализации способа согласно настоящему изобретению выявляют повышенное метилирование последовательностей промоторов и интронов FAM19A4 в сочетании с повышенным метилированием последовательности hsa-miR124-2, поскольку он обладает повышенной чувствительностью.

Зрелая последовательность hsa-miR124-2 (номер MIMAT0000422) кодируется тремя индивидуальными незрелыми последовательностями микроРНК, расположенными в трех разных областях генома, т.е. hsa-miR124-2 (номер MI0000443) локализуется в хромосоме 8p23.1, hsa-miR124-2 (номер MI0000444) на хромосоме 8q12.3 и hsa-miR124-3 (номер MI0000445) на хромосоме 20q12.33 (указанные номера базы данных микроРНК, miRBase (www.mirbase.org), факультет естественных наук, Университет Манчестера).

Использование анализа гиперметилирования hsa-miR124 в способах обнаружения или предсказания возникновения ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени и ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний в образцах мазка с поверхности шейки матки описано в WO 2013/039394 и Wilting и др. (Mol. Cancer 2010: 9, 167).

Согласно настоящему изобретению также предложен набор компонентов, как указано в формуле изобретения, для применения в способе обнаружения ВПЧ-индуцированных предраковых поражений с высоким инвазивным потенциалом и ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний, связанных с FAM19A4 и hsa-miR124-2, в исследуемых клетках субъекта. Такой набор может включать в соответствующих вариантах кисть или лопатку для (цервикального) соскоба и контейнер, наполненный средой для сбора, для сбора исследуемых клеток. В альтернативном варианте для сбора цервикальных клеток методом цервикально-вагинального смыва обеспечивают устройство для взятия проб, состоящее из шприца для спринцевания, одноразового мочевого женского катетера и контейнера с жидкостью для орошения. Набор в соответствии с настоящим изобретением может содержать праймеры и зонды для

- 7 032860 детектирования метилирования промотора FAM19A4 и hsa-miR124-2.

Набор компонентов в соответствии с изобретением включает средство для детектирования метилирования FAM19A4 и hsa-miR124-2 промотора, такое как чувствительные к метилированию рестрикционные ферменты, или зонды или праймеры, способные к гибридизации с нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1 и/или фиг. 2. Конечно, если анализ также предназначен для детектирования метилирования hsa-miR124-2, в него могут быть включены праймеры и зонды для детектирования метилирования в этой последовательности.

Еще в одном альтернативном варианте реализации набора согласно изобретению средство для детектирования метилирования FAM19A4 и hsa-miR124-2 промотора может быть объединено со средствами для детектирования инфекции ВПЧ, предпочтительно для определения типа инфекции ВПЧ высокого риска. Такие средства могут включать ВПЧ-специфические праймеры или зонды, белковые маркёры для инфекции ВПЧ или даже суррогатные маркёры для инфекции ВПЧ, известные в данной области.

Настоящее изобретение ниже иллюстрируется следующими примерами:

Примеры

Пример 1. Идентификация PRDM14 и FAM19A4 в качестве мишеней метилирования в ВПЧиндуцированной трансформации.

Всесторонний анализ изменений метилирования геномной ДНК, ассоциированных с ВПЧиндуцированной трансформацией in vitro, проводили (экспрессия вирусных онкогенов и последующая иммортализация первичных кератиноцитов) с помощью специфического к метилированию цифрового кариотипирования (MSDK) (Hu и др., 2005). MSDK - это основанный на последовательности метод, который состоит в расщеплении геномной ДНК чувствительным к метилированию рестрикционным ферментом (AscI), что позволяет построить объективные и комплексные профили метилирования. В этом способе последовательности длиной 21 п.о., полученные из определенных мест генома, объединяли и исследовали методом высокоэффективного секвенирования. Определяли геномные изменения метилирования ДНК, причиной которых является экспрессия ВПЧ16 E6 и E7, путем сравнения паттернов метилирования нетрансдуцированных кератиноцитов крайней плоти (5 пассаж) с трансдуцированными клетками ВПЧ16E6E7 ранних пассажей (7 пассаж). Кроме того, с использованием иммортализованных ВПЧ16E6E7 трансдуктантов (30 пассаж) исследовали изменения метилирования, ассоциированные с приобретением бессмертности, критической так называемой точки невозврата, событие в процессе трансформации.

Применяя этот подход, идентифицировали PRDM14 и FAM19A4 как новые мишени метилирования при ВПЧ-индуцированной трансформации, метилирование которых стало особенно очевидным в иммортализованных трансдуктантах, но в случае PRDM14 оно все же нечасто наблюдалась в клетках ранних пассажей.

Метилирование области промотора PRDM14 и FAM19A4 проверяли количественной специфической к метилированию ПЦР (qMSP) в независимых сериях трансфецированных ВПЧ линий кератиноцитов. Праймеры и зонды для qMSP приведены в табл. 1. Метилирование промотора PRDM14 было обнаружено в двух иммортализованных линиях клеток кератиноцитов с ВПЧ 16 (FK16A, FK16B) и двух иммортализованных линиях клеток кератиноцитов ВПЧ18 (FK18A, FK18B). Кроме того высокие уровни метилирования PRDM14 были обнаружены в трех ВПЧ-ВР-положительных клеточных линиях рака шейки матки (SiHa, HeLa и CaSki) и в HPV16-положительной линии клеток рака головы и шеи (93VU147T). Анализ метилирования PRDM14 в трех изолятах ВПЧ-отрицательных первичных кератиноцитов (HFK) был отрицательным (см. табл. 2).

Обработка раковых клеток шейки матки SiHa ингибитором метилирования 5-аза-2дезоксицитидином (DAC) привело к повышению экспрессии мРНК PRDM14, что указывает на то, что метилирование промотора PRDM14 регулирует экспрессию его гена в клетках рака шейки матки (фиг. 2).

Аналогично PRDM14, метилирование промотора FAM19A4 было выявлено в двух иммортализованных клеточных линиях кератиноцитов с ВПЧ 16 (FK16A, FK16B) и двух иммортализованных клеточных линиях кератиноцитов ВПЧ18 (FK18A, FK18B), а также в клеточных линиях рака шейки матки (HeLa SiHa, и CaSki) и в клеточных линиях рака головы и шеи (93VU147T), причем последние демонстрировали самые высокие уровни метилирования FAM19A4. Анализ метилирования FAM19A4 в трех изолятах ВПЧ-отрицательных первичных кератиноцитов (HFK) был отрицательным (см. табл. 2).

Пример 2. Функциональная роль PRDM14 в цервикальном канцерогенезе.

