EA028720B1 - Гидрохлориды фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1н-пиридо[4,3-b]индолов в качестве средств снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, фармакологическое средство на их основе и способ его применения - Google Patents

Abstract

Гидрохлориды фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1н-пиридо[4,3-b]индолов общей формулы (I)где R, Rи Rпредставляют собой H; Rпредставляет собой Me или Et; Rпредставляет собой H; Rпредставляет собой H, F, Cl, Br, CFO, Me, MeO; Rпредставляет собой H; Rпредставляют собой H, F; Rпредставляет собой F, CF; в качестве средства снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, фармакологическое средство на их основе и способ его применения.

Description

Изобретение относится к использованию химических соединений в области медицины и может быть использовано как эффективное средство при изготовлении фармакологических препаратов для предупреждения и лечения заболеваний, связанных с неконтролируемой агрегацией белков.

Неконтролируемая агрегация определенных типов белков является ключевым звеном развития нейродегенеративных процессов, лежащих в основе патогенеза многих нейродегенеративных заболеваний. Накопление в нервной системе различных промежуточных (олигомеров, протофибрилл) и конечных (фибриллярных и аморфных отложений) продуктов, многие из которых обладают цитотоксическими свойствами, приводит к функциональным нарушениям и, в конечном итоге, к гибели нейронов. Такой тип патологии, получивший название протеинопатия, объединил в одну группу неврологические расстройства с существенно различающимися клиническими проявлениями патологии. В эту группу заболеваний входят такие широко распространенные и в настоящее время неизлечимые нейродегенеративные расстройства, как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (БАС), фронто-темпоральная дегенерация (ФТД), хорея Гентингтона и прионовые болезни. До сих пор лечение протеинопатий является преимущественно симптоматическим, поскольку не разработаны эффективные средства, непосредственно воздействующие на патогенетический процесс, лежащий в основе заболевания.

В настоящее время процесс неконтролируемой агрегации белков рассматривается как одна из важнейших мишеней для создания нового поколения терапевтических средств, которые позволят модифицировать процессы, лежащие в основе развития нейродегенерации, и тем самым замедлить течение болезни или даже остановить патологический процесс [1асоЪ§еп Ι.8., КетИаг! Р., Рап§а1о§ Μ.Ν. ИеигоКХ. 2005. νοί. 2(4). р: 612-626; Аа1кег Е.С., 1Ъе§Ъи С.С., Тобб С.А., КоЪш5опа Н.Е., 1искеге Μ., ΙΓ Н.Е., Сапбу§ 8. Вюсйешюа1 Рйагшасо1оду. 2005. νο1. 69. р. 1001-1008; СЬп81еп§еп Ό.Ό. ίΝ8 8рес1гиш§. 2007. νο1. 12. р. 113-123].

Известно, что производное соединений гидрированных пиридо(4,3-Ъ)индолов, а именно γкарболина - отечественный препарат димебон, способен снижать содержание патологических включений амилоидного типа, образуемых склонным к агрегации белком γ -синуклеином в тканях нервной системы модельных животных (С.О. Бачурин, А.А. Устюгов, О. Петерс, Т.А. Шелковникова, В.Л. Бухман, Н.Н. Нинкина, Доклады РАН, 2009, 428, 262-265).

Однако фармакокинетические свойства димебона не обеспечивают достаточно широкого спектра действия лекарств, изготовленных на его основе.

Предлагаемое изобретение решает задачу расширения арсенала средств, снижающих неконтролируемую агрегацию белков в нервной системе, приводящую к развитию разрушающих процессов в центральной и периферической нервной системе.

Поставленная задача решается применением гидрохлоридов фторсодержащих замещенных 5-[2(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ъ]индолов общей формулы (I) в качестве эффективного средства для снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе.

где К₁, К₂ и К₄ представляют собой Н;

К₃ представляет собой Ме или Εΐ;

К₅ представляет собой Н;

Кб представляет собой Н, Е, С1, Вг, СЕ₃О, Ме, ОМе;

К₇ представляет собой Н;

К₈ представляют собой Н, Е;

К₉ представляет собой Е, СЕ₃.

Еще одним аспектом изобретения является фармакологическое средство для снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество соединения формулы (I).

Также еще одним аспектом изобретения является способ снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, заключающийся во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество соединения формулы (I) в дозе 0,05-1,5 мг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

- 1 028720

Применение гидрохлоридов фторированных производных пиридо([4,3-Ь])индолов в качестве потенциальных средств для лечения таких нейродегенеративных расстройств, как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (БАС), шизофрения, рассеянный склероз, и ряда других заболеваний за счет из способности к связыванию с гистаминным, адренергическим, допаминовым, серотониновым, имидазолиновым АМРА- и аминергическим протеин-связаным рецепторами, а также способности этих соединений влиять на захват Са²+ в синаптосомах мозга крыс и улучшать запоминание у обработанных скополамином крыс, известно (заявка АО 2009/038764, А1, МКИ С07О 471/04 (2006/01), опуб. 26.03.2009; заявка АО 2009/055828, А1, МКИ С07П 471/04 (2006/01), опуб. 30.04.2009).

В наших исследованиях неожиданно было обнаружено, что хроническое применение гидрохлоридов фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов формулы (I) на животных, у которых путём генетической модификации вызывалась усиленная экспрессия склонных к агрегации белков, в частности белка γ-синуклеина и белка тау приводит к существенному снижению агрегации этих белков, подавлению астроглиоза, увеличению числа живых нейронов.

Техническим эффектом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является расширение спектра действия лекарств, изготовленных на его основе.

Так, выявление у известных ранее соединений формулы (I) новых свойств, позволит применить их не только для более эффективного лечения болезни Альцгеймера (БА), болезни Паркинсона (БП), бокового амиотрофического склероза (БАС), фронто-темпоральной дедегенерации (ФТД), хореи Гентингтона, но и для предупреждения и лечения более широкого спектра нейродегенеративных заболеваний, в частности прогрессирующего надъядерного паралича, кортикобазальной дегенерации, болезни Пика и прионовых болезней, напрямую связанных с неконтролируемой агрегацией белков в нервной системе.

В табл. 1 и 2 приведены данные по выходу, температуре плавления и характеристикам спектров ЯМР ^!Н и ¹⁹Р соединений, представляющих заявляемые классы соединений.

На фиг. 1 показано иммуногистохимическое окрашивание срезов спинного мозга 12-месячных гомозиготных трансгенных мышей линии Τ1ιν1ιηγδΝ антителами против γ-синуклеина, не получавших вещества (контроль) и животных, которые получали вещество, начиная с трех месячного возраста. Увеличение 100 х.

На фиг. 2 представлены результаты количественного подсчёта γ-синуклеинположительных агрегатов в срезах спинного мозга 12-месячных животных контрольной группы и животных, получавших вещество РС-203 (Р1иогосоп1ашт§-СагЬо1ше) формулы № 9. Подсчитана плотность агрегатов на единицу площади.

На фиг. 3 показано иммуногистохимическое окрашивание срезов спинного мозга 4- и 5-месячных гомозиготных трансгенных мышей линии Ρ301δ антителами против белка тау, не получавших препарат (контроль) и получавших РС-203, начиная с пятинедельного возраста. Увеличение 400х.

На фиг. 4 представлены результаты количественного подсчёта тау-положительных агрегатов в срезах спинного мозга 4- и 5-месячных животных в контрольной и экспериментальной группе (п = 3, показана ± стандартная погрешность среднего значения).

На фиг. 5 показано иммуногистохимическое окрашивание глиального фибриллярного кислого белка ГФКБ на поперечных срезах шейного отдела спинного мозга у 12-месячных трансгенных животных линии Τ1ιυ1 ιηγδΝ в контрольной и экспериментальной группе. Увеличение 400х.

