EA025042B1

EA025042B1 - Способ дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры

Info

Publication number: EA025042B1
Application number: EA201400641A
Authority: EA
Inventors: Александр Евгеньевич Гущин; Татьяна Андреевна Румянцева; Герман Александрович Шипулин; Дмитрий Александрович Куевда; Ольга Юрьевна Шипулина
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис"
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2016-11-30
Also published as: EA201400641A1

Abstract

Изобретение относится к медицине, более конкретно - к лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры. У пациентки берут влагалищный мазок и определяют в нём концентрацию ДНК всех бактерий, концентрацию ДНК бактерии Gardnerella vaginalis, концентрацию ДНК бактерии Atopobium vaginae и концентрацию ДНК бактерий Lactobacillus spp. методом амплификации нуклеиновых кислот. На основании полученных данных рассчитывают коэффициенты соотношений концентраций: KC1 = lg [ДНК Lac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]), KC2 = lg [ДНК Bac] - lg [ДНК Lac] и KC3 = lg [ДНК Bac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]). При lg [ДНК Bac]≥5, KC1>1 и KC2≤1 констатируют отсутствие бактериального вагиноза, при lg [ДНК Bac]≥5, 0,5≤KC1≤1, KC2≤1 и KC3≤2 констатируют промежуточное состояние микрофлоры, при lg [ДНК Bac]≥5, KC1<0,5 и KC3≤2 диагностируют бактериальный вагиноз, а при lg [ДНК Bac]<5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа. При отсутствии бактериального вагиноза и 5≤lg [ДНК Bac]<6 констатируют снижение степени бактериальной обсеменённости влагалища. Дополнительно в мазке определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp. и концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. методом амплификации нуклеиновых кислот. При lg [ДНК Bac]≥6, ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep]) ≤ [ДНК Lac] и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение: "нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено", при lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]) - lg ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])≤1 диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры, а при lg [ДНК Bac]≥5, ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep]) > [ДНК Lac], KC2>1 и KC3>2 констатируют преобладание аэробной микрофлоры. При наличии местной воспалительной реакции в сочетании с повышенным содержанием или преобладанием аэробной микрофлоры диагностируют аэробный вагинит. Изобретение

Description

Изобретение относится к медицине, более конкретно - к лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры.

Уровень техники

Инфекционные заболевания урогенитального тракта у женщин занимают первое место в структуре гинекологической патологии [Оопбегк О.О.О. ИейиШои апб с1акк1йсайоп о£ аЬиогта1 уадта1 Лога. Век! Ргас!. Кек. СЬп. ОЬк!е!. Оупаесо1. 2007 1ип; 21(3): 355-373. ЕриЬ 2007 Арг 16].

Возбудителями инфекционных заболеваний урогенитального тракта могут являться не только облигатно патогенные микроорганизмы (№1ккейа допоггЬоеае, СЫатуФа йасЬотайк, Мусор1акта депПаЮт, ТпсНотопак уадшаЬк и др.), но при определённых условиях и условно-патогенные микроорганизмы, в норме обитающие во влагалище.

В составе вагинальной микрофлоры здоровой женщины репродуктивного возраста доминируют лактобактерии (лактобациллы, Ьас!оЬасШик крр., от лат. креыа1ек - виды), такие как ЬаЛоЬасШик спкраШк, ЬаЛоЬасШик шегк, ЬаЛоЬасШик даШпагит, Ьас!оЬасШик даккегк Ьас!оЬасШик уадшаЬк, Ьас!оЬасШик ]епкеш1, ЛасЮЬасШик ашбой1ик, Ьас!оЬасШик р1аи1агит [Под ред. Чайки В.К. Инфекции в акушерстве и гинекологии: Практическое руководство. Донецк, ООО Альматео, 2006; Бйшуакап 8. апб N. Ргебйскк Ό.Ν. ТЬе Нитап Уадша1 Вас1епа1 Вю1а апб Вас1епа1 Уадшоык. 1п1егб1кс1р1шагу Регкресйуек оп Шесйоик ЭРеакек, Уо1ите 2008, Агйс1е ГО 750479].

Лактобактерии, составляющие нормофлору влагалища, защищают его от размножения патогенных и условно-патогенных бактерий. К защитным факторам лактобактерии относят образование молочной кислоты, ведущее к поддержанию кислой среды здорового влагалища, образование перекиси водорода и бактериоцинов, высокую адгезионную способность и иммуностимулирующие свойства, в совокупности обеспечивающие колонизационную резистентность влагалищного микробиоценоза [Под ред. Чайки В.К. Инфекции в акушерстве и гинекологии: Практическое руководство. Донецк, ООО Альматео, 2006].

Кроме лактобактерий, в составе микрофлоры влагалища могут присутствовать в вариабельных, но в норме незначительных количествах следующие бактерии: ВбгбоЬаЛейит крр., ЕиЬас!ейит крр., С1окйгбшт крр., РгорюшЬас1епит крр., СогупеЬаЛейит крр., ВаЛегсибек крр., Ргеуо!е11а крр., РикоЬаЛейит крр., ЬерЮПгх крр., Сатру1оЬаЛег крр., ЕйегоЬаЛейасеае крр. (ЕксЬейсЫа крр., К1еЬк1е11а крр., Еп1егоЬас!ег крр., Рго!еик крр.), Асше!оЬаЛег крр., МоЬбипсик крр., Ркеиботопак крр., Оагбпеге11а уадшайк, А1ороЬшт уад1пае, 8!арЬу1ососсик крр., Мюгососсик крр., Ейегососсик крр., 81гер!ососсик крр., РерЮсоссик крр., РерЮкЛерЮсоссик крр., Уеб1опе11а крр., Мусор1акта Ьотшщ, Игеар1акта крр. (Игеар1акта рагуит, Игеар1акта игеа1уйсит), а также грибы Сапб1ба крр. (Сапб1ба а1Ысапк, Сапб1ба д1аЬга!а, Сапб|ба калек Сапб|ба рагаркбоык, Сапб1ба ЛорюаЬк), Асйпотусек крр. и др. [Под ред. Чайки В.К. Инфекции в акушерстве и гинекологии: Практическое руководство. Донецк, ООО Альматео, 2006].

Неблагоприятные эндогенные и экзогенные факторы (гормональные нарушения, использование антибиотиков, оральных и внутриматочных контрацептивов, снижение иммунитета, перенесённые воспалительные заболевания и др.) могут приводить к нарушениям баланса вагинальной микрофлоры, т.е. снижению содержания лактобактерий и замещению их условно-патогенными микроорганизмами. Известно два основных вида таких нарушений: бактериальный вагиноз и аэробный вагинит.

Бактериальный вагиноз - это клинический синдром, вызванный замещением лактобактерий вагинальной микрофлоры условно-патогенными анаэробными и факультативно-анаэробными бактериями. [Под ред. Савельевой Г.М., Бреусенко В.Г. Гинекология: Учебник. Москва, ГЭОТАРМЕД, 2004]. Бактериальный вагиноз является полимикробным синдромом с чрезвычайно широким спектром обнаруживаемых условно-патогенных микроорганизмов, насчитывающим сотни видов. Достоверная связь с бактериальным вагинозом была продемонстрирована для представителей восьми родов бактерий ОагбпегеПа, А1ороЬшт, МедакрЬаега, ЕддейЬе11а, Аегососсик, Ьер!о!г1сЬ1а/8пеа!Ь1а, Ргеуо!е11а, РарбЬЬаЛег [Ьшд Ζ. е! а1. Мо1еси1аг апа1ук1к о£ !Ье б1уегкЬу о£ уад1па1 тюгоЬю!а аккола1еб \\ЬЬ ЬаЛепа1 уадшоык. ВМС Оепотюк. 2010 8ер 7; 11:488].

Также специалисты выделяют промежуточный тип микрофлоры, при котором не происходит полного (или почти полного) замещения лактобактерий условно-патогенными анаэробными и факультативно-анаэробными бактериями, однако количество последних существенно повышено по сравнению с нормой. Промежуточный тип микрофлоры можно рассматривать как переход от нормы к бактериальному вагинозу (только-только заболевает) или обратно (восстановление микрофлоры) [№деп! К.Р. е! а1. КеЬаЬбЬу о£ б1адпокшд ЬаЛепа1 уадшоык 1к ипргоуеб Ьу а к1апбагб|/еб тебюб о£ дгат к!а1п иНегргеЫбоп. 1. СЬп. МюгоЬю1. 1991 РеЬ; 29(2): 297-301].

Аэробный вагинит - это нарушение баланса вагинальной микрофлоры, отличное от бактериального вагиноза. При аэробном вагините происходит замещение лактобактерий вагинальной микрофлоры условно-патогенными аэробными микроорганизмами (Еп1егоЬаЛейасеае крр., в том числе ЕксЬейсЫа соЬ, К1еЬк1е11а крр., Рго1еик крр., 8!арЬу1ососсик крр., в том числе 8!арЬу1ососсик аигеик, 8!гер!ососсик крр., в том числе Огоир В 8!гер!ососсик, он же 8Лер!ососсик ада1асйае, Огоир А 81гер!ососсик, Ейегососсик крр.). В отличие от бактериального вагиноза, имеющего не воспалительный характер, аэробный вагинит харак- 1 025042 теризуется развитием местной воспалительной реакции и иммунного ответа [ΌοηάβΓδ О.О.О. е( а1. Όβίΐηί!ίοη οί а 1урс οί аЬпогта1 уадта1 йога Ша! ίδ ΟίδΙίηοί Ггот Ьас1сг1а1 ναβίηοδίδ: аегоЫс уадтШз. ВЮС. 2002 ,1ап; 109(1): 34-43].

Нарушения баланса вагинальной микрофлоры могут сопровождаться клиническими проявлениями (патологические выделения с неприятным запахом, зуд, жжение, диспареуния), однако могут протекать и бессимптомно. Бессимптомное течение особенно опасно, так как в отсутствие адекватной терапии возможно развитие таких грозных последствий для здоровья женщины и её потомства, как воспалительные заболевания органов малого таза, преждевременные роды, рождение детей с низкой массой тела, воспалительные осложнения беременности и родов, повышенная восприимчивость к инфекциям, передающимся половым путём [Под ред. Савельевой Г.М., Бреусенко В.Г. Гинекология: Учебник. Москва, ГЭОТАРМЕД, 2004].

В связи с этим трудно переоценить важность надёжной и эффективной диагностики (в том числе дифференциальной) нарушений баланса вагинальной микрофлоры, позволяющей своевременно определиться с выбором подходящей терапии. Сложности такой диагностики обусловлены, во-первых, неспецифичностью соответствующих симптомов, а в ряде случаев и их отсутствием, во-вторых, огромным разнообразием видов условно-патогенной микрофлоры, имеющих разные свойства, в том числе различную чувствительность к антибиотикам, в-третьих, условно-патогенным характером возбудителей, который обуславливает ограниченную диагностическую ценность их качественного определения и требует только количественного подхода.

Существующие на настоящий момент методы диагностики не в полной мере справляются с указанными затруднениями.

Классические методы лабораторной диагностики, основанные на культивировании микроорганизмов на питательных средах, не подходят для выявления некультивируемых и трудно культивируемых условно-патогенных микроорганизмов, среди которых микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом. Для культивируемых микроорганизмов этот метод также не лишён существенных недостатков, среди которых сложности стандартизации и количественного определения, длительные сроки культивирования.

