EA028031B1 - Твердая форма производного дигидропиридооксазина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(S)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-b][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона; фармацевтическим композициям и комбинациям, содержащим такие формы, а также к способам применения этих форм, включая их фармацевтические композиции и комбинации для лечения заболеваний.

Description

Изобретение относится к новой твердой форме производного дигидропиридооксазина, к способам его получения и его применению в фармацевтических композициях.

Уровень техники

В международной патентной заявке РСТ/1В2012/057554, опубликованной как \УО 2013/093849, описаны производные дигидробензооксазина и дигидропиридооксазина, которые являются подходящими для лечения нарушения или заболевания, которое опосредовано активностью ферментов Р13К. В РСТ/1В2012/057554 описаны (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ъ][1,4]оксазин-7 -илокси]пирролидин-1 -ил}метанон и способы получения этого соединения.

Эти соединения являются пригодными для лечения, отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими фармакологически активными соединениями, связанных с Р13К заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, аутоиммунные нарушения, воспалительные заболевания, аллергические заболевания, заболевания дыхательных путей, такие как астма и СОРИ, отторжение трансплантата, злокачественные опухоли, например гематопоэтического происхождения, или солидные опухоли.

Эти соединения также являются пригодными для лечения, отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими фармакологически активными соединениями, состояний, заболеваний или нарушений, например аутоиммунных нарушений, воспалительных заболеваний, аллергических заболеваний, заболеваний дыхательных путей, таких как астма и СОРИ, отторжение трансплантата; продукция антител, презентация антигена, продукция цитокинов или лимфоидный органогенез являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, обыкновенную пузырчатку, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, системную красную волчанку, рассеянный склероз, миастению гравис, синдром Шегрена, аутоиммунную гемолитическую анемию, АИСА-ассоциированный васкулит, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, хроническую аутоиммунную крапивницу, аллергию (атопический дерматит, контактный дерматит, аллергический ринит), синдром Гудпасчера, АМК (антителоопосредованное отторжение трансплантата), опосредованное В-клетками сверхострое, острое и хроническое отторжение трансплантата и злокачественные опухоли гематопоэтической природы, включая, но не ограничиваясь ими, множественную миелому; лейкемию; острый миелогенный лейкоз; хронический миелогенный лейкоз; лимфоцитарный лейкоз; миелолейкоз; неходжкинскую лимфому; лимфомы; истинную полицитемию; эссенциальную тромбоцитемию; миелофиброз с миелоидной метаплазией и болезнь Вальденстрема; более конкретно из ревматоидного артрита (КА), обыкновенной пузырчатки (РУ), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (1ТР), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), аутоиммунной гемолитической анемии (А1НА), приобретенной гемофилии типа А (АНА), системной красной волчанки (8ЬЕ), рассеянного склероза (М8), миастении гравис (МО), синдрома Шегрена (88), АИСА-ассоциированного васкулита, криоглобулинемии, хронической аутоиммунной крапивницы (САИ), аллергии (атопического дерматита, контактного дерматита, аллергического ринита), синдрома Гудпасчера, отторжения трансплантата и злокачественных опухолей гематопоэтической природы, а также при иммунопатологии, связанной с заболеванием или инфекцией, например тяжелой и церебральной малярии, трипаносомозе, лейшманиозе, токсоплазмозе и нейроцистицеркозе.

Сущность изобретения

Изобретение относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона, фармацевтическим композициям и комбинациям, содержащим такую форму. Кроме того, изобретение относится к способам применения такой формы, включая ее фармацевтические композиции и комбинации для лечения заболеваний, опосредованных активностью ферментов Р13К, предпочтительно активацией изоформы Р13К5.

Хорошо известно, что кристаллическая форма активного фармацевтического ингредиента (АР1) конкретного лекарственного средства часто является важным фактором простоты получения, гигроскопичности, стабильности, растворимости, стабильности при хранении, простоты состава, скорости растворения в желудочно-кишечных жидкостях и биодоступности ίη νίνο лекарственного средства. Кристаллические формы возникают, когда одна и та же композиция вещества кристаллизуется в другой структурной решетке, что приводит к различным термодинамическим свойствам и стабильностям, характерным для конкретной кристаллической формы. Кристаллические формы также могут включать различные гидраты или сольваты одного и того же соединения. При принятии решения, какая форма является предпочтительной, сравнивают различные свойства форм и выбирают предпочтительную форму на основании многих переменных физических свойств. Нельзя исключать, что одна форма может являться предпочтительной при некоторых обстоятельствах, когда считают, что определенные аспекты, такие как простота получения, стабильность и т.д., являются критическими. В других ситуациях другая форма может являться предпочтительной вследствие большей скорости растворения и/или лучшей биодоступности. Пока еще невозможно прогнозировать, будет ли конкретное соединение образовывать полиморфы, будут ли любые такие полиморфы являться подходящими для коммерческого использования в терапевтической композиции, или какие полиморфы будут проявлять такие желательные свойства.

- 1 028031

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой порошковую рентгеновскую дифрактограмму примера Р1, кристаллическая безводная форма;

фиг. 2 - график дифференциальной сканирующей калориметрии примера Р1, кристаллическая безводная форма.

Подробное описание изобретения

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона.

В другом варианте осуществления безводная кристаллическая форма (1,1-диоксогексагидро1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей следующие пики, приведенные в градусах 2-θ ±0,2°: 9,1, 10,2, 11,9, 13,0, 17,1, 17,7, 18,7, 20,3, 20,8, 26,0, 26,7, 23,2, 24,1, 24,8, 29,3, 27,4 и 21,4.

В другом варианте осуществления безводная кристаллическая форма (1,1-диоксогексагидро1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона характеризуется рентгенодифракционным спектром, по существу, таким же как спектр рентгеновской порошковой дифракции, представленный на фиг. 1.

В другом варианте осуществления безводная кристаллическая форма (1,1-диоксогексагидро1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона характеризуется графиком дифференциальной сканирующей калориметрией, по существу, таким же, как график, представленный на фиг. 2.

Если не указано иное, термин форма по настоящему изобретению относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона.

Если не указано иное, общие термины, используемые выше и далее в настоящем описании, предпочтительно в рамках этого описания имеют следующие ниже значения.

Изобретение можно более полно понять посредством ссылки на следующее ниже описание, включая следующий ниже словарь терминов и заключительные примеры. Как используют в настоящем описании, термины включающий, состоящий и содержащий используют в настоящем описании в их открытом неограничивающем смысле.

Как используют в настоящем описании, термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), средства придания изотоничности, замедляющие всасывание средства, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственных средств, связывающие средства, эксципиенты, дезинтегрирующие средства, смазывающие средства, подсластители, ароматизаторы, красители и т.п., и их сочетания, как известно специалистам в данной области (см., например, ВетищЮп'х РЬагтасеийса1 Заепсек, 18ΐΗ Εά. Маск Ргшйид Сотрапу, 1990, рр. 1289-1329). За исключением тех случаев, когда общепринятый носитель является несовместимым с активным ингредиентом, предусматривают его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.

Термин терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое вызывает биологический или медицинский ответ индивидуума, например снижение или ингибирование активности фермента или белка или улучшение симптомов, облегчения состояний, замедление или отсрочивание прогрессирования заболевания, или профилактику заболевания и т.д. В одном из неограничивающих вариантов осуществления термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении индивидууму является эффективным, чтобы (1) по меньшей мере частично облегчать, ингибировать, предотвращать и/или улучшать состояние, или нарушение, или заболевание, (ί) опосредованное Р13К, или (ίί) связанное с активностью Р13К, или (ίίί) характеризующееся активностью (нормальной или аномальной) Р13К, или (2) уменьшать или ингибировать активность Р13К, или (3) уменьшать или ингибировать экспрессию Р13К. В другом неограничивающем варианте осуществления термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или ткань, или неклеточный биологический материал, или среду является эффективным, по меньшей мере, для частичного понижения или ингибирования активности Р13К; или, по меньшей мере, частичного снижения или ингибирования экспрессии Р13К. Значение термина терапевтически эффективное количество, как проиллюстрировано в указанном выше варианте осуществления для Р13К, также применяют таким же образом к любым другим релевантным белкам/пептидам/ферментам.

Как используют в настоящем описании, термин индивидуум относится к животному. Как правило, животное представляет собой млекопитающее. Например, индивидуум также относится к приматам (например, людям, мужчинам или женщинам), коровам, овце, козам, лошади, собакам, кошкам, кроли- 2 028031 кам, крысам, мышам, рыбам, птицам и т.п. В определенных вариантах осуществления индивидуум представляет собой примата. В других вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека.

Как используют в настоящем описании, термин ингибирует, ингибирование или ингибирующий относится к уменьшению или подавлению данного состояния, симптома или нарушения, или заболевания или значительному снижению исходной активности биологической активности или процесса.

Как используют в настоящем описании, термин лечит, лечащий или лечение любого заболевания или нарушения в одном из вариантов осуществления относится к улучшению состояния заболевания или нарушения (т.е. замедлению, или купированию, или уменьшению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления лечит, лечащий или лечение относится к облегчению или улучшению состояния по меньшей мере одного физического параметра, включая параметры, которые пациент может не ощущать. В еще одном варианте осуществления лечит, лечащий или лечение относится к модулированию заболевания или нарушения физически (например, стабилизация неощущаемого симптома), физиологически, (например, стабилизация физического параметра) или оба варианта. В еще одном варианте осуществления лечит, лечащий или лечение относится к профилактике или отсрочиванию начала, или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения.

Как используют в настоящем описании, индивидуум нуждается в лечении, если в результате такого лечения такой индивидуум получит благоприятное действие с биологической, медицинской точки зрения или с точки зрения качества жизни.

Как используют в настоящем описании, термин в форме единственного числа и аналогичные термины, используемые в контексте настоящего изобретения, особенно в отношении пунктов формулы изобретения, необходимо интерпретировать как включающие формы единственного и множественного числа, если не указано иное в настоящем описании или если это явно не противоречит контексту.

Все способы, описываемые в настоящем описании, можно проводить в любом подходящем порядке, если не указано иное в настоящем описании или если это явно не противоречит контексту. Использование любого и всех примеров или типичного выражения, например такой как, приведенного в настоящем описании, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничений на объем изобретения, если явно не заявлено иначе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей форму по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическую композицию можно формулировать для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение и ректальное введение и т.д. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получать в твердой форме (включая без ограничения капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (включая без ограничения растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции можно подвергать общепринятым фармацевтическим обработкам, такими как стерилизация, и/или они могут содержать общепринятые инертные разбавители, смазки или буферные средства, а также адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, средства для смачивания, эмульгаторы и буферы и т.д.

Как правило, фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент совместно с:

a) разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином;

b) смазывающими веществами, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; для таблеток также

c) связывающими средствами, например алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия и/или поливинилпирролидоном; при желании

ά) дезинтегрантами, например крахмалами, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью, или шипучими смесями, и/или

е) абсорбентами, красителями, вкусоароматическими добавками и подсластителями.

Таблетки можно покрывать оболочкой или растворяющейся в кишечнике оболочкой известными в данной области способами.

Подходящие для перорального введения композиции включают эффективное количество формы по настоящему изобретению в форме таблеток, таблеток-леденцов, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул или сиропов, или эликсиров. Предназначенные для перорального применения композиции получают любым известным в данной области способом для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или более средств, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов для обеспечения фармацевтически элегантных и приятных на вкус препаратов. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксическими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые являются подходящими для получения таблеток. Такие эксципиенты, например, представляют собой инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фос- 3 028031 фат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; связывающие средства, например крахмал, желатин или гуммиарабик, и смазки, например стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Таблетки покрывают или не покрывают оболочкой известными способами для замедления распадаемости и всасывания в желудочнокишечном тракте и, таким образом, обеспечивают длительное действие в течение более продолжительного периода времени. Например, можно применять вещество, обеспечивающее задержку по времени, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Составы для перорального применения могут содержаться в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с водой или масляной средой, например арахисовым маслом, парафиновым маслом или оливковым маслом.

Некоторые инъецируемые композиции представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории преимущественно получают из жировых эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут являться стерилизованными и/или содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие средства или эмульгаторы, способствующие растворению вещества, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества. Указанные композиции получают в соответствии с общепринятыми способами смешивания, гранулирования или покрытия, соответственно, и они содержат приблизительно 0,1-75% или содержат приблизительно 1-50% активного ингредиента.

Подходящие для чрескожного применения композиции содержат эффективное количество формы по изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для чрескожной доставки, включают легко всасываемые фармакологически приемлемые растворители для содействия прохождению через кожу хозяина. Например, трансдермальные устройства находятся в форме повязки, содержащий опорный элемент, резервуар, содержащий соединение необязательно с носителями, необязательно регулирующий скорость барьер для доставки соединения в кожу хозяина при регулируемой и заданной скорости в течение пролонгированного периода времени и средства для прикрепления устройства к коже.

Подходящие для местного нанесения композиции, например на кожу и глаза, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели или распыляемые составы, например для доставки посредством аэрозоля или т.п. В частности, такие местные системы доставки являются подходящими для нанесения на кожу, например, для лечения рака кожи, например, для профилактического использования в кремах, лосьонах, спреях для защиты от солнца и т.п. Таким образом, они являются особенно пригодными для применения в местных составах, включая косметические составы, хорошо известные в данной области. Такие составы могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, повышающие тоничность средства, буферы и консерванты.

Как используют в настоящем описании, местное применение также может относиться к ингаляции или интраназальному применению. Их можно подходящим способом доставлять в форме сухого порошка (либо отдельно, в виде смеси, например, сухой смеси с лактозой, либо в виде частиц смешанных компонентов, например, с фосфолипидами) из ингалятора сухого порошка или в виде аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера, насоса, спрея, аэрозольного ингалятора или небулайзера с использованием подходящего пропеллента или без его использования.

Настоящее изобретение дополнительно относится к безводным фармацевтическим композициям и лекарственным формам, содержащим форму по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, т.к. вода может облегчать разрушение некоторых соединений.

Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы по настоящему изобретению можно получать с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и условий низкого содержания влаги или низкой влажности. Безводную фармацевтическую композицию можно получать и хранить таким образом, чтобы сохранять ее безводную природу. Таким образом, безводные композиции упаковывают с использованием веществ, для которых известно, что они предохраняют от воздействия воды, так что их можно включать в подходящие наборы лекарственных форм. Примеры подходящей упаковки включают, но не ограничиваются ими, герметично закрывающие пленки, пластмассы, стандартные контейнеры для лекарственных средств (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные безъячейковые упаковки.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям и лекарственным формам, которые содержат одно или более средств, которые понижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента разрушается. Такие средства, которые в настоящем описании обозначают как стабилизаторы, включают, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН-буферы или солевые буферы и т.д.

Форма по настоящему изобретению может являться пригодной для лечения состояний, заболеваний или нарушений, включая иммунопатологии, связанные с заболеванием или инфекцией, при которых одна или более функций В-клеток, таких как образование антител, презентация антигена, продукция цитокинов или лимфоидный органогенез, являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, обыкновенную пузырчатку и родственные заболевания, идиопатическую тромбоцитопеническую

- 4 028031 пурпуру, системную красную волчанку, рассеянный склероз, миастению гравис, синдром Шегрена, аутоиммунную гемолитическую анемию, АЯСА-ассоциированный васкулит, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, хроническую аутоиммунную крапивницу, аллергию (атопический дерматит, контактный дерматит, аллергический ринит), синдром Гудпасчера, АМК (антителоопосредованное отторжение трансплантата), опосредованное В-клетками сверхострое, острое и хроническое отторжение трансплантата и злокачественные опухоли гематопоэтической природы, включая, но не ограничиваясь ими, множественную миелому, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, миелолейкоз, неходжкинскую лимфому, лимфомы, истинную полицитемию, эссенциальную тромбоцитемию, миелофиброз с миелоидной метаплазией и болезнь Вальденстрема.

Изобретение включает способы лечения состояний, заболеваний или нарушений, при которых одна или более функций нейтрофилов, таких как выделение супероксида, индуцированный экзоцитоз или хемоаттрактивная миграция, являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, сепсис, легочные или респираторные нарушения, такие как астма, воспалительные дерматозы, такие как псориаз, а также при иммунопатологии, связанной с заболеванием или инфекцией, и другие.

Изобретение включает способы лечения состояний, заболеваний или нарушений, при которых одна или более функций базофилов и тучных клеток, таких как хемоаттрактивная миграция или активированная аллергеном 1дЕ-опосредованная дегрануляция, являются аномальными или нежелательными, включая аллергические заболевания (атопический дерматит, контактный дерматит, аллергический ринит), а также другие нарушения, такие как СОРИ, астму или эмфизему.

Изобретение включает способы лечения состояний, заболеваний или нарушений, при которых одна или более функций Т-клеток, таких как продукция цитокинов или клеточноопосредованная цитотоксичность, являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, рассеянный склероз, острое или хроническое отторжение клеточной ткани или трансплантатов органов или злокачественные опухоли гематопоэтической природы, а также при иммунопатологии, связанной с заболеванием или инфекцией.

Кроме того, изобретение включает способы лечения нейродегенеративных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний и агрегации тромбоцитов.

Кроме того, изобретение включает способы лечения заболеваний кожи, таких как поздняя кожная порфирия, полиморфный фотодерматоз, дерматомиозит, солнечная крапивница, красный плоский лишай слизистой оболочки полости рта, панникулит, склеродермия, уртикарный васкулит.

Кроме того, изобретение включает способы лечения хронических воспалительных заболеваний, таких как саркоидоз, анулярная гранулема.