На фиг. 6 показано иммуногистохимическое окрашивание ГФКБ на поперечных срезах спинного мозга у 4- и 5-месячных трансгенных животных линии Ρ301δ в контрольной и экспериментальной группе.

На фиг. 7 представлены средние значения продолжительности нахождения мышей линии Τ^^γδΝ на стержне до падения для экспериментальной РС-203 (квадраты), получавших вещество с первого месяца жизни, и контрольной (круги) групп.

На фиг. 8 представлены средние значения продолжительности нахождения мышей линии Ρ301δ на вращающемся стержне до падения для экспериментальной РС-203 (квадраты), получавших вещество с первого месяца жизни, и контрольной (круги) групп.

На фиг. 9 представлены средние значения продолжительности нахождения мышей линии Τ^^γδΝ на перевернутой сетке до падения для экспериментальной РС-203 (квадраты), получавших вещество с трех месяцев жизни, и контрольной (круги) групп.

На фиг. 10 представлены средние значения продолжительности нахождения мышей линии Ρ301δ на перевернутой сетке до падения для экспериментальной РС-203 (квадраты), получавших вещество с трех месяцев жизни, и контрольной (круги) групп.

На фиг. 11 показана иммунодетекция склонной к агрегации рекомбинантной формы белка Ρυδ человека в клетках нейробластомы δΗ-δΥ5Υ при помощи антител против С-концевого эпитопа этого белка.

На фиг. 12 показана иммунодетекция аберрантной формы белка ТОР-43 человека, обладающей повышенными агрегационными свойствами, в клетках нейробластомы δΗ-δΥ5Υ при помощи антител про- 2 028720 тив С-концевого эпитопа.

Синтез соединений.

Соединения формулы (I) гидрохлориды фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов согласно изобретению получают с использованием способов, известных в данной области техники для получения сходных веществ, исходя из замещенных 2,3,4тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов и фторсодержащих 3-винилпиридинов. Взаимодействие замещенных 2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов и фторсодержащих 3-винилпиридинов осуществляют нагреванием эквимольной смеси реагентов в диметилсульфоксиде (ДМСО) при 135-140°С в течение 8-10 ч в присутствии каталитических количеств фторида цезия, в результате чего образуются фторсодержащие замещенные 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолы, обработка которых соляной кислотой приводит к получению заявляемых гидрохлоридов (схема 1)

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Пример 1. Получение фторсодержащих замещенных 5-[2-(5-фторпирид-2-ил)этил]-2,3,4тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов (общая методика).

ммоль 2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индола, 1 ммоль фторсодержащего 3-винилпиридина, 200 мг С§Е, 5 мг гидрохинона в 1,5 мл ДМСО нагревали при перемешивании при 135-140°С в течение 8 ч. ДМСО и винилпиридин удаляли в вакууме 3 мм рт. ст., из остатка продукт экстрагировали хлористым метиленом. Хлористый метилен упаривали и остаток хроматографировали на силикагеле (60 меш), элюент метанол/хлороформ = 1/5.

Выходы, температуры плавления и данные спектров ЯМР ¹Н и ¹⁹Р соединений 1-7, 23-29 приведены в табл. 1 и 2.

Пример 2. Получение гидрохлоридов фторсодержащих замещенных 5-[2-(5-фторпирид-2-ил)этил]2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов (общая методика).

К суспензии основания в 5 мл воды добавляли 0,1 мл концентрированной соляной кислоты и нагревали до полного растворения основания. Воду и соляную кислоту упаривали в вакууме и полученный остаток перекристаллизовывали из 50% этанола.

Выходы, температуры плавления и данные спектров ЯМР ¹Н и ¹⁹Р соединений 8-21, 30-36 приведены в табл. 1 и 2.

Биологическая активность полученных соединений.

Оценка биологической активности полученных соединений проходила в два этапа. На начальном этапе происходила оценка цитотоксичности вещества в концентрации 100 мкМ и отбор соединений в клеточной модели протеинопатии. На последующем этапе наиболее перспективные вещества оценивались на ш νΐΐίο и ΐη νΐνο моделях протеинопатии неконтролируемой агрегации белков в нервной системе. Концентрация в 100 мкМ была выбрана в качестве пороговой величины, поскольку ранее полученные данные свидетельствуют о том, что вещества, обладающие ΐη νΐΐίο активностью выше 100 мкМ также обладают высокой цитотоксичностью.

Исследование цитотоксичности соединений.

Для оценки токсичности полученных веществ использовали клеточную культуру нейробластомы человека 8Η-8Υ5Υ. Адгезивная перевиваемая клеточная линия нейробластомы человека была получена из 8Η-8Υ5Υ из Европейской коллекции клеточных культур (Еигореап Со11есйоп о£ Се11 СиЙигез), каталожный Νο 94030304. Культуру вели на матрасах (Сошшд Е1а§к, 25см²) в СО₂-инкубаторе (Са1ахуК) при 37°С, 5% СО₂, относительной влажности воздуха 80%. Пассаж проводился каждые 4-5 дней. Клетки использовали не более чем на 20 пассажа.

Клетки выращивали на 96-луночных планшетах (Шскт). Через заданное в эксперименте время вносили исследуемые соединения в концентрации 100 мкМ. Обычно делали 4 повтора на каждую точку. После 24-часовой экспозиции исследуемых образцов фотометрически измеряли суммарную метаболическую активность клеток в каждой лунке в Се11Тйег-В1ие тесте. Данный тест основан на способности живых метаболически активных клеток переводить ресазурин (темно-синий, почти не флюоресцирующий с

- 3 028720 максимумом поглощения при 605 нм) в резоруфин (розовый, с высоким уровнем флуоресценции и максимальным поглощением при 573 нм).

Для проведения теста на цитотоксичность использовали набор Се11Тйет-В1ие (Рготеда), следуя протоколу производителя. Степень клеточной гибели измеряли по Се11Тйет-В1ие флуоресценции при 530 нм (поглощение)/560 нм (испускание).

В качестве опорного модельного вещества готовили 100 мМ раствор Димебона в воде, стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм фильтр, фасовали в стерильные 0,5 мл пробирки и хранили аликвоты при -20°С. Перед добавлением разводили до нужной концентрации в культуральной среде.

В культуральную среду на следующий день после рассева клеток добавляли Димебон и исследуемые вещества в концентрации 100 мкМ. В контрольные лунки добавляли только растворитель (вода или ИМ8О). Через 24 ч определяли количество жизнеспособных клеток Се11Тйет-В1ие тестом (Рготеда) согласно инструкции производителя. Измеренную флуоресценцию в контрольных лунках приравнивали к 100% и определяли процент выживших клеток при обработке полученными веществами по следующей формуле:

_п, флуоресцен ция экспернмен т х 100%

Уовыживших клеток = —-—-—=--флуоресценция _ контроль

Соединения, которые показали высокую цитотоксичность, не использовались в последующем тесте по исследованию противоагрегационных свойств полученных соединений.

Исследование противоагрегационных свойств полученных соединений.

Следующим этапом являлось определение соединений, способных препятствовать формированию белковых агрегатов. В качестве тест-системы была использована клеточная культура нейробластомы 8Н8Υ5Υ с экспрессией аберрантной формы белка ТИР-43 человека, обладающей повышенными агрегационными свойствами при помощи антител против С-концевого эпитопа. Из этапа 1 были отобраны вещества, в которых % выживших клеток составил более 75%. Клетки культивировались на 24-луночных плашках в течение всего времени на покровных стёклах. Поддержание жизнеспособности культуры и регистрация активности осуществлялась в условиях СО₂-инкубатора.

