EA032432B1 - Специфический аналог трифторэтилхинолина для применения при лечении синдрома шегрена - Google Patents

Abstract

В заявке описан N-{(R)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-d]пиримидин-4-иламин, который проявляет эффективность при лечении и/или профилактике синдрома Шегрена.

Description

Настоящее изобретение относится к новому терапевтическому применению известного химического соединения. Более подробно настоящее изобретение относится к применению специфичного замещенного производного хинолина, содержащего фторированную этильную боковую цепь, для лечения синдрома Шегрена.

№{(К)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-д]пиримидин-4-иламин подробно описан в заявке 40 2012/032334. В данной публикации указано, что заявленные в ней соединения являются полезными фармацевтическими препаратами, прежде всего для лечения неблагоприятных воспалительных, аутоиммунных, сердечнососудистых, нейродегенеративных, метаболических, онкологических, ноцицептивных и офтальмологических состояний.

В заявке 40 2012/032334 отсутствует специальное раскрытие или предложение об эффективности описанных в ней соединений при лечении синдрома Шегрена.

Синдром Шегрена представляет собой хроническое аутоиммунное нарушение, при котором иммунные клетки атакуют и разрушают экзокринные железы, в основном слюнные и слезные железы. Характерным симптомом синдрома Шегрена является генерализованная сухость, прежде всего полости рта (ксеростомия) и глаз (ксерофтальмия, сухой кератоконъюктивит). Синдром Шегрена может вызвать сухость кожи, носовой полости и влагалища, а также других органов тела, таких как почки, кровеносные сосуды, легкие, печень, поджелудочная железа, мозг и периферическая нервная система. Синдром Шегрена по клинической классификации относят или к первичному нарушению (которое развивается само по себе) или к вторичному состоянию, когда оно развивается в комбинации по крайней мере с одним заболеванием соединительной ткани, таким как системная красная волчанка или ревматоидный артрит.

Считается, что синдром Шегрена встречается у 3% популяции с небольшими вариациями или без вариаций в зависимости от географического распространения. Предрасположенность женщин к развитию этого заболевания в 9 раз выше по сравнению с мужчинами. Средний возраст начала заболевания составляет 40-60 лет, при этом заболеваемость повышается с увеличением возраста.

Синдром Шегрена может поражать жизненно-важные органы тела и сопровождаться симптомами, которые могут стабилизироваться, ухудшаться или входить в ремиссию. Некоторые пациенты могут ощущать только незначительные симптомы сухости глаз или ротовой полости в умеренной степени, в то время как другие страдают от изнуряющих циклов, включающих хорошее самочувствие с последующим состоянием тяжелой степени. В то время как многие пациенты могут излечивать свои симптомы индивидуально, другим приходится страдать от нечеткости зрения, постоянного дискомфорта в глазах, повторных инфекционных заболеваний полости рта, опухших ушных слюнных желез, хрипоты и трудностей при глотании и еде. Изнуряющая усталость и боль в суставах могут значительно снизить качество жизни.

В настоящее время синдром Шегрена не поддается лечению и не существует эффективного способа восстановления секреции желез. Существующее лечение в основном является симптоматическим и поддерживающим и включает влагозамещающую терапию (например, для облегчения симптомов сухости глаз и полости рта) и различные способы смачивания. Существуют лекарственные средства, включая циклоспорин для лечения хронической сухости глаз и цевимелин или пиокарпин для стимуляции слюноотделения. Для облегчения симптомов опорно-двигательного аппарата назначают также противоспалительные агенты, такие как метотрексат и гидроксихлорохин. Однако ни один из существующих в настоящее время лекарственных препаратов не является идеальным, хотя бы только из-за широкого спектра значительных побочных эффектов.

Неожиданно было установлено, что Ы-{(К)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]-2,2,2трифторэтил}пиридо[3,2-б]пиримидин-4-иламин проявляет эффективность ίη νίνο на модели синдрома Шегрена у животных.

В настоящем изобретении предлагается Ы-{(К)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-б]пиримидин-4-иламин формулы (А):

Ν чХ

О' (А) или его фармацевтически приемлемая соль для лечения и/или профилактики синдрома Шегрена.

В настоящем изобретении предлагается также способ лечения и/или профилактики синдрома Шегрена, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества Ν{(К)-1-[8-хлор-2-(1 -оксипиридин-3 -ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо [3,2-ά] пиримидин-4

- 1 032432 иламина формулы (А), как показано выше, или его фармацевтически приемлемой соли.