В других вариантах осуществления состояние или нарушение (например, Р13К-опосредованные) выбраны из группы, состоящей из истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, миелофиброза с миелоидной метаплазией, астмы, СОРИ, АКО8, синдрома Лоффлера, эозинофильной пневмонии, паразитарного (в частности, многоклеточными) заражения (включая тропическую эозинофилию), бронхопульмонального аспергиллеза, узелкового периартериита (включая синдром Черджа-Стросс), эозинофильной гранулемы, связанных с эозинофилами расстройств, затрагивающих дыхательные пути, вследствие реакции на лекарственные средства, псориаза, контактного дерматита, атопического дерматита, очаговой алопеции, полиморфной эритемы, герпетиформного дерматита, склеродермии, витилиго, гиперчувствительного ангиита, крапивницы, буллезного пемфигоида, красной волчанки, пузырчатки, приобретенного буллезного эпидермолиза, аутоиммунных гематологических расстройств (например, гемолитической анемии, апластической анемии, чистой эритроцитарной анемии и идиопатической тромбоцитопении), системной красной волчанки, полихондрита, склеродермии, грануломатоза Вегенера, дерматомиозита, хронического активного гепатита, миастении гравис, синдрома Стивенса-Джонсона, идиопатической спру, аутоиммунного воспалительного заболевания кишечника (например, язвенного колита и болезни Крона), эндокринной офтальмопатии, болезни Грейвса, саркоидоза, альвеолита, хронического гиперчувствительного пневмонита, рассеянного склероза, первичного билиарного цирроза, увеита (переднего и заднего), интерстициального фиброза легкого, псориатического артрита, гломерулонефрита, сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, гипертензии, тромбоза глубоких вен, инсульта, инфаркта миокарда, нестабильной стенокардии, тромбоэмболии, легочной эмболии, тромболитических заболеваний, острой артериальной ишемии, периферийных тромботических окклюзии и ишемической болезни сердца, реперфузионных повреждений, ретинопатии, такой как диабетическая ретинопатия или ретинопатия, индуцированная гипербарическим кислородом, и состояний, характеризующихся повышенным внутриглазным давлением или секрецией водянистой влаги глаз, таких как глаукома.

В другом варианте осуществления форма по настоящему изобретению является пригодной для лечения, профилактики или улучшения состояния аутоиммунного заболевания и воспалительных состояний, в частности, воспалительных состояний с этиологией, включающей аутоиммунный компонент, таких как артрит (например, ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит и деформирующий артрит) и ревматизм, включая воспалительные состояния и ревматизм, включая остеопороз, воспалительную боль, спондилоартропатии, включая ангилозирующий спондилит, болезнь Рейтера, реак- 5 028031 тивный артрит, псориатический артрит и энтеропатический артрит, гиперчувствительность (включая гиперчувствительность дыхательных путей и гиперчувствительность кожи) и аллергии. Конкретные аутоиммунные заболевания, при который можно применять формы по изобретению, включают аутоиммунные гематологические нарушения (включая, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, чистую эритроцитарную анемию и идиопатическую тромбоцитопению), приобретенную гемофилию А, болезнь Холодовых агглютининов, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Шегрена, системную красную волчанку, воспалительные поражения мышц, полихондрит, склеродому, васкулиты, ассоциированные с антителами против нейтрофилов в цитоплазме, опосредованные 1дМ нейропатии, опсоклонус-миоклонус синдром, грануломатоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, миастению гравис, псориаз, синдром Стивенса-Джонсона, обыкновенную пузырчатку, листовидную пузырчатку, идиопатическую спру, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника (включая, например, язвенный колит, болезнь Крона и синдром раздраженного кишечника), эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, рассеянный склероз, нейромиелит зрительного нерва, первичный билиарный цирроз, ювенильный диабет (сахарный диабет I типа), увеит (передний, срединный и задний, а также панувеит), сухой кератоконъюнктивит и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит и гломерулонефрит (с нефротическим синдромом и без него, например, включая идиопатический нефротический синдром или нефропатию с минимальными изменениями), опухоли, воспалительные заболевания кожи и роговицы, миозит, ослабление костных имплантатов, нарушения обмена веществ, такие как атеросклероз, диабет и дислипидемия.

В другом варианте осуществления форма по настоящему изобретению является пригодной для лечения состояний или нарушений, выбранных из группы, состоящей из первичной В-клеточной лимфомы кожи, иммунобулезного заболевания, обыкновенной пузырчатки, эксфолиативной пузырчатки, эндемичной формы бразильской пузырчатки (Родо 8е1уадет), паранеопластической пузырчатки, буллезного пемфигоида, пемфигоида слизистой оболочки, врожденного буллезного эпидермолиза, хронической реакции трансплантат против хозяина, дерматомиозита, системной красной волчанки, васкулита, васкулита небольших сосудов, гипокомплементемического уртикарного васкулита, васкулита, опосредованного антинейтрофильными цитоплазматическими антителами, криоглобулинемии, синдрома Шницлера, макроглобулинемии Вальденстрема, отека Квинке, витилиго, системной красной волчанки, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, рассеянного склероза, болезни Холодовых агглютининов, аутоиммунной гемолитической анемии, связанного с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами васкулита, реакции трансплантат против хозяина, криоглобулинемии и тромботической тромбоцитопенической пурпуры.

Таким образом, в качестве дополнительного варианта осуществления настоящее изобретение относится к использованию безводной кристаллической формы (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона в терапии. В дополнительном варианте осуществления терапия выбрана из заболевания, которое можно лечить ингибированием ΡΙ3Κ. В другом варианте осуществления заболевание выбрано из приведенного выше списка, соответственно из аутоиммунных нарушений, воспалительных заболеваний, аллергических заболеваний, заболеваний дыхательных путей, таких как астма и СОРЭ, отторжения трансплантата; образование антител, презентация антигена, продукция цитокинов или лимфоидный органогенез являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, обыкновенную пузырчатку, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, системную красную волчанку, рассеянный склероз, миастению гравис, синдром Шегрена, аутоиммунную гемолитическую анемию, АИСА-ассоциированный васкулит, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, хроническую аутоиммунную крапивницу, аллергию (атопический дерматит, контактный дерматит, аллергический ринит), синдром Гудпасчера, АМК (антителоопосредованное отторжение трансплантата), опосредованное В-клетками сверхострое, острое и хроническое отторжение трансплантата и злокачественные опухоли гематопоэтической природы включая, но не ограничиваясь ими, множественную миелому, лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, миелолейкоз, неходжкинскую лимфому, лимфому, истинную полицитемию, эссенциальную тромбоцитемию, миелофиброз с миелоидной метаплазией и болезнь Вальденстрема; предпочтительно из ревматоидного артрита (КА), обыкновенной пузырчатки (РУ), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ΙΤΡ), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), аутоиммунной гемолитической анемии (А1НА), приобретенной гемофилии типа А (АНА), системной красной волчанки (8ЬЕ), рассеянного склероза (М8), миастении гравис (МС), синдрома Шегрена (88), АИСА-ассоциированного васкулита, криоглобулинемии, хронической аутоиммунной крапивницы (САИ), аллергии (атопического дерматита, контактного дерматита, аллергического ринита), синдрома Гудпасчера, отторжения трансплантата и злокачественных опухолей гематопоэтической природы, а также при иммунопатологии, связанной с заболеванием или инфекцией, например тяжелой и церебральной малярии, трипаносомозе, лейшманиозе, токсоплазмозе и нейроцистицеркозе.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения заболевания, которое

- 6 028031 лечат ингибированием ΡΙ3Κ, включающему введение терапевтически приемлемого количества безводной кристаллической формы (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7 -илокси]пирролидин-1 -ил}метанона. В дополнительном варианте осуществления заболевание выбрано из приведенного выше списка, предпочтительно из аутоиммунных нарушений, воспалительных заболеваний, аллергических заболеваний, заболеваний дыхательных путей, таких как астма и СОРЭ. отторжения трансплантата; образование антител, презентация антигена, продукция цитокинов или лимфоидный органогенез являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, обыкновенную пузырчатку, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, системную красную волчанку, рассеянный склероз, миастению гравис, синдром Шегрена, аутоиммунную гемолитическую анемию, АЯСА-ассоциированный васкулит, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, хроническую аутоиммунную крапивницу, аллергию (атопический дерматит, контактный дерматит, аллергический ринит), синдром Гудпасчера, АМК (антителоопосредованное отторжение трансплантата), опосредованное В-клетками сверхострое, острое и хроническое отторжение трансплантата и злокачественные опухоли гематопоэтической природы, включая, но не ограничиваясь ими, множественную миелому, лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, миелолейкоз, неходжкинскую лимфому, лимфомы, истинную полицитемию, эссенциальную тромбоцитемию, миелофиброз с миелоидной метаплазией и болезнь Вальденстрема; более предпочтительно из ревматоидного артрита (КА), обыкновенной пузырчатки (РУ), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ΙΤΡ), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), аутоиммунной гемолитической анемии (А1НА), приобретенной гемофилии типа А (АНА), системной красной волчанки (8ЬЕ), рассеянного склероза (М8), миастении гравис (МО), синдрома Шегрена (88), АЯСА-ассоциированного васкулита, криоглобулинемии, хронической аутоиммунной крапивницы (САИ), аллергии (атопического дерматита, контактного дерматита, аллергического ринита), синдрома Гудпасчера, отторжения трансплантата и злокачественных опухолей гематопоэтической природы, а также при иммунопатологии, связанной с заболеванием или инфекцией, например, тяжелой и церебральной малярии, трипаносомозе, лейшманиозе, токсоплазмозе и нейроцистицеркозе.

Таким образом, в качестве дополнительного варианта осуществления настоящее изобретение относится к использованию безводной кристаллической формы (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона для получения лекарственного средства. В дополнительном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для лечения заболевания, которое можно лечить ингибированием ΡΙ3Κ. В другом варианте осуществления заболевание выбрано из приведенного выше списка, предпочтительно из аутоиммунных нарушений, воспалительных заболеваний, аллергических заболеваний, заболеваний дыхательных путей, таких как астма и СОРЭ, отторжения трансплантата; образование антител, презентация антигена, продукция цитокинов или лимфоидный органогенез являются аномальными или нежелательными, включая ревматоидный артрит, обыкновенную пузырчатку, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, системную красную волчанку, рассеянный склероз, миастению гравис, синдром Шегрена, аутоиммунную гемолитическую анемию, АЯСА-ассоциированный васкулит, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, хроническую аутоиммунную крапивницу, аллергию (атопический дерматит, контактный дерматит, аллергический ринит), синдром Гудпасчера, АМК (антителоопосредованное отторжение трансплантата), опосредованное Вклетками сверхострое, острое и хроническое отторжение трансплантата и злокачественные опухоли гематопоэтической природы, включая, но не ограничиваясь ими, множественную миелому, лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, миелолейкоз, неходжкинскую лимфому, лимфомы, истинную полицитемию, эссенциальную тромбоцитемию, миелофиброз с миелоидной метаплазией и болезнь Вальденстрема; более предпочтительно из ревматоидного артрита (КА), обыкновенной пузырчатки (РУ), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ΙΤΡ), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), аутоиммунной гемолитической анемии (А1НА), приобретенной гемофилии типа А (АНА), системной красной волчанки (8ЬЕ), рассеянного склероза (М8), миастении гравис (МО), синдрома Шегрена (88), АЯСА-ассоциированного васкулита, криоглобулинемии, хронической аутоиммунной крапивницы (САИ), аллергии (атопического дерматита, контактного дерматита, аллергического ринита), синдрома Гудпасчера, отторжения трансплантата и злокачественных опухолей гематопоэтической природы, а также при иммунопатологии, связанной с заболеванием или инфекцией, например, тяжелой и церебральной малярии, трипаносомозе, лейшманиозе, токсоплазмозе и нейроцистицеркозе.

Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению может находиться в единице дозирования приблизительно 1-1000 мг активного ингредиента(-ов) для индивидуума приблизительно 50-70 кг, или приблизительно 1-500 мг, или приблизительно 1-250 мг, или приблизительно 1-150 мг, или приблизительно 0,5-100 мг, или приблизительно 1-50 мг активных ингредиентов. Терапевтически эффективная доза соединения, фармацевтической композиции или их сочетания зависит от вида индивидуума, массы тела, возраста и индивидуального состояния, подлежащих лечению нарушения или заболе- 7 028031 вания или тяжести указанного. Врач, клиницист или ветеринар в данной области могут легко определять эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для профилактики, лечения или ингибирования прогрессирования нарушения или заболевания.

Свойства указанных выше доз продемонстрированы в тестах ίη νίίτο и ίη νίνο с использованием преимущественно млекопитающих, например мышей, крыс, собак, обезьян или выделенных органов, тканей и их препаратов. Форму по настоящему изобретению можно применять ίη νίίτο в форме растворов, например, водных растворов, и ίη νίνο энтерально, парентерально, преимущественно внутривенно, например в виде суспензии или в водном растворе. Доза ίη νίίτο может находиться в диапазоне приблизительно от 10^-3 молярных до 10^-9 молярных концентраций. В зависимости от пути введения терапевтически эффективное количество ίη νίνο может находиться в диапазоне приблизительно 0,1-500 мг/кг или приблизительно 1-100 мг/кг.

Форму по настоящему изобретению можно вводить одновременно с, или до, или после одного или более других терапевтических средств. Форму по настоящему изобретению можно вводить раздельно одним и тем же или другим путем введения или совместно в одной и той же фармацевтической композиции в виде других средств.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к продукту, содержащему безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7 -илокси]пирролидин-1 -ил}метанона и по меньшей мере одного другого терапевтического средства в качестве комбинированного препарата для одновременного, отдельного или последовательного использования в терапии. В одном из вариантов осуществления терапия представляет собой лечение заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ. Продукты, предоставляемые в качестве комбинированного препарата, включают композицию, содержащую безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона и другого терапевтического средства(средств) совместно в одной и той же фармацевтической композиции или безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона и другое терапевтическое средство(-а) в отдельной форме, например, в форме набора.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона и другого терапевтического средства(средств). Необязательно фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, как описано выше.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к набору, содержащему две или более отдельные фармацевтические композиции, по меньшей мере одна из которых содержит безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1 -ил}метанона. В одном из вариантов осуществления набор содержит средства для раздельного хранения указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутылка или разделенный пакет из фольги. Пример такого набора представляет собой блистерную упаковку, как правило, используемую для упаковки таблеток, капсул и т.п.

Набор по настоящему изобретению можно использовать для введения различных лекарственных форм, например перорального и парентерального, для введения отдельных композиций с различными интервалами дозирования или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. Для помощи в соблюдении режима терапии набор по настоящему изобретению, как правило, содержит инструкции по введению.

В способах комбинированного лечения по изобретению форму по изобретению и другое терапевтическое средство могут получать и/или формулировать одни и те же или разные производители. Кроме того, форма по изобретению и другое терапевтическое средство могут быть объединены в комбинированной терапии: (ί) до выдачи комбинированного продукта врачам (например, в случае набора, содержащего форму по изобретению и другое терапевтическое средство); (ίί) самим врачом (или под руководством врача) непосредственно перед введением; (ίίί) у самого пациента, например, при последовательном введении формы по изобретению и другого терапевтического средства.

Изобретение также относится к применению безводной кристаллической формы (1,1диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для применения в качестве фармацевтического средства.

Таким образом, изобретение относится к применению безводной кристаллической формы (1,1диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для лечения заболевания. Изобретение также относится к применению безводной кристаллической формы (1,1-диоксогексагидро- 8 028031

1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где лекарственное средство получают для введения с другим терапевтическим средством. Изобретение также относится к применению другого терапевтического средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где лекарственное средство вводят с безводной кристаллической формой (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона.

Изобретение также относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для применения в способе лечения. Изобретение также относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где безводную кристаллическую форму (1,1диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона получают для введения с другим терапевтическим средством. Изобретение также относится к другому терапевтическому средству для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где другое терапевтическое средство получают для введения с безводной кристаллической формой (1,1диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона. Изобретение также относится к безводной кристаллической форме (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3[ 1 -(6-метокси-5-метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7 -илокси]пирролидин-1 ил}метанона вводят с другим терапевтическим средством. Изобретение также относится к другому терапевтическому средству для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где другое терапевтическое средство вводят с безводной кристаллической формой (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона.

Изобретение также относится к применению безводной кристаллической формы (1,1диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для лечения заболевания. Изобретение также относится к использованию безводной кристаллической формы (1,1-диоксогексагидро1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона для лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где пациент ранее получал лечение (например, за 24 ч) другим терапевтическим средством. Изобретение также относится к применению другого терапевтического средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного активностью ферментов ΡΙ3Κ, где пациент ранее получал (например, за 24 ч) лечение безводной кристаллической формой (1,1диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро1Н-пиридо [3,4-Ь] [ 1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона.

Безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона можно вводить в виде одного активного ингредиента или в комбинации, например, в качестве адъюванта, с другими лекарственными средствами, например иммуносупрессивными или иммуномодулирующими средствами, или другими противовоспалительными средствами, например для лечения или профилактики острого или хронического отторжения алло- или ксенотрансплантата или воспалительных или аутоиммунных нарушений, или химиотерапевтическим средством, например антипролиферативным средством против злокачественных клеток. Например, безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона можно использовать в комбинации с ингибитором кальциневрина, например циклоспорином А или ΡΚ 506, ингибитором тТОК, например рапамицином, 40-О-(2-гидроксиэтил)-рапамицином, СО779, АВТ578, АР23573, ТАРА-93, биолимус-7 или биолимус-9; аскомицином, обладающим иммуносупрессивными свойствами, например АВТ-281, А8М981 и т.д.; кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; лефлуномидом; мизорибином; микофеноловой кислотой или солью; микофенолатом мофетила; 15дезоксиспергуалином или его иммуносупрессивным гомологом, аналогом или производным; ингибитором ΡΚΟ, например, как описано в \УО 02/38561 или \УО 03/82859, например соединением примера 56 или 70; ингибитором 1А1<3-киназы. например, И-бензил-3,4-дигидроксибензилиденцианоацетамид-а- 9 028031 циано-(3,4-дигидрокси)-Ы-бензилциннамамидом (тирфостин ΆΟ490), продигиозином 25-С (ΡΝυΐ56804), [4-(4'-гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолином] (νΗΙ-Ρ131), [4-(3'-бром-4'гидроксилфенил)амино-6,7-диметоксихиназолином] (νΗΙ-Ρ154), [4-(3',5'-дибром-4'-гидроксилфенил)амино-6,7-диметоксихиназолином] \УН1-Р97. ККХ-211, 3-{(3К,4К)-4-метил-3-[метил-(7Нпирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1-ил}-3-оксопропионитрилом в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, например моноцитратом (также называемым СР-690,550), или соединением, как описано в \νθ 04/052359 или \νθ 05/066156; иммуносупрессивными моноклональными антителами, например моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС, СЭ2, ΟΌ3, ΟΌ4, СЭ7, С1Ж ΟΌ25, ΟΌ28, ΟΌ40, ΟΌ45, ΟΌ52, ΟΌ58, (1)80, С1)86 или их лиганды; другими иммуномодулирующими соединениями, например рекомбинантной связывающей молекулой, содержащей по меньшей мере часть внеклеточного домена СТЬА4 или его мутант, например, по меньшей мере, внеклеточный участок СТЬА4 или его мутант, связанный с не-СТЬА4 белковой последовательностью, например СТЬА41§ (например, обозначаемой АТСС 68629) или ее мутанту, например, ЬЕА29У; ингибиторами молекул адгезии, например, антагонистами ЬРА-1, антагонистами 1САМ-1 или 3, антагонистами УСАМ-4 или антагонистами УЪА-4, или антигистаминами, или противокашлевыми средствами, или бронхорасширяющим средством или блокаторами рецептора ангиотензина, или противоинфекционным средством.

