EA025894B1 - Соединения на основе микрорнк и способы модулирования активности mir-21 - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены композиции и способы для ингибирования активности miR-21. Композиции имеют определенные паттерны модификаций нуклеозидов, позволяющие получать сильные ингибиторы активности miR-21. Композиции можно применять для ингибирования miR-21, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с аномальной экспрессией miR-21, таких как фиброз и рак.

Description

В данном документе обеспечены способы и композиции для модуляции активности ιηίΒ-21. Описание известного уровня техники

МикроРНК (микроРНК), также известные как зрелые микроРНК, являются небольшими (имеющими длину приблизительно 18-24 нуклеотидов) молекулами некодирующих РНК, закодированными в геномах растений и животных. В некоторых случаях высококонсервативные эндогенно экспрессирующиеся микроРНК регулируют экспрессию генов путем связывания с З'-нетранслируемыми областями (3'ИТК) конкретных мРНК. Более 1000 различных микроРНК выявили в растениях и животных. Определенные зрелые микроРНК, по-видимому, происходят из длинных эндогенных первичных транскриптов микроРНК (также известных как при-микроРНК, при-тй, при-ииР или при-пре-микроРНК), которые часто имеют длину в несколько сотен нуклеотидов (Бее е! а1., ЕМВО 1., 2002, 21(17), 4663-4670).

Функциональные анализы микроРНК выявили, что эти небольшие некодирующие РНК способствуют различным физиологическим процессам у животных, включая контроль продолжительности развития, органогенез, дифференцировку, паттернинг, эмбриогенез, контроль роста и запрограммированную гибель клеток. Примеры конкретных процессов, в которых участвуют микроРНК, включают дифференцировку стволовых клеток, нейрогенез, ангиогенез, гемопоэз и экзоцитоз (обзор приведен в Лйаге/Оагс1а апб М18ка, □еуе1ортеп1, 2005, 132, 4653-4662).

Краткое описание настоящего изобретения

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ттР-21, и где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе.

В данном документе обеспечены способы ингибирования активности ттР-21, включающие приведение клетки в контакт с соединением, описанным в данном документе. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях ίη νίνο. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях ίη νίίτο.

В данном документе обеспечены способы лечения заболевания, ассоциированного с ιηίΡ-21. включающие введение субъекту, имеющему заболевание, ассоциированное с ιηίΡ-21, соединения, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления животное является человеком.

Соединения, описанное в данном документе, обеспечены для применения в терапии.

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηίΡ-21 (δΕβ ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3':

где каждый Ρ независимо представляет собой небициклический нуклеозид;

X равен от 1 до 4;

каждый Ν^Β независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид; и каждый Ν^ζ независимо представляет собой модифицированный нуклеозид.

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιπίΡ-21 (δΕβ ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5'-3':

где Ν^Μ независимо представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид; и Ν^ζ независимо представляет собой модифицированный нуклеозид.

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιπίΡ-21 (δΕβ ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'3':

где каждый Ρ представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид;

- 1 025894 каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и каждый Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηίΒ-21 (8ЕО ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'3':

где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηίΒ-21 (8Е0 ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5'-3':

где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I или III X равен 1, X равен 2, X равен 3 или X равен 4.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95 или на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности ιηίΒ-21 (8Е0 ГО Ν0:1).

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, нуклеиновое основание в положении 1 ιηίΒ-21 спарено с первым нуклеиновым основанием на 3'конце модифицированного олигонуклеотида.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из ΕΝΆ-нуклеозида, еЕ1-нуклеозида и ΕΝΑ-нуклеозида.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере два небициклических нуклеозида содержат сахарные фрагменты, отличающиеся друг от друга. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид имеет тот же тип сахарного фрагмента.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид представляет собой еЕЕнуклеозид. В определенных вариантах осуществления еЕЕнуклеозид представляет собой 8-еЕ1-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления еЕ1-нуклеозид представляет собой К-еЕ1-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид представляет собой ΕΝΑ-нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, β-Όрибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-Ометоксиэтилнуклеозида. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспечен- 2 025894 ных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид представляет собой β-Όдезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды. В таких определенных вариантах осуществления каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, самый крайний с 5'-конца и самый крайний с З'-конца небициклические нуклеозиды представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой βΌ-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, два небициклических нуклеозида представляют собой 2'-МОЕ-нуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I или III каждый нуклеозид К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I или III три нуклеозида К представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и один нуклеозид К представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере один цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый цитозин представляет собой 5метилцитозин. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, цитозин во втором положении модифицированного олигонуклеотида представляет собой 5-метилцитозин.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I К состоит из четырех связанных нуклеозидов Ν^Κ1-Ν^Κ2-Ν^Κ3-Ν^Κ4, где Ν^Κ1 представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид, и каждый из Ν^Κ2-Ν^Κ3-Ν^Κ4 представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1нуклеозид; каждый № представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1нуклеозид; каждый № представляет β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 8-еЕ1нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый К представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; каждый

N представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Όдезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III каждый К представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой β-Όдезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой §-еЕ1-нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой §-еЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:4, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В данном документе обеспечены способы ингибирования активности ттК-21, включающие приведение клетки в контакт с соединением, обеспеченным в данном документе. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях ίη νίνο. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях ίη νίίτο. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой фибробласт, клетку, характеризующуюся гиперпролиферацией, кератиноцит или клетку, находящуюся под действием гипоксии. В определенных вариантах осуществления фибробласт представляет собой фибробласт, характеризующийся гиперпролиферацией.

В данном документе обеспечены способы уменьшения экспрессии коллагена в клетке, включающие приведение клетки в контакт с соединением, обеспеченным в данном документе.

В данном документе обеспечены способы лечения, предупреждения или отсрочки начала заболевания, ассоциированного с ттК-21, включающие введение субъекту, имеющему такое заболевание, любого из соединений, обеспеченных в данном документе.

В определенных вариантах осуществления заболеванием является фиброз. В определенных вариантах осуществления фиброз является фиброзом почек, фиброзом легких, фиброзом печени, фиброзом сердца, фиброзом кожи, возрастным фиброзом, фиброзом селезенки, склеродермией или посттрансплантационным фиброзом.

В определенных вариантах осуществления фиброз является фиброзом почек и присутствует у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из гломерулосклероза, тубулоинтерстициального фиброза, ^Λнефропатии, интерстициального фиброза/атрофии канальцев; хронического повреждения почек, повреждение нефронов, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гломерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек и терминальной стадии почечной недостаточности.

В определенных вариантах осуществления фиброз почек возникает в результате острой или повторной травмы почки.

- 4 025894

В определенных вариантах осуществления фиброз является фиброзом печени и присутствует у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из хронического повреждения печени, инфекционного гепатита, неалкогольного стеатогепатита и цирроза.

В определенных вариантах осуществления легочный фиброз является идиопатическим легочным фиброзом, или субъект имеет хроническое обструктивное заболевание легких.

В определенных вариантах осуществления заболевание является воспалительным заболеванием.

В данном документе обеспечены способы стимулирования заживления ран у субъекта, включающие введение субъекту, имеющему острую или хроническую рану, любого из соединений, обеспеченных в данном документе.

В определенных вариантах осуществления хроническая рана является острой или хронической послеоперационной раной, проникающей раной, авульсионным повреждением, переломом, резаным повреждением, ожоговым поражением, рваной раной, укушенной раной, артериальной язвой, венозной язвой, пролежнем или диабетической язвой.

В определенных вариантах осуществления соединение местно вводят в рану.

В данном документе обеспечены способы лечения фибропролиферативного нарушения у субъекта, включающие введение субъекту любого из соединений, обеспеченных в данном документе.

Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать выбор субъекта, обладающего повышенной экспрессией шгК-21 в одной или нескольких тканях.

В определенных вариантах осуществления введение любого из соединений, обеспеченных в данном документе, субъекту снижает экспрессию коллагена.

В определенных вариантах осуществления субъект нуждается в улучшенной функции органов, где функция органов выбрана из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.

В определенных вариантах осуществления введение любого из соединений, обеспеченных в данном документе, улучшает функцию органов у субъекта, где функция органов выбрана из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.

Любой из способов, обеспеченных в данном документе, включает оценивание функции почек у субъекта, что может включать измерение уровня остаточного азота мочевины в крови субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение у субъекта клиренса креатинина; измерение у субъекта степени протеинурии; измерение у субъекта соотношения альбумин: Сг и/или измерение у субъекта количества выделяемой мочи.

Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать оценивание функции печени у субъекта, что может включать измерение в крови субъекта уровней аланинаминотрансферазы; измерение в крови субъекта уровней аспартатаминотрансферазы; измерение в крови субъекта уровней билирубина; измерение в крови субъекта уровней альбумина; измерение у субъекта протромбинового времени; измерение у субъекта степени асцита и/или измерение у субъекта степени энцефалопатии.

Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать оценивание функции легких у субъекта, что может включать измерение у субъекта жизненной емкости легких; измерение у субъекта форсированной жизненной емкости легких; измерение у субъекта объема форсированного выдоха за одну секунду; измерение у субъекта максимальной объемной скорости выдоха; измерение у субъекта скорости форсированного выдоха; измерение у субъекта максимальной произвольной вентиляции; определение у субъекта соотношения объема форсированного выдоха за одну секунду и форсированной жизненной емкости; измерение у субъекта соотношения вентиляция/перфузия; измерение у субъекта вымывания азотаи/или измерение абсолютного объема воздуха в одном или нескольких легких субъекта.

Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать оценивание у субъекта функции сердца, что может включать измерение у субъекта минутного объема сердца; измерение у субъекта ударного объема сердца; измерение у субъекта средней скорости систолического выброса; измерение у субъекта систолического давления крови; измерение у субъекта фракции выброса левого желудочка; определение у субъекта ударного индекса; определение у субъекта сердечного индекса; измерение у субъекта процентного снижения фракции выброса левого желудочка; измерение у субъекта средней скорости циркулярного укорочения волокон миокарда; измерение у субъекта характера скорости притока крови в левый желудочек; измерение у субъекта характера скорости потока крови через легочные вены и/или измерение максимальной скорости раннего диастолического движения фиброзного кольца митрального клапана субъекта.

Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать введение субъекту по меньшей мере одного терапевтического средства, выбранного из противовоспалительного средства, иммуносупрессивного средства, противодиабетического средства, дигоксина, вазодилататора, ингибиторов ангиотензин-11-превращающего фермента (АСЕ), блокаторов рецепторов ангиотензина II (АКВ), блокатора кальциевых каналов, динитрата изосорбида, гидралазина, нитрата, гидралазина, бета-блокатора, натрийуретических пептидов, гепариноида и ингибитора фактора роста соединительной ткани. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное средство, где нестероидное противовоспалительное средство необязательно выбрано из ибупрофена, ингибитора СОХ-1 и ингибитора СОХ-2. В определенных вариантах осуществле- 5 025894 ния иммуносупрессивное средство выбрано из кортикостероида, циклофосфамида и микофенолата мофетила. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид, где кортикостероид необязательно представляет собой преднизон. В определенных вариантах осуществления ингибиторы ангиотензин-П-превращающего фермента (АСЕ) выбраны из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла. В определенных вариантах осуществления блокаторы рецепторов ангиотензина II (АКБ) выбраны из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.

В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой рак. В определенных вариантах осуществления рак является раком печени, раком молочной железы, раком мочевого пузыря, раком предстательной железы, раком толстой кишки, раком легких, раком мозга, гемобластозом, раком поджелудочной железы, раком головы и шеи, раком языка, раком желудка, раком кожи или раком щитовидной железы. В определенных вариантах осуществления рак печени является гепатоклеточной карциномой. В определенных вариантах осуществления рак мозга является мультиформной глиобластомой. В определенных вариантах осуществления гемобластоз является острым миелогенным лейкозом, острым лимфоцитарным лейкозом, острым моноцитарным лейкозом, множественной миеломой, хроническим лимфоцитарным лейкозом, хроническим миелоидным лейкозом, лимфомой Ходжкина или неходжкинской лимфомой.

В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают применение по отношению к субъекту по меньшей мере одной дополнительной противораковой терапии. В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой применение средства, вызывающего повреждение ДНК, ингибитора пролиферации, антифолата, ингибитора рецепторов факторов роста, антиангиогенного средства, ингибитора рецепторных тирозинкиназ, ингибитора киназ, ингибитора факторов роста, цитотоксического средства, радиотерапию или хирургическое удаление опухоли. В определенных вариантах осуществления средство, вызывающее повреждение ДНК, представляет собой 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлорэтамин, мельфалан, митомицин С, митоксантрон, оксалиплатин, темозоломид или топотекан. В определенных вариантах осуществления антифолат представляет собой метотрексат, аминоптерин, тимидилатсинтазу, серингидроксиметилтрансферазу, фолилполиглутамилсинтетазу, д-глутамилгидролазу, глицинамидрибонуклеотидтрансформилазу, лейковорин, аминоимидазолкарбоксамидрибонуклеотидтрансформилазу, 5-фторурацил или переносчик фолатов. В определенных вариантах осуществления ингибитор рецепторов факторов роста представляет собой эрлотиниб или гефитиниб. В определенных вариантах осуществления ингибитор ангиогенеза представляет собой бевацизумаб, талидомид, карбоксиамидотриазол, ΤΝΡ-470, СМ101, ΙΡΝ-α, тромбоцитарный фактор-4, сурамин, 8И5416, тромбоспондин, антагонист УЕСРК. ингибиторный фактор ангиогенеза, получаемый из хрящевой ткани, ингибитор матриксных металлопротеиназ, ангиостатин, эндостатин, 2метоксиэстрадиол, текогалан, тетратиомолибдат, пролактин или линомид. В определенных вариантах осуществления ингибитор киназ представляет собой бевацизумаб, ΒΙΒν 2992, цетуксимаб, иматиниб, трастузумаб, гефитиниб, ранибизумаб, пегаптапниб, сорафениб, дазатиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нилотиниб, лапатиниб, панитумумаб, вандетаниб, Е7080, пазопаниб, мубритиниб или фостаматиниб.

В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, приводит в результате к уменьшению размера опухолей и/или числа опухолей. В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, предупреждает или задерживает увеличение размера опухолей и/или числа опухолей. В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, предупреждает или замедляет метастатическое прогрессирование. В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, увеличивает время общего выживания и/или выживание без прогрессирования у субъекта. В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают выбор субъекта с повышенным уровнем сывороточного альфа-фетопротеина и/или повышенным уровнем сывороточного дез-гамма-карбоксипротромбина. В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают снижение уровня сывороточного альфа-фетопротеина и/или сывороточного дез-гамма-карбоксипротромбина. В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают выбор животного с аномальной функцией печени.

В любом из способов, обеспеченных в данном документе, субъект является человеком.

В любом из способов, обеспеченных в данном документе, соединение присутствует в виде фармацевтической композиции.

Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в терапии. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в лечении фиброза. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в стимулировании заживления ран. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в лечении рака. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в предупреждении и/или

- 6 025894 отсрочке начала метастазирования.

Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в лечении заболевания сердца.

Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для лечения фиброза. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для стимулирования заживления ран. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для лечения рака. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для предупреждения и/или отсрочки начала метастазирования.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано соотношение альбумина и креатинина в моче (АСК, мкг А1Ь/мг Сг) в модели ишемии-реперфузии/нефрэктомии (ΙΚ/Νχ) на мышах, которым вводили соединения на основе антиШ1К21, как описано в примере 5.

На фиг. 2 показана экспрессия (А) коллагена 1А1 и (В) коллагена 3А1 в почках в модели ИИО на мышах, которым вводили соединения на основе анти-тгК21, как описано в примере 6.

Подробное описание

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, какое обычно понимает специалист в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Если не приводятся конкретные определения, номенклатура, используемая по отношению к аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии и их способам и методикам, описываемым в данном документе, хорошо известны и широко применяются в данной области техники. В случае если в данном документе имеются несколько определений терминов, преимущество имеют таковые из данного раздела. Для химического синтеза, химического анализа, получения, составления и доставки фармацевтических препаратов и лечения субъектов можно применять стандартные методики. Такие определенные методики и способы можно найти, например, в СатЬобубта1е МобШсабоик ίη Аибкеике Кекеагсб под редакцией §аи§у1 и Соок, Атепсап Сбет1са1 8оше1у, какбнщЮп Ό.Ο, 1994 и в Кепнпфоп'к Рбагтасеибса1 8аепсек, Маск РиЬбкЫид Со., ЕакЮп, Ра., 18-е издание, 1990; и которые включены в данный документ ссылкой для любых целей. В допустимых случаях все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и публикации, последовательности из СΕNΒАNΚ, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые ссылаются по всему полному раскрытию в данном документе, если не указано иное, включены ссылкой во всем объеме. Если ссылка делается на ИКЬ или другой подобный идентификатор или адрес, то понимают, что такие идентификаторы могут изменяться, и конкретная информация в интернете может изменяться, но путем поиска в интернете можно найти эквивалентную информацию. Ссылки на нее свидетельствуют о доступности и публичном распространении такой информации.

Перед тем как будут раскрыты и описаны настоящие композиции и способы, следует понимать, что терминология, использованная в данном документе, служит только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей. Следует отметить, что использованные в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Определения.

Фиброз означает образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани. В определенных вариантах осуществления фиброз имеет место как репаративный или реактивный процесс. В определенных вариантах осуществления фиброз имеет место в ответ на повреждение или поражение. Выражение фиброз следует понимать как образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в качестве репаративного или реактивного процесса, в отличие от образования фиброзной ткани как нормальной составляющей органа или ткани.

Субъект, предположительно имеющий означает субъекта, у которого проявляются один или несколько клинических индикаторов заболевания.

Субъект, предположительно имеющий фиброз означает субъекта, у которого проявляются один или несколько клинических индикаторов фиброза.

Фибробласт означает клетку, которая дает начало образованию соединительной ткани.

Фибропролиферативное нарушение означает нарушение, характеризующееся избыточной пролиферацией и/или активацией фибробластов.

Рак печени означает злокачественную опухоль печени, либо первичный рак, либо метастазирующий рак. В определенных вариантах осуществления рак печени включает, без ограничений, рак, происходящий из гепатоцитов, такой как, например, виды гепатомы и гепатоклеточной карциномы; фиброламеллярной карциномы и виды холангиокарциномы (или рака желчных протоков).

Метастазирование означает процесс, благодаря которому рак распространяется из места, где он

- 7 025894 впервые возник как первичная опухоль, в другие места локализации в организме. Метастатическое прогрессирование первичной опухоли отражается в нескольких стадиях, включая отделение от соседних клеток первичной опухоли, выживание в кровотоке и рост в месте вторичной локализации.

Время общего выживания означает период времени, в течение которого субъект остается в живых после диагностирования или лечения заболевания. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления время общего выживания представляет собой выживание после диагностирования. В некоторых вариантах осуществления время общего выживания представляет собой выживание после начала лечения.

Выживание без прогрессирования означает период времени, в течение которого субъект, имеющий заболевание, остается в живых без ухудшения течения заболевания. В определенных вариантах осуществления выживание без прогрессирования определяют путем определения стадии заболевания или проведения его количественной оценки. В определенных вариантах осуществления выживание без прогрессирования у субъекта, имеющего рак печени, определяют путем оценивания размера опухолей, числа опухолей и/или метастазирования.

Анти-тЖ означает олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, комплементарной микроРНК. В определенных вариантах осуществления анти-тЖ представляет собой модифицированный олигонуклеотид.

Анти-тЖ-Х, где тЖ-Х обозначает конкретную микроРНК, означает олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, комплементарной тЖ-Х. В определенных вариантах осуществления антишЖ-Х полностью комплементарна тЖ-Х. В определенных вариантах осуществления анти-тЖ-Х по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90 или по меньшей мере на 95% комплементарна тЖ-Х. В определенных вариантах осуществления анти-тЖ-Х представляет собой модифицированный олигонуклеотид.

тЖ-21 означает зрелую микроРНК с нуклеотидной последовательностью ИАОСииАиСАОАСИОАиОииОА (§ЕЦ ΙΌ N0:1).

Последовательность тЖ-21 со структурой типа стебель-петля означает последовательность со структурой типа стебель-петля с нуклеотидной последовательностью ИОиСОООиАОСииАисАОАсиоАиоииоАсиоииоААисисАиоосААСАССАоисоАиооосиоисиоАСА (§ец ГО N0:2).

Целевая нуклеиновая кислота означает нуклеиновую кислоту, с которой предназначено гибридизировать олигомерное соединение.

Нацеливание означает процесс конструирования и выбора нуклеотидной последовательности, которая будет гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой.

Нацеленный на означает с нуклеотидной последовательностью, которая будет позволять осуществлять гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой.

Захват мишени означает взаимодействие олигонуклеотида с микроРНК, которой он комплементарен, таким образом, чтобы изменять активность, экспрессию или уровень микроРНК. В определенных вариантах осуществления захват мишени означает взаимодействие анти-тЖ с микроРНК, которой она комплементарна, таким образом, чтобы ингибировать активность микроРНК.

Модуляция означает отклонение функции, количества или активности. В определенных вариантах осуществления модуляция означает увеличение функции, количества или активности. В определенных вариантах осуществления модуляция означает уменьшение функции, количества или активности.

Экспрессия означает любые функции и этапы, благодаря которым кодируемая геном информация превращается в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке.

5'-концевой целевой сайт означает нуклеиновое основание целевой нуклеиновой кислоты, комплементарное самому крайнему с З'-конца нуклеиновому основанию конкретного олигонуклеотида.

З'-концевой целевой сайт означает нуклеиновое основание целевой нуклеиновой кислоты, комплементарное самому крайнему с 5'-конца нуклеиновому основанию конкретного олигонуклеотида.

Область означает часть из связанных нуклеозидов в нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную области целевой нуклеиновой кислоты. Например, в определенных подобных вариантах осуществления олигонуклеотид комплементарен области последовательности микроРНК со структурой типа стебельпетля. В таких определенных вариантах осуществления олигонуклеотид полностью комплементарен области последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля.

Сегмент означает меньшую часть или субфрагмент области.

Нуклеотидная последовательность означает порядок смежных нуклеиновых оснований в олигомерном соединении или нуклеиновой кислоте, как правило, перечисленных в ориентации 5'-3', независимо от какой-либо модификации сахаров, связей и/или нуклеиновых оснований.

Смежные нуклеиновые основания означают нуклеиновые основания, непосредственно прилегающие друг к другу в нуклеиновой кислоте.

Комплементарность нуклеиновых оснований означает способность двух нуклеиновых оснований к нековалентному спариванию посредством образования водородных связей.

- 8 025894

Комплементарный означает, что одна нуклеиновая кислота способна гибридизироваться с другой нуклеиновой кислотой или олигонуклеотидом. В определенных вариантах осуществления комплементарный относится к олигонуклеотиду, способному гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой.

Полностью комплементарный означает, что каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида способно спариваться с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в целевой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид полностью комплементарен микроРНК, т. е. каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида комплементарно нуклеиновому основанию в соответствующем положении в микроРНК. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид, где каждое нуклеиновое основание обладает комплементарностью по отношению к нуклеиновому основанию в области последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля, полностью комплементарен последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля.

Процентная комплементарность означает процентную долю нуклеиновых оснований олигонуклеотида, комплементарных части целевой нуклеиновой кислоты, имеющей такую же длину. Процентную комплементарность вычисляют путем деления числа нуклеиновых оснований олигонуклеотида, комплементарных нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях в целевой нуклеиновой кислоте, на общее число нуклеиновых оснований в олигонуклеотиде.

Процентная идентичность означает число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте, идентичных нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях во второй нуклеиновой кислоте, деленное на общее число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота представляет собой микроРНК, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой микроРНК.

В определенных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.

Гибридизировать означает гибридизацию комплементарных нуклеиновых кислот, происходящую в результате комплементарности нуклеиновых оснований.

Несовместимость означает нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты, неспособное спариваться с нуклеиновым основанием в соответствующем положении второй нуклеиновой кислоты.

Идентичный применительно к нуклеотидным последовательностям означает имеющий такую же нуклеотидную последовательность независимо от модификаций сахаров, связей и/или нуклеиновых оснований и независимо от метилированного состояния любых присутствующих пиримидинов.

МикроРНК означает эндогенную некодирующую РНК, имеющую длину от 18 до 25 нуклеиновых оснований, являющуюся продуктом расщепления пре-микроРНК с помощью фермента Ищет. Примеры зрелых микроРНК находятся в базе данных микроРНК, известной как ттКВаке (ййр://тюгота.8апдег.ас.ик/). В определенных вариантах осуществления микроРНК сокращают как микроРНК или тЖ.

Пре-микроРНК или пре-тгК означает некодирующую РНК, имеющую шпилечную структуру, являющуюся продуктом расщепления при-тгК. с помощью рибонуклеазы, специфичной к двуцепочечным РНК, известной как ИтокИа.

Последовательность со структурой типа стебель-петля означает РНК, имеющую шпилечную структуру и содержащую последовательность зрелой микроРНК. Последовательности пре-микроРНК и последовательности со структурами типа стебель-петля могут перекрываться. Примеры последовательностей со структурами типа стебель-петля находятся в базе данных микроРНК, известной как тгКВаке (ййр://тютогпа. капдег. ас .ик/).

При-микроРНК или при-тгК. означает некодирующую РНК, имеющую шпильковую структуру, являющуюся субстратом для рибонуклеазы Итокйа, специфичной к двуцепочечным РНК.

Предшественник микроРНК означает транскрипт, происходящий из геномной ДНК и содержащий некодирующую структурированную РНК, содержащую одну или несколько последовательностей микроРНК. Например, в определенных вариантах осуществления предшественник микроРНК представляет собой пре-микроРНК. В определенных вариантах осуществления предшественник микроРНК представляет собой при-микроРНК.

МикроРНК-регулируемый транскрипт означает транскрипт, регулируемый с помощью микроРНК.

Моноцистронный транскрипт означает предшественник микроРНК, содержащий одну последовательность микроРНК.

Полицистронный транскрипт означает предшественник микроРНК, содержащий две или более последовательности микроРНК.

Затравочная последовательность означает нуклеотидную последовательность, содержащую от 6 до 8 смежных нуклеиновых оснований из нуклеиновых оснований 1-9 5'-конца последовательности зрелой микроРНК.

Соответствующая затравочной последовательности означает нуклеотидную последовательность, комплементарную затравочной последовательности и имеющую такую же длину, как затравочная последовательность.

- 9 025894

Олигомерное соединение означает соединение, содержащее несколько связанных мономерных субъединиц. Олигомерные соединения включают олигонуклеотиды.