Традиционно используемые для диагностики бактериального вагиноза критерии Амселя обладают невысокой диагностической чувствительностью [§На В.Е. е! а1. ИШНу οί Лтхе1 сгИейа, Ыидей δ^ΐΐ, амЬ диайНаБуе РСК Юг СагЬиегеПа νη^ίηπίΐδ. Мутор^та Ιιοιηίηίδ. аЫ касГОЬасПН.^ δρρ. Γογ άίη§ηοδίδ οΓ Ьас1ейа1 νηφηοδίδ ίη Питан ^ттиηοάейс^еηсу νίιπδ-ίηί€^ά \νοηκη. 1. С1ш. МюгоЬю1. 2005 §ер; 43(9): 4607-4612] и не дают информации о качественном и количественном составе микрофлоры, что может привести к ошибкам в выборе терапии.

Метод диагностики бактериального вагиноза, основанный на микроскопии окрашенных по Граму препаратов с подсчётом морфотипов бактерий и применением критериев Ньюджента, достаточно точен, но не лишён некоторой доли субъективизма и очень трудоёмок, что значительно снижает пропускные возможности лаборатории. Кроме того, некоторые значимые для диагностики бактериального вагиноза виды условно-патогенной микрофлоры, в частности ΑίοροΝιιιπ νад^ηае, не имеют специфических микроскопических признаков и ошибочно принимаются за другие виды [БсПМегй Α. е! а1. Τ1ιΐΌ\νίη§ (Не Ысе Гэг (Пе άίηβηοδίδ οί \'адта1 ^трИтй? Αηη С1т МюгоЬю1 АйтисгоЬ. 2006 РеЬ 17; 5:4].

Метод диагностики аэробного вагинита, основанный на микроскопии нативных препаратов с оценкой лактобациллярной степени, морфотипов сопутствующей микрофлоры и подсчётом лейкоцитов и парабазальных эпителиоцитов, также трудоёмок и не лишён некоторой доли субъективизма |Οοηώ;Γδ С.С.С. е! а1. □еПтНю!'! οί а !уре οί аЬгюгта1 \'адта1 Ποπι !На! ίδ άίδίίηΟ Ггот Ьас1ейа1 νηβίηοδίδ: аегоЫс νΗβίηίΙίδ. ВГОС. 2002 1ащ 109(1): 34-43].

Современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, имеют множество преимуществ перед традиционными методами диагностики. Наибольшее распространение получил метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Анализ методом ПЦР возможно проводить как в качественном, так и в количественном формате.

ПЦР позволяет в короткие сроки, с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять как культивируемые, так и некультивируемые микроорганизмы в любом биологическом образце. Количественная ПЦР позволяет объективно и достоверно определять количества микроорганизмов. Возможность стандартизации и автоматизации анализа являются его дополнительными преимуществами.

Известен способ исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления ФЕМОФЛОР 16. В 16 пробирках определяется общее количество бактерий (общая бактериальная масса, ОБМ) в образце, количество лактобактерий и количества 22 условно-патогенных микроорганизмов/групп микроорганизмов: 16 видов/родов анаэробных бактерий (СагЬиегеПа νад^ηа1^δ/Р^еνο!е11а Ь^ν^а/Рο^ρПу^οтοηаδ δρρ., ЕиЬас!егшт δρρ., Бте-Ийа δρρ./^еρ!ο!^^Н^а δρρ./ΡиδοЬас!е^^ит δρρ., Ме^рПега δρρ./Vе^1οηе11а δρρ./^^а1^δ!е^ δρρ., ^асНηοЬас!е^^ит δρρ./С1οδί^^ά^ит δρρ., ΜοΝΗιικιΐδ δρρ./Сο^уηеЬас!е^^ит δρρ., Рер^й^Ш^сс^ δρρ., Α!οροЬ^ит νηφηκΕ одно семейство и два рода аэробных бактерий (ЕйегоЬайейасеае, БЕерЮ^сс^ δρρ., БОрНу^^сс^ δρρ.), Мутор^та Нοт^η^δ. Игеар^та δρρ., С-пЫй- δρρ. Способ включает в себя алгоритм

- 2 025042 формирования лабораторного заключения на основании анализа относительных (в % от ОБМ) количеств выявленных бактерий [ФЕМОФЛОР. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Методическое пособие для лаборантов. ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России. ЗАО НПФ ДНК-Технология].

Однако данный подход имеет ряд недостатков. В диагностикум включен ряд представителей условно-патогенной микрофлоры, диагностическая ценность которых не подтверждена опубликованными результатами исследований. Во влагалище женщин с бактериальным вагинозом различными исследователями было обнаружено большое количество разнообразных условно-патогенных микроорганизмов, однако одного факта такого обнаружения недостаточно для эффективного использования микроорганизмов в качестве количественных диагностических маркеров заболевания [Мепагб ТР. е1 а1. Мо1еси1аг сщапбПсабоп оГ Оагбпеге11а уадиыПя апб АЮроЬшт уадтае 1оабя 1о ргеб1с1 Ьас1ег1а1 уадшоя1я. С1т 1пГес1 Όίδ. 2008 1и1. 1; 47(1): 33-43]. Включение невалидированных маркеров в исследование неоправданно повышает трудоёмкость проведения анализа и сложность его интерпретации.

Выдаваемые лабораторные заключения (абсолютный/относительный нормоценоз, выраженный/умеренный аэробный/анаэробный/смешанный дисбиоз) не содержат указаний на известные нозологии. Кроме того, авторам настоящего изобретения не известно опубликованных данных о валидации данного способа, включающего количественный алгоритм формирования заключения, относительно стандартных методов диагностики соответствующих нозологии (бактериальный вагиноз, аэробный вагинит).

Наиболее близким по технической сущности к настоящему изобретению является способ диагностики бактериального вагиноза, описанный в международной заявке на изобретение νθ 2011/068679 [ЦИЕЗТ Ι)ΙΑ(.,ΝΟδΤΙ('δ ΙΝνΕδΤΜΕΝΤδ ШСОРРОКАТЕИ, Мебюбя Гог 1Не б1адиоя1я оГ Ьас1епа1 уадшоя1я, 09.06.2011].

Способ включает количественное определение одного или более вида лактобактерий и двух или более видов условно-патогенных микроорганизмов в биологическом образце и расчёт на их основании диагностического показателя. При его значении меньше 0,2 диагностируют бактериальный вагиноз, при значении от 0,2 до 4,99 диагностируют промежуточный тип вагинальной микрофлоры, и при значении 5 и более диагностируют нормальное состояние вагинальной микрофлоры. Диагностический показатель представляет собой отношение суммы логарифмов концентраций лактобактерий к сумме логарифмов концентраций условно-патогенных бактерий или отношение логарифма суммы концентраций лактобактерий к логарифму суммы концентраций условно-патогенных бактерий. Условно-патогенные бактерии выбраны из группы АЮроЬшт уащпае. МедаярЬега ярр., Оагбпеге11а уадшаПя.

Данный способ диагностики валидирован относительно критериев Ньюджента, однако его чувствительность и специфичность невысока: 57 и 60% соответственно (для различных вариантов расчёта диагностического показателя значения чувствительности и специфичности различаются, здесь приведены наилучшие характеристики).

Кроме того, способ обладает ещё одним существенным недостатком: он разграничивает только три состояния вагинальной микрофлоры: бактериальный вагиноз, промежуточный тип вагинальной микрофлоры и нормальное состояние вагинальной микрофлоры. Нарушения баланса вагинальной микрофлоры, отличные от бактериального вагиноза и промежуточного типа вагинальной микрофлоры (например, преобладание аэробной микрофлоры, аэробный вагинит), способ ошибочно относит к промежуточному типу вагинальной микрофлоры.

Отсутствие определения общего количества бактерий в образце не позволяет оценить адекватность взятия биологического образца, что может приводить к погрешностям в определении диагностического показателя; не позволяет отличить нарушения баланса вагинальной микрофлоры иного (не анаэробного) генеза, а также состояние снижения бактериальной обсеменённости влагалища.

Сущность изобретения

Задачами настоящего изобретения являются:

создание надёжного и эффективного способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры, основанного на количественном определении ДНК бактерий нормальной и условно-патогенной микрофлоры;

повышение диагностической чувствительности и специфичности;

минимизация затрачиваемых для диагностики материальных и временных ресурсов посредством оптимального выбора бактерий-маркеров нарушений баланса вагинальной микрофлоры, т.е. выбора маркёров, необходимых и достаточных для чувствительной и специфичной диагностики;

повышение надёжности диагностики с использованием принципа количественной оценки бактерий нормальной и условно-патогенной микрофлоры не в абсолютных показателях, а по отношению к общему количеству бактерий в образце, что позволяет нивелировать значительный разброс в определении абсолютной концентрации микроорганизмов, связанный с качеством взятия биологического материала;

разработка экспертного алгоритма интерпретации получаемых результатов количественного анализа;

валидация способа, включая алгоритм;

- 3 025042 расширение арсенала современных методов лабораторной диагностики.

В рамках настоящего изобретения был проведён анализ мировой научной литературы с целью оптимального выбора диагностических маркеров бактериального вагиноза, т.е. выбора таких условнопатогенных микроорганизмов, количественное определение которых необходимо и достаточно для чувствительной и специфичной диагностики этого состояния.

Оагйпегейа уад1пайк определяется у 99% женщин с бактериальным вагинозом [ВгайкЬате С.8. с1 а1. ТЬе аккошайоп оГ АЮроЬЫт уадтае апй Оагйпеге11а уадтайк \νί11ι Ьас1сг1а1 уадтопк апй гесиггепсе айег ога1 те1гоЫйа/о1е Легару. 1. 1пГес(. Όίκ. 2006 §ер 15; 194(6): 828-836]. Этот вид бактерий в отличие от других ассоциированных с бактериальным вагинозом видов сочетает в себе три фактора вирулентности: способность к адгезии к эпителиальным клеткам человека, способность образовывать биоплёнки и цитотоксичность [Райегкоп ТЬ. е1 а1. Апа1ук1к оГ айЬегепсе, Ыой1т Гогтайоп апй суЮохюйу киддек(к а дгеа1ег у1ги1епсе ро(епйа1 оГ Оагйпегейа уадтайк ге1айуе Ю о(Ьег Ьас(ейа1-уадшок1к-аккос1а(ей апаегоЬек. МюгоЬю1оду. 2010 РеЬ; 156(Р4 2): 392-399]. По последним данным Оагйпеге11а уадтайк является этиологическим агентом бактериального вагиноза [ЗсйетеЬке ТК. е( а1. Ко1е оГ Оагйпегейа уадтайк ш (Не РаЛодепеык оГ Вас(ейа1 Уадшоык: А Сопсер(иа1 Мойе1. 1. 1пГес(. Όίκ. 2014 Маг 31. [ЕриЬ аЬеай оГ рйп(]]. Стандартной терапией бактериального вагиноза является метронидазол. При этом обнаружение прочих представителей условно-патогенной микрофлоры не меняет тактику лечения бактериального вагиноза. Исключение составляет А(ороЬшт уадтае, для которой была продемонстрирована устойчивость к метронидазолу [Ие Васкег Е. е( а1. АпйЬюйс киксерйЬййу оГ А(ороЬшт уадтае. ВМС !пГес( Όίκ. 2006 Маг 16; 6:51]. Соответственно обнаружение этого вида бактерий в значительных количествах меняет тактику терапии.

Таким образом, из всего многообразия видов условно-патогенной микрофлоры, ассоциированной с бактериальным вагинозом, в качестве количественных диагностических маркеров заболевания были выбраны два вида: Оагйпегейа уадтайк и А(ороЬЫт уадтае.