В случае, когда безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона вводят в комбинации с другой иммуносупрессивной/иммуномодулирующей, противовоспалительной, химиотерапевтической или противоинфекционной терапией, дозы вводимого совместно иммуносупрессора, иммуномодулирующего, противовоспалительного, химиотерапевтического или противовоспалительного соединения будут обязательно изменяться в зависимости от типа совместно применяемого лекарственного средства, например, либо стероида или ингибитора кальциневрина, от конкретного применяемого лекарственного средства, от состояния, подлежащего лечению и т.д.

Безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона также можно эффективно использовать в комбинации с другими терапевтическими средствами, особенно другими антипролиферативными средствами. Такие антипролиферативные средства включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы ароматазы; антиэстрогены; ингибиторы топоизомеразы I; ингибиторы топоизомеразы II; активные в отношении микротрубочек средства; алкилирующие средства; ингибиторы гистондеацетилазы; соединения, которые индуцируют процессы клеточной дифференцировки; ингибиторы циклооксигеназы; ингибиторы ММР; ингибиторы тТОК; противоопухолевые антиметаболиты; соединения платины; соединения, направленно воздействующие/снижающие киназную активность белков или липидов и дополнительные антиангиогенные соединения; соединения, которые направлено воздействуют, снижают или ингибируют активность протеинфосфатаз или липидфосфатаз; агонисты гонадорелина; антиандрогены; ингибиторы метионинаминопептидазы; бисфосфонаты; модификаторы биологического ответа; антипролиферативные антитела; ингибиторы гепараназы; ингибиторы онкогенных изоформ Как; ингибиторы теломеразы; ингибиторы протеасомы; средства, используемые для лечения гематологических злокачественных новообразований; соединения, которые направленно воздействует, снижают или ингибируют активность Р11-3; ингибиторы Нкр90; темозоломид (ТЕМООАЬ®) и лейковорин.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор ароматазы относится к соединению, которое ингибирует продукцию эстрогена, т.е. преобразование субстратов андростендиона и тестостерона в эстроген и эстрадиол соответственно. Термин включает, но не ограничивается ими, стероиды, особенно атаместан, экземестан и форместан, и в частности, нестероиды, особенно аминоглютетимид, роглетимид, пиридоглютетимид, трилостан, тестолактон, кетоконазол, ворозол, фадрозол, анастрозол и летрозол. Экземестан можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΛΡΟΜΛδΙΝ. Форместан можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ЬЕКГАКОК Фадрозол можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием АРЕМА. Анастрозол можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием АКРМГОЕХ. Летрозол можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием РЕМАКА или РЕМАК. Аминоглютетимид можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ОКШЕТЕК Комбинация по изобретению, содержащая химиотерапевтическое средство, которое является ингибитором ароматазы, является особенно пригодной для лечения гормонрецептор-позитивных опухолей, например, различных видов рака молочной железы.

Как используют в настоящем описании, термин антиэстроген относится к соединению, которое антагонизирует эффект эстрогенов на уровне эстрогенового рецептора. Термин включает, но не ограничивается ими, тамоксифен, фулвестрант, ралоксифен и ралоксифена гидрохлорид. Тамоксифен можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием NΟ^УΛ^ЕX.

- 10 028031

Ралоксифена гидрохлорид можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ЕУ18ТА. Фулвестрант можно формулировать, как описано в патенте США №4659516, или его можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΡΑδΕΘΌΕΧ. Комбинация по изобретению, содержащая химиотерапевтическое средство, которое является антиэстрогеном, является особенно пригодной для лечения эстроген-рецепторпозитивных опухолей, например различных видов рака молочной железы.

Как используют в настоящем описании, термин антиандроген относится к любому веществу, которое способно ингибировать биологическое действие андрогенных гормонов и включает, но не ограничивается ими, бикалютамид (ΟΑδΘΌΕΧ), который можно формулировать, например, как описано в патенте США №4636505.

Как используют в настоящем описании, термин агонист гонадорелина включает, но не ограничивается ими, абареликс, гозерелин и гозерелина ацетат. Гозерелин описан в патенте США №4100274, и его можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΖΘΕΑΌΕΧ. Абареликс можно формулировать, например, как описано в патенте США №5843901.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор топоизомеразы I включает, но не ограничивается ими, топотекан, гиматекан, иринотекан, камптотециан и его аналоги, 9-нитрокамптотецин и макромолекулярный конъюгат камптотецина ΡΝυ-166148 (соединение А1 в АО 99/17804). Иринотекан можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием САМРТО8АК. Топотекан можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΗΥί',ΆΜΤΙΝ.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор топоизомеразы II включает, но не ограничивается ими, антрациклины, такие как доксорубицин, включая липосомальный состав, например ί',ΆΕΡΥΧ; даунорубицин; эпирубицин; идарубицин; неморубицин; антрахиноны митоксантрон и лозоксантрон; и подофиллотоксины этопозид и тенипозид. Этопозид можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ЕТОРОРНО8. Тенипозид можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием УМ 26-ВК1§ТОЬ. Доксорубицин можно вводить, например, в той форме как его продают, например под товарным наименованием АОК1ВЬА§ТЩ или ΛΌΚΙΛΜΥΟΙΝ. Эпирубицин можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием РАКМОКиВ1С1Х Идарубицин можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΖΑVΕ^Оδ. Митоксантрон можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ХОУАХ ТКОХ

Термин активное в отношении микротрубочек средство относится к стабилизаторам микротрубочек, дестабилизаторам микротрубочек и ингибиторам полимеризации микротобулина, включая, но не ограничиваясь ими, таксаны, например паклитаксел и доцетаксел; алкалоиды барвинка, например винбластин, в частности винбластина сульфат; винкристин, в частности винкристина сульфат, и винорелбин; дискодермолиды; колхицины и эпотилоны и их производные, например эпотилон В или Ό или его производные. Паклитаксел можно вводить, например, в той форме, как его продают, например ТАХОЬ. Доцетаксел можно вводить, например, в той форме как его продают, например под товарным наименованием ТАХОТЕКЕ. Винбластина сульфат можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием УШВЬА§ТЩ К.Р. Винкристина сульфат можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΡΑΚΜΙδΉΝ. Дискодермолид можно получать, например, как описано в патенте США №5010099. Также включены производные эпотилона, которые описаны в АО 98/10121, патенте США №6194181, АО 98/25929, АО 98/08849, АО 99/43653, АО 98/22461 и АО 00/31247. Особенно предпочтительными являются эпотилон А и/или В.

Как используют в настоящем описании, термин алкилирующее средство включает, но не ограничивается ими, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан или нитрозомочевину (ВСХи или Ойабе1). Циклофосфамид можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием С.АС.ЪО8Т1Х Ифосфамид можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием НОЬОХАХ

Термин ингибиторы гистондеацетилазы или ингибиторы НОАС относятся к соединениям, которые ингибируют гистондеацетилазу и которые обладают антипролиферативным действием. Они включают соединения, описанные в АО 02/22577, особенно Х-гидрокси-3-[4-[[(2-гидроксиэтил)[2-(1Н-индол3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид, Х-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид и их фармацевтически приемлемые соли. Он дополнительно конкретно включает субероиланилид гидроксамовой кислоты (§АНА).

Термин противоопухолевый антиметаболит включает, но не ограничивается ими, 5-фторурацил или 5-Ρυ; капецитабин; гемцитабин; деметилирующие ДНК средства, такие как 5-азацитидин и децитабин; метотрексат и эдатрексат и антагонисты фолиевой кислота, такие как пеметрексед. Капецитабин можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ХЕЬОНА. Гемцитабин можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΟΕΜΖΑΚ. Также включено моноклональное антитело трастузумаб, которое можно вво- 11 028031 дить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ΗΕΚΟΕΡΤΙΝ.

Как используют в настоящем описании, термин соединение платины включает, но не ограничивается ими, карбоплатин, цис-платин, цисплатин и оксалиплатин. Карбоплатин можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием САКВОРЕАТ. Оксалиплатин можно вводить, например, в той форме, как его продают, например под товарным наименованием ЕЬОХАТПХ

Как используют в настоящем описании, термин соединения, направленно воздействующие/снижающие активность белка или липидкиназы или активность протеинфосфатазы или липидфосфатазы, или дополнительные антиангиогенные соединения включает, но не ограничивается ими, ингибиторы тирозиновой протеинкиназы и/или сериновых и/или треониновых киназ, или ингибиторы липидкиназы, например:

a) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецепторов тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡΚ), такие как соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность ΡΌΟΡΚ, в частности соединения, которые ингибируют рецептор ΡΌΟΡ, например производное ^фенил-2-пиримидинамина, например иматиниб, 8И101, 8иббб8 и

СРВ-111;

b) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецепторов фактора роста фибробластов (РСРК);

c) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецептора инсулиноподобного фактора роста I (ЮР-ГК), такие как соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность ЮР-ΙΚ, в частности соединения, которые ингибируют рецептор 1СР-1К, такие как соединения, описанные в \УО 02/092599;

ά) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность семейства рецепторных тирозинкиназ Тгк;

е) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность семейства рецепторных тирозинкиназ Ах1;

ί) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецептора с-Ме1;

д) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецепторной тирозинкиназы КИ/8СРК;

к) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецепторных тирозинкиназ С-кП - (части семейства ΡΌΟΡΚ), такие как соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность семейства рецепторных тирозинкиназ с-кП. в частности соединения, которые ингибируют рецептор с-кй, например иматиниб;

ί) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность представителей семейства с-АЬ1 и их продукты слияния генов, например киназы ВСК-АЬ1, такие как соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность представители семейства сАЬ1 и их продуктов слияния генов, например производное Юфенил-2-пиримидинамина, например иматиниб, ΡΌ180970, АС957, №Сб80410 или ΡΌ173955 от Ρα^Όανίκ;

_)) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность представителей семейства протеинкиназы С (ТКС) и КаР серин/треониновых киназ, представителей МЕК, 8КС, 1АК, РАК, ΡΌΚ и представителей семейства Κακ/ΜΑΡΚ, или семейства киназ ΡΙ(3), или семейства киназ, родственных ΡI(3)-киназе, и/или представителей семейства циклинзависимых киназ (СПК), и, в частности, представляют собой соединения производные стауроспорина, описанные в патенте США №5093330, например мидостаурин; примеры дополнительных соединений включают, например, ИСЮ01; сафингол; ВАУ 43-9006; бриостатин 1; перифосин; илмофозин; КО 318220 и КО 320432; СО б97б; Ικίκ 3521; ΕΥ333531/ΕΥ379196; соединения изохинолина, такие как соединения, описанные в \УО 00/09495; ΡΤΙ; ΡΌ184352 или ОА\б97 (ингибитор Ρ^);

k) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность ингибиторов тирозиновых протеинкиназ, такие как соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность ингибиторов тирозиновых протеинкиназ, включают иматиниба мезилат (СЬЕЕУЕС) или тирфостин. Тирфостин предпочтительно представляет собой низкомолекулярное (Мг<1500) соединение или его фармацевтически приемлемую соль, в частности соединение, выбранное из соединений класса бензилиденмалонитрилов или класса 8-арилбензолмалоннитрилов или бисубстратного хинолина, более конкретно, любое соединение, выбранное из группы, состоящей из тирфостина А23/КС-50810, АС 99, тирфостина АС 213, тирфостина АС 1748, тирфостина АС 490, тирфостина В44, энантиомера тирфостина В44(+), тирфостина АС 555, АС 494, тирфостина АС 55б, АС957 и адафостина (сложного адамантилового эфира 4-{[(2,5-дигидроксифенил)метил]амино}бензойной кислоты, N80 б80410, адафостин, и

l) соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность семейства рецепторных тирозинкиназ эпидермального фактора роста (ЕСРК, ЕгЬВ2, ЕгЬВ3, ЕгЬВ4 в виде гомо- или гетеродимеров), такие как соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют

- 12 028031 активность семейства рецепторов эпидермального фактора роста, в частности представляют собой соединения, белки или антитела, которые ингибируют представителей семейства рецепторных тирозинкиназ БОР, например, рецептора БОР, ЕтЬВ2, ЕгЬВЗ и ЕгЬВ4, или связываются с родственными БОР или БОР лигандами и, в частности, представляют собой такие соединения, белки или моноклональные антитела, которые в общем и конкретно описаны в \УО 97/02266, например соединение примера 39, или в ЕР 0564409, νθ 99/03854, ЕР 0520722, ЕР 0566226, ЕР 0787722, ЕР 0837063, патенте США №5747498, νθ 98/10767, νθ 97/30034, νθ 97/49688, νθ 97/38983 и, в частности, νθ 96/30347, например соединение, известное как СР 358774, νθ 96/33980, например соединение ΖΌ 1839, и νθ 95/03283, например соединение ΖΜ105180, например трастузумаб (НЕКСЕРТШ), цетуксимаб, иресса, тарцева, О81-774, С1-1033, ЕКВ-569, Ον-2016, Е1.1, Е2.4, Е2.5, Е6.2, Е6.4, Е2.11, Е6.3 или Е7.6.3 и производные 7Н-пирроло-[2,3б]пиримидина, которые описаны в νθ 03/013541.

Дополнительные антиангиогенные соединения включают соединения, обладающие другим механизмом своей активности, например не связанной с ингибированием протеинкиназ или липидкиназ, например талидомид (ТНАБОМГО) и ΤΝΡ-470.

Соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность протеинфосфатаз или липидфосфатаз, представляют собой, например, ингибиторы фосфатазы 1, фосфатазы 2А, РΤЕN или СЭС25. например окадаиковую кислоту или ее производное.

Соединения, которые индуцируют процессы клеточной дифференцировки, представляют собой, например, ретиноевую кислоту, α-, γ- или δ-токоферол или α-, γ- или δ-токотриенол.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор циклооксигеназ включает, но не ограничивается ими, например, ингибиторы Сох-2, 5-алкил-замещенную 2-ариламинофенилуксусную кислоту и производные, такие как целекоксиб (СЕБЕВКЕХ), рофекоксиб (У1ОХХ), эторикоксиб, валдекоксиб или 5-алкил-2-ариламинофенилуксусную кислоту, например 5-метил-2-(2'-хлор-6'фторанилино)фенилуксусную кислоту или люмиракоксиб.

Как используют в настоящем описании, термин бисфосфонаты включает, но не ограничивается ими, этридоновую, клодроновую, тилудроновую, памидроновую, алендроновую, ибандроновую, ризедроновую и золедроновую кислоту. Этридоновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием ΌΙΌΡΌΝΡΕ. Клодроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием ВОNЕРОδ. Тилудроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием §КЕБГО. Памидроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием АКЕЭГА™, Алендроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием РО8АМАХ. Ибандроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием ВОN^КАNАΤ. Ризедроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием АСТО^ЖБ. Золедроновую кислоту можно вводить, например, в той форме, как ее продают, например под товарным наименованием ΖОΜЕΤА.

Термин ингибиторы тТОК относятся к соединениям, которые ингибируют мишень рапамицина (тТОК) у млекопитающих и которые обладают антипролиферативной активностью, таким как сиролимус (Каратипе®), эверолимус (СеШеаи™), СС1-779 и АВТ578.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор гепараназы относится к соединениям, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют разрушение гепаринсульфата. Термин включает, но не ограничивается им, ΡΙ-88.

Как используют в настоящем описании, термин модификатор биологического ответа относится к лимфокину или интерферону, например γ-интерферону.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор онкогенных изоформ Как, например НКак, К-Как или Ν-Как, относится к соединениям, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют онкогенную активность Как, например ингибитор фарнезилтрансферазы, например Б-744832, ΌΚ8Ο557 или К115777 ^атиеШа).

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор теломеразы относится к соединениям, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность теломеразы. В частности, соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность теломеразы, представляют собой соединения, которые ингибируют рецептор теломеразы, например теломестатин.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор метионинаминопептидазы относится к соединениям, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность метионинаминопептидазы. Соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность метионинаминопептидазы, представляют собой, например, бенгамид или его производное.

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор протеасомы относится к соединениям, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность протеасомы. Соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность протеасомы, включают, например Ρδ-341 и ΜΕΝ 341.

- 13 028031

Как используют в настоящем описании, термин ингибитор матриксной металлопротеиназы или ингибитор ММР, включает, но не ограничивается ими, пептидомиметические и непептидомиметические ингибиторы коллагена, производные тетрациклина, например гидроксаматный ингибитор пептидомиметика батимастата и его перорально биодоступный аналог маримастат (ВВ-2516), приномастат (ЛС3340), метастат (N80 683551) ΒΜδ-279251, ΒΑΥ 12-9566, ТАА211, ΜΜΙ270Β или АА1996.

Как используют в настоящем описании, термин средства, используемые для лечения гематологических злокачественных новообразований включает, но не ограничивается ими, ΡΜδ-подобные ингибиторы тирозинкиназ, например соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие активность рецепторов ΡΜδ-подобной тирозинкиназы (Ρ1ΐ-3Κ); интерферон, 1-Ь-Эарабинофуранзилцитозин (ага-с) и бисульфан и ингибиторы АЬК, например соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют киназу анапластической лимфомы.