Олигонуклеотид означает соединение, содержащее несколько связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга.

Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь означает 3'-5'-фосфодиэфирную связь между нуклеозидами.

Природный сахар означает сахар, обнаруживаемый в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).

Межнуклеозидная связь означает ковалентную связь между прилегающими нуклеозидами.

Связанные нуклеозиды означают нуклеозиды, соединенные с помощью ковалентной связи.

Нуклеиновое основание означает гетероциклический фрагмент, способный к нековалентному спариванию с другим нуклеиновым основанием.

Нуклеозид означает нуклеиновое основание, связанное с сахарным фрагментом.

Нуклеотид означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.

Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из ряда связанных нуклеозидов, означает соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, имеющий установленное число связанных нуклеозидов. Таким образом, соединение может включать дополнительные заместители или конъюгаты. Если не указано иное, соединение не включает каких-либо дополнительных нуклеозидов помимо таковых олигонуклеотида.

Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из ряда связанных нуклеозидов, означает соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, имеющий установленное число связанных нуклеозидов. Таким образом, соединение может включать дополнительные заместители или конъюгаты. Если не указано иное, соединение не включает каких-либо дополнительных нуклеозидов помимо таковых модифицированного олигонуклеотида.

Модифицированный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, имеющий одну или несколько модификаций в отношении встречающихся в природе конца, сахара, нуклеинового основания и/или межнуклеозидной связи. Модифицированный олигонуклеотид может содержать немодифицированные нуклеозиды.

Одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид означает модифицированный олигонуклеотид, не гибридизирующийся с комплементарной цепью.

Модифицированный нуклеозид означает нуклеозид, имеющий любое изменение по сравнению со встречающимся в природе нуклеозидом. Модифицированный нуклеозид может иметь модифицированный сахар и немодифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может иметь модифицированный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может иметь природный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой бициклический нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой небициклический нуклеозид.

Модифицированная межнуклеозидная связь означает любое изменение по сравнению со встречающейся в природе межнуклеозидной связью.

Фосфотиоатная межнуклеозидная связь означает связь между нуклеозидами, где один из немостиковых атомов является атомом серы.

Модифицированный сахарный фрагмент означает замещение и/или любое изменение по сравнению с природным сахаром.

Немодифицированное нуклеиновое основание означает встречающиеся в природе гетероциклические основания РНК или ДНК: пуриновые основания аденин (А) и гуанин (О) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) (включая 5-метилцитозин) и урацил (И).

5-метилцитозин означает цитозин, содержащий метальную группу, присоединенную к 5положению.

Неметилированный цитозин означает цитозин, не имеющий метальной группы, присоединенной к 5-положению.

Модифицированное нуклеиновое основание означает любое нуклеиновое основание, не являющееся немодифицированным нуклеиновым основанием.

Фуранозил означает структуру, содержащую 5-членное кольцо, состоящее из четырех атомов углерода и одного атома кислорода.

Встречающийся в природе фуранозил означает рибофуранозил, обнаруженный во встречающейся в природе РНК, или дезоксирибофуранозил, обнаруженный во встречающейся в природе ДНК.

Сахарный фрагмент означает встречающийся в природе фуранозил или модифицированный сахарный фрагмент.

Модифицированный сахарный фрагмент означает замещенный сахарный фрагмент или заменитель сахара.

Замещенный сахарный фрагмент означает фуранозил, не являющийся встречающимся в природе

- 10 025894 фуранозилом. Замещенные сахарные фрагменты включают, без ограничений, сахарные фрагменты, содержащие модификации в 2'-положении, 5'-положении и/или 4'-положении встречающегося в природе фуранозила. Определенные замещенные сахарные фрагменты являются бициклическими сахарными фрагментами.

Заменитель сахара означает структуру, не содержащую фуранозил и способную заменять встречающийся в природе фуранозил нуклеозида таким образом, чтобы полученный в результате нуклеозид был способен (1) включаться в состав олигонуклеотида и (2) гибридизироваться с комплементарным нуклеозидом. Такие структуры включают относительно простые изменения фуранозила, такие как кольца, содержащие различное число атомов (например, 4-, 6- или 7-членные кольца); замену кислорода фуранозила атомом, не являющимся кислородом (например, углеродом, серой или азотом); или как изменение числа атомов, так и замену кислорода. Такие структуры могут также содержать замещения, соответствующие таковым, описанным в отношении замещенных сахарных фрагментов (например, 6-членные карбоциклические бициклические заменители сахара, необязательно содержащие дополнительные заместители). Заменители сахара также включают более сложные замены сахара (например, некольцевые системы пептидной нуклеиновой кислоты). Заменители сахара включают без ограничения морфолино, циклогексенилы и циклогекситы.

2'-О-метиловый сахар или 2'-ОМе-сахар означает сахар, имеющий О-метиловую модификацию в 2'-положении.

2'-О-метоксиэтиловый сахар или 2'-МОЕ-сахар означает сахар, имеющий О-метоксиэтиловую модификацию в 2'-положении.

2'-О-фтор или 2'-Р означает сахар, имеющий фтормодификацию в 2'-положении.

Бициклический сахарный фрагмент означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7 членное кольцо (включая без ограничений фуранозил), содержащее мостик, соединяющий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что дает в результате бициклическую структуру. В определенных вариантах осуществления 4-7-членное кольцо является кольцом сахара. В определенных вариантах осуществления 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В таких определенных вариантах осуществления мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.

Сахарный фрагмент закрытой нуклеиновой кислоты (ΕΝΑ) означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик (СН₂)-0 между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.

Сахарный фрагмент ΕΝΑ означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик (СН₂)₂0 между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.

Сахарный фрагмент с закрепленным этилом (сЕ4) означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик СН(СН₃)-0 между 4' и 2' атомами кольца фуранозы. В определенных вариантах осуществления мостик СН(СН₃)-0 закреплен в δ-ориентации. В определенных вариантах осуществления (СН₂)₂-О закреплен в К-ориентации.

δ-сЕЕсахарный фрагмент означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий δ-закрепленный мостик СН(СН3)-0 между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.

К-сЕЕсахарный фрагмент означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий Кзакрепленный мостик СН(СН₃)-0 между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.

2'-О-метилнуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-О-метиловую модификацию сахара.

2'-О-метоксиэтилнуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-Ометоксиэтиловую модификацию сахара. 2'-О-метоксиэтилнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

2'-фторнуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-фтормодификацию сахара. 2'-фторнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

Бициклический нуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий бициклический сахарный фрагмент. Бициклический нуклеозид может иметь модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

сЕЕнуклеозид означает нуклеозид, содержащий сЕЕсахарный фрагмент. сЕЕнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

δ-сЕЕнуклеозид означает нуклеозид, содержащий δ-сЕЕсахарный фрагмент.

К-сЕЕнуклеозид означает нуклеозид, содержащий К-сЕЕсахарный фрагмент.

Небициклический нуклеозид означает нуклеозид, имеющий сахар, отличный от бициклического сахара. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид содержит встречающийся в природе сахар. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид содержит модифицированный сахар. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

β-Ό-дезоксирибонуклеозид означает встречающийся в природе ДНК-нуклеозид. β-Ό- 11 025894 дезоксирибонуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

β-Ό-рибонуклеозид означает встречающийся в природе РНК-нуклеозид. β-Ό-рибонуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

'ΈΝΛ-нуклеозид означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент ΌΝΑ.

ΕΝΑ-нуклеозид означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент ΕΝΑ.

Мотив означает паттерн модифицированных и/или немодифицированных нуклеиновых оснований, сахаров и/или межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде. В определенных вариантах осуществления мотив представляет собой нуклеозидный паттерн.

Нуклеозидный паттерн означает паттерн модификаций нуклеозидов в модифицированном олигонуклеотиде или его области. Нуклеозидный паттерн представляет собой мотив, описывающий расположение модификаций нуклеозидов в олигонуклеотиде.

Полностью модифицированный олигонуклеотид означает, что каждое нуклеиновое основание, каждый сахар и/или каждая межнуклеозидная связь модифицированы.

Единообразно модифицированный олигонуклеотид означает, что каждое нуклеиновое основание, каждый сахар и/или каждая межнуклеозидная связь имеют одну и ту же модификацию во всем модифицированном олигонуклеотиде.

Стабилизирующая модификация означает модификацию нуклеозида, обеспечивающую повышенную стабильность модифицированного олигонуклеотида в присутствии нуклеаз по сравнению с таковой, обеспеченной 2'-дезоксинуклеозидами, связанными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. Например, в определенных вариантах осуществления стабилизирующая модификация представляет собой стабилизирующую модификацию нуклеозида. В определенных вариантах осуществления стабилизирующая модификация представляет собой модификацию межнуклеозидной связи.

Стабилизирующий нуклеозид означает нуклеозид, модифицированный с обеспечением повышенной нуклеазной стабильности олигонуклеотиду по сравнению с таковой, обеспеченной 2'дезоксинуклеозидом. В одном из вариантов осуществления стабилизирующий нуклеозид представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид.

Стабилизирующая межнуклеозидная связь означает межнуклеозидную связь, обеспечивающую улучшенную нуклеазную стабильность олигонуклеотида по сравнению с таковой, обеспеченной фосфодиэфирной межнуклеозидной связью. В одном из вариантов осуществления стабилизирующая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

Субъект означает человека или животное, отличное от человека, выбранных для лечения или терапии.

Субъект, нуждающийся в этом означает статус, при котором субъекта идентифицируют как нуждающегося в терапии или лечении.

Субъект, предположительно имеющий означает субъекта, у которого проявляется один или несколько клинических индикаторов заболевания.

Введение означает предоставление субъекту фармацевтического средства или композиции и включает без ограничений введение медицинским работником и самостоятельное введение.

Парентеральное введение означает введение посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает без ограничений подкожное введение, внутривенное введение или внутримышечное введение.

Подкожное введение означает введение непосредственно под кожу.

Внутривенное введение означает введение в вену.

Внутрисердечное введение означает введение в сердце. В определенных вариантах осуществления внутрисердечное введение происходит с помощью катетера. В определенных вариантах осуществления внутрисердечное введение происходит с помощью операции на открытом сердце.

Легочное введение означает введение в легкие.

Вводимый сопутствующим образом относится к совместному введению двух средств любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих таковых проявляются у пациента одновременно. При сопутствующем введении не требуется, чтобы оба средства вводили в одной фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или используя один и тот же путь введения. Не требуется, чтобы эффекты обоих средств проявлялись в одно и то же время. Требуется только, чтобы эффекты перекрывались в течение определенного периода времени, и не требуется, чтобы они были одинакового протяжения во времени.

Продолжительность означает период времени, в течение которого продолжается активность или событие. В определенных вариантах осуществления продолжительность лечения представляет собой период времени, в течение которого вводят дозы фармацевтического средства или фармацевтической композиции.

Терапия означает способ лечения заболевания. В определенных вариантах осуществления терапия включает без ограничений химиотерапию, радиотерапию или введение фармацевтического средства.

Лечение означает применение одной или нескольких конкретных процедур, применяемых для из- 12 025894 лечения или улучшения течения заболевания. В определенных вариантах осуществления конкретная процедура представляет собой введение одного или нескольких фармацевтических средств.

Улучшение течения означает уменьшение тяжести по меньшей мере одного индикатора состояния или заболевания. В определенных вариантах осуществления улучшение течения включает отсрочку или замедление прогрессирования одного или нескольких индикаторов состояния или заболевания. Тяжесть индикаторов может определяться с помощью субъективных или объективных мер, известных специалистам в данной области.

Подверженный риску развития означает статус, при котором субъект предрасположен к развитию состояния или заболевания. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития состояния или заболевания, проявляет один или несколько симптомов состояния или заболевания, но не проявляет достаточного числа симптомов, чтобы у него можно было диагностировать состояние или заболевание. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития состояния или заболевания, проявляет один или несколько симптомов состояния или заболевания, но в меньшей степени, чем требуется для диагностирования состояния или заболевания.

Предупредить начало означает предупредить развитие состояния или заболевания у субъекта, подверженного риску развития заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития заболевания или состояния, получает лечение, подобное лечению, получаемому субъектом, у которого уже есть заболевание или состояние.

Отсрочить начало означает отсрочить развитие состояния или заболевания у субъекта, подверженного риску развития заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития заболевания или состояния, получает лечение, подобное лечению, получаемому субъектом, у которого уже есть заболевание или состояние.

Терапевтическое средство означает фармацевтическое средство, применяемое для излечения, улучшения течения или предупреждения заболевания.

Доза означает установленное количество фармацевтического средства, обеспеченного в одном введении. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить в двух или более болюсах, таблетках или инъекциях. Например, в определенных вариантах осуществления, где необходимо подкожное введение, для необходимой дозы требуется объем, который нелегко предоставить посредством одной инъекции. В таких вариантах осуществления можно применять две или более инъекций для достижения необходимой дозы. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить в двух или более инъекциях для того чтобы свести к минимуму реакцию в месте инъекции у индивида. В определенных вариантах осуществления дозу вводят посредством медленной инфузии.

Единица дозирования означает форму, в которой обеспечено фармацевтическое средство. В определенных вариантах осуществления единица дозирования представляет собой флакон, содержащий лиофилизированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления единица дозирования представляет собой флакон, содержащий восстановленный олигонуклеотид.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству фармацевтического средства, обеспечивающему терапевтическую пользу животному.

Фармацевтическая композиция означает смесь веществ, подходящих для введения индивиду, включающую фармацевтическое средство. Например, фармацевтическая композиция может содержать стерильный водный раствор.

Фармацевтическое средство означает вещество, обеспечивающее терапевтический эффект при введении субъекту.

Активный фармацевтический ингредиент означает вещество в фармацевтической композиции, обеспечивающее необходимый эффект.

Улучшенная функция органа означает изменение функции органа в сторону нормального диапазона значений. В определенных вариантах осуществления функцию органа определяют путем измерения уровня молекул, обнаруживаемых в крови субъекта. Например, в определенных вариантах осуществления улучшенную функцию печени измеряют по уменьшению уровней печеночной трансаминазы в крови.

Приемлемый профиль безопасности означает картину побочных эффектов, находящуюся в клинически приемлемых пределах.

Побочный эффект означает физиологический ответ, связанный с лечением, отличный от необходимых эффектов. В определенных вариантах осуществления побочные эффекты включают без ограничений реакции в месте инъекции аномалии функциональных проб печени, аномалии почечной функции, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы и виды миопатии. Такие побочные эффекты можно выявить прямо или косвенно. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или аномалию функции печени. Например, повышенный уровень билирубина может указывать на гепатотоксичность или аномалию функции печени.

Реакция в месте инъекции означает воспаление или аномальное покраснение кожи в месте инъекции у индивида.

Податливость субъекта означает соблюдение субъектом указаний в отношении рекомендованной или назначенной терапии.

- 13 025894

Следовать предписаниям означает соблюдение субъектом указаний в отношении рекомендованной терапии.

Рекомендованная терапия означает лечение, рекомендованное медицинским работником для лечения, улучшения течения, отсрочки или предупреждения заболевания.

Обзор.

Ш1К-21 является убиквитарно экспрессирующейся микроРНК, связанной с разнообразными клеточными процессами, включая дифференцировку клеток, пролиферацию, апоптоз и обновление матрикса. Кроме того, Щ1К-21 ассоциирована с несколькими заболеваниями. ιηίΚ-21 часто регулируется на повышенном уровне при раке, и ингибирование ιηίΚ-21 показало уменьшение роста опухоли в нескольких моделях рака на животных.

Ингибирование ιηίΚ-21 в модели гипертрофии сердца на животных показало роль ιηίΚ-21 в заболевании сердца. Роль в фиброзе была показана в моделях фиброза сердца, фиброза почек и фиброза легких на животных. Изучение ингибирования ιηίΚ-21 в модели на тканевых эксплантатах проиллюстрировало, что ингибирование ιηίΚ-21 стимулирует заживление ран. Ингибиторы ιηίΚ-21 как таковые применимы в разнообразных условиях научных исследований и клинических условиях.

Чтобы идентифицировать сильные ингибиторы ιηίΚ-21. было создано большое число соединений на основе анти-пиК-2Е Соединения варьировали по длине, а также по числу, размещению и идентичности бициклических нуклеозидов и небициклических нуклеозидов. Исходную серию соединений тестировали в ίη νίίτο анализе с применением люциферазы, в котором идентифицировали подгруппу соединений как активные соединения, являющиеся активными соединениями ίη νίίτο. Эти ίη νίίτο активные соединения затем тестировали в ίη νίνο анализах, чтобы идентифицировать те соединения, которые являются сильными ингибиторами ιηίΚ-21 ίη νίνο. Из первоначальных ίη νίίτο и ίη νίνο этапов скрининга выбирали определенные соединения в качестве основы для создания дополнительных соединений. Экспериментально наблюдаемые корреляции между структурой и активностью (как ίη νίίτο, так и ίη νίνο) применяли для информационного обеспечения создания этих дополнительных соединений, с дополнительными изменениями длины, отбора и расположения бициклических и небициклических нуклеозидов. Скрининговые анализы ίη νίίτο и ίη νίνο затем повторили в отношении этих дополнительных соединений. Определенные соединения также тестировали на другие свойства, например восприимчивость к активности экзонуклеаз. Наблюдали, что наиболее активные ίη νίίτο соединения, являющиеся наиболее активными ίη νίίτο, не обязательно были наиболее активными ίη νίνο соединениями, являющимися наиболее активными ίη νίνο, и, дополнительно, что некоторые умеренно активные ίη νίίτο соединения, являющиеся умеренно активными ίη νίίτο, были высокоактивными соединениями ίη νίνο. Среди 178 соединений, подвергнутых скринингу ίη νίίτο в ходе этого способа, 60 идентифицировали как активные в анализе с применением люциферазы. Среди этих 60 активных ίη νίίτο соединений идентифицировали подгруппу таковых как активные ίη νίνο. В ходе этого повторяющегося способа создания и скрининга соединений наблюдали, что соединения, имеющие конкретные паттерны модификаций бициклических и небициклических нуклеозидов, были сильными ингибиторами ιηίΒ-21 ίη νίνο. Эти соединения как таковые применимы для модуляции клеточных процессов, стимулируемых активностью тгК-21. Дополнительно, такие соединения применимы для лечения, предупреждения и/или отсрочки начала заболеваний, ассоциированных с тгК-21. Такие заболевания могут характеризоваться аномально высокой экспрессией ιηίΚ-21 по сравнению с образцами, не имеющими заболевания. Такие заболевания включают без ограничений фиброз, острое повреждение почек, гипертрофию сердца, инфаркт миокарда и рак. Дополнительно, композиции и способы, обеспеченные в данном документе, можно применять для стимулирования заживления ран.

Определенные модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на тгК-21.

В данном документе обеспечены модифицированные олигонуклеотиды, имеющие определенные паттерны бициклических и небициклических нуклеозидов. Модифицированные олигонуклеотиды с паттернами, идентифицированными в данном документе, являются эффективными ингибиторами активности т1К-21.

Каждый из нуклеозидных паттернов, проиллюстрированных в данном документе, показан в ориентации 5'-3'.

В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где последовательность модифицированного олигонуклеотида, состоящая из нуклеиновых оснований, комплементарна ιηίΒ-21 (δΕΟ ΙΌ N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3':

где каждый К представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; и каждый Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

- 14 025894

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 1. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 2. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 3. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 4.

В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна Ш1К-21 (8ЕЦ ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5'-3':

где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна Ш1К-21 (8ЕЦ ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'-3':

где каждый К представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4; каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и каждый Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III X равен 1. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 2. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III X равен 3. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III X равен 4.

В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна Ш1К-21 (8ЕЦ ГО N0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'-3':

где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна Ш1К-21 (8ЕЦ ГО Ν0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5'-3':

где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

Следующие варианты осуществления применяют к любому из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, включая нуклеозидные паттерны Σ-ν.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидного паттерна, описанного в данном документе.

- 15 025894

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна ιηίΚ-21 (§ЕЦ ГО N0:1). В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 95% комплементарна (5>Е0 ГО N0:1). В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна (8ЕЦ ГО N0:1).

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна Ш1К-21, так что положение 1 микроРНК спарено с отида. Например

5'-иАссиидисАОАсисАисиисА-З'

I I I I I I I I 1 ! I I I I I I I I I

3'-АТССААТАСТСТСАСТАСА-5'

5’-иАСсиилисАСАсосАисиисА-з' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3'-АТССААТАСТСТСАСТАСААСТ-5'

3'-концевым нуклеиновым основанием олигонукле(π>ίΚ-21; ЗЕО Ю N0:1) {анти-пи.Н-21; ЗЕС ΙΕ N0:3);

(ιτιίΚ-21; ЗЕО Ю N0:1) (анти-пц.К-21; 5Е<2 ΙΏ N0:4).

Следует понимать, что в §ЕЦ ГО N0:3 и §ЕЦ ГО N0:4 каждый Т в последовательности может независимо представлять собой либо нуклеиновое основание Т, либо нуклеиновое основание И, и что соединение, имеющее последовательность §ЕЦ ГО N0:3 или §ЕЦ ГО N0:4, может содержать все Т, все и или любую комбинацию и и Т. Таким образом, присутствие Т в различных положениях в §ЕЦ ГО N0:3 и 8Е0 ГО N0:4 во всем данном раскрытии и в сопроводительном перечне последовательностей не является ограничивающим по отношению к тому, представляет ли собой конкретное нуклеиновое основание Т или И.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из ЬНА-нуклеозида. сЕЕ нуклеозида и ЕNА-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления сахарные фрагменты по меньшей мере двух бициклических нуклеозидов отличаются друг от друга. В определенных вариантах осуществления все бициклические нуклеозиды имеют одинаковые сахарные фрагменты. В определенных вариантах осуществления каждый бициклический нуклеозид представляет собой сЕЕнуклеозид. В определенных вариантах осуществления каждый бициклический нуклеозид представляет собой Ь-НАнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, сЕЕнуклеозид представляет собой δ-сЕЕнуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, сЕЕнуклеозид представляет собой К-сЕЕнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, β-Ό-рибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, по меньшей мере два небициклических нуклеозида содержат сахарные фрагменты, отличающиеся друг от друга, и независимо выбраны из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, β-Ό-рибонуклеозида, 2'О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, по меньшей мере два небициклических нуклеозида содержат сахарные фрагменты, отличающиеся друг от друга, и независимо выбраны из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-Ометоксиэтилнуклеозида.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид имеет один и тот же тип сахарного фрагмента и выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, β-Ό-рибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-Ометоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-Ометилнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, не более 3 небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О- 16 025894 метоксиэтилнуклеозиды. В определенных вариантах осуществления не более 2 небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды. В определенных вариантах осуществления не более 1 небициклического нуклеозида представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, один небициклический нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ-нуклеозид, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления два небициклических нуклеозида представляют собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Όдезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления три небициклических нуклеозида представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, самый крайний с 5'-конца небициклический нуклеозид и самый крайний с 3'-конца небициклический нуклеозид представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

В определенных вариантах осуществления любого нуклеозидного паттерна I, где X равен 4, каждый нуклеозид К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I, где X равен 4, два нуклеозида К представляют собой β-Όдезоксирибонуклеозиды, и два нуклеозида К представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I, где X равен 4, три нуклеозида К представляют собой β-Ό-дезоксирибонуклеозиды, и один нуклеозид К представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I К представляет собой Ν^-Ν^²Ν^-ΝΧ где Ν¹''¹ представляет собой 2'-МОЕ-нуклеозид, Ν^ι<2 представляет собой β-Όдезоксирибонуклеозид, Ν⁸³ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид, и Ν^ι<4 представляет собой βΌ-дезоксирибонуклеозид.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I К состоит из четырех связанных нуклеозидов где Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид, и каждый из

Ν^-Ν^-Ν*⁴ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-0метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО Ν0:4, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 1, и каждый нуклеозид К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой 2'-0-метоксиэтилнуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО Ν0:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 4, и каждый нуклеозид К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой 2'-0-метоксиэтилнуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО Ν0:4, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-0-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность 8Е0 ГО Ν0:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО Ν0:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-0-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность 8Е0 ГО Ν0:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II Ν^Μ представляет собой 2'-О- 17 025894 метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой ΕΝΑ-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; и X равен 1. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; X равен 1; и каждый № представляет собой немодифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый № представляет собой немодифицированный нуклеозид; каждый Ν^Β независимо выбран из 8-сЕ!-нуклеозида и ΕΝΑ-нуклеозида; и Ν^γ выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, 2'-Ометоксиэтилнуклеозида, 8-сЕ!-нуклеозида и ΕΝΑ-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; и каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; каждый Ν^Β независимо выбран из 8-сЕ!-нуклеозида и ΌΝΑ-нуклеозида; и Ν^γ выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, 8-сЕ!-нуклеозида и ΌΝΑнуклеозида. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый № представляет собой немодифицированный нуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и Ν^γ выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 8-сЕ!-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III К представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый № представляет собой β-Όдезоксирибонуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и Ν^γ выбран из β-Όдезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 8-сЕ!-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна III имеет нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β выбран из 8-сЕ!-нуклеозида и ΌΝΑ-нуклеозида; каждый № выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида; Ν^γ выбран из 2'-Ометоксиэтилнуклеозида, 8-сЕ!-нуклеозида, ΌΝΑ-нуклеозида и Ρ-Ό-дезоксирибонуклеозида; и Ν^ζ выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, ΕΝΑ-нуклеозида и 8-сЕ!-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна IV имеет нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый Ν выбран из β-Όдезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида; Ν^γ выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, 8сЕСнуклеозида и β-Ό-дезоксирибонуклеозида; и Ν^ζ выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 8-сЕ1нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна IV имеет нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; Ν^γ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 8-сЕ1нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна IV имеет нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Τ и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V Ν^Μ представляет собой 2'-Οметоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β выбран из 8-сЕ!-нуклеозида и ΌΝΑ-нуклеозида; каждый № выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-Ο-метоксиэтилнуклеозида; и Ν^ζ выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, ΌΝΑ-нуклеозида и 8-сЕ!-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна V имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ выбран из 2'-Ο-метоксиэтилнуклеозида и 8-сЕ!-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна V имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

- 18 025894

В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V Ν^Μ представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна V имеет нуклеиновую последовательность δΕβ ГО Ν0:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, имеет последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований и модификаций, как показано в табл. 1. Модификации нуклеозидов обозначаются следующим образом: нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Ь представляют собой ΌΝΆнуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом δ означают δ-сΕΐ-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Верхний индекс Ме означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.