В настоящем изобретении предлагается также применение Ы-{(В)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-6]пиримидин-4-иламина формулы (А), как показано выше, или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики синдрома Шегрена.

Для эффективного лечения и/или профилактики синдрома Шегрена предлагается фармацевтическая композиция, включающая Ν-{ (К)-1 -[8-хлор-2-( 1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил] -2,2,2-трифторэтил}пиридо [3,2-6] пиримидин-4-иламин формулы (А), как показано выше, или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Типичные фармацевтические композиции можно использовать в пригодной форме для перорального, трансбуккального, парентерального, интраназального, местного, офтальмологического и ректального введения или для введения с использованием ингаляции или вдувания.

Для перорального введения фармацевтические композиции можно использовать, например, в форме таблеток, пастилок, капсул, растворов, сиропов или суспензий или в виде сухого продукта для разведения водой или другим носителем перед применением. Для трансбуккального введения композиции можно использовать в форме таблеток или пастилок. Для парентерального введения композиции могут быть в форме инъекций, например в виде струйного введения или вливания для подкожного введения, или в виде состава пролонгированного действия, например в виде лекарственного депо, которое можно вводить трансплантацией или внутримышечной инъекцией, и составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы, например в стеклянных ампулах или контейнерах со множеством доз, например в стеклянных флаконах, и в форме такой как суспензии, растворы или эмульсии в масляном или водном носителе, или активный ингредиент может быть представлен в порошкообразной форме для разведения пригодным носителем, например апирогенной стерильной водой перед использованием. Для интраназального или для ингаляционного введения композицию можно использовать в виде аэрозольного спрея или небулайзера. Для местного введения композиция может быть представлена в форме мази или лосьона. Для офтамологического введения композиция может быть представлена в виде тонкодисперсной суспензии или мази. Для ректального введения композицию можно использовать в виде свечей.

Композиции можно перерабатывать стандартными способами, известными фармацевтике, например, как описано в справочнике Кепипфоп: 1Нс 8аеисе апб Ргасйсе о£ Рйагтасу, Рйагтасеи11са1 Рге§8, 21 изд. (2011).

Для применения при лечении и/или профилактике синдрома Шегрена №{(К.)-1-[8-хлор-2-(1оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-6]пиримидин-4-иламин или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить в суточной дозе приблизительно от 1 нг/кг до 1000 мг/кг, обычно приблизительно от 2 нг/кг до 500 мг/кг, как правило приблизительно от 5 нг/кг до 200 мг/кг, приемлемо приблизительно от 10 нг/кг до 100 мг/кг, предпочтительно от 10 нг/кг до 50 мг/кг, более предпочтительно от 10 нг/кг до 40 мг/кг в расчете на массу тела человека. Обычно активный ингредиент вводят от 1 до 4 раз в сутки.

При необходимости Ν-{(Κ)-1 -[8-хлор-2-( 1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо [3,2-6] пиримидин-4-иламин или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить в комбинации с другим фармацевтически активным агентом, например противовоспалительным соединением, таким как метотрексат или гидроксихлорохин.

Особые аспекты настоящего изобретения описаны ниже. №{(К.)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо [3,26]пиримидин-4-иламин (далее соединение (А)) исследовали ίη νίνο на индуцируемой модели эктопического лимфонеогенеза в слюнных железах мыши, которая имитирует синдром Шегрена. Полученные результаты представлены на прилагаемых фигурах.

На фиг. 1 представлен анализ профиля лимфоцитов с использованием активированного флуоресценцией сортинга клеток (РАС8) в день 15 после катетеризации слюнных желез мышей, которым вводили носитель или соединение (А) в профилактических целях в день 0.

Носитель: η = 3 мыши

Соединение (А): η = 5 мышей

ΜΖ В-клетки = В-клетки маргинальной зоны

РО В-клетки = Фолликуллярные В-клетки * р < 0,05 ** р < 0,01

На фиг. 2 представлен анализ профиля лимфоцитов методом РАС8 в день 15 после катетеризации слюнных желез мышей, которым вводили носитель или соединение (А) в лечебных целях в день 3 после

- 2 032432 катетеризации.

Носитель: η = 4 мыши

Соединение (А): η = 5 мышей

ΜΖ В-клетки = В-клетки маргинальной зоны РО В-клетки = Фолликуллярные В-клетки * р< 0,05 ** р < 0,01

На фиг. 3 приведена экспрессия связанных с ТЬО (третичного лимфоидного органа) генов в день 15 после катетеризации слюнных желез мышей, которым вводили носитель или соединение (А) в профилактических целях в день 0. Количественный анализ мРНК методом ОТ-ПЦР распознает кодирование требуемых генов, нормализованных по конститутивным генам. Относительные величины экспрессии, обозначенные ВО, калибровали по величинам в день 0 после катетеризации слюнных желез.