Эксперимент проведён в трёх повторах для каждого соединения, прошедшие первичный отбор в тесте по цитотоксичности. После проведения трансфекции и добавлении полученных соединений в концентрации 100 мкМ (через 18 ч) стёкла с клетками инкубировались с первичными антителами против изучаемого маркера ТИР-43 человека, образующего клеточные включения, далее - со вторичными антителами, несущими флуоресцентную метку к иммуноглобулинам хозяина первичного антитела. Результаты микроскопического анализа получены при помощи фотокамеры Ие1са ИР8 490 и программного обеспечения 1,е1са ЛррПсаИоп 8нИе 2.8.1 (Иеюа М1стозуз1етз). Проведённый иммуногистохимический анализ позволил определить размер, морфологию, плотность, а также локализацию ТИР-43-позитивных включений, способствующих развитию протеинопатии. После проведения морфологического анализа была определена степень ингибирования формирования ТИР-43-позитивных включений относительно модельного препарата Димебон. Плотность агрегатов при обработке Димебоном считалась 100%. Полученные данные выявили гидрохлориды (8-21, 30-36), показавшие высокую степень предотвращения образования ТИР-43-позитивных включений в отличие от оснований (1-7, 23-29).

Ниже приведено подробное описание дальнейших биологических испытаний на примере веществалидера, проявившего наивысшую степень предотвращения образования ТИР-43-позитивных включений.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения подтверждается на примере соединения РС-203 (формула № 9).

РС-203 (формула № 9)

Для исследований биологических свойств этого соединения были использованы как т \'Шо, так и т У1уо модели протеинопатии. В качестве т \'Шо моделей были использованы клетки нейробластомы человека 8Η-8Υ5Υ с эктопической экспрессией амилоидогенных белков ТИР-43 и Ρϋ8, которая даёт возможность воспроизводить ключевые звенья молекулярной патологии, связанной с нарушением метаболизма этих белков.

Данный подход комплементарен исследованиям на трансгенных животных, имеющим своей целью выяснение механизмов возникновения и развития нейродегенеративных изменений, а также позволяет

- 4 028720 проводить первичный отбор потенциальных терапевтических средств, непосредственно влияющих на механизмы неконтролируемой агрегации. В качестве амилоидогенных модельных белков были избраны мутантные формы белка ΤΌΡ-43 и Ρυδ, которые способны образовывать патологические включения в тканях нервной системы. Установлено, что белки ΤΌΡ-43 и Ρυδ участвуют в регуляции процессинга, транспорта и метаболизма РНК. Нарушение функции данных белков может приводить к развитию протеинопатий. Так, у пациентов с наследственными и идиопатическими формами некоторых вариантов бокового амиотрофического склероза (БАС) и фронтотемпоральной дегенерации с убиквитинированными включениями (ФТД-У были выявлены точечные мутации, приводящие к замене аминокислоты в кодирующей части генов ΤΌΡ-43 и Ρυδ. Данный тип молекулярной патологии может быть воспроизведен в клеточных модельных системах.

Показано, что в экспрессии избранных модельных белков в клетках нейробластомы человека δΗδΥ5Υ детектировалась неконтролируемая агрегация аберрантных форм этих белков, сопровождающаяся формированием и накоплением нерастворимых патологических включении. В подобных клеточных системах удаётся воспроизвести молекулярную патологию, специфичную для каждой из мутаций генов ΤΌΡ-43 или Ρυδ, приводящих к нарушению структуры кодируемых ими белков.

Биологическое действие соединения РС-203 (формула № 9) было исследовано на двух различных типах протеинопатий. В качестве ΐη νΐνο моделей для исследований были использованы линии трансгенных мышей Τ^'1ΐ4βδΝ и Ρ301δ. Линия трансгенных мышей Τ^'1ΐ4βδΝ на генетической основе в С57В161 характеризуется высоким уровнем эктопной экспрессии γ-синуклеина человека в тканях центральной нервной системы модельных животных. Экспрессия трансгена направляется нейронспецифическим промотором Τ%-'1 доступным в каталоге 1аск8оп ЬаЬога1огу (Ййр://]ахш1се.)ах.огд/81га1п/008843.й1ш1). В данной линии мышей происходит постепенное накопление склонного к агрегации белка γ-синуклеина, формирование внутриклеточных патологических отложений амилоидного типа и накопление их в тканях различных отделов центральной нервной системы, что в свою очередь способствует воспроизведению ключевых звеньев патогенеза протеинопатий.

Другая линия трансгенных мышей Ρ301δ (полное название линии в соответствии с базой данных .Гаск8оп8 РаЬогаЮгу - В6; С3-Τд(Ρ^ηρ-ΜΑΡΤ*Ρ301δ)Ρδ19V1е/^) характеризуется сверхпродукцией аберрантной формы белка тау человека. Под контролем промотора прионового белка Ρίηρ экспрессия трансгена осуществляется в тканях центральной нервной системы модельных животных и ведёт к накоплению гиперфосфорилированных форм белка тау, способных формировать нейрофибриллярные клубки, которые являются характерными гистопатологическими структурами, выявляемыми при таупатиях, таких как болезнь Альцгеймера, прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальная дегенерация и болезнь Пика. Таким образом линия Ρ301δ моделирует важное звено протеинопатий, связанных с неконтролируемой агрегацией белков.

Группы экспериментальных и контрольных животных формировали из потомства от скрещивания гетерозиготных по трансгену родителей. Использовали когорты гомозиготных по трансгенной аллели самцов. Условия содержания были одинаковы для контрольной и для экспериментальной групп и не менялись на протяжении всей программы исследований: 12-часовой световой цикл при температуре 22°С, свободный доступ к корму и воде. Исследуемое соединение РС-203 растворяли в питьевой воде в концентрации 70 мкг/мл и данный раствор использовался в качестве единственного источника питьевой воды в экспериментальной группе мышей, доступ к питьевому раствору, содержащему соединение РС-203, не ограничивался. Питьевой раствор меняли 3 раза в неделю. Суточное потребление животными воды регистрировалось, оно соответствовало физиологической норме потребления жидкости и составляло в среднем 5 мл на мышь весом 30 г.

Потребление питьевого раствора, содержащего соединение РС-203, не отличалось от потребления чистой питьевой воды и также составляло 5 мл в день на мышь весом 30 г. Соответственно, при пересчете на массу тела животного суточная доза потребления вещества составляла: 11.7 мг/кг.

Пример 4. Определение влияния соединения РС-203 на содержание патологических включений амилоидного типа, сформированных белком γ-синуклеином, в пораженных отделах нервной системы модельных мышей линии Τ^'1ΐ4γδΝ.

Экспериментальная группа мышей начинала получать вещество, когда возраст животных достигал 12 недель,и получала его на протяжении последующих 9 месяцев.

Контрольная группа вещество не получала. В возрасте 12 месяцев у животных контрольной и экспериментальной групп после медикаментозной эвтаназии путем внутрибрюшинного введения летальной дозы пентобарбитала натрия (Еи1йа1а1) был произведен забор тканей спинного мозга для последующего анализа. Спинной мозг извлекали и фиксировали отдельно шейный, грудной и поясничный отделы. Пре- 5 028720 параты для последующей окраски специфическими агентами на амилоидные отложения фиксировали в холодном растворе Карнуа (60% этанол, 30% хлороформ, 10% ледяная уксусная кислота) при +4°С в течение ночи. Для фиксации препаратов, предназначенных для последующего иммуногистохимического анализа, использовали 4% раствор параформальдегида в фосфатном буфере (РВ8). Затем образцы промывали дистиллированной водой (2 раза по 1 ч) и проводили дегидратацию тканей при комнатной температуре последовательно в 75% этаноле (в течение 15 мин), 96% этаноле (2 раза, по 5 и 10 мин), 100% этаноле (2 раза по 10 мин), смеси этанол-хлороформ (1:1, 30 мин), хлороформе (1 ч), затем инкубировали в хлороформе при 4°С в течение ночи, после чего заключали в парафин. Анализ количества и распределения агрегатов проводили на поперечных срезах спинного мозга.