Таблица 1

Соединения на основе анти-ииК-21

№ соединения	Последовательность и химизм (5’-3*)	5Е<Э № ΝΟ
25068		4
25070	АЕСаАТСзАОТСзТОАизААССзТАЕ	3
25072	ΑΕΥΑΓΤΕΟ^ΛΕΟΕΤΥ^ΤρΟττΑΕυ^ΛΕΛ^ΟρΟκΤρΑ^	3
25082	Тв^СААСзАТСзАОТСзТОЛизААОСзТАЕ	4
25922	АЕ”'С8АТ™С5Ает™С5ТСАТзААем'С5ТАв	3
25923	АвСзАТСзАСТСзТСАизААССзТАз	3
25924	Ае^СзАГ^СзАОТ^СзТОАТзААО^СзТАз “	3
25114	АЕ меСЕАТмеСьАОТм,СьТОАТ1ААОмеСьТА1,	3
25115	ЛЕ мсС, Л Г,',еС, АОТ'-С| ТОЛТ1,ААО'’сС,,ТЛ,.	3
25221	АвСзАТСзАОТСзТСАизААОСзивАз	3
25220	АвСзАТСзАзОТСзизОАизАзАОСзизАЕ	3

В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн I. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн II. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн III. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн IV. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн V.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид с любым из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, где по меньшей мере одно нуклеиновое основание представляет собой цитозин. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один цитозин представляет собой 5метилцитозин. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин представляет собой 5метилцитозин. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание.

Модифицированные олигонуклеотиды могут подвергаться расщеплению экзонуклеазами и/или эндонуклеазами в разных положениях по всей длине модифицированного олигонуклеотида. Продукты такого ферментативного расщепления могут сохранять ингибирующую активность в отношении ттР-21 и как таковые считаться активными метаболитами. Продукт метаболизма модифицированного олигонуклеотида как таковой можно применять в способах, описанных в данном документе.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на т1Р-21, имеет нуклеозидный паттерн, выбранный из табл. 2А, где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

- 19 025894

Продукты метаболизма нуклеозидного паттерна II

Таблица 2А

5’

3’

Ν-'

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν

Ν4

77

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'3

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'3

Ν2

ΝΒ

Ν4

Ν4

ΝΒ

Ν*3

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν*3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν'3

Ν2

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

ιΤ3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν2

Ν43

Ν

Ν43

77

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν*3

77

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν13

ΝΒ

Ν43

77

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν2

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν13

ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

ν’3

ΝΒ

Ν’3

Ν2,

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'3

Ν43

ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν2

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν'3

ΝΒ

ΝΒ

Ν43

Ν*3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν2

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν*3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν2

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν2

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν2

Ν

ν“

Ν4

Ν43

ν“

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

ΝΜ

ΝΒ

№

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν4

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν4

77

77

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν13

Ν'3

Ν43

ΝΒ

77

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν'3

Ν*3

ΝΒ

Ν4

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν44

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν13

ΝΒ

Ν13

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν4^

Ν43

ΝΒ

Ν*3

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

ν’3

№

ΝΒ

Ν44

Ν'3

Ν43

ΝΒ

ъ/3

Ν43

Ν13

ΝΒ

Ν43

Ν43

ν“

Ν'3

Ν'3

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν13

ΝΒ

Ν'3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

ΝΒ

Ν13

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

№

ΝΒ

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

ΝΒ

Ν13

Ν44

771

ΝΒ

Ν43

Ν43

77

77

Ν13

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν33

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν'3

77

Ν43

Ν43

77

77

Ν13

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на Ш1К-21, имеет нуклеозидный паттерн, выбранный из табл. 2В, где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

Таблица 2В

Продукты метаболизма нуклеозидного паттерна IV

5’

3’

ΝΜ

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'3

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν'3

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν*

Νζ

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν'3

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν1

Νζ

Ν43

Ν*3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν*3

ν“

ν'3

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'

Ν2

Ν43

ΝΒ

Ν*3

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν1

Ν2·

77

Ν43

77

Ν43

ΝΒ

Ν43

77

77

77

77

77

Ν43

ΝΒ

Ν1

77

Ν43

Ν43

Ν'3

Ν“

Ν'3

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν*

Ν2

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ν“

77

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν’

Ν2

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'

Νζ

ΝΒ

Ν13

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'

Νζ

Ν43

Ν43

Ν43

77

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

77

Ν2

Ν43

Ν13

Ν“

Ν43

Ν13

Ν43

ΝΒ

Ν'

Ν2

Ν43

77

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

ν“

Ν2

Ν“

ΝΒ

Ν'3

Ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν13

Ν43

ΝΒ

Ν'

ΝΜ

ΝΒ

Ν43

Ν'3

ν“

Ν43

Ν13

Ν'3

ν“

Ν43

Ν43

Ν’3

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

ΝΒ

Ν43

Ν'3

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'

ΝΒ

Ν43

ν'3

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν13

Ν43

ΝΒ

Ν*3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν13

Ν43

ΝΒ

Ν'

77

77

ΝΒ

77

77

77

77

Ν43

Ν43

77

ΝΒ

Ьг

77

77

ΝΒ

Ν43

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν4

Ν13

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν'3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν'

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

ιΈ

Ν43

ν“

Ν'3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν13

Ν“

Ν'3

Ν43

Ν43

Ν14

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν'

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν43

Ν43

ν“

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν'

Νυ

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν13

ΝΒ

77

77

Ν43

Ν“

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν'

Ν43

ΝΒ

Ν13

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν'3

Ν43

ΝΒ

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν14

Ν43

Ν'3

Ν43

Ν“

Ν'

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

Ν“

Ν'3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν'

Ν43

Ν13

Ν43

ΝΒ

Ν'3

Ν'3

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

ΝΒ

Ν43

Ν43

Ν43

ΝΒ

ν'

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на Ш1К-21, имеет нуклеозидный паттерн, выбранный из табл. 2С, где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый Ν^Β представляет собой бицик- 20 025894 лический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; и Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

Таблица 2С

Продукты метаболизма нуклеозидного паттерна VII

5’

3’

ТУ

Ν’

Ν1*

Ν’

ν’

Ν'*

Ν4’

Ν’

Ν’

Ν4

Ν'*

Ν’

ν’

ν'*

ν’

ν’

№

ТУ

Ν1*

Ν4

Ν“

ν

Ν4

Ν4

ν“

Ν’

Ν'*

Ν**

Ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

ν’

Ж

Νυ

Ν4

ν“

ΝΒ

Ν4

Ν'*

ν’

ΝΒ

Ν’*

Ν4

Ν’

ν’

Ν4

ТУ

ν’

ν’

Ж

Ν4

ν’

Ν’

Ν'*

№

ν’

Ν’

Ν1*

Ν**

Ν’

ν’

Ж

Ν'*

ν’

ν’

Ν*

ν’

Ν“

Ν4

Ν4

Νβ

ΝΒ

ίγ

Ν4

Ν’

ν’

Ν4

Ж

ν’

ν’

ΝΛ

Ν’

Ν**

Ν4

Ν’

Ν’

Ν4

Νυ

Νυ

Νυ

Ж

Ν'*

ν’

ν’

Ν

Ν1*

Ν'*

ΝΗ

ΝΒ

Ν'*

Νυ

Ν’

Ν’

Ж

Ν'*

ΝΒ

ΝΒ

Ν

Ν'*

Ν’

Ν’

Ν4

Νυ

Ν’

Ν’

Ж

Ж

Ν’

Ν’

Ж

Ν’

Ν’

Ν4

Ν'*

Ν’

Ν’

Ν4

Ж

ν’

ν’

Ν’

Ν’

Ν4

Ν'*

ТУ

ТУ

Ж

Ж

ν’

ν’

Ж

Ν'*

Ν4

Ν’

Ν’

Ж

ν'*

ν’

ν’

Ν2

Ν4

Ν’

ν’

Ж

Ж

ν’

ν’

Ν2

ΝΜ

ν’

Ν1*

Νυ

ν’

ν’

Ν'*

Ν**

Ν“

ΝΒ

Ν4

Ν4

Ν’

ν’

Ж

Ж

ν’

ν’

ТУ

Ν’

Νυ

Ν4

ν’

Ν11

Ν4

Ν'*

Ν’

Ν’

Ν'*

ж

Ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

Ν’

Νυ

Ν4

ν’

Ν’

Ν4

1Й*

ТУ

Ν’

Ν'*

Ν**

Ν’

ν’

Ν4

Ж

ν’

ТУ

ΝΒ

Ν1*

Ν4

ν’

Ν’

Ν4

Ν4

ΝΒ

ΝΒ

Ν1*

Ж

ν’

ν’

Ν4

Ж

ν’

Νυ

ν’

Ν’

Ν'*

Ν4

Ν’

Ν’

Ν1*

Ж

ТУ

ν’

ν'*

Ν'*

ν’

Ν’

Νυ

Ν4

ν’

Ν’

Ν1*

Ν4

Ν’

ΝΒ

Ν^

Ж

ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

Ν4

ΝΗ

ΝΒ

Ν4

Ν'*

ν“

Ν’

Ν**

Ν4

ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

Ν’

Ν4

Ν’

Ν’

Ν4

Ν4

ν’

Ν’

Ν4

Ж

ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

Ν

ΝΒ

Ν'*

Ν**

ν’

Ν’

Ν4

Ν4

ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

ν’

ν’

ΝΒ

Ν1*

Ν1*

ν’

Ν’

Ν'*

Ж

Ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

ΝΒ

Ν'*

Ν4

ν’

Ν’

Ν4

Ж

ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

ν’

Ν’

Ν'*

Ν**

ν’

ν’

Ν4

Ж

ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

Ν1*

Ν**

Ν’

ν’

Ν'*

Ж

ν’

ν’

Ν1*

ν'*

ν’

Ν’

Ν1*

Ν4

Ν’

Ν’

Ν1*

Ж

ν’

ν’

ν'*

ν'*

Ν’

Ν4

Ν’

Ν’

Ν4

Ν4

ν’

ν’

Ж

ν'*

Ν’

Ν’

Ν4

Ν’

Ν’

Ν4

Ж

ν’

ν’

ν'*

ν'*

ν’

Ν’

Ν’

Ν**

Ж

ν’

ν’

ν'*

Ж

ν’

ν’

Ν’

Ν’

Ν4

Ν4

ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

ν’

Ν4

Ν4

ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

Ν’

Νυ

Νυ

Ж

ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

Ν4

Ν4

ν’

ν’

Ж

ν'*

ν’

Ν’

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на тЖ.-21, имеет нуклеозидный паттерн и нуклеотидную последовательность, выбранные из табл. 3А. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом § означают §-сЕ1-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.

Продукты метаболизма соединения № 25070

Таблица 3А

5’

3’

Ν,

Ν,

Ν,

ν4

Ж

Ж

Ж

Ж

Ν,

Ν,„

Ν,,

N,2

Ж,

N,4

N,5

N,4

Ж,

Ν.»

Ν,,

Αε

С»

А

Т

Ся

А

О

т

Ся

т

0

А

Ия

А

А

0

Ся

т

Ае

с8

А

Т

А

С

т

Ся

т

О

А

Ия

А

А

О

Сб

т

Ае

А

т

Ся

А

С

т

Ся

т

0

А

Ия

А

А

с

Ся

т

Ае

т

Ся

А

О

т

Ся

т

0

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Ае

Ся

А

О

т

Ся

т

0

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Ае

А

О

т

Ся

т

с

А

и5

А

А

с

Ся

т

Ае

с

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

с

Ся

т

Ае

т

Ся

т

0

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Ае

Ся

т

0

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Ае

т

0

А

Ия

А

А

с

Ся

т

Ае

о

А

Ия

А

А

о

Ся

т

Ае

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Ае

Αε

ст

А

т

Ся

А

О

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Αε

Ск

А

т

Ся

А

О

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

О

с§

Ся

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

с

Ся

т

с5

А

т

с£

А

О

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

О

Ся

А

т

Ся

А

О

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

О

Ся

т

А

т

Ся

А

О

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

с

Ся

т

Ся

А

о

т

Ся

т

О

А

Ия

А

А

О

Ся

т

т

Ся

А

с

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

с

Ся

Ся

А

о

т

Ся

т

О

А

Ия

А

А

О

Ся

т

Ся

А

с

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

с

Ся

А

О

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

О

Ся

т

А

О

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

о

Ся

О

т

Ся

т

о

А

Ся

А

А

О

с&

т

с

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

с

Ся

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

0

Ся

т

т

Ся

т

о

А

Ия

А

А

с

Ся

Ся

т

о

А

Ия

А

А

с

Ся

т

Ся

т

с

А

Ия

А

А

с

Ся

т

0

А

Ия

А

А

О

Ся

т

т

σ

А

и5

А

А

с

Ся

I I I I 1 I г I Г 1 1 о | А 1 и_а IА | А I о | с₈ | т | |

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на

- 21 025894 тЖ-21, имеет нуклеозидный паттерн и нуклеотидную последовательность, выбранные из табл. 3В. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом 8 означают 8-сЕйнуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.

Таблица 3В

Продукты метаболизма соединения № 25923

5’

3'

Ν,

ν7

Ν,

N4

№

Ν6

Ν,

Ν,

Ν,

Ν,„

Ν„

Ν,,

Ν,,

N,4

Ν,,

Ν,ή

N,7

Ν,»

Ν,,

Ае

Ся

А

т

С8

А

О

т

Ся

т

С

А

и8

А

А

е

Ся

т

Ая

с5

А

т

Ся

А

С

т

Ся

т

0

А

и8

А

А

о

с8

т

Аз

А

т

Ся

А

С

т

Ся

т

О

А

Ся

А

А

о

Ся

т

Ая

т

Ся

А

с

т

Ся

т

0

А

ия

А

А

0

Ся

т

Аз

Ся

А

0

т

С9

т

е

А

и5

А

А

с

Ся

т

Ад

А

О

т

Ся

т

с

А

ия

А

А

е

Ся

т

Ая

с

т

Ся

т

0

А

ия

А

А

0

Ся

т

Ад

т

С5

т

с

А

и8

А

А

с

Ся

т

Ад

Ся

т

с

А

и8

А

А

с

Ся

т

Аз

т

о

А

ия

А

А

0

Ся

т

Ад

а

А

ия

А

А

0

Ся

т

Аз

А

ия

А

А

о

Ся

т

Аз

Ае

Ся

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

с

А

и8

А

А

с

Ся

т

Ае

Ся

А

т

А

О

т

Ся

т

е

А

и5

А

А

е

Ся

Ся

А

т

Ся

А

О

т

Ся

т

о

А

ия

А

А

о

Ся

т

Ся

А

т

Ся

А

о

т

Ся

т

С

А

ия

А

А

с

Ся

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

е

А

и8

А

А

е

Ся

т

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

0

А

и8

А

А

С

Ся

т

Ся

А

о

т

Ся

т

с

А

и8

А

А

с

Ся

т

т

Ся

А

с

т

Ся

т

е

А

и8

А

А

е

Ся

Ся

А

О

т

Ся

т

О

А

и5

А

А

О

Ся

т

Ся

А

О

т

Ся

т

0

А

и8

А

А

с

Ся

А

О

т

Ся

т

е

А

и8

А

А

е

Ся

т

А

с

т

Ся

т

с

А

и8

А

А

0

Ся

О

т

Ся

т

с

А

и8

А

А

е

Ся

т

О

т

Ся

т

с

А

и8

А

А

о

т

Ся

т

0

А

и8

А

А

0

Ся

т

т

Ся

т

0

А

ия

А

А

0

Ся

Ся

т

0

А

и»

А

А

0

Ся

т

Ся

т

о

А

ия

А

А

о

Ся

т

с

А

А

А

о

Ся

т

т

с

А

и8

А

А

е

Ся

о

А

и5

А

А

о

Сб

т

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на тЖ-21, имеет нуклеозидный паттерн и нуклеотидную последовательность, выбранные из табл. 3С. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом 8 означают 8-сЕйнуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.

- 22 025894

Таблица ЗС

Продукты метаболизма соединения № 25221

5’

3’

Ν,

Ν,

Ν,

ν5

Ν,

Ν»

Ν,

Ν,ο

Ν,,

N,2

Ν,,

Ν,»

N,5

Ν»

Ν,,

N..

Ν„

Ае

С®

А

т

Ся

А

О

т

Ся

т

О

А

и5

А

А

О

Ся

и5

Аз

Ся

А

т

Ся

А

С

т

Ся

т

С

А

и8

А

А

С

Ся

и®

А®

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

О

А

и5

А

А

С

С5

и®

Ая

т

Ся

А

с

т

Ся

т

0

А

и5

А

А

с

Ся

и®

Ая

С<?

А

0

т

Ся

т

0

А

ия

А

А

с

Ся

и.®

Ая

А

с

т

Ся

т

0

А

и®

А

А

О

Ся

и5

Аз

с

т

с5

г

о

А

υδ

А

А

с

С5

и3

Ая

т

Ся

т

0

А

и5

А

А

О

Ся

и®

Ая

Ся

т

0

А

Ся

А

А

0

Ся

Ня

Ая

т

0

А

и5

А

А

е

Сз

и5

Аз

с

А

и®

А

А

с

С8

и3

Аз

А

и5

А

А

с

С5

Ая

Ае

Ся

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

0

А

и®

А

А

0

Ся

Ар

Ся

А

т

Ся

А

0

т

Ся

т

е

А

и®

А

А

с

Ся

Ся

А

т

Ся

А

0

т

Ся

т

с

А

и®

А

А

с

Ся

Ся

А

т

Ся

А

с

т

Ся

т

с

А

и5

А

А

с

Ся

А

т

Ся

А

0

т

Ся

т

0

А

и®

А

А

с

Ся

и®

А

т

Ся

А

о

т

Ся

т

0

А

и®

А

А

о

Ся

т

Ся

А

с

т

Ся

т

с

А

и®

А

А

с

Ся

и®

т

Ся

А

0

т

Ся

т

0

А

и8

А

А

О

Ся

Ся

А

0

т

Ся

т

с

А

и®

А

А

0

Ся

и8

Ся

А

0

т

Ся

т

0

А

и®

А

А

с

Сз

А

0

т

Ся

т

0

А

и8

А

А

О

Ся

Ся

А

с

т

Ся

т

е

А

ия

А

А

с

Ся

с

т

Ся

т

С

А

ия

А

А

0

Ся

ия

0

т

Ся

т

0

А

и5

А

А

с

Ся

т

Ся

т

0

А

и»

А

А

О

Ся

т

Ся

т

0

А

и.,

А

А

0

Ся

Ся

т

с

А

и®

А

А

с

Ся

и®

Ся

т

с

А

и®

А

А

с

Ся

т

0

А

и5

А

А

0

С5

и®

т

0

А

А

А

с

Ся

О

А

и8

А

А

О

Ся

и5

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на тЖ-21, имеет нуклеозидный паттерн и последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований, выбранных из табл. 3Ό. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Όдезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕнуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом § означают δ-сЕС-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.

Таблица 3Ό

Продукты метаболизма соединения № 25220

5’

3’

Ν,

Ν,

Ν,

ν4

ν5

ν7

Ν,

Ν,

Ν,ο

Ν,,

N,2

Ν13

Ν,,

N,5

Ν,ί

Ν,;

Ν,„

Ν,,

Ае

Ся

А

т

Сз

Ая

0

т

Ся

и®

0

А

и®

А®

А

0

Ся

и®

Ав

Ся

А

т

Ся

Аз

о

т

Ся

и®

0

А

и®

Аз

А

0

Ся

и®

Ае

А

т

Ся

Аз

о

т

Ся

Ня

0

А

Ся

Аз

А

0

Ся

и®

Ае

т

Ся

Ая

о

т

Ся

и®

с

А

и®

Аз

А

е

Ся

и5

Ае

Ся

А§

0

т

Ся

ия

0

А

и®

Аз

А

о

Ся

и®

Ае

Ая

0

т

Ся

с

А

и8

Ая

А

0

Ся

и®

Ае

с

т

Ся

и®

0

А

ия

Аз

А

0

Ся

и®

Ае

т

Ся

и5

0

А

ия

Ая

А

с

Ся

и®

Ае

Ся

ия

с

А

и8

Ая

А

0

Ся

и®

Ае

и®

с

А

Ся

А3

А

с

Ся

и®

Ае

с

А

и®

А®

А

0

Сз

Оя

Ае

А

и$

А®

А

0

Ся

и®

Ае

Ае

Ся

А

т

Ся

Ая

0

т

Ся

и®

с

А

и8

Ая

А

с

Ся

и®

Ае

Ся

А

т

Ся

Аз

0

т

Ся

и®

с

А

и8

Аз

А

с

Ся

Ся

А

т

Ся

Ар

с

т

Ся

и?

6

А

и8

Ая

А

с

Ся

и®

Ся

А

т

Ся

Ая

с

т

Ся

и®

а

А

и®

Аз

А

с

Ся

А

т

Ся

А?

о

т

Сз

и5

с

А

и$

Ая

А

0

Ся

и5

А

т

Ся

Ая

0

т

Ся

и®

с

А

и$

Ая

А

0

Ся

т

Ся

Ая

0

т

Ся

и®

0

А

1>5

А3

А

с

Ся

и®

т

С?

Аз

0

т

Ся

и5

с

А

из

Ая

А

0

Сз

Ся

Аз

0

т

Ся

0

А

Ся

Ая

А

0

Ся

и$

Ся

Ая

о

т

Ся

и5

0

А

и5

Ая

А

о

Ся

Ая

0

т

Ся

и5

с

А

и®

Ая

А

с

Ся

и5

Ая

0

т

Сз

и3

с

А

и5

Ая

А

с

Ся

0

т

Ся

и®

с

А

и8

Аз

А

0

С»

и®

с

т

Ся

и?

0

А

Ся

Ая

А

0

Сз

т

Ся

и®

с

А

Ся

Ая

А

0

Ся

и®

т

Ся

и®

с

А

Ся

Ая

А

0

Ся

Ся

и®

0

А

и8

Аз

А

с

Ся

и®

Ся

и®

0

А

Ся

Ая

А

0

Ся

и®

с

А

и.,

Аз

А

с

Ся

и.

и®

с

А

Ся

Ая

А

о

Ся

с

А

Ся

Ая

А

0

Ся

и®

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из более чем 19 связанных нуклеозидов и содержит нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе. Нуклеозиды, присутствующие в дополнение к нуклеозидам, описанным нуклеозидным паттерном, являются

- 23 025894 либо модифицированными, либо немодифицированными. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 21 связанного нуклеозида и имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную тгК-21, может иметь нуклеозидный паттерн II длиной 19 связанных нуклеозидов. Дополнительные два нуклеозида могут состоять из модифицированных или немодифицированных сахарных фрагментов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 связанного нуклеозида и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе.

Определенные пути применения настоящего изобретения.

Модуляция активности тгК-21.

Соединения, обеспеченные в данном документе, являются сильными и специфичными ингибиторами активности тгК-21 и являются, таким образом, применимыми для модулирования активности тгК-21.

МикроРНК связываются с матричными РНК и подавляют их экспрессию. В некоторых случаях ингибирование активности микроРНК приводит к дерепрессии матричной РНК, т.е. экспрессия матричной РНК повышается на уровне РНК и/или белка. В данном документе обеспечены способы модулирования экспрессии тгК-21-регулируемого транскрипта, включающие приведение клетки в контакт с соединением согласно настоящему изобретению, где соединение содержит модифицированный олигонуклеотид с последовательностью, комплементарной т!К-21.

В определенных вариантах осуществления тгК-21-регулируемый транскрипт представляет собой ΥΟΌ1, и ингибирование тгК-21 приводит в результате к повышению уровня мРНК ΥΟΌ1. В определенных вариантах осуществления ттК-21-регулируемый транскрипт представляет собой РРАК-альфа, и ингибирование тгК-21 приводит в результате к повышению уровня мРНК РРАК-альфа. В определенных вариантах осуществления т!К-21-регулируемый транскрипт представляет собой ΚΝΡ167.

В определенных вариантах осуществления тгК-21-регулируемый транскрипт представляет собой 8РО20. В определенных вариантах осуществления ингибирование тгК-21 в печени приводит в результате к повышению уровня мРНК 8РО20.

В определенных вариантах осуществления после приведения клетки в контакт с соединением соласно настоящему изобретению наблюдают по меньшей мере 1,5-кратное повышение уровня мРНК тК21-регулируемого транскрипта. В определенных вариантах осуществления после приведения клетки в контакт с соединением согласно настоящему изобретению наблюдают по меньшей мере 2,0-кратное повышение уровня мРНК тгК-21-регулируемого транскрипта. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 2,5-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 3,0-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНКрегулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 3,5-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 4,0кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 4,5-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 5,0-кратно.

Определенные микроРНК, как известно, нацеливаются на несколько матричных РНК, в некоторых случаях на несколько сотен матричных РНК. Ингибирование активности одной микроРНК может привести к выявляемым изменениям экспрессии многих микроРНК-мишеней. В данном документе обеспечены способы модулирования нескольких тгК-21-регулируемых транскриптов, включающие ингибирование активности тгК-21, где происходят обширные изменения экспрессии генов.

В определенных вариантах осуществления после ингибирования тгК-21 с помощью соединения согласно настоящему изобретению могут наблюдаться фенотипические изменения. Такие фенотипические изменения могут происходить с выявляемыми изменениями экспрессии ттК-21-регулируемого транскрипта или без них.

Фибропролиферативные нарушения.

Нормальным физиологическим ответом на повреждение или поражение органа или ткани включается восстановление поврежденной ткани, что является фундаментальным биологическим процессом, необходимым для выживания. В ходе процесса восстановления после того как чужеродные материалы,

- 24 025894 бактерии и поврежденная ткань устраняются, фибробласты мигрируют в место поражения с отложением нового внеклеточного матрикса, который затем становится структурно организованным, что является частью фазы ремоделирования ткани.

Фибробласты являются наиболее распространенными клетками, обнаруживаемыми в соединительной ткани, и отвечают за синтез ретикулина и других эластических волокон, поддерживающих внеклеточный матрикс и играющих важную роль в нормальном заживлении ран (§етро№8к1 Ο.Ό. с1 а1., 2002. ГСоипб Кера1г Кедепегайоп. 3:120-131). Фибробласты отвечают за отложение коллагена, необходимого для восстановления пораженной ткани и возврата в прежнее состояние ее структуры и функции. В ходе процесса заживления ран активированные фибробласты превращаются в миофибробласты, являющиеся альфа-8МЛ+фибробластами, секретирующими коллаген. На начальных стадиях процесса заживления ран миофибробласты вырабатывают матриксные металлопротеазы, разрывающие базальную мембрану и позволяющие воспалительным клеткам эффективно мобилизоваться в место поражения. В ходе поздних стадий восстановления после поражения миофибробласты стимулируют закрытие раны, процесс, благодаря которому края раны перемещаются по направлению к центру раны. Таким образом, активность фибробластов является существенной для нормального процесса заживления.