Для определения потенциальной функциональной роли PRDM14 в цервикальном канцерогенезе трансфецировали клетки ВПЧ16-содержащих клеточных линий рака шейки матки SiHa и CaSki вектором, экспрессирующим PRDM14 и пустым контрольным вектором (GFP). Эктопическая экспрессия PRDM14 в SiHa и CaSki, трансфецированных PRDM14, подтверждена анализом ОТ-ПЦР (RT-PCR). После трансфекции индукцию клеточного апоптоза измеряли путем исследования клеток, окрашенных аннексином V и пропидий иодидом (PI), методом FACS. По сравнению клетками, трансфецированными пустым контрольным вектором, и нетрансфецированными родительскими клетками, в клетках со сверхэкспрессией PRDM14 наблюдалась сильная индукция апоптоза (фиг. 4). Сильная индукции апоптоза при эктопической экспрессии PRDM14 в клетках рака шейки матки указывает на участие PRDM14 в супрес

- 8 032860 сии опухоли при цервикальном канцерогенезе. По аналогии с результатами, полученными для клеточных линий рака шейки матки, эктопическая экспрессия PRDM14 в ВПЧ16-положительных клеточных линиях рака головы и шеи также приводила к индукции апоптоза (фиг. 4). Следовательно, эти данные указывают на то, что PRDM14 принимает участие в супрессии опухоли при ВПЧ-положительных раковых заболеваниях головы и шеи. При введении PRDM14 в эмбриональные клетки почки человека (НЕК) индукции апоптоза не наблюдалось, что свидетельствует о том, что индукция апоптоза, наблюдаемая в ВПЧположительных раковых клеточных линиях, не является результатом неспецифического эффекта конструкции, используемой для трансфекции.

Пример 3. Метилирование промотора PRDM14 и FAM19A4 - частое событие при поражениях CIN высокой степени, плоскоклеточных карциномах шейки матки аденосквамозных карциномах, аденокарциномах и нейроэндокринных карциномах.

Далее исследовали метилирование PRDM14 и FAM19A4 промотора в образцах ткани шейки матки методом количественной специфичной к метилированию ПЦР (qMSP), как описано в примере 1. В качестве референсного гена для измерения общей ДНК выбрали ген домашнего хозяйства 6-актина (ACTB). Для всех образцов величину измеренного метилирования ДНК делили на количество ACTB, и образцы с отношением выше заданного порогового значения (например, среднее отношение нормального контроля (за исключением значительных выбросов) +2.58x стандартное отклонение) определяли как положительные.

Обнаружили, что метилирование промотора PRDM14 определялось в 11% (2/18) в контрольных образцах шейки матки, в 33% (13/40) поражений CIN1, в 55% (23/42) поражений CIN3 и в 100% (42/42) плоскоклеточных карцином шейки матки (SCC) (табл. 3). Уровни метилирования PRDM14, определенные на разных стадиях заболевания, приведены на фиг. 5.

Вместе с плоскоклеточной карциномой шейки матки также исследовали метилирование промотора PRDM14 при аденокарциноме шейки матки. Аденокарциномы, которые составляют до 20% карцином шейки матки, представляют особый интерес, так как процент заболеваемости аденокарциномой шейки матки остается на прежнем уровне или даже увеличивается в странах с общегосударственной программой скрининга рака шейки матки. Это означает, что аденокарцинома шейки матки и предшествующие ей поражения желез, т.е. аденокарциномы in situ (ACIS), часто не выявляются при скрининге на основе цитологии. На основании сравнительных генетических и эпигенетических исследований плоскоклеточных карцином шейки матки и аденокарцином шейки матки было обнаружено, что два опухолевых гистотипа развиваются по различным путям канцерогенеза (Dong и др., 2001, Kang и др., 2005, Wilting и др., 2006, Henken и др., 2007). Следовательно, большинство биомаркёров, позволяющих обнаружить плоскоклеточную карциному шейки матки, могут не обеспечивать выявление аденокарциномы шейки матки.

Маркеры метилирования, такие как CADM1, CDH1, DAPK1 и SOX17, более специфичны для плоскоклеточных карцином, в то время как маркёры RASSF1A, APC, DKK3 и SFRP2 преимущественно метилированы при аденокарциномах (Overmeer и др., 2008, Kang и др., 2005, Dong и др., 2001, van der Meide др., 2011)

Интересно, что метилирование промотора PRDM14 оказалось исключением, а именно, в отличие от большинства известных маркёров, по метилированию промотора PRDM14 выявляли аденокарциному шейки матки и плоскоклеточную карциному с близкой частотой; т.е. у 97% (30/31) аденокарцином было показано метилирование PRDM14 промотора и 57% (12/21) аденокарцином in situ были положительными на метилирование PRDM14 (фиг. 5, табл. 3). Сходные результаты получили для аденосквамозных карцином шейки матки и нейроэндокринных карцином.

Таким образом, метилирование промотора PRDM14 является универсальным маркёром метилирования для всех гистотипов карциномы шейки матки.

Анализ метилирования промотора FAM19A4 показал положительное метилирование в 19% (3/16) контрольных образцов нормальной шейки матки, в 12% (3/26) поражений CIN1, в 43% (18/42) поражений CIN3 и в 100% (42/42) плоскоклеточных карцином шейки матки (SCC), 52% (11/21) аденокарцином in situ (ACIS) и 92% (24/26) аденокарцином (AdCA) (табл. 3). Уровни метилирования FAM19A4, обнаруженные на разных стадиях заболевания и в разных гистотипах показаны на фиг. 5. Следовательно, метилирование промотора FAM19A4 также представляет собой универсальный маркёр метилирования для всех гистотипов карциномы шейки матки.

Пример 4. Определение метилирования PRDM14 и FAM19A4 промотора в ВПЧ-ВР-положительных цервикальных соскобах.

Используя дизайн исследования случай-контроль для женщин, участвующих в скрининге населения, исследовали соскобы с поверхности шейки матки ВПЧ-ВР-положительных женщин, у которых была диагностирована стадия >CIN2 (включая 2 карциномы) (случаи) в сравнении с ВПЧ-ВР-положительными женщинами у которых была диагностирована стадия не выше CIN1 (контроли). Соскобы с поверхности шейки матки этих женщин собрали в поддерживающую среду, в которой хорошо сохраняются нуклеиновые кислоты.

Метилирование PRDM14 было обнаружено у 23% (8/35) ВПЧ-ВР-положительных женщин контрольной группы с нормальной цитологией и у 74% (17/23) женщин со стадией >CIN2. Метилирование

- 9 032860

FAM19A4 было обнаружено у 3% (1/35) ВПЧ-ВР-положительных женщин контрольной группы с нормальной цитологией и у 52% (12/23) женщин со стадией >CIN2. В более широкой группе из 200 ВПЧ-ВРположительных соскобов с поверхности шейки матки, собранных в ходе скрининга населения POBASCAM (Rijkaart и др., Lancet Oncology 2012), последующий валидационный анализ показал, что FAM19A обнаруживается у >80% женщин со стадией >CIN3 при пороговом значении для анализа, дающем специфичность 50%. При пороге, соответствующем специфичности 70%, выялвяется 70% женщин со стадией >CIN3.

Эти данные показывают, что анализ метилирования как PRDM14, так и FAM19A4 может выявить основное заболевание шейки матки (CIN2⁺) в ВПЧ-ВР-положительных соскобах с поверхности шейки матки и таким образом обеспечивает перспективные маркёры для скрининга заболеваний шейки матки путем первичного тестирования на ВПЧ.