Приготовление гистологических срезов.

Срезы толщиной 8 мкм получали с помощью ротационного микротома Ьеюа РМ2265 и монтировали на предметные стекла 8ирегРгок1 (ΒΌΗ, Роо1е, Великобритания) для последующего окрашивания Конго красным, либо на слайды Со1б §еа1 8Мек (Оо1б 8еа1 Ргобис1к, Великобритания) для последующего иммуноокрашивания. Срезы депарафинизировали в ксилоле (2 раза по 5 мин) с последующей регидратацией в серии спиртов (этанол, при комнатной температуре) понижающейся концентрации.

Окрашивание Конго красным и подсчет амилоидных отложений.

После депарафинизации и регидратации в серии спиртов (этанол) понижающейся концентрации (100%, 90%, 70%) срезы дважды промывали дистиллированной водой (по 5 мин). Окраску срезов проводили в 0,5% растворе Конго красного (8щта. США) в 50% спирте в течение 7 мин при комнатной температуре. Фиксацию окраски осуществляли 1 мин в 0,2% ΚΟΗ в 80% спирте. Затем срезы промывали водой и высушивали на воздухе. После нанесения капли среды для заключения в 1_ММи-Моип1 (Тйетто Е1ес1гоп Сотротайои, США), предметное стекло накрывали покровным стеклом (50x24 мм) и подсушивали в сухожаровом шкафу при 37°С или при комнатной температуре. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Ьеюа ΌΜΙ 4000В. Микрофотографии получали при помощи фотокамеры Ьеюа ΌΡ8 490 и программного обеспечения Ьеюа Аррйсайои §ш!е 2.8.1 (Ьеюа Мюто8у81етк, Германия). Подсчёт количества окрашенных амилоидных отложений осуществляли на участке серого вещества площадью 0,1 мм² с использованием программы 1таде1 (ЬйрУ/ткЪтеЪ.шйдоу/у/). Статистический анализ проводили при помощи программы Ехсе1 из пакета Мютокой ОГГюе (Мютокой Согр., США).

Результаты данного эксперимента, представленные на фиг. 1 и 2, показали, что систематическое применение соединения РС-203 существенно снижает количество амилоидных отложений в тканях спинного мозга трансгенных животных линии Тйу1ту§Ы по сравнению с группой контрольных животных, не получавших исследуемое соединение РС-203. Выявленное действие препарата может быть обеспечено двумя возможными механизмами: РС-203 может либо предотвращать образование новых агрегатов, либо влиять на стабильность уже предсформированных включений, например, активируя собственные защитные механизмы клетки, направленные на очистку внутреннего функционального пространства от аберантных белков и фибриллярных структур.

Пример 5. Определение влияния соединения РС-203 на содержание гистопатологических включений амилоидного типа в тканях спинного мозга линии модельных мышей Р3018.

Для исследования влияния вещества РС-203 на содержание агрегатов белка тау человека была использована линия мышей с оверпродукцией гиперфосфорилированной формы белка тау, в которой отмечается ранняя неврологическая патология, связанная с отложением белка тау в нейронах. Экспериментальная группа трансгенных мышей Р3018 начинала получать препарат РС-203 с пятинедельного возраста, когда формирование нейрофибриллярных клубков еще не выявляется гистологическими методами. Таким образом, мыши в экспериментальной группе получали препарат в течение 15 или 20 недель (до 4и 5-месячного возраста соответственно). Результаты анализа количества патологических агрегатов белка тау в тканях спинного мозга трансгенных животных линии Р3018, представленные на фиг. 3 и 4, показывают, что пролонгированное применение исследуемого вещества РС-203, начатое на пресимптоматической стадии протеинопатии, ведет к статистически достоверному уменьшению количества тау позитивных отложений в нейронах спинного мозга трансгенных животных.

Таким образом, РС-203 эффективно снижает формирование отложений белка тау человека, что напрямую связано с его противоагрегационными свойствами ίη νί\Ό.

Пример 6. Определение влияния соединения РС 203 на процессы астроглиоза в нейронах животных с повышенным синтезом белка γ-синуклеина.

Влияние соединений на процессы, связанные с реактивным астроглиозом как показателем воспалительной реакции, присущей заболеваниям с неконтролируемой агрегацией белков, осуществляли путем изучения уровня маркерного глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ). Для этого использовались трансгенные мыши двух линий Τ^^γδΝ и Р3018. Чем меньше была воспалительная реакция в тканях нервной системы, которая выявляется специфической окраской активированных астроцитов, тем эффективнее было средство для подавления этой реакции. Для экспериментов использовались срезы спинного мозга, подготовленные по методике, описанной в предыдущем примере 5. Далее срезы инку- 6 028720 бировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против ГФКБ (ΌΑΚΘ, США) в блокирующем буфере, используя разведение 1:1000, при температуре 4°С в течение ночи.

Как видно из приведенных на фиг. 5 данных о влиянии соединения РС-203 на процессы астроглиоза в нейронах животных с повышенным синтезом белка γ-синуклеина, пролонгированное применение вещества существенно снижает уровень активиированных астроцитов у животных с γ-синуклеинопатией.

Таким образом, РС-203 эффективно ингибирует нейроспецифическую воспалительную реакцию, обычно сопутствующую неконтролируемой агрегации белков в тканях нервной системе животных.

Пример 7. Определение влияния соединения РС-203 на-развитие астроглиоза в нейронах животных с повышенным синтезом гиперфосфорилированной формы белка тау.

Условия проведения эксперимента аналогичны примеру 6.

У мышей линии Р3018 с патологией, развивающейся в результате агрегации гиперфосфорилированного тау белка человека, количество выявляемых активированных астроцитов существенно возрастает по мере прогрессии нейродегенеративного процесса и соответствует стадии развития протеинопатии: у мышей линии ΤΗγ^γδΝ симптоматическая стадия γ-синуклеинопатии наблюдается, начиная с 6 месяцев, тогда как нейрональная симптоматика, обусловленная тау-патией у мышей линии Р3018 развивается гораздо раньше. Соответственно, и астроглиоз у мышей линии Р3018 развивается раньше, чем у мышей линии ΤΗγ^γδΝ. Применение препарата существенно снижает выраженность астроглиоза в двух моделях на симптоматической стадии протеинопатии.

Как следует из данных, приведенных на фиг. 6, исследуемое вещество существенно снижает уровень астроглиоза, который вызван неконтролируемой агрегацией белка тау. Это является прямым указанием на то, что соединение РС-203 эффективно ингибирует воспалительную реакцию, связанную с процессом неконтролируемой агрегации белков в тканях нервной системы животных.

Пример 8. Определение влияния соединения РС-203 на прогрессию симптомов, связанных с неконтролируемой агрегацией белка γ-синуклеина в нервной системе трансгенных животных: оценка баланса и координации на вращающемся стержне.

Моторную функцию трансгенных мышей линии ΤΗγ^γδΝ оценивали по способности животных удерживаться на стержне в ускоряющемся режиме вращения. Продолжительность каждого тестирования на вращающемся стержне составляла 5 мин, скорость вращения стержня за этот период возрастала от 4 до 40 об/мин. Регистрировалось время, которое животное способно удерживаться на стержне. Тестирование повторяли 3 раза для каждого животного с 30-минутными перерывами между тестами и брали среднее значение времени нахождения на стержне до падения.

Животные тестировались на вращающемся стержне в режиме постоянного ускорения. Представлены средние значения продолжительности нахождения животных на стержне до падения для экспериментальной, получавших вещество РС-203 с первого месяца жизни (квадраты) и контрольной (круги) групп.