С целью оптимального выбора диагностических маркеров аэробного вагинита были проанализированы литературные данные и проведён ряд экспериментов.

Известны следующие четыре рода/семейства возбудителей аэробного вагинита: Еп(егоЬас(ейасеае (представители ЕксЬейсЫа сой, К1еЬк1е11а крр., Рго(еик крр.), 8(арЬу1ососсик крр. (представитель 8(арЬу1ососсик аигеик), 8(гер(ососсик крр. (представители Огоир В §(гер(ососсик, он же 8(гер(ососсик ада1асйае, Огоир А §(гер(ососсик), ЕЫегососсик крр. [Иопйегк О.О.О. е( а1. ИейЫйоп оГ а (уре оГ аЬпогта1 уадта1 йога (Ьа( 1к й1кйпс( Ггот Ьас(ейа1 уадтокЫ аегоЫс уадйийк. ВГОО. 2002 1аи; 109(1): 34-43].

Экспериментальным путём исследована информативность основных групп аэробных микроорганизмов на уровне родов/семейств (Еп(егоЬас(ейасеае, 8(арЬу1ососсик крр., 8(гер(ососсик крр., ЕЫегососсик крр.) и отдельных видов (ЕксЬейсЫа сой, 8(арЬу1ососсик аигеик, 8(гер(ососсик ада1асйае). Была продемонстрирована непригодность ЕЫегососсик крр. в качестве количественного диагностического маркера и установлена низкая чувствительность (48%) совокупности отдельных видов аэробных микроорганизмов для диагностики аэробного вагинита.

Таким образом, из известных представителей условно-патогенной микрофлоры, ассоциированной с аэробным вагинитом, в качестве количественных диагностических маркеров заболевания были выбраны следующие три группы аэробных микроорганизмов на уровне родов/семейств: ЕЫегоЬас(ейасеае, 8(арЬу1ососсик крр., 8(гер(ососсик крр.

Задачи настоящего изобретения решены созданием способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры, включающего определение концентрации ДНК всех бактерий, концентрации ДНК бактерии Оагйпегейа уадтайк, концентрации ДНК бактерии А(ороЬшт уад1пае, концентрации ДНК бактерий БаЫоЬасйЫк крр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, отличающегося тем, что на основании полученных данных рассчитывают коэффициенты соотношений концентраций:

КС1 = 1д [ДНК Бас] - 1д ([ДНК Оу] + [ДНК Ау]),

КС2 = 1д [ДНК Вас] - 1д [ДНК Бас],

КС3 = 1д [ДНК Вас] - 1д ([ДНК Оу] + [ДНК Ау]), где [ДНК Бас] - концентрация ДНК бактерий БаЫоЬасйЫк крр. в ГЭ/мл, [ДНК Оу] - концентрация ДНК бактерии Оагйпегейа уадтайк в ГЭ/мл, [ДНК Ау] - концентрация ДНК бактерии А(ороЫит уадтае в ГЭ/мл, [ДНК Вас] - концентрация ДНК всех бактерий в ГЭ/мл, при 1д [ДНК Вас]>5, КС1>1 и КС2<1 констатируют отсутствие бактериального вагиноза, при 1д [ДНК Вас]>5, 0,5<КС1<1, КС2<1 и КС3<2 констатируют промежуточное состояние микрофлоры, при 1д [ДНК Вас]>5, КС1<0,5 и КС3<2 диагностируют бактериальный вагиноз, а при 1д [ДНК Вас]<5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при отсутствии бактериального вагиноза и 5<1д [ДНК Вас]<6 констатируют снижение степени бактериальной обсеме- 4 025042 нённости влагалища.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Еп1сгоЬас1спассас. концентрацию ДНК бактерий §Гарйу1ососси5 врр., концентрацию ДНК бактерий ЗГгерГососсив врр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, при 1д [ДНК Вас]>6 и ([ДНК Εηί] + [ДНК 81арй] + [ДНК 8йер]) < [ДНК Ьас], где [ДНК Εηί] - концентрация ДНК Еп1егоЬас1епасеае в ГЭ/мл, [ДНК §Гарй] - концентрация ДНК бактерий §Гарйу1ососси5 врр. в ГЭ/мл, [ДНК §Ггер] - концентрация ДНК бактерий ЗГгерГососсив врр. в ГЭ/мл, и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение: нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК ЕпГегоЬасГег1асеае, концентрацию ДНК бактерий §Гарйу1ососси5 врр., концентрацию ДНК бактерий ЗГгерГососсив врр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, при 1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]) - 1д ([ДНК Εηί] + [ДНК 81арй] + [ДНК 8йер]) < 1, где [ДНК Εηί] - концентрация ДНК Еп1егоЬас1епасеае в ГЭ/мл, [ДНК §1арй] - концентрация ДНК бактерий §1арйу1ососсш врр. в ГЭ/мл, [ДНК §1гер] - концентрация ДНК бактерий §1гер1ососсив врр. в ГЭ/мл, диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при бактериальном вагинозе в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют бактериальный вагиноз в сочетании с аэробным вагинитом.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Εηίе^оЬасίе^^асеае, концентрацию ДНК бактерий §1арйу1ососсив врр., концентрацию ДНК бактерий §1гер1ососсив врр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, при 1д [ДНК Вас]>5, ([ДНК Εηί] + [ДНК 81арй] + [ДНК 81гер]) > [ДНК Ьас], КС2>1 и КС3>2, где [ДНК Εηί] - концентрация ДНК Εηίе^оЬасίе^^асеае в ГЭ/мл, [ДНК 81арН| - концентрация ДНК бактерий 81арНу1ососсив врр. в ГЭ/мл, [ДНК δί гер] - концентрация ДНК бактерий ЕНгерЮсоссив врр. в ГЭ/мл, констатируют преобладание аэробной микрофлоры.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при преобладании аэробной микрофлоры дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют аэробный вагинит.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при констатации промежуточного состояния микрофлоры дополнительно определяют рН выделений пациентки и наличие жалоб на патологические выделения у пациентки и при рН<4,5 и отсутствии жалоб на патологические выделения пациентке рекомендуют повторить анализ в следующем менструальном цикле, а при рН>4,5 и наличии жалоб на патологические выделения у пациентки диагностируют бактериальный вагиноз.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что образец представляет собой влагалищный мазок.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что метод амплификации нуклеиновых кислот представляет собой метод количественной полимеразной цепной реакции.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что метод количественной полимеразной цепной реакции представляет собой метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что полимеразная цепная реакция представляет собой мультиплексную полимеразную цепную реакцию.

Изобретение позволяет надёжно и эффективно проводить дифференциальную диагностику нарушений баланса вагинальной микрофлоры. При осуществлении способа по изобретению достигается повышение чувствительности до 98,5% и специфичности до 97,4% для диагностики бактериального вагиноза при минимальных затратах материальных и временных ресурсов.

Созданное изобретение можно использовать как для первичной диагностики, подтверждения или опровержения ранее поставленных диагнозов и назначения терапии, так и для последующего контроля эффективности лечения и мониторинга критериев излеченности.

- 5 025042

Перечень фигур

Фиг. 1. Распределение пациенток по общему количеству бактерий в образце (в 1д).

Фиг. 2. Концентрации аэробных микроорганизмов у пациенток с аэробным вагинитом.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В исследование были включены 274 пациентки репродуктивного возраста, обратившиеся в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Российской Академии Медицинских Наук. Средний возраст пациенток составил 30±5,7 лет. Каждая пациентка была обследована с использованием как клинических, так и лабораторных методов диагностики с целью дифференцировки различных нарушений баланса вагинальной микрофлоры: бактериального вагиноза, промежуточного состояния микрофлоры, бактериального вагиноза в сочетании с аэробным вагинитом, аэробного вагинита.

Первый этап разработки способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры включал в себя:

1) определение критериев Амселя (наличие специфических выделений из влагалища, повышение рН>4,5, положительный аминный тест, наличие ключевых клеток при бактериоскопии);

2) микроскопию мазка, окрашенного по Граму, с оценкой баллов Ньюджента (0-3 балла - норма; 4-6 баллов - промежуточный тип микрофлоры; 7-10 баллов - бактериальный вагиноз);

3) определение концентрации ДНК всех бактерий, концентрации ДНК бактерии Сагбпеге11а уадшаПк, концентрации ДНК бактерии ЛЮроЪшт уадшае, концентрации ДНК бактерий БасЮЪасШщ 8рр. во влагалищном мазке методом амплификации нуклеиновых кислот - мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Для проведения исследования методом мультиплексной ПЦР от каждой пациентки получали вагинальный образец (влагалищный мазок) в транспортной среде с муколитиком (ТСМ, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. № 953) объёмом 500 мкл. Далее проводили экстракцию нуклеиновых кислот с использованием комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала АмплиПрайм ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. № 102-22). Для дальнейшей амплификации использовали 10 мкл полученного элюата, содержащего ДНК изучаемых микроорганизмов (объём полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).

Во время приготовления реакционной смеси использовали 100-кратный ТЕ-буфер для получения необходимой концентрации праймеров, зондов и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (6ΝΤΡ). Состав реакционной смеси приведён в табл. 1.

Таблица 1

Состав реакционной смеси (ПЦР-смесь-1)

Название	Последовательность	Флуо- рофор	Концентрация, пмоль/мкл
Праймеры
Ονί	8С8-АТА-88С-1ТГ-ТСС-Т^-Т8Т-АТС-АСТ		5,0
Ον-Α3	СТС-ССС-АТТ-С88-ААА-ТСС-ТСе-8АТ-СА		5,0
ΑΤν-ί	еСТ-САА-ССС-СТА-ТСС-8СТ-ССТ		6,0
ΑΤν-аз	ТА§-С§8-САС-88А-АА_ё-ТАТ-ААТ-СТС-С		6,0
БР-5П1	Т_ёТ-ААС-Т§А-С_ВС-Т8А-£₈С-ТС_ё-АА		1,5
ЬР-азп	А8А-88С-88А-ААС-СТС-ССА-АСА-СТ		1,5
51631Е	САС-АТТ-8§8-АСТ-£А£-АСА-Сёё-ССС-А		0,6
81652М	С_ёС-АСТ-8_ёе-АСТ-ёА8-АТА-С_ёг-ССС-А		0,6
31683Р	САС-АТТ-8бА-АСТ-8А§-АСА-С§8-ТСС-А		0,6
А163	С₈Т-АТТ-АСС-8С₈-8СТ-8СТ-88С-АС		1,8
Зонды
Ον-Ζ	(Рат)-ССС-АСТ-С8§-САе-СТС-ССС-§А8-8СА-Т- (ВНф1)	Раш	0,8
ΑΤν-ΐΒΙ	(КбО)-ССА-А8Т-§ТА-8С8-8Т8-ААА-Т£С-_ё-(ВНф 1)	К6О	1,5
ЬР-ρη-ΚΒ	(Кох)-СТС-АТС-8ТТ-ТАС-§8С-А1§-§АС-ТАС-Са8- (ВфН2)	Кох	1,5
ΒΥΖ-Ογ5	(Су5)-АСТ-ССТ-Ас§-88А-88С-А8С-А8-(КТф2)	Су5	4,0
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
άΝΤΡ (4.4 шМ)			5,0

- 6 025042

Для получения реакционной смеси в пробирку вносили 10 мкл ПЦР-смеси-1 и 5 мкл ПЦР-смеси-2гсб (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. № 863).

