EA030454B1 - КОНЪЮГАТ МОНОМЕРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПОЛИПЕПТИДА И ФРАГМЕНТА Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПОНИЖЕННЫМ КЛИРЕНСОМ, ОПОСРЕДОВАННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ - Google Patents

КОНЪЮГАТ МОНОМЕРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПОЛИПЕПТИДА И ФРАГМЕНТА Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПОНИЖЕННЫМ КЛИРЕНСОМ, ОПОСРЕДОВАННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Download PDF

Info

Publication number
EA030454B1
EA030454B1 EA201690116A EA201690116A EA030454B1 EA 030454 B1 EA030454 B1 EA 030454B1 EA 201690116 A EA201690116 A EA 201690116A EA 201690116 A EA201690116 A EA 201690116A EA 030454 B1 EA030454 B1 EA 030454B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
immunoglobulin
fragment
physiologically active
conjugate
active polypeptide
Prior art date
Application number
EA201690116A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690116A1 (ru
Inventor
Сун Хи Парк
Мин Юнг Ким
Хьюнг Кю Лим
Сан Мин Бэ
Сун Юб Чун
Се Чанг Квон
Original Assignee
Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханми Фарм. Ко., Лтд. filed Critical Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Publication of EA201690116A1 publication Critical patent/EA201690116A1/ru
Publication of EA030454B1 publication Critical patent/EA030454B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической композиции длительного действия, содержащей конъюгат, который содержит физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19; конъюгату мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащему мономер физиологически активного полипептида, связанный через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина, в котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженную опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина; и к способу получения данной фармацевтической композиции длительного действия.

Description

Изобретение относится к фармацевтической композиции длительного действия, содержащей конъюгат, который содержит физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19; конъюгату мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащему мономер физиологически активного полипептида, связанный через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина, в котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженную опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина; и к способу получения данной фармацевтической композиции длительного действия.
030454
Область техники
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции длительного действия, содержащей конъюгат, который содержит физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19; конъюгату мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащему мономер физиологически активного полипептида, связанный через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина, в котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина; и к способу получения данной фармацевтической композиции длительного действия.
Предшествующий уровень техники
Известно, что in vivo белки подвергаются клиренсу посредством разных механизмов, включающих деградацию протеазами сыворотки, элиминация через почки или клиренс посредством рецепторов. Таким образом, были сделаны разные попытки избежать таких механизмов клиренса белка для увеличения периода полувыведения физиологически активных белков для того, чтобы усилить посредством этого их терапевтическую эффективность. В частности, проводили исследования на конъюгатах белка, которые содержат полиэтиленгликолевый полимер (ПЭГ), альбумин, жирную кислоту или фрагмент Fc (константную область) антитела, связанные с белком для того, чтобы увеличить период полувыведения белка. Такие исследования нацелены на ковалентное связывание данного вещества с физиологически активным белком для того, чтобы увеличить период полувыведения физиологически активного белка в сыворотке и сократить интервал введения лекарственного средства для повышения посредством этого удобства пациента. В частности, для того чтобы стабилизировать белки и ингибировать их контакт с протеазами и их устранение через почки, используют способ химического присоединения высокорастворимых полимеров, таких как ПЭГ, к поверхности белковых лекарственных средств.
В случае данного способа известно, что полимер неспецифично связывается со специфическим сайтом или разными сайтами белка-мишени для увеличения растворимости белка, стабилизации белка и предотвращения гидролиза белка и, кроме того, не вызывает особых побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991). Однако этот способ обладает недостатками, заключающимися в том, что даже несмотря на то, что ПЭГ, связанный с физиологически активным белком, может увеличивать стабильность белка, он значительно снижает титр белка, и по мере увеличения молекулярной массы ПЭГ его реакционная способность с белком снижается, приводя к уменьшению выхода. Кроме того, когда специфический аминокислотный остаток белка модифицирован жирными кислотами, модифицированная жирная кислота обратимо связывается с сывороточным альбумином с увеличением периода полувыведения белка в сыворотке, но данный период полувыведения составляет примерно от одних суток до одной недели, указывая на то, что увеличение периода полувыведения не является таким значительным. Кроме того, имеется недостаток, состоящий в том, что физиологически активный белок, обратимо диссоциировавший от альбумина, легко устраняется через почки.
По этим причинам предпринимали усилия по использованию фрагментов иммуноглобулинов для увеличения периода полувыведения физиологически активных веществ, включающих белки. В частности, активно проводили исследования для увеличения стабильности терапевтических белков посредством слияния терапевтических белков с такими фрагментами Fc иммуноглобулина.
Известна экспрессия интерферона (выложенная в открытый доступ публикация корейского патента № 20039464), рецептора интерлейкина-4, рецептора интерлейкина-7 или рецептора эритропоэтина (корейский патент № 249572) в виде слияния с фрагментом Fc иммуноглобулина у млекопитающего посредством способа генной инженерии. Также в международной публикации патента № WO 01/03737 раскрыт слитый белок, содержащий цитокин или фактор роста, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина через олигопептидный линкер. Кроме того, в патенте США № 5116964 раскрыт слитый белок, содержащий LHR (гликопротеин клеточной поверхности лимфоцита) или белок CD4, слитый с аминоили карбоксильным концом фрагмента Fc иммуноглобулина посредством генной инженерии, и в патенте США № 5349053 раскрыт слитый белок IL-2 (интерлейкин-2) с фрагментом Fc иммуноглобулина. Кроме того, примеры белков, слитых с Fc, полученных методами генной инженерии, включают слитый белок интерферона-бета или его производного с фрагментом Fc иммуноглобулина (международная публикация патента № WO 00/23472), слитый белок рецептора IL-5 с фрагментом Fc иммуноглобулина (патент США № 5712121), слитый белок интерферона-альфа с фрагментом Fc иммуноглобулина G4 (патент США №
- 1 030454
5723125) и слитый белок белка CD4 с фрагментом Fc иммуноглобулина G2 (патент США № 6451313). Кроме того, патент США № 5605690 относится к модификации аминокислотных остатков во фрагменте Fc иммуноглобулина и раскрывает слитый белок TNFR-Fc lgG1, полученный способом генной инженерии с использованием фрагмента Fc, полученного модифицированием аминокислотных остатков конкретного сайта связывания комплемента или сайта связывания рецептора во фрагменте Fc иммуноглобулина. Более того, способы получения слитых белков способом генной инженерии с использованием области Fc иммуноглобулина, модифицированной, как описано выше, также раскрыты в патентах США №№ 6277375, 6410008 и 6444792. Однако требуется, чтобы биомедицинские препараты, имеющие фрагмент Fc иммуноглобулина, слитый с ними, преодолевали проблемы цитотоксичности, вызванные эффекторной функцией, присущей фрагменту Fc.
Описание изобретения
Техническая проблема.
Авторы настоящего изобретения предприняли значительные усилия для получения конъюгата, имеющего повышенный период полувыведения в сыворотке in vivo, посредством слияния фрагмента Fc иммуноглобулина с физиологически активным полипептидом. В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что при связывании физиологически активного полипептида в мономерной форме с фрагментом Fc иммуноглобулина он демонстрирует значительно пониженный клиренс, опосредованный рецептором, а также демонстрирует длительный период полувыведения даже в крысиной животной модели по сравнению с ситуацией, когда физиологически активный полипептид присутствует в мультимерной форме, посредством этого осуществляя настоящее изобретение.