Носитель: η = 3 мыши

Соединение (А): η = 2 мыши * р < 0,05

На фиг. 4 приведена экспрессия связанных с ТЬО генов в день 15 после катетеризации слюнных желез мышей, которым вводили носитель или соединение (А) в профилактических целях в день 0 или в лечебных целях в день 3 после катетеризации.

Носитель: η = 3 мыши

Соединение (А), день 0 после катетеризации: η = 3 мыши Соединение (А), день 3 после катетеризации: η = 3 мыши *р< 0,05 ** р < 0,01 *** р < 0,001

Способ.

Соединение (А) оценивали на модели мыши ίη νίνο по индуцируемому формированию эктопической ткани, как описано в работе М. ВотЬагШсп и др. 1. 1ттипо1., 189, 3767-3776 (2012), которая является признанной моделью синдрома Шегрена у животных.

Краткое описание способа.

Мышам дикого типа (С57ВБ/6) вводили репликативно дефективный аденовирус 5 (АдУ5) (10⁸ бляшкообразующих единиц (БОЕ)) с использованием ретроградной катетеризации выводного протока подчелюстной железы и животных умерщвляли через определенные периоды времени после катетеризации. Соединение (А) или контроль-носитель вводили ежедневно через зонд в профилактических и в лечебных целях, начиная в день 0 или в день 3 после катетеризации соответственно. Для оценки иммунного статуса клеток в извлеченных слюнных железах мыши использовали проточную цитометрию суспензий отдельных клеток и количественную ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии белка и мРНК в образцах.

Ферментативное расщепление слюнных желез и проточная цитометрия.

Расщепление стромальных клеток.

Инфицированные репликативно дефективным вирусом АдУ5 слюнные железы мыши, которой вводили соединение (А) или носитель, извлекали из выбранной мыши через различные периоды времени. Железы препарировали и помещали в среду ΒΡΜΙ-1640 (содержащую 2% ЭТС, 1 мл) во льду. После сбора всех слюнных желез среду ΒΡΜΙ-1640 удаляли и заменяли на смесь ферментов (ΒΜΡΙ, содержащую 2% ЭТС, 0,8 мг/мл диспазы, 0,2 мг/мл коллагеназы Р и 0,1 мг/мл ДНКазы Ι, 2 мл). Слюнные железы нарезали на маленькие кусочки и пробирки инкубировали при 37°С на водяной бане при перемешивании на магнитной мешалке. Через 20 мин фрагменты слюнных желез осторожно измельчали с использованием пипетки объемом 1 мл для более интенсивного разрушения ткани и высвобождения большинства клеток. Смесь переносили на водяную баню и выдерживали для оседания крупных фрагментов в течение 30 с, и затем смесь ферментов удаляли. Добавляли ледяной буферный раствор ЕАС8 (0,5% БСА, 2 мМ ЭДТУ в ФБР, 10 мл) и центрифугировали (1800 об/мин, 4 мин, 4°С). После центрифугирования в пробирку для расщепления добавляли свежую смесь ферментов (2 мл). Содержимое осторожно измельчали с использованием пипетки объемом 1 мл и инкубировали при периодическом осторожном перемешивании с использованием пипетки объемом 1 мл. Через 10 мин клетки интенсивно перемешивали в течение 30 с с использованием пипетки объемом 1 мл. Смесь снова инкубировали для оседания фрагментов, суперна

- 3 032432 тант удаляли и добавляли в предварительно отцентрифугированный клеточный дебрис и в пробирку для расщепления добавляли свежую смесь ферментов (2 мл). Смесь для расщепления затем интенсивно перемешивали с использованием пипетки объемом 1 мл каждые 5 мин до тех пор, пока при осмотре каждой пробирки для сбора образцов не становилось ясно, что все оставшиеся фрагменты слюнных желез полностью расщепились. Супернатанты центрифугировали после каждого удаления (1800 об/мин, 4 мин, 4°С) до тех пор, пока в конце концов не оказывалась, что каждая пробирка для сбора образцов содержала все содержимое клеток слюнных желез. Клетки отфильтровывали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 70 мкм и их количество оценивали с использованием гемоцитометра.

Анализ методом проточной цитометрии.