Пример 5. Анализ метилирования FAM19A4 в цервикальных соскобах женщин со стадией CIN3, ассоциированной с непродолжительной и продолжительной ВПЧ-инфекцией.

В предшествующих исследованиях сравнивали изменения количества копий ДНК при стадиях CIN3 у женщин с непродолжительной (<5 лет) предшествующей ВПЧ-инфекцией и при стадиях CIN3 у женщин с продолжительной (>5 лет) предшествующей ВПЧ-инфекцией (Bierkens и др., Int J. Cancer 2012:131(4):E579-85). Продолжительность предшествующих ВПЧ-ВР-инфекций служила заменой продолжительности поражения, на основании которой поражению CIN3 может быть присвоена соответственная более низкая или более высокая степень заболевания. Тот факт, что значительные изменения в количестве копий ДНК обнаружили в поражениях CIN3 с продолжительной предшествующей инфекцией ВПЧ-ВР, подтверждает предположение, что эта категория представляет собой более тяжелую стадию заболевания, так называемую тяжелую (продвинутую) стадию CIN3 с повышенным риском развития рака.

Чтобы определить, может ли анализ метилирования FAM19A4 обнаружить поражения CIN3 высокой степени (продвинутые), исследовали соскобы с поверхности шейки матки у 19 женщин с CIN3 с непродолжительной предшествующей ВПЧ-ВР инфекцией и у 29 женщин с CIN3 с продолжительной предшествующей инфекцией ВПЧ. Самое интересное, что во всех (29/29; 100%) соскобах, взятых у женщин с инвазивными поражениями CIN3 (долгосрочная предшествующая ВПЧ-ВР инфекция) было обнаружено метилирование FAM19A4, в отличие от 42% (8/19) соскобов среди женщин с поражениями CIN3, связанными с непродолжительной инфекцией ВПЧ-ВР, так называемыми ранними стадиями CIN3. Положительный результат теста на метилирование был основан пороговых значениях анализа, заданных таким образом чтобы обеспечивать 70% специфичность. Такая удивительно высокая распространенность у женщин с поражениями высоких степеней указывает на то, что тестирование на метилирование FAM19A4 позволяет выявить всех женщин с поражениями CIN3 высоких степеней, которые требуют немедленного направления на кольпоскопию.

Пример 6. Метилирование промотора FAM19A4 в цервикальных соскобах пациентов, больных раком.

Исследовали метилирование FAM19A4 в 60 (общее число) цервикальных соскобах пациентов с карциномой шейки матки. Эти соскобы включали 10 аденокарцином, 2 аденокарциномы in situ, 2 аденосквамозные карциномы, 43 плоскоклеточных карциномы и 3 недифференцированные карциномы. Все карциномы, за исключением 1 аденокарциномы, дали положительный результат на метилирование FAM19A4 (специфичность 70%). В дополнение к соскобам больных раком шейки матки, положительный результат на метилирование FAM19A4 обнаружили также в подмножестве соскобов, взятых у женщин с раком эндометрия. Самое интересное, что вся серия полученных соскобов больных раком, дала положительный результат теста на комбинацию метилирования FAM19A4 и hsa-miR124-2 (Wilting и др., Mol Cancer 2010: 9, 167).

Следовательно, комбинированное исследование на метилирование FAM19A4 и hsa-miR124-2 в соскобах шейки матки позволяет обнаружить все (100%) случаи рака как шейки матки, так и эндометрия.

Пример 7. Метилирование промотора PRDM14 и FAM19A4 в самостоятельно собранных образцах.

Далее исследовали самостоятельно собранные пациентами цервикально-вагинальные образцы, полученные с использованием либо VibaBrush (Rovers Medical Devices, Oss, Нидерланды), либо Delphiscreener (Delphi BioScience B.V., Scherpenzeel, Нидерланды). В ходе проспективного исследования женщинам, которые, даже после второго напоминания, не отвечали на приглашение на плановый осмотр шейки матки (см. www.trialregister.nl Trial no.NTR962 (PROHTECT trial)), были отправлены 45000 пакетов для самостоятельного сбора образцов. Предложение самостоятельного сбора проб для исследования на ВПЧ-ВР женщинам, которые не посещали врача, обеспечил возвращение в программу скрининга до 30% этих женщин (Gok др. BMJ 2010; 340: C1040). Самостоятельно собранные образцы эквивалентны тем, которые берет врач для теста на ВПЧ (Brink и др. J. Clin Microbiol 2006; 44: 2518-23). Исследование на ВПЧ-ВР самостоятельно собранных образцов выявляет, по крайней мере, столько же поражений стадии >CIN2 в этой группе населения, как при регулярном скрининге в соответствующей выборке посещающих врача женщин (Bais и др., Int J. Cancer: 2007, 120: 1505-1510.; Gok и др. BMJ 2010; 340: c1040). Тем не менее, и в случае самостоятельно собранных образцов для анализа на ВПЧ также существует не

- 10 032860 обходимость в инструментах для стратификации ВПЧ-ВР-положительных женщин на тех, у кого есть, и у кого нет стадии >CIN2/3 и >аденокарциномы in situ. В то время как обычное цитологическое исследование не может быть надежно выполнено с использованием собранных цервикально-вагинальных образцов (Brink и др., J. Clin Microbiol 2006; 44: 2518-23), анализ метилирования ДНК может применяться к самостоятельно собранным цервикально-вагинальным смывам (Eijsink и др., Gynecol Oncol 2011; 120: 280-3).

Важно отметить, что полученные в настоящем исследовании данные показывают, что маркёры метилирования FAM19A4 и PRDM14 дают возможность обнаружения стадии CIN2⁺ не только в образцах самостоятельно собранных цервикально-вагинальных смывов, но и в самостоятельно собранных образцах вагинальных мазков. Вагинальные мазки - это тот тип образцов, в котором исследование ранее известных маркёров часто характеризуется низкой клинической чувствительностью. Соответственно, маркёры FAM19A4 и hsa-miR124-2 могут считаться универсальными детектирующими маркёрами, использующимися как в цервикальных мазках, взятых врачом, так и в самостоятельно-собранных образцах смывов и мазков.

Серия из 177 самостоятельно собранных образцов вагинальных мазков ВПЧ-ВР-положительных женщин без признаков клинически значимого заболевания в дальнейшем (т.е. нормальная цитология/ВПЧ - CIN0/CIN1 гистология), а также 74 самостоятельно собранных образцов вагинальных мазков ВПЧ-ВР-положительных женщин со стадией >CIN3 (68 CIN3, 4 SCC, 1 ACIS, 1 аденосквамозная клеточная карцинома, доказанные в течение 36 месяцев) исследовали методом qMSP на метилирование промотора PRDM14 и FAM19A4. FAM19A4 в сочетании с анализом метилирования PRDM14 и самостоятельно показал чувствительность 70% для стадии >CIN3 при специфичности 70%. На настоящий момент метилирование FAM19A4 является единственным маркёром метилирования, позволяющим предсказывать стадию >CIN3 поражению у ВПЧ-ВР-положительных женщин по самостоятельно собранным образцам вагинальных мазков с приемлемой чувствительностью (>60%), что удивительно. Самостоятельно собранные образцы вагинальных мазков с другими маркёрами метилирования или комбинациями маркёров дают намного более низкие уровни чувствительности. Так как традиционные соскобы или образцы цервикально-вагинальных смывов не дают лучших результатов, эти данные являются неожиданными.