Техническое решение.
Целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции длительного действия, содержащей конъюгат, содержащий физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, который содержит мономер физиологически активного полипептида, связанный через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина, в котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению с конъюгатом, содержащим физиологически активный полипептид, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения фармацевтической композиции длительного действия, включающего: (а) связывание физиологически активного полипептида с фрагментом Fc иммуноглобулина с получением смеси конъюгатов физиологически активный полипептид-фрагмент Fc иммуноглобулина; и (б) выделение из смеси конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащего одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина.
Полезные эффекты.
Как описано выше, конъюгат по изобретению, содержащий мономер физиологически активного полипептида, связанный с Fc иммуноглобулина, демонстрирует значительно пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс и, таким образом, имеет увеличенный период полувыведения в сыворотке. Соответственно конъюгат по настоящему изобретению может давать лекарственное средство, имеющее увеличенный период полувыведения в сыворотке и терапевтическое преимущество.
Описание графических материалов
На фиг. 1 схематически показана типичная структура конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина (фиг. 1А) и самая основная конфигурация конъюгата димер физиологически активного полипептида-Fc (фиг. 1Б).
На фиг. 2 показано сравнение степени интернализации рецептора между конъюгатом агониста GLP1-фрагмента Fc иммуноглобулина (пример по настоящему изобретению) и слитым белком агонист GLP1-фрагмент Fc иммуноглобулина, в котором агонист GLP-1 присутствует в димерной форме (сравнительный пример).
На фиг. 3 показано сравнение фармакокинетики in vivo между конъюгатом агониста GLP-1 из примера по настоящему изобретению и конъюгатом агониста GLP-1 из сравнительного примера.
Лучший способ.
Для достижения приведенных выше целей в одном аспекте согласно настоящему изобретению
- 2 030454
предложена фармацевтическая композиция длительного действия, содержащая конъюгат, содержащий физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19.
В одном воплощении конъюгат, который включен в фармацевтическую композицию длительного действия, может содержать непептидильный линкер, вставленный между физиологически активным полипептидом и фрагментом Fc иммуноглобулина, для связывания физиологически активного полипептида с фрагментом Fc иммуноглобулина.
В другом воплощении мономерный конъюгат может демонстрировать пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
В еще одном воплощении физиологически активный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из следующих: глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), человеческий гормон роста (hGH), эритропоэтин (EPO), глюкагон, оксинтомодулин, инсулин, гормон, высвобождающий гормон роста, пептид, высвобождающий гормон роста, интерфероны, рецепторы интерферонов, рецептор, связанный с G-белком, интерлейкины, рецепторы интерлейкинов, ферменты, белки, связывающие интерлейкины, белки, связывающие цитокины, фактор активации макрофагов, пептид макрофагов, фактор B-клетки, фактор T-клетки, белок A, ингибитор аллергии, гликопротеины некроза клеток, иммунотоксин, лимфотоксин, фактор некроза опухоли, супрессоры опухолей, фактор роста метастазов, альфа-1 антитрипсин, альбумин, а-лактальбумин, аполипопротеин-E, сильно гликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины, гемоглобин, тромбин, пептид, активирующий рецептор тромбина, тромбомодулин, факторы крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, фактор активации плазминогена, пептид, связывающий фибрин, урокиназа, стрептокиназа, гирудин, белок C, C-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутаза, лептин, фактор роста тромбоцитов, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, фактор роста кости, белок, стимулирующий рост кости, кальцитонин, атриопептин, фактор, индуцирующий рост хряща, элкатонин, фактор активации соединительной ткани, ингибитор пути тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, люлиберин, фактор роста нервов, паратиреоидный гормон, релаксин, секретин, соматомедин, инсулиноподобный фактор роста, гормон коры надпочечников, холецистокинин, полипептид поджелудочной железы, гастрин-рилизинг пептид, кортикотропинрилизинг гормон, тиреотропин, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, антигены поверхности клетки, антигены вакцины вирусного происхождения, моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты антител.
В еще одном воплощении физиологически активный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), человеческого гормона роста (hGH), эритропоэтина (EPO), глюкагона, оксинтомодулина, инсулина и их производных.
В еще одном воплощении непептидильный линкер может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоль-пропиленгликоль, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида декстрана, поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, галуроновой кислоты и их комбинации.
В еще одном воплощении непептидильный линкер может иметь молекулярную массу, варьирующую от 1 до 100 кДа.
В еще одном воплощении фрагмент Fc иммуноглобулина может состоять из 1-4 доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов CH1, CH2, CH3 и CH4.
В еще одном воплощении фрагмент Fc иммуноглобулина может дополнительно содержать шарнирную область.
В еще одном воплощении фрагмент Fc иммуноглобулина может быть выбран из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, их комбинаций и их гибридов.
В еще одном воплощении фрагмент Fc иммуноглобулина может представлять собой фрагмент Fc
IgG4.
В еще одном воплощении фрагмент Fc иммуноглобулина может находиться в негликозилированной форме.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, который содержит мономер физиологически активного полипептида, связанный через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина, в
- 3 030454
котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения фармацевтической композиции длительного действия, включающий: (а) связывание физиологически активного полипептида с фрагментом Fc иммуноглобулина с получением смеси конъюгатов физиологически активный полипептид-фрагмент Fc иммуноглобулина; и (б) выделение из смеси конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащего одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина.
В одном воплощении физиологически активный полипептид и фрагмент Fc иммуноглобулина, которые включены в конъюгат в данном способе, могут быть связаны друг с другом посредством непептидильного линкера.
В еще одном воплощении конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина в данном способе, может демонстрировать пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Способ осуществления изобретения
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция длительного действия, содержащая конъюгат, содержащий физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19.
В одном воплощении настоящего изобретения обнаружили, что конъюгат, содержащий мономер физиологически активного полипептида, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, демонстрировал пониженные опосредованную рецептором интернализацию и опосредованный рецептором клиренс по сравнению с конъюгатом, содержащим мультимер физиологически активного полипептида, в частности, с димером физиологически активного полипептида, связанным с фрагментом Fc иммуноглобулина, и, таким образом, может иметь повышенный период полувыведения в сыворотке. Таким образом, обнаружили, что лекарственное средство, содержащее конъюгат, который содержит мономер физиологически активного полипептида, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, для демонстрации пониженного клиренса, опосредованного рецептором, может использоваться в качестве лекарственного средства длительного действия, так как оно демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию и опосредованный рецептором клиренс. Другими словами, настоящее изобретение основано на открытии того, что конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию и опосредованный рецептором клиренс по сравнению с мультимерным конъюгатом, в частности с димерным конъюгатом.
Термин "фармацевтическая композиция длительного действия" в том виде, как он здесь используется, относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, который демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию и опосредованный рецептором клиренс по сравнению с самим физиологически активным полипептидом или с конъюгатом мультимер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина. Другими словами, данный термин относится к фармацевтической композиции, содержащей мономерный конъюгат, который содержит одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина. Кроме того, термин "фармацевтическая композиция" можно использовать взаимозаменяемо с термином "композиция".