Фибробласты, принимающие участие в нормальном процессе восстановления после поражения, могут происходить из локальных мезенхимальных клеток, мобилизованных из костного мозга, или быть полученными благодаря эпителиально-мезенхимальному переходу. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) описывает ряд быстрых изменений клеточного фенотипа (Ка11иг1 К. апб №ί1δοη Е.О. 2003. ί. С1ш. йуеЦ. 112:1776-1784), во время которых неподвижные эпителиальные клетки утрачивают межклеточные контакты, приобретают мезенхимальные признаки и проявляют миграционный фенотип. Резидентные фибробласты, инфильтрирующие фиброциты или перицитоподобные клетки могут также принимать участие в процессе восстановления после поражения.

В определенных условиях процесс восстановления ткани происходит в избытке, что приводит в результате к избыточному накоплению компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ) и существенному ремоделированию ЕСМ, что способствует образованию постоянного фиброзного рубца. Образование этой избыточной фиброзной соединительной ткани, процесс, известный как фиброз, способствует аномальным изменениям архитектуры ткани и препятствует нормальной функции органов.

Фиброз может иметь место в любой части организма и может являться результатом разнообразных физических, метаболических, ишемических, инфекционных, воспалительных или иммунологических поражений. Хотя места анатомической локализации, происхождение и клинические проявления фиброза могут различаться, существуют важные патологические признаки, общие для всех типов фиброза. Независимо от места локализации, в котором имеет место фиброз, фиброзный процесс включает секрецию и активацию профибротических цитокинов, рост и активацию популяций мезенхимальных клеток и синтез и организацию внеклеточного матрикса и, в конечном счете, приводит к разрушению нормальной ткани. Фиброз, если его оставить без лечения, может привести к разнообразным состояниям сердца, легких, почек, печени, глаз и кожи, среди других тканей.

Как демонстрируется в данном документе, ингибирование ттК-21 в модели фиброза приводит к пониженному отложению коллагена. Соответственно в данном документе обеспечены композиции и способы лечения, предупреждения и/или отсрочки начала фиброза, включающие введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен ттК-21, субъекту. Субъект с диагнозом фиброз может быть подвержен риску развития фиброза или может предположительно иметь фиброз.

В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет фиброз почек, фиброз легких, фиброз печени, фиброз сердца, фиброз кожи, возрастной фиброз, фиброз селезенки, склеродермию или посттрансплантационный фиброз.

Многие заболевания или аномалии почек характеризуются наличием фиброза. Соединения, обеспеченные в данном документе, как таковые применимы для лечения, улучшения течения, предупреждения и/или отсрочки начала развития любого заболевания почек, характеризующегося наличием фиброза. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние почек. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития фиброза, имеет заболевание или состояние почек. В определенных вариантах осуществления субъект, предположительно имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние почек. Соответственно в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фиброз, подверженного риску его развития или предположительно имеющего фиброз, где субъект имеет заболевание или состояние почек. Заболевание или состояние почек может быть одним или несколькими из, без ограничения, поражения нефронов, тубулоинтерстициального фиброза, ^Л-нефропатии, интерстициального фиброза/тубулярной атрофии, гломерулосклероза, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гломерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек, сахарного диабета, диабетической нефропатии, хронической рецидивирующей инфекции почек, гипертензии, системной гипертензии, интрагломерулярной гипертензии или терминальной стадии почечной недостаточности.

- 25 025894

Хроническое заболевание почек может характеризоваться наличием фиброза. Соответственно в определенных вариантах осуществления заболевание или состояние почек представляет собой хроническое заболевание почек. В определенных вариантах осуществления субъект подвержен риску развития хронического заболевания почек. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий острое повреждение почек, подвержен риску развития фиброза и/или хронического заболевания почек. Соответственно композиции и способы, обеспеченные в данном документе, можно применять в отношении субъекта, имеющего острое повреждение почек, для предупреждения или отсрочки начала развития фиброза и/или хронического заболевания почек.

В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет фиброз почек, возникающий в результате острой или повторной травмы почек. Травма может возникать в результате хирургического вмешательства, химиотерапии, обработки радиоактивным излучением, отторжения аллотрансплантата, хронического отторжения трансплантата и острого отторжения трансплантата.

В определенных вариантах осуществления фиброз почек может возникать в результате подвергания действию любого средства, которое может быть нефротоксичным, после острого или хронического воздействия. Такие средства включают фармацевтические средства, включая без ограничений аналгетики, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антибиотики, литий, циклоспорин, месалазин, контрастные средства, химиотерапевтические средства; профессиональные токсины, включая без ограничений тяжелые металлы; и токсины окружающей среды, включая без ограничений тяжелые металлы (например, кадмий, хлорид ртути) или растительные нефротоксины (например, аристолохиевая кислота).

Многие заболевания или аномалии печени характеризуются наличием фиброза. Соответственно в определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние печени. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития фиброза, имеет заболевание или состояние печени. В определенных вариантах осуществления субъект, предположительно имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние печени. Соответственно в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фиброз, подверженного риску его развития или предположительно имеющего фиброз, где субъект имеет заболевание или состояние печени. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние печени может быть одним или несколькими, без ограничений, из хронического повреждения печени, инфекционного вирусного гепатита (включая инфекционный вирусный гепатит С и инфекционный вирусный гепатит В), неалкогольную жировую болезнь печени (ΝΑΡΈΌ), неалкогольный стеатогепатит (ΝΑδΗ), алкогольную болезнь печени (ΑΕΌ), алкогольный стеатогепатит, мостовидный фиброз или цирроз. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние печени ассоциировано с воздействием токсичных химических веществ. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние печени возникает в результате воздействия фармацевтических средств, например ацетаминофена. В определенных вариантах осуществления субъект, получающий химиотерапию, подвержен риску развития фиброза печени и/или хронического повреждения печени.

Фиброз может присутствовать при многих заболеваниях или аномалиях легких. Соответственно в определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние легких. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития фиброза, имеет заболевание или состояние легких. В определенных вариантах осуществления субъект, предположительно имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние легких. Соответственно в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фиброз, подверженного риску его развития или предположительно имеющего фиброз, где субъект имеет заболевание или состояние легких. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние легких может быть одним или несколькими, без ограничений, из фиброза легких, идиопатического легочного фиброза или хронического обструктивного заболевания легких. В определенных вариантах осуществления фиброз легких может возникать в результате вдыхания частиц вещества, таких как обнаруживаемые в силикагеле, асбесте, загрязнителях воздуха или сигаретном дыме.

В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой фиброз сердца.

В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой фиброз кожи. В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой возрастной фиброз. В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой фиброз селезенки.

Склеродермия представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся фиброзом наряду с другими симптомами. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет склеродермию. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий склеродермию, имеет фиброз внутренних органов в дополнение к фиброзу кожи.

Фиброз часто имеет место в трансплантированных органах, что приводит к потере функции органа и, в конечном счете, к хроническому отторжению трансплантированного органа. Предупреждение или лечение фиброза в трансплантированных органах может предупреждать или задерживать хроническое отторжение трансплантированного органа, или, другими словами, может продлевать функционирование трансплантированного органа. Соответственно в определенных вариантах осуществления субъект имеет

- 26 025894 посттрансплантационный фиброз. В определенных вариантах осуществления посттрансплантационный фиброз представляет собой посттрансплантационный фиброз почек. В определенных вариантах осуществления фиброз, ассоциированный с трансплантацией, представляет собой посттрансплантационный фиброз печени. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, вводят перед трансплантацией. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, вводят одновременно с трансплантацией. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, вводят после трансплантации.

В данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фибропролиферативное нарушение. В определенных вариантах осуществления такие способы включают введение субъекту, имеющему или предположительно имеющему фибропролиферативное нарушение, модифицированного олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью, комплементарной микроРНК или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления микроРНК представляет собой Ш1К-21.

Рак и метастазирование.

При многочисленных типах рака демонстрировалась аномально высокая экспрессия Ш1К-21. Дополнительно, ингибирование т1К-21 в ίη νίίΓΟ и ίη νίνο моделях демонстрировало, что ингибиторы шгК21 применимы для ингибирования клеточных процессов, содействующих росту раковых клеток, а также для лечения рака.

Соответственно в определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, применяемые для лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала развития рака. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак печени, рак молочной железы, рак легких, рак толстой кишки, рак яичников, рак шейки матки, лейкоз, лимфому, рак мозга, рак пищевода, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак почки, меланому, миелому, рак полости рта, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы или рак яичка. В определенных вариантах осуществления рак печени представляет собой гепатоклеточную карциному. В определенных вариантах осуществления рак печени связан с метастазированием рака, возникшего в другой части организма, например рака костей, рака толстой кишки или рака молочной железы.

В определенных вариантах осуществления при раке печени уровень Ш1К-21 повышен, и уровень одного или нескольких ш1К-21-регулируемых транскриптов понижен. В определенных вариантах осуществления т!К-21-регулируемый транскрипт, уровень которого понижен, представляет собой δΡΟ20.

В определенных вариантах осуществления рак печени представляет собой гепатоклеточную карциному (НСС). Диагностирование гепатоклеточной карциномы, как правило, производят с помощью визуализационных тестов в отношении печени, таких как ультразвуковое исследование органов брюшной полости, сканирование при помощи спиральной компьютерной томографии (СТ) или сканирование при помощи трехфазной СТ. Такие визуализационные тесты можно выполнять в сочетании с измерением уровней альфа-фетопротеина в крови и/или уровней дез-гамма-карбоксипротромбина в крови. В отношении определенных субъектов можно применять МК1 вместо сканирования при помощи СТ. Визуализационные тесты в отношении печени позволяют определять оценку размера, числа, локализации, метастазирования опухолей вне печени, раскрытого состояния артерий и вен печени и/или инвазии опухоли в них. Данное определение оценки способствует принятию решения относительно того, какой режим терапевтического или паллиативного вмешательства является подходящим. Окончательный диагноз, как правило, подтверждается с помощью игольной биопсии и патогистологического исследования.

Соответственно в определенных вариантах осуществления рак печени выявляют после сканирования при помощи компьютерной томографии (СТ), выявляющей опухоли. В определенных вариантах осуществления рак печени выявляют после магнитно-резонансной томографии (МК1). В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется одной первичной опухолью. В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется несколькими первичными опухолями. В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется плохо определяемой первичной опухолью с паттерном инфильтрирующего роста. В определенных вариантах осуществления НСС представляет собой одну первичную опухоль с сосудистой инвазией. В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется несколькими первичными опухолями с сосудистой инвазией. В определенных вариантах осуществления НСС метастазирует в один или несколько лимфатических узлов. В определенных подобных вариантах осуществления лимфатические узлы являются региональными лимфатическими узлами. В определенных вариантах осуществления НСС метастазирует в одну или несколько отдаленных тканей. В определенных вариантах осуществления НСС метастазирует в другие области печени, воротную вену, лимфатические узлы, надпочечники, кости или легкие. В определенных вариантах осуществления присутствует фиброз.

Использовали ряд систем, чтобы определить прогноз в отношении НСС, включая систему ΤΝΜ, систему по Окуда, систему Барселонской клиники лечения рака печени (ВСЬС) и количественный показатель по системе СЫР. Каждая из этих систем включает четыре признака, признаваемые важными детерминантами выживания: тяжесть основного заболевания печени, размер опухоли, распространение опухоли в прилегающие структуры и наличие метастазов. Система ΤΝΜ классифицирует НСС как стадии I, II, III, IV или V. Система ВСЬС классифицирует НСС как стадии А1, А2, Α3, А4, В, С и Ό и включает рас- 27 025894 чет количественного показателя тяжести печеночной недостаточности согласно классификации по Чайлд-Пью.

В определенных вариантах осуществления рак печени классифицируют как стадию 1, стадию 2, стадию 3А, стадию 3В, стадию 3С или стадию 4. Стадия 1 характеризуется тем, что раковая опухоль имеет размер не больше 2 см и не начинает распространяться. На стадии 2 раковая опухоль поражает кровеносные сосуды печени или в печени находится более чем одна опухоль. На стадии 3А раковая опухоль имеет размер больше 5 см или распространяется в кровеносные сосуды возле печени. На стадии 3В раковая опухоль распространяется в близлежащие органы, такие как кишечник или желудок, но не распространяется в лимфатические узлы. На стадии 3С раковая опухоль может быть любого размера и распространяться в близлежащие лимфатические узлы. На стадии 4 раковая опухоль распространяется в части организма, расположенные далеко от печени, такие как легкие.

Биомаркеры в крови субъекта можно применять для дополнения диагностирования рака печени, определения стадии рака печени или разработки прогноза в отношении выживания. Такие биомаркеры включают опухолевые биомаркеры крови, такие как альфа-фетопротеин и дез-гаммакарбоксипротромбин. В определенных подобных вариантах осуществления у субъекта повышен уровень альфа-фетопротеина в крови. В определенных подобных вариантах осуществления у субъекта повышен уровень дез-гамма-карбоксипротромбина в крови.

Субъект, имеющий рак печени, также может страдать от аномальной функции печени. Оценку функции печени можно определить с помощью функциональных проб печени, в которых измеряют, помимо прочих параметров, уровни печеночных трансаминаз в крови. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий аномальную функцию печени, имеет повышенные уровни печеночных трансаминаз в крови. Печеночные трансаминазы крови включают аланинаминотрансферазу (АЬТ) и аспартатаминотрансферазу (А8Т). В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий аномальную функцию печени, имеет повышенный уровень билирубина в крови. В определенных вариантах осуществления субъект имеет аномальные уровни альбумина в крови.

В определенных вариантах осуществления оценку функции печени субъекта определяют по классификационной системе Чайлд-Пью, которая определяет три класса функции печени. В данной классификационной системе баллы присваивают в соответствии с измерениями в одной из пяти категорий: уровни билирубина, уровни альбумина, протромбиновое время, степень асцита и степень энцефалопатии. Один балл присваивают за каждую из следующих имеющихся характеристик: уровень билирубина в крови меньше 2,0 мг/дл; уровень альбумина в крови больше 3,5 мг/дл; протромбиновое время по показателю международного нормализованного отношения (INК) меньше 1,7; асцит отсутствует; или энцефалопатия отсутствует. Два балла присваивают за каждую из следующих имеющихся характеристик: уровень билирубина в крови 2-3 мг/дл; уровень альбумина в крови 3,5-2,8 мг/дл; протромбиновое время по ΓΝΚ 1,7-2,3; асцит от слабого до умеренного или энцефалопатия слабая. Три балла присваивают за каждую из следующих имеющихся характеристик: уровень билирубина в крови больше 3,0 мг/дл; уровень альбумина в крови меньше 2,8 мг/дл; протромбиновое время по ΓΝΚ больше 2,3; асцит от тяжелого до стойкого или энцефалопатия тяжелая. Количественные показатели складывают, и класс А присваивают по количественному показателю 5-6 баллов, класс В присваивают по количественному показателю 7-9 баллов, и класс С присваивают по количественному показателю 10-15 баллов.

Субъект, имеющий рак печени, мог ранее страдать от инфекции хронического гепатита С, инфекции хронического гепатита В, неалкогольной жировой болезни печени или цирроза или может страдать от них в настоящее время. Субъектов, имеющих рак печени, сопровождающийся инфекцией гепатита С, инфекцией гепатита В, неалкогольной жировой болезнью печени или циррозом и/или являющийся их результатом, можно лечить с помощью способов, описанных в данном документе.

Ответ субъекта на лечение можно оценивать с помощью тестов, подобных таковым, применяемым для диагностирования рака печени, включая без ограничений сканирование при помощи СТ, МЫ и игольную биопсию. Оценку ответа на лечение можно также определить путем измерения уровней биомаркеров в крови для сравнения с уровнями биомаркеров до лечения.

Ш1К-21 также связана с процессом метастазирования. Хотя ЕМТ имеет место при нормальных физиологических процессах, ЕМТ связан с процессом метастазирования. Значимость ЕМТ в прогрессировании опухолей изучали в нескольких исследованиях (ОгеепЬигд О. аик Нау Е., 1986. Эсу. ΒίοΙ. 115:363379; Воуег В. е1 а1., 1989. ί. Се11. Βΐά. 109:1495-1509; ИеБага Υ. е1 а1., 1992. ί. Се11. ΒίοΙ. 117: 889-894). Эпителиальные клетки объединяются с помощью интегринов в основной внеклеточный матрикс (ЕСМ), называемый базальной мембраной. Мезенхимальные клетки, с другой стороны, имеют способность инвазировать и перемещаться по трехмерной структуре ЕСМ. Следовательно, ЕМТ, по меньшей мере, поверхностно напоминает превращение нормальных прилипающих клеток в метастатический фенотип.

В данном документе обеспечены способы лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала метастазирования. Метастазирование может являться результатом миграции раковых клеток из любого первичного очага рака в любой вторичный очаг рака.

Острое повреждение почек.

Острое повреждение почек представляет собой быструю потерю функции почек, которая может

- 28 025894 быть вызвана многочисленными причинами, включая низкий объем крови, воздействие токсинов и мочевую обструкцию. В модели острого повреждения почек наблюдали повышенный уровень шЖ.-21. Соответственно в определенных вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, применяют для лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала развития острого повреждения почек. В определенных вариантах осуществления острое повреждение почек может быть результатом воздействия токсичных веществ, таких как токсины окружающей среды или противораковые терапевтические средства. Острое повреждение почек может возникать вследствие повреждения самой почки, например, при состояниях, таких как гломерулонефрит, острый тубулярный некроз и острый интерстициальный нефрит. В определенных вариантах осуществления острое повреждение почек вызвано обструкцией мочеточника, такой как связанная с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, камнями в почках, закупоренным мочевым катетером, камнями в мочевом пузыре, злокачественной опухолью мочевого пузыря, мочеточника или почек. В определенных вариантах осуществления острое повреждение почек может прогрессировать до фиброза и/или хронического заболевания почек. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, вводят субъекту с острым повреждением почек, чтобы предупредить или задержать начало развития фиброза и/или хронического заболевания почек. В некоторых вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, вводят субъекту для того, чтобы усилить восстановление после острого повреждения почек.

Заболевания сердца.

При заболевании сердца человека обнаруживали повышенную экспрессию тЖ-21, и ингибирование тЖ-21 в соответствующих моделях на животных продемонстрировало улучшения относительно фиброза сердца и функции сердца. Соответственно в определенных вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, применяют для лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала развития одного ил нескольких заболеваний сердца. В определенных вариантах осуществления заболевание сердца представляет собой фиброз сердца, увеличение сердца, гипертрофию сердца, расширение сердца, гипертрофическую кардиомиопатию, сердечную недостаточность, ремоделирование после инфаркта миокарда, инфаркт миокарда, кардиомиопатию (например, гипертрофическую кардиомиопатию, рестриктивную кардиомиопатию, дилатационную кардиомиопатию (ΌΟΜ), идиопатическую дилатационную кардиомиопатию или дилатационную кардиомиопатию с формами аритмии), диастолическую сердечную недостаточность, хроническую фибрилляцию предсердий, первичную легочную гипертензию, синдром острой дыхательной недостаточности, синдром Бругада, прогрессирующее поражение проводящей системы сердца, уремический перикардит, антрациклиновую кардиомиопатию, артериальный фиброз, лучевой фиброз лимфатических сосудов, саркоидоз, склеродермию, фиброэластоз эндокарда, избыточный серотонинергический эффект, поражение клапанов сердца, фиброз предсердий, фибрилляцию предсердий, митральный порок сердца, гипертензию, хроническую дисфункцию желудочка, перегрузку давлением и объемом или фиброз миокарда.

Клеточные процессы.

В данном документе обеспечены композиции и способы для снижения или предупреждения пролиферации или активации фибробластов. Также в данном документе обеспечены композиции и способы для ингибирования синтеза внеклеточного матрикса, который включает без ограничений синтез коллагена, фибронектина, коллагеназы или тканевого ингибитора металлопротеиназы.

В данном документе обеспечены способы модулирования клеточных процессов, связанных с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЕМТ). Такие способы включают приведение эпителиальной клетки в контакт с соединением, состоящим из модифицированного олигонуклеотида, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен тЖ-21. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт задерживает переход эпителиальной клетки к фибробласту. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт предупреждает переход эпителиальной клетки к фибробласту.

В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, может останавливать, замедлять или снижать пролиферацию раковых клеток. В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, может индуцировать апоптоз раковых клеток. В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, может снижать выживание раковых клеток.

В определенных вариантах осуществления эпителиальная клетка представляет собой раковую клетку. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт задерживает метастазирование раковой клетки. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт предупреждает метастазирование раковой клетки.

Некоторые клинические исходы.

В определенных вариантах осуществления применение соединений или способов, обеспеченных в данном документе, в результате приводит к одному или нескольким клинически желательным исходам у субъекта. Такие улучшения можно применять для определения степени, до которой субъект отвечает на лечение.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение

- 29 025894 течения фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является замедление дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является остановка дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является ослабление проявлений фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение содержания коллагена в органе, в котором имеется фиброз.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение течения фиброза в любом органе или ткани. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является замедление дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является остановка дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является ослабление проявлений фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение содержания коллагена в пораженном органе.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция почек. Оценку функции почек можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение уровня остаточного азота мочевины в крови субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение у субъекта клиренса креатинина; измерение у субъекта степени протеинурии; измерение у субъекта соотношения микроальбумин:креатинин; измерение у субъекта количества выделяемой мочи; измерение уровней мРНК молекулы повреждения почек-1 (ΚΙΜ-1) в моче и/или измерение уровней кластерина в моче.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция печени. Оценку функции печени можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение уровней аланинаминотрансферазы в крови субъекта; измерение уровней аспартатаминотрансферазы в крови субъекта; измерение уровней билирубина в крови субъекта; измерение уровней альбумина в крови субъекта; измерение у субъекта протромбинового времени; измерение у субъекта степени асцита и/или измерение у субъекта степени энцефалопатии.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция легких у субъекта, имеющего легочный фиброз. В определенных вариантах осуществления субъект имеет идиопатический легочный фиброз. Оценку функции легких можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение у субъекта жизненной емкости легких; измерение у субъекта форсированной жизненной емкости легких; измерение у субъекта объема форсированного выдоха за одну секунду; измерение у субъекта максимальной объемной скорости выдоха; измерение у субъекта скорости форсированного выдоха; измерение у субъекта максимальной произвольной вентиляции легких; определение у субъекта соотношения объема форсированного выдоха за одну секунду и форсированной жизненной емкости легких; измерение у субъекта соотношения вентиляция/перфузия; измерение у субъекта вымывания азота; измерение абсолютного объема воздуха в одном или нескольких легких субъекта и применение теста с 6-минутной ходьбой.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция сердца у субъекта, имеющего фиброз сердца. Оценку функции сердца можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение у субъекта минутного объема сердца; измерение у субъекта ударного объема сердца; измерение у субъекта средней скорости систолического выброса; измерение у субъекта систолического давления крови; измерение у субъекта фракции выброса левого желудочка; определение у субъекта ударного индекса; определение у субъекта сердечного индекса; измерение у субъекта процентного снижения фракции выброса левого желудочка; измерение у субъекта средней скорости циркулярного укорочения волокон миокарда; измерение у субъекта характера скорости притока крови в левый желудочек; измерение у субъекта характера скорости потока крови через легочные вены; измерение у субъекта пиковой скорости раннего диастолического движения фиброзного кольца митрального клапана.

В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение числа опухолей и/или уменьшение размера опухолей у субъекта, имеющего рак. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение числа раковых клеток у субъекта, имеющего рак. Дополнительные клинически желательные исходы включают увеличение времени общего выживания у субъекта и/или увеличение времени выживания без прогрессирования у субъекта. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает увеличение размера опухолей и/или числа опухолей. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает метастатическое прогрессирование. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, замедляет или останавливает метастатическое прогрессирование. В определенных

- 30 025894 вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает рецидив опухолей. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает рецидив метастазирования опухолей.

Оценку некоторых желательных клинических исходов можно определить с помощью измерений биомаркеров крови. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, может в результате приводить к снижению уровня альфа-фетопротеина в крови и/или уровня дез-гамма-карбоксипротромбина в крови. Введение соединения, обеспеченного в данном документе, может дополнительно приводить в результате к улучшению функции печени, о чем свидетельствует уменьшение уровней АЬТ и/или А8Т в крови.

Некоторые дополнительные терапевтические средства.

Методы лечения фиброза или любого из состояний, перечисленных в данном документе, могут включать применение более чем одного терапевтического средства. Соответственно в определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего или предположительно имеющего фиброз, включающие введение по меньшей мере одного терапевтического средства в дополнение к введению модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований, комплементарную ιηίΡ-21.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство включает фармацевтическое средство.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противовоспалительные средства. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой стероидное противовоспалительное средство. В определенных вариантах осуществления стероидное противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид. В определенных вариантах осуществления кортикостероид представляет собой преднизон. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. В определенных вариантах осуществления нестероидное противовоспалительное средство представляет собой ибупрофен, ингибитор С0X-I или ингибитор СОХ-2.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают иммуносупрессивные средства. В определенных вариантах осуществления иммуносупрессивное средство представляет собой кортикостероид, циклофосфамид или мофетил микофенолата.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противодиабетическое средство. Противодиабетические средства включают без ограничений бигуаниды, ингибиторы глюкозидазы, инсулины, сульфонилмочевины и тиазолидиндионы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают блокаторы рецепторов ангиотензина II (АКБ). В определенных вариантах осуществления блокатор рецепторов ангиотензина II представляет собой кандесартан, ирбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмисартан или эпросартан.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают без ограничений диуретики (например, спиронолактон, эплеренон, фуросемид), инотропные препараты (например, добутамин, милринон), дигоксин, вазодилататоры, ингибиторы ангиотензин-П-превращающего фермента (АСЕ) (например, представляющие собой каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фозиноприл и рамиприл), блокаторы кальциевых каналов, динитрат изосорбида, гидралазин, нитраты (например, мононитрат изосорбида, динитрат изосорбида), гидралазин, бета-блокаторы (например, карведилол, метопролол) и натрийуретические пептиды (например, несиритид).

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают гепариноиды. В определенных вариантах осуществления гепариноид представляет собой полисульфат пентозана.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой фармацевтическое средство, блокирующее один или несколько ответов на фиброгенные сигналы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой терапевтическое средство на основе антитела к фактору роста соединительной ткани. В определенных вариантах осуществления терапевтическое средство на основе антитела к СТСР представляет собой моноклональное антитело к СТСР.