Суспензии индивидуальных клеток инкубировали в смеси с разбавленными антителами (100 мкл) в течение 30 мин при 4°С в ледяном буферном растворе ЕАС8 (0,5% БСА, 2 мМ ЭДТУ в ФСБ), содержащем коктейли следующих антител: СЭ45 РЕВСРСУ5.5 (1:300) или СЭ45 еЕ1иог780 (1:800) клон 30-Е11, СО3е РЕСУ7 или Е1ТС (1:100) клон 145-2С11, СЭ4 еЯиог450 (1:100) клон ВМ4-5, СО62Е РЕ (1:500) клон МЕЬ-14, СИ44 Е1ТС (1:500) клон ΙΜ7, СО8а АРС (1:400) клон 53-6.7, В220 МТС (1:200) или В220 еДиог450 (1:50) клон ВА3-6В2, СО23 РЕ (1:200) клон ВЗВ4, СО19 РЕ (1:200) или АРС-СУ7 (1:100) клон 1Ό3, СИ5 МТС (1:100) клон 53-7.3 (все антитела фирмы еВюкшепсе) и СИ21 АРС (1:50) клон 7С6 (все антитела фирмы ΒΌ Вюкаепсек). Внутриклеточное окрашивание К167 проводили с использованием набора буферных растворов для фиксации/пермеабилизации (фирмы еВюкаепсе) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Краткое описание метода.

После окрашивания поверхности коктейлями требуемых антител клетки промывали буферным раствором ЕАС8, ресуспендировали в буферном растворе для фиксации/перемеабилизации (фирмы еВю8С1епсе, 350 мкл) и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Клетки дважды промывали буферным раствором для пермеабилизации (фирмы еВюкшепсек) при 1800 об/мин в течение 4 мин и затем инкубировали в К167 А1еха-Е1иог647 (1:50) клон В56 (фирмы ВО ВюкОепсек) при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали буферным раствором для промывки, ресуспендировали в буферном растворе ЕАС8 и анализировали с использованием Суап-АЭР (Нако) с настроенной проточной цитометрией на исключение нежизнеспособных клеток. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения Е1о\\'1о (Тгее 81:аг).

Результаты.

Значительное уменьшение числа Т и В клеток наблюдали ш у1уо в катетеризированных слюнных железах мыши, которой в целях профилактики вводили соединение (А), по сравнению с мышью, которой водили носитель, по данным проточной цитометрии изолированных лимфоцитов (фиг. 1). Аналогичным образом значительное снижение числа Т и В клеток наблюдали ш у1уо в катетеризированных слюнных железах мыши, которой в лечебных целях вводили соединение (А) в день 3 после катетеризации, по сравнению с мышью, которой водили носитель, по данным проточной цитометрии изолированных лимфоцитов (фиг. 2).

Наблюдали также значительное ингибирование профиля экспрессии связанных с ТЬО генов у мышей, которым вводили в профилактических целях соединение (А) (фиг. 3 и 4). Такое снижение сохраняется у мышей, которых лечили начиная с дня 3 после катетеризации (фиг. 4).

Выводы.

Проведенные испытания свидетельствуют о том, что соединение (А) проявляет эффективность при введении его в профилактических или лечебных целях и приводит к уничтожению воспалительных очагов и регрессии ш у1уо воспаления слюнных желез в признанной модели синдрома Шегрена у животных.

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение Ν-{ (В)-1 -[8-хлор-2-( 1-оксипиридин-3-ил)хинолин-3 -ил] -2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-б]пиримидин-4-иламина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения и/или профилактики синдрома Шегрена.
2. 2. Применение по п.1, где синдромом Шегрена является первичный синдром Шегрена.
3. 3. Способ лечения и/или профилактики синдрома Шегрена, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества №{(В)-1-[8-хлор-2-(1-оксипиридин-3ил)хинолин-3-ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-б]пиримидин-4-иламина или его фармацевтически приемлемой соли.
4. 4. Способ по п.3, где синдромом Шегрена является первичный синдром Шегрена.
5. 5. Применение Ν-{(Β)-1 -[8-хлор-2-( 1-оксипиридин-3 -ил)хинолин-3 -ил]-2,2,2-трифторэтил}пиридо[3,2-б]пиримидин-4-иламина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики синдрома Шегрена.
6. 6. Применение по п.5, где синдромом Шегрена является первичный синдром Шегрена.

   - 4 032432

   Число клеток СО3₅+СО62Ь+СО44-

   Т-клетки памяти