Далее в каждую амплификационную пробирку вносили 15 мкл реакционной смеси и 10 мкл элюата ДНК. Кроме того, в каждой постановке использовали калибраторы для количественного анализа микроорганизмов (в соответствующие пробирки вносили по 10 мкл калибраторов). В каждой постановке участвовали 2 калибратора с концентрацией 10⁵ и 10³ копий/реакция.

Состав калибраторов (РС1 и РС2).

Калибраторы включают в себя два препарата, клонированных в фаг λ: концентрированный раствор положительный контрольный образец (КР ПКО) Оагбпеге11а уащпаПх и КР ПКО Ьас1оЬасШи5 5рр., и два препарата, клонированных в вектор рСет-Т: КР ПКО АЮроЬшт уащпае и КР ПКО ЕксЬепсЫа сой. Для разведения исходных КР используется ДНК-буфер с ро1у(А). Конечная концентрация каждого препарата для калибратора РС1 составляет 1-10⁵ копий/реакция; для калибратора РС2 - 1-10³ копий/реакция.

Амплификацию проводили на приборе Ко1от-Оеие О (ΟΙΑΟΕΝ, 1011132).

Программа амплификации:

Этап	Температура, °С	Время	Измерение флуоресценции	Кол-во циклов
НоИ/ удерживание температуры	95	15 мин	-	1
1 СусНп§/ Цитирование	95	5 с	-	5
60	20 с	-
72	15с	-
2 СусНп§/ Циклирование	95	5 с	-	40
60	20 с	РАМ, ЮЕ, КОХ, Су5
72	15с

Далее проводилось сопоставление результатов, полученных тремя методами диагностики бактериального вагиноза. В связи с тем, что как критерии Амселя, так и оценка с использованием баллов Ньюджента подразумевают определённую долю субъективизма, в качестве расширенного золотого стандарта использовались оба метода. Оценка диагностических характеристик способа по изобретению проводилась по тем образцам, для которых заключение по критериям Амселя и баллам Ньюджента совпадали.

Результаты исследования образцов от 274 пациенток приведены в табл. 2. Для каждого образца приведены следующие данные:

Оценка состояния вагинальной микрофлоры по критериям Амселя - бактериальный вагиноз (БВ) или отсутствие бактериального вагиноза (ОБВ);

Оценка состояния вагинальной микрофлоры по баллам Ньюджента - бактериальный вагиноз (БВ), промежуточный тип микрофлоры (ПТ) или отсутствие бактериального вагиноза (ОБВ);

концентрации бактерий, выраженные в единицах ГЭ/мл, определённые методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени: [ДНК Ον] - концентрация ДНК бактерии Оагйиеге11а να^ίηαΐίδ, [ДНК Αν] - концентрация ДНК бактерии АЮроЬшт νад^ηае, [ДНК Ьас] - концентрация ДНК бактерий Ьас1оЬасШи5 5рр., [ДНК Вас] - концентрация ДНК всех бактерий;

рассчитанные коэффициенты соотношений концентраций бактерий: КС1 = 1д [ДНК Ьас] - 1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]),

КС2 = 1д [ДНК Вас] - 1д [ДНК Ьас],

КС3 = 1д [ДНК Вас] - 1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]).

- 7 025042

Таблица 2

Результаты, полученные при обследовании 274 пациенток по критериям Амселя, по баллам Ньюджента и методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

№	Амсель	Ньюд- жент	1ДНКСу\|	1ДНК Αν)	[ДИК Ьае\|	\|ДПК Вас)	КС1	КС2	КСЗ
1	БВ	БВ	Ι,Ε+08	8,Ε+07	2,Ε+05	3.Ε+08	-2,89	3,16	0,28
2	БВ	БВ	5.Е+06	Ι,Ε+09	8,Ε+07	7,Ε+08	-1,17	0,92	-0,26
3	БВ	БВ	5,Е+О7	2,ЕЮ7	3,Ε+06	7.Ε+07	-1,45	1,41	-0,04
4	БВ	БВ	2.Е+08	о,ешо	6.Ε+02	2.Ε+07	-5,57	4,53	-1,04
5	БВ	БВ	2.Е+08	Ι,Ε+08	3,Ε+05	3.Ε+08	-2,96	3,06	0,10
6	БВ	БВ	3,Е+07	Ι,Ε+08	2,Ε+06	9.Ε+08	-1,85	2,59	0,74
7	БВ	БВ	2.Е+09	2.ЕЮ8	Ι,Ε+06	6.Ε+08	-3,15	2,59	-0,56
8	БВ	БВ	5,Е+07	2,ΕΗ)7	2.Ε+05	2,Ε+08	-2,58	3,06	0,49
9	БВ	БВ	З.Е+08	6,ΕΚ>7	7,Ε+05	Ι,Ε+08	-2,79	2,24	-0,55
10	БВ	БВ	2.Е+08	ό,ΕΗ)6	1,Ε+04	3.Ε+07	-4,08	3,29	-0,79
11	БВ	БВ	5.Е+08	0,Ε+00	3.Ε+06	ό,Ε+07	-2,22	1,25	-0,97
12	БВ	пт	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	4,Ε+07	3,Ε+Ο7	7,57	-0,11	7,46
13	БВ	БВ	8,Е+04	7,ЕЮ5	2,Ε+03	2,Ε+06	-2,55	3,00	0,44
14	БВ	БВ	6.Е+08	7,Ε ί-07	Ι,Ε+05	9.Ε+07	-3,70	2,81	-0,89
15	БВ	ПТ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,ΕΚΜ)	Ι,Ε+07	Ι,Ε+07	7,16	-0,17	6,98
16	БВ	пт	Ο,Ε+ΟΟ	0.ЕЮ0	3,Ε+07	2,Ε+07	7,52	-0,30	7,22
17	БВ	пт	0,Е+00	Ο,ΕτΟΟ	1,Ε+08	7.Ε+07	8,08	-0,25	7,82
18	БВ	БВ	ό,Ε+08	3,Ε4)8	3,Ε+06	9.Б+08	-2,47	2,44	-0,03
19	БВ	ПТ	Ο,Ε+ΟΟ	ο,Εωο	Ι,Ε+05	1,Ε+0ό	5,11	1,03	6,14
20	БВ	БВ	8,Е+07	1.ЕЮ7	4,Ε+05	Ι,Ε+08	-2,37	2,43	0,06
21	БВ	ПТ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,ΕΗ,Ο	4,Ε+08	2,Ε+08	8,59	-0,21	8,38
22	БВ	БВ	З.Е+05	Ο,Ε ИЗО	2,Ε+05	2,Ε+06	-0,06	0,94	0,88
23	БВ	ПТ	7,Е+06	4,Ε Ю5	4,Ε+04	1 ,Ε+06	-2,27	1,44	-0,83
24	БВ	БВ	2.Е+08	1.ЕЮ7	ΰ,Ε+04	3,Ε+07	-3,52	2,68	-0,85
25	БВ	БВ	1,Е+08	Ο,Ε Ю0	4,Ε+06	2,Ε+08	-1,50	0,19	1,69
26	БВ	БВ	З.Е+08	7,Ε+07	2.Ε+06	3.Ε+08	-2,26	2,17	-0,09
27	БВ	БВ	5,Е+08	Ο,Ε 4)7	8,Ε+07	2.Ε+Ο8	-0,85	0,40	-0,46
28	ОБВ	пт	1,Е+03	Ο,Ει-ΟΟ	1,Ε+09	5.Ε+08	5,95	-0,32	5,63
29	БВ	пт	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	1 ,Ε+05	1 ,Ε+06	5,08	0,96	6,03
30	БВ	БВ	1,Е+07	6,ΕηΟ7	7,Ε+Ο5	2.Ε+08	-2,06	2,35	0,29
31	БВ	ПТ	4,Е+05	Ο,Ε Η00	Ι,Ε+08	7.Ε+07	2,41	-0,23	2,18
32	БВ	БВ	Ι,Ε+07	4.ЕЮ7	ό,Ε+05	3.Ε+07	-1,94	1,73	-0,21
33	БВ	БВ	1,Е+06	5,Ε Ю6	2,Ε+Ο5	2,Ε+06	-1,42	0,84	-0,58
34	БВ	ПТ	0,Е+00	Ο,Ε 4)0	3,Ε+06	9.Ε+05	6,52	-0,57	5,95
35	БВ	БВ	Ι,Ε+08	9.ЕЮ6	ό,Ε+05	4.Ε+07	-2,27	1,85	-0,43
36	БВ	БВ	3,Ε+Ο7	4,Ε 1-07	Ι,Ε+07	5,Ε+03	-0,81	1,62	0,81