Соединения, которые направленно воздействуют, снижают или ингибируют активность рецепторов ΡΜδ-подобной тирозинкиназы (Ρ1ΐ-3Κ), в частности, представляют собой соединения, белки или антитела, которые ингибируют представителей семейства рецепторных киназ ΡΙΐ-ЗК, например, РКС412, мидостаурин, производное стауроспорина, 8Ш1248 и ΜΕΝ518.

Как используют в настоящем описании, термин ингибиторы Н8Р90 включает, но не ограничивается ими, соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие характерную АТФазную активность Н8Р90; разрушающие, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие клиентские белки Н8Р90 через убиквитин-протеасомный путь. В частности, соединения, направленно воздействующие, снижающие или ингибирующие характерную АТФазную активность Н8Р90, представляют собой соединения, белки или антитела, которые ингибируют АТФазную активность Н8Р90, например, 17-аллиламино, 17-деметоксигелданамицин (17ААС), производное гелданамицина, другие родственные гелданамицину соединения, радицикол и ингибиторы НОАС.

Как используют в настоящем описании, термин антипролиферативные антитела включает, но не ограничивается ими, трастузумаб (Нетсерйи™), трастузумаб-^Μ1, эрлотиниб (Тагсеуа™, бевацизумаб (АуаьБи™), ритуксимаб (Кйихаи®), РКО64553 (антитело против СЭ40) и антитело 2С4. Под антителами подразумевают, например, интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела, образованные по меньшей мере двумя интактными антителами, и фрагменты антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.

Для лечения острого миелолейкоза ^ΜΡ) можно использовать безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона в комбинации со стандартными видами терапии лейкоза, особенно в комбинации с видами терапии, используемыми для лечения ΑΜ^. В частности, безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона можно вводить в комбинации, например, с ингибиторами фарнезилтрансферазы и/или другими лекарственными средствами, пригодными для лечения ΑΜ^, такими как даунорубицин, адриамицин, Ага-С, УР-16, тенипозид, митоксантрон, идарубицин, карбоплатин и РКС412.

Безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона также можно эффективно использовать в комбинации с другими терапевтическими средствами, особенно другими противомалярийными средствами. Такие противомалярийные средства включают, но не ограничиваются ими, прогуанил, хлорпрогуанил, триметоприм, хлорохин, мефлохин, люмефантрин, атоваквон, пириметамин-сульфадоксин, пириметамин-дапсон, галофантрин, хинин, хинидин, амодиахин, амопирохин, сульфонамиды, артемизинин, артефлен, артеметер, артесунат, примахин, ингаляционный N0, Ь-аргинин, дипропилентри-амин NОNОат (донор N0), росиглитазон (агонист РРАКд), активированный уголь, эритропоэтин, левамизол и пиронаридин.

Безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона также можно эффективно применять в комбинации с другими терапевтическими средствами, такими как используемые для лечения лейшманиоза, трипаносомоза, токсоплазмоза и нейроцистицеркоза. Такие средства включают, но не ограничиваются ими, хлорохина сульфат, атоваквон-прогуанил, артеметер-люмефантрин, хинин-сульфат, артесунат, хинин, доксициклин, клиндамицин, меглумин антимонат, стибоглюконат натрия, милтефозин, кетоконазол, пентамидин, амфотерицин В (АтВ), липосомальный АтВ, паромомицин, эфлорнитин, нифуртимокс, сурамин, меларсопрол, преднизолон, бензнидазол, сульфадиазин, пириметамин, клиндамицин, триметоприм, сульфаметоксазол, азитромицин, атоваквон, дексаметазон, празиквантел, альбендазол, бета-лактамы, фторхинолоны, макролиды, аминогликозиды, сульфадиазин и пириметамин.

Структуру активных средств, определяемых по кодовым номерам, общим или товарным наименованиям, можно брать из современного издания стандартного справочника Тйе Μе^ск 1ибех или из баз

- 14 028031 данных, например, Ра1еп15 1п1егпа11опа1. например, ΙΜ8 \7огИ РиЬПсаОот.

Указанные выше соединения, которые можно использовать в комбинации с безводной кристаллической формой (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона, можно получать и вводить, как описано в данной области, такой как в документах, цитируемых выше.

Безводную кристаллическую формау (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона также можно эффективно использовать в комбинации с известными терапевтическими способами, например, введением гормонов или особенно облучением.

В частности, безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси]пирролидин-1-ил}метанона можно использовать как радиосенсибилизирующее средство, особенно для лечения опухолей, которые проявляют слабую чувствительность к лучевой терапии.

Под комбинацией подразумевают или фиксированную комбинацию в одной стандартной лекарственной форме, или набор частей для комбинированного введения, где безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанона и партнера по комбинации можно вводить независимо одновременно или раздельно с интервалами во времени, которые, в частности, обеспечивают возможность того, что партнеры по комбинации демонстрируют совместное, например, синергетическое действие, или любую их комбинацию. Как используют в настоящем описании, термины совместное введение или комбинированное введение или т.п. переназначены включать введение выбранного партнера по комбинации одному нуждающемуся в этом индивидууму (например, пациенту) и предназначены включать схемы лечения, при которых средства необязательно вводить тем же самым путем введения или одновременно. Как используют в настоящем описании, термин фармацевтическая комбинация означает продукт, который является результатом смешивания или комбинации более чем одного активного ингредиента и включает фиксированные и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин фиксированная комбинация означает, что активные ингредиенты, например, безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6метокси-5-метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1 ил}метанона и партнера по комбинации, вводят пациенту одновременно в виде единого целого или дозы. Термин нефиксированная комбинация означает, что активные ингредиенты, например, безводную кристаллическую форму (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1 -ил}метанона) и партнера по комбинации, вводят пациенту в виде отдельных соединений одновременно, параллельно или последовательно без конкретных ограничений по времени, где такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также относится к смешанной терапии, например, введению трех или более активных ингредиентов.

Примеры

Подробное описание экспериментов.

Следующие ниже примеры предназначены для иллюстрации изобретения, и их не следует истолковывать как ограничивающие его. Температуры приведены в градусах Цельсия. Если не указано иное, все выпаривания проводят при пониженном давлении, как правило, приблизительно от 15 и 100 мм рт.ст. (=20-133 мбар). Структуру конечных продуктов, промежуточных соединений и исходных веществ подтверждают стандартными аналитическими способами, например микроанализом и спектроскопическими характеристиками, например Μ8, ΙΚ, ЯМР. Используемые сокращенные обозначения представляют собой общепринятые в данной области сокращенные обозначения.

Все исходные вещества, структурные элементы, реагенты, кислоты, основания, дегидратирующие средства, растворители и катализаторы, используемые для синтеза форм по настоящему изобретению, являются коммерчески доступными, или их можно получать способами органического синтеза, известными специалисту в данной области (НоиЬеп-^еу1 4(1 Εά. 1952, Ме11ю05 о£ Огдашс 8уп1Не515. Ткете, Уо1ите 21). Кроме того, формы по настоящему изобретению можно получать способами органического синтеза, известными специалисту в данной области, как продемонстрировано в следующих ниже примерах.

Сокращенные обозначения.

- 15 028031

АСЫ	ацетонитрил
АсОН	уксусная кислота
водн.	водный
Вое	трет-бутоксикарбонил
ВосгО	ди-трет-бутилдикарбонат
СВи	трет-бутил
ЕВиОН	трет-бутанол
ВгеббРНоз	2- (дициклогексилфосфино)-3,б-диметокси-2'-4 б'-триизопропил-1,1'-бифенил
ушир.с	уширенный синглет
соми	(1-циано-2-этокси-2- оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино карбения гексафторфосфат
КОНЦ .	концентрированный
сут.	сутки
д	дублет
дд	дублет дублетов
бЬа	дибензилиденацетон
ОСМ	дихлорметан
ΌΕΑ	диэтиламин
ϋΕΑϋ	диэтилазодикарбоксилат
ΏΕΑΡ	диэтиламинопиридин
ϋΙΡΕΑ	диизопропилэтиламин
ΏΜΕ	диметилформамид
ϋΜΜΕ	диметоксиметан
ϋΜ5Ο	диметилсульфоксид

- 16 028031

ϋΡΡΑ	дифенилфосфорилазид
ϋΡΡΡ	1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен
ЕЭС	1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимидгидрохлорид
экв .	эквивалент(-ы)
Ε3Ι	ионизация электрораспылением
εε3ν	триэтиламин
εε2ο	диэтилэфир
ЕЬОАс	этилацетат
ЕЬОН	этанол
4	час(-ы)
ΗΑτυ	0- (7-азабензотриазол-1-ил) -Ν, Ν,Ν',Ν'тетраметилуронийгексафторфосфат
нвти	0- (1Н-бензотриазол-1-ил) -Ν, Ν, Ν' , Ν' тетраметилуронийгексафторфосфат
ΗΜΏ3	гексаметилдисилазан
ΗΟΒΤ	1-гидроксибензтриазол
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
ΙΡΑ	изопропанол
ЬСМЗ	жидкостная хроматография с масс-спектрометрией
тСРВА	мета-хлорпероксибензойная кислота
МеОН	метанол
Μ	мультиплет
мин	минута(ы)
М3	масс-спектрометрия
тм	микроволновое излучение
ЯМР	спектроскопия ядерного магнитного резонанса
ЫаОЬВи	трет-бутоксид натрия
ΝΡ	нормальная фаза

- 17 028031

ΟΒΌ	оптимальная плотность слоя
Ρά2 (с1Ъа) з	трис(дибензилиденацетон)дипалладий
РЬ-НСОз МР 5РЕ	бикарбонатный картридж на полимерной подложке для удаления кислоты
преп.	препаративная
РРЬз	трифенилфосфин
кв	квартет
Иас-ΒΙΝΑΡ	рацемический 2,2'-бис(ди-пара-толилфосфино)1,1'-бинафтил
РР	обращенная фаза
Иб	время удержания
кт	комнатная температура
ИиРЬоз	2-дициклогексилфосфино-2',б'-диизопропокси1,1'-бифенил
нас.	насыщенный
5СХ-2	макропористый полистирол-сульфоновая кислота на полимерной подложке
раст.	раствор
т	триплет
ТВМЕ	трет-бутилметиловый эфир
ТВАЕ	фторид тетрабутиламмония
ТВОМ5С1	трет-бутилдиметилсилилхлорид
тетраметил- трет-бутил- ХрЬоз	2-ди-трет-бутилфосфино-З,4,5,б-тетраметил2',4',б'-триизопропилбифенил
ТЕА	трифторуксусная кислота
ТНЕ	тетрагидрофуран
ТЬС	тонкослойная хроматография
ирье	сверхэффективная жидкостная хроматография
ХрЬоз	2-дициклогексилфосфино-2',4',б'триизопропилбифенил
Ρά[РиРЬоз]	(2-дициклогексилфосфино-2'б'-диизопропил-1 1'бифенил)(2-(2-аминоэтил)фенил)палладий (II)

Используемое микроволновое оборудование представляет собой Вю1аде ΙηίιίαΙοί'®.

Все соединения называли с использованием ΆιιΙοΧοιη.

Общая хроматографическая информация.

Способ ЬСМ8 М1 (К1_М1).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x50 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: Асцш1у СРВС Н88 Т3, 1,8 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05 об.% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония В) АСИ + 0,04% об. муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 2-98% В в течение 1,4 мин, 98% В 0,45 мин, скорость потока = 1,2 мл/мин. Температура колонки для ВЭЖХ: 50°С.

Способ ЬСМ8 М2 (К1_М2).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: А§сепй§ Ехрг姧 С18, 2,7 мкм.

- 18 028031

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05 об.% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония В) АСИ + 0,04 об.% муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 2-98% В в течение 1,4 мин, 0,75 мин 98% В, скорость потока = 1,2 мл/мин. Температура колонки для ВЭЖХ: 50°С.

Способ ЬСМ8 М3 (К1_М3).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АхсеШЕ Ехргекк С18, 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05 об.% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония В) АСИ + 0,04 об.% муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 2-98% В в течение 8,5 мин, 1 мин 98% В, скорость потока = 1,2 мл/мин. Температура колонки для ВЭЖХ: 50°С.

Способ ЬСМ8 М4 (Имд).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 4,6x50 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: ЗииИге С18, 5 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,1 об.% ТРА, В) АСИ + 0,1 об.% ТРА.

Градиент ВЭЖХ: 5-100% В в течение 8,0 мин В, скорость потока = 2 мл/мин.

Температура колонки для ВЭЖХ: 40°С.

Способ ЬСМ8 М5 (К1_М5).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 0,46x25 см.

Тип колонки для ВЭЖХ: СЫга1се1 О1-Н (1189).

Элюент ВЭЖХ: ЕЮН/МеОН 60:40.

Градиент ВЭЖХ: изократический, скорость потока = 0,5 мл/мин.

Детектор: УФ 220 нм.

Способ ЬСМ8 М6 (К1_М6).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АхсеШЕ Ехргекк С18, 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05% ТРА, В) АСИ + 0,04% ТРА.

Градиент ВЭЖХ: 2-98% В в течение 1,4 мин, 0,75 мин 98% В, скорость потока = 1,2 мл/мин. Температура колонки для ВЭЖХ: 50°С.

Способ ЬСМ8 М7 (К!м7).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АхсеШЕ Ехргекк С18, 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05% ТРА, В) АСИ + 0,04% ТРА.

Градиент ВЭЖХ: 10-95% В в течение 3,0 мин, 1 мин 95% В, скорость потока = 1,2 мл/мин. Температура колонки для ВЭЖХ: 50°С.

Способ ЬСМ8 М8 (К1_М8).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АхсеШЕ Ехргекк С18 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония, В) ацетонитрил + 0,04% муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 10-95% В в течение 3,0 мин, скорость потока = 1,2 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М9 (Км).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АхсеШЕ Ехргекк С18 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония, В) ацетонитрил + 0,04% муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 10% В от 0,0 до 0,5 мин, затем от 0,5 мин до 3,0 мин градиент 10-95% В, скорость потока =1,2 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М10 (К1_М10).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x50 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АссцнА ИРЬС ВЕН С18 1,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,1 об.% муравьиной кислоты, В) ацетонитрил.

Градиент ВЭЖХ: 20-25% В в течение 1,00 мин, затем 25-95% В в течение 3,20 мин, затем 95-100% В в течение 0,10 мин, затем 100% в течение 0,20 мин, скорость потока =0,7 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М11 (К1_М11).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x50 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АссцнА ИРЬС ВЕН С18 1,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,1 об.% муравьиной кислоты, В) ацетонитрил.

Градиент ВЭЖХ: 5-10% В в течение 1,00 мин, затем 10-90% В в течение 3,00 мин, затем 90-100% В в течение 0,10 мин, затем 100% в течение 0,40 мин, скорость потока =0,7 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М12 (Ими).

- 19 028031

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АксепДк Ехргекк С18 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,1 об.% ТРА, В) ацетонитрил.

Градиент ВЭЖХ: 10-95% В более 1,7 мин и 1,2 мл/мин в.качестве скорости потока растворителя, а затем 95 5 В более 0,7 мин, скорость потока = 1,4 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М13 (Κί_Μ13).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АксепДк Ехргекк С18 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05% муравьиная кислота + 3,75 мМ ацетата аммония, В) ацетонитрил + 0,04% муравьиная кислота.

Градиент ВЭЖХ: 10-95% В в течение 3,7 мин, скорость потока = 1,2 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М14 (Ими).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x30 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: АксепДк Ехргекк С18, 2,7 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония, В) ацетонитрил + 0,04% муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 10-95% В в течение 1,5 мин, 1 мин 95% В, скорость потока = 1,2 мл/мин.

Способ ЬСМ8 М15 (Ими).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 0,46x25 см.

Тип колонки для ВЭЖХ: СЫга1се1 ΘΌ-Η (1194).

Элюент ВЭЖХ: Нехаи/ΕΐΘΗ 50:50 + 0,05% ЭЕА.

Градиент ВЭЖХ: изократический, скорость потока = 0,5 мл/мин.

Детектор: УФ 220 нм.

Способ ЬСМ8 М16 (Κΐ_Μ16).

Размеры колонки для ВЭЖХ: 2,1x50 мм.

Тип колонки для ВЭЖХ: Асдш!у ИРЬС Н88 Т3, 1,8 мкм.

Элюент ВЭЖХ: А) вода + 0,05 об.% муравьиной кислоты + 3,75 мМ ацетата аммония В) АСЫ + 0,04 об.% муравьиной кислоты.

Градиент ВЭЖХ: 5-98% В в течение 1,4 мин, 98% В 0,4 мин, скорость потока = 1,0 мл/мин.

Температура колонки для ВЭЖХ: 60°С.

Порошковая рентгеновская дифрактометрия.

Средства измерений.

Способ Х1.

Устройство: Вгикег Ό8 СЛЭЭ5> ЭРсоуег.

Излучение: СиКа (40 кВ, 4 0 мА).

Детектор: детектор Н1-8ТАК Агеа.

Диапазон сканирования: 6-39° (значение 2-θ).

Определение температуры плавления.

Температуру плавления определяли дифференциальной сканирующей калориметрией (Э8С). Э8С являлась такой, как регистрировали на устройстве ТА 1п81гитеп18 Э8С 02000 с использованием скорости нагрева 10°С/мин. Образец 0,6 мг взвешивали в стандартной алюминиевой чаше (чаша + крышка, ТА 900786.901, 900779.901). Устройство эксплуатировали с использованием программного обеспечения ТНегта1 Айуайаде 0-5>епе5 ν.2.6.0,367 и программного обеспечения ТЬегта1 Айуайаде У4.6.9. Тепловые переходы характеризовали с использованием программы ишуег8а1 Апа1у818 ν4^ Βιιί1ά 4.3.0.6. Образцы измеряли против чаши образца без отверстия под штифт. Образец обрабатывали в соответствии со следующим ниже протоколом.

Этап 1. Уравновешивание при 0°С.

Этап 2. Скорость изменения температуры 10°С/мин до 300°С.