В фармацевтической композиции по настоящему изобретению мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, может присутствовать в молярном отношении по меньшей мере 19:1, предпочтительно по меньшей мере 99:1, более предпочтительно по меньшей мере 500:1 по отношению к мультимерному конъюгату, содержащему две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с фрагментом Fc иммуноглобулина. Другими словами, фармацевтическая композиция длительного действия отличается тем, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерно- 4 030454
му конъюгату ([мономерный конъюгат]/[мультимерный конъюгат]) составляет по меньшей мере 19.
Согласно одному воплощению настоящего изобретения физиологически активный полипептид в конъюгате физиологически активный полипептид-непептидильный полимер-фрагмент Fc иммуноглобулина присутствует в мономерной форме, и в данном случае конъюгат имеет более длительную продолжительность действия in vivo по сравнению со случаем, в котором физиологически активный полипептид присутствует в димерной форме. Таким образом, в случае композиции, в которой в качестве конъюгата присутствует только мономерный конъюгат без мультимерного конъюгата или в которой молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату, в частности к димерному конъюгату, составляет по меньшей мере 19, данная композиция имеет превосходный эффект увеличения периода полувыведения физиологически активного полипептида в сыворотке по сравнению с другими композициями.
В частности, мономерный конъюгат согласно настоящему изобретению имеет длительную продолжительность действия in vivo, так как интернализация физиологически активного полипептида, опосредованная рецептором, уменьшается по сравнению с мультимерным конъюгатом, содержащим две или более чем две молекулы физиологически активного полипептида, связанные с фрагментом Fc иммуноглобулина. В частности, известно, что почечная экскреция, другой механизм, который определяет период полувыведения молекулы, зависит от молекулярной массы молекулы. Таким образом, если бы почечная экскреция была важной переменной, которая определяет период полувыведения, тогда период полувыведения возрастал бы по мере увеличения отношения мультимерного конъюгата, имеющего более высокую молекулярную массу. Однако в настоящем изобретении было обнаружено, что мономерный конъюгат демонстрировал более длительную продолжительность действия in vivo. В этом отношении можно видеть, что опосредованная рецептором интернализация является важным фактором увеличения периода полувыведения in vivo конъюгата согласно настоящему изобретению. Такие результаты могут приписываться полезным эффектам (например, пониженное стерическое препятствие) мономерного конъюгата, которые не могли быть обнаружены в мультимерном конъюгате.
Таким образом, фармацевтическая композиция длительного действия по настоящему изобретению может демонстрировать более длительную продолжительность действия in vivo по сравнению с фармацевтической композицией, содержащей либо конъюгат мультимер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, либо конъюгат, содержащий димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с Fc иммуноглобулина. В частности, в фармацевтической композиции по настоящему изобретению мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, может присутствовать в молярном отношении по меньшей мере 19:1, предпочтительно по меньшей мере 99:1, более предпочтительно по меньшей мере 500:1 относительно мультимерного конъюгата, содержащего две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с фрагментом Fc иммуноглобулина, и в этом случае композиция, содержащая мономерный конъюгат и мультимерный конъюгат дает превосходную композицию длительного действия, так как период полувыведения композиции in vivo не уменьшается.
Термин "конъюгат физиологически активный полипептид-фрагмент Fc иммуноглобулина" в том виде, как он здесь используется, относится к конъюгату, содержащему физиологически активный полипептид, конъюгированный с фрагментом Fc иммуноглобулина. Предпочтительно конъюгат может содержать непептидильный линкер, вставленный между физиологически активным полипепидом и фрагментом Fc иммуноглобулина для связывания физиологически активного полипепида с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Термин "конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина" в том виде, как он здесь используется, относится к конъюгату, содержащему мономер физиологически активного полипептида, конъюгированный с фрагментом Fc иммуноглобулина. Данный конъюгат включает форму, в которой один физиологически активный полипепид связан с одним фрагментом Fc иммуноглобулина. Здесь один фрагмент Fc иммуноглобулина предпочтительно находится в форме, в которой две цепи Fc связаны друг с другом, например, посредством дисульфидной связи, но не ограничивается ей. Структура этого конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина проиллюстрирована на фиг. 1, но не ограничивается ей. В данном описании изобретения термин "конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина" используется взаимозаменяемо с термином "мономерный конъюгат".
Конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина характеризуется тем, что он демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с мультимерным конъюгатом, содержащим две или более чем две молекулы физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим мультимер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина. Таким образом, лекарственное средство, которое содержит один конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина или содержит данный конъюгат в высоком отношении, демонстрирует большую про- 5 030454
должительность действия in vivo и превосходную терапевтическую эффективность.
В то же время мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы физиологически активного полипептида, связанные с фрагментом Fc иммуноглобулина, включает форму, в которой две или более чем две молекулы физиологически активного полипептида связаны с одним фрагментом Fc иммуноглобулина (например, состоящим из двух цепей Fc, связанных друг с другом дисульфидным мостиком или тому подобным).
В частности, конъюгат димер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина включает форму, в которой две молекулы физиологически активного полипептида связаны с одним фрагментом Fc иммуноглобулина (например, состоящим из двух цепей Fc, связанных друг с другом дисульфидным мостиком или тому подобным). Здесь физиологически активный полипептид может быть связан через непептидильный линкер с каждой из двух цепей, составляющих фрагмент Fc иммуноглобулина, но не ограничиваясь им. Данная конфигурация показана на фиг. 1(Б).
Кроме того, конъюгат в рамке считывания включает форму, в которой мультимер физиологически активного полипептида, в частности димер физиологически активного полипептида, связывается в рамке считывания с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и также образуется мультимер, в котором два или более чем два слитых полипептида, содержащих физиологически активный полипептид сливаются с фрагментом Fc иммуноглобулина.
В то же время в конъюгате мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина согласно настоящему изобретению мономер физиологически активного полипептида ковалентно связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Термин "непептидильный линкер" в том виде, как он здесь используется, относится к биосовместимому полимеру, состоящему из двух или более чем двух повторяющихся звеньев, связанных друг с другом, в котором повторяющиеся звенья связаны друг с другом посредством любой непептидной ковалентной связи. Данный непептидильный линкер может иметь два конца или три конца.
Непептидильный линкер, который используется в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля с пропиленгликолем, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биодеградируемых полимеров, таких как полимолочная кислота (PLA) и полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации, но не ограничивается ими. Предпочтительно он представляет собой полиэтиленгликоль.
Кроме того, их производные, известные в данной области, и производные, которые можно легко получить согласно современному уровню техники, также попадают в пределы объема настоящего изобретения.
Пептидильный линкер, который используется в слитом белке, полученный традиционным способом слияния в рамке считывания, имеет недостаток в том, что он легко расщепляется протеазой in vivo и, таким образом, также не может быть получен ожидаемый эффект увеличения периода полувыведения активного лекарственного средства в сыворотке посредством носителя. По этой причине помимо пептидильного линкера для получения конъюгата в настоящем изобретении можно использовать непептидильный линкер. Непептидильный линкер может представлять собой полимер, который имеет устойчивость к протеазе, для поддержания периода полувыведения пептида в сыворотке, аналогичного периоду полувыведения носителя. Следовательно, в настоящем изобретении можно использовать любой непептидильный линкер без какого-либо ограничения, при условии, что он сделан из полимера, имеющего вышеописанную функцию, то есть полимера, имеющего устойчивость к протеазе in vivo. Данный непептидильный линкер имеет молекулярную массу 1-100 кДа, предпочтительно 1-20 кДа, но не ограничивается ими.