- 8 025042

37	ЕВ	БВ	9,Е+08	6,Е+07	8,Ε+06	2,Ε+08	-2,07	1,34	-0,74
38	БВ	пг	Ο,Ε+00	0,Е+00	2.Ε+07	Ι,Ε+07	7,33	-0,16	7,17
39	БВ	БВ	3,Е+08	4,Е+07	3.Ε+05	2.Ε+Ο8	-3,08	2,90	-0,18
40	БВ	БВ	2,Е+08	Ι,Ε+08	3.Ε+07	Ι,Ε+08	-1,03	0,52	-0,51
41	БВ	пт	0,Е+00	0,Е+00	8.Ε+06	Ι,Ε+07	6,91	0,12	7,03
42	БВ	БВ	4.Е+07	0,Ε+00	2.Ε+06	Ι,Ε+08	-1,34	1,77	0,44
43	БВ	ПТ	0,Е+00	0,Ε+00	3,Ε+08	Ι,Ε+08	8,40	-0,30	8,10
44	БВ	БВ	2,Е+08	0,Ε+00	2,Ε+07	Ι,Ε+08	-0,96	0,67	-0,29
45	БВ	БВ	5,Е+06	Ι,Ε+06	3.Ε+03	5.Ε+06	-3,37	3,26	-0,11
46	БВ	пт	0,Е+00	0,Ε+00	Ι,Ε+08	5,Ε+07	7,98	-0,30	7,68
47	БВ	БВ	3,Е+06	6,Ε+04	8,Ε+06	5,Ε+06	0,42	-0,16	0,26
48	БВ	БВ	0,Е+00	0,Ε+00	4,Ε+Ο8	2,Ε+08	8,56	-0,32	8,24
49	БВ	БВ	Ι,Ε+06	Ο,Ε+00	1,Ε+02	3,Ε+06	-3,83	0,40	4,23
50	ОБВ	пт	Ο,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+08	6,Ε+07	8,10	-0,31	7,79
51	БВ	БВ	8,Е+07	Ι,Ε+07	5,Ε+04	5,Ε+07	-3,29	3,00	-0,30
52	БВ	БВ	Ι,Ε+06	2,Ε+06	Ι,Ε+06	7.Ε+06	-0,29	0,73	0,44
53	БВ	БВ	3,Е+07	2,Ε+06	Ι,Ε+05	2,Ε+07	-2,48	2,27	-0,21
54	БВ	БВ	2.Е+06	2,Ε+08	2,Ε+06	3.Ε+08	-2,00	2Д5	0,15
55	БВ	БВ	Ι,Ε+08	4,Ε+07	3,Ε+05	9,Ε+07	-2,68	2,47	-0,21
56	БВ	БВ	4.Е+08	6,Ε+03	Ι,Ε+05	2,Ε+08	-3,42	3,06	-0,37
57	БВ	БВ	5.Е+08	Ι,Ε+08	4,Ε+05	4,Ε+08	-3,21	2,96	-0,26
58	БВ	БВ	2,Е+09	9,Ε+07	5,Ε+07	8.Ε+08	-1,67	1,26	-0,41
59	БВ	БВ	4,Е+09	Ι,Ε+08	4,Ε+07	Ι,Ε+09	-2,03	1,56	-0,47
60	БВ	БВ	З.Е+09	2.Ε+08	4,Ε+07	Ι,Ε+09	-1,87	1,39	-0,48
61	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	Ι,Ε+07	6,Ε+06	7,10	-0,36	6,75
62	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	3,Ε+08	2.Ε+08	8,51	-0,21	8,29
63	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Ε+00	2.Ε+06	8,Ε+05	6,23	-0,32	5,91
64	ОБВ	пт	2,Е+08	0,Ε+00	2,Ε+03	2,Ε+07	-5,07	4,08	-0,99
65	ОБВ	пт	0.Е+00	0,Ε+00	3.Ε+06	3.Ε+07	6,50	0,90	7,40
66	ОБВ	пт	6.Е+04	0,Ε+00	9.Ε+06	7,Ε+06	2,17	-0,08	2,09
67	ОБВ	пт	Ο,Ε+00	0,Ε+00	4,Ε+03	Ι,Ε+06	3,65	2,40	6,05
68	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	8.Ε+07	ό,Ε+07	7,92	-0,12	7,79
69	ОБВ	ПТ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	4.Ε+05	2,Ε+06	5,56	0,81	6,37
70	ОБВ	ОБВ	2,Е+03	Ο,Ε+00	3,Ε+08	2,Ε+08	5,10	-0,10	5,00
71	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	5,Ε+08	З.Ё+08	8,66	-0,19	8,47
72	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+05	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	9.Ε+07	3,15	-0,18	2,97
73	ОБВ	ОБВ	1,Е+06	Ο,Ε+00	3,Ε+06	Ι,Ε+07	0,38	0,75	1,13
74	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	4,Ε+08	3,Ε+08	8,63	-0,15	8,49
75	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	2,Ε+07	Ι,Ε+07	7,32	-0,19	7,13
76	ОБВ	ПТ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	ό,Ε+07	4,Ε+07	7,77	-0,15	7,62
77	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	ό,Ε+07	4,Ε+07	7,77	-0,15	7,62
78	ОБВ	ПТ	1,Е+08	3,Ε+05	7.Ε+06	9,Ε+07	-1,26	1,09	-0,18
79	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	Ο,Ε +00	5.Ε+06	3,Ε+06	2,44	-0,25	2,19
80	ОБВ	ПТ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	Ι,Ε+06	3,Ε+07	6,08	1,44	7,51
81	ОБВ	ПТ	2,Е+03	4,Ε+04	7,Ε+04	2,Ε+06	0,15	1,37	1,52
82	ОБВ	ОБВ	ό,Ε+05	Ο,Ε +00	7,Ε+06	5,Ε+06	1,06	-0,15	0,91

- 9 025042

83	БВ	БВ	\|,Е+08	2.Ε+06	8,Ε+04	4,Ε+08	-3,14	0,59	3,73
84	ЬВ	БВ	3,Е+08	Ι,Ε+07	Ι,Ε-ι 05	7,Ε+07	-3,44	2,83	-0,62
85	ОБВ	ОБВ	1,Е+05	2.Ε+03	2,Ε+08	2.Ε+08	3,24	-0,16	3,09
86	ОБВ	ОБВ	З.Е+06	4, Ε 4-03	1,Ε+08	Ι,Ε+08	1,69	-0,15	1,54
87	ОБВ	ПТ	2,Ь+09	2.Ε+08	3,Ε+07	4.Ε+08	-1,96	1,13	-0,83
88	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	Ι,Ε+07	7.Ε+06	7,13	-0,27	6,86
89	ОБВ	пт	1,Е+08	2.Ε+08	2.Ε+07	ό,Ε+07	-1,26	0,57	-0,69
90	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	Ι,Ε+03	ΐ,Ε+09	5.Ε+08	4,64	-0,28	4,36
91	ОБВ	ПТ	2,Е+03	0,Ε+00	1,Ε+05	2.Ε+08	1,62	3,20	4,81
92	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	4,Ε+07	2,Ε+07	7,55	-0,28	7,27
93	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	2,Ε+08	2,Ε+08	8,40	-0,21	8,19
94	БВ	БВ	0,Е+00	Ι,Ε+08	1,Ε+05	4,Ε+07	-2,91	2,49	-0,42
95	ОБВ	ОБВ	4,Е+03	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	5,Ε+07	4,44	-0,32	4,12
96	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Ε+00	2,Ε+08	Ι,Ε+08	8,31	-0,27	8,04
97	БВ	БВ	2,Е+07	Ι,Ε+06	5,Ε+05	5,Ε+06	-1,64	1,03	-0,61
98	ОБВ	ПТ	3,Е+08	Ι,Ε+07	5,Ε+06	Ι,Ε+08	-1,75	1,33	-0,42
99	ОБВ	пт	Ι,Ε+07	ό,Ε+06	1,Ε+04	ό,Ε+06	-3,17	2,67	-0,50
100	ОБВ	ОБВ	1,Е+05	9,Ε+04	2,Ε+07	Ι,Ε+07	1,98	-0,28	1,69
101	ОБВ	ОБВ	2.Е+07	0,Ε+00	2,Ε+08	8,Ε+07	1,12	-0,40	0,72
102	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	2,Ε+06	8,Ε+05	6,38	-0,46	5,92
103	ОБВ	пт	2,Е+07	5.Ε+05	Ι,Ε+08	4.Ε+07	0,90	-0,47	0,42
104	ОБВ	пт	0,Е+00	2.Ε+05	3,Ε+08	2.Ε+08	3,12	-0,27	2,85
105	ОБВ	пт	9,Е+07	Ο,Ε+00	2.Ε+08	9,Ε+07	0,42	-0,41	0,01
106	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	3,Ε+08	Ι,Ε+08	8,54	-0,51	8,03
107	БВ	БВ	1,Е+09	9.Ε+07	Ι,Ε+07	5.Ε+08	-2,05	1,67	-0,37
108	БВ	БВ	5.Е+08	2.Ε+07	2,Ε+07	2.Ε+08	-1,50	1,11	-0,39
109	ОБВ	пт	Ο,Ε+00	0,ЕЮ0	Ι,Ε+08	8,Ε+07	8,12	-0,20	7,92
110	ОБВ	ОБВ	0,Е+(ДО	Ο,ΕΚΙΟ	2,Ε+07	8,Ε+06	7,35	-0,46	6,89
111	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,ΕιΌΟ	3.Ε+Ο8	Ι,Ε+08	8,40	-0,32	8,08
112	ОБВ	ПТ	ό,Ε+06	0,ЕЮО	5,Ε+07	4,Ε+07	0,91	-0,04	0,87
113	БВ	БВ	6.Ε+06	2,ЕЮ6	5_τΕ+06	7,Ε+06	-0,17	0,14	-0,03
114	БВ	БВ	Ι,Ε+09	ό,Ε+07	Ι,Ε+07	7.Ε+08	-1,94	1,68	-0,26
115	ОБВ	ОБВ	5,Ε+03	0,ЕЮ0	5.Ε+08	3,Ε+08	4,95	-0,24	4,71
116	БВ	БВ	2,Ε+09	8.ΕΗ37	2,Ε+07	7,Ε+08	-1,93	1,56	-0,37
117	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	3.Ε+Ο5	Ι,Ε+06	5,43	0,59	6,01
118	ОБВ	ПТ	2.Ε+05	Ο,ΕηΟΟ	2.Ε+06	9,Ε+0ό	1,06	0,64	1,70
119	БВ	БВ	5,Ε+0ό	Ο,Ε+00	Ι,Ε+05	Ι,Ε+07	-1,62	1,92	0,31
120	БВ	БВ	5.Ε+08	4,Ε1-07	2.Ε+06	5,Ε+07	-2,36	1,36	-1,00
121	БВ	БВ	Ι,Ε+09	ό,Εΐ-07	Ι,Ε+07	5,Ε+08	-1,91	1,53	-0,39
122	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+07	5.Ε+06	7,01	-0,28	6,73
123	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε+00	3.Ε+Ο5	Ι,Ε+06	5,53	0,49	6,01
124	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+07	3,Ε+06	7,01	-0,55	6,46
125	ОБВ	ОБВ	0,Ε+0Ο	Ο,ΕηΟΟ	Ι,Ε+08	ό,Ε+07	8,08	-0,32	7,76
126	ОБВ	ПТ	0,Ε+00	0,Ε+00	7,Ε+04	Ι,Ε+06	4,82	1,19	6,01
127	ОБВ	пт	2,Ε+03	Ο,ΕηΟΟ	Ι,Ε+03	Ι,Ε+06	-0,20	2,97	2,77
128	ОБВ	ОБВ	7.Ε+03	0,Ε+00	Ι,Ε+07	5,Ε+06	3,20	-0,35	2,85