В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может представлять собой фармацевтическое средство, усиливающее иммунную систему организма, включая низкодозовый циклофосфамид, тимостимулин, витамины и биологически активные добавки (например, антиоксиданты, включая витамины А, С, Е, бета-каротин, цинк, селен, глутатион, коэнзим С-10 и эхинацею) и вакцины, например комплекс с иммуностимулирующими свойствами (ЦЗС0М), содержащий вакцинный состав, в котором объединены мультимерная система презентации антигена и адъювант.

В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство выбрано для лечения или улучшения течения побочного эффекта одной или нескольких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Такие побочные эффекты включают без ограничений реакции в месте инъекции, аномалии функциональных проб печени, аномалии почечной функции, токсичность в отношении печени, токсичность в отношении почек, аномалии центральной нервной системы и формы

- 31 025894 миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на токсичность в отношении печени или аномалию функции печени. Например, повышенный уровень билирубина может указывать на токсичность в отношении печени или аномалию функции печени.

Еще одни примеры дополнительных фармацевтических средств включают без ограничений иммуноглобулины, включая без ограничений иммуноглобулин для внутривенного введения (1У1д); аналгетики (например, ацетаминофен); салицилаты; антибиотики; противовирусные средства; противогрибковые средства; модификаторы адренергических рецепторов; гормоны (например, стероидные анаболические средства, андроген, эстроген, кальцитонин, прогестин, соматостатин и тиреоидные гормоны); иммуномодуляторы; миорелаксанты; антигистаминные средства; средства против остеопороза (например, бифосфонаты, кальцитонин и эстрогены); простагландины, противоопухолевые средства; психотерапевтические средства; седативные средства; продукты, полученные из сумаха укореняющегося или сумаха лакового; антитела и вакцины.

Методы лечения рака часто включают применение более чем одного терапевтического средства. Соответственно в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы уменьшения или предупреждения метастазирования, включающие введение субъекту соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен Ш1К-21, и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, являющегося средством противораковой терапии.

В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой химиотерапию. Подходящие химиотерапевтические средства включают доцетаксел, циклофосфамид, ифосфамид, метотрексат, винбластин, цисплатин, 5-фторурацил, гемцитабин, доксорубицин, митомицин С, сорафениб, этопозид, карбоплатин, эпирубицин, иринотекан и оксалиплатин. Дополнительное подходящее химиотерапевтическое средство включает олигомерное соединение, отличное от композиции, нацеленной на Ш1К-21, обеспеченной в данном документе, которое применяют для лечения рака.

В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой радиотерапию. В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой хирургическое удаление опухоли. В определенных вариантах осуществления средство противораковой терапии представляет собой средство, вызывающее повреждение ДНК, ингибитор пролиферации, антифолат, ингибитор рецепторов факторов роста, антиангиогенное средство, ингибитор рецепторных тирозинкиназ, ингибитор киназ, ингибитор факторов роста или цитотоксическое средство.

В определенных вариантах осуществления средство, вызывающее повреждение ДНК, представляет собой 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлорэтамин, мельфалан, митомицин С, митоксантрон, оксалиплатин, темозоломид или топотекан.

В определенных вариантах осуществления антифолат представляет собой метотрексат, аминоптерин, тимидилатсинтазу, серингидроксиметилтрансферазу, фолилполиглутамилсинтетазу, гаммаглутамилгидролазу, глицинамидрибонуклеотидтрансформилазу, лейковорин, аминоимидазолкарбоксамидрибонуклеотидтрансформилазу, 5-фторурацил или переносчик фолатов.

В определенных вариантах осуществления ингибитор рецепторов факторов роста представляет собой эрлотиниб или гефитиниб.

В определенных вариантах осуществления ингибитор ангиогенеза представляет собой бевацизумаб, талидомид, карбоксиамидотриазол, ΤΝΡ-470, СМ101, ΙΡΝ-α, тромбоцитарный фактор-4, сурамин, 8И5416, тромбоспондин, антагонист ΥΕΟΡΚ, ингибиторный фактор ангиогенеза, получаемый из хрящевой ткани, ингибитор матриксных металлопротеиназ, ангиостатин, эндостатин, 2-метоксиэстрадиол, текогалан, тетратиомолибдат, пролактин или линомид.

В определенных вариантах осуществления ингибитор киназ представляет собой бевацизумаб, ΒΙΒ\ν 2992, цетуксимаб, иматиниб, трастузумаб, гефитиниб, ранибизумаб, пегаптаниб, сорафениб, дазатиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нилотиниб, лапатиниб, панитумумаб, вандетаниб, Е7080, пазопаниб, мубритиниб или фостаматиниб.

Некоторые последовательности микроРНК, состоящие из нуклеиновых оснований.

Модифицированные олигонуклеотиды, имеющие нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе, имеют последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований, которая комплементарна Ш1К-21 (8Еф ГО N0:1) или ее предшественнику (8Еф ГО N0:2). В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида способно подвергаться спариванию оснований с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в нуклеотидной последовательности ιηίΒ-21 или ее предшественника. В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида может иметь одну или несколько пар оснований с нарушением комплементарности по отношению к нуклеотидной последовательности шгК-21 или последовательности предшественника, и остается способной гибридизироваться с ее целевой последовательностью.

Поскольку последовательность штК-21 содержится в последовательности предшественника шгК-21,

- 32 025894 модифицированный олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную ттК-21, также комплементарен области предшественника ιηίΡ-21.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из числа связанных нуклеозидов, которое равно длине ιηίΡ-21.

В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида меньше длины т1К-21. Модифицированный олигонуклеотид с числом связанных нуклеозидов, которое меньше длины т!К-21, где каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида является комплементарным каждому нуклеиновому основанию при соответствующем положении ιηίΡ-21. считается модифицированным олигонуклеотидом с нуклеотидной последовательностью, которая полностью комплементарна области последовательность ιηίΡ-21. Например, модифицированный олигонуклеотид состоящий из 19 связанный нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание комплементарно соответствующему положению ιηίΡ-21. которая составляет 22 нуклеиновых оснований в длину, является полностью комплементарным области ιηίΡ-21 длиной 19 нуклеиновых оснований. Такой модифицированный олигонуклеотид характеризуется приблизительно 86% полной комплементарности к полной длине ιηίΡ-21. а также характеризуется 100% комплементарности к части ттК-21 длиной 19 нуклеиновых оснований.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной затравочной последовательности, т.е. модифицированный олигонуклеотид содержит соответствующую затравочную последовательность. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из шести нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 1-6 т!К-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 2-7 ттК-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 3-8 ттК-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из семи нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из семи нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 1-7 ттК-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из семи нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 2-8 ттК-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из восьми нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из восьми нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 1-8 ттК-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из восьми нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 2-9 ттК-21.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с одним несовпадением по отношению к нуклеотидной последовательности ттК-21 или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с двумя несовпадениями по отношению к нуклеотидной последовательности ттК-21 или ее предшественнику. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с не более двумя несовпадениями по отношению к нуклеотидной последовательности ттК-21 или ее предшественнику. В таких определенных вариантах осуществления несовпадающие нуклеиновые основания являются смежными. В таких определенных вариантах осуществления несовпадающие нуклеиновые основания не являются смежными.

В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида больше длины ттК-21. В таких определенных вариантах осуществления нуклеиновое основание добавочного нуклеозида является комплементарным нуклеиновому основанию последовательности ттК-21 со структурой типа стебель-петля. В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида на одну единицу больше длины ттК-21. В таких определенных вариантах осуществления дополнительный нуклеозид находится на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных таких вариантах осуществления дополнительный нуклеозид находится на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида на две единицы больше длины ттК-21. В таких определенных вариантах осуществления два добавочных нуклеозида находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления два добавочных нуклеозида находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид расположен на 5'конце, и один дополнительный нуклеозид расположен на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления область олигонуклеотида может быть полностью комплементарна нуклеотидной последовательности ттК-21, но весь модифицированный олигонуклеотид не полностью комплементарен ннК-21. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 24 связанных нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание нуклеозидов 1-23 комплементарно соответствующему положению ттК-21, которая составляет 22 нуклеиновых оснований в длину, имеет часть из 22 нуклеозидов, которая

- 33 025894 полностью комплементарна нуклеотидной последовательности т|К-21, и приблизительно 96% полной комплементарности нуклеотидной последовательности ипК-2 1.

Некоторые модифицированные олигонуклеотиды.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 8-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-16 связанный нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19-24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21-24 связанных нуклеозидов.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 8 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 9 связанный нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 10 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 11 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 13 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 связанного нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов.

Нуклеотидные последовательности, изложенные в данном документе, включающие без ограничения те, которые находятся в примерах и в перечне последовательностей, не зависят от любой модификации нуклеиновой кислоты. Поэтому нуклеиновые кислоты, определенные в §ЕЦ ΙΌ ΝΟ, могут независимо содержать одну или несколько модификаций одного или нескольких остатков сахара, одну или несколько межнуклеозидных связей и/или одно или несколько нуклеиновых оснований.

Хотя в перечне последовательностей, прилагаемом к данной заявке, каждая нуклеотидная последовательность указывается либо как РНК, либо ДНК, в соответствии с требованием на практике эти последовательности могут быть модифицированы с помощью любой комбинации химических модификаций. Специалист в данной области техники легко поймет, что такое обозначение как РНК или ДНК для описания модифицированных олигонуклеотидов носит несколько условный характер. Например, модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий фрагмент сахара 2'-ОН и тиминовое основание, может быть описан как ДНК с модифицированным сахаром (2'-ОН для природного 2'-Н ДНК) или как РНК с модифицированным основанием (тимин (метилированный урацил) для природного урацила РНК).

Соответственно нуклеотидные последовательности, обеспеченные в данном документе, включая без ограничения те, которые находятся в перечне последовательностей, предназначены охватить нуклеиновые кислоты, содержащие какую-либо комбинацию природной или модифицированной РНК и/или ДНК, включая без ограничения такие нуклеиновые кислоты с модифицированными нуклеиновыми основаниями. Посредством дополнительного примера и без ограничения олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью АТСОАТСО охватывает любой олигонуклеотид с такой нуклеотидной последовательностью, либо модифицированной либо немодифицированной, включая без ограничения такие соединения, содержащие РНК-основания, такие как те, которые имеют последовательность АИСОАИСО, и те, которые имеют несколько ДНК-оснований и несколько РНК-оснований, таких как АИСОАТСО, и олигонуклеотиды с другими модифицированными основаниями, такими как АТ^теСОАИСО, где ^теС обозначает 5-метилцитозин. Подобным образом, олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью АИСОАИСО охватывает любые олигонуклеотиды с такой нуклеотидной последовательностью, либо модифицированной, либо немодифицированной, включая без ограничения такие соединения, содержащие ДНК-основания, такие как те, которые имеют последовательность АТСОАТСО, и те, которые имеют несколько ДНК-оснований и несколько РНК-оснований, таких как АИСОАТСО, и олигонуклео- 34 025894 тиды с другими модифицированными основаниями, такими как АТ^теСОАИСО, где ^теС обозначает 5метилцитозин.

Некоторые модификации.

В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды, обеспеченные в данном документе, могут содержать одну или несколько модификаций нуклеинового основания, сахара и/или межнуклеозидной связи, и поэтому представляют собой модифицированный олигонуклеотид. Модифицированное нуклеиновое основание, сахар и/или межнуклеозидная связь могут быть выбраны среди немодифицированных форм из-за необходимых свойств, таких как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенное сродство в отношении других мишеней олигонуклеотидов или нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеазы.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько модифицированных нуклеозидов. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой стабилизирующий нуклеозид. Примером стабилизирующего нуклеозида является нуклеозид с модифицированным сахаром.

В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром. В таких определенных вариантах осуществления нуклеозиды с модифицированным сахаром могут дополнительно содержать природный или модифицированный фрагмент гетероциклического основания и/или природную или модифицированную межнуклеозидную связь, и могут включать дополнительные модификации независимо от модификации сахара. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 2'модифицированный нуклеозид, где сахарное кольцо модифицировано при 2' атоме углерода из природной рибозы или 2'-дезоксирибозы.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит фрагмент бициклического сахара. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ό-сахар в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ό-сахар в бета-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ь-сахар в альфаконфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ь-сахар в бета-конфигурации.

В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит мостиковую группу между 2'- и 4' атомами углерода. В таких определенных вариантах осуществления мостиковая группа содержит от 1 до 8 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит от 1 до 4 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит 2 или 3 связанные бирадикальные группы. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит 2 связанные бирадикальные группы. Примеры таких заместителей сахаров по 4'-2' включают без ограничения -[С(Ка)(К_ь)]п-, -[С(Ка)(К_ь)]п-0-, -С(К_аК_ьЖК)-0- или -С(К_аКъ)-0-Ы(К)-; 4'-СН₂-2', 4'-(СН₂)₂-2', 4'-(СН₂)з-2'; 4'-(СН₂)-О-2' (ΕΝΑ); 4'-(СН₂)-8-2'; 4'-(СН₂)₂-0-2' ^ΝΑ); 4'-СН(СН₃)-0-2' (сЕ1) и 4'-СН(СН₂ОСН₃)-О-2', а также их аналоги (см., например, патент США № 7399845, выданный 15 июля 2008 г.); 4'-С(СН₃)(СН₃)-О2' и его аналоги (см., например, \У0 2009/006478, опубликованную 8 января 2009 г.); 4'-СН₂-Ы(0СН₃)-2' и его аналоги (см., например, \У0 2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 г.); 4'-СН₂-О-Ы(СН₃)-2' (см., например, υδ 2004/0171570, опубликованную 2 сентября 2004 г.); 4'-СН₂-0-Ы(К)-2' и 4'-СН₂-Ы(К)0-2'-, где каждый К независимо представляет собой Н, защитную группу или С₃-С₃₂алкил; 4'-СН₂-Ы(К)0-2', где К представляет собой Н, Ц-С^алкил или защитную группу (см. патент США № 7427672, выданный 23 сентября 2008 г.); 4'-СН₂-С(Н)(СН₃)-2' (см., например, СЬайорабЬуауа, е1 а1., ί. 0гд СНет., 2009, 74, 118-134) и 4'-СН₂-С(=СН₂)-2', а также его аналоги (см., опубликованную международную заявку РСТ \У0 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.).

В определенных вариантах осуществления такие 4'-2' мостики независимо содержат 1 или 2-4 связанных групп, независимо выбранных из -[С(К_а)(К_ь)]_п-, -С(К_а)=С(К_ь)-, -0(^,)=^, -С(=ИК_а)-, -С(=0)-, С(=5)-, -0-, -δΐ(Κ)₂-, -δ(=0)χ- и -Ν(Κ,)-;

где х равен 0, 1 или 2; η равен 1, 2, 3 или 4;

каждый к, и К_ь независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, Ц-С^алкил, замещенный С1-С1₂алкил, С₂-С₃₂алкенил, замещенный С₂-С₃₂алкенил, С₂-С1₂алкинил, замещенный С₂С1₂алкинил, С₅-С₂₀арил, замещенный С₆-С₂₀арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С₅-С₇алициклический радикал, замещенный С₅С₇алициклический радикал, галоген, 0Л|, ΝΙιΙ₂, δΙ₁, Ν₃, С00Т, ацил (С(=0)-Н), замещенный ацил, СН сульфонил (δ(=0)₂-ίι), или сульфоксил (δ(=0)-6₁); и каждый Т и Ь независимо представляет собой Н, С/С1₂алкил, замещенный Ц-С^алкил, С₂-Ю₂алкенил, замещенный С₂-Ц₂алкенил, С₂-С1₂алкинил, замещенный С₂-С1₂алкинил, С₅-С₂₀арил, замещенный С₅-С₂₀оарил, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, Ц-С^аминоалкил, замещенный С₃С₁₂аминоалкил или защитную группу.

- 35 025894

Нуклеозиды, содержащие такие остатки бициклического сахара, называют бициклическими нуклеозидами или ΒΝΑ. В определенных вариантах осуществления бициклические нуклеозиды включают без ограничения (А) α-Ь-метиленокси (4'-СН₂-О-2') ΒΝΑ; (В) β-Ό-метиленокси (4'-СН₂-О-2') ΒΝΑ; (С) этиленокси (4'-(СН₂)₂-О-2') ΒΝΑ; (Ό) аминоокси (4'-СН₂-0-Ы(К)-2') ΒΝΑ; (Е) оксиамино (4'-СН₂-Ы(К)-02') ΒΝΑ; (Р) метил(метиленокси) (4'-СН(СН₃)-О-2') ΒΝΑ (также называемый связанный этил или сЕ1); (О) метилен-тио (4'-СН₂-8-2') ΒΝΑ; (Н) метилен-амино (4'-СН₂-Ы(К)-2') ΒΝΑ; (I) метил-карбоциклический (4'-СН₂-СН(СН₃)-2') ΒΝΑ; (ί) с-М0Е (4'-СН₂-0Ме-2') ΒΝΑ и (К) пропилен-карбоциклический (4'-(СН₂)₃2') ΒΝΑ, как изображено ниже

где Вх представляет собой фрагмент нуклеинового основания, и К независимо представляет собой Н, защитную группу или Ц-С^алкил.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из галогена, аллила, амино, азидо, 8Н, ΟΝ, 0ί.’Ν. СР₃, 0СР₃, О-, 8- или ЖК_т)-алкила; 0-, 8- или ЖКт)-алкенила; 0-, 8- или ЖКт)-алкинила; 0-алкиленил-О-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила, О-аралкила, 0(СН₂)₂8СН₃,0-(СН₂)₂-0-Ы(К_т)(К_п) или 0-СН₂-С(=0)^К_т)(К_п), где каждый К_т и К_п независимо представляет собой Н, защитную аминогруппу или замещенный или незамещенный Ц-С^алкил. Такие 2'-замещающие группы могут быть дополнительно замещены одной или несколькими замещающими группами, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро (Ν02), тиола, тиоалкокси (8-алкил), галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из Р, ΝΉ₂, Ν₃, 0СР₃, 0-СН₃, 0(СН₂)^Н₂, СН₂-СН=СН₂, О-СН₂СН=СН2, ОСН2СН2ОСН₃, 0(СН2)28СН₃, 0-(СН2)2-0-Ы(Кт)(Кп), -0(СН2)20(СН2ЖСН₃)2 и Νзамещенного ацетамида (0-СН₂-С(=0)-Ы(К_т)(К_п), где каждый К_т и К_п независимо представляет собой Н, защитную аминогруппу или замещенный или незамещенный Ц-С^алкил.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из Р, 0СР3, 0-СН3, ОСН2СН2ОСН3, 2'-0(СН2)28СН3, 0-(СН2)2-0^СН₃)₂, -0(СН₂)₂0(СН₂)^(СН₃)₂ и 0-СН₂-С(=0)-Ы(Н)СН₃.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из Р, О-СН3 и ОСН2СН2ОСН3.

В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид. 4'-Тиомодифицированный нуклеозид содержит β-Ό-рибонуклеозид, где 4'-0 заменен 4'-8. 4'-Тио-2'модифицированный нуклеозид представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид, содержащий 2'-ОН, замененный 2'-замещающей группой. Подходящие 2'-замещающие группы включают 2'-ОСН3, 2'О-(СН2)2-ОСН3 и 2'-Р.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одну или несколько межнуклеозидных модификаций. В таких определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь содержит атом фосфора.

- 36 025894

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь не содержит атом фосфора. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется межнуклеозидной связью на основе короткоцепочечного алкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется межнуклеозидной связью на основе циклоалкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется смешанной межнуклеозидной связью на основе гетероатома и алкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется смешанной межнуклеозидной связью на основе гетероатома и циклоалкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными межнуклеозидными связями. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется одной или несколькими гетероциклическими межнуклеозидными связями. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь имеет амидный скелет. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь содержит смешанные составные части на основе N О, δ и СН₂.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько 5-метилцитозинов. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин модифицированного олигонуклеотида содержит 5метилцитозин.

В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-гидроксиметил-цитозина, 7-деазагуанина и 7-деазааденина. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 7-деазааденина, 7-деазагуанозина, 2аминопиридина и 2-пиридона. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-замещенных пиримидинов, 6-азапиримидинов и N-2, N-6 и 0-6 замещенных пуринов, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.

В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит полициклический гетероцикл. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит трициклический гетероцикл. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит производное феноксазина. В определенных вариантах осуществления феноксазин может быть дополнительно модифицирован с образованием нуклеинового основания, известного из уровня техники как 0-с1атр.

Некоторые фармацевтические композиции.

В данном документе обеспечены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления такие фармацевтические композиции применяют для лечения нарушения обмена веществ и связанных состояний. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-30 связанных нуклеозидов и содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную ιηίΚ-21 или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 8-30 связанных нуклеозидов и содержащего нуклеотидную последовательность, комплементарную тгК-21 или ее предшественнику.

Подходящие пути введения включают без ограничения пероральный, ректальный, чресслизистый, интестинальный, энтеральный, местный, в виде суппозиториев, посредством ингаляции, интратекальный, интракардиальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокулярный, внутриопухолевый и парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, внутримозговой и подкожный). В определенных вариантах осуществления фармацевтические препараты для интратекального введения вводят для достижения локальных, а не системных воздействий. Например, фармацевтические композиции могут вводить непосредственно на участок необходимого эффекта (например, в печень).

В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят в форме единицы дозирования (например, таблетки, капсулы, болюса и т. п.). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид при дозе в пределах диапазона, выбранного из 25-800 мг, 25-700 мг, 25-600 мг, 25-500 мг, 25-400 мг, 25-300 мг, 25-200 мг, 25-100 мг, 100-800 мг, 200-800 мг, 300-800 мг, 400-800 мг, 500-800 мг, 600-800 мг, 100-700 мг, 150-650 мг, 200600 мг, 250-550 мг, 300-500 мг, 300-400 мг и 400-600 мг. В определенных вариантах осуществления такие фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид в дозе, выбранной из 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 270, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375,

- 37 025894

380, 385, 390, 395, 400, 490, 495, 500, 505, 510, 600, 605, 610, 615, 620, 710, 715, 720, 725, 730,

405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485,

515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595,

625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705,

735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795 и 800 мг. В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит дозу модифицированного олигонуклеотида, выбранную из 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 и 800 мг.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическим средством является стерильный лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид, который перерастворяют подходящим растворителем, например стерильной водой для инъекций или стерильным солевым раствором для инъекций. Перераствренный продукт вводят в виде подкожной инъекции или в виде внутривенной инфузии после разбавления в солевом растворе. Продукт лиофилизированного лекарственного средства состоит из модифицированного олигонуклеотида, который был приготовлен в воде для инъекций или в солевом растворе для инъекций, доведенный до рН 7,0-9,0 с помощью кислоты или основания во время приготовления, и затем лиофилизирован. Лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид может составлять 25800 мг олигонуклеотида. Понятно, что диапазон включает 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 и 800 мг модифицированного лиофилизированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид представляет собой количество олигонуклеотида в пределах диапазона, выбранного из 25-800 мг, 25-700 мг, 25-600 мг, 25-500 мг, 25-400 мг, 25-300 мг, 25-200 мг, 25-100 мг, 100-800 мг, 200-800 мг, 300-800 мг, 400-800 мг, 500-800 мг, 600-800 мг, 100-700 мг, 150-650 мг, 200-600 мг, 250-550 мг, 300-500 мг, 300-400 мг и 400-600 мг. Продукт лиофилизированного лекарственного средства может быть упакован в 2 мл флакон типа I из прозрачного стекла (обработанный сульфатом аммония), закрытый пробкой из бромбутиловой резины и уплотненный алюминиевой крышкой ТЫР-ΟΡΡ®.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, обеспеченные в данном документе, могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно находящиеся в фармацевтических композициях, при их уровнях применения, установленных в области техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически-активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или может содержать дополнительные материалы, применяемые при физическом составлении различных лекарственных форм композиций согласно настоящему изобретению, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замутняющие средства, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны чрезмерно препятствовать биологическим активностям компонентов композиции настоящего изобретения. Составы могут стерилизовать и, при необходимости, смешивать с вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, отдушками и/или ароматическими веществами и т. п., которые не оказывают вредного воздействия на олигонуклеотид(ы) состава.

Липидные фрагменты применялись при различных видах терапии нуклеиновыми кислотами в разнообразных способах. В одном способе нуклеиновую кислоту вводят в предварительно сформированные липосомы или липоплексы, полученные из смесей катионных липидов и нейтральных липидов. В другом способе ДНК-комплексы с моно- или поликатионными липидами образуются без присутствия нейтральных липидов. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в определенной клетке или ткани. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в жировой ткани. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в мышечной ткани.