Кроме того, серию из 350 самостоятельно собранных образцов цервикально-вагинальных смывов ВПЧ-ВР-положительных женщин, в том числе 272 ВПЧ-ВР-положительных женщин без признаков клинически значимого заболевания в дальнейшем наблюдении (т. е. нормальная цитология/ВПЧ - CIN0/CIN1 гистология) а также 78 образцов цервикально-вагинальных смывов ВПЧ-ВР положительных женщин со стадией >CIN3, исследовали на метилирование PRDM14 и FAM19A4. FAM19A4 в сочетании с анализом метилирования PRDM14 или отдельно показал чувствительность 70% для стадии >CIN3 со специфичностью 70%. Это доказывает универсальную детектирующую функцию FAM19A4 в сочетании с метилированием PRDM14 или другими маркёрами метилирования или отдельно на различных типах образцов, включая цервикальные соскобы и самостоятельно собранные (цервикально-)вагинальные мазки и образцы смывов.

В дальнейших исследованиях определяли, могут ли другие маркёры метилирования кроме PRDM14 дополнять FAM19A4 для обнаружения стадии > CIN3 в самостоятельно собранных вагинальных мазках и образцах смывов. При уровнях специфичности ниже 70% (60 и 50%) оказалось, что маркёр метилирования hsa-miR124-2 (Wilting и др., Mol. Cancer 2010: 9, 167) имеет дополняющие значение и обеспечивает повышение чувствительности по сравнению с анализом только на маркёр FAM19A4.

Эти данные показывают, что анализ метилирования промотора PRDM14 и FAM19A4 в самостоятельно собранных материалах, включая самостоятельно собранные образцы вагинальных мазков и самостоятельно собранные образцы цервикально-вагинальных промываний, является возможным, и позволит улучшить выявление заболеваний шейки матки высокой степени. FAM19A4, в частности, дает высокий уровень чувствительности и специфичности (70%/70%), что выше результатов для других маркёров метилирования или генотипирования HPV16/18, в самостоятельно собранных образцах вагинальных мазков и самостоятельно собранных образцах цервикально-вагинальных смывов. Совместный анализ FAM19A4 и hsa-mir124-2 показал специфичность выше, чем уровни специфичности 50% и 60%, по сравнению с исследованием только FAM19A4.

Пример 8. Анализ метилирования промоторов PRDM14 и FAM19A4 в ВПЧ-ВР-положительных плоскоклеточных карциномах головы и шеи, карциномах вульвы, предраковых поражениях и карциномах ануса.

Для того чтобы определить, происходит ли метилирование промотора PRDM14 и FAM19A4 при других видах карцином, ассоциированных с ВПЧ-ВР, с помощью qMSP анализа исследовали 20 ВПЧВР-положительных плоскоклеточных карцином головы и шеи (HNSCC) и 2 нормальных образца слизистой оболочки рта. Уровни метилирования PRDM14 и FAM19A4 были значительно (p<0,05) выше в HNSCC по сравнению с образцами нормальной слизистой органов головы и шеи (фиг. 6). Во всех образцах (20/20) с HNSCC, уровни метилирования PRDM14 были выше по сравнению с контролем. В 90% (18/20) HNSCC уровни метилирования FAM19A4 были выше по сравнению с контрольными.

Кроме того, исследовали образцы 3 ВПЧ-ВР-положительных карцином вульвы, 4 предраковых по

- 11 032860 ражений вульвы (VIN3) и 3-ВПЧ-ВР положительных карцином ануса на метилирование PRDM14 и FAM19A4. Все 11 поражений показали высокие уровни метилирования PRDM14 и все, кроме 1 поражения VIN3, показали высокие уровни метилирования FAM19A4, что аналогично с поражениями шейки матки.

Эти данные показывают, что не связанные с раком шейки матки ВПЧ-ВР-положительные (пред)раковые поражения, а именно поражения головы и шеи, вульвы и ануса, могут быть обнаружены с помощью анализа метилирования FAM19A4 и/или PRDM14.

Таблица 1

Последовательности праймеров и зондов (5'-3'), используемые для количественного MSP анализа PRDM14 и FAM19A4

	Прямой праймер	Обратный праймер	Зонд
PRDM 14	TTATTAGCGGGTTAGA CGTCGTTT	CGTCCCGAAATCGA ACCC	CTTACTCTCCGCTCCC AATTCGAAAAATCC
FAM 19 A4	AGTCGGGCGGTTCGGT TA	CCAAAAACGACGCG CAACTA	CCCAACTAACGCGCT AA

Таблица 2 Сводные данные анализов количественного чувствительного к метилированию ПЦР (qMSP) PRDM14 и FAM19A4 на первичных кератиноцитах, ВПЧ16 и ВПЧ18-трансфектных кератиноцитах (ранние и поздние пассажи иммортализованных клеточных линий FK16A, FK16B, FK18A и FK18B) и ВПЧ-ВРположительных клеточных линий рака шейки матки

		PRDM14 qMSP	FAM19A4 qMSP
Первичные кератиноциты	HFK1	-	-
HFK2	-	-
HFK3	-	-
ВПЧ16 и 18 иммортализованные кератиноциты	FK16A	+	+
FK16B	+	+
FK18A	+	+
FK18B	+	+
Клеточные линии рака шейки матки	SiHa	++	++
HeLa	++	++
CaSki	++	++
Клеточные линии рака органов головы и шеи	93VU1 47Т	++	++

-: отрицательный;

+: положительный;

++: сильно положительный.

Таблица 3

Процент метилирования PRDM14 и FAM19A в положительных образцах тканей шейки матки, определенный методом qMSP

	PRDM 14	FAM19A4
Норма	11% (2/18)	19% (3/16)
CIN1	33% (13/40)	12% (3/26)
CIN3	55% (23/42)	43% (18/42)
see	100% (42/42)	100% (42/42)
ACIS	57% (12/21)	52% (11/21)
AdCA	97% (30/31)	92% (24/26)

CIN: цервикальная интераэпителиальная неоплазия;

SCC: плоскоклеточная карцинома;

ACIS: аденокарцинома in situ;

AdCA: аденокарцинома.

- 12 032860

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Self-screen B.V.