- 10 025042

129	ОБВ	ПТ	ЗХ+05	З.ЕЮ5	3,Ε+05	Ι,Ε+06	-0,19	0,46	0,27
130	ОБВ	ПТ	0,Е+00	Ο,ΕΚΙΟ	3.Ε+04	2,Ε+06	4,54	1,80	6,33
131	ОБВ	ОБВ	4,Е+05	Ο,Ε+00	7.Γ+08	4,Ε+08	3,18	-0,20	2,98
132	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε Κ0	2.Ε+06	ό,Ε+05	6,19	-0,40	5,78
133	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε КО	1.Ε4 08	7,Ε+07	8,15	-0,31	7,84
134	ОБВ	ОБВ	О,Е+0О	Ο,Ε КО	δ,Ε+06	Ι,Ε+07	6,93	0,23	7,15
135	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε КО	3,Ε+07	δ,Ε+06	7,50	-0,60	6,90
136	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	Ο,Ε+00	4,Ε+06	2.Ε+06	2,29	-0,21	2,09
137	ОБВ	ОБВ	1,Е+06	5,ΕΚ)3	3,Ε+08	4.Ε+08	2,55	0,04	2,59
138	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0.ЕЩ0	2,Ε+08	Ι,Ε+08	8,21	-0,08	8,13
139	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε Κ0	7,Ε+07	Ι,Ε+07	7,84	-0,85	6,99
140	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	7,Ε+06	7,02	-0,18	6,84
141	ОБВ	ОБВ	ЦЕ+03	Ο,Ε Κ0	4,Ε+08	2,Ε+08	5,62	-0,30	5,32
142	ОБВ	ОБВ	О,Е+00	Ο,Ε+00	8.Ε+07	ό,Ε+07	7,90	-0,09	7,81
143	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,ΕΚΙΟ	7.Ε+07	7.Ε+07	7,84	-0,03	7,81
144	ОБВ	ОБВ	1.ЕЧЙЗ	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	Ι,Ε+08	4,99	-0,06	4,93
145	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,ΕΚΙΟ	2.Ε+07	Ι,Ε+07	7,24	-0,24	7,00
146	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,ΕΚΙΟ	3.Ε+07	2.Ε+Ο7	7,54	-0,14	7,39
147	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε Κ0	Ι,Ε+07	7,Ε+06	7,03	-0,18	6,84
148	ОБВ	ОБВ	4,Е+05	Ο,ΕΚΙΟ	5,Ε+06	3.Ε+06	Ι,π	-0,17	0,94
149	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε Κ0	9,Ε+07	7.Ε+07	7,95	-0,08	7,87
150	ОБВ	ОБВ	0,Е КО	Ο,ΕΚΙΟ	4,Ε+07	3.Ε+07	7,59	-0,07	7,51
151	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε Ю0	Ι,Ε+08	8,Ε+07	8,06	-0,14	7,92
152	ОБВ	ОБВ	0,Е+О0	Ο,Ε Щ0	Ι,Ε+06	8,Ε+05	6,08	-0,19	5,89
153	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε КО	8,Ε+07	7,Ε+07	7,90	-0,04	7,86
154	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε КО	2,Ε+06	2,Ε+06	6,37	-0,17	6,19
155	ОБВ	ОБВ	2,Е+03	Ο,Ε Ю0	Ι,Ε+07	8,Ε+06	3,77	-0,10	3,67
156	ОБВ	ОБВ	ЦЕ+05	Ο,Ε ИО	4.Ε+07	3.Ε+07	2,47	-0,15	2,32
157	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,ΕΚΙΟ	2,Ε+07	Ι,Ε+07	7,21	-0,18	7,03
158	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,ЕЮО	3.Ε+08	2.Ε+08	8,43	-0,06	8,37
159	ОБВ	ОБВ	4>Е+04	0,ЕЮ0	3.Ε+08	3.Ε+08	3,86	0,03	3,89
160	ОБВ	ОБВ	4.Е+06	Ο,ΕΚΙΟ	8,Ε+07	9.Ε+07	1,26	0,05	1.31
161	ОБВ	ОБВ	4,Е+03	1,ЕЮЗ	8,Ε+07	4,Ε+07	4,23	-0,30	3,93
162	ОБВ	ОБВ	6,Е+О3	Ο,Ε КО	7,Ε+08	Ι,Ε+09	5,10	0,13	5,23
163	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,Ε КО	3.Ε+Ο6	2,Ε+06	6,46	-0,22	6,24
164	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε ЮС	2,Ε+Ο5	Ι,Ε+06	5,24	0,91	6,14
165	ОБВ	ОБВ	6,Е+04	Ο,ΕηΟΟ	2,Ε+08	2,Ε+08	3,53	-0,09	3,44
166	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε КО	3,Ε+08	2,Ε+08	8,50	-0,27	8,23
167	ОБВ	ОБВ	0,Ε+0ΰ	Ο,Ε КО	3,Ε+08	4,Ε+08	8,54	0,01	8,55
168	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	ο,ε то	1 ,Ε+08	9,Ε+07	8,06	-0,12	7,93
169	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	ο,ε то	Ι,Ε+07	Ι,Ε+07	7,10	-0,10	7,00
170	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	ο,ε то	7,Ε+07	3,Ε+Ο7	7,83	-0,29	7,54
171	ОБВ	ОБВ	2,Ε+03	Ο,Ε КО	2,Ε+08	ό,Ε+07	4,88	-0,39	4,49
172	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε КО	2,Ε+07	Ι,Ε+07	7,26	-0,28	6,98
173	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,Ε КО	2,Ε+08	9,Ε+07	5,21	-0,26	4,95
174	ОБВ	ОБВ	2.Ε+Ο5	Ο,Ε КО	3,Ε+07	2,Ε+07	2,1,	-0,17	1,94

- 11 025042

175	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0.БЮ0	8.Е+07	5.Е+07	7,91	-0,20	7,71
176	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,ЕЮ0	2.Е+04	1 ;Е+06	4,29	1,74	6,03
177	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Е+00	Ι,Ε+08	1,Е+О8	8,02	-0,01	8,01
178	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	О.ЕЮО	2.Е+08	2.Е+08	8,29	0,07	8,37
179	ОБВ	ОБВ	3,Е+03	0,ЕЮ0	4.Е+08	2.Е+08	5,04	-0,28	4,76
180	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,ЕЮ0	6.Е+07	4.Е+07	7,75	-0,10	7,65
181	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+04	0,ЕЮ0	Ι,Ε+07	5.Е+06	2,85	-0,32	2,53
182	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	0,Е+00	7.Е+07	5.Е+07	3,58	-0,13	3,45
183	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	О.ЕЮО	З.Е+08	Ι,Ε+08	8,50	-0,38	8,12
184	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,ЕЮ0	2,Е+08	2.Е+08	8,28	0,01	8,29
185	ОБВ	ОБВ	З.Е+ОЗ	0.ЕЮ0	З.Е+07	З.Е+07	3,93	0,00	3,94
186	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	О.ГЮО	5,Е+08	4.Е+08	8,73	-0,11	8,61
187	ОБВ	ОБВ	З.Е+04	0,ЕЮ0	Ι,Ε+07	8,Е+06	2,65	-0,13	2,51
188	ОБВ	ОБВ	2.Е+04	0,ЕЮ0	9.Е+06	4.Е+06	2,60	-0,32	2,28
189	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	о,еюо	2,Е+06	8.Е+05	6,22	-0,30	5,92
190	ОБВ	ОБВ	З.Е+04	0.ЕЮ0	1.Е+08	9.Е+07	3,49	-0,03	3,46
191	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Е+00	8.Е+0Й	7.Е+06	6,92	-0,07	6,85
192	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	2,Е+05	6.Е+08	2.Е+08	3,51	-0,43	3,07
193	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0.ЕЮ0	З.Е+08	2.Е+08	8,52	-0,30	8,22
194	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	6.Е+05	Ι,Ε+06	5,80	0,35	6,14
195	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0.ЕЮ0	З.Е+06	2,Е+08	6,45	1,90	8,34
196	ОБВ	ОБВ	5,Е+04	0,ЕЮ0	9.Е+05	2.Е+06	1,24	0,36	1,60
197	ОБВ	ОБВ	7.Е+03	Ο,Ε+ΟΟ	4,Е+08	2,Е+08	4.73	-0,28	4,45
198	ОБВ	ОБВ	1,Е+03	0,ЕКЮ	9,Е+04	1,Е+06	1,86	1,14	3,00
199	ОБВ	ОБВ	1.Е+03	0.ЕЮ0	2.Е+08	Ι,Ε+08	5,20	-0,32	4,87
200	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	0,ЕЮ0	5.Е+06	4.Е+06	6,70	-0,09	6,62
201	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+05	2,Е+04	1 ,Е+07	] ,Е+07	1,86	0,00	1,86
202	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	О.ЕЮО	З.Е+08	2.Е+08	8,45	-0,10	8,35
203	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	О.ЕЮО	8.Е+07	7.Е+07	7,91	-0,06	7,85
204	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Е+0О	Ι,Ε+06	8,Е+05	6,01	-0,10	5,91
205	ОБВ	ОБВ	0,Ε+0ΰ	0.ЕЮ0	З.Е+04	Ι,Ε+06	4,41	1,61	6,03
206	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0.Е+00	2.Е+02	2.Е+06	2,30	4,07	6,37
207	ОБВ	ОБВ	4.Е+05	2.Е+03	2.Е+08	Ι,Ε+08	2,68	-0,11	2,56
208	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	1.Е+07	З.Е+07	З.Е+07	0,30	0,03	0,33
209	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Е+00	2.Е+08	2.Е+08	8,28	-0,09	8,19
210	ОБВ	ОБВ	9.Е+03	Ο,Ε+00	5.Е+03	8.Е+06	-0,23	3,19	2,96
211	ОБВ	ОБВ	5.Е+ОЗ	1.Е+03	2,Е+06	Ι,Ε+06	2,46	-0,20	2,27
212	ОБВ	ОБВ	З.Е+05	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	9.Е+06	1,51	-0,10	1,41
213	БВ	БВ	З.Е+08	1,ЕЮ8	2.Е+05	2.Е+08	-3,21	2,88	-0,33
214	БВ	БВ	Ι,Ε+06	О,Е+О0	5,Е+02	2.Е+06	-3,34	3,60	0,26
215	БВ	БВ	4.Е+08	Ι,Ε+08	6.Е+06	6,Е+08	-1,94	1,95	0,00
216	ОБВ	пт	Ο,Ε+00	0.Е+00	Ι,Ε+05	4.Е+07	4,98	2,61	7,59
217	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0.Е+00	9.Е+03	2.Е+06	3,95	2,35	6,30
218	БВ	БВ	1,Е+07	Ο,Ε+ΟΟ	Ι,Ε+07	1,Е+07	0,12	-0,03	0,09
219	ОБВ	пт	3,Е+06	0.Е+00	З.Е+06	2.Е+06	-0,01	-0,10	-0,11
220	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,Ε+00	9.Е+05	2.Е+06	5,97	0,34	6,30