Пример Р1. (1,1-Диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5метилпиридин-3 -ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4-Ь][1,4]оксазин-7 -илокси]пирролидин-1 -ил}метанон

- 20 028031

a) 7-Хлор-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин.

Раствор 7-хлор-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин-2-она (регистрационный номер СА8 928118-43-8) (3,70 г, 20 ммоль) в ТНР (63 мл) обрабатывали ВН₃-ТНР (1М в ТНР, 47 мл, 47 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 75°С в течение 1 ч, затем охлаждали до комнатной температуры и гасили метанолом (24 мл, 60 0 ммоль). Концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении и остаток абсорбировали ЕЮАс и промывали насыщенным водным раствором \а11СО₃. Органический слой сушили над ΜβδΟ₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта в виде бледно-желтого твердого вещества (3,3 г, выход 96%).

иРЬС Κί_Μ1=0,47 мин; ΕδΙΜδ: 171 [(М+Н)+].

¹Н ЯМР (400 МГц, ΏΜδΟ-ά₆): δ 7,53 (с, 1Н), 7,11 (ушир.с, 1Н), 6,47 (с, 1Н), 4,09 (т, 2Н), 3,17-3,38 (м,

2Н).

b) 2,3-Дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин-7-ол.

Смесь 7-хлор-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазина (1,08 г, 6,33 ммоль), водного раствора КОН (1,07 г, 19 ммоль КОН в 5,4 мл воды), 2-ди-трет-бутилфосфино-3,4,5,6-тетраметил-2',4',6-триизопропилбифенила 98% (0,30 г, 0,63 ммоль) и Р4₂(4Ъа)₃ (0,29 г, 0,32 ммоль) в диоксане (32,5 мл) подвергали дегазации три раза с использованием азота, пробирку герметично запечатывали и перемешивали реакционную смесь при 100°С в течение 5 ч. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь фильтровали через фильтр НуПо, ополаскивали ЕЮАс и метанолом. Концентрировали фильтраты и получали указанное в заголовке соединение после флэш-хроматографии на силикагеле ([)С\1/\1еО11, от 98:2 до 75:25) в виде оранжевого остатка (660 мг, выход 69%).

ЕРЛС Κί_Μι=0,34 мин; ΕδΙΜδ: 153 [(М+Н)+].

¹Н ЯМР (400 МГц, ΏΜ^^): δ 10,33 (ушир.с, 1Н), 7,03 (ушир.с, 1Н), 6,71 (с, 1Н), 5,15 (с, 1Н), 3,95 (т, 2Н), 3,25 (м, 2Н).

c) Трет-бутиловый эфир (8)-3-(2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин-7-илокси)пирролидин-1карбоновой кислоты.

Сухой раствор 2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин-7-ола (0,66 г, 4,34 ммоль) и третбутилового эфира (К)-3-метансульфонилоксипирролидин-1-карбоновой кислоты (регистрационный номер СА8 127423-61-4) (1,73 г, 6,51 ммоль) в ΏΜΡ (40 мл) обрабатывали гидридом натрия (60% в минеральном масле, 0,21 г, 8,68 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при 80°С в течение 18 ч. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляли ТВМЕ и промывали насыщенным водным раствором \а! 1СО₃. Органический слой сушили над ΜΙΰδΟι, фильтровали, концентрировали

- 21 028031 и получали указанное в заголовке соединение после флэш-хроматографии на силикагеле (циклогексан/ЕЮАс, от 95:5 до 30:70) в виде желтого масла (1,035 г, чистота 75%, выход 56%).

ЕТЕС К1_М1=0,65 мин; Е81М8: 322 [(М+Н)+].

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,54 (с, 1Н), 5,86 (с, 1Н), 5,42 (ушир.с, 1Н), 4,25-4,41 (м, 1Н), 4,19 (т, 2Н), 3,38-3,66 (м, 6Н), 2,00-2,18 (м, 2Н), 1,46 (д, 9Н).

ά) Трет-бутиловый эфир (8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-карбоновой кислоты.

Смесь трет-бутилового эфира (8)-3-(2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7илокси)пирролидин-1-карбоновой кислоты (254 мг, 0,79 ммоль), 5-бром-2-метокси-3-метилпиридина (регистрационный номер СА8 760207-87-2) (208 мг, 1,03 ммоль), ΧΡΙ105 (30 мг, 0,06 ммоль) и ΝαΟίΒιι (167 мг, 1,74 ммоль) в диоксане (6 мл) подвергали дегазации аргоном в течение 5 мин, затем добавляли Ρά₂(^α)₃ (29 мг, 0,03 ммоль). Пробирку фильтровали аргоном, герметично запечатывали и перемешивали реакционную смесь при 100°С в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь фильтровали через фильтр НуЛо, ополаскивали ЕЮАс и промывали фильтраты насыщенным водным раствором ЯаНСО₃. Водный слой дважды повторно экстрагировали ЕЮАс, объединенные органические слои сушили над Яа₂8О₄, фильтровали, концентрировали и получали указанное в заголовке соединение после флэш-хроматографии на силикагеле (гептан/ЕЮАс, от 100:0 до 50:50) в виде прозрачной камеди (274 мг, выход 78%). ЕТЕС К_М1=1,20 мин; Е81М8: 443 [(М+Н)+].

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,93 (д, 1Н), 7,61 (ушир.с, 1Н), 7,30-7,35 (м, 1Н), 5,71 (с, 1Н), 5,34-5,46 (м, 1Н), 4,31 (ушир.с, 2Н), 3,99 (с, 3Н), 3,68 (т, 2Н), 3,34-3,62 м, 4Н), 2,23 (с, 3Н), 2,01-2,09 (м, 2Н), 1,44 (с, 9Н).

е) 1 -(6-Метокси-5 -метилпиридин-3 -ил)-7-((8)-пирролидин-3 -илокси)-2,3-дигидро-1Н-пиридо [3,4Ь][1,4]оксазин.

Раствор трет-бутилового эфира (8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Нпиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-карбоновой кислоты (364 мг, 0,82 ммоль) в Όί'Μ (6 мл) обрабатывали ТРА (0,63 мл, 8,23 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 18 ч, затем гасили насыщенным водным раствором ЯаНСО₃ и экстрагировали ЭСМ. Органический слой сушили над М§8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта в виде красного масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (313 мг, чистота 90%, количественный выход).

ЕТЕС К_М1=0,65 мин; Е81М8: 343 [(М+Н)+].

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭСЕ): δ 7,93 (д, 1Н), 7,62 (с, 1Н), 7,32 (д, 1Н), 5,70 (с, 1Н), 5,26-5,36 (м, 1Н), 4,31 (т, 2Н), 3,99 (с, 3Н), 3,67 (т, 2Н), 2,95-3,15 (м, 3Н), 2,81-2,92 (м, 1Н), 2,22 (с, 3Н), 1,98-2,10 (м, 1Н), 1,79-1,90 (м, 1Н).

ί) (1,1-Диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(8)-3-[1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1-ил}метанон.

Раствор 1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-карбоновой кислоты (регистрационный номер СА8 64096-87-3) (106 мг, 0,59 ммоль) в ОМЕ (4 мл) обрабатывали НВТи (225 мг, 0,59 ммоль) и ΌΙΡЕА (0,24 мл, 1,37 ммоль). Получаемый оранжевый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, затем добавляли раствор 1-(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-7-((8)-пирролидин-3илокси)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ь] [1,4]оксазина (156 мг, 0,46 ммоль) в ОМЕ (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении и абсорбировали остаток ОСМ и промывали насыщенным водным раствором ЯаНСО₃. Органический слой сушили посредством его пропускания через разделяющий фазы картридж, концентрировали и получали указанное в заголовке соединение после 8РС-хроматографии (колонка ОЕАБ (250 мм х 30 мм, 60А, 5 мкм) Ρπι^Ιοη, градиент 11-16% метанола в сверхкритическом СО₂ в течение 6 мин) в виде незначительно окрашенного твердого вещества (112 мг, выход 49%).

ЕТЕС К_М1=0,81 мин; Е8ПМ8: 503 [(М+Н)+].

¹Н ЯМР (400 МГц, 1)\18О-сЕ): δ 8,01 (с, 1Н), 7,61 (м, 1Н), 7,52 (д, 1Н), 5,52 (д, 1Н), 5,24-5,43 (м, 1Н), 4,26 (ушир.с, 2Н), 3,89 (с, 3Н), 3,59-3,79 (м, 3Н), 3,41-3,56 (м, 2Н), 3,21-3,39 (м, 1Н), 2,98-3,21 (м, 4Н), 2,67-2,83 (м, 1Н), 1,84-2,20 (м, 9Н).

¹Н ЯМР (600 МГц, 1)\18О-сЕ): δ 8,01 (с, 1Н), 7,63-7,59 (м, 1Н), 7,55-7,51 (м, 1Н), 5,55-5,51 (м, 1Н), 5,43-5,24 (м, 1Н), 4,29-4,22 (м, 2Н), 3,90 (с, 3Н), 3,80-3,60 (м, 2Н), 3,56-3,37 (м, 3Н), 3,28-2,99 (м, 5Н), 2,89-2,66 (м, 1Н), 2,19-2,09 (м, 4Н), 2,08-1,98 (м, 2Н), 1,98-1,86 (м, 3Н).

Кристаллизация соединения примера Р1 нагреванием и охлаждением в изопропаноле/простом диэтиловом эфире.

474 мг аморфного соединения примера Р1 суспендировали в 1,4 мл изопропанола. Смесь нагревали до 70°С и перемешивали при 70°С, обеспечивая полное растворение соединения примера Р1. Раствор охлаждали до комнатной температуры, получали клейкий остаток. Добавляли 2 мл простого диэтилового эфира и перемешивали взвесь в течение 48 ч. Получали белую суспензию. Фильтровали суспензию и сушили твердое вещество при 40°С, 15 мбар. Получали тонкодисперсный белый порошок. Вещество со- 22 028031 держит только незначительное остаточное количество растворителя (<0,5%). Получали кристаллическую безводную форму соединения примера Р1 с началом плавления при 148,77°С.

Список наиболее значимых пиков 2-тета из порошковой рентгеновской дифрактограммы с допусками ±0,5 безводной формы соединения примера Р1 (способ М1) (включая низкие/слабые пики для информации). Примечание: этот список пиков не является исчерпывающим, а только в числе прочего.

Биологическая оценка.

Активность соединения можно оценивать следующими ниже способами ΐη νίίΓο и ΐη νίνο.

Биологические анализы.

1. Определение ингибирования ферментативной активности изоформ Р13К-альфа и ΡΙ3Κ-дельта.

1.1. Т естирование активности липидкиназы.

Эффективность соединений в качестве ингибиторов Р13-киназы можно определять так, как указано ниже.

Киназную реакцию проводят в конечном объеме 50 мл на лунку половины площади 96-луночного планшета СОБТЛК Конечные концентрации АТФ и фосфатидилинозитола в анализе составляли 5 мМ и 6 мг/мл соответственно. Реакцию инициировали добавлением Р13-киназы, например Р13-киназы δ.

ρ110δ. Компоненты анализа добавляют в каждую лунку, как указано ниже:

мл тестируемого соединения в 5% ЭМБО на лунку в столбцы 2-1;

общую активность определяют добавлением 10 мл 5% об./об. ЭМБО в первые 4 лунки столбца 1 и последние 4 лунки столбца 12;

исходные значения определяют добавлением 10 мМ контрольного соединения в последние 4 лунки столбца 1 и первые 4 лунки столбца 12;

на планшет получают 2 мл смеси для анализа на планшет:

1,912 мл буфера НЕРЕБ для анализа;

8,33 мл исходного 3 мМ раствора АТФ с получением конечной концентрации 5 мкМ на лунку;

мл [³³Р]АТФ, исходя из данных активности с получением 0,05 мКи на лунку;

мл 1 мг/мл исходного раствора Р1 с получением конечной концентрации 6 мг/мл на лунку;

мл исходного 1М раствора МдС1₂ с получением конечной концентрации 1 мМ на лунку;

мл смеси для анализа добавляют в каждую лунку;

мл смеси ферментов получают для каждого планшета (х*-мкл Р13-киназы ρ110δ в 2 мл киназного буфера). Во время добавления в анализируемые планшеты смесь ферментов хранят на льду;

мл смеси ферментов добавляют/лунку для инициации реакции; затем планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин;

реакцию останавливают добавлением 50 мл суспензии микросфер ШОЛ-БРЛ (микросферы для

- 23 028031 сцинтилляционного анализа сближения, покрытые агглютинином из проростков пшеницы) в каждую лунку;

анализируемый планшет герметично закрывают с использованием Тор8еа1-8 (термосварки для полистироловых микропланшетов, РегктЕ1тег ЬА§ [Пеи1ксЫаий] ОтЬН, Кобдаи, Оегтапу) и инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 60 мин;

затем анализируемый планшет центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2 мин с использованием настольной центрифуги 1оиаи Цопав 1ис., Nаиΐек, Ргаисе);

анализируемый планшет считывают с использованием Раскагб ТорСоии!, где каждую лунку считывают в течение 20 секунд;

* объем фермента зависит от ферментативной активности используемой партии.

В более предпочтительном анализе киназную реакцию проводят в конечном объеме 10 мл на лунку малообъемного 384-луночного черного планшета с несвязывающей поверхностью СОКМГОО (каталожный номер №3676). Конечные концентрации АТФ и фосфатидилинозитола (ΡΙ) в анализе составляют 1 мМ и 10 мг/мл, соответственно. Реакцию инициируют добавлением АТФ.

Компоненты анализа добавляют в каждую лунку, как указано ниже:

нл тестируемых соединений в 90% ЭМ8О на лунку, в столбцы 1-20, 8 концентраций (стадия серийных разведений 1/3 и 1/3,33) в одну.

Низкий контроль: 50 нл 90% ЭМ8О в половину лунок столбцов 23-24 (0,45% в конечном итоге).

Высокий контроль: 50 нл эталонного соединения (например, соединение примера 7 в VО 2006/122806) в другую половину столбцов 23-24 (2,5 мкМ в конечном итоге).

Стандарт: 50 нл эталонного соединения, как уже указано, разводили как тестируемые соединения в столбцах 21-22.

мл буфера получают на анализ:

200 мкл 1М ТК1§ НС1 рН 7,5 (10 мМ в конечном итоге);

мкл 1М МдС1₂ (3 мМ в конечном итоге);

500 мкл 2М №С1 (50 мМ в конечном итоге);

100 мкл 10% СНАР8 (0,05% в конечном итоге);

200 мкл 100 мМ ОТТ (1 мМ в конечном итоге);

18,94 мл воды, очищенной с использованием системы ШноРиге;

мл Р1 получают на анализ:

200 мкл 1 мг/мл Ь-альфа-фосфатидилинозитола (печень крупного рогатого скота, ДуаиИ Ро1аг ЫрМк, каталожный номер 840042С, ΜV=909,12) получали в 3% октилглюкозида (10 мкг/мл в конечном итоге);

9,8 мл буфера;

мл АТФ получают на анализ:

6,7 мл исходного 3 мМ раствора АТФ с получением конечной концентрации 1 мкМ на лунку 10 мл буфера;

2,5 мл каждой конструкции Р13К получают на анализ в Р1 со следующими ниже конечными концентрациями:

нМ Р13К-альфа ЕМУ В1075;

нМ бета ЕМУ ВУ949;

нМ дельта ЕМУ ВУ1060;

150 нМ гамма ЕМУ ВУ950;

мкл Р1/Р13К2 добавляют в каждую лунку;

мкл АТФ добавляют в каждую лунку для инициации реакции;

затем планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин (альфа, бета, дельта) или 120 мин (гамма);

реакцию останавливают добавлением 10 мл киназы-О1о (Рготеда, каталожный номер №6714); анализируемые планшеты считывают через 10 мин на ридере 8уиетду 2 (ВюТек, УегтоШ И8А) с временем интегрирования 100 мс и установленной чувствительностью 191;

выход: высокий контроль составляет примерно 60000 импульсов и низкий контроль составляет

30000 или ниже;

этим люминесцентным анализом получают пригодное отношение Ζ' от 0,4 до 0,7.

Значение Ζ' является универсальным измерением надежности анализа. Ζ' от 0,5 до 1,0 считают лучшим анализом.

Для этого анализа получают указанные конструкции Р13К так, как указано ниже.

1.2. Получение генетических конструкций.

Для получения белков Р13-киназы α для скрининга соединений используют две различные конструкции ВУ 1052 и ВУ 1075.

Р13К-а ВУ-1052 р85(1§Н2)-О1у линкер-р110а (О20аа)-С-концевая НЦ-метка.

Получают продукты ПЦР для внутреннего домена 8Н2 (ЦЗН2) субъединицы р85 и для субъединицы

- 24 028031 р110-а (с делецией первых 20 аминокислот) и сливают посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами.

Продукт ПЦР 1§Н2 получают из первой цепи кДНК с использованием сначала праймеров дтеО130р01 (5'-СОАОААТАТОАТАОАТТАТАТОААОААТ-3') (8ЕО ГО ХО: 1) и дтеО130-р02 (5'-ТООТТТААТОСТОТТСАТАСОТТТОТСААТ-3') (8ЕО ГО ХО: 2). Затем во второй реакции ПЦР ОаЕетеау (Ιηνίίτοдеп АО, Ва§е1, 8\уйхег1апй) добавляют участки рекомбинантной АЙВ 1 и линкерные последовательности к 5'-концу и 3'-концу фрагмента 1§Н2 р85 соответственно с использованием праймеров дтеО130-р03 (5'ОООАСААОТТТОТАСААААААОСАООСТАСОААООАОАТАТАСАТАТОСОАОААТАТОАТАОА ТТАТАТОААОААТ-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 3) и дтеО152-р04 (5'-ТАССАТААТТССАССАССАССАССООААА ТТСССССТООТТТААТОСТОТТСАТАСОТТТОТС ААТ-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 4).

Фрагмент Р110-а также получали из первой цепи кДНК сначала с использованием праймеров дтеО152-р01 (5'-СТАОТООААТОТТТАСТАССАААТОО-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 5) и дтеО152-р02 (5'ОТТСААТОСАТОСТОТТТААТТОТОТ-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 6).