В определенных вариантах осуществления ^Τ^ΑΡ^Ω применяют для получения фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид. ^Τ^ΑΡ^Ω является жировой эмульсией, полученной для внутривенного введения. В ее составе содержится 10% соевого масла, 1,2% фосфолипидов яичного желтка, 2,25% глицерина и вода для инъекций. К тому же гидроксид натрия добавляли для доведения рН так, чтобы конечный рН продукт находился в диапазоне 6-8,9.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение полиамина или липидный фрагмент, образующий комплекс с нуклеиновой кислотой. В определенных вариантах осуществления такие препараты содержат одно или несколько соединений, каждое в отдельности имеющее структуру, определенную формулой (ζ), или их фармацевтически приемлемую соль

- 38 025894 где каждый Х³ и Х^Ь для каждого случая независимо представляют собой С₁-₆алкилен; η равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; каждый К независимо представляет собой Н, где по меньшей мере η+2 .-фрагментов в по меньшей мере приблизительно 80% молекул соединения формулы (Ζ) в препарате не является Н; т равно 1, 2, 3 или 4; Υ представляет собой О, ΝΚ² или 8; К¹ представляет собой алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими заместителями; и К² представляет собой Н, алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими заместителями; при условии, что если η=0, тогда по меньшей мере η+3 К-фрагментов не являются Н. Такие препараты описаны в публикация РСТ \УО/2008/042973. которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме для раскрытия липидных препаратов. Некоторые дополнительные препараты описаны в Акте с1 а1., №Циге Βίοίοείιηοίοβν 26, 561 -569 (1 мая 2008 г.), которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме для раскрытия липидных препаратов.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, обеспеченные в данном документе, содержат один или несколько модифицированных олигонуклеотидов и один или несколько наполнителей. В таких определенных вариантах осуществления наполнители выбирают из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, обеспеченную в данном документе, получают с использованием известных способов, включая без ограничения способы смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, отмучивания, эмульгирования, помещения в капсулы, захватывания или таблетирования.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, представляет собой жидкость (например, суспензию, крепкий настой и/или раствор). В таких определенных вариантах осуществления жидкую фармацевтическую композицию получают с использованием ингредиентов, известных из уровня техники, включая без ограничения воду, гликоли, масла, спирты, ароматизирующие средства, консерванты и красящие вещества.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, представляет собой твердое вещество (например, порошок, таблетку и/или капсулу). В таких определенных вариантах осуществления твердую фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько олигонуклеотидов, получают с использованием ингредиентов, известных из уровня техники, включая без ограничения крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связующие и средство для улучшения распадаемости таблеток.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, составлена в виде депо-препарата. Некоторые такие депо-препараты, как правило, являются длительно действующими по сравнению с препаратами, не относящимися к депо-препаратам. В определенных вариантах осуществления такие препараты вводят путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. В определенных вариантах осуществления депо-препараты получают с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, эмульсия в подходящем масле), или ионообменных смол, или в виде труднорастворимых производных, например в виде труднорастворимой соли.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают без ограничения липосомы и эмульсии. Некоторые системы доставки применяют для получения некоторых фармацевтических композиций, включая такие, которые содержат гидрофобные соединения. В определенных вариантах осуществления используют некоторые органические растворители, например диметилсульфоксид.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит один или несколько тканеспецифических молекул для доставки, разработанные для доставки одного или нескольких фармацевтических средств согласно настоящему изобретению к конкретному типу ткани или клетки. Например, в определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифическим антителом.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему сорастворителей. Некоторые такие системы сорастворителей содержат, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно-активное вещество, водорастворимый органический полимер и водную фазу. В определенных вариантах осуществления такую систему сорастворителей применяют для гидрофобных соединений. Неограничивающим примером такой системы сорастворителей является система сорастворителей νΡΌ, которая представляет собой раствор абсолютного этанола, содержащего 3% вес./об., бензилового спирта, 8% вес./об. неполярного поверхностно-активного вещества Ро1у5ОгЬа1е 80™ и 65% вес./об. полиэтиленгликоля 300. Пропорции таких систем сорастворителей могут варьироваться существенно без значительного изменения их характеристик растворимости и токсичности. Кроме того, идентичность компонентов сорастворителей может изменяться, например, вместо Ро1у5ОгЬа1е 80™ могут применять другие поверхностно-активные вещества; размер фракции полиэтиленгликоля может изменяться; другие биосовместимые полимеры могут заменять полиэтиленгликоль,

- 39 025894 например, поливинил пирролидоном; а также другие сахара или полисахариды могут замещать декстрозы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему замедленного высвобождения. Неограничивающий пример такой системы замедленного высвобождения представляет собой полупроницаемую матрицу твердых гидрофобных полимеров. В определенных вариантах осуществления системы замедленного высвобождения могут в зависимости от их химической природы высвобождать фармацевтические средства в течение часов, дней, недель или месяцев.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, обеспеченную в данном документе, получают для перорального введения. В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию составляют путем комбинирования одного или нескольких соединений, содержащих модифицированный олигонуклеотид, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Такие определенные носители позволяют составлять фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и т. п. для перорального приема внутрь субъектом. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального применения получают путем смешивания олигонуклеотида и одной или нескольких сред. Подходящие среды включают без ограничения наполнитель, такой как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон (РУР). В определенных вариантах осуществления такая смесь необязательно является измельченной и необязательно добавляют вспомогательное средство. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции образуют с получением таблетки или ядер драже. В определенных вариантах осуществления добавляют средства для улучшения распадаемости таблеток (например, поперечносшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альгинат натрия).

В определенных вариантах осуществления на ядрах драже предусматривается покрытие. В таких определенных вариантах осуществления могут применять концентрированные сахарные растворы, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбопол-гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В таблетки или покрытия драже могут добавлять красящие вещества или пигменты.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения находятся в твердых капсулах из двух частей, изготовленных из желатина. Некоторые такие твердые капсулы из двух частей содержат одно или несколько фармацевтических средств согласно настоящему изобретению в смеси с одной или несколькими средами для лекарства, такими как лактоза, связующими, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения находятся в мягких герметизированных капсулах, изготовленных из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. В некоторых мягких капсулах одно или несколько фармацевтических средств согласно настоящему изобретению растворяют или суспендируют в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. К тому же могут добавляться стабилизаторы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции получают для буккального введения. Некоторые такие фармацевтические композиции представляют собой таблетки или пастилки, составленные традиционным способом.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают для введения путем инъекции (например, внутривенный, подкожный, внутримышечный и т. д.). В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит носитель и составлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенкса, раствор Рингера, или физиологический солевой буфер. В определенных вариантах осуществления включают другие ингредиенты (например, ингредиенты которые способствуют растворимости или служат в качестве консервантов). В определенных вариантах осуществления инъецируемые суспензии получают с применением подходящих жидких носителей, суспендирующих средств и т. п. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в стандартной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозных контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций являются суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных средах и могут содержать средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Некоторые растворители, подходящие для применения в фармацевтической композиции для инъекций, включают без ограничения липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, сложные эфиры синтетической жирной кислоты, такие как этилолеат или триглицериды, и липосомы. Водная суспензии для инъекции может содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно такие суспензии могут также содержать

- 40 025894 подходящие стабилизаторы или средства, которые повышают растворимость фармацевтических средств, что позволяет получение высококонцентрированных растворов.

В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для чресслизистого введения. В таких определенных вариантах осуществления применяют в составе смачивающие средства, соответствующие барьеру, через который проходят. Такие смачивающие средства, как правило, известны из уровня техники.

В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для введения путем ингаляции. Некоторые из таких фармацевтических композиций для ингаляции получают в форме аэрозоля в упаковке, находящейся под давлением, или распылителя. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат распыляющее средство, например дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другой подходящий газ. В определенных вариантах осуществления при применении аэрозоля, находящегося под давлением, единица дозирования может определяться с помощью клапана, который доставляет измеренное количество. В определенных вариантах осуществления могут быть составлены капсулы и гильзы для применения в ингаляторе или инсуффляторе. Некоторые из таких составов содержат порошкообразную смесь фармацевтического средства согласно настоящему изобретению и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для ректального введения, например суппозитории или удерживающую клизму. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат известные ингредиенты, такие как масло какао и/или другие глицериды.

В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для наружного введения. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат мягкие увлажняющие основы, такие как мази или кремы. Иллюстративный пример подходящих мазевых основ включает без ограничения вазелин, вазелин с летучими силиконами, а также ланолин и воду в масляных эмульсиях. Иллюстративный пример подходящих основ на основе крема включают без ограничения кольдкрем и гидрофильную мазь.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит модифицированный олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В определенных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество является достаточным для предупреждения, облегчения или уменьшения интенсивности симптомов заболевания или для продления выживания субъекта, подвергающегося лечению. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах возможности специалиста в данной области техники.

В определенных вариантах осуществления один или несколько модифицированных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном документе, составляют в виде пролекарства. В определенных вариантах осуществления при введении ίη νίνο пролекарства химически превращаются в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления применяют пролекарства, поскольку они являются более простыми для введения, чем соответствующая активная форма. Например, в некоторых случаях пролекарство может быть более биодоступным (например, посредством перорального введения), чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях пролекарство может обладать улучшенной растворимостью по сравнению с соответствующей активной формой. В определенных вариантах осуществления пролекарства менее водорастворимы, чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях такие пролекарства обладают превосходной передачей через клеточные мембраны, где водорастворимость пагубно воздействует на подвижность. В определенных вариантах осуществления пролекарство представляет собой сложный эфир. В таких определенных вариантах осуществления сложный эфир метаболически гидролизуется в карбоновую кислоту при введении. В определенных случаях карбоновая кислота, содержащаяся в соединении, находится в соответствующей активной форме. В определенных вариантах осуществления пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В таких определенных вариантах осуществления пептид расщепляется при введении с образованием соответствующей активной формы.

В определенных вариантах осуществления пролекарство получают путем модифицирования фармацевтически активного соединения так, чтобы активное соединение образовывалось при введении ίη νίνο. Пролекарство может быть разработано, чтобы изменять метаболическую стабильность или транспортные характеристики лекарственного средства, защитить от побочных эффектов или токсичности, для улучшения аромата лекарственного средства или изменения других характеристик или свойств лекарственного средства. В силу знания фармакодинамических процессов и метаболизма лекарственного средства ίη νίνο специалист в данной области техники, как только фармацевтически активное соединение стало известно, может разработать пролекарства соединения (см., например, №дгабу (1985) Μούίαηαΐ СНспиЦгу А ЕюсНсписа! АрргоасЬ, 0\Гогй ишусгЩу Ргекк, Νο\ν Υοιίν радек 388-392).

Некоторые пути введения.

В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает парентеральное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает внутривенное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает подкожное введение.

В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает внутриартериальное введе- 41 025894 ние. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает интракардиальное введение. Подходящие средства для интракардиального введения включают применение катетера или введение во время операции на открытом сердце. В определенных вариантах осуществления введение включает применение стента.

В определенных вариантах осуществления введение включает пульмональное введение. В определенных вариантах осуществления пульмональное введение включает доставку аэрозолизованного олигонуклеотида в легкое субъекта путем ингаляции. После ингаляции субъектом аэрозолизованного олигонуклеотида олигонуклеотид распределяется в клетках как нормальной, так и воспаленной легочных тканей, включая альвеолярные макрофаги, эозинофилы, эпителий, эндотелий кровеносных сосудов и бронхиолярный эпителий. Подходящее устройство для доставки фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, включает без ограничения стандартное распылительное устройство. Составы и способы модуляции размера капель при применении распылительных устройств для нацеливания на конкретные участки дыхательного пути и легких хорошо известны специалистам в данной области техники. Дополнительные подходящие устройства включают ингаляторы сухого порошка или ингаляторы с измеренной дозой.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции вводят для достижения локальных, а не системных воздействий. Например, при пульмональном введении фармацевтическую композицию доставляют в легкое с минимальным системным воздействием.

Дополнительные подходящие пути введения включают без ограничения пероральный, ректальный, чресслизистый, интестинальный, энтеральный, местный, посредством суппозиториев, интратекальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокулярный, внутримышечный, внутримозговой и внутриопухолевый.

Некоторые соединения.

В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид с определенными нуклеозидными паттернами, и применения таких соединений для модуляции активности, уровня или экспрессии целевой нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид. В таких определенных вариантах осуществления соединение состоит из олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид является комплементарным небольшой некодирующей РНК. В определенных вариантах осуществления небольшая некодирующая РНК является ииК-21.

В таких определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, гибридизированный с комплементарной цепью, т. е. соединение содержит двухцепочечное олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления при гибридизации модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью образуется по меньшей мере один тупой конец. В таких определенных вариантах осуществления гибридизация модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью образуется тупой конец на каждом конце двухцепочечного олигомерного соединения. В определенных вариантах осуществления конец модифицированного олигонуклеотида содержит один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов по отношению к количеству связанных нуклеозидов комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных нуклеозидов находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных нуклеозидов находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно нуклеиновое основание нуклеозида одного или нескольких добавочных нуклеозидов комплементарно целевой РНК. В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание каждого одного или нескольких дополнительных нуклеозидов комплементарно целевой РНК. В определенных вариантах осуществления конец комплементарной цепи содержит один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов по отношению к количеству связанных нуклеозидов олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов находятся на 3'-конце комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов находятся на 5'конце комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления два дополнительных связанных нуклеозида являются связанными с концом. В определенных вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид является связанным с концом.

В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, сопряженный с одним или несколькими фрагментами, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных в результате антисмысловых олигонуклеотидов. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой фрагмент холестерина. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой липидный фрагмент. Дополнительные фрагменты для конъюгации включают карбогидраты, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флюоресцеины, родамины, кумарины и красители. В определенных вариантах осуществления сопряженная группа присоединена непосредственно к олигонуклеотиду. В определенных вариантах осуществления сопряженная группа присоединена к модифицированному олиго- 42 025894 нуклеотиду с помощью связывающего фрагмента, выбранного из амино, гидроксила, карбоновой кислоты, тиола, ненасыщенностей (например, двойных или тройных связей), 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (ΑΌ0), сукцинимидил-4-^-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС), 6аминогексановой кислоты (АНЕХ или ΑΗΑ), замещенного С^Сюалкила, замещенного или незамещенного С₂-С;₀алкенила и замещенного или незамещенного С₂-Сюалкинила. В таких определенных вариантах осуществления замещающая группа выбрана из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро, тиола, тиоалкокси, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.

В таких определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий одну или несколько стабилизирующих групп, которые присоединены к одному или обоим концам модифицированного олигонуклеотида, для улучшения свойств, таких как, например, стабильность по отношению к воздействию нуклеазы. Включенные стабилизирующие группы являются сар-структурами. Такие концевые модификации защищают модифицированный олигонуклеотид от экзонуклеазного разрушения и могут помочь при доставке и/или локализации в пределах клетки. Сар может присутствовать на 5'-конце (5'-сар) или на З'-конце (3'-сар) или может присутствовать на обоих концах. Сар-структуры включают, например, инвертированные деоксиабазические сар.

Подходящие сар-структуры включают 4',5'-метилен-нуклеотид, 1-(бета-Э-еритрофураносил)нуклеотид, 4'-тио-нуклеотид, карбоциклический аналог нуклеотида, 1,5-ангидрогекситол-нуклеотид, Ьнуклеотид, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, фосфородитиоатную связь, трео-пентафураносил-нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентил-нуклеотид, 3'-3'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 3'-3'-инвертированный абазический фрагмент, 3'-2'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 3'-2'инвертированный абазический фрагмент, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, аминогексилфосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфотиоат, фосфородитиоат, образующий мостик фрагмент метилфосфоната и необразующий мостик фрагмент метилфосфоната, 5'-аминоалкилфосфат, 1,3-диамино-2пропилфосфат, 3-аминопропилфосфат, 6-аминогексилфосфат, 1,2-аминододецилфосфат, гидроксипропилфосфат, 5'-5'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 5'-5'-инвертированный абазический фрагмент, 5'-фосфорамидат, 5'-фосфотиоат, 5'-амино, образующий мостик и/или необразующий мостик 5'фосфорамидат, фосфотиоат и фрагмент 5'-меркапто.

Некоторые дополнительные терапевтические средства.

Лечение заболевания, ассоциированного с шгК.-21, может включать более одного терапевтического средства. Поэтому в определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего заболевание или с подозрением на заболевание, ассоциированное с шгК.-21, включающие введение по меньшей мере одного терапевтического средства дополнительно к введению модифицированного олигонуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, комплементарную микроРНК.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство содержит фармацевтическое средство.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противовоспалительные средства. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой стероидное противовоспалительное средство. В определенных вариантах осуществления стероидное противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид. В определенных вариантах осуществления кортикостероидом является преднизон. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. В определенных вариантах осуществления нестероидным противовоспалительным средством является ибупрофен, ингибитор СОХ-Ι или ингибитор СОХ-2.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противодиабетические средства. Противодиабетические средства включают без ограничения бигуаниды, ингибиторы глюкозидазы, инсулины, сульфонилмочевины и тиазолидинедионы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают без ограничения диуретические средства (например, спиронолактон, эплеренон, фуросемид), инотропы (например, добутамин, милринон), дигоксин, сосудорасширяющие средства, ингибиторы фермента, превращающего ангиотензин ΙΙ (АСЕ), (например, каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фозиноприл и рамиприл), блокаторы рецептора ангиотензина II (ΑΚΒ) (например, кандесартан, ирбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмисартан, эпросартан), блокаторы кальциевого канала, изосорбид динитрат, гидралазин, нитраты (например, изосорбид мононитрат, изосорбид динитрат), гидралазин, бетаблокаторы (например, карведилол, метопролол) и натрийуретические пептиды (например, несиритид).

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают гепариноиды. В определенных вариантах осуществления гепариноидом является пентозан полисульфат.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой фармацевтическое средство, которое блокирует один или несколько ответов на фиброгенные сигналы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой терапевтическое средство антитела к фактору роста соединительной ткани. В определенных вариантах осущест- 43 025894 вления терапевтическое средство анти-СТОР представляет собой моноклональное антитело к СТОК

В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может представлять собой фармацевтическое средство, которое укрепляет иммунную систему организма, включая малодозовый циклофосфамид, тимостимулин, витамины и пищевые добавки (например, антиоксиданты, включая витамины А, С, Е, бета-каротин, цинк, селен, глутатион, коэнзим 0-10 и эхинацею), а также вакцины, например иммуностимулирующий комплекс (18СОМ), который содержит вакцину, состав которой сочетает в себе мультимерное презентирование антигена и адъюванта.

В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство выбирают для лечения или уменьшения интенсивности побочного эффекта одной или нескольких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Такие побочные эффекты включают без ограничения реакции в участке инъекции, отклонения от нормы печеночной пробы, отклонения от нормы почечной функции, гепатотоксичность, нефротоксичность, отклонения от нормы центральной нервной системы и виды миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке может указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени.

Дополнительные примеры дополнительных фармацевтических средств включают без ограничения иммуноглобулины, включая без ограничения внутривенный иммуноглобулин (1У1д); анальгетики (например, ацетаминофен); салицилаты; антибиотики; противовирусные средства; противогрибковые средства; адренергические модификаторы; гормоны (например, анаболические стероиды, андроген, эстроген, кальцитонин, прогестин, соматостатин и тироидные гормоны); иммуномодуляторы; мышечные релаксанты; антигистамины; средства против остеопороза (например, бифосфонаты, кальцитонин и эстрогены); простагландины, противоопухолевые средства; психотерапевтические средства; седативные средства; продукты сумаха укореняющегося или сумаха ядовитого; антитела и вакцины.

Некоторые наборы.

Настоящее изобретение также обеспечивает наборы. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению, содержащих модифицированный олигонуклеотид, где нуклеотидная последовательность олигонуклеотида комплементарна нуклеотидной последовательности ипК-21. Соединения, комплементарные т!К-21, могут содержать любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления соединения, комплементарные т1К-21, могут находиться во флаконе. Несколько флаконов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. В некоторых вариантах осуществления флакон изготовлен так, чтобы он был доступным для шприца. Набор также может содержать инструкции для применения соединений, комплементарных ипК-21.

В некоторых вариантах осуществления наборы могут применять для введения соединения, комплементарного т1К-21, субъекту. В таких случаях дополнительно к соединению, комплементарному т!К-21, набор может дополнительно содержать одно или несколько из следующего: шприц, тампон, пропитанный спиртом, ватный шарик и/или марлевую прокладку. В некоторых вариантах осуществления соединения, комплементарные т|К-21, могут находиться в предварительно наполненном шприце (например, шприцах с разовой дозой с, например, калибром иглы 27, иглой '/₂ дюйма с колпачком иглы), вместо флакона. Несколько предварительно заполненных шприцов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. Набор также может содержать инструкции для введения соединений, комплементарных ттК-21.

Некоторые экспериментальные модели.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы применения и/или испытания модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению на экспериментальной модели. Специалисты в данной области техники имеют возможность выбирать и модифицировать протоколы для таких экспериментальных моделей для оценки фармацевтического средства согласно настоящему изобретению.

Обычно модифицированные олигонуклеотиды сначала испытывают в культивируемых клетках. Подходящие типы клеток включают те, которые относятся к типу клеток, для которого необходима доставка модифицированного олигонуклеотида ίη νί\Ό. Например, подходящие типы клеток для изучения способов, описанных в данном документе, включают эмбриональные или культивируемые клетки.

В определенных вариантах осуществления степень, в которой модифицированный олигонуклеотид препятствует активности тгК-21, оценивают в культивируемых клетках. В определенных вариантах осуществления ингибирование активности микроРНК может быть оценено путем измерения уровней микроРНК. Альтернативно, могут измерять уровень предсказанного или подтвержденного микроРНКрегулируемого транскрипта. Ингибирование активности микроРНК может приводить в результате к повышению количества ттК-21-регулируемого транскрипта и/или белка, кодируемого ттК-21регулируемым транскриптом. Кроме того, в определенных вариантах осуществления некоторые могут измерять фенотипические результаты.

Несколько животных моделей доступны специалистам в данной области техники для изучения ттК21 на моделях заболевания человека. Например, ингибиторы ттК-21 могут быть изучены на моделях ра- 44 025894 ка, таких как ортотопические модели ксенотрансплантата, модели токсининдуцированного рака или модели генетически индуцированного рака. В таких моделях рака исследования могут быть проведены для оценки эффектов ингибиторов т1К-21 на размер опухоли, число опухолей, общее выживание и/или выживание без прогрессирования заболевания.

Эффекты ингибиторов тгК-21 на сердечную функцию и фиброз могут быть изучены на моделях трансаортальной исчерченности или инфаркта миокарда, каждый из которых индуцирует отклонения сердечной функции и фиброз. Модели фиброза почек включают одностороннюю обструкцию мочеточника и ишемическое/реперфузионное повреждение. В течение ранних моментов времени модель ишемически-реперфузионного повреждения почек может применяться в качестве модели для острого повреждения почек, в то время как поздние моменты времени служат в качестве модели для фиброза почек. Модели фиброза печени индуцируют с помощью, например, интоксикации четыреххлористым углеродом или иссечения желчного протока. Эффекты тгК-21 на фиброз легкого может быть изучен, например, на модели блеомицин-индуцированного пульмонального фиброза. Модели заживления ран также доступны специалистам в данной области техники, например мышах ί'.'57Β1/Ι<8Ϊ-ά^άΚ которые проявляют несколько характеристик видов диабета зрелого возраста, таких как значительно отсроченное закрытие раны.

Некоторые количественные анализы.

Эффекты антисмыслового ингибирования тгК-21, следующего после введения модифицированных олигонуклеотидов, могут быть оценены с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. В определенных вариантах осуществления такие способы применяют для проведения количественного анализа уровней микроРНК в клетках или ткани ш νίΐΓο или ш νίνο. В определенных вариантах осуществления изменения уровней микроРНК измеряют с помощью микроматричного анализа. В определенных вариантах осуществления изменения уровней микроРНК измеряют с помощью одного из нескольких коммерчески доступных ПЦР анализов, таких как ТацМап® ΜκγοΚΝΑ Α88ау (Αρρ^ά Βίο8У81ет8). В определенных вариантах осуществления антисмысловое ингибирование т1К-21 оценивают путем измерения уровня мРНК и/или белка мишени т1К-21. Антисмысловое ингибирование т1К-21, как правило, приводит в результате к повышению уровня мРНК и/или белка мишени микроРНК.

Анализ захвата мишени.

Модуляция активности микроРНК с помощью анти-тгК или имитатора микроРНК может быть оценена путем измерения захвата мишени. В определенных вариантах осуществления захват мишени измеряют с помощью микроматричного профилирования мРНК. В последовательностях мРНК, которые модулируются (активность либо повышается, либо понижается) с помощью анти-ιπίΚ или имитатора микроРНК, выполняется поиск на предмет затравочных последовательностей микроРНК для сравнения модуляции мРНК, которые являются мишенями микроРНК, с модуляцией мРНК, которые не являются мишенями микроРНК. Таким образом, может оцениваться взаимодействие анти-тгК с т1К-21 или имитатора т1К-21 с его мишенями. В случае анти-ниК проводится скрининг мРНК, уровни экспрессии которых повышаются, в отношении последовательностей мРНК, которые содержат затравочное совпадение с микроРНК, к которой комплементарна анти-ииК.

Примеры

Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие широкий объем настоящего изобретения.

Специалисту в данной области техники будет легко позаимствовать основополагающие принципы данного открытия для разработки различных соединений без отклонения от сущности настоящего изобретения.

Пример 1. Скрининг ш νίΐΓο соединений анти-11иК-21.

Различные анти-тгК, нацеленные на тгК-21 и содержащие сЕСнуклеозиды, оценивали в отношении их ингибирующих эффектов на активность тгК-21. Как показано в табл. А, эти соединения различны по длине, а также по числу, типу и размещению модифицированных нуклеозидов. 25919 содержит 2'-МОЕ и 2'-фтор-нуклеозиды, а также известно ингибирование тгК-21, и, таким образом, его включали в качестве положительного контроля. Оставшиеся соединения содержат сЕСнуклеозиды в комбинации с 2'-МОЕнуклеозидами и/или β-Ό-дезоксирибонуклеозидами.

- 45 025894

Таблица А

Соединения анти-т!к-21

Соединение №	Последовательность и химизм (5’-3’)	3Ε(}ΙΟΝΟ
25919	иЕСЕАрАрСрАрирСрАрСригСЕиЕСЕАрирАрАрОрСниЕАЕ	4
25067	Те меСА8Ам6СА8ТмеСАС8ТмеСТОА8ТААО8 меСТАе	4
25068	ТЕ^СЕАЕАЕСзАЕТЕСзАЕСЕТЕСзТЕСЕАЕизАЕАЕОЕСзТЕАЕ	4
25070	АЕС8АТС8АОТС5ТОАи5ААОС5ТАЕ	3
25071	А.*'СА5ТмеСАС8ГСТОА8ТА8АС8меСТАе	3
25072	АЕС5АЕТЕС5АЕСЕТЕС&ТЕСЕАЕизАЕАЕСЕС5ТЕАЕ	3
25077	А£Те™СеА8О8Т( меСеТеО8А8ТеАеА8О8‘”СеТеАе	5
25082	ТЕ™СААСзАТС5АСТС5ТОАи5ААОС8ТАЕ	4
25731	А.те’“с^.е,те’”свт.овА5теАвА8ав ,с,и8А8	5

В предыдущей табл. А нуклеозиды, не сопровождающиеся индексом, обозначают β-Όдезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом Е, обозначают 2'-МОЕнуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом δ, обозначают δ-сЕЕнуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом Р, обозначают 2'-фтор-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Верхний индекс Ме обозначает 5метальную группу в пиримидиновом основании нуклеозида.

Соединения оценивали в отношении ингибирующей активности пиК-21 при анализе с применением люциферазы. Конструкт с люциферазой в качестве датчика для выявления микроРНК сконструировали с применением рСЕ-3-МС.Ъ2 (Рготеда). Конструкт вводили в клетки Не1а для испытания способности соединений анти-т1К ингибировать активность тгК-21. В данном анализе т|К-21, присутствующая в клетках Не1а, связывалась со своим родственным сайтом(ми) в конструкте с люциферазой в качестве датчика и подавляла экспрессию люциферазы. Когда соответствующую анти-тгК вводили в клетки, она связывалась с т!К-21 и ослабляла подавление экспрессии люциферазы. Таким образом, в данном анализе антитгК, которые являются эффективными ингибиторами экспрессии т|К-21, будут вызывать повышение экспрессии люциферазы.