Кроме того, в настоящем изобретении непептидильный линкер, который связан с фрагментом Fc иммуноглобулина, может быть сделан не только из одного вида полимера, но также из комбинации разных видов полимеров.
Непептидильный линкер, который используется в настоящем изобретении, имеет реакционноспособные группы, способные к связыванию с фрагментом Fc иммуноглобулина и с белковым лекарственным средством.
Реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного полимера предпочтительно выбраны из группы, состоящей из реакционноспособной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного. Здесь сукцинимидное производное может представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, когда непептидильный полимер имеет реакционноспособную альдегидную группу на его обоих концах, физиологически активный полипептид и иммуноглобулин эффективно связываются с обоими концами непептидильного линкера соответственно, одновременно минимизируя неспецифические реакции. Конечный продукт, образованный восстановительным алкилированием через альдегидную связь, является значительно более стабильным, чем связанный через амидную связь. Альдегидная реакционноспособная группа может селективно связываться с N-концом при низком pH и может образовать ковалентную связь с остатком лизина при высо- 6 030454
ком pH, например pH 9,0.
Реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного линкера могут быть одинаковыми или разными. Например, один конец непептидильного линкера может иметь малеимидную группу, и другой конец может иметь альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутилальдегид. При использовании в качестве непептидильного линкера полиэтиленгликоля, имеющего на обоих концах гидроксильные реакционноспособные группы, гидроксильные группы могут быть активированы до разных реакционноспособных групп посредством известной химической реакции. В качестве альтернативы для получения конъюгата по настоящему изобретению можно использовать имеющийся в продаже полиэтиленгликоль, имеющий модифицированную реакционноспособную группу.
Термин "физиологически активный полипептид" в том виде, как он здесь используется, в собирательном значении относится к полипептидам, имеющим любую физиологическую активность in vivo, которые обычно имеют полипептидную структуру и имеют разные физиологические активности. Физиологически активные полипептиды включают полипептиды, которые функционируют для регуляции генетической экспрессии и физиологической функции и для исправления ненормального состояния, вызванного недостатком или избыточной секрецией вещества, которое участвует в регуляции функций in vivo. Физиологически активные полипептиды могут включать обычные белковые терапевтические агенты.
В конъюгате по настоящему изобретению вид и размер физиологически активного полипептида не являются конкретно ограниченными, при условии, что он может быть связан с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, с демонстрацией пониженных опосредованной рецептором интернализации или опосредованного рецептором клиренса по сравнению с ситуацией, когда он связан с фрагментом Fc иммуноглобулина в мультимерной форме. Кроме того, более предпочтительным является физиологически активный полипептид, опосредованная рецептором интернализация и опосредованный рецептором клиренс которого являются главными механизмами клиренса белка in vivo.
Физиологически активный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из следующих: глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), человеческий гормон роста (hGH), эритропоэтин (EPO), глюкагон, оксинтомодулин, инсулин, гормон, высвобождающий гормон роста, пептид, высвобождающий гормон роста, интерфероны, рецепторы интерферонов, рецептор, связанный с G-белком, интерлейкины, рецепторы интерлейкинов, ферменты, белки, связывающие интерлейкины, белки, связывающие цитокины, фактор активации макрофагов, пептид макрофагов, фактор B-клетки, фактор T-клетки, белок A, ингибитор аллергии, гликопротеины некроза клеток, иммунотоксин, лимфотоксин, фактор некроза опухоли, супрессоры опухолей, фактор роста метастазов, альфа-1 антитрипсин, альбумин, α-лактальбумин, аполипопротеин-E, сильно гликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины, гемоглобин, тромбин, пептид, активирующий рецептор тромбина, тромбомодулин, факторы крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, фактор активации плазминогена, пептид, связывающий фибрин, урокиназа, стрептокиназа, гирудин, белок C, C-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутаза, лептин, фактор роста тромбоцитов, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, фактор роста кости, белок, стимулирующий рост кости, кальцитонин, атриопептин, фактор, индуцирующий рост хряща, элкатонин, фактор активации соединительной ткани, ингибитор пути тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, люлиберин, факторы роста нервов, паратиреоидный гормон, релаксин, секретин, соматомедин, инсулиноподобный фактор роста, гормон коры надпочечников, холецистокинин, полипептид поджелудочной железы, гастрин-рилизинг пептид, кортикотропин-рилизинг гормон, тиреотропин, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, антигены поверхности клетки, антигены вакцины вирусного происхождения, моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты антител. Предпочтительно физиологически активный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из следующих: глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), человеческий гормон роста (hGH), эритропоэтин (EPO), глюкагон, оксинтомодулин, инсулин и их производные, но не ограничивается ими.
Кроме того, подразумевается, что термин "физиологически активный полипептид" в том виде, как он здесь используется, включает не только природные физиологически активные полипептиды, но также агонисты, предшественники, производные, фрагменты или варианты каждого полипептида.
Физиологически активный полипептид, который используется в настоящем изобретении, может представлять собой агонист GLP-1, и его примером может быть (Ш-имидазол-4-ил)-ацетил1(GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1) (Bachem) или HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG (SEQ ID NO: 2) (Bachem)), но конкретно не ограничивается им. Аминокислотная последовательность приведена в направлении от N-конца к C-концу.
(1H-Имидазол-4-ил)-ацетил-1(GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (Bachem)) использовали для получения конъюгата агонист-GLP1-фрагмент Fc иммуноглобулина в примере по настоящему изобретению.
Здесь примеры производных оксинтомодулина включают все примеры, раскрытые в выложенной в открытый доступ публикации корейского патента № 10-2012-0137271, и примеры производных пептида,
- 7 030454
высвобождающего инсулин, включают примеры, раскрытые в выложенной в открытый доступ публикации корейского патента № 10-2009-0008151, но не ограничиваются ими.
Поскольку область Fc иммуноглобулина представляет собой биодеградируемый полипептид, который метаболизируется in vivo, она является безопасной для применения в качестве носителя лекарственного средства. Также, поскольку область Fc иммуноглобулина имеет молекулярную массу меньшую, чем полная молекула иммуноглобулина, она является полезной для приготовления, очистки и выхода конъюгата. Кроме того, поскольку область Fab, которая демонстрирует высокую негомогенность из-за различия в аминокислотной последовательности между антителами, удалена, область Fc имеет значительно повышенную гомогенность вещества и низкий потенциал к индукции антигенности сыворотки.
Термин "область Fc иммуноглобулина" в том виде, как он здесь используется, относится к белку, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3) иммуноглобулина, исключая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Область Fc иммуноглобулина может дополнительно включать шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Также область Fc иммуноглобулина в настоящем изобретении может представлять собой удлиненную область Fc, которая содержит часть или полную константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, при условии, что она имеет физиологическую функцию, по существу, равную или лучшую, чем нативная форма. Кроме того, она может представлять собой фрагмент, имеющий делецию в относительно длинной части аминокислотной последовательности CH2 и/или CH3.