- 12 025042

221	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Е+0О	Ι,Ε+05	6,Ε+06	5,17	1,57	6,74
222	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,ЕЮ0	Ι,Ε+05	2,Ε+06	5,02	1,28	6,30
223	БВ	БВ	1.Е+09	0,Е+ОО	3,Ε+08	8.Ε+08	-0,73	0,48	-0,25
224	ОБВ	ОБВ	3,Е+03	Ο,Ε+00	1,ΕΡ)6	3.Ε+06	2,71	0,29	3,01
225	ОБВ	ПТ	1,Е+08	0,Е+ОО	2,Ε+07	5.Ε+07	-0,94	0,46	-0,48
226	ОБВ	ПТ	6.Е+05	0,Е+00	9,Ε+07	Ι,Ε+08	2,19	0,02	2,21
227	ОБВ	ОБВ	2,Е+05	0,ЕЮ0	5,Ε+06	3,Ε+06	1,50	-0,20	1,30
228	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	ϋ,Ε+00	4,Ε+08	4,Ε+08	8,57	0,02	8,59
229	ОБВ	ПТ	2,Е+03	6.Е+07	5,Ε+07	7.Ε+07	-0,10	0,15	0,05
230	ОБВ	ОБВ	1,Е+04	0_тЕ+00	3,Ε+08	3,Ε+08	4,44	-0,10	4,34
231	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0.ЕЮ0	4,Ε+06	3.Ε+06	6,57	-0,11	6,46
232	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	8,Ε+05	2.Ε+07	5,88	1,38	7,27
233	БВ	БВ	З.Е+09	8.Ε+07	6,Ε+06	4,Ε+08	-2,68	1,84	-0.84
234	ОБВ	ОБВ	О,Е+00	0,ЕЮ0	5,Ε+01	2,Ε+06	1,69	4,61	6,30
235	ОБВ	ОБВ	4.Е+04	Ο,ΕγΟΟ	Ι,Ε+06	7.Ε+05	1,55	-0,24	1,31
236	БВ	БВ	5,Е+09	0,Е+00	6,Ε+04	7,Ε+Ο8	-4,91	4,10	-0,81
237	ОБВ	ОБВ	4,Е+03	0,Е+00	9,Ε+08	9,Ε+08	5,31	0,00	5,32
238	ОБВ	ОБВ	5,Е+О3	Ο,Ε+00	2,Ε+08	2,Ε+08	4,59	-0,04	4,55
239	ОБВ	ОБВ	7,Е+03	Ο,Ε+00	2,Ε+07	Ι,Ε+07	3,40	-0,21	3,19
240	ОБВ	ОБВ	б,Е+03	Ο,Ε+00	6.Ε+06	5,Ε+06	3,02	-0,15	2,87
241	ОБВ	ОБВ	5.Е+03	Ο,Ει-ΟΟ	7.Ε+07	4.Ε+07	4,20	-0,28	3,92
242	ОБВ	ОБВ	7.Е+05	Ο,Ε+00	Ι,Ε+06	6,Ε+05	0,16	-0,23	-0,07
243	ОБВ	ОБВ	4,Е+03	Ο,ΕγΟΟ	4,Ε+06	Ι,Ε+07	3,01	0,42	3,43
244	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,Ε+00	3,Ε+07	3,Ε+07	4,42	-0,04	4,38
245	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,ΕγΟΟ	3,Ε+Ο8	4,Ε+08	5,50	0,09	5,59
246	ОБВ	ПТ	8,Е+07	0,Ε+00	3.Ε+06	1 ,Ε+07	-1,43	0,58	-0,85
247	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,Ε+00	2,Ε+04	1 ,Ε+06	4,37	1,65	6,02
245	ОБВ	пт	2.Е+06	2,Ε*-04	Ι,Ε+07	8,Ε+0ό	0,82	-0,12	0,70
249	ОБВ	ОБВ	3,Е+04	Ο,Ε+00	5,Ε+04	1 ,Ε+06	0,27	1,32	1,59
250	ОБВ	ПТ	6.Е+06	6.ЕЮ5	3.Ε+06	5,Ε+06	-0,38	0,25	-0,13
251	ОБВ	пт	Ι,Ε+07	\|,ЕЮ7	5,Ε+06	2.Ε+07	-0,69	0,62	-0,07
252	ОБВ	ОБВ	2.Е+04	Ο,ΕγΟΟ	Ι,Ε+07	2,Ε+07	2,74	0,32	3,06
253	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	2,Ε+07	7,10	0,15	7,24
254	ОБВ	ОБВ	5.Е+03	0,Ε+00	Ι,Ε+07	3,Ε+07	3,43	0,35	3,78
255	ОБВ	пт	7,Е+07	0,ЕЮ0	5,Ε+07	9,Ε+07	-0,15	0,26	0,11
256	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	4,Ε+04	Ι,Ε+06	4,60	1,42	6,02
257	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	0,Ε+00	β,Ε+05	Ι,Ε+06	2,83	0,10	2,94
258	ОБВ	ОБВ	5,Е+03	Ο,Ε+00	3.Ε+08	3,Ε+08	4,81	0,00	4,81
259	ОБВ	ОБВ	О,Е+0О	0,Ε+00	3.Ε+08	4,Ε+08	8,49	0,11	8,60
260	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	7.Ε+05	Ι,Ε+06	5,87	0,16	6,02
261	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,Ε+00	2.Ε+05	Ι,Ε+06	5,40	0,63	6,02
262	ОБВ	ОБВ	2.Е+03	Ο,Ε+00	7,Ε+06	Ι,Ε+08	3,60	1,21	4,81
263	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	2.Ε+06	2,Ε+06	6,36	-0,17	6,19
264	ОБВ	ОБВ	0,Е+0О	Ο,Ε+00	4.Ε+05	Ι,Ε+06	5,57	0,45	6,02
265	ОБВ	ОБВ	4,Е+04	Ο,Ε+00	6.Ε+05	Ι,Ε+06	1,19	0,25	1,44
266	ОБВ	ПТ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+08	9,Ε+07	7,98	-0,03	7,95
267	ОБВ	ОБВ	1,Е+03	Ο,Ε+00	8,Ε+05	Ι,Ε+06	2,90	0,09	2,99
268	ОБВ	ОБВ	7,ЕгОЗ	Ο,ΕΓΟΟ	Ι,Ε+07	7,Ε+06	3,19	-0,24	2,95
269	ОБВ	ОБВ	4,Е+08	7,Ε+07	4.Ε+05	5.Ε+08	-3,00	3,07	0,07
270	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	Ι,Ε+03	Ι,Ε+08	Ι,Ε+08	3,74	-0,05	3,69
271	БВ	БВ	б,Е+07	3.Ε+06	3,Ε+04	3.Ε+07	-3,34	3,08	-0,26
272	БВ	БВ	З.Е+07	Ι,Ε+07	3, Ε+06	2.Ε+07	-1,12	0,78	-0,34
273	БВ	БВ	6,Е+03	4, Ε+07	4,Ε+0ό	2,Ε+08	-0,99	1,76	0,78
274	ОБВ	пт	1.Е+04	2.Ε+04	6.Ε+04	Ι,Ε+06	0,26	1,35	1,61

Далее для анализа были выбраны только те образцы, для которых были получены совпадающие результаты по данным критериев Амселя и баллов Ньюджента (БВ, N=66, ОБВ, N=156), табл. 3 и 4 соответственно.

- 13 025042

Таблица 3

Результаты исследования методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени образцов от 66 пациенток с бактериальным вагинозом по критериям Амселя и по баллам Ньюджента

№	Амсель	Ньюд- жент	\|ДНКСу\|	\|ДНК Ат\|	1ДНК Ьас [	1ДНК Вас,	КС1	КС2	КСЗ
1	ЕВ	БВ	1,Е+08	8.Е+07	2.Ε+05	З.Е+08	-2,89	3,16	0,28
2	БВ	БВ	5,Е+06	Ι,Ε+09	8.Ε+07	7.Ε+08	-1,17	0,92	-0,26
3	БВ	БВ	5,Е+07	2.Е+07	3.Ε+06	7.Ε+07	-1,45	1,41	-0,04
4	БВ	БВ	2.Е+08	0,Е+00	6,Ε+02	2.Ε+07	-5,57	4,53	-1,04
5	БВ	БВ	2,Е+08	Ι,Ε+08	3,Ε+05	З.Е+08	-2,96	3,06	0,10
6	БВ	БВ	З.Е+07	Ι,Ε+08	2,Ε+06	9.Ε+08	-1,85	2,59	0,74
7	БВ	БВ	2,Е+09	2.Ε+08	1,Ε+Ο6	ό,Ε+08	-3,15	2,59	-0,56
8	БВ	БВ	5.Е+07	2.Ε+07	2.Ε+05	2.Ε+08	-2,58	3,06	0,49
9	БВ	БВ	З.Е+08	6.ЕЮ7	7,Ε+05	Ι,Ε+08	-2,79	2,24	-0,55
10	БВ	БВ	2.Е+О8	β,Ε+06	Ι,Ε+04	3.Ε+07	-4,08	3,29	-0,79
11	БВ	БВ	5.Е+08	Ο,Ε+ΟΟ	3.Ε+06	6.Ε+07	-2,22	1,25	-0,97
13	БВ	БВ	8.Е+04	7.Ε+05	2.Ε+03	2.Ε+06	-2,55	3,00	0,44
14	БВ	БВ	6,Е+08	7,Ε+07	Ι,Ε+05	9,Ε+07	-3,70	2,81	-0,89
18	БВ	БВ	6,Е+О8	3.Ε+Ο8	3.Ε+Ο6	9.Ε+08	-2,47	2,44	-0,03
20	БВ	БВ	8.Е+07	Ι,Ε+07	4.Ε+05	Ι,Ε+08	-2,37	2,43	0,06
22	БВ	БВ	3,Е+05	0,Ε+00	2.Ε+05	2.Ε+06	-0,06	0,94	0,88
24	БВ	БВ	2,Е+08	Ι,Ε+07	6.Ε+04	3,Ε+07	-3,52	2,68	-0,85
25	БВ	БВ	1,Е+08	Ο,Ε+ΟΟ	4.Ε+06	2,Ε+08	-1,50	1,69	0,19
26	БВ	БВ	3,Е+08	7.Ε+07	2.Ε+06	3.Ε+08	-2,26	2,17	-0,09
27	БВ	БВ	5,Е+О8	ό,Ε+07	8.Ε+07	2.Ε+08	-0,85	0,40	-0,46
30	БВ	БВ	1,Е+07	6,Ε+07	7.Ε+05	2.Ε+08	-2,06	2,35	0,29
32	БВ	БВ	Ι,Ε+07	4,Ε+07	6.Ε+05	3,Ε+Ο7	-1,94	1,73	-0,21
33	БВ	БВ	Ι,Ε+06	5,Ε+06	2,Ε+Ο5	2.Ε+06	-1,42	0,84	-0,58
35	БВ	БВ	Ι,Ε+08	9,Ε+06	ό,Ε+05	4,Ε+07	-2,27	1,85	-0,43
36	БВ	БВ	3,Е+07	4,Ε+07	ί,Ε+07	5.Ε+08	-0,81	1,62	0,81

- 14 025042

37	БВ	БВ	9,Е+08	6,ЕЮ7	8,Εά 06	2,Е+08	-2,07	1,34	-0,74
39	БВ	БВ	З.Ы-08	4.Е+07	З.Е+05	2,Е+08	-3,08	2,90	-0,18
40	БВ	БВ	2,Е4 08	1,ЕЮ8	З.Е+07	1,Е+08	-1,03	0,52	-0,51
42	БВ	ЬВ	4.ЕЮ7	0.Е+00	2.Е+06	Ι,Ε+08	-1,34	1,77	0,44
44	БВ	БВ	2,Е+08	0,ЕЮ0	2.Е+07	Ι,Ε+08	-0,96	0,67	-0,29
45	БВ	БВ	5.Е+06	1,ЕЮ6	З.Е+ОЗ	5,Е+06	-3,37	3,26	-0,11
47	БВ	БВ	3,Е+06	6,ЕЮ4	8,Е+06	5.Е+06	0,42	-0,16	0,26
48	БВ	БВ	0,Е+00	0,ЕЮ0	4,Е+08	2,Е+08	8,56	-0,32	8,24
49	БВ	БВ	1,Е+06	0,ЕЮ0	1.Е+02	З.Е+06	-3,83	4,23	0,40
51	БВ	БВ	8,Е+07	1,ЕЮ7	5,Е+04	5,Е+07	-3,29	3,00	-0,30
52	БВ	БВ	1,Е+06	2,ЕЮ6	1,Е+06	7.Е+06	-0,29	0,73	0,44
53	БВ	БВ	З.Е+07	2,ЕЮ6	1,Е+05	2,Е+07	-2,48	2,27	-0,21
54	БВ	БВ	2,Е+0б	2,ЕН)8	2.Е+06	З.Е+08	-2,00	2,15	0,15
55	БВ	БВ	Ι,Ε+08	4,ЕЮ7	3,Е+О5	9.Е+07	-2,68	2,47	-0,21
56	БВ	БВ	4,Е+08	б.ЕЮЗ	1,Е+05	2,Е+08	-3,42	3,06	-0,37
57	БВ	БВ	5, Е+08	1,ЕЮ8	4,Е+05	4,Е+08	-3,21	2,96	-0,26
58	БВ	БВ	2.Е+09	9,ЕЮ7	5.Е+07	8,Е+08	-1,67	1,26	-0,41
59	БВ	БВ	4.Е+09	1.ЕЮ8	4,Е+07	Ι,Ε+09	-2,03	1,56	-0,47
60	БВ	БВ	З.Е+09	2,Е+08	4,Е+07	1,Е+09	-1,87	1,39	-0,48
83	БВ	БВ	Ι,Ε+08	2,ЕШ6	8.Е+04	4.Е+08	-3,14	3,73	0,59
84	БВ	БВ	З.Е+08	1,ЕЮ7	1,Е+05	7,Е+07	-3,44	2,83	-0,62
94	БВ	БВ	0.Е+00	1,ЕЮ8	1,Е+05	4,Е+07	-2,91	2,49	-0,42
97	БВ	БВ	2,Е+07	1,ЕЮ6	5,Е+05	5.Е+06	-1,64	1,03	-0,61
107	БВ	БВ	Ι,Ε+09	9.ЕЮ7	1.Е+07	5,Е+08	-2,05	1,67	-0,37
108	БВ	БВ	5,Е+08	2,ЕЮ7	2.Е+07	2,Е+08	-1,50	1,11	-0,39
113	БВ	БВ	6,Е+О6	2,ЕЮ6	5.Е+06	7,Е+06	-0,17	0,14	-0,03
114	БВ	БВ	Ι,Ε+09	6,ЕЮ7	1.Е+07	7,Е+08	-1,94	1,68	-0,26
116	БВ	БВ	2.Е+09	8.ЕЮ7	2.Е+07	7_?Е+08	-1,93	1,56	-0,37
119	БВ	БВ	5,Е+06	0,ЕЮ0	1.Е+05	Ι,Ε+07	-1,62	1,92	0,31
120	БВ	БВ	5,Е+08	4,Е1-07	2.Е+06	5,Е+07	-2,36	1,36	-1,00
121	БВ	БВ	1,Е+09	6,Е Ю7	1,Е+07	5,Е+08	-1,91	1,53	-0,39
213	БВ	БВ	3,Е+08	1.ЕЮ8	2,Е+05	2,Е+08	-3,21	2,88	-0,33
214	БВ	БВ	1,Е+06	0,Е ЮО	5,Е+02	2,Е+06	-3,34	3,60	0,26
215	БВ	БВ	4,Е+08	1.ЕН08	6,Е+06	6,Е+08	-1,94	1,95	0,00
218	БВ	ЕВ	1 ,Е+07	0_;ЕьОО	Ι,Ε+07	Ι,Ε+07	0,12	-0,03	0,09
223	БВ	БВ	1,Ё+09	0,Е+00	З.Е+08	8,Е+08	-0,73	0,48	-0,25
233	БВ	БВ	3,Е+09	8.Е+07	6,Е+06	4,Е+08	-2,68	1,84	-0,84
236	БВ	БВ	5,Е+09	0.Е1-00	6,Е+04	7,Е+08	-4,91	4,10	-0,81
271	БВ	БВ	6.Е+07	3,ЕЮ6	3,Е+04	3,Е+07	-3,34	3,08	-0,26
272	БВ	БВ	З.Е+07	1.ЕЮ7	3,Е+06	2.Е+07	-1,12	0,78	-0,34
273	БВ	БВ	6.Е+03	4.Е Ю7	4,Е+06	2,Е+08	-0,99	1,76	0,78