В последующей реакции ПЦР добавляют линкерную последовательность и гистидиновую метку к 5'-концу и 3'-концу фрагмента р110-а соответственно с использованием праймеров дте152-р03 (5'ОООООААТТТССООТООТООТООТООААТТАТООТАСТАОТООААТОТТТАСТАССАААТООА-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 7) и дтеО152-р06 (5'-АОСТССОТОАТООТОАТООТОАТОТОСТССОТТСААТОСАТОСТ ОТТТААТТОТОТ-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 8).

Слитый белок Р85-1§Н2/р110-а собирают в третьей реакции ПЦР посредством перекрывающихся линкеров на 3'-конце фрагмента 1§Н2 и 5'-конце фрагмента р110-а с использованием указанного выше праймера дтеО130-р03 и праймера, содержащего перекрывающуюся гистидиновую метку и рекомбинантные последовательности АЙВ2 (5'-ОООАССАСТТТОТАСААОАААОСТОООТТТААОСТССОТОА ТООТОАТООТОАТОТОСТСС-3') (8ЕЕ) ГО ХО: 9).

Этот конечный продукт рекомбинировали в реакции ОК (1п\йгодеп) в донорный вектор рЭОХК201 с получением исходного клона ОКР318. Этот клон подтверждают секвенированием и используют в реакции ЬК Оа1е\уау для переноса вставки в адаптированный Оа1е\уау вектор рВ1иеВас4.5 (Лгуйгодеп) для получения экспрессирующего вектора ЬК410 на основе бакуловируса.

Р13Ка ВУ-1075 р85(1§Н2)-12Хд1у линкер-р110а(020аа)-С-концевая Н18-метка.

Конструкцию для бакуловируса ВУ-1075 получают трехступенчатым лигированием, которое включает фрагмент р85 и фрагмент р110-а, клонированные в вектор рВ1иеВас4.5. Фрагмент р85 получают из плазмиды р1661-2, расщепляемой Хйе/8ре. Фрагмент Р110-а получают из ЬК410 (см. выше) как фрагмент 8ре1/НЙ1Й111. Клонирующий вектор рВ1иеВас4.5 (Лгуйгодеп) расщепляют Хйе/ЛпйПЕ Результатом этого является конструкция РЕО 153.8.

Компонент р85 (1§Н2) получают путем ПЦР с использованием ОКР 318 (описанной выше) в качестве матрицы и одного прямого праймера КАС1028 (5'-ОСТАОСАТОСОАОААТАТОАТАОАТТАТАТО ААОААТАТАСС) ЛЕО ГО ХО: 10) и двух обратных праймеров КАС1029 (5'-ОССТССАССАССТССОС СТООТТТААТОСТОТТСАТАСОТТТОТС) ЛЕО ГО ХО: 11) и КАС1039 (5'-ТАСТАОТССОССТССА ССАССТССОССТССАССАССТССОСС) ЛЕО ГО ХО: 12).

Два обратных праймеры перекрываются и встраиваются в линкер 12хО1у и Х-концевую последовательность гена р110а в участок §ре1. Линкер 12хО1у заменяет линкер в конструкции ВУ1052. Фрагмент ПЦР клонируют в рСК2.1 ТОРО Лгуйгодеп). Из получаемых клонов определяют, что р1661-2 является правильным. Эту плазмиду расщепляют с помощью Хйе и §ре1 и получаемый фрагмент выделяют в геле и очищают для субклонирования.

Фрагмент р110-а для клонирования получают ферментативным расщеплением клона ЬК410 (см. выше) с помощью 8ре1 и НшйШ. Участок §ре1 располагается в кодирующей области гена р110а. Получаемый фрагмент выделяют в геле и очищают для субклонирования.

Клонирующий вектор рВ1иеВас4.5 Лтайодеп) получают ферментативным расщеплением с помощью Хйе и НшйШ. Рестриктированный вектор очищают на колонке О1адеп (Ошадеп КУ, Уеп1о, Хе1йег1апЛ), а затем подвергают дефосфорилированию щелочной фосфатазой из кишечника теленка (С1Р) (Хете Епд1апй ВюЬаЪк, 1р5\У1с1г МА). После завершения реакции С1Р рестриктированный вектор снова очищают на колонке с получением конечного вектора. Проводят лигирование в 3 этапа с использованием лигазы Косйе КарЛ и рекомендаций поставщика.

Р13Кв ВУ-949 р85(1§Н2)-О1у линкер-р110Ъ (полноразмерный)-С-концевая Н18-метка.

Получают продукты ПЦР для внутреннего домена 8Н2 (1§Н2) субъединицы р85 и для полноразмерной субъединицы р110-Ъ и подвергают слиянию посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами.

Продукт ПЦР 1§Н2 получают из первой цепи кДНК сначала с использованием праймеров дтеО130р01 (5'-СОАОААТАТОАТАОАТТАТАТОААОААТ-3') ЛЕО ГО ХО: 1) и дтеО130-р02 (5'-ТООТТТААТОСТОТТСАТАСОТТТОТСААТ-3') ЛЕО ГО ХО: 2). Затем во второй реакции ПЦР ОаЕетеау (1п\Нгодеп) добавляют участки рекомбинантной АйВ1 и линкерные последовательности на 5'-конец и 3'-конец фрагмента 1§Н2 р85, соответственно, с использованием праймеров дтеО130-р03 (5'-ОООАСААОТТТ

- 25 028031

СТАСААААААССАСССТАССААССАСАТАТАСАТАТСССАСААТАТСАТАСАТТАТАТСААСААТ -3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 3) и д^С130-р05 (5'-АСТСААССАТССТССТССТССТССТССТССТТТААТССТСТТ САТАССТТТСТС-3') (8ЕО ΙΌ Ш: 13).

Также получали фрагмент р110-Ь из первой цепи кДНК сначала с использованием праймеров §^С130-р04 (5'-АТТАААССАССАССАССАССАССАССАТССТТСАСТТТСАТААТСССТССТССТ-3') (8Е0 ΙΌ NΟ: 4), который содержит линкерные последовательности и 5'-конец р110-Ь и §^С130-р0б (5'АССТСССТСАТССТСАТССТСАТСТССТССАСАТСТСТАСТСТТТСССААСТСТСТС-3') (8ЕЕ) ΙΌ NΟ: 14), который содержит последовательности 3'-конца р110-Ь, слитого с гистидиновой меткой.

Слитый белок р85-1§Н2/р110-Ь собирают путем ПЦР с перекрывающимися праймерами реакцией линкеров на 3'-конце фрагмента ί8Η2 и 5'-конце фрагмента р110-Ь с использованием указанного выше праймера д^С130-р03 и праймера, содержащего перекрывающуюся гистидиновую метку и рекомбинантные последовательности АйВ2 (5'-СССАССАСТТТСТАСААСАААССТСССТТТААССТССС ТСАТССТСАТССТСАТСТССТСС-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 15).

Этот конечный продукт рекомбинировали в реакции ОК Са1е\\ау (Зпуйгодеп) в донорный вектор р^ΟNΚ201 с получением исходного клона ОКР253. Этот клон подтверждают секвенированием и используют в реакции ЬК Са1е\\ау для переноса вставки в адаптированный Са1е\\ау вектор рВ1иеВас4.5 (Ιηνί!годеп) для получения экспрессирующего вектора ЬК280 на основе бакуловируса.

ΡΌ^ ВУ-10б0 р85(18Н2)-С1у линкер-р110й(полноразмерный)-С-концевая Ηίκ-метка.

Получают продукты ПЦР для внутреннего домена 8Н2 (т8Н2) субъединицы р85 и для полноразмерной субъединицы р110-й и подвергают слиянию посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами.

Продукт ПЦР ί8Η2 получают из первой цепи кДНК сначала с использованием праймеров детС130р01 (5'-ССАСААТАТСАТАСАТТАТАТСААСААТ-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 1) и д^С130-р02 (5'-ТССТТТАА ТССТСТТСАТАССТТТСТСААТ-3') (8Е0 ΙΌ NΟ: 2). Затем во второй реакции ПЦР Са1е\\ау (ЗпуПгодеп) участков рекомбинантной АйВ1 и добавляют линкерные последовательности на 5'-конец и 3'-конец фрагмента ί8Η2 р85 соответственно с использованием праймеров д^С130-р03 (5'СССАСААСТТТСТАСААААААССАСССТАССААССАСАТАТАСАТАТСССАСААТАТСАТАСА ТТАТАТСААСААТ-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 3) и д^С154-р04 (5'-ТССТССТССТССТССТССТССТТТААТССТС ТТСАТАССТТТСТС-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 1б).

Фрагмент Р110-а также получают из первой цепи кДНК сначала с использованием праймеров д^С154-р01 (5'-АТССССССТССССТССАСТСССССАТ-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 17) и д^С154-р02 (5'СТАСТСССТСТТСТСТТТССАСАССТ-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 18).

В последующей реакции ПЦР добавляют линкерные последовательности и гистидиновую метку на 5'-конец и 3'-конец фрагмента р110-й соответственно с использованием праймеров д\\354-р()3 (5'АТТАААССАССАССАССАССАССАССАСССССТССССТССАСТСССССАТССА-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 19) и д^С154-р0б (5'-АССТСССТСАТССТСАТССТСАТСТССТСССТСССТСТТСТСТТТССАСА ССТТСТ-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 20).

Слитый белок р85-^8Η2/р110-ά собирают в третьей реакции ПЦР путем перекрывания линкеров на 3'-конце фрагмента ί8Η2 и 5'-конце фрагмента р110-й с использованием указанного выше праймера детС130-р03 и праймера, содержащего перекрывающуюся гистидиновую метку и рекомбинантные последовательности Са1е\\ау ЦпШгодеп) АйВ2 (5'-СССАССАСТТТСТАСААСАААССТСССТТТААССТ СССТСАТССТСАТССТСАТСТССТСС-3') (8ЕЕ) ΙΌ Ш: 21).

Этот конечный продукт рекомбинируют в реакции ОК Са1е\\ау (Зпуйгодеп) в донорный вектор р^ΟNΚ201 с получением исходного клона ОКР319. Этот клон подтверждают секвенированием и используют в реакции ЬК Са1е\\ау для переноса вставки в адаптированный Са1е\\ау вектор рВ1иеВас4.5 (Ιιτνί!годеп) для получения экспрессирующего вектора ЬК415 на основе бакуловируса.

ΡΒ^ ВУ-950 р110д(О144аа)-С-концевая Ηίκ-метка.

Эту конструкцию получают от Кодег ^ййатк 1аЬ, МКС БаЬогаЮгу оР Мо1еси1аг Вю1оду, СатЬпйде, ИК (ноября, 2003). Описание конструкции в Ρасо1ά М.Е. е1 а1., (2000) Се11, 103, 931-943.

1.3. Экспрессия и очистка белка.

Способы получения рекомбинантного бакуловируса и белка для изоформ ΡΙ3Ι<.

Плазмиды рВ1ие-Вас4.5 (для изоформ а, Ь и ά) или рУЪ1393 (для д), содержащие различные гены ΡI3-киназы, совместно трансфицировали в геномную ДНК Васи1оСо1й \УТ (ВО Вюкшепсек, Ргапкйп Ьакек, N1, И8А) способами, рекомендуемыми поставщиком. Затем рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате трансфекции, очищали способом бляшкообразования на клетках насекомых 8Р9 с получением нескольких изолятов, экспрессирующих рекомбинантный белок. Положительные клоны отбирали посредством вестерн-блоттинг с антителом против ΗΙ8 или антителом против изоформ \уе51егп. Для изоформ альфа и дельта ΡI3Κ проводят вторичную очистку способом бляшкообразования на первых клональных исходных растворах вируса ΡΙ3Ι<. Амплификацию всех изолятов бакуловируса проводят при низкой множественности заражения (тор для получения высокого титра, низкого пассажа для продукции белка. Бакуловирусы обозначают как ВУ1052 (α) и ВУ1075 (α), ВУ949 (β), ВУ10б0 (δ) и ВУ950 (γ).

- 2б 028031

Продукция белка включает инфицирование (пассаж 3 или ниже) суспендированных клеток Тп5 (ТпсНоркыа ηί) или ТпйРго (Ехргеккюп 8ук1етк, ЬЬС, ХУооШапТ СА, И8А) в не содержащей белка среде при то1 2-10 в течение 39-48 ч в 2 л стеклянных колбах Эрленмейера (110 об/мин) или волновых биореакторах (22-25 об/мин). Сначала волновые биореакторы с рабочим объемом 10 л засевают при плотности Зе5 клеток/мл на половину емкости (5л). Реактор покачивают при 15 об/мин во время фазы клеточного роста в течение 72 ч с добавлением 5% кислорода, смешанного с воздухом (0,2 л/мин). Непосредственно перед инфицированием культуры из волнового реактора анализируют на плотность, жизнеспособность и разбавляют до приблизительно 1,5е6 клеток/мл. После 2-4 ч дополнительного культивирования добавляют 100-500 мл вируса высокого тира, низкого пассажа. Кислород повышают до 35% в течение 39-48 ч периода инфицирования и увеличивают число оборотов в минуту качающейся платформы до 25. Во время инфицирования наблюдают за биопроцессами клеток посредством анализатора жизнеспособности Уюе11 (Весктап СоиИег, 1пс, Ри11егЮп, СА, И8А) в отношении жизнеспособности, диаметра и плотности. Показания Ыоуа Вюапа1у/ег (ЫОУА Вютекса1 Согр., ^аНЬат, МА, И8А), считывающего различные параметры и метаболиты (рН, насыщение О₂, глюкозу и т.д.) снимают каждые 12-18 ч вплоть до сбора. Клетки из волнового биореактора собирают через 40 ч после инфицирования. Клетки собирают центрифугированием (4°С при 1500 об/мин), а затем хранят на льду во время объединения осадков для лизирования и очистки. Получают объединенные осадки с небольшими количествами холодной среды Грейса без добавок (без ингибиторов протеаз).

Протокол очистки Р13К-альфа для НТ8 (ВУ1052).

Р13К-альфа очищают в три хроматографических стадии: аффинная хроматография с использованием иммобилизованных металлов на смоле Νί-сефароза (СЕ НеаИЬсаге, принадлежащая Сепега1 Е1ес1пс Сотрапу, РшгйеЫ, СТ, И8А), гель-фильтрация с использованием колонки 8ирегйех 200 26/60 (СЕ НеаИЬсаге) и в заключении катионообменная стадия на колонке 8Р-ХЬ (СЕ НеаНЬсаге). Все буферы охлаждают до 4°С и проводят лизирование, охлаждая на льду. Быстро проводят фракционирование на колонке при комнатной температуре.

Как правило, замороженные клетки насекомых лизируют в гипертоническом лизирующем буфере и наносят на препаративную колонку 1МАС. Смолу промывают 3-5 объемами колонки лизирующего буфера с последующим промыванием 3-5 объемами колонки буфером для промывания, содержащим 45 мМ имидазола, а затем элюируют целевой белок буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Анализируют фракции посредством гелей 8Э8-РАОЕ, окрашенных кумасси, и объединяют фракции, содержащие целевой белок и наносят на препаративную колонку СРС. Фракции из препаративной колонки СРС анализируют посредством гелей 8Э8-РАОЕ, окрашенных кумасси, и объединяют фракции, содержащие целевой белок. Объединенные фракции после колонки СРС разбавляют в буфере с низким содержанием соли и наносят на препаративную колонку 8Р-ХЬ. Колонку промывают буфером с низким содержанием соли до получения стабильной фоновой оптической плотности А280 и элюируют с использованием градиента 20 объемов колонки от 0 мМ №С1 до 500 мМ №С1. Фракции после колонки 8Р-ХЬ снова анализируют посредством гелей 8Э8-РАОЕ, окрашенных кумасси, и объединяют фракции, содержащие целевой белок. Конечные объединенные фракции подвергают диализу в буфере для хранения, содержащем 50% глицерина и хранят при -20°С. Конечные объединенные фракции анализируют на активность в анализе фосфоинозитолкиназы.

Протокол очистки Р13К-бета для НТ8 (ВУ949).

Р13К-бета очищают в две хроматографические стадии: аффинная хроматография с использованием иммобилизованных металлов (1МАС) на смоле Νί-сефароза (СЕ НеаИЬсаге) и гель-фильтрация (СРС) с использованием колонки 8ирегйех 200 26/60 (СЕ НеаИЬсаге). Все буферы охлаждают до 4°С и проводят лизирование, охлаждая на льду. Быстро проводят фракционирование на колонке при комнатной температуре.

Как правило, замороженные клетки насекомых лизируют в гипертоническом лизирующем буфере и наносят на препаративную колонку 1МАС. Смолу промывают 3-5 объемами колонки лизирующего буфера с последующим промыванием 3-5 объемами колонки буфером для промывания, содержащим 45 мМ имидазола, а затем элюируют целевой белок буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Фракции анализируют посредством гелей 8Э8-РАОЕ, окрашенных кумасси и объединяют фракции, содержащие целевой белок и наносят на препаративную колонку СРС. Фракции после колонки СРС анализируют посредством гелей 8Э8-РАОЕ, окрашенных кумасси и объединяют фракции, содержащие целевой белок. Конечные объединенные фракции подвергают диализу в буфере для хранения, содержащем 50% глицерина, и хранят при -20°С. Конечные объединенные фракции анализируют на активность в анализе фосфоинозитолкиназы.

Протокол очистки Р13К-гамма для НТ8 (ВУ950).

Р13К-гамма очищают в две хроматографические стадии: аффинная хроматография с использованием иммобилизованных металлов (1МАС) на смоле Νί-сефароза (СЕ НеаНЬсаге) и гель-фильтрация (СРС) с использованием колонки 8ирегйех 200 26/60 (СЕ НеаНЬсаге). Все буферы охлаждают до 4°С и проводят лизирование, охлаждая на льду. Быстро проводят фракционирование на колонке при комнатной температуре. Как правило, замороженные клетки насекомых лизируют в гипертоническом лизирующем буфере и

- 27 028031 наносят на препаративную колонку 1МАС. Смолу промывают 3-5 объемами колонки лизирующего буфера с последующим промыванием 3-5 объемами колонки буфером для промывания, содержащим 45 мМ имидазола, а затем элюируют целевой белок буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Фракции анализируют посредством гелей 8Э8-РАСЕ, окрашенных кумасси и объединяют фракции, содержащие целевой белок и наносят на препаративную колонку ОРС. Фракции после колонки ОРС анализируют посредством гелей 8Э8-РАСЕ, окрашенных кумасси и объединяют фракции, содержащие целевой белок. Конечные объединенные фракции подвергают диализу в буфере для хранения, содержащем 50% глицерина и хранят при -20°С. Конечные объединенные фракции анализируют на активность в анализе фосфоинозитолкиназы.