Другими словами область Fc иммуноглобулина в настоящем изобретении может содержать: 1) домен CH1, домен CH2, домен CH3 и домен CH4, 2) домен CH1 и домен CH2, 3) домен CH1 и домен CH3, 4) домен CH2 и домен CH3, 5) комбинацию одного или более чем одного домена и шарнирную область (или часть шарнирной области) иммуноглобулина и 6) димер каждого домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.
В настоящем изобретении подразумевается, что фрагмент Fc иммуноглобулина включает не только нативную аминокислотную последовательность, но также мутацию данной последовательности. Термин "мутант по аминокислотной последовательности" в том виде, как он здесь используется, относится к последовательности, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности по одному или более чем одному аминокислотному остатку из-за делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинаций. Например, в случае Fc IgG аминокислотные остатки в положениях 214238, 297-299, 318-322 или 327-331, известные как важные в связывании, могут быть использованы в качестве подходящей мишени для модификации.
Кроме того, также возможны разные мутанты, включая мутантов, имеющих делецию области, способной образовать дисульфидную связь, делецию нескольких аминокислотных остатков на N-конце нативного Fc или присоединение остатка метионина на N-конце нативного Fc. Более того, для устранения эффекторных функций может быть удален сайт связывания комплемента, например сайт связывания C1q, и также может быть удален сайт антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Методики получения таких производных последовательности фрагмента Fc иммуноглобулина раскрыты в международных публикациях патентов № WO 97/34631 и WO 96/32478.
Аминокислотные замены в белках и пептидах, которые обычно не изменяют активность молекул, известны в данной области (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Чаще всего встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly в обоих направлениях.
В некоторых случаях фрагмент Fc иммуноглобулина также может быть модифицирован, например, фосфорилированием, сульфатированием, акрилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием или амидированием.
Вышеописанные мутанты Fc представляют собой мутантов, которые демонстрируют ту же самую биологическую активность, что и активность области Fc по настоящему изобретению, но имеют улучшенную структурную стабильность против нагревания, pH или тому подобного.
Кроме того, эти фрагменты Fc можно получать из нативных форм, выделенных у людей и животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или они могут представлять собой рекомбинантные формы или их производные, полученные из трансформированных животных клеток или микроорганизмов. Здесь они могут быть получены из нативного иммуноглобулина путем выделения целого иммуноглобулина из живого организма людей или животных и его обработки протеазой. При обработке целого иммуноглобулина папаином он расщепляется на Fab и Fc, и при его обработке пепсином он расщепляется на pF'c и F(ab)2. Эти фрагменты могут быть подвергнуты, например, эксклюзионной хроматографии для выделения Fc или pF'c.
Предпочтительно он представляет собой область Fc рекомбинантного иммуноглобулина, полученную из микроорганизма с использованием человеческой области Fc.
Кроме того, область Fc иммуноглобулина может находиться в форме, имеющей нативные сахарные
- 8 030454
цепи, увеличенные сахарные цепи по сравнению с нативной формой или уменьшенные сахарные цепи по сравнению с нативной формой, или может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей Fc иммуноглобулина можно проводить с использованием традиционных способов, таких как химический способ, ферментативный способ и способ генной инженерии с использованием микроорганизма. Область Fc иммуноглобулина, полученная удалением сахарных цепей от Fc, демонстрирует резкое снижение аффинности связывания с комплементом (C1q) и уменьшение или потерю антителозависимой клеточной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности и, таким образом, не индуцирует ненужные иммунные ответы in vivo. В этом отношении фрагмент Fc иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящим для применения в качестве носителя лекарственного средства.
Термин "дегликозилирование" в том виде, как он здесь используется, означает ферментативное удаление сахарных группировок из области Fc, и термин "агликозилирование" означает негликозилированный фрагмент Fc, который продуцируется в прокариотах, предпочтительно в Е. coli.
Тем временем область Fc иммуноглобулина может происходить от человека или животных, таких как крупный рогатый скот, козы, свиньи, мыши, кролики, хомяки, крысы или морские свинки. Предпочтительно она имеет человеческое происхождение. Кроме того, фрагмент Fc иммуноглобулина может представлять собой фрагмент Fc, который происходит из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, их комбинаций или их гибридов. Предпочтительно он происходит из IgG или IgM, которые принадлежат к числу самых распространенных белков в человеческой крови, и наиболее предпочтительнее он происходит из IgG, который, как известно, увеличивает период полувыведения белков, связывающих лиганд.
Термин "комбинация" в том виде, как он здесь используется, означает то, что полипептиды одинакового происхождения, кодирующие одноцепочечные фрагменты Fc иммуноглобулина, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. Другими словами, димер или мультимер может быть образован из двух или более чем двух фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD и Fc IgE.
Термин "гибрид" в том виде, как он здесь используется, означает то, что последовательности, кодирующие два или более чем два фрагмента Fc иммуноглобулина разного происхождения, присутствуют в одноцепочечном фрагменте Fc иммуноглобулина. В настоящем изобретении возможны разные типы гибридов. Другими словами, доменные гибриды могут состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из CH1, CH2, CH3 и CH4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и могут включать шарнирную область.
С другой стороны, IgG может быть разделен на подклассы lgG1, lgG2, lgG3 и IgG4, и в настоящем изобретении можно использовать их комбинации или гибриды. Предпочтительными являются подклассы lgG2 и IgG4 и наиболее предпочтительным является фрагмент Fc IgG4, редко имеющий эффекторные функции, такие как CDC (комплементзависимая цитотоксичность). Другими словами, наиболее предпочтительным фрагментом Fc иммуноглобулина для применения в качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению является негликозилированный фрагмент Fc, происходящий из человеческого IgG4. Человеческий фрагмент Fc является более предпочтительным, чем фрагмент Fc, не являющийся человеческим, который может действовать в качестве антигена в человеческом организме и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как образование нового антитела против данного антигена.
В одном примере настоящего изобретения конъюгат получали связыванием мономера физиологически активного полипептида через непептидильный полимер с фрагментом Fc иммуноглобулина (пример) и обнаружили, что полученный конъюгат демонстрирует пониженную опосредованную рецептором интернализацию и, таким образом, имеет повышенный период полувыведения in vivo по сравнению с конъюгатом в физиологически активном полипептиде, который присутствует в димерной форме (фиг. 2 и 3).
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, который содержит мономер физиологически активного полипептида, связанный через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина, в котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Здесь физиологически активный полипептид, фрагмент Fc иммуноглобулина, непептидильный линкер и конъюгат являются такими, как описано выше.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения фармацевтической композиции длительного действия, включающий: (а) связывание физиологически активного полипептида с фрагментом Fc иммуноглобулина с получением смеси конъюгатов физиологически актив- 9 030454
ный полипептид-фрагмент Fc иммуноглобулина; и (б) выделение из смеси конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащего одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина.
Здесь физиологически активный полипептид, фрагмент Fc иммуноглобулина, непептидильный линкер и фармацевтическая композиция длительного действия являются такими, как описано выше.