<120> СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВПЧ-ИНДУЦИРОВАННЫХ ИНВАЗИВНЫХ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ ПОРАЖЕНИЙ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ FAM19A4 И HSAMIR124-2 В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ <130> P99544PC00 <150> EP 12188377.1 <151> 2012-10-12 <160> 10 <170> PatentIn, версия 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер <400> 1 ttattagcgg gttagacgtc gttt 24 <210> 2 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер <400> 2 cgtcccgaaa tcgaaccc <210> 3 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер <400>3 agtcgggcgg ttcggtta18 <210>4 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер <400>4 ccaaaaacga cgcgcaacta <210>5 <211>30 <212> ДНК

- 13 032860

<213>	Искусственная
<220>
<223>	зонд

<400>	5
cttactctcc gctcccaatt cgaaaaatcc	30
<210>	6
<211>	17
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	зонд
<400>	6
cccaac	taac gcgctaa	17

<210> 7 <211> 2443 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 7 cccgccagct tctctcttcc aggccgcgcc aggcgaggaa ctttctgtga gaattcaaat cgcgtccaag catcctcggt cccgaaacct ttagggactc aagccgctgc cggggcgggt cctgtcccgg atgtgaatgg gcggtctttg gtcgctagcc cgtttaaagc cggaagcgtc tggcggcgtc caggccgggg cgctccccat ctcacccggc aactaagcgt ggcgctcggt tttcccgaag cacttaagga gggggtgccg tcttagccgg gtgaggctgc tcagctaaga aagactgcgt tcctttctct atgggtctgg gaagtgacag ataaaagccc ggcccaacgc gtagatgttc acctcagtct ggaagcagcg ttcccccacc ccctcaatgg accttggttt ctgcggcggc ccgagagagc tcccacgtgt ctcctttccc tcagccccga gccggggggc ctcggcgctt ccggcgagga tcagagcctg gcgggaggcc aaaacgacca cactgccggg

120

180

240

300

360

420

480

540 gactcgcgag gaacagacac ttccgaactg actccggttc cgtgttcggt gaaggccagc ttaagtgagc gcggggagaa tcgatgcccc aagtctaccg cccgctccgc ctggggcccg cagttcgttt cctgaggtcg ctgcctgtgt accctgcttg ttcattcttc ggtgcggggg cgtccacgcg gtttccgagg ggcgcatcct aggacccgcg ggggctctgg cccagccgag tgcgctcggc accaacgagt ggaaccgggt aggggtgctt gcgaagcttc ccaccaggtc ggagcggaga agggtgtgtg ttttttctcc ggcgagtgct gaccccaggg gacgacgcgg gcggccccgc agcccgagtg ggtggcgctc gggcggtggt tggatggtcg gaggaggcta cgtggctgac gttttcttat agcctcggtg cgggaggact gctcccgagg aacccgggga agggcagcca gggtcacacc gagcgcgtct ggcccaggag tcccggccca tttgtaggac tgggggccga ggagagggaa ccagcgctca caccagcggg gtaaggggct tgcgcgcgga ccgactccgc cgccactagg gacagagggc ggatctgcgt ccgccctctt gcctaccgag ttggaggtgg cttccagggc ttctgccctc ggagaagggc ctcttctcct tgggctcatt aacttgctgc ggcagtcgcc ggctacccca atgtggcgga aaagtggcgc gctgggccag ccatctgcgc cgcctggagc gccccgaggt tgagaagaag aagcggagag ggggaaggca aggcgctccc tcagacgccg cgaccccggg ggggcttatc acgcctggag gtcccaggga gagtcgagag gggccgggtc aagcctggct cccgagtggc tgtcggaggt cgttggggag tcgggggctt gcctttggag gaccccgtgt gatctcaaga ctgtctatta gaggctcttc ggccccaata cgctgcccgc gcccctcccc agcaggtcgc ggtgcgaccc tgtcgcttgc tggcagggcc gaaggaaagg cgggtgtggg acactaaccc gcctcgtccc ccttcgggca acgcgagtcc tgggggccct cggcaatact gggtttggaa tcggccaatg aattccctac cagccctcag cccgcagcgt aggcacggga ggcggcagca tgaatcccaa gatcgggagg tctttaattt cccgccggcc aaacgccatc gctcccacct gtcctggtag gagggaaaag tgcgggcagt ggggtccctg agggtcctcg tccattgccc ccgcggctcc gaacttcaat aaggcggccg ggaatttaga caggtatcag ggctgggatc ggccttctgg gggtagcaca gcctgcccta aactgatgag gctgcggtgg cctcgacctg ggcccgcccg ccaggaggcg caggacgcgc ctcgctggcg gttgcagatc agacgggccg ctgagtcatg ctgaaggggc ctttcccggc ggccagggct aatgattgga aggttcaggc caggaccgcc gacctgcccg gctcttccct tccgaccgcc cacagaccct gggttttgca ggcttaggga gtagggcagg

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220

- 14 032860 atcccggcag ttgtcttaat tggatctggg aagctcccgc atttccgttt tgtgggagcg gctggctggg gcggtgtcct ggggcttttt ggctggcggg gtggaggagg cagcggcgcc tgtgtttgct atcggactgg ctggtgggga cgcttttctg tctattgctg gggcgtttat ggcgcgggtc cag ttttttcgtt cctgttccct ggaccccggg

2280

2340

2400

2443 <210> 8 <211> 2166 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 8 agccgccgag gacaaggtgt ttcccgtcct ttccggcagc atggcgcctc ccctggtaca cccttcctga cgtgcggtcc gctacccgcc atggacacta tggaggccgc ccttgctgag gcaagctgcc gcagcagcca cgggatggct ggagagcagc cagaaacagc agcgtctgct cccgggtctg accgtggtac cgagtacgcg ctaccccggc ccgcagaacc ctggccaccg gcccccgcca ggcctacaga ccaattcccc ggtgccagca caagtgaggc tggccgcgta tggaggaaga tgcccccctt gggagcctct acgtccccag gtgaagatct cgtgcctcag ctacacgcct cttccaacct ccccttccgg ctacgatctg ggaagtgccg gggccaccaa

120

180

240

300

360

420 atcattggtg ccccctgcgg tcacccagca gctcggttcc ctggagcacc tctggatctg ctatgcctca tttatcgcca gtgaagacct cactttatag ttccccaagg tgcaaagaga tttctggata tctgaagagt tattacagag ccctgttctc catgttcatg tcttccagcc tattgtacta ggggagaagc gacagccatg aaaatcttct ccctgccagg ggatcactca accaaaaaaa aggaggtcga tcgccccact acaaaaaaaa tctctctatt acgcct gcgacaacga atgcttctct agcagtcaga agttcacgga cagccagcct attctcttcc tgcagacggt aaggagtcag acggagacaa atggaaaagg agcagaacct tccatcagaa ttcctgtgag ctgcagaagg ataagcacct tctgcaaacg agaagcaccg taaacaaaca agaggttcac ccttcaaatg tccggcgttc cagatcaaga cacaatgact agtccaggag tacaaaaatc ggtggcagga gcttttcaac tgagtagccc tccttttatg gagtggcccg gttacctgag ggatggtccc ggaggacctg gcaccatgcg tcaaactctg gtttggtgaa gtttgggccc ttctgtgatg aggtacgggg agttgctgtg ccaagagctc ccttcaggtc ctacagatgt caagtacacc atcctttgag gcctcacaag catgcgagtc agcctccagc caagtactgt acacaaggag aacattctac cacgcctgta ttcgagacca agctgggggt tggtttgagc ctgggtgaca tcaagagtgt ggttatagaa tgttgtggac gggctgagga aaaccctcca cacttcgttc atttcaggcc gataaagact gtcccacatt tttcaaggta tgggagatct aactggatgt cagtgtcaag cttgtgtggt acagagccgg gaaagatgtg ccctgtgtgg aagcgggacc tgttctacat cactctggag atactccgca ggtaaatctt gatgatggct tcccacatga atcccagcac gcctgggcaa ggtggcacat acaggagacg gaaccagacc ggagacaatg gtccctgcag ctgacacttt cctcccagtt accaagaagg tgtacggggt tcctggtccc cccttcaact ttggtgtgtt aagtggtcaa ttgaagatgg cctatgtcaa ggcatatatt atggagactg ggaagcagcc ggaaggtatt acaagggcga ggcttcggat gtgggaaatg acagaccata cacacatcag ttgcatccca gctcatgcag agtttcatga tttgggaggc catggtgaaa gcctgtggtt gaggttgctg ctgtctcaaa taaaaacaag ttggctgtgt aattccaccg attaccttgc gaagtcccct cactcccagc cccagacagc tccagaaggt ctgcagtagt tgccagtgaa tcatttgagc ctgtgcccgc ttatgagagc ctatgagaaa atctgggccc tacctacaaa taggaaattt ccacattctt tttctctcaa ccagtgtgtg gcagcactcc tgctgcccat catctgtggg agactactag agaggtgggt tcctgtctct ccagccactc tgagctgaga acaaaacaaa agattcggat gtggtggctc