День 1.

Клетки Не1а (АТСС), стабильно трансфицированные конструктом с люциферазой, сконструированным так, что он содержал последовательность, комплементарную т1К-21, посеяли в колбы Т-170 (ВИ Ра1соп) при 3,5*10⁶ клеток/колба. Клетки Не1а выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (1пуйгодеп).

День 2.

В каждой колбе клетки Не1а трансфицировали 0,5 мкг плазмидой рЬКЬ, применяемой для выявления (Рготеда), экспрессирующей ген Кет11а, для применения при нормализации. Клетки Не1а трансфицировали с применением 20 мкл липофектамина 2000/колба (ЧпуПгодеп). Через 4 ч трасфекции клетки промывали с помощью ΡΒδ и трипсинизировали. Клетки Не1а помещали на 40к/лунка в 24-лунковые планшеты (ВИ Ра1соп) и оставляли на ночь.

День 3.

Клетки Не1а трансфицировали анти-тгК с применением липофектина (ЧпуПгодеп) при 2,5 мкл липофектина/100 нМ Аδ0/мл 0рй-МЕМ I Кейисей δе^ит Мейшт (1пуДгодеп) в течение 4 ч. После Αδ0трасфекции клетки Не1а снова подпитывали модифицированной по способу Дульбекко средой Игла с высоким содержанием глюкозы (ЧпуПгодеп).

День 4.

Клетки Не1а пассивно лизировали и измеряли активность люциферазы с применением Ииа1Ьисйегаке Керойег Аккау δу8ΐет (Рготеда).

Анализ с применением люциферазы проводили для испытания способности анти-ниК с нуклеозидными паттернами, описанными в данном документе, для ингибирования активности пиК-21. Результаты сравнивали с фиктивным лечением, при котором клетки не получали лечение анти-ииК. Эксперимент повторяли и результаты двух экспериментальных реплик, показанных в следующей табл. В, в виде значений для люциферазы нормализовали к бета-галактозидазной активности.

- 46 025894

Таблица В

Ингибирующая активность соединений анти-тЖ-21

Лечение	Концентрация олигонуклеотида
500 нМ	100 нМ	20 нМ	4нМ	0,8 нМ	0,16 нМ
Фиктивная трансфекция	39	40	47	50	33	45
25919	202	171	114	84	53	40
25067	42	30	41	43	23	38
25068	122	97	86	64	54	45
25070	165	132	128	99	87	65
25071	42	53	63	50	36	48
25072	143	115	86	76	49	40
25077	40	42	33	45	33	34
25082	202	176	147	112	89	70
25731	59	38	39	32	45	34

Как проиллюстрировано в табл. В, несколько сЕ1-содержащих соединений продемонстрировали ингибирование тЖ-21 дозозависимым образом: 25068, 25070, 25072 и 25082.

Пример 2. Вариации модифицированных нуклеозидов соединения анти-тЖ-21 25070.

Как показано в предыдущем примере, 25070 представляет собой сильный ингибитор активности тЖ-21 при анализе с применением люциферазы. Для оценки изменений типа модифицированного нуклеозида при различных положениях 25070 разработали дополнительные соединения анти-тЖ-21, как показано в табл. С.

Таблица С

Дополнительные соединения анти-тЖ-21

Эталон №	Последовательность и химизм (5’-3’)	Вариация по отношению к 25070
25070	АЕС5АТС&АОТС5ТСАизААОС5ТАЕ (5Ер ГО ΝΟ: 3)	Отсутствует
25922	АЕ МеС&АТМеС&АСТМвС5ТСАТ5ААСМеС5ТАЕ (5Е<2 ГО ΝΟ: 3)	Каждый цитозин представляет собой 5метилцитозин
25923	АЕС5АТС5АеТСЕТСАЩААОС3ТА£ (8Е0 ГО ΝΟ: 3)	З’-концевой нуклеозид представляет собой сЕ1нуклеозид вместо 2'-МОЕнуклеозида
25924	АЕ МеС5АТМвС5АОТМеС5ТОАТ5ААСЫеС5ТА5 (ЗЕ<3 ГО ΝΟ: 3)	З’-концевой нуклеозид представляет собой сЕфнуклеозид вместо 2’-МОЕнуклеозида, и каждый цитозин представляет собой 5-метил цитозин
25116	АЕ м*С5АЕТЕМеСЕАЕСЕТЕ м'С5ТЕОЕАЕ|*Г8АЕАЕСЕ м,С8ТЕАЕ ($Ε<2ΙΠΝ0; 3)	Каждый не являющийся бициклическим нуклеозид представляет собой 2МОЕ-нуклеозид, и каждый цитозин представляет собой 5-мсгилцитсзин
25117	АЕ МеСЕАЕТЕМеСЕАЕСЕТЕкиСЕТЕОЕАЕ МеТьАЕАЕОЕМеСЕТЕАЕ (5Е(2 ГО ΝΟ: 3)	Каждый не являющийся бициклическим нуклеозид представляет собой 2 ’ МОЕ-нуклеозид. и каждый цитозин представляет собой 5-метил цитозин

В табл. Р нуклеозиды, не сопровождающиеся индексом, обозначают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом Е, обозначают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом 8, обозначают 8-сЕ1-нуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом Р, обозначают 2'-фтор-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Верхний индекс Ме обозначает 5-метальную группу в пиримидиновом основании нуклеозида.

Анализ с применением люциферазы проводили, как описано в данном документе, для испытания способности анти-тЖ в табл. Р ингибирования активности тЖ-21. Результаты сравнивали с фиктивным лечением, при котором клетки не получали лечение анти-тЖ. Эксперимент повторяли и результаты двух экспериментальных реплик, показанных в следующей таблица Ό, в виде кратного изменения значения люциферазы по отношению к фиктивному лечению.

- 47 025894

Таблица Ό

Анализ с применением люциферазы для испытания различных соединений анти-т1К-21

Лечение	Концентрация соединения анти-πιϊΚ
50,0	16,7	5,6	1,9	0,6	0,2
25070	11,00	11,28	6,22	1,14	1,01	1,04
25922	11,46	11,60	8,81	1,34	1,10	1,02
25923	10,81	11,34	5,18	1,10	1,01	1,06
25924	8,99	13,01	7,80	1,37	1,25	1,10
25116	1,98	5,64	2,47	1,06	0,98	1,06
25117	2,91	7,36	3,64	1,14	1,15	Ь05

Как проиллюстрировано в табл. Ό, несколько сЕ!-содержащих соединений продемонстрировали ингибирование т1К-21 дозозависимым образом дополнительно к 25070: 25922, 25923 и 25924. Соединения анти-т1К-21 25116 и 25117, каждое из которых содержит модификацию сахара при каждом нуклеозиде, где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, были неэффективными ингибиторами тЖ.-21.

Пример 3. Сравнение нуклеозидных паттернов, придающих активность соединениям анти-т1К-21.

Для определения взаимосвязи между нуклеозидными паттернами, которые придают активность соединениям анти-т1К-21, размещение модифицированных и немодифицированных нуклеозидов сравнивали по всем активным соединениям анти-т1К-21, которые показаны в табл. Е.

Таблица Е

Активные сЕОсодержащие соединения анти-т1К-21

Соответствую щая строка в таблице ниже	Соединение №	Последовательность и химизм (5’-3’)	5Е«2 ГО ΝΟ
1	25068		4
2	25070	А^ТСзАОТСЛОАиаААССзТАв	3
3	25072	АеС$АеТеСзАеОеТеС5ТеОеАе1ЛАеАеОеСзТеАе	3
4	25082	ТЕ™СААС5АТСЕАеТС8ТСАи5ААСС5ТАЕ	4
5	25922	АЕ“С8АГС5АеТ,С8ТСАТ5ААС™С5ТАв	3
ό	25923	АеСзАТСзАОТСзТСАИзААССбТАв	3
7	25924	Ае“СзАГ,’С8АОТщС5ТСАТ5ААС“С5ТАз	3

Таблица Ρ

Выровненные структуры активных сЕ1-содержащих соединений анти-пиК-21

Нуклеиновое основание и сахарный фрагмент

Те

“Се

ае

Ае

Сз

Ае

Те

Сз

Ае

Се

Те

Сз

Те

Се

Ае

и8

Ае

Ае

Се

Сз

ТЕ

Ае

2

Ае

Сз

А

т

Сз

А

<3

т

Сз

т

0

А

и8

А

А

С

Сз

Т

Ае

3

Ае

Сз

Ае

Те

Сз

Ае

СЕ

Те

Сз

Те

Се

Ае

и5

Ае

Ае

Се

Сз

Те

ае

4

Те

-ηϊ£—

А

А

Сз

А

т

Сз

А

О

т

Сз

т

О

А

и8

А

А

С

Сз

т

Ае

5

Ае

А

т

-НЗ^-

А

О

т

™сГ

т

0

А

и5

А

А

с

“сГ

т

Ае

6

ае

Сз

А

т

с5

А

с

т

Сз

т

с

А

и8

А

А

о

Сз

т

а5

7

Ае

М!/-,

А

т

А

О

т

“Сз

т

0

А

Тз

А

А

О

“сГ

т

А§

Сравнение размещения модифицированных и немодифицированных нуклеозидов (табл. Ρ выше) выявило некоторые нуклеозидные паттерны, которые были общими для каждого высокоактивного соединения анти-т1К-21.

Например, сравнение структуры на 5'-конце каждого соединения выявило область, которая по длине находится в диапазоне от 1 до 4 нуклеозидов, каждый из которых представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид (колонка К в табл. С ниже). Следующая область содержит один бициклический нуклеозид, за которым следует два не являющихся бициклическими нуклеозида, за которым следует один бициклический нуклеозид (колонка 1 в табл. С ниже).

Затем следует повторяющийся блок из четырех нуклеозидов, после трех не являющихся бициклическими нуклеозидов следует один бициклический нуклеозид, и данный блок из четырех нуклеозидов встречается всего три раза (колонка 2 в табл. С ниже).

В каждой активной анти-т1К-21 два 3'-концевых нуклеозида не являются бициклическими нуклеозидами (колонка Т в табл. С ниже).

Таблица С

Структура нуклеозидного паттерна

Область	к	1	2	τ
Тип нуклеозида	Ν4 Длина στ 1 до 4	ΝΒ-Ν<)-№-ΝΒ	(Ν<3.ν4-№-νβ),	№-νζ

Данный нуклеозидный паттерн представлен следующей формулой I в ориентации 5'-3':

(Κ)_χ-Ν^β-Ν'⁵-Ν^<3-Ν^β-(Ν'⁵-Ν'^:;’-№-Ν^β)3-№-Ν^ζ, где каждый К представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид; X равен от 0 до 4;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид;

каждый № представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид; и каждый Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

- 48 025894

Данная формула охватывает каждый из нуклеозидных паттернов соединений активной анти-пиК-21 25068, 25070, 25072, 25082, 25922, 25923 и 25924, при этом продемонстрировано, что нуклеозидный паттерн I обеспечивает активность активной анти-ннК, причем обеспечивается возможность выбирать из бициклического нуклеозида, не являющегося бициклическим нуклеозидом и модифицированным нуклеозидом. Соответственно в данном документе обеспечиваются композиции, содержащие модифицированные олигонуклеотиды с нуклеиновым основанием, комплементарнным т|К-21, и нуклеозидным паттерном, описанным формулой I.

Для определения взаимосвязи между нуклеозидными паттернами, которые придают активность соединениям активной анти-т|К-21, которые составляют 19 связанных нуклеозидов в длину, сравнивали размещение модифицированных и немодифицированных нуклеозидов во всех высокоактивных соединениях, которые показаны в табл. Н. Для иллюстрации подобных размещений некоторых нуклеозидов соединения показаны повторно в табл. I.

Таблица Н

Соединения активной анти-пиК-21

Соответствую шая строка в таблице I	Соединение №	Последовательность и химизм (5’-3')	8Е(} 10 N0:
1	25070	АЕС^ТСБАОТСЦХ5Аи3АА6С3ТАЕ	3
3	25922	АЕ меС5АТмеС5АОТ“С5ТОАТ5ААО“С8ТАЕ	3
4	25923	АЕС5АТСаАСТС3ТОАи5ААССЕТА3	3
5	25924	АЕ еС3АТ“*С8АОТмеС8ТОАТ5ААО“,С8ТА8	3
2	25072	АЕС3АЕТЕС3АЕСЕТЕС5ТЕОЕАЕи3АЕАЕСЕС5ТЕАЕ	3

Таблица I

Выравнивание нуклеозидов соединений активной анти-т|К-21, показанных в табл. Н

единения анти-т£К-21, которое составляет 19 связанных нуклеозидов в длину.

Например сравнение структур на 5'-конце каждого соединения выявило один модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом (колонка Ν^Μ в табл. ί ниже). Следующая область содержит один бициклический нуклеозид, за которым следует два не являющихся бициклическими нуклеозида, за которой следует один бициклический нуклеозид (колонка 1 в табл. ί ниже).

Затем следует повторяющийся блок из четырех нуклеозидов, после трех не являющихся бициклическими нуклеозидов следует один бициклический нуклеозид, и данный блок из четырех нуклеозидов встречается всего три раза (колонка 2 в табл. I ниже).

В каждой активной анти-пиК-21 предпоследний нуклеозид на 3'-конце представляет собой немодифицированный нуклеозид (колонка Ν в табл. ί ниже). Нуклеозид на 3'-конце, который комплементарен нуклеотидному основанию в положении 1 т1К-21, представляет собой модифицированный нуклеозид (колонка Ν^ζ в табл. ί ниже).

Таблица I

Сходства нуклеозидных паттернов

Область	ΝΜ	1	2	Ν	Νζ
Тип нуклеозид а	ΝΜ			Ν'3	Νζ

Данный нуклеозидный паттерн представлен следующей формулой II в ориентации 5'-3':

где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид;

каждый № представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид; и

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

Данные, обеспеченные в данном документе, демонстрируют, что данный нуклеозидный паттерн придает активность соединению анти-т|К-21, и, кроме того, что активность соединения поддерживается разнообразием модифицированных нуклеозидов. Соответственно в данном документе обеспечены композиции, содержащие модифицированный олигонуклеотид с последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарную ттК-21, и нуклеозидный паттерн формулы II.

Подобные анализы проводили в группе соединений анти-т1К.-21, включая 25211 и 25220. В результате проведенных анализов были установлены формулы Ш-У.

Пример 2. Ингибирование ιηίΡ-21 в модели фиброза почек.

- 49 025894

Односторонняя обструкция мочеточника (ИИ0) представляет собой устойчивую экспериментальную модель повреждения почек, приводящее к интерстициальному фиброзу, и таким образом применяется в качестве экспериментальной модели, которая отражает заболевание почек человека. ИИ0 проводят путем хирургического лигирования одного мочеточника. Фиброз характеризуется повышением коллагена, наличие и степень фиброза почек могут быть определены путем измерения содержания коллагена. Для оценки содержания коллагена измеряют как коллаген 1А1 (Οοΐ 1А1), так и коллаген 3А1 (Οοΐ 3А1). Фиброз почек может быть визуализирован путем окрашивания образцов ткани пикро-сириусом красным для определения повышения содержания коллагена. Фиброз почек может также наблюдаться путем измерения количества гидроксипролина, который представляет собой основной компонент коллагена, в образце.

На модели ИИ0 фиброза почек испытывали αΕΐ-содержащие соединения анти-т|К-21, признанные активными при анализе с применением люциферазы. Известно ингибирование активности ιηίΚ-21 ίη νίνο с помощью 25919, содержащего 2'-МОЕ и 2'-фтор-модификации, при этом его включали в качестве положительного контроля. Каждую группу из 8 животных лечили следующим образом: только ии0, ИИ0 с ΡΒδ или ии0 с соединением анти-тгК-21. Что касается дня процедуры ии0, ΡΒδ или соединения анти-пиК-21 вводили на -3, -1 и +5 день. Соединения анти-т1К-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения анти-тгК вводили до процедуры ии0, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. На 11 день животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовали сперва к ΟΑΡΌΗ, а затем к контрольным животным фиктивного лечения. Экспрессия коллагена 1А1 и коллагена 3А1 показана в таблице К ниже.

Таблица К

Снижение экспрессии коллагена в модели ИИ0 несколькими соединениями анти-тгК-21

Группа лечения	Животное №	Коллаген 1А1 (Нормализир свайная экспрессия)	Среднее	Коллаген ЗА1 (Нормализир ованная экспрессия)	Среднее
Фиктивное лечение	1	0,5	0,9	0,5	1,3
2	0,9	0,9
3	1,1	1,1
4	0,5	0,6
5	0,7	0,7
6	0,7	0,9
7	и	4,1
8	1,6	1,5
иио-рвз	1	96,9	114,9	5X5	874
2	108,4	67,0
3	115,0	78,6
	4	102,0		91,0
5	103,1	88,4
6	144,5	117,4
7	134,3	103,4
8	115,0	994
иио-25068	1	84,7	96,4	64,8	60,6
2	75,1	564
3	85,5	47,4
4	89,1	764
5	90,4	57,0
6	125,8	63,0
7	124,4	59,6
иио-25070	1	67,7	81,0	36,4	55,5
2	97,7	75,6
3	88,8	47Д
4	95,9	55,5
5	71,4	63,3
6	44,5	28,5
7	73,0	64,2
8	109.4	72,9
иио-25072	1	96,2	113,8	69,4	65,5
2	85,7	54,5
3	127,4	58,8
4	100,0	69,2
5	159,2	93,8
6	120,5	65,8
7	108,0	46,9
ЦиО-25082	1	122,2	91,7	62,9	59,1
2	188,3	78,9
3	102,5	82,2
4	67,6	43,8
5	40,6	32,6
6	44.1	34,3
7	73.8	75,8
8	94,7	62,5
ииО-25919	1	150,2	86,6	67,1	56,9
2	54,2	33,9
3	84,6	87,6
4	67,7	47,3
5	78,7	67,7
6	62,2	46,7
7	89,2	47,0
8	106,2	57,8

- 50 025894

Данное исследование повторяли 2-3 раза с каждой из групп лечения выше. Метаанализ исследований выявил, что лечение 25070 проявляет наибольшую активность исходя из экспрессии коллагена, приводящей к 40% ингибированию коллагена 1А1 и 30% ингибированию коллагена 3А1. 25068 было также активным при снижении экспрессии коллагена, но в меньшей степени чем 25070. 25072 и 25082, несмотря на активные ингибиторы ииК-21 в испытаниях ίη νίΐτο, описанные в данном документе, демонстрируют снижение экспрессии коллагена непостоянно.

ииО-исследование повторяли для подтверждения активности 25070. Анти-ттК вводили подкожно при дозе 20 мг/кг. Результаты в табл. Ь ниже подтверждают, что 25070 представляет собой сильный ингибитор экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1.

Таблица Ь

Снижение экспрессии коллагена в модели ИИО при профилактическом введении 25070

Лечение	Животное	Коллаген 1А1 (Нормализир ованная экспрессия)	Среднее	Коллаген ЗА1 (Нормализир ованная экспрессия)	Среднее
Фиктивное лечение	1	1,0	1,0	0,7	13
2	1,3	0,8
3	1,0	2,9
4	0,8	0,6
ШО-РВ5	I	102,7	74,3	64,5	58,8
2	76,3	61,9
3	76,5	79,5
4	53,4	61,3
5	88,8	44,8
6	70,7	44,4
7	58,8	53,3
8	67,4	60,6
иио-25070 20 мг/кг 8С		13,9	30,2	34,9	42,4
2	9,2	47,4
3	32/5	25,3
4	57,2	38,0
5	47,6	47,9
6	26,1	54,3
7	35,0	56,1
8	20,4	35,2

Сравнение ИИО-исследований выявило 25070 в качестве весьма сильного ингибитора экспрессии коллагена в модели ИИО, таким образом, 25070 представляет собой терапевтическое средство-кандидат для лечения фиброза, включая фиброз почек.

Пример 3. Сравнение анти-тгК-21 с блокатором рецептора ангиотензина.

Блокатор рецептора ангиотензина ирбесартан, как было показано, блокирует образование тубулоинтерстициального фиброза в модели хронического повреждения почек, характеризующегося фиброзом. Эффекты 25070 сравнивали с ирбесартаном в модели ИИО фиброза.

Контрольные группы лечения включали только ИИО (фиктивное лечение) и ИИО с подкожным введением РВ8 Дополнительная контрольная группа включала ИИО с носителем Τ\\^η-Μί720 перорально. 25070 вводили подкожно при дозе 20 мг/кг на 5 день до, 2 день до и 3 день после процедуры ииО. Ирбесартан вводили перорально ежедневно в 0 день вплоть до 7 после процедуры ИИО. Животных умерщвляли на 10 день после процедуры ИИО. Ткань почек собирали для измерения экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1. Результаты показаны в табл. М ниже и иллюстрируют статистически значимое снижение (р<0,05 с помощью одностороннего АNОVА) экспрессии С'о11А1 у обработанных 25070 животных по отношению к животным, обработанных солевым раствором. Ирбесартан не выявлял статистически значимого снижения экспрессии ί'ο11Α1. Как ирбесартан, так и 25070 выявляли значительные снижения экспрессии Со13а1, при этом 25070 выявляло большее снижение по сравнению с ирбесартаном.

- 51 025894

Таблица М

Большая степень снижения экспрессии коллагена с помощью 25070 по сравнению с ирбесартаном в модели ии0

Группа	Животное №	Коллаген 1А1 (Нормализирова иная экспрессия)	Среднее	Коллаген ЗА1 (Нормализиро ванная экспрессия)	Среднее
Фиктивное лечение		14	1,0	0,9	и
2	0,8	0,6
3	0,9	1,6
4	1,4	14
иио-рвз (подкожно)		112,5	129,6	92,1	93,2
2	167^2	97,9
3	179,0	85,6
4	93,1	95,5
5	151,7	66,3
б	874	71,3
7	117,5	142,4
8	1294	94,9
иио+25070 (20 мг/кг подкожно)	1	87,5	64,2	38,6	53,7
2	67,4	56,9
3	22,2	77,2
4	61,9	50,7
5	42,0	76,4
6	69,2	49,7
7	68,4	44,3
8	95,2	35,9
иио- носитель		272,9	150,2	248,0	132,4
2	127,9	180,4
Ти?ееп/МС (РО)	3	108,4		142,8
4	101,1	57,1
5	125,0	108,5
6	304,2	186,2
7	119,9	88,6
	42,4	47,5
иио- ирбесартан (РО)		125,4	117,8	65,5	73,2
2	86,7	(образец отсутствует)
3	106,6	63,8
4	110,7	63,2
	198,3	50,8
6	92,2	63,6
7	118,1	82,8
8	104,1	122,5

Дополнительным индикатором фиброза является процентное отношение ткани почек, которая проявляет экспрессию коллагена, после процедуры ИИ0. Соответственно ткань почек также собирали для гистологического анализа для оценки доли ткани почек, которая проявляет повышенную экспрессию коллагена; результаты находятся в табл. Ν ниже. Долю площади коллагена измеряют гистологически посредством количественного анализа площади ткани почек при обработке изображения, которую окрашивают в красный цвет с помощью окрашивающего средства пикросириуса красного; процент окрашенной красным стандартизировали к площади среза почки. Поскольку срезы ткани анализировали слепым способом, несмотря на то что образцы в табл. М и Ν являются образцами одного и того же исследования, нумерация образцов в табл. Ν ниже не обязательно соответствует нумерации образцов в табл. М выше.

Таблица Ν

Большая степень снижения экспрессии коллагена с помощью 25070 по сравнению с ирбесартаном в модели ии0

Группа	(номера не тождественны номерам ПЦР)	Доля площади коллагена (%)	Среднее
Фиктивное лечение	1	1,419	Г5
2	1,178
3	1,615
4	1,675
иио-рвз (подкожно)	1	12,988	ПД
2	17,691
3	12,55
4	9,99

- 52 025894

	5	8,828
6	9,394
7	9,491
8	7,49
иио+25070 (20 мг/кг подкожно)	1	7,632	8,0
2	9,937
3	8,015
4	6,611
5	6,319
6	11,272
7	6,803
8	7,405
иио- носитель ТЧиееп/МС (РО)	1	10,587	8,0
2	8,499
3	11,339
4	3,244
5	2,954
6	8,748
7	9,5
8	9,29
иио- Ирбссартан (РО)	1	6,105	8,0
2	7,481
3	15,877
4	7,914
5	6,614
6	5,706
7	7,798
8	6,154

Данные результаты демонстрируют, что ингибирование ιιιίΡ-21 с помощью 25070 ингибирует экспрессию коллагена с большей активностью, нежели ирбесартан, при этом дополнительно подтверждается, что 25070 представляет собой средство-кандидат для лечения, предупреждения и/или улучшения течения фиброза.

Пример 4. Ингибирование ιιιίΡ-21 в модели ишемического/реперфузионного повреждения.

Модель ишемически-реперфузионного повреждения (ГКТ) создают у мыши посредством одностороннего или двустороннего пережатия почечных артерий, которое приводит к повреждению канальцев, воспалению и фиброзу. Почечная дисфункция в данной модели может произойти либо рано (<5 дней), либо поздно (>7 дней), причем ранние моменты времени применяемы для испытания средств-кандидатов для лечения острого повреждения почек, а поздние моменты времени применяемы для модели хронического фиброза.

Соединения анти-ииК-21 испытывали на модели одностороннего ГР!. Одностороннее ГР! индуцировали в течение периода времени 30 мин. Группы лечения были следующими: фиктивное лечение с процедурой ГО1; ГО1 с введением ΡΒδ подкожно; ГО1 с соединением 25070 с анти-ииК-21 вводили интраперитонеально при дозе 20 мг/кг; 25919 с 2'-фтор/2'-МОЕ-модифицированной анти-ииК-21 вводили интраперитонеально при дозе 20 мг/кг и 25319 с 2'-фтор/2'-модифицированной анти-ииК-21 с несовпадением (содержит три несовпадения с последовательностью т!Р-21) вводили интраперитонеально при дозе 20 мг/кг. ΡΒδ или соединения анти-ииР вводили на 5, 6, и 7 день после ГО1 и животных умерщвляли через 14 дней после ГОГ Поскольку соединение анти-т!Р вводили через 5 дней после повреждения в почке или позже, когда фиброз проявлялся в некоторой степени, данная схема лечения считается лечебной схемой, а не профилактической схемой.