Стадия (а) в способе по настоящему изобретению представляет собой стадию ковалентного связывания физиологически активного полипептида через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина. Стадия (а) может включать этапы: (1) связывания любого одного физиологически активного полипептида и фрагмента Fc иммуноглобулина с реакционноспособной группой на одном конце непептидильного линкера; и (2) связывание оставшегося физиологически активного полипептида или фрагмента Fc иммуноглобулина с реакционноспособной группой на другом конце непептидильного линкера. Стадия (а) может дополнительно включать между этапами (1) и (2) стадию выделения физиологически активного полипептида или фрагмента Fc иммуноглобулина, связанного с одним концом непептидильного линкера. Для получения данного конъюгата описание корейского патента № 10-0725315 может быть включено сюда посредством ссылки.
При получении конъюгата этим способом конъюгаты, содержащие физиологически активный полипептид в димерной или мультимерной форме, могут образоваться в качестве побочных продуктов, помимо конъюгата, содержащего физиологически активный мономер, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Таким образом, способ по настоящему изобретению может дополнительно включать после стадии (а) получения смеси конъюгатов стадию (б) выделения из данной смеси конъюгата мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащего мономер физиологически активного полипептида, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Условия выделения на стадии (б) могут варьировать в зависимости от использованных видов непептидильного линкера, физиологически активного полипептида и тому подобного.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Следует понимать, однако, что данные примеры служат лишь для иллюстративных целей и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример. Получение конъюгата агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина.
Пропион-ЛТП2 ПЭГ (полиэтиленгликоль с двумя пропиональдегидными группами) (IDB, Корея) массой 3,4 кДа подвергали сайтспецифичному взаимодействию с остатком лизина агониста GLP-1. Для получения конъюгата, в котором ПЭГ и агонист GLP-1 связаны друг с другом в соотношении 1:1, реакционную смесь затем подвергали хроматографии на катионообменной колонке для очистки моноПЭГилированного агониста GLP-1. Для получения конъюгата агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащего моноПЭГилированный агонист GLP-1, специфично связанного с N-концом фрагмента Fc иммуноглобулина, проводили реакцию при pH 5,0-8,2. После реакции связывания проводили двухэтапный процесс очистки с использованием гидрофобной колонки и анионообменной колонки, получая посредством этого конъюгат агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина, содержащий агонист GLP-1, сайт-специфично связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина.
Анализировали конъюгат агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина, полученный данным способом, и в результате обнаружили, что в полученном конъюгате присутствовал только конъюгат мономер агониста GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина или мультимерный конъюгат, включающий следовое количество конъюгата димер агониста GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина, в количестве 5% (мас./мас.) или менее, на основе общей массы полученного конъюгата.
Сравнительный пример. Получение конъюгата димер агониста GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина.
Последовательность ДНК, кодирующую агонист GLP-1, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, клонировали в вектор для экспрессии в клетке животного. ДНК, кодирующую рекомбинантный белок, трансфицировали в линию клеток животного 293-F (клетка Freestyle 293-F, Invitogen), используя трансфекционный раствор (реактив Freestyle™ MAX, Invitogen), и затем клетки культивировали в течение 48 ч, и собирали культуру. Экспрессированный конъюгат димер агониста GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина очищали из культуры с использованием аффинной колонки.
Экспериментальный пример 1. Оценка интернализации рецептора.
Для оценки интернализации рецептора использовали анализ интернализации с активированным GPCR (рецептор, сопряженный с G-белком) PathHunter® express. В частности, клетки U2OS, которые экспрессируют человеческий рецептор GLP-1, высевали на белый 96-луночный планшет и культивировали в течение 24-48 ч. Конъюгат агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина из примера серийно 4кратно разводили из 3 мкМ маточного раствора, и экспрессируемый в рамке считывания конъюгат агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина сравнительного примера серийно 4-кратно разводили из 15 мкМ маточного раствора, и каждое из разведений добавляли в лунки планшета. Затем индуцировали интернализацию рецептора каждым из конъюгатов в CO2-инкубаторе при 37°C в течение 3 ч. Затем в лунки
- 10 030454
планшета добавляли субстрат для выявления эндоцитированного рецептора, давали реагировать при комнатной температуре в течение 60 мин, и измеряли люминисценцию планшета с использованием люминисцентного планшет-ридера. Результаты измерения показаны на фиг. 2.
В результате, как показано на фиг. 2, конъюгат из примера демонстрировал EC50 (полумаксимальная эффективная концентрация) 377 нМ, и конъюгат из сравнительного примера демонстрировал EC50 14,59 нМ, указывая на то, что конъюгат агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению демонстрировал значительно пониженную интернализацию рецептора по сравнению с конъюгатом агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина сравнительного примера. Такие результаты свидетельствуют о том, что конъюгат, содержащий мономер физиологически активного полипептида, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, может демонстрировать пониженные опосредованную рецептором интернализацию и клиренс по сравнению с конъюгатом, в котором физиологически активный полипептид присутствует в димерной форме.
Экспериментальный пример 2. Анализ для сравнения фармакокинетики in vivo между конъюгатами агонист GLP-1-фрагмент иммуноглобулина.
Для того чтобы сравнить фармакокинетику in vivo между конъюгатом агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина из примера и конъюгатом агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина, анализировали изменения в сывороточных концентрациях конъюгатов с использованием нормальных крыс SD.
В частности, каждый из конъюгата агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина (400 мкг/кг) и конъюгата агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина (400 мкг/кг) разводили в физиологическом растворе и вводили животным подкожно в дозе 2 мл/кг. В 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 288, 312 и 336 ч после введения анализируемых веществ отбирали кровь из яремной вены крыс, и отделяли сыворотку от крови. Затем в каждом из образцов сыворотки количественно измеряли концентрацию лекарственного средства посредством твердофазного иммуноферментного анализа, и результаты количественного измерения показаны на фиг. 3.
В результате периоды полувыведения в сыворотке конъюгата агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина из примера и конъюгата агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина из сравнительного примера составляли 40,9 и 28 ч соответственно, и максимальные сывороточные концентрации конъюгатов составляли 1758,6 и 742,7 нг/мл соответственно. Другими словами при подкожном введении лекарственных средств нормальным крысам в одинаковой дозе было продемонстрировано то, что конъюгат мономерный агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению превосходил в показателях поглощения in vivo и периода полувыведения конъюгат димерный агонист GLP-1-фрагмент Fc иммуноглобулина (фиг. 3).
В то время как настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные иллюстративные воплощения, специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение, будет понятно, что настоящее изобретение можно воплощать в других конкретных формах без отступления от технической сущности или существенных характеристик настоящего изобретения. Следовательно, описанные выше воплощения считаются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Кроме того, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, а не подробным описанием, и следует понимать, что все модификации или изменения, полученные из значений и объема настоящего изобретения и его эквивалентов, включены в объем приложенной формулы изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ХАНМИ ФАРМ. КО., ЛТД.