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2166 <210> 9 <211> 2350 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 9 agtgttctca ctagttacct ctataaaata attatcagtt gggagtcaaa tctcgctctg agggaccgct gtgtaatctt gagatcagat acttcacttg gaagtcttag tcgaccaggc ctacgacgcc cagtaaacga gaactaatcc cggaagagtg ctgaattttt tggagtgcag atgctttgca tttaacttct cagtaaaatg gagggcatga tttttttttt tggtgcgatc catggattta gttatctcat agtgacactg ggtgggagga tgagacgaag gcaagctccg

120

180

240

300

360 tactaaagag ctgtgcttca aataccatta ctaggaatgg tttttttttt tcggctcact

- 15 032860 cctccccggt ccgccaccac tcaggatggt ggattacagg aagtatttag cgcgaagcca gcaaaccgct gtcttcctta agcacctgcg tgggggcgcg cggggccagg ggcccggccc ccgccctgga cctcagctgc tcctggtaga tcccggggct agtacctagt gttggaaggg aggtgctgtc gcagctcccc gtgcaacccg cggccgcttc cggaggaggc tggacaagtc agcaggtggg taggatcttg aagcttcccg aggcatctca ctttgccctg gggagaggat acacagtgcc acggagcctt ggactcgccg ttggtttaac <210> 10 <211> 1923 <212> ДНК <213> Homo <400> 10 gtcttctgag ggaatttgga ttatgaggtc ttctagccta ggggacatgc ggtgctgcaa cgggacaggt ttcagaaatg cagattactc ggtagcgaag gcttggattc tttgtatatg gtgattttat ttcccaagga accactaagg atgttccaaa aagtggtttt ctggtgaaga taacccttga ctattttttt tcaatgtacc agctctatca tcacgccatt gcctggctaa ctcgatctcc cgtgagcaac gtattcatac gattagttca ttgggtcctg tgtggagctc gagtggtggc ccgcctgagc cagggacagg ctcctggtca cggggcgcac cgcttctcca gacgtgggaa cccgcgggga tccggacgcg ataaggaggg tcgtgggcag tcatcccggc aagttggaag cagtttcggg cactcgatga gaccttagcg agccggtcag cttgaagggc cccaagtgga gatttgccca ttaatccgct tggaactgga gctggtgcgt agtaaagctg agacctagcc sapiens ctacgataat gtcactctga cccaaggatg cgtgttaatg aggtcaccac taagaaccgc ggcgggcaca gtggtgtcac aggttggtcc agagaggtgt ccatcatggc tgagctgtga ttcattgaat gcatacctcc gcatgttcat gggtcctcat aaaggggtct aaattactgc agaatagaag tttgctttcc attttactga gaacatattt ctcctgcctc tttttgtatt cgacctcatg cgagcccggc gtgggccgag tgaatgtgct cgtggagaat aacgcgactc cacagcgagg aggggtgcgg agcagccggg gcgcgctagc cgactgcgcg gcagcagctt cttttcttct ggcggcacgg ccggtccgac gcgagaggat ccgctgcctc tctctggggc gggcactccg gttcatgtct attggtatag cttcatccct cgtccccccg gcagcgagcg gaactggagc ccaaggtggc cctagaagag aagcttgatc tttcttctcg tgaatcagct tggtgcccat tttttggaac aatatatcct agagtctgtg gtgtgctgta caaatcaagc atagaagagc actcgggctc atgaatccgt tgtagcagtg gcttcaatcc ccctttgcag gaggtggcat tataaccaca aaaatccgag tcttcacttt tctgttcctc aaaaagattt tagagatcaa gacatagttg attttccagt gtgctaagga ataaaacttg agcctcccga tttagtagag atccacccgc cccagctgta ttttctcctc actgcacggg ggtttcgagt tcaggtattc cgctcgggag ggcggggaga cggcccggcc tgggctcggc cgcggctgcg caggcttctc cctggcgagg tgagcgtcct ttggatgccg ggggtggggg tcggctggta gccggggaga aagtaaggat gacagaatcc ggggtggtga ttaatctgag cccccacccc cttgggaggc gggtctggaa atctctacat agggcatcct tcctgcacct aatcagcatc cctaagcagt cccccgtcac ggcagaaatg ggaataagtg ctaagtcagt agctgatgtc aagggacctg ggtcacaaac aaccttcttg gtttggaagg gcaataaagt tggaggggca aaaattgtct tcacttaact agccaccacc aagagcaaat ctttctgctt ttttgaactt tggcaaaaca ctgattaact gattattgtg tagcagagat agcatatcaa ttggaatttt gtagctggga acggggtttc ctcagcctcc ttttatacat tctcatacaa gtggctaaga gagagccgaa aggaagaata aggcgcctgg aggccggccc aatcagcgcg tccgcactgc ggcaaacatc ccgcaggagc ctgcagaggt cgggctccgg gctctagtcg tggatttgga ccgagttaac gtgcctgtgc gtgtggctgg ccgggggtgc actcaccgtg ctaggatctt caccctgaag gtcttccagc gttgcgtctc ttctttcgct tgaccctacg ggtgaggctg atttaacgtt atgtacatgc cgagattcag attggttcta tgtttgacta gttgctgtcg cgcctcaagc tgaggtggtc ggtcaagtgc tgttgaagct agaggattgt caaaactacg gcaggaggcg aggatttcag ggcccagccc catttgacat cagagtcttc ttacaaaaga ttccttttgt tatttgcaga ggtaaagaac tgtgcattgt aaaatgagag ttccaatatt tacggctttt ctacaagcac accgtgttag caaagtgctg taaaaaagaa gcacattaca aatcctgctt ccctaaatcc ccttttgctc aggccggcag acgtggaccg ttccgcggcg tagctgcgcg gggagtcctg ttcgggcttc gatgggccgc tgcggcgatc agtaagaagg ccctgtattt tcagctcggt tgaggtcggc agagaggcag tctgctgatg agctcttttc tctaggagca ctctggttgc tgggagcgca tttccgcggg ctttttccca caaggagctc cccaagccag taggggctcc acgggttcac ggacccccct