Как видно из приведенных фиг. 7 данных, исследуемое вещество РС 203 существенно замедляет развитие клинических проявлений нейродегенеративного процесса, вызванного γ-синуклеинопатией, поскольку баланс и координация трансгенных животных, получавших вещество статистически достоверно лучше, чем у контрольных животных, не получавших вещество.

Пример 9. Определение влияния соединения РС-203 на прогрессию симптомов, связанных с неконтролируемой агрегацией гиперфосфорилированной формы белка тау в нервной системе трансгенных животных: оценка баланса и координации на вращающемся стержне.

Моторную функцию трансгенных мышей линии Р3018 оценивали по способности животных удерживаться на стержне в ускоряющемся режиме вращения. Продолжительность каждого тестирования на вращающемся стержне составляла 5 мин, скорость вращения стержня за этот период возрастала от 4 до 40 об/мин. Регистрировалось время, которое животное способно удерживаться на стержне. Тестирование повторяли 3 раза для каждого животного с 30-минутными перерывами между тестами и брали среднее значение времени нахождения на стержне до падения.

Животные тестировались на вращающемся стержне в режиме постоянного ускорения. На фиг. 8 представлены средние по группе значения тестирования контрольных мышей (круги) и экспериментальная группа РС-203 (квадраты), получавших вещество с первого месяца жизни. Как видно из приведенных данных исследуемое вещество существенно замедляет развитие клинических проявлений таупатии.

Таким образом, РС-203 эффективно уменьшает нарушения равновесия и координации у трансгенных животных линии Р3018, вызванные аггрецией белка тау.

Пример 10. Определение влияния соединения РС-203 на прогрессию симптомов связанных с неконтролируемой агрегацией белка γ-синуклеина в нервной системе трансгенных мышей: оценка способности животных удерживаться на перевернутой сетке.

По мере прогрессии нейродегенеративных процессов, вызванных у трансгенных животных линии Τ^^γδΝ γ-синуклеинопатией, регистрируется недостаточность двигательной функции, обусловленная дегенерацией нервов и развитием мышечной слабости - животные утрачивают способность удерживаться на перевернутой сетке. Способность животных удерживаться на перевернутой сетке оценивали регулярно ежемесячно, начиная с трехмесячного возраста в группе, получавшей соединение, и в контрольной

- 7 028720 группе трансгенных животных. В данном тесте регистрировалось время, которое животное удерживается на перевернутой сетке.

На фиг. 9 представлены средние по группе значения тестирования в контрольной группе мышей (круги) и в экспериментальной группе РС-203 (квадраты), получавших вещество с трех месяцев.

Как видно из приведенных данных, исследуемое вещество существенно замедляет развитие симптомов, обусловленных нарушением иннервации конечностей. Таким образом, соединение РС-203 эффективно влияет на прогрессию γ-синуклеинопатии. В данном тесте регистрировалось время, которое животные линии Р301Б способны были удерживаться на перевернутой сетке трансгенных мышей.

Пример 11. Определение влияния соединения РС-203 на прогрессию симптомов, связанных с неконтролируемой агрегацией гипрфосфорилированной формы белка тау в нервной системе трансгенных мышей: оценка способности животных удерживаться на перевернутой сетке.

Способность животных удерживаться на перевернутой сетке оценивали ежемесячно, начиная с двухмесячного возраста и в группе, получавшей исследуемое соединение РС-203 и в контрольной группе трансгенных животных.

Представлены средние по группе значения тестирования контрольных мышей (круги) и экспериментальная группа получавших вещество РС-203 с первого месяца жизни, (квадраты). Как видно из приведенных на фиг. 10 данных, исследуемое вещество существенно замедляет развитие симптомов, обусловленных нарушением иннервации конечностей таупатии. Таким образом, вещество РС 203 эффективно уменьшает выраженность симптомов, обусловленных неконтролируемой агрегацией белков в тканях нервной системы животных.

Пример 12. Определение влияния соединения РС-203 на образование агрегатов белка РИБ в клеточных культурах.

Способность исследуемого соединения влиять на процесс формирования и/или стабильности патогенных белковых агрегатов была исследована в культурах клеток, экспрессирующих аберрантные формы белка РИБ человека склонного к агрегации. Перевиваемую культуру клеток нейробластомы человека БН8Υ5Υ трансфецировали плазмидными конструктами, содержащими последовательности, кодирующие мутантные формы белка РЦБ человека, ассоциированные с некоторыми наследственными формами бокового амиотрофического склероза (БАС), которые имеют повышенную склонность к агрегации и способны формировать патогенные белковые включения. Данная модельная система позволяет воспроизводить отдельные этапы молекулярной патологии протеинопатий, связанных с нарушением метаболизма этих белков. После трансфекции к клеточным культурам непосредственно в питательную среду добавляли соединение РС-203, а затем анализировали количество включений, образованных белком РИБ. В контрольной культуре происходило последовательное накопление агрегатов белка РИБ, которое в конечном итоге приводило к гибели клеток. Однако при добавлении соединения РС-203 процесс образования белковых агрегатов существенно замедлялся.

Как следует из фиг. 11, окрашенные РИБ положительные агрегаты присутствуют в цитоплазме контрольной культуры клеток, тогда как в клетках, обработанных РС-203, окрашивание белка РИБ происходит диффузно. Это указывает на то, что соединение ингибирует формирование агрегатов белка РИБ.

Пример 13. Определение влияния соединения РС-203 на образование агрегатов белка ТОР-43 в клеточных культурах.

Для проверки неожиданно выявленных нами свойств соединения РС 203 ингибировать формирование цитоплазматических белковых агрегатов был использован другой белок. Белок ТОР-43 так же, как и РИБ, является ДНК/РНК связывающим белком, имеет схожую с ним доменную структуру и выполняет в клетке схожие функции регуляции метаболизма РНК. Более того, мутации в структурной части гена, приводящие к изменению первичной последовательности кодируемого им белка, также как и для РИБ, выявлены при ряде форм БАС и фронто-темпоральной дегенерации. Плазмидная ДНК, содержащая укороченную часть гена ТОР-43 человека, кодирующую аберрантную форму этого белка с высокими агрегационными свойствами, в составе экспрессирующего эукариотического вектора, была доставлена в клетки нейробластомы человека БН-БΥ5Υ методом трансфекции, так же как и в предыдущем эксперименте. Через 18 ч в цитоплазме трансфецированых клеток детектировалось образование включений, количество которых было существенно меньше, если в питательную среду добавляли соединение РС-203, что также способствует предотвращению формирования агрегатов аберрантной формы белка ТОР-43.

Как следует из фиг. 12, окрашенные ТОР-43 положительные агрегаты присутствуют в цитоплазме контрольной культуры клеток, также имеется уменьшенное по сравнению с контрольной количество окрашенных ТОР-43 положительных агрегатов в клетках, обработанных РС-203. Таким образом, учитывая особые агрессивные свойства используемой аберрантной формы белка ТОР-43, соединение РС-203 предотвращает агрегацию ТОР-43.

Следующим аспектом изобретения является фармакологическое средство для улучшения когнитивных функций и памяти, содержащее эффективное количество соединения формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармакологическое средство согласно изобретению приготавливается с помощью общепринятых в данной области техники приемов и включает фармакологически эффективное количество активного

- 8 028720 агента, представляющего соединения формулы (I) (называемый далее активное начало), составляющее обычно от 1 до 20 вес.% или от 1 до 20 мг в дозируемой форме, в сочетании с одной или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными добавками, такими как разбавители, связующие, разрыхляющие агенты, адсорбенты, ароматизирующие вещества, вкусовые агенты. В соответствии с известными методами фармацевтические композиции могут быть представлены различными жидкими или твердыми формами. Примеры твердых лекарственных форм включают, например, таблетки, пилюли, желатиновые капсулы и др.

Композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного начала с жидким или тонкоизмельченным твердым носителем.

Композиции согласно изобретению в форме таблеток содержат от 1 до 20% активного начала и наполнителя или носителя. В качестве таковых для таблеток применяются а) разбавители: свекловичный сахар, лактоза, глюкоза, натрия хлорид, сорбит, маннит, гликоль, фосфат кальция двузамещенный; б) связующие вещества: магниевый силикат алюминия, крахмальная паста, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и поливинилпирролидон; в) разрыхлители: декстроза, агар, альгиновая кислота или ее соли, крахмал, твин.

Пример 1.

100 мг таблетки, содержащие по 5 мг соединения по изобретению.

Соединение по изобретению	5 мг
Лактоза	50,0 мг
Альгиновая кислота	20,0 мг
Лимонная кислота	5,0 мг
Трагакант	20,0 мг

Таблетка может быть сформирована посредством прессовки или формовки активного ингредиента с одним или более дополнительными ингредиентами.

Получение прессованных таблеток осуществляется на специальной установке. Активный ингредиент в свободной форме, такой как порошок или гранулы, в количестве 50 г (количество вещества, необходимое для получения 10000 таблеток) перемешивается со связующим веществом - трагакантом (200 г), смешивается с разбавителем - лактозой (500 г), в смесь добавляется разрыхляющее вещество - альгиновая кислота (200 г) и лимонная кислота (50 г).

Для желатиновых капсул используются дополнительно красители и стабилизаторы. В качестве красителей используются тетразин, индиго; в качестве стабилизаторов могут быть представлены натрия метабисульфит, натрия бензоат. Предлагаемые желатиновые капсулы содержат от 1 до 20% активного ингредиента.

Пример 2.

500 мг капсулы, содержащие по 20 мг соединения по изобретению.

Соединение по изобретению	20 мг
Г лицерин	100,0 мг
Сахарный сироп	319,0 мг
Мятное масло	40,0 мг
Натрия бензоат	10,0 мг
Аскорбиновая кислота	5,0 мг
Тетразин	5,0 мг

200 г активного вещества (количество, необходимое для приготовления 10000 капсул) тонко измельчают и смешивают в смесителе с глицерином (1000 г) и сахарным сиропом (3190 г). После перемешивания в смесь добавляют мятное масло (400 г), бензоат натрия (100 г), аскорбиновую кислоту (50 г) и тетразин (50 г). Желатиновые капсулы приготовляют капельным методом. Этот метод позволяет осуществлять одновременное капельное дозирование раствора лекарственного вещества и нагретой желатиновой массы (900 г желатина) в охлажденное вазелиновое масло. В результате образуются бесшовные шарообразные желатиновые капсулы, заполненные лекарственной смесью, полностью готовые к употреблению, содержащие 20 мг активного начала.

Согласно изобретению способ улучшения когнитивных функций и памяти заключается во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индолов формулы (I), в дозе 1-150 мг по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Назначаемая для приема доза активного компонента - соединения формулы (I) -варьируется в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол, вес человека, конкретно назначаемое соединение,

- 9 028720 способ приема, форма препарата, в виде которой назначается активное соединение.

Как видно из приведенных примеров, применением соединений формулы (I) предлагаемое изобретение решает задачу расширения арсенала средств, снижающих неконтролируемую агрегацию белков в нервной системе, приводящую к развитию разрушающих процессов в центральной и периферической нервной системе.