<120> Конъюгат мономера биологически активного полипептида и фрагмента Fc иммуноглобулина с пониженным клиренсом, опосредованным рецептором, и способ его получения
<130> OPA14111
<150> KR 10-2013-0082511
<151> 2013-07-12
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 38
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
- 11 030454
<220>
<223> Агонист GLP-1
<400> 1
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser
20 25 30
Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 2
<211> 29
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Агонист GLP-1
<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
20 25

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтическая композиция длительного действия, которая содержит конъюгат, содержащий физиологически активный полипептид, связанный с фрагментом Fc иммуноглобулина, где данная композиция содержит мономерный конъюгат, содержащий одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, и возможно содержит мультимерный конъюгат, содержащий две или более чем две молекулы того же самого физиологически активного полипептида, связанные с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, при условии, что молярное отношение мономерного конъюгата к мультимерному конъюгату в композиции составляет по меньшей мере 19.
  2. 2. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой конъюгат дополнительно содержит непептидильный линкер, вставленный между физиологически активным полипептидом и фрагментом Fc иммуноглобулина для связывания физиологически активного полипептида с фрагментом Fc иммуноглобулина.
  3. 3. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой мономерный конъюгат демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
  4. 4. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), человеческого гормона роста (hGH), эритропоэтина (EPO), глюкагона, оксинтомодулина, инсулина, гормона, высвобождающего гормон роста, пептида, высвобождающего гормон роста, интерферонов, рецепторов интерферонов, рецептора, связанного с Gбелком, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, ферментов, белков, связывающих интерлейкины, белков, связывающих цитокины, фактора активации макрофагов, пептида макрофагов, фактора B-клетки, фактора T-клетки, белка A, ингибитора аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксина, лимфотоксина, фактора некроза опухоли, супрессоров опухолей, фактора роста метастазов, альфа-1 антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, сильно гликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, пептида, активирующего рецептор тромбина, тромбомодулина,
    - 12 030454
    факторов крови VII, Vila, VIII, IX и XIII, фактора активации плазминогена, пептида, связывающего фибрин, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка C, C-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, фактора роста тромбоцитов, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста кости, белка, стимулирующего рост кости, кальцитонина, атриопептина, фактора, индуцирующего рост хряща, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, люлиберина, факторов роста нервов, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, гормона коры надпочечников, холецистокинина, полипептида поджелудочной железы, гастрин-рилизинг пептида, кортикотропин-рилизинг гормона, тиреотропина, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, антигенов поверхности клетки, антигенов вакцины вирусного происхождения, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител.
  5. 5. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), человеческого гормона роста (hGH), эритропоэтина (EPO), глюкагона, оксинтомодулина, инсулина и их производных.
  6. 6. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.2, в которой непептидильный линкер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликольпропиленгликоль, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
  7. 7. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.2, в которой непептидильный линкер имеет молекулярную массу, варьирующую от 1 до 100 кДа.
  8. 8. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой фрагмент Fc иммуноглобулина состоит из 1-4 доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов CH1, CH2, CH3 и CH4.
  9. 9. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой фрагмент Fc иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирную область.
  10. 10. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой фрагмент Fc иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc, имеющий происхождение из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, их комбинаций и их гибридов.
  11. 11. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой фрагмент Fc иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc IgG4.
  12. 12. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой фрагмент Fc иммуноглобулина является негликозилированным.
  13. 13. Фармацевтическая композиция длительного действия по п.1, в которой фрагмент Fc иммуноглобулина содержит шарнирную область, константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3).
  14. 14. Конъюгат мономер физиологически активного полипептида-фрагмент Fc иммуноглобулина, в котором физиологически активный полипептид связан через непептидильный линкер с фрагментом Fc иммуноглобулина в мономерной форме, причем данный конъюгат демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с конъюгатом, содержащим димер физиологически активного полипептида, связанный в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
  15. 15. Способ получения фармацевтической композиции длительного действия по п.1, включающий:
    (а) связывание физиологически активного полипептида с фрагментом Fc иммуноглобулина с получением смеси конъюгатов физиологически активный полипептид-фрагмент Fc иммуноглобулина; и
    (б) выделение из указанной смеси конъюгата мономер физиологически активного полипептидафрагмент Fc иммуноглобулина, содержащего одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина.
  16. 16. Способ по п.15, в котором физиологически активный полипептид и фрагмент Fc иммуноглобулина связаны друг с другом через непептидильный линкер.
  17. 17. Способ по п.15, в котором конъюгат фармацевтической композиции длительного действия, который содержит одну молекулу физиологически активного полипептида, связанную с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, демонстрирует пониженные опосредованную рецептором интернализацию или опосредованный рецептором клиренс по сравнению либо с димерным конъюгатом, содержащим две молекулы физиологически активного полипептида, связанные через непептидильный линкер с одним фрагментом Fc иммуноглобулина, либо с димером физиологически активного полипептида, связанным в рамке считывания с фрагментом Fc иммуноглобулина.
    - 13 030454
EA201690116A 2013-07-12 2014-07-14 КОНЪЮГАТ МОНОМЕРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПОЛИПЕПТИДА И ФРАГМЕНТА Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПОНИЖЕННЫМ КЛИРЕНСОМ, ОПОСРЕДОВАННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ EA030454B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130082511 2013-07-12
PCT/KR2014/006329 WO2015005748A1 (ko) 2013-07-12 2014-07-14 수용체-매개 제거가 감소된, 생리활성 폴리펩타이드 단량체-면역글로불린 Fc 단편 결합체 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690116A1 EA201690116A1 (ru) 2016-07-29
EA030454B1 true EA030454B1 (ru) 2018-08-31

Family

ID=52280326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201690116A EA030454B1 (ru) 2013-07-12 2014-07-14 КОНЪЮГАТ МОНОМЕРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПОЛИПЕПТИДА И ФРАГМЕНТА Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПОНИЖЕННЫМ КЛИРЕНСОМ, ОПОСРЕДОВАННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Country Status (23)

Country Link
US (1) US10487128B2 (ru)