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2350 gcaacagatg gaaccacatc cactggctct cagcacctcc gccgtgcaca tcttgcttcc tccattgtga aaagtgctgc aaggtaacgc gagctctttt caacttcata tctctgcttc cctctctgga aaaatggatc acttggatgt ccttgtatta tgtagattag gtttatttta atttttactt cgttttaact ttataaccaa gtgtagtcat

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

- 16 032860 gtaggtaaat tcaaatttat gaatttttag ctgtgttagc cagacatgtc aatgactgac tgggatgaat tccctgtcct cagttatttg aatttttgaa ata catttaaaat gccaattata actgtaaatg catcttattt tccacatatt ccagatttta tttatatatt ttcacattta attttattct tatttgttat ataaaacaat tgaaaagatt agttcttctt ctttaaaatc ctcaaatgct gatgtataat aagaaatgcc tagggggaaa tgcagaggga gatcatatga ctcaatttag ttaactccga aacttagctg tgagtcctga gtcatgcgga gttgttaaag aaaaacatag ataaatactt atggaaagga ataagtaaaa atcaagggtt gacaggagtc tttccctact ttggcttaat aacgtatgaa tacatactac tttctgcacc taatgttgtt atggaaagat aaattcatcc atttcttaga tttcagtgct tctgtgactt gattttgcag acagatgaag tgtaaaaata aagttaatta tatagcctaa ttgttggcgt tgctgatggc

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1923

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ выявления ВПЧ-индуцированных (индуцированных вирусом папилломы человека) предраковых поражений высокой степени и ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний, который включает определение гиперметилирования генов FAM19A4 и hsa-miR124-2 в клетках, причем такое гиперметилирование указывает на присутствие ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени и/или ВПЧ-индуцированных инвазивных раковых заболеваний.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное ВПЧ-индуцированное предраковое поражение высокой степени или ВПЧ-индуцированное инвазивное раковое заболевание являются предраковым поражением шейки матки высокой степени или инвазивным раком шейки матки.
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанное ВПЧ-индуцированное инвазивное раковое заболевание является инвазивным раком, индуцированным ВПЧ высокого риска.
4. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором гиперметилирование FAM19A4 указывает на присутствие поражения CIN3 (цервикальной интраэпителиальной неоплазии) поздних стадий.
5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанное гиперметилирование определяют в CpG-богатых последовательностях, представленных на фиг. 2.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что ВПЧ-индуцированное раковое заболевание представляет собой инвазивную карциному и указанное гиперметилирование является гиперметилированием CpG-богатого гена FAM19A4 и/или его промотора, повышенным в исследуемой клетке по сравнению со сравнимой нормальной клеткой.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что определение гиперметилирования осуществляется с использованием чувствительной к метилированию эндонуклеазы рестрикции, выбранной из группы, состоящей из рестриктаз BssHII, MspI, NotI и HpaII.
8. 8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что для определения гиперметилирования проводят специфическую к метилированию ПЦР, основанную на бисульфитной модификации ДНК, с последующими специфическими ПЦР-реакциями, нацеленными на CpG-богатые последовательности.
9. 9. Способ по п.8, в котором используют нуклеотидный зонд или праймер, связывающийся с нуклеотидной последовательностью FAM19A4, показанной на фиг. 2.
10. 10. Способ по п.9, где указанный нуклеотидный зонд или праймер имеет детектируемую метку.
11. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что нуклеотидный зонд имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

    а) полинуклеотидной последовательности, способной к гибридизации в жестких условиях с последовательностью FAM19A4, показанной на фиг. 2;

    б) полинуклеотида, характеризующегося по меньшей мере 70% идентичностью с полинуклеотидом а);

    в) полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду а); и

    г) полинуклеотида, содержащего по меньшей мере 15 нуклеотидных оснований из а) или б).
12. 12. Набор компонентов для применения в способе выявления ВПЧ-индуцированных предраковых поражений высокой степени или ВПЧ-индуцированных раковых заболеваний согласно п.1, включающий средство для определения гиперметилирования гена FAM19A4 и гиперметилирования гена hsamiR124-2, причем указанное средство содержит зонды и/или праймеры, специфичные для нуклеотидной последовательности FAM19A4 на фиг. 2, и зонды и/или праймеры, специфичные для нуклеотидной последовательности hsa-miR124-2;

    средство для выявления инфекции ВПЧ, отличающееся тем, что указанное средство содержит специфичные к ВПЧ зонды и праймеры.

    - 17 032860

    Промотор гена PRDM14, кодирующая последовательность, CpG-богатая последовательность интрона 1 и 3'UTR >hgl9_knownGene_ucOОЗхут.3 range=chr8:70963886-70984562 5'pad=0 3'pad=0 strand=- repeatMasking=none cccgccagctttagggactctggcggcgtctcttagccgggtagatgttc ctcctttccctctctcttccaagccgctgccaggccgggggtgaggctgc acctcagtcttcagccccgaaggccgcgcccggggcgggtcgctccccat tcagctaagaggaagcagcggccggggggcaggcgaggaacctgtcccgg ctcacccggcaagactgcgtttcccccaccctcggcgcttctttctgtga atgtgaatggaactaagcgttcctttctctccctcaatggccggcgagga gaattcaaatgcggtctttgggcgctcggtatgggtctggaccttggttt tcagagcctgcgcgtccaaggtcgctagcctttcccgaaggaagtgacag ctgcggcggcgcgggaggcccatcctcggtcgtttaaagccacttaagga ataaaagcccccgagagagcaaaacgaccacccgaaacctcggaagcgtc gggggtgccgggcccaacgctcccacgtgtcactgccggggactcgcgag gcgaagcttcccagcgctcaaggcgctcccgcctcgtccccaggtatcag gaacagacacccaccaggtccaccagcgggtcagacgccgccttcgggca ggctgggatcttccgaactgggagcggagagtaaggggctcgaccccggg acgcgagtccggccttctggactccggttcagggtgtgtgtgcgcgcgga ggggcttatctgggggccctgggtagcacacgtgttcggtttttttctcc ccgactccgcacgcctggagcggcaatactgcctgccctagaaggccagc ggcgagtgctcgccactagggtcccagggagggtttggaaaactgatgag ttaagtgagcgaccccaggggacagagggcgagtcgagagtcggccaatg gctgcggtgggcggggagaagacgacgcggggatctgcgtgggccgggtc AATTCCCTACCCTCGACCTGTCGATGCCCCGCGGCCCCGCCCGCCCTCTT AAGCCTGGCTCAGCCCTCAGGGCCCGCCCGAAGTCTACCGAGCCCGAGTG GCCTACCGAGCCCGAGTGGCCCCGCAGCGTCCAGGAGGCGCCCGCTCCGC GGTGGCGCTCTTGGAGGTGGTGTCGGAGgtaggcacgggacaggacgcgc ctggggcccggggcggtggtcttccagggccgttggggagggcggcagca ctcgctggcgcagttcgttttggatggtcgttctgccctctcgggggctt tgaatcccaagttgcagatccctgaggtcggaggaggctaggagaagggc gcctttggaggatcgggaggagacgggccgctgcctgtgtcgtggctgac ctcttctcctgaccccgtgttctttaatttctgagtcatgaccctgcttg gttttcttattgggctcattgatctcaagacccgccggccctgaaggggc ttcattcttcagcctcggtgaacttgctgcctgtctattaaaacgccatc ctttcccggcggtgcgggggcgggaggactggcagtcgccgaggctcttc gctcccacctggccagggctcgtccacgcggctcccgaggggctacccca ggccccaatagtcctggtagaatgattggagtttccgaggaacccgggga atgtggcggacgctgcccgcgagggaaaagaggttcaggcggcgcatcct agggcagccaaaagtggcgcgcccctcccctgcgggcagtcaggaccgcc aggacccgcggggtcacaccgctgggccagagcaggtcgcggggtccctg gacctgcccgggggctctgggagcgcgtctccatctgcgcggtgcgaccc agggtcctcggctcttccctcccagccgagggcccaggagcgcctggagc tgtcgcttgctccattgccctccgaccgcctgcgctcggctcccggccca gccccgaggttggcagggccccgcggctcccacagaccctaccaacgagt tttgtaggactgagaagaaggaaggaaagggaacttcaatgggttttgca ggaaccgggttgggggccgaaagcggagagcgggtgtgggaaggcggccg ggcttagggaaggggtgcttggagagggaaggggaaggcaacactaaccc ggaatttagagtagggcaggatcccggcagatttccgtttggggcttttt tgtgtttgcttctattgctgttttttcgttttgtcttaattgtgggagcg ggctggcgggatcggactgggggcgtttatcctgttcccttggatctggg gctggctggggtggaggaggctggtggggaggcgcgggtcggaccccggg aagctcccgcgcggtgtcctcagcggcgcccgcttttctgcag.......