Таблица 1

- 10 028720

Таблица 2

Данные спектров ЯМР 'Н и ¹⁹Р синтезированных соединений

№	Спектр ЯМР 'Η, δ, м. д. (7/Гц)	Спектр ЯМР19Р, δ, м. д., (7/Гц)
1	2.58 (с+т, 5Н), 2.77 (т, 2Н, 7=6.1 Гц), 3.08 (т, 2Н, 7=3.1 Гц), 3.70 (с, 2Н), 4.45 (т, 2Н, 7=3.1 Гц), 6.93 (д, 1Н 7=7.2 Гц), 7.057.33 (м, 4Н), 7.47 (д, 1Н 7=3.1 Гц), 8.20 (с, 1Н), 8.38 (д, 1Н, 7=3.1 Гц)	-47.12 (д, 7=9 Гц)
2	2.44 (с, ЗН), 2.58 (с+т, 5Н), 2.71 (т, 2Н, 7=6.1 Гц), 3.02 (т, 2Н, 7=6.1 Гц), 3.63 (с, 2Н), 4.21 (т, 2Н, 7=6.1 Гц), 6.88 (д, 1Н, 7=7.1 Гц), 6.98 (д, 1Н, 7=7.1 Гц), 7.10 (д, 1Н 7=7.1 Гц), 7.21 (с, 1Н), 8.13 (с, 1Н), 8.32 (д, 1Н, 7=3 Гц)	-47.46 (д, 7=9 Гц)
3	2.53 (с+т, 5Н), 2.76 (т, 2Н, 7=6.2 Гц), 3.06 (т, 2Н, 7=6.2 Гц), 3.65 (с, 2Н), 4.26 (т, 2Н, 7=6.2 Гц), 6.88 (д, 1Н, 7=6.8 Гц), 7.07 (д, 1Н, 7=6.8 Гц), 7.26 (д, 1Н 7=6.8 Гц), 7.57 (с, 1Н), 8.15 (с, 1Н), 8.37 (д, 1Н, 7=3 Гц)	-49.02 (д, 7=9.5 Гц)
4	2.48 (с+т, 5Н), 2.57 (т, 2Н, 7=6.2 Гц), 2.92 (т, 2Н, 7=6.2 Гц), 3.45 (с, 2Н), 4.11 (т, 2Н, 7=6.2 Гц), 6.6 (д, 1Н, 7=7.2 Гц), 6.97 (с, 2Н), 7.28 (с, 1Н), 8.01 (с, 1Н), 8.25 (д, 1Н, 7=3 Гц)	- 48.22 (д, 7=9.7 Гц)
5	2.56 (с+т, 5Н), 2.76 (т, 2Н, 7=5.9 Гц), 3.07 (т, 2Н, 7=5.9 Гц), 3.64 (с, 2Н), 4.27 (т, 2Н, 7=5.9 Гц), 6.90 (м, 2Н), 7.11 (м, 2Н), 8.17 (с, 1Н), 8.37 (д, 1Н, 7=3 Гц)	-46.13 (дт, 1Р, 7=4.2 Гц, 7=9.7 Гц), -49.11 (д, 1Р, 7=9 Гц)
6	2.54 (с+т, 5Н), 2.75 (т, 2Н, 7=5.9 Гц), 3.06 (т, 2Н, 7=5.9 Гц), 3.67 (с, 2Н), 3.90 (с, ЗН), 4.26 (т, 2Н, 7=5.9 Гц), 6.83 (д, 1Н, 7=6.9 Гц), 6.92 (с, 1Н), 7.13 (д, 1Н, 7=5.9 Гц), 7.30 (с, 2Н), 8.18 (с, 1Н), 8.36 (д, 1Н, 7=3 Гц)	-49.11 (д, 7=9 Гц)
7	1.20 (т, ЗН, 7=6.2 Гц), 2.46 (с+т, 5Н), 2.63 (м, 2Н), 2.76 (м, 2Н), 3.01 (т, 2Н), 3.67 (с, 2Н), 4.20 (т, 2Н), 6.87 (д, 1Н), 6.97 (с, 1Н), 7.09 (д, 1Н), 7.23 (1, 2Н), 8.16 (с, 1Н), 8.32 (д, 1Н, I 3)	- 48.22 (д, 7=9 Гц)
8	2.95 (д, ЗН, 7=4.9 Гц), 3.05-3.24 (м, 4Н), 3.46 (м, 1Н), 3.76 (м, 1Н), 4.29 (м, 1Н), 4.45 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 4.62 (м, 1Н), 7.09 (м, 2Н), 7.46 (м, 2Н), 7.80 (д, 1Н, 7=9 Гц), 8.33 (с, 1Н), 8.53 (д, 1Н, 7=3 Гц), 11.23 (уш. с, 1Н)	-48.70 (д, 7=9 Гц)
9	2.92 (д, ЗН, 7=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4Н), 3.43 (м, 1Н), 3.70 (м, 1Н), 4.24 (м, 1Н), 4.38 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 4.55 (м, 1Н), 6.95 (д, 1Н, 1=8.6 Гц), 7.21 (с, 1Н), 7.34 (д, 1Н, 7=8.6 Гц), 7.88 (д, 1Н, 7=9.7 Гц), 8.36 (с, 1Н), 8.58 (уш. с, 1Н), 11.39 (уш. с, 1Н)	- 47.23 (д, 7=9 Гц)
10	2.92 (д, ЗН, 7=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4Н), 3.44 (м, 1Н), 3.75 (м, 1Н), 4.24 (м, 1Н), 4.43 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 4.58 (м, 1Н), 7.22 (д, 1Н, 7=8.6 Гц), 7.44 (д, 7=8.6, Гц), 7.69 (с, 1Н), 7.76 (д, 1Н, 7=9.5 Гц), 8.28 (с, 1Н), 8.48 (д, 1Н, 7=3 Гц), 11.39 (уш. с, 1Н)	-49.21 (д, 7=9.5 Гц)
11	2.92 (д, ЗН, 7=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4Н), 3.44 (м, 1Н), 3.75 (м, 1Н), 4.24 (м, 1Н), 4.43 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 4.55 (м, 1Н), 7.10 (дд, 1Н, 1=2.3 Гц, 7=8.8 Гц), 7.48 (д, 7=8.8 Гц), 7.55 (д, 1Н, 7=2.3 Гц), 7.89 (д, 1Н, 7=9.7 Гц), 8.37 (с, 1Н), 8.58 (д, 1Н, 7=3), 11.51 (уш. с, 1Н)	- 47.98 (д, 7=9.7 Гц)
12	2.95 (д, ЗН, 7=4.9 Гц), 3.07-3.24 (м, 4Н), 3.46 (м, 1Н), 3.76 (м, 1Н), 4.23 (м, 1Н), 4.43 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 4.54 (м, 1Н), 6.96 (дд, 1Н, 7=2.7 Гц, 7=9.1 Гц, 7=9.7 Гц), 7.27 (дд, 1Н, 7=2.7 Гц, 7=9.7), 7.47 (дд, 7=9.1 Гц, 7= 4.2 Гц), 7.78 (д, 1Н, 7=9 Гц), 8.30 (с, 1Н), 8.51 (д, 1Н, 7=3 Гц), 11.23 (уш. с, 1Н)	-46.51 (дт, 1Р, 7=4.2 Гц, 7=9.7 Гц), - 49.00 (д, 1Р, 7=9 Гц)
13	2.94 (д, ЗН, 7=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4Н), 3.42 (м, 1Н), 3.73 (м, 1Н), 3.77 (с, ЗН); 4.24 (м, 1Н), 4.37 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 4.55 (м, 1Н), 6.98 (д, 1Н, 7=2.3 Гц), 7.10 (дд, 1Н, 7=2.3 Гц, 7=8.6 Гц), 7.36 (д, 7=8.6 Гц), 7.72 (д, 1Н, 7=9.7 Гц), 8.29 (с, 1Н), 8.48 (д, 1Н, 7=3 Гц), 10.96 (уш. с, 1Н)	- 49.36 (д, 7=9 Гц)
14	2.95 (д, ЗН, 7=4.0 Гц), 3.07-3.24 (м, 4Н), 3.46 (м, 1Н), 3.76 (м, 1Н), 4.23 (м, 1Н), 4.43 (м, 2Н), 4.54 (м, 1Н), 7.07 (дд, 1Н, 1=2.0 Гц, 7=9.3 Гц), 7.56 (д, 1Н, 7=9.3 Гц), 7.82 (д, 1Н, 7=9.7 Гц), 8.36 (с, 1Н), 8.53 (д, 1Н, 7=2 Гц), 11.43 (уш. с, 1Н)	20.81 (с, ЗР), - 48.63 (д, 1Р, 7=8.5 Гц)
15	1.40 (т, ЗН, 7=4.9 Гц), 3.07-3.24 (м, 4Н), 3.29 (м, 2Н), 3.46 (м, 1Н), 3.76 (м, 1Н), 4.29 (м, 1Н), 4.25 (м, 2Н), 4.63 (м, 1Н), 7.07 (м, 2Н), 7.47 (м, 2Н), 7.76 (д, 1Н, 7=9.0 Гц), 8.30 (с, 1Н), 8.48 (д, 1Н, 7=3.0 Гц), 11.00 (уш. с, 1Н)	- 49.07 (д, 7=9 Гц)
16	1.38 (т, ЗН, 7=4.9 Гц), 2.38 (с, ЗН), 3.06-3.24 (м, 4Н), 3.27 (м, 2Н), 3.45 (м, 1Н), 3.78 (м, 1Н), 4.26 (м, 2Н), 4.30 (м, 1Н), 4.58 (м, 1Н), 6.95 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 7.27 (с, 1Н), 7.34 (д, 7=8.0 Гц), 7.75 (д, 1Н, 7=9.0 Гц), 8.27 (с, 1Н), 8.49 (д, 1Н, 7=3.1 Гц), 10.87	-49.13 (д, 7=9 Гц)