Протокол очистки Р13К-дельта для НТ8 (ВУ1060).

Р13К-дельта очищают в три хроматографические стадии: аффинная хроматография с использованием иммобилизованных металлов на смоле Νί-сефароза (ОЕ НеаННсаге), гель-фильтрация с использованием колонки 8ирегйех 200 26/60 (ОЕ НеаННсаге) и в заключении анионообменная стадия на колонке ф-НР (ОЕ НеаННсаге). Все буферы охлаждают до 4°С и проводят лизирование, охлаждая на льду. Быстро проводят фракционирование на колонке при комнатной температуре. Как правило, замороженные клетки насекомых лизируют в гипертоническом лизирующем буфере и наносят на препаративную колонку 1МАС. Смолу промывают 3-5 объемами колонки лизирующего буфера с последующим промыванием 3-5 объемами колонки буфером для промывания, содержащим 45 мМ имидазол, а затем элюируют целевой белок буфером, содержащим 250 мМ имидазол. Фракции анализируют посредством гелей 8Э8-РАСЕ, окрашенных кумасси и объединяют фракции, содержащие целевой белок и наносят на препаративную колонку ОРС. Фракции после колонки ОРС анализируют посредством гелей 8Э8-РАСЕ, окрашенных кумасси, и объединяют фракции, содержащие целевой белок. Объединенные фракции из колонки ОРС разбавляют в буфере с низким содержанием соли и наносят на препаративную колонку ф-НР. Колонку промывают буфером с низким содержанием соли до получения стабильной фоновой оптической плотности А280 и элюируют с использованием градиента 20 объемов колонки от 0 мМ ИаС1 до 500 мМ ИаС1. Снова фракции после колонки ф-НР анализируют посредством гелей 8Э8-РАСЕ, окрашенных кумасси, и объединяют фракции, содержащие целевой белок. Конечные объединенные фракции подвергают диализу в буфере для хранения, содержащем 50% глицерина, и хранят при -20°С. Конечные объединенные фракции анализируют на активность в анализе фосфоинозитолкиназы.

1С₅₀ определяют общепринятым способом аппроксимации 4-параметрической кривой, который проводят до лучшей аппроксимации. Четырехпараметрическое логистическое уравнение используют для расчета значений 1С₅₀ (ГОВ8 ХБП1) процента ингибирования каждого соединения при 8 концентрациях (как правило, 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ). Альтернативно, значения 1С₅₀ вычисляют с использованием ИЪ^ХЕГН модель 204, которая является 4-параметрической логистической моделью.

Кроме того, альтернативно, для анализа снижения уровня АТФ подлежащие тестированию соединения растворяют в ΌΜ8Ο и непосредственно наносят в белый 384-луночный планшет по 0,5 мкл в лунку. Для инициации реакции в каждую лунку добавляют 10 мкл 10 нМ Р13-киназы и 5 мкг/мл 1-альфафосфатидилинозитола (Р1) добавляют с последующим добавлением 10 мкл 2 мкМ АТФ. Реакцию проводят приблизительно до 50% снижения уровня АТФ, а затем останавливают добавлением 20 мкл раствора киназа-СМ (Рготеда Сюрз., Маά^8οη, ^1, И8А). Остановленную реакцию инкубируют в течение 5 мин, а затем детектируют оставшийся АТФ посредством люминесценции. Затем определяют значения 1С₅₀.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где диапазон активности, выражаемой как 1С₅₀, в ферментативном анализе Р13К-дельта составляет от 1 до 500 нМ.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где диапазон активности, выражаемой как 1С₅₀, в ферментативном анализе Р13К-дельта составляет от 1 до 100 нМ.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где диапазон активности, выражаемой как 1С₅₀, в ферментативном анализе Р13К-дельта составляет от 0,5 до 10 нМ.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где диапазон активности, выражаемой как 1С₅₀, в клеточном анализе Р13К-дельта составляет от 1 до 1000 нМ.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где диапазон активности, выражаемой как 1С₅₀, в клеточном анализе Р13К-дельта составляет от 1 до 500 нМ.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где для ингибитора демонстрируют селективность в отношении изоформы дельта Р13К по сравнению с одной или более других изоформ, где эта селективность является по меньшей мере 10-кратной.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор Р13К, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта Р13К, где для ингибитора демон- 28 028031 стрируют селективность в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ по сравнению с одной или более других изоформ, где эта селективность является по меньшей мере 20-кратной.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор ΡΙ3Κ, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ, где для ингибитора демонстрируют селективность в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ по сравнению с различными паралогами ΡΙ3Κ α и β, где эта селективность является по меньшей мере 10-кратной.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор ΡΙ3Κ, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ, где для ингибитора демонстрируют селективность в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ по сравнению с различными паралогами ΡΙ3Κ α и β, где эта селективность является по меньшей мере 20-кратной.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор ΡΙ3Κ, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ, где диапазон активности, выражаемой как Ι0₅ο, в клеточном анализе ΡI3Κ-дельта составляет от 1 нМ до 500 нМ и где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ, где для ингибитора демонстрируют селективность в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ по сравнению с различными паралогами ΡΙ3Κ α и β, где эта селективность является по меньшей мере 10-кратной.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор ΡΙ3Κ, где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ, где диапазон активности, выражаемой как ΙΟ₅₀, в клеточном анализе ΡI3Κ-дельта составляет от 1 нМ до 500 нМ и где указанный ингибитор обладает ингибирующим действием в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ, где для ингибитора демонстрируют селективность в отношении изоформы дельта ΡΙ3Κ по сравнению с различными паралогами ΡΙ3Κ α и β, где эта селективность является по меньшей мере 20-кратной.

2. Клеточные анализы

2.1. Опосредованное фосфоинозитид-3-киназой (ΡΙ3Κ) фосфорилирование Ак1 1/2 (§473) в клетках

Ка1-1.

Клетки Ка!-1, стабильно экспрессирующие миристоилированную форму каталитической субъединицы фосфоинозитид-3-киназы человека (ΡΙ3Κ) альфа, бета или дельта, высевали в 384-луночные планшеты с плотностью 7500 (ΡI3Κ-альфа), 6200 (ΡΟΚ-бета) или 4000 (ΡI3Κ-дельта) клеток в 30 мкл полной среды для выращивания (модифицированной Дульбекко среды Игла (ИМЕМ с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки, 1% (об./об.) МЕМ не являющихся незаменимыми аминокислот, 10 мМ НЕΡЕ§, 2 мМ Ь-глутамина, 10 мкг/мл пуромицина и 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина) и инкубировали при 37%С/5%СО₂/95% влажности в течение 24 ч. Соединения разбавляли в 384-луночных планшетах с получением 8-точечных серийных разведений для 40 тестируемых соединений в 90% ИМ§О, а также 4 эталонных соединений плюс 16 высоких контролей и 16 низких (ингибированных) контролей. Планшеты с предварительным разведением получали распределением путем пипетирования 250 нл растворов соединений в 384-луночные полипропиленовые планшеты с использованием нанолитрового дозатора Нитпнпд\ус11. Соединения предварительно разбавляли добавлением 49,75 мкл полной среды для выращивания. 10 мкл предварительно разбавленного раствора соединения переносили в планшет с клетками с использованием 384-канального устройства для пипетирования, что приводило к конечной концентрации ИМ§О 0,11%. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37%С/5%СО2/95% влажности. Супернатант удаляли, клетки лизировали в 20 мкл лизирующего буфера для детекции А1р1а§сгееп® §игеР1ге®.

Для детекции р-АКТ(§ег473) использовали набор для анализа р-Ак! 1/2 (§ег473) §игеРие® (ТегкС пЕ1тег, и.§.А). 5 мкл клеточного лизата переносили в 384-луночный малообъемные планшеты ΡτοχίΡΠίδ для детекции с использованием 384-канального устройства для пипетирования. Добавление реагентов А1рЬа§сгееп® §игеРие® проводили по протоколу производителя. Сначала добавляли 5 мкл смеси реакционного буфера плюс активирующий буфер, содержащей акцепторные гранулы А1р1а§сгееп®, планшет герметично закрывали и инкубировали на планшетном шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 2 мкл разбавленного буфера, содержащего донорные гранулы А1рЬа§стееп®, и инкубировали планшет на планшетном шейкере, как указано выше, дополнительно в течение 2 ч. Планшеты считывали на совместимом с А1р1а§сгееп® планшетном ридере с использованием стандартных настроек А1р1а§сгееп®.

2.2. Определение активации В-клеток мышей.

Было установлено, что ΡΙ3Κδ модулирует функцию В-клеток, когда клетки стимулируют посредством В-клеточного рецептора (ВСК) (Оккепйаид е! а1., §аепсе, 297:1031 (2002)). Для оценки ингибирующего свойства соединений в отношении активации В-клеток измеряют повышение экспрессии маркеров активации СИ86 и СИ69 на В-клетках мышей, получаемых из антитела селезенки мышей, после стимуляции антителом против ^М. СИ69 является хорошо известным маркером активации В- и Т-клеток (§апс1ю е! а1., Ттепбк Iттиηο1., 26:136 (2005). СИ86 (также известный как В7-2) преимущественно экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках, включая В-клетки. Покоящиеся В-клетки экспрессируют СЭ86 на низких уровнях, но повышают уровень его экспрессии после стимуляции, например ВСК или

- 29 028031 рецептором 1Ь-4. СЭ86 на В-клетках взаимодействует с СЭ28 на Т-клетках. Это взаимодействие является необходимым для оптимальной активации Т-клеток и для получения оптимального ответа 1дО1 (Саггепо е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1., 20:29 (2002)).

У мышей Ва1Ь/с собирали селезенки, выделяли спленоциты и дважды промывали КРМ1, содержащим 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РВ8), 10 мМ НЕРЕ8, 100 единиц/мл пенициллина/стрептомицина. КРМ1 с такими добавками далее обозначают как среда. Клетки доводят до 2,5х10⁶ клеток/мл в среде и добавляют 200 мкл клеточной суспензии (5х 10⁶ клеток) в соответствующие лунки 96-луночных планшетов.

Затем стимулируют клетки добавлением 50 мкл тАЬ против 1дМ в среде (конечная концентрация: 30 мкг/мл). После инкубации в течение 24 ч при 37°С клетки окрашивают с использованием следующей смеси антител: антитело против СЭ86-Р1ТС мыши, антитело против СЭ69-РегСР-Су5.5 мыши, антитело против СЭ19-РегСР мыши для оценки В-клеток и антителом против СЭ3-Р1ТС мыши, антителом против СЭ69-РЕ мыши для оценки Т-клеток (2 мкл каждого антитела/лунку). Через один час при комнатной температуре (кт) в темноте клетки переносят в 96-луночные планшеты с глубокими лунками. Клетки однократно промывают 1 мл РВ8, содержащим 2% РВ8 и после повторного суспендирования в 200 мкл образцы анализируют на проточном цитометре РАС8 СаПЬиг. Лимфоциты размещают в окне на точечной диаграмме Р8С/88С в соответствии с размером и гранулярностью и в дальнейшем анализируют на экспрессию СЭ19. СЭ3 и маркеры активации (СЭ86. СЭ69). Данные рассчитывают из дот-блотов в виде процента положительно окрашенных клеток для активации маркеров в популяции СЭ19+ или СЭ3+ с использованием программного обеспечения ВЭ Се110е51.

Для оценки ингибирующего свойства соединений соединения сначала растворяли и разбавляли в ЭМ8О с последующим разбавлением 1:50 в среде. У мышей Ва1Ь/с выделяли спленоциты ресуспендировали и переносили в 96-луночные планшеты, как описано выше, (200 мкл/лунку). В планшеты добавляют разбавленные соединения или растворитель (25 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем стимулируют культуры 25 мкл тАЬ против 1дМ/лунку (конечная концентрация 30 мкг/мл) в течение 24 ч при 37°С и окрашивают антителом против СЭ86-Р1ТС мыши и антителом против СЭ19-РегСР мыши (2 мкл каждого антитела/лунку). Экспрессию СЭ86 на СЭ19-положительных В-клетках количественно определяют посредством проточной цитометрии, как описано выше.

2.3. Определение активации В-клеток крысы.

Было выявлено, что Р13К5 модулирует функцию В-клеток, когда клетки стимулируют посредством В-клеточного рецептора (ВСК) (ОккепЛаид е! а1., 8с1епсе 297:1031 (2002). Для оценки ингибирующего свойства соединений в отношении активации В-клеток повышение экспрессии маркеров активации СЭ86 на В-клетках крысы, получаемых из цельной крови, измеряли после стимуляции антителом против 1дМ и рекомбинантным 1Ь-4. Молекула СЭ86 (также известная как В7-2) преимущественно экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках, включая В-клетки. Покоящиеся В-клетки экспрессируют СЭ86 на низких уровнях, но повышают уровень его экспрессии после стимуляции, например, ВСК или рецептором 1Ь-4. СЭ86 на В-клетках взаимодействует с СЭ28 на Т-клетках. Это взаимодействие является необходимым для оптимальной активации Т-клеток и для получения оптимального ответа 1дО1 (Саггепо е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1., 20:29 (2002)).

Забор крови у крыс.

Цельную кровь собирали из брюшной аорты взрослых самцов крыс БеШк (ЬЕХУ/НапНчб) оЬу с использованием 10 мл шприца с гиподермальной иглой, предварительно покрытой гепарином натрия. Кровь переносили в 50 мл пробирки Ра1соп и доводили концентрацию антикоагулянта до 100 Ед/мл.

Стимуляция В-клеток крыс и обработка специфическим ингибитором.

Для оценки эффектов ш уПго иммуносупрессивных лекарственных средств гепаринизированную кровь предварительно разбавляли до 50% средой. В качестве среды служили ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы (Аттеб кат. №1-26Р01-1) с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 2 мМ Ь-глутамина, 50 мг/мл декстрана 40 и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (РС8, Ре!ас1опе I, ОЛсо №10270-106). Затем к 190 мл предварительно разбавленной крови добавляли 10 мл предварительно разбавленного тестируемого соединения в 96-луночные планшеты с И-образным дном для микротитрования (Яипс) с получением 3-кратного серийного разведения с диапазоном концентраций от 20 до 0,0003 мМ. Контрольные лунки предварительно обрабатывали ЭМ8О с получением конечной концентрации 0,5% ЭМ8О. Культуры подготавливали в двух повторах, лунки перемешивали встряхиванием на планшетном шейкере (НеМо1рП ТПтатах 101; 30 с, скорость 900), набирали в пипетку и выливали и встряхивали на планшетном шейкере снова. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 1 ч. Затем 20 мл поликлональных АЬ козы против 1дМ крысы (8его!ес, кат. №302001) и добавляли 10 мл разбавленного рекомбинантного т1Ь-4 (1тшипо1оо18 №340085) с получением конечных концентраций 30 мкг/мл и 5 нг/мл соответственно. Планшеты смешивали встряхиванием на планшетном шейкере, как указано выше, и инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% СО₂.

Определение активации В-клеток проточной цитометрией.

После инкубации в каждую лунку добавляли 15 мл 25 мМ раствора ЕЭТА и встряхивали в течение

- 30 028031 мин для открепления прикрепившихся клеток. Затем для анализа поверхностных маркеров активации образцы окрашивали меченным РЕ-Су5 антителом против СИ45КА крысы (ΒΏ кат. №557015) для обеспечения выделения окна на В-клетках в анализе РАС8. Кроме того, образцы окрашивали меченным РЕ антителом против СИ86 крысы (ΒΏ кат. №551396). Все процедуры окрашивания проводили при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. После инкубации образцы переносили в 96-луночные планшеты для микротитрования с глубокими лунками с У-образным дном (Согшпд №396096), содержащие 2 мл/лунке лизирующего раствора Βϋ (ΒΏ №349202). После лизиса эритроцитов образцы промывали 2 мл С'е11№А8Н (ΒΏ №349524). Данные получали на проточном цитометре Ь8КП или РАС8сайЬиг (ΒΏ Β^οзс^еηсез) с использованием программного обеспечения Сейциез! Р1из или Э1УА (версия 6.1.1), соответственно. Лимфоциты выделяли в окно в дот-блоте Р8С/88С в зависимости от размера и гранулярности и дополнительно анализировали в отношении экспрессии СИ45КА и маркеров активации. Данные рассчитывали из дот-блотов или гистограмм в виде процента клеток, положительно окрашенных на маркеры активации, в СИ45КА + популяции.

Статистическая оценка.

Процент ингибирования активации В-клеток после воздействия лекарственного средства рассчитывали по следующей формуле:

% ингибирования = 100 χ ^СТИМУ^ЛЯЦ^ИЯ без лекарственного средства - стимуляция лекарственным средством стимуляция без лекарственного средства - нестимулированные

Для аппроксимации нелинейной кривой регрессии использовали программное обеспечение ΟΚΙΟΙΝ 7 (ОпщпЬаЬ СогрогаПоп, ΝοΠίκιιηρΙοη. ΜΑ). Концентрацию лекарственного средства, приводящую к 50% ингибированию (1С₅₀) получали аппроксимацией уравнения Хилла к данным ингибирования.

2.4. Определение индуцированного ТРК9 1Ь-6 в спленоцитах мыши.

Получение суспензии отдельных клеток из селезенки мыши.