    intron 1.......exon2-14: AGCCGCCGAGCGTGCGGTCCCG

    GGATGGCTCTACCCCGGCCAAGTGAGGCCGTGCCTCAGGACAAGGTGTGC TACCCGCCGGAGAGCAGCCCGCAGAACCTGGCCGCGTACTACACGCCTTT CCCGTCCTATGGACACTACAGAAACAGCCTGGCCACCGTGGAGGAAGACT TCCAACCTTTCCGGCAGCTGGAGGCCGCAGCGTCTGCTGCCCCCGCCATG CCCCCCTTCCCCTTCCGGATGGCGCCTCCCTTGCTGAGCCCGGGTCTGGG CCTACAGAGGGAGCCTCTCTACGATCTGCCCTGGTACAGCAAGCTGCCAC CGTGGTACCCAATTCCCCACGTCCCCAGGGAAGTGCCGCCCTTCCTGAGC AGCAGCCACGAGTACGCGGGTGCCAGCAGTGAAGATCTGGGCCACCAAAT CATTGGTGGCGACAACGAGAGTGGCCCGTGTTGTGGACCTGACACTTTAA TTCCACCGCCCCCTGCGGATGCTTCTCTGTTACCTGAGGGGCTGAGGACC TCCCAGTTATTACCTTGCTCACCCAGCAAGCAGTCAGAGGATGGTCCCAA ACCCTCCAACCAAGAAGGGAAGTCCCCTGCTCGGTTCCAGTTCACGGAGG AGGACCTGCACTTCGTTCTGTACGGGGTCACTCCCAGCCTGGAGCACCCA GCCAGCCTGCACCATGCGATTTCAGGCCTCCTGGTCCCCCCAGACAGCTC TGGATCTGATTCTCTTCCTCAAACTCTGGATAAAGACTCCCTTCAACTTC CAGAAGGTCTATGCCTCATGCAGACGGTGTTTGGTGAAGTCCCACATTTT GGTGTGTTCTGCAGTAGTTTTATCGCCAAAGGAGTCAGGTTTGGGCCCTT TCAAGGTAAAGTGGTCAATGCCAGTGAAGTGAAGACCTACGGAGACAATT CTGTGATGTGGGAGATCTTTGAAGATGGTCATTTGAGCCACTTTATAGAT GGAAAAGGAGGTACGGGGAACTGGATGTCCTATGTCAACTGTGCCCGCTT CCCCAAGGAGCAGAACCTAGTTGCTGTGCAGTGTCAAGGGCATATATTTT ATGAGAGCTGCAAAGAGATCCATCAGAACCAAGAGCTCCTTGTGTGGTAT GGAGACTGCTATGAGAAATTTCTGGATATTCCTGTGAGCCTTCAGGTCAC AGAGCCGGGGAAGCAGCCATCTGGGCCCTCTGAAGAGTCTGCAGAAGGCT ACAGATGTGAAAGATGTGGGAAGGTATTTACCTACAAATATTACAGAGAT AAGCACCTCAAGTACACCCCCTGTGTGGACAAGGGCGATAGGAAATTTCC CTGTTCTCTCTGCAAACGATCCTTTGAGAAGCGGGACCGGCTTCGGATCC ACATTCTTCATGTTCATGAGAAGCACCGGCCTCACAAGTGTTCTACATGT GGGAAATGTTTCTCTCAATCTTCCAGCCTAAACAAACACATGCGAGTCCA CTCTGGAGACAGACCATACCAGTGTGTGTATTGTACTAAGAGGTTCACAG CCTCCAGCATACTCCGCACACACATCAGGCAGCACTCCGGGGAGAAGCCC TTCAAATGCAAGTACTGTGGTAAATCTTTTGCATCCCATGCTGCCCATGA CAGCCATGTCCGGCGTTCACACAAGGAGGATGATGGCTGCTCATGCAGCA TCTGTGGGAAAATCTTCTCAGATCAAGAAACATTCTACTCCCACATGAAG TTTCATGAAGACTACTAGCCCTGCCAGGCACAATGACTCACGCCTGTAAT CCCAGCACTTTGGGAGGCAGAGGTGGGTGGATCACTCAAGTCCAGGAGTT CGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAATCCTGTCTCTACCAAAAAAATA CAAAAATCAGCTGGGGGTGGTGGCACATGCCTGTGGTTCCAGCCACTCAG GAGGTCGAGGTGGCAGGATGGTTTGAGCACAGGAGACGGAGGTTGCTGTG AGCTGAGATCGCCCCACTGCTTTTCAACCTGGGTGACAGAACCAGACCCT GTCTCAAAACAAAACAAAACAAAAAAAATGAGTAGCCCTCAAGAGTGTGG AGACAATGTAAAAACAAGAGATTCGGATTCTCTCTATTTCCTTTTATGGG TTATAGAAGTCCCTGCAGTTGGCTGTGTGTGGTGGCTCACGCCT