- 11 028720

	(уш. с, 1Н)
17	1.36 (т, ЗН, 7=5.1 Гц), 3.07 (м, 2Н), 3.05-3.31 (м, 4Н), 3.40 (м, 1Н), 3.75 (м, 1Н), 4.22 (м, 1Н), 4.66 (м, 1Н), 7.10 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 7.48 (д, 7=8.0 Гц), 7.59 (с, 1Н), 8.11 (д, 1Н, 1=9.0 Гц), 8.44 (с, 1Н), 8.72 (уш. с, 1Н), 10.54 (уш. с, 1Н)	-49.01 (д, 7=9 Гц)
18	1.37 (т, ЗН, 7=4.9 Гц), 3.08 (м, 2Н), 3.07-3.30 (м, 4Н), 3.44 (м, 1Н), 3.80 (м, 1Н), 4.24 (м, 1Н), 4.65 (м, 1Н), 7.09 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 7.46 (д, 7=8.0 Гц), 7.59 (с, 1Н), 8.09 (д, 1Н, 7=9.0 Гц), 8.45 (с, 1Н), 8.70 (уш. с, 1Н), 10.56 (уш. с, 1Н)	- 48.93 (д, 7=9 Гц)
19	1.24 (т, ЗН, 7=4.9 Гц), 2.68 (к, 2Н, 1=4,9 Гц), 2.55 (м, 2Н), 2.80	-47.37 (дт, 1Р,
	(м, 2Н), 3.06 (т, 4Н, 7=4.9 Гц), 3.67 (с, 2Н), 4.26 (т, 2Н, 7=4.9	7=4.4 Гц, 7=9.7
	Гц), 6.91 (м, 2Н), 7.12 (м, 2Н), 8.16 (с, 1Н), 8.38 (д, 1Н, 7=3.3	Гц),-49.10 (д, 1Р,
	Гц), 11.23 (уш. с, 1Н)	7=9 Гц)
20	1.35 (т, ЗН, 7=4.9 Гц), 3.09 (м, 2Н), 3.08-3.30 (м, 4Н), 3.43 (м, 1Н), 3.62 (с, ЗН); 3.88 (м, 1Н), 4.25 (м, 1Н), 4.65 (м, 1Н), 7.08 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 7.44 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 7.59 (с, 1Н), 8.11 (д, 1Н, 7=9.0 Гц), 8.49 (с, 1Н), 8.71 (уш. с, 1Н), 10.53 (уш. с, 1Н)	- 48.93 (д, 7=9 Гц)
21	1.39 (т, ЗН, 7=4.9 Гц), 3.06 (м, 2Н), 3.07-3.31 (м, 4Н), 3.45 (м,	20.89 (с, ЗР), -
	1Н), 3.82 (м, 1Н), 4.23 (м, 1Н), 4.66 (м, 1Н), 7.09 (д, 1Н, 7=8.0	48.55 (д, 1Р, 7=8.5
	Гц), 7.47 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 7.61 (с, 1Н), 8.10 (д, 1Н, 7=9.0 Гц), 8.47 (с, 1Н), 8.71 (уш. с, 1Н), 10.55 (уш. с, 1Н)	Гц)
23	2.25 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 2.39 (с, ЗН), 2.55 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 2.99 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 3.50 (с, 2Н), 4.13 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 7.00 (м, 4Н), 7.28 (д.д, 1Н), 7,34 (д, 1Н, 7=8.1 Гц), 8.30 (с, 1Н),	9.24 с
24	2.24 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 2.39 и 2,42 оба (т, 6Н, 7=4.8 Гц), 2.53 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.03 (т, 2Н, 7=4.8 Гц ), 3.47 (с, 2Н), 4.16 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 6.82 (д, 1Н, 7=8.2 Гц), 6.95 (м, 2Н), 7.07 (с, 1Н) ,7.36 (д, 1Н, 7=8.2 Гц), 8.34 (с, 1Н),	9.59 с
25	2.24 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 2.39 (с, ЗН), 2.54 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.02 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.45 (с, 2Н), 4.16 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 6.76 (т.д., 1Н), 6.98 (м, ЗН), 7.37 (д, 1Н, 7=8.0 Гц), 8.32 (с, 1Н),	9.62 с
26	2.26 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 2.38 (с, ЗН), 2.53 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 2.96	-45.12 (м, 1Р), 9.51
	(т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.42 (с, 2Н), 4.09 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 6.94 (м, 2Н), 7.03 (д, 1Н, 7=8.1 Гц), 7.25 (с, 1Н), 7.36 (д, 1Н, 7=8.1 Гц), 8.24 (с, 1Н),	(с, ЗР)
27	2.23 (т, 2Н, 7=4.9 Гц), 2.52 (с, ЗН), 2.53 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.03 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.47 (с, 2Н), 3.78 (с, ЗН), 4.15 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 6.67 (м, 2Н), 6.94 (м, 2Н),7.36 (д, 1Н, 7=8,0 Гц), 8.34 (с, 1Н),	9.42 с
28	2.33 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 2.22 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 2.55 (м, 4Н), 2.98	-57.24 (м, 1Р), -
	(т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.48 (с, 2Н), 4.13 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 6.95 (м,	44.05 (м, 1Р), 9.09
	ЗН), 7.34 (м, 2Н), 8.35 (с, 1Н),	(сЗР)
29	1.13 (т, 1Н, 7=4.8 Гц), 2.39 (с, ЗН), 2.54 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.02 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 3.45 (с, 2Н), 4.16 (т, 2Н, 7=4.8 Гц), 6.76 (т.д., 1Н, 7=4.8 Гц, 7= 6.5 Гц), 6.98 (м, ЗН), 7.37 (д, 1Н, 7=8.1 Гц), 8.32 (с, 1Н),	9.53 с
30	2.76 (с, ЗН), 2.99 (м, 4Н), 3.52 (м, 2Н), 3.92 - 4,55 (м, 4Н), 6,91 (м, 1Н), 7,26 (м, 2Н), 7,60 (м, ЗН), 8.39 (м, 1Н), 11,27 (уш.с, 1Н)	11.47 с
31	2.38 (с, ЗН), 2.92 (с, ЗН), 3.11 (м, 2Н), 3.61 (м, 4Н), 4.07-4.76 (м, 4Н), 6.94 (д, 1Н, 7=6.8 Гц), 7.21 (с, 1Н), 7.23 (д, 1Н, 7=6.8 Гц), 7.82 (м, 2Н), 8.54 (с, 1Н), 11,13 (уш.с, 1Н)	11.39с
32	2.59 (с, ЗН), 2.80 (м, 2Н), 3.13 (м, 4Н), 4.12 (м, 4Н), 6,74 (д, 1Н, 7=6.9 Гц), 7,05 (м, 1Н), 7,20 (с, 1Н), 7,47 (м, 2Н), 8.21 (с, 1Н), 11,27 (уш.с, 1Н)	11.54с
33	2.52 (с, ЗН), 2.91 (м, ЗН), 3.11 (м ЗН), 4,17 - 4,64 (м 4Н), 6,92	-44.59 (м, 1Р),
	(м, 1Н), 7,25 (д, 1Н, 7=7.1 Гц), 7,39 (м, 1Н), 7,76 (м, 1Н), 7,86 (м, 1Н), 8,54 (с 1Н), 11,43 (уш.с, 1Н)	11.49 (с ЗР)
34	2.92 (д, ЗН, 7=3.8 Гц), 3.11 (м, 2Н), 3.62 (м, 4Н), 3.78 (с, ЗН); 4.13 - 4.68 (м, 4Н), 6.74 (д. д, 1Н, 7=2.7 Гц, 7=6.8 Гц), 6.99 (д, IH. 7=6.8 Гц)), 7.33 (д, 1Н. 7=6.8 Гц), 7.83 (м, 2Н), 8.54 (с, 1Н), II. 04(уш. с, 1Н)	11.53 с
35	2.54 (с, ЗН), 2.77 (м, 4Н), 3.32 (м, 1Н), 3.88 (м, 2Н), 4.11 (м,	-57.48 (м, 1Р), -
	ЗН), 6,56 (т, 1Н. 7=6.7 Гц), 6.79 (д, 1Н. 7=6.7 Гц), 7,40 (м, 2Н),	44.12 (м, 1Р),
	8.08 (с, 1Н), 11,09 (уш.с, 1Н)	11.61 (с ЗР)
36	1.37 (т, ЗН. 7=5.1 Гц), 3.12 (м, 2Н), 3.10-3.35 (м, 4Н), 3.42 (м, 1Н), 3.75 (м, 1Н), 4.23 (м, 1Н), 4.71 (м, 1Н), 7.10 (д. д, 1Н,	11.38с
	7=2.5 Гц, 7=6.8 Гц), 7.45 (д, 1Н, 7=6.8 Гц), 7.62 (д, 1Н, 7=6.8 Гц), 7.74 - 8.01 (м, 2Н, ), 10.52 (уш. с, 1Н)

- 12 028720

Claims (3)

1. Гидрохлориды фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)этил]-2,3,4-тетрагидро-1Нпиридо[4,3-Ь]индолов общей формулы (I) в качестве средства для снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе где К₁, К₂ и К₄ представляют собой Н;

К₃ представляет собой Ме или Εί;

К₅ представляет собой Н;

Кб представляет собой Н, Е, С1, Вг, СЕ₃О, Ме, МеО;

К₇ представляет собой Н;

К₈ представляют собой Н, Е;

К₉ представляет собой Е, СЕ₃.

2. Фармакологическое средство для снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество соединения формулы (I).

3. Способ снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, заключающийся во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество соединения формулы (I) в дозе 0,01-1,5 мг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.