Непосредственно после эвтаназии у мышей С57Β^/6 извлекали селезенки. Из селезенок удаляли избыток жира перед растиранием селезенки через 0,4 мкМ сетчатый фильтр для клеток с использованием плунжера от 5 мл шприца. Получали суспензию отдельных клеток и доводили объем до 15 мл в 50 мл пробирки Ра1соп с использованием холодного ΓΒδ. Перед удалением супернатанта клетки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С и ресуспендировали в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов на селезенку и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Перед центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С к клеткам добавляли ледяной РБ8 (30 мл). Удаляли супернатант и дважды промывали клетки 40 мл среды для культивирования спленоцитов мыши (ΜδСΜ). ΜδСΜ состояла из ΚΡΜΙ с добавлением 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 1х не являющихся незаменимыми аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ β-меркаптоэтанола и 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ΡΒδ). Клетки ресуспендировали в 10-20 мл ΜδСΜ и подсчитывали с использованием устройства для подсчета клеток СоиПезз. Из одной селезенки мышей С57Β^/6 получали приблизительно 60х10⁶ спленоцитов.

Стимуляция спленоцитов мыши и обработка специфическим ингибитором.

Спленоциты высевали в конечной плотности 2х10⁵ клеток/лунку в объеме 100 мкл в 96-луночные плоскодонные планшеты и инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37°С в течение 2-4 ч. Затем тестируемые соединения распределяли с использованием автоматического устройства регулируемой подачи жидкости с использованием заранее предварительно подготовленных планшетов с исходным раствором соединений. Исходные планшеты содержали соединения (в 90%/10% ΏΜδΟ/άά^Ο), приведенные к 8-10 единицам используя 2- или 3-кратные разбавления. Устройства регулируемой подачи жидкости дозировало 1 мкл каждого раствора из заранее подготовленного планшета с исходным соединением в лунку с соответствующем назначением в 96-луночном планшете. Конечная начальная концентрация соединений в культуре клеток составляла 10 мкМ. Конечная концентрация ΏΜδΟ в культурах клеток составляла 0,5%. Перед добавлением лиганда ТЕК, клетки инкубировали с соединениями в течение 1 ч. Затем добавляли 10х ЕС₈₀ концентрацию СрО1826 в объеме 20 мкл (для конечного объема культуры 200 мкл), после чего инкубировали культуры в течение ночи в увлажненном инкубаторе 37°С.

Определение интерлейкина-6 ЕР18А.

После культивирования в течение ночи планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем 150 мкл каждой культуры переносили в 96-луночные планшеты в У-образной формой дна и измеряли уровни 1Ь-6 с использованием коммерчески доступного набора сэндвич-ЕР18А для ΙΡ-6 мыши. В кратком изложении, планшеты покрывали в течение ночи захватывающим антителом, после чего блокировали в течение 1 ч ΓΒδ/0,1% ΒδΑ. Образцы и стандарты добавляли в объеме 50 мкл и инкубировали планшет в течение 2 ч при комнатной температуре. После удаления стандартов/образцов промывали планшет с использованием ΓΒδ/0,05% Тиееп, добавляли 50 мкл биотинилированного детектируемого антитела, после чего инкубировали планшет в течение 2 ч при комнатной температуре при встряхивании. Планшеты снова промывали перед добавлением 50 мкл стрептавидинапероксидазы хрены на лунку в течение 20 мин. После дополнительных промывания планшета 50 мкл ТМВ в каждую лунку добавляли субстрат и инкубировали планшеты в течение 20 мин перед добавлением 25 мкл/лунку останавливающего раствора. Уровни !Ь-6 измеряли с использованием планшетного ри- 31 028031 дера 8рес!гаМах 190 (450 нм) и анализировали с использованием программного обеспечения 8ойМах Рго и СгарЬРай Рпкт.

2.5. Определение индуцированного ТЬК9 1РИ-альфа в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) человека.

Получение РВМС из свежей крови человека.

Кровь человека (приблизительно 75 мл) собирали в 10 пробирок 8-Мопоуейе, содержащих гепарин (8-Мопоуейе 7,5 мл ИН гепарина 16 МЕд/мл крови; 8!агк!ей1). Подготавливали пробирки Ьеисокер™ (30 мл, №227290; Стешет Вю-опе) добавлением 15 мл среды для выделения лимфоцитов Ь8М1077™ на пробирку (№Л5-004; РАА ЬаЬогаЮйек) и центрифугированием в течение 30 с при 1000д. Приблизительно 25 мл крови переносили в пробирки Ьеисокер™ после разбавления равными частями РВ8 (без Са₂+/Мд₂+; №14190-094). Образцы центрифугировали при 800д в течение 20 мин при 22°С с использованием центрифуги ЕррепйогГ 5810К без торможения. Слой РВМС аккуратно удаляли с поверхности плазма:среда для разделения и переносили в чистую 50 мл пробирку. Клетки однократно промывали добавлением РВ8 (до 45 мл) и центрифугировали (1400 об/мин, 10 мин при 22°С) без торможения (с установленной скоростью 9) с использованием ЕррепйогГ 5810К. Осажденные клетки аккуратно ресуспендировали в среде (КРМ1 1640 + СЬйаМАХ-Е 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 10 мМ НЕРЕ8 и 5% об./об. РС8) и объединяли образцы. Компоненты среды 2-меркаптоэтанол (№31350-010; 50 мМ), Нерек (№15630-056, 1М) и КРМ1 1640 (1 ж) + С1п1аМАХ-1 (№ 61870-010) получали от СЬсо.

РС8 (№ 2-01Р36-1) получали от Анитей. РВМС подсчитывали с использованием автоматического устройства для подсчета клеток СопШекк® (образец предварительно разбавляли 1:10 в среде перед добавлением равного объема (10 мкл) трипанового синего). Клетки разбавляли до 4x10⁶ клеток/мл и высевали в 384-луночные планшеты (№353962; ВесЮп Оюктпкоп АС) с получением конечного объема 25 мкл (т.е. 1к10⁵ клеток/лунку).

Стимуляция РВМС и обработка специфическим ингибитором.

Соединения предварительно разбавляли в 100% об./об. ΌΜ8Ο (№41640-100 мл; 81дта-А1йпсЬ) с последующим переносом в среду (с получением конечной концентрации ΌΜ8Ο 0,25%). Клетки обрабатывали соответствующим разведением соединения (5 мкл) или контролем носителем (5 мкл) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С в увлажненном инкубаторе в воздухе с 5% (об./об.) СО₂. Клетки стимулировали СрС2216 (0,3 мкМ; №Йг1-Ьойиа; 1иу1уодеи) или контролем носителем (10 мкл/лунку) и инкубировали в течение 20 ч. Планшеты быстро центрифугировали (200xд в течение 2 мин при 22°С) и удаляли образцы супернатанта (30 мкл) для количественного определения уровней 1РИа.

Количественное определение 1РИа с использованием технологии АЛрЬаЫка.

Для количественного определения 1РИ-альфа использовали набор А1рЬаЫ8А интерферона человека (№АЬ264Р) от РегкгиЕ1тег. Получают свежую смесь антител, содержащую акцепторные гранулы, покрытые антителами против 1РИа (конечная концентрация 5 мг/мл) и биотинилированное антитело против 1РИа (конечная концентрация 0,5 нМ) и дозируют (5 мкл) в 384-луночные планшеты ОрЕркйе™ (№6007299; РегкгиЕ1тег). Получали разведения известных стандартов 1РИа (1РИа В (2Ь) человека) и совместно с клеточными супернатантами (5 мкл) добавляли в указанные выше планшеты. Планшеты быстро центрифугировали (плюс при 200д), покрывали адгезивной герметизирующей пленкой, перемешивали вихревым способом и инкубировали 1 час при комнатной температуре в темноте. Получали покрытые стрептавидином донорные гранулы (конечная концентрация 20 мг/мл) и добавляли в каждую лунку (5 мкл) в слабо освещенном месте (чувствительная к свету смесь). Планшеты инкубировали 30 мин при комнатной температуре (не следует планшеты центрифугировать или накрывать). После инкубации планшеты считывали с использованием мультипланшетного ридера Еиущюи™, снабженного функцией АЬРНА, применяя собственные стандартные настройки А1рЬа8сгееп устройства (например, общее время измерения: 550 мс, время возбуждения лазера 680 нм: 180 мс, зеркало: Ό640 ак, эмиссионный фильтр: М570\у, центральная длина волны 570 нм, полоса пропускания 100 нм, пропускание 75%). Получали данные для анализа и количественного определения уровней 1РИа.

Оценка и анализ данных.

Данные анализировали с использованием Ехсе1 ХЬ Ей 4.0 (Мюгокой) со встроенным ХЬЕй (ШВ5; версия 4.3.2). Конкретные концентрации 1РИа определяли после экстраполяции на стандартные кривые с использованием 1РИа В (2Ь) человека. Отдельные значения 1С₅₀ соединений определяли посредством нелинейной регрессии после аппроксимации кривых к экспериментальным данным.

3. Определение продукции антител к эритроцитам овцы (8КВС).

В кратком изложении крыс ОРА инъецировали в/в эритроцитами овцы на сутки 0 и обрабатывали перорально в течение четырех последовательных суток (с суток 0 по сутки 3) исследуемыми соединениями. Суспензии клеток селезенки получали на сутки 4 и высевали лимфоциты на мягкий агар в присутствии индикаторных клеток (8КВС) и комплемента. Лизис индикаторных клеток вследствие секреции специфического к 8КВС антитела (преимущественно подкласса 1дМ) и наличие комплемента приводили к бляшкам. Подсчитывали число бляшек на плашку и выражали в виде числа бляшек на селезенку.

- 32 028031

Иммунизация. Группы по пять самок крыс ОРА иммунизировали на сутки 0 2x10⁸/мл ЗКВС (получаемыми от ЬаЬога1огу Ашта1 Зегу1се§ БАЗ, Ыоуагйз Рйагта АО) в объеме 0,5 мл на крысу посредством в/в инъекции.

Обработка соединением. Животных обрабатывали соединением, суспендированным в 0,5% СМС, 0,5% Т\уееп 80, в течение 4 последовательных суток (сутки 0, 1, 2 и 3), начиная на сутки иммунизации. Соединение вводили перорально дважды в сутки с интервалом в 12 ч между дозами в применяемом объеме 5 мл/кг массы тела.

Получение суспензий клеток селезенки.

На 4-е сутки животных подвергали эвтаназии с использованием СО₂. Селезенки удаляли, взвешивали и хранили в пластиковых пробирках, содержащих 10 мл холодного (4°С) сбалансированного солевого раствора Хэнка (НВЗЗ; О1Ьсо, рН 7,3, содержащего 1 мг фенолового красного/100 мл) для каждой селезенки крысы. Селезенки гомогенизировали с использованием стеклянного гомогенизатора Поттера, оставляли на льду в течение 5 мин и переносили 1 мл супернатанта в новую пробирку. Клетки однократно промывали в 4 мл НВЗЗ, затем удаляли супернатанты и ресуспендировали осадки в 1 мл НВЗЗ. Определяли число лимфоцитов на селезенку посредством автоматического устройства для подсчета клеток и доводили суспензии клеток селезенки до концентрации клеток 30x10⁶/мл.

Анализ бляшкообразования.

Подготавливали чашки Петри с мягким агаром с 0,7% агарозой (ЗЕ!^А) в НВЗЗ.

Кроме того, подготавливали один мл 0,7% агарозы в пластиковых пробирках и хранили при 48°С на водяной бане. Добавляли приблизительно 50 мкл 30x10⁶/мл суспензии клеток селезенки и 50 мкл ЗКВС при 40x10⁸/мл, быстро перемешивали ^ог!ех) и переливали на подготовленные чашки с агарозой. Чашки Петри немного поворачивали для получения равномерного распределения клеточной смеси на слое агарозы. Чашки оставляли при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Затем добавляли 1,4 мл комплемента морской свинки (Наг1ап; 10%) и продолжали инкубировать еще в течение 60 мин при 37°С. Специфические к ЗКВС антитела, выделяемые высеянными Вклетками, связывались с антигеном (ЗКВС) в непосредственный близости от них. Эти комплексы антиген-антитело активировали комплемент и приводили к лизису ЗКВС, оставляя яркое пятно (бляшку) в красном слое эритроцитов. Бляшки подсчитывали с использованием микроскопа.

Для определения ингибирования образования бляшек использовали следующую ниже формулу:

% ингибирования = С*100/У-100, где V - среднее число бляшек/селезенка для группы носителя; С - среднее число бляшек/селезенка для группы, обрабатываемой соединением.

Ссылки.

МКЛете & А.А.Хогбт (1963), Р1ацие ГогтаПоп т адаг Ьу зтд1е апйЬобу-ргобистд се11з. Зшепсе 140:405.

МКЛете, А.А.Хогбт & С. Непгу (1963), Тйе адаг р1ацие 1есЬшдие 1ог гесодш/тд апйЬобу-ргобистд се11з. 1п: Се11 Воипб АпйЬоШез, В.Атоз & Н.Корго^зкц Ебз., А1з1аг 1пз1. Ргезз, Рййабе1рй1а рр.109-125.

Биологические данные.

Ферментативный анализ

Пример	Р13К-альфа (мкМ)	Р13К-дельта (мкМ)
Р1	0, 109	0, 003

Клеточные анализы

Пример	Клетка Р13Кб/1С5о [мкмоль/л]	Р.ИВ/1С50 СР86 [нмоль/л]
Р1	0, 011	7

- 33 028031

Список последовательностей <110> ыоуаггтз АС <120> ТВЕРДАЯ ФОРМА ПРОИЗВОДНОГО ДИГИДРОПИРИДООКСАЗИНА <130> РАТ055990А <160> 21 <170> Рагеппп уегзтоп 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 1 сдадаасасд атадаттата сдаадаас 28 <210> 2 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 2 тддтттаатд стдттсатас дтттдтсаат 30 <210> 3 <211> 76 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 3 дддасаадп гдгасааааа адсаддссас дааддадага гасагагдсд адаагагдаг 60 адастагасд аадааг 76 <210> 4 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 4 тассатаатт ссассассас сассддаааг гсссссгддг ггаагдсгдг ссасасдт 60 дгсааг 66 <210> 5 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственный

- 34 028031 <220>

<223> праймер <400> 5 сбадбддааб дтттастасс ааабдд 26 <210> 6 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 6 дббсаабдса бдсбдбббаа ббдбдб 26 <210> 7 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 7 дддддааббб ссддбддбдд бддбддаатг абддбасбад бддаабдббб асбассаааб 60 дда 63 <210> 8 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 8 адсбссдбда бддбдабддб дабдбдсбсс дббсаабдса бдсбдбббаа ббдбдб 56 <210> 9 <211> 61 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 9 дддассасбб гдгасаадаа адсбдддстб аадсбссдбд абддбдабдд гдабдбдсбс 60

с
<210>	10
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	искусственный
<220>
<223>	праймер

- 35 028031 <400> 10 дссадсагдс дадаагагда тадапатат даадаагага сс 42 <210> 11 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 11 дссгссасса ссгссдссгд дтаагдсг дпсагасдг пдгс 45 <210> 12 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 12 гасгадгссд ссгссассас сгссдссгсс ассассгссд сс 42 <210> 13 <211> 54 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 13 ассдаадсаг ссгссгссгс сгссгссгдд таагдсгд псагасдп гдгс 54 <210> 14 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 14 адсгссдгда гддгдагддг дагдгдсгсс адагсгдгад гстссдаа сгдгдгд 57 <210> 15 <211> 61 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 15 дддассасп гдгасаадаа адсгдддт аадсгссдгд агддгдагдд гдагдгдссс 60 с 61 <210> 16 <211> 45

- 36 028031 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 16 бссбссбссб ссбссбссбд дтттаатдст дббсабасдб ббдбс 45 <210> 17 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 17 абдсссссбд дддбддасбд ссссаб 26 <210> 18 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 18 сбасбдссбд ббдбсбббдд асасдб 26 <210> 19 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 19 аббааассад даддаддадд аддаддассс ссбддддбдд асбдссссаб дда 53 <210> 20 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 20 адсбссдбда бддбдабддб дабдбдсбсс сбдссбдббд бсбббддаса сдббдб 56 <210> 21 <211> 61 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> праймер <400> 21 дддассасбб бдбасаадаа адсбдддббб аадсбссдбд абддбдабдд бдабдбдсбс 60

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Безводная кристаллическая форма (1,1-диоксогексагидро-1лямбда*6*-тиопиран-4-ил)-{(3)-3-[1(6-метокси-5-метилпиридин-3-ил)-2,3-дигидро-1Н-пиридо[3,4-Ъ][1,4]оксазин-7-илокси]пирролидин-1ил}метанона, отличающаяся порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей следующие пики, данные при градусах 2-θ ±0,2°: 9,1, 10,2, 11,9, 13,0, 17,1, 17,7, 18,7, 20,3, 20,8, 26,0, 26,7, 23,2, 24,1, 24,8, 29,3, 27,4 и 21,4.
2. 2. Безводная кристаллическая форма по п.1 с рентгенодифракционным спектром, по существу, таким же, как спектр рентгеновской порошковой дифракции, представленный на фиг. 1.
3. 3. Безводная кристаллическая форма по п.1 с графиком дифференциальной сканирующей калориметрии, по существу, таким же, как график, представленный на фиг. 2.
4. 4. Применение формы по любому из пп.1-3 в качестве фармацевтического средства для лечения заболеваний или нарушений, которые опосредованы активностью ферментов Р13К.
5. 5. Комбинация для лечения заболеваний, которые опосредованы активностью ферментов Р13К, содержащая терапевтически эффективное количество формы по любому из пп.1-3 и одно или более терапевтически активных средств, выбранных из средств с иммуносупрессивной, иммуномодулирующей,

   - 37 028031 противовоспалительной, химиотерапевтической или противоинфекционной активностью.
6. 6. Применение формы по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний или нарушений, которые опосредованы активностью ферментов Р13К.
7. 7. Применение формы по п.6, где заболевания или нарушения опосредованы активностью изоформы Р13К5.
8. 8. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, которые опосредованы активностью ферментов Р13К, содержащая терапевтически эффективное количество формы по любому из пп.1-3 и один или более фармацевтически приемлемых носителей.
9. 9. Способ модулирования активности ферментов Р13К у индивидуума, включающий стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количества формы по любому из пп.1-3.
10. 10. Способ по п.9 модулирования активности изоформы РР3К5.
11. 11. Применение формы по любому из пп.1-3 для лечения нарушения или заболевания у индивидуума, опосредованного активностью изоформы РР3К5.