Ткань почек собирали для анализа экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1 (показан в табл. О) и доли площади коллагена (показаны в табл. Р). Поскольку долю площади коллагена анализировали слепым способом, несмотря на то что образцы в табл. О и Р являются образцами одного и того же исследования, нумерация образцов в табл. О не соответствовала нумерации образцов в табл. Р. Ошибка обработки данных образца помешала проанализировать долю площади коллагена для контрольного лечения анти-т1Р-21 с несовпадением, поэтому результаты для данной группы лечения представлены только для экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1. В данном исследовании 25070 проявляло статистически значимое снижение доли площади коллагена.

- 53 025894

Таблица О

Снижение экспрессии коллагена с помощью 25070 в модели ГК! при введении дозы на 5, 6 и 7 день

Группа	Животное Ха	Коллаген 1А1 (Нормализкрова иная экспрессия)	Среднее	Коллаген ЗА1 (Нормалкзирова иная экспрессия)	Среднее
Фиктивное лечение	1	2>1	1,1	2,6	1,1
2	1,1	1,0
3	0,7	0,7
4	о,7	0,7
5	1,0	0,7
6	0,7	0,9
7	0,9	1,0
8	1.3	13
ΙΚ1-ΡΒ8	1	83,5	85,1	64,9	63,9
2	34,8	29,4
3	79,0	61,9
	4	74,5		46,6
5	102,3	61,9
6	128,6	99,5
7	92,9	82,8
ΙΚΙ-25319 (ММ)	1	155,8	923	119,5	793
2	181,2	209,9
3	33,4	29,0
4	34,7	18,9
5	81,8	74,7
6	90,4	50,1
7	68,5	53,1
ΙΚΙ-25919	1	108,7	72,0	87,5	59,9
2	103,9	72,3
3	29,5	14,3
4	95,8	104,4
5	35,5	27,1
6	42,2	34,9
7	64,1	56,1
8	96,4	82,8
ΙΚΙ-25070	1	81,7	50,2	57,8	34,2
2	57,4	18,1
3	37,9	39,3
4	55,3	36,0
5	22,3	20,6
6	52,4	38,6
7	53,0	33,4
	41,5	29,7

Таблица Р

Снижение доли площади коллагена с помощью 25070 в модели ΣΚ! при введении дозы на 5, 6 и 7 день

Группа	Животное (не тождественны как для ПЦР)	Доля площади коллагена (#)	Среднее
Фиктивное лечение	1	1,398	1,8
2	1,406
3	2,88
4	1,782
3	1,119
6	2,11
7	1,552
$	1,795
ΙΚΙ-ΡΒ5	1	12,181	15,1
2	16,352
3	14,818
4	17,089
5	14,552
	6	16,92
7	13,629
ΙΚΙ-25919	1	7,093	8,2
2	8,254
3	8,095
4	8,559
5	8,681
6	6,31
7	8,416
8	9,905
ΙΚΙ-25070	1	10,266	9,7
2	11,772
3	10,267
4	8,404
5	7,862
б	6,975
7	8,381
8	13,773

- 54 025894

Аналогичное исследование проводили с теми же группами лечения и дополнительными днями лечения В данном исследовании средства лечения вводили интраперитонеально на 5, 6, 7, 14 и 21 день после процедуры ΙΚΙ. Животных умерщвляли на 27 день и почечную ткань собирали для анализа экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1, а также доли площади коллагена. Поскольку долю площади коллагена анализировали слепым способом, несмотря на то что образцы в табл. О и К являются образцами одного и того же исследования, нумерация образцов в табл. О ниже не соответствовала нумерации образцов в табл. К. В данном исследовании 25070 выявляло статистически значимое снижение доли площади коллагена.

Таблица О

Снижение экспрессии коллагена с помощью 25070 в модели ΙΚΙ при введении дозы на 5, 6, 7, 14 и 21 день

Группа	Животное Ха	Коллаген 1А1 (Нормализированн ая экспрессия)	Среднее	Коллаген ЗА1 (Нормализирован нал экспрессия)	Среднее
Фиктивное лечение		1,0	1,0	1,0	1,0
2	1,5	1,6
3	0,8	0,8
4	1,1	0,8
5	1,1	1Д
б	0,8	0,9
7	0,8	0,8
8	О	1,2
1Ы-РВ8	1	44,8	47,1	33,4	29,8
	2	38,7		27,3
3	4,7	5,3
4	443	28,3
5	26,7	22,4
6	55,6	32,6
7	113,2	59,2
1К1-25319 (ММ)	1	53,8	69,9	31,7	44,2
2	713	33,9
3	72,1	4»,4
4	69,2	54,2
5	46,2	25,1
6	103,0	56,0
7	73,8	68,0
ΙΚ1-25919	1	75,5	48,3	40,2	34,9
2	50,4	43,1
3	49,2	34,5
4	43,2	35,7
5	41,7	41,1
6	53,6	36,9
7	44,8	24,5
8	28,0	22,9
ИИ-25070	1	26,4	31,4	16,4	20,8
2	37,4	27,0
3	41,9	28,5
4	36,8	19,6
5	14,1	113
6	27,7	19,3
7	29,4	21,4
8	37,6	23,1

Таблица К

Снижение доли площади коллагена с помощью 25070 в модели ΙΚΙ при введении дозы на 5, 6, 7, 14 и 21 день

Группа	Животное (не тождественны как для ПЦР)	Доля площади коллагена (#)	Среднее
Фиктивное лечение	1	1,195	1,5
2	1,917
3	1,287
4	1,388
5	1,635
6	1,391
7	1,953
8	1,127
ΙΚΙ-ΡΒ8	1	15,431	15,2
2	13,394
3	12,856
4	14,459

- 55 025894

Данные исследования продемонстрировали снижение содержания коллагена после ингибирования шгК-21 на модели острого повреждения почек. Таким образом, соединение анти-шгК-21 25070 представляет собой терапевтическое средство для лечения острого повреждения почек. Например, предупреждение или отсрочка начала фиброза после острого повреждения почек может предотвратить или замедлить появление хронического заболевания почек.

Для оценки гибкости введения соединения анти-т1К-21 25070 сравнивали активность соединения в 14-дневном исследовании выше, где анти-ш^Κ-21 вводили на 3, 5 и 7 день после процедуры ЖЕ, с различными в 14-дневном исследовании, где анти-1шК-21 вводили интраперитонеально на 3, 5 и 7 день после процедуры ЖЕ. Данные в табл. 8 демонстрируют, что аналогичное ингибирование экспрессии коллагена наблюдали в одном из исследований, указывая на то, что режим дозирования может быть гибким. Кратное изменение экспрессии коллагена 1А1 или коллагена 3А1 по отношению к животным фиктивного лечения показано в табл. 8 и иллюстрирует статистически значимое снижение экспрессии коллагена при одном из режимов дозирования.

Таблица 8

Уменьшение экспрессии коллагена с помощью 25070 в модели М при введении дозы на 3, 5 и 7 день

Группа	Животное №	Коллаген 1А1 (Нормализирован ная экспрессия)	Среднее	Коллаген ЗА1 (Нормализирован ная экспрессия)	Среднее
Фиктивное лечение	1	0,9	1,0	0,9	1,0
2	13	1,2
3	1,2	1,2
4	0,7	0,8
ΙΚΙ-ΡΒ5	1	30,3	37,6	35,0	39,6
2	30,9	293
3	33,6	29,3
4	50,7	52,4
5	27,7	25,9
6	28,1	33,5
7	20,9	23,5
8	34,0	40,0
9	34,3	33,2
10	45,1	51,5
И	66,9	75,0
12	48,4	46,9
25070 (3,5,7 день)	1	37,5	27,2	35,3	27,9
2	21,9	23,6
3	35,3	32,1
4	26,0	25,1
5	24,9	31,3
6	16,8	18,6
7	30,8	зоз
8	34,3	37,6
9	36,8	40,0
10	9,4	9,5
11	28,0	23,2
12	24,6	28,7
25070 (5,6,7 день)	1	21,7	24,5	24,9	26,2
2	22,8	26,3
3	15,8	13,6
4	27,6	25,4
5	27,1	32,7
6	29.3	29,9
7	10,8	9,7
8	21,5	22,2
9	29,9	33,2
10	35,0	35,4
11	28,3	323
12	24,2	28,9

- 56 025894

Пример 5. Ингибирование тгК-21 в модели ишемически-реперфузионного повреждения/нефрэктомии.

Модель ишемически-реперфузионного повреждения/нефрэктомии (ГК/Νχ) создают у мыши посредством временного одностороннего пережатия артерии у одной почки, которое приводит к повреждению канальцев, воспалению и фиброзу, после которого следует удаление второй почки в ранний момент времени. В данной модели фазы острой почечной дисфункции пригодны для испытания средств-кандидатов для лечения острого повреждения почек (т. е. вплоть до приблизительно первых 5 дней), а поздние фазы почечной дисфункции пригодны для модели хронического фиброза (т. е. после приблизительно первых 5 дней).

Соединения анти-тгК-21 испытывали на модели ГК/Νχ. 25109. с несовпадением 6-основания к тгК21, применяли в качестве контрольного соединения (А_ЕА_ЗАТС_ЗТОТС_ЗТСАИ_ЗААТА_ЗАА_Е; где нуклеозиды, не сопровождающиеся индексом, обозначают β-дезоксинуклеозиды; нуклеозиды, сопровождающиеся индексом Е, обозначают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды, сопровождающиеся индексом З, обозначают З-сЕГ-нуклеозиды; и все межнуклеозидные связи являются фосфотиоатными межнуклеозидными связями).

Односторонний ГК индуцировали в течение периода 30 мин. Группы лечения были следующие фиктивное лечение с процедурой ГК, ГК с введением РВЗ подкожно, ГК с введением контроля 25109 с несовпадением подкожно при дозе 20 мг/кг; ГК с введением соединения 25070 анти-тгК-21 подкожно при дозе 20 мг/кг и ГК с введением соединения 25923 анти-тгК-21 подкожно при дозе 20 мг/кг. РВЗ или анти-тГК вводили на 2, 3, 4 и 8 день после ГК. На 8 день здоровую почку извлекали с помощью нефрэктомии из каждого животного и животных умерщвляли на 9 день. Непосредственно перед умерщвлением собирали мочу путем прямой пункции мочевого пузыря.

В моче каждой мыши измеряли соотношение альбумина к креатинину. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 1. В данном исследовании как 25070 ,так и 25923 выявляли статистически значимое снижение соотношения мочевого альбумина к креатинину. Геометрическое среднее соотношения альбумина к креатинину в каждой группе мышей составляло 16 мкг А1Ь/мг Сг (контроль только с нефрэктомией), 127 мкг А1Ь/мг Сг (ГК/Νχ, контроль РВЗ), 140 мкг А1Ь/мг Сг (ГК/Νχ, контроль 25109), 40 мкг А1Ь/мг Сг (ГК/Νχ, 25070) и 31 мкг А1Ь/мг Сг (ГК/Νχ, 25923). Уровни остаточного азота мочевины и сывороточного креатинина были аналогичными у всех мышей ГК/Νχ, и были повышены по отношению к контрольным мышам только с нефрэктомией (данные не показаны).

Пример 6. Выживание мышей модели ГК/Νχ после введения соединения анти-т1К-21.

Частоту выживания мышей модели ГК/Νχ через два дня после нефрэктомии определяли в шести различных экспериментах для определения, повышает ли введение соединения анти-т1К-21 выживание. В первых трех экспериментах соединение анти-тгК-21 вводили на 5, 6 и 7 день после ишемическиреперфузионного повреждения и нефрэктомию проводили на 10 или 11 день. Во вторых трех экспериментах соединение анти-тгК-21 вводили на 2, 3 и 4 день, а нефрэктомию проводили на 7 день. Частоты выживания мышей ГК/Νχ в каждом эксперименте показаны в табл. Т.

Таблица Т

Повышение частоты выживания с помощью 25070 мышей ГК/Νχ через два дня после нефрэктомии

Исслед ование	День Νχ	Частота выживания через 2 дня после Νχ	Доза 25070
РВ5	25070
1	10 день	58,3%	91,7%	30 мг/кг
2	11 день	50%	83,3%	30 мг/кг
3	10 день	50%	66,6%	20 мг/кг
Краткое описание (10/11 день Νχ)	55% (20/36)	80% (29/36)
4	7 день	41,7%	75%	20мг/кг
5	7 день	50%	66,7%	20мг/кг
6	7 день	66,7%	66,7%	20мг/кг
Краткое описание (7 день Νχ)	52% (19/36)	69% (25/36)

В первых трех экспериментах, в которых нефрэктомию проводили на 10 или 11 день, частота выживания РВЗ-обработанных мышей составляла 55%, в то время как частота выживания 25070обработанных мышей составляла 80% (Р=0,02 с использованием 1-стороннего точного критерия Фишера) Во вторых трех экспериментах, в которых нефрэктомию проводили на 7 день, частота выживания РВЗ-обработанных мышей составляла 52%, в то время как частота выживания 25070-обработанных мышей составляла 69% (Р=0,11 с использованием 1-стороннего точного критерия Фишера)

Пример 7. Разработка дополнительных соединений анти-тгК-21.

- 57 025894

При следующем введении соединения 25070 мышам было обнаружено, что приблизительно в 50% соединения, присутствующего в ткани почек, не хватает 3'-концевого нуклеозида через 7 дней после инъекции. Стабильность 25070 и 25923 оценивали в анализе гомогената печени ех νίνο В данном анализе 5 мкМ олигонуклеотида инкубировали в гомогенате печени (50 мг ткани на мл) в течение 24 ч при 37°С. После данного инкубирования олигонуклеотид экстрагировали с помощью экстракции жидкостью жидкости (ЬЬЕ) с последующей твердофазной экстракцией (8РЕ). Длины олигонуклеотида и количества измеряли с помощью времяпролетной масс-спектрометрии высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС-ТОР Μ8). Активность нуклеазы в гомогенате ткани печени подтверждали с применением эталонных олигонуклеотидов, которые включали соединение с известной устойчивостью к активности нуклеаз, соединение, чувствительное к активности 3'-экзонуклеазы, и соединение, чувствительное к активности эндонуклеазы. Соединение внутреннего стандарта применяли для контроля эффективности экстракции. В данном анализе приблизительно 58% соединения 25070 присутствует в виде соединения полной длины, и в приблизительно 27% соединения 25070 отсутствует 3'-концевой нуклеозид приблизительно 68% соединения 25923 присутствует в виде соединения полной длины, и в приблизительно 18% соединения отсутствует 3'-концевой нуклеозид.

Разработали дополнительные соединения и данные соединения испытали в отношении стабильности ех νίνο и ίη νίνο. Ех νίνο проводили, как описано выше. Для испытания ίη νίνο соединения вводили мышам, выделяли почечную ткань, а также проводили экстракцию и определение соединения, как для анализа ех νίνο. В табл. и показаны структуры для соединения 25923, 25220 и 25221, а также результаты измерений стабильности.

Таблица и

Ех νίνο и ίη νίνο стабильность 25923, 25220 и 25221

Соединение	Структура	ех νινο (печень)	ιη νινο (почка)
	ί о4	1 δ	Ν(%)	§ Ζ
25923	АЕС8АТС5АСТС8ТСАи$ААОС8ТА5	17	13	2-3	58±3	14±5
25220	АвС8Атс8А5етс8и5ОАи8А8АОС8и8АЕ	3	0	3	67±16	1б±6
25221	АЕС5АТС5АОТС5ТОАи5ААОС5и5А5	3	0	3	76±4	4±1

Соединения 25220 и 25221, а также 25923 испытывали в модели ИИО в отношении их эффектов на фиброз. Каждую группу из 8 животных обрабатывали следующим образом: фиктивная операция, ИИО с РВ8, ИИО с 25220, ИИО с 25221 или ииО с 25923. Относительно дня процедуры ИИО, РВ8 или соединения анти-тЖ-21 вводили на -5, -3 и +3 день. Соединения анти-т1К-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения анти-тЖ вводили до процедуры ИИО, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. На 10 день животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в режиме реального времени и стандартизировали к САРИН.

Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 2. Экспрессия коллагена 1А1 и коллагена 3А1 показана на фиг. 2А и 2В соответственно. Введение соединения 25220 или 25221 снижало экспрессию коллагена 1А1 и коллагена 3А1 на статистически значимую величину (*=р<0,05; **=р<0,01; ***=р<0,001), так как и введение соединения 25923.

Различные модификации настоящего изобретения в дополнение к таким, описанным в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области техники из приведенного выше описания. Такие модификации также предназначены для попадания в пределы объема приложенной формулы изобретения. Каждая ссылка (включая без ограничения журнальные статьи, патенты США и не США, публикации патентных заявок, публикации международных патентных заявок, номера доступа ΟΒΝΒΑΝΚ® и т. п.), приведенная в настоящей заявке, в частности, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

- 58 025894

Перечень последовательностей.

<1Ю> РЕГУЛУС ТЕРАПЬЮТИКС ИНК Бхат, Балкришен <120> СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МИКРОРНК И СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ΜΙΚ.-21 <130> КЕОиЬ-32423/\УО-1/ОКО <150> из 61/478767 <151> 2011-04-25 <150 υδ 61/565779 <151> 2011-12-01 <160> 4 <170> Ра1еп11пверсия3.5 <210> 1 <211> 22 <212> РНК <213> Ното&ар1еп5 <400> 1 иа&сииаиса §аси§аи§ии §а 22 <210> 2 <211> 72 <212> РНК <213> Нотозар1еп5 <400> 2 и§ис§§§иа§ сииаиса§ас идаидии§ас и§ии§ааиси саисдсааса сса§ис&аи§ 60 ддси§иси§а са 72 <210> 3 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Синтетическая <400> 3 аса!сад!с1 даТаадсга 19 <210> 4 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетическая <400> 4

1саасагса§ тс!£агаа£С 1а 22

Claims (54)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или

1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или

1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или

1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или

1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-22 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна тК-21 (ЗЕО ГО Ν0:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3':

(Н)\-\-\-\-\-(\-\-\-\);-\-\. где каждый К независимо представляет собой небициклический нуклеозид;

X равен от 1 до 4;

каждый Ν^Β независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид, и где

2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

- 59 025894

2. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна т1К-21 (ЗЕО ГО Ν0:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5'-3':

Ν^Μ-Ν^Β-№-№-Ν^Β-(№-№-№-Ν^Β)₃-№-Ν^ζ где Ν^Μ независимо представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид, и где

2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

3. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна т1К-21 (8Е0 ГО ΝΟ:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'-3':

(Εχ-ΝΧ^-Ν’-ΝΧ^-Ν’-^-Ν^-ΝΧΝξ где каждый К представляет собой небициклический нуклеозид;

X равен от 1 до 4;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид, и где

4. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна т!К-21 (8Е0 ГО ΝΟ:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'-3':

Ν^Μ-Ν^Β-№-№-Ν^Β-(№-№-№-Ν^Β)₃-Ν^γ-Ν^ζ, где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^γ представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид, и где

5. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ттК-21 (8Е0 ГО ΝΟ:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5'-3':

Ν^Μ-Ν^Β-(№-№-Ν^Β-Ν^Β)₄-Ν^ζ, где Ν^Μ представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом;

каждый Ν^Β представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № представляет собой небициклический нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой модифицированный нуклеозид.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.

7. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности ттК-21 (8ЕО ГО ΝΟ:1).

8. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из ΕΝΆ-нуклеозида, сЕЕнуклеозида и ЕNΑ-нуклеозида.

9. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой 8сЕЕнуклеозид.

10. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид.

11. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.

12. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый небициклический нуклеозид представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.

13. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

14. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.

15. Соединение по любому из пп.1-14, где по меньшей мере один цитозин представляет собой 5метилцитозин или где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

16. Соединение по п.1, где:

- 60 025894

a) Р состоит из четырех связанных нуклеозидов Ν^Ρ1-Ν^Ρ2-Ν^Ρ3-Ν^Ρ4, где Ν^Ρ1 представляет собой 2'-Ометоксиэтилнуклеозид, и каждый Ν^-Ν^-Υ⁴ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

b) каждый Р представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

c) каждый Р представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; б) каждый Р представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид;

е) каждый Р представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; или ί) каждый Р представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой ΕΝΆ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид.

17. Соединение по п.1, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру, выбранную из ΤΕ^ΜΤΕΛΕΛΕθδΛΕΤΕθδΛΕθΕΤΕθδΤΕθΕΛΕυδΛΕΛΕθΕθδΤΕΛΕ и ΤΕ^ΜίΓΑΑΟδΑΤΟδΑΟΤΟδΤΟΑυδΑΑΟΟδΤΑΕ, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом δ означают δ-сΕΐ-нуклеозиды и верхний индекс Ме означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.

18. Соединение по п.2, где:

a) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

b) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

c) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; каждый Ν представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой δ-сΕΐ-нуклеозид;

б) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид или е) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой ΌΝΑ-нуклеозид.

19. Соединение по п.2, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру, выбранную из

ΑΕΟδΑΤΟδΑΟΤΟδΤΟΑυδΑΑΟΟδΤΑΕ, ^ΑΕСδ^ΑΕ^ΤΕСδ^ΑΕ^ΟΕ^ΤΕСδ^ΤΕ^ΟΕ^ΑΕ^υδ^ΑΕ^ΑΕ^ΟΕСδ^ΤΕ^ΑΕ^,

- 61 025894 а_е ^Мсс8ат^Мсс8аот^Мсс8тоат8аао^Мсс8та_е,

АеС8АТС8АОТС8ТОАИ8ААОС8ТА8 и А_е ^МсС8АТ^МсС8АОТ^МсС8ТОАТ8ААО^МсС8ТА₈, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом 8 означают 8-сЕ1-нуклеозиды и верхний индекс Ме означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.

20. Соединение по п.19, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру

АеС8АТС8АОТС8ТОАИ8ААОС8ТАе, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом 8 означают 8-сЕ1-нуклеозиды.

21. Соединение по п.3, где:

a) каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

b) каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид или

c) каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

X равен 1;

каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^γ представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид.

22. Соединение по п.4, где:

a) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;

b) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^γ представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид;

c) Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^γ представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид.

23. Соединение по п.5, где

Ν^Μ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый Ν^Β представляет собой 8-сЕ1-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;

Ν^ζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

24. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО Ν0:3 или где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО Ν0:4 и где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и и.

25. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью, или где каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь, и где модифицированная межнуклеозидная связь возможно представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

26. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид

- 62 025894

АЕС₃АТС₃АСТС₃ТСАи₃ААСС₃ТАЕ, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом δ означают δ-οΕΐ-нуклеозиды и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь.

27. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида

АΕСδАТСδАСТСδТСАυδААССδТАΕ, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом Е означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом δ означают δ-сΕί-нуклеозиды и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.26 или 27 и фармацевтически приемлемый носитель.

29. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для ингибирования активности т1К-21 в клетке, где лекарственное средство предназначено для приведения в контакт с клеткой.

30. Применение по п.29, отличающееся тем, что клетка находится в условиях ίη νίνο или клетка находится в условиях ίη νίίτο.

31. Применение по п.29 или 30, отличающееся тем, что клетка представляет собой фибробласт, клетку, характеризующуюся гиперпролиферацией, кератиноцит или клетку, находящуюся под действием гипоксии.

32. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для снижения экспрессии коллагена в клетке, где лекарственное средство предназначено для приведения в контакт с клеткой.

33. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения, предупреждения или отсрочки начала развития заболевания, ассоциированного с тгК-21, у субъекта, имеющего заболевание, ассоциированное с тгК-21, где лекарственное средство предназначено для введения субъекту, имеющему заболевание, ассоциированное с тгК-21.

34. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой фиброз.

35. Применение по п.34, отличающееся тем, что фиброз выбирают из фиброза почек, фиброза легких, фиброза печени, фиброза сердца, фиброза кожи, возрастного фиброза, фиброза селезенки, склеродермии и посттрансплантационного фиброза.

36. Применение по п.35, отличающееся тем, что

a) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из гломерулосклероза, тубулоинтерстициального фиброза, 1дА-нефропатии, интерстициального фиброза/тубулярной атрофии; хронического повреждения почек, поражения нефронов, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокальносегментарного гломерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек и терминальной стадии почечной недостаточности, присутствует фиброз почек;

b) фиброз почек возникает в результате острой или повторной травмы почек;

c) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из хронического повреждения печени, инфекционного гепатита, неалкогольного стеатогепатита и цирроза, присутствует фиброз печени; легочный фиброз представляет собой идиопатический легочный фиброз; и/или

ά) субъект имеет хроническое обструктивное заболевание легких.

37. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения фибропролиферативного нарушения у субъекта, где лекарственное средство предназначено для введения субъекту.

38. Применение по любому из пп.33-37, включающее отбор субъекта, имеющего повышенную экспрессию тгК-21 в одной или нескольких тканях.

39. Применение по любому из пп.33-37, отличающееся тем, что субъект нуждается в улучшенной функции органов, где функцию органов выбирают из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.

40. Применение по любому из пп.33-39, отличающееся тем, что введение улучшает функцию органов у субъекта, где функцию органа выбирают из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.

41. Применение по любому из пп.33-40, где указанное лечение включает введение по меньшей мере одного терапевтического средства, выбранного из противовоспалительного средства, иммуносупрессивного средства, противодиабетического средства, дигоксина, вазодилататора, ингибиторов ангиотензин-ΙΙпревращающего фермента (АСЕ), блокаторов рецепторов ангиотензина II (АКВ), блокатора кальциевых каналов, динитрата изосорбида, гидралазина, нитрата, гидралазина, бета-блокатора, натрийуретических пептидов, гепариноида и ингибитора фактора роста соединительной ткани.

- 63 025894

42. Применение по п.41, где указанное терапевтическое средство представляет собой по меньшей мере один ингибитор АСЕ.

43. Применение по п.42, где ингибитор АСЕ выбран из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла.

44. Применение по п.41, включающее введение по меньшей мере одного ингибитора АКВ.

45. Применение по п.44, где ингибитор АКВ выбран из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.

46. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой рак и/или включает метастазирование.

47. Применение по п.46, отличающееся тем, что рак представляет собой рак печени, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак головного мозга, гемобластоз, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак языка, рак желудка, рак кожи или рак щитовидной железы.

48. Применение по любому из пп.46 или 47, где указанное лечение дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного дополнительного средства противораковой терапии.

49. Применение по п.33, где заболевание представляет собой заболевание сердца.

50. Применение по любому из пп.33-49, отличающееся тем, что субъект является человеком.

51. Применение по любому из пп.33-50, отличающееся тем, что соединение представлено в виде фармацевтической композиции.

52. Применение соединения по любому из пп.1-27 в терапии.

53. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата.

54. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата для стимулирования заживления ран.