EP (2) EP3639858A1 (ru)
JP (3) JP2016529227A (ru)
KR (2) KR102182701B1 (ru)
CN (2) CN105517578B (ru)
AR (1) AR096891A1 (ru)
AU (1) AU2014287880C1 (ru)
BR (1) BR112016000680A2 (ru)
CA (1) CA2918023A1 (ru)
DK (1) DK3020418T3 (ru)
EA (1) EA030454B1 (ru)
ES (1) ES2792975T3 (ru)
HK (1) HK1223017A1 (ru)
HU (1) HU231423B1 (ru)
IL (1) IL243568B (ru)
MX (1) MX2016000343A (ru)
MY (1) MY176834A (ru)
NO (1) NO20160175A1 (ru)
PH (1) PH12016500075A1 (ru)
PT (1) PT3020418T (ru)
TW (1) TWI680768B (ru)
UA (1) UA119850C2 (ru)
WO (1) WO2015005748A1 (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090038701A1 (en) 2006-01-17 2009-02-12 Baxter International Inc. Device, system and method for mixing
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
HU231358B1 (hu) * 2014-03-31 2023-03-28 Hanmi Pharm. Co., Ltd Eljárás fehérjék és peptidek oldhatóságának javítására immunoglobulin Fc fragmentum kapcsolás alkalmazása révén
EP3260139A4 (en) 2015-02-17 2018-09-05 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting insulin or insulin analogue complex
WO2016210328A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of symptoms associated with intracranial hemorrhage
CA2996853A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 Baxter International Inc. Hemostatic material
TW201718629A (zh) * 2015-09-25 2017-06-01 韓美藥品股份有限公司 包含多個生理多肽及免疫球蛋白Ｆｃ區之蛋白質接合物
WO2018009921A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 AskGene Pharma, Inc. Fusion protein comprising leptin and methods for producing and using the same
BR112019002394B1 (pt) 2016-08-10 2021-12-21 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Proteína heterodimérica fundida com fc e seu uso
WO2018030806A1 (ko) * 2016-08-10 2018-02-15 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
CA3037844A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
CN110291103A (zh) * 2016-12-05 2019-09-27 韩美药品株式会社 具有弱化的免疫应答的缀合物
KR20180091773A (ko) 2017-02-07 2018-08-16 한미약품 주식회사 비펩티드성 중합체 링커 화합물, 그 링커 화합물을 포함하는 결합체, 및 이들의 제조방법
WO2018174668A2 (ko) * 2017-03-23 2018-09-27 한미약품 주식회사 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도
WO2019010224A1 (en) 2017-07-03 2019-01-10 Torque Therapeutics, Inc. FUSION MOLECULES TARGETING IMMUNE REGULATORY CELLS AND USES THEREOF
KR102144380B1 (ko) * 2017-09-27 2020-08-13 한양대학교 산학협력단 제2형 당뇨병 치료를 위한 락토페린 기반의 유전자 전달체
JP2020535199A (ja) * 2017-09-29 2020-12-03 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 効力が向上した持続性タンパク質結合体
WO2019190293A1 (ko) * 2018-03-30 2019-10-03 한미약품 주식회사 뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물
SG11202103313RA (en) * 2018-09-06 2021-04-29 Cidara Therapeutics Inc Compositions and methods for the treatment of viral infections
SG11202104136YA (en) 2018-10-23 2021-05-28 Dragonfly Therapeutics Inc Heterodimeric fc-fused proteins
US11267858B2 (en) * 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
WO2022216129A1 (ko) 2021-04-09 2022-10-13 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체를 포함하는 만성 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050047032A (ko) * 2003-11-13 2005-05-19 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
KR20060106486A (ko) * 2005-04-08 2006-10-12 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US20120244578A1 (en) * 2009-11-23 2012-09-27 Amgen Inc. Monomeric antibody fc
US8431132B2 (en) * 2006-01-27 2013-04-30 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-FC fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
ES2251009T3 (es) 1990-06-28 2006-04-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Proteinas de fusion con partes de inmunoglobulinas, su preparacion y uso.
ATE288923T1 (de) 1991-02-08 2005-02-15 Progenics Pharm Inc Cd4-gamma2- und cd4-igg2-chimären
EP0533006A1 (en) 1991-09-18 1993-03-24 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
ATE279947T1 (de) 1996-03-18 2004-11-15 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
IL142350A0 (en) 1998-10-16 2002-03-10 Biogen Inc Interferon-beta fusion proteins and pharmaceutical compositions containing the same
ES2317843T3 (es) 1999-07-13 2009-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Proteinas de fusion de eritropoyetina-inmunoglobulina.
DE10021731B4 (de) 2000-05-04 2005-12-08 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Cyclipostine, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitung derselben
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
KR100824505B1 (ko) * 2005-08-16 2008-04-22 한미약품 주식회사 개시 메티오닌 잔기가 제거된 면역글로불린 Ｆｃ 영역의대량 생산방법
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
PE20110221A1 (es) * 2008-07-23 2011-04-06 Hanmi Science Co Ltd Un complejo polipeptidico que consiste en un polimero no-peptidil que posee tres terminaciones funcionales
DK2408800T3 (en) 2009-03-20 2016-08-29 Hanmi Science Co Ltd A process for the preparation of a site-specific conjugate of a physiologically active polypeptide
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
DK3434687T3 (da) 2011-06-10 2021-06-07 Hanmi Science Co Ltd Hidtil ukendte oxyntomodulinderivater og farmaceutisk præparat til behandling af fedme omfattende samme
MY164680A (en) * 2011-06-17 2018-01-30 Hanmi Science Co Ltd A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
KR20050047032A (ko) * 2003-11-13 2005-05-19 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법
KR20060106486A (ko) * 2005-04-08 2006-10-12 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US8431132B2 (en) * 2006-01-27 2013-04-30 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-FC fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
US20120244578A1 (en) * 2009-11-23 2012-09-27 Amgen Inc. Monomeric antibody fc

Also Published As

Publication number Publication date
PT3020418T (pt) 2020-05-28
EA201690116A1 (ru) 2016-07-29
TWI680768B (zh) 2020-01-01
JP2016529227A (ja) 2016-09-23
UA119850C2 (uk) 2019-08-27
BR112016000680A2 (pt) 2017-12-12
JP2019163258A (ja) 2019-09-26
KR20150008012A (ko) 2015-01-21
NO20160175A1 (en) 2016-02-03
PH12016500075B1 (en) 2016-04-18
AR096891A1 (es) 2016-02-03
EP3020418B1 (en) 2020-02-26
JP6976400B2 (ja) 2021-12-08
NZ716251A (en) 2020-12-18
CN110876808B (zh) 2023-06-13
ES2792975T3 (es) 2020-11-12
AU2014287880B2 (en) 2020-01-02
CN110876808A (zh) 2020-03-13
PH12016500075A1 (en) 2016-04-18
MX2016000343A (es) 2016-05-05
HU231423B1 (hu) 2023-08-28
CA2918023A1 (en) 2015-01-15
JP2021059585A (ja) 2021-04-15
HUP1600209A2 (hu) 2016-05-30
KR20200136856A (ko) 2020-12-08
CN105517578A (zh) 2016-04-20
TW201513884A (zh) 2015-04-16
AU2014287880A1 (en) 2016-02-11
HK1223017A1 (zh) 2017-07-21
IL243568A0 (en) 2016-02-29
CN105517578B (zh) 2020-03-10
WO2015005748A1 (ko) 2015-01-15
IL243568B (en) 2020-01-30
AU2014287880C1 (en) 2020-07-09
US10487128B2 (en) 2019-11-26
KR102182701B1 (ko) 2020-11-26
DK3020418T3 (da) 2020-06-02
EP3020418A1 (en) 2016-05-18
MY176834A (en) 2020-08-24
US20160158378A1 (en) 2016-06-09
EP3020418A4 (en) 2017-01-11
EP3639858A1 (en) 2020-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6976400B2 (ja) 受容体媒介クリアランスが減少した、生理活性ポリペプチド単量体と免疫グロブリンＦｃ断片との結合体及びその製造方法
US11207383B2 (en) Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
KR101200659B1 (ko) 세 말단 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 이용한 생리활성 폴리펩타이드 약물 결합체
RU2696973C2 (ru) FC-фрагмент IGG4, содержащий модифицированную шарнирную область
US20220380437A1 (en) Immunoglobulin fc conjugate which maintains binding affinity of immunoglobulin fc fragment to fcrn
AU2013228144B2 (en) An improved process for preparation of physiologically active polypeptide complex
JP2022190132A (ja) 持続性が増加した生理活性物質の結合体及びその用途
US10660940B2 (en) Preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate
NZ716251B2 (en) Conjugate of biologically active polypeptide monomer and immunoglobulin fc fragment with reduced receptor-mediated clearance, and the method for preparing the same