- 15 025042

Таблица 4

Результаты исследования методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени образцов от 156 пациенток без бактериального вагиноза по критериям Амселя и по баллам Ньюджента

№	Амсель	Ныод- ягент	\|ДНКСу\|	!ΑΙ4ΚΑν\|	\|ДНК Бас\|	[ДНК Вас]	КС1	КС2	ксз
61	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	Ι,Ε+07	6.Ε+06	7,10	-0,36	6,75
62	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	3,Ε+08	2.Ε+08	8,51	-0,21	8,29
63	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	2,Ε+06	8.Ε+05	6,23	-0,32	5,91
68	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	8,Ε+07	6,Е+07	7,92	-0,12	7,79
70	ОБВ	ОБВ	2.Е+ОЗ	Ο,Ε+00	3,Ε+08	2.Ё+08	5,10	-0,10	5,00
71	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Ε+00	5.Ε+08	З.Е+08	8,66	-0,19	8,47
72	ОБВ	ОБВ	1 ,Е+05	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	9,Е+07	3,15	-0,18	2,97
73	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+06	0,Ε+00	3.Ε+06	Ι,Ε+07	0,38	0,75	1,13
74	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ϋΟ	0,Ε+0Ο	4,Ε+08	З.Е+08	8,63	-0,15	8,49
75	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	2.Ε+07	Ι,Ε+07	7,32	-0,19	7,13
77	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	6,Ε+07	4,Е+07	7,77	-0,15	7,62
79	ОБЕ	ОБВ	2.Ε+04	0,Ε+00	5,Ε+06	З.Е+06	2,44	-0,25	2,19
82	ОБВ	ОБВ	6,Ε+05	0,Ε+00	7,Ε+06	5.Е+06	1,06	-0,15	0,91
85	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+05	2.Ε+03	2,Ε+08	2,Е+08	3,24	-0,16	3,09
86	ОБВ	ОБВ	3,Ε+06	4,Ε+03	Ι,Ε+08	Ι,Ε+08	1,69	-0,15	1,54
88	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+07	7.Е+06	7,13	-0,27	6,86
90	ОБВ	ОБВ	2.Ε+04	Ι,Ε+03	Ι,Ε+09	5.Е+08	4,64	-0,28	4,36
92	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	0,Ε+00	4,Ε+07	2,Е+07	7,55	-0,28	7,27
93	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+Οΰ	Ο,Ε+00	2,Ε+08	2,Е+08	8,40	-0,21	8,19
95	ОБВ	ОБВ	4,Ε+03	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	5,Е+07	4,44	-0,32	4,12
96	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	0,Ε+00	2,Ε+08	1 ,Е+08	8,31	-0,27	8,04
100	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+05	9,Ε+04	2,Ε+07	3,Е+07	1,98	-0,28	1,69
101	ОБВ	ОБВ	2,Ε+07	0,Ε+00	2,Ε+08	8,Е+07	1,12	-0,40	0,72
102	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	2,Ε+06	8.Е+05	6,38	-0,46	5,92
106	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε+00	3,Ε+Ο8	1 ,Е+08	8,54	-0,51	8,03
по	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	0,Ε+00	2.Ε+07	8.Е+06	7,35	-0,46	6,89
111	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε+00	3,Ε+08	Ι,Ε+08	8,40	-0,32	8,08
115	ОБВ	ОБВ	5,Ε+03	0,Ε+00	5.Ε+08	З.Е+08	4,95	-0,24	4,71
117	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	ΰ,Ε+00	3,Ε+Ο5	1 ,Е+06	5,43	0,59	6,01
122	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε+00	1_τΕ+07	5,Е+06	7,01	-0,28	6,73
123	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	ΰ,Ε+00	3.Ε+Ο5	Ι,Ε+06	5,53	0,49	6,01
124	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	ΰ,Ε+00	Ι,Ε+07	З.Е+06	7,01	-0,55	6,46
125	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+08	6,Е+07	8,08	-0,32	7,76
128	ОБВ	ОБВ	7,Ε+03	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	5.Е+06	3,20	-0,35	2,85
131	ОБВ	ОБВ	4,Ε+05	0,Ε+00	7,Е+08	4,Е+08	3,18	-0,20	2,98
132	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε+00	2,Ε+0ό	ΰ,Ε+05	6,19	-0,40	5,78
133	ОЕВ	ОБВ	0,Ε+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	7,Е+07	8,15	-0,31	7,84
134	ОБВ	ОБВ	ΰ,Ε+00	0,Ε+0ΰ	8,Ε+06	1 ,Е+07	6,93	0,23	7,15
135	ОБВ	ОБВ	0,Ε+00	0,Ε+00	3.Ε+07	8,Е+06	7,50	-0,60	6,90
136	ОБВ	ОБВ	2,Ε+04	Ο,Ε+00	4.Ε+06	2,Е+Об	2,29	-0,21	2,09

- 16 025042

137	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+06	5.Е+03	3.Ε+08	4,Ε+08	2,55	0,04	2,59
138	ОБВ	ОБВ	0_?Е+00	0.Е+00	2,Ε+08	Ι,Ε+08	8,21	-0,08	8,13
139	ОБВ	ОБВ	0,ЕЮ0	Ο,Ε+00	7,Ε+07	Ι,Ε+07	7,84	-0,85	6,99
140	ОБВ	ОБВ	О>Е+0О	0.Е+00	Ι,Ε+07	7,Ε+06	7,02	-0,18	6,84
141	ОБВ	ОБВ	1,Е+03	0,Е+00	4,Ε+08	2,Ε+08	5,62	-0,30	5,32
142	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+ΟΟ	β,Ε+07	6.Ε+07	7,90	-0,09	7,81
143	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Е+00	7.Ε+07	7,Ε+07	7,84	-0,03	7,81
144	ОБВ	ОБВ	1₊Е+03	0,Е+00	Ι,Ε+08	Ι,Ε+08	4,99	-0,06	4,93
145	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Е+00	2,Ε+07	Ι,Ε+07	7,24	-0,24	7,00
146	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Е+00	3,Ε+07	2,Ε+07	7,54	-0,14	7,39
147	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0.Е+00	Ι,Ε+07	7,Ε+06	7,03	-0,18	6,84
148	ОБВ	ОБВ	4.Е+05	0,Е+00	5,Ε+06	3.Ε+06	1,11	-0,17	0,94
149	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0, Е4 00	9.Ε+07	7,Ε+07	7,95	-0,08	7,87
150	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	Ο,Ε+00	4.Ε+07	3.Ε+07	7,59	-0,07	7,51
151	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	8,Ε+07	8,06	-0,14	7,92
152	ОБВ	ОБВ	О.Е+ОО	Ο,Ε+00	Ι,Ε+06	8,Ε+Ο5	6,08	-0,19	5,89
153	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	8.Ε+07	7.Ε+07	7,90	-0,04	7,86
154	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	2.Ε+06	2,Ε+06	6,37	-0,17	6,19
155	ОБВ	ОБВ	2,Е+03	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	8,Ε+06	3,77	-0,10	3,67
156	ОБВ	ОБВ	1,Е+05	Ο,Ε+00	4.Ε+07	3,Ε+07	2,47	-0,15	2,32
157	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,ΕτΟΟ	2.Ε+07	Ι,Ε+07	7,21	-0,18	7,03
158	ОБВ	ОБВ	О,Е+0О	Ο,Ε+00	3.Ε+08	2,Ε+08	8,43	-0,06	8,37
159	ОБВ	ОБВ	4,Е+04	ο,ε+οο	3.Ε+08	3,Ε+08	3,86	0,03	3,89
160	ОБВ	ОБВ	4,Е+0б	Ο,Ε+ΟΟ	Ε,Ε+07	9,Ε+07	1,26	0,05	1,31
161	ОБВ	ОБВ	4.Е+03	1.Ε403	8,Ε+07	4,Ε+07	4,23	-0,30	3,93
162	ОБВ	ОБВ	б,Е+03	Ο,Ε+00	7.Ε+08	Ι,Ε+09	5,10	0,13	5,23
163	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε4 00	3.Ε+06	2.Ε+06	6,46	-0,22	6,24
164	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε-ίΟΟ	2,Ε+05	Ι,Ε+06	5,24	0,91	6,14
165	ОБВ	ОБВ	б.Е+04	Ο,Ε+00	2,Ε+08	2,Ε+08	3,53	-0,09	3,44
166	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+00	3.Ε+08	2.Ε+08	8,50	-0,27	8,23
167	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε40Ο	3.Ε+08	4.Ε+08	8,54	0,01	8,55
168	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	9,Ε+07	8,06	-0,12	7,93
169	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	Ι,Ε+07	7,10	-0,10	7,00
170	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	7,Ε+07	3,Ε+07	7,83	-0,29	7,54
171	ОБВ	ОБВ	2,Е+03	Ο,Ε+00	2,Ε+08	6,Ε+07	4,88	-0,39	4,49
172	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	2.Ε+07	Ι,Ε+07	7,26	-0,28	6,98
173	ОБВ	ОБВ	1.Е+03	0,Ε+ΘΟ	2.Ε+08	9.Ε+07	5,21	-0,26	4,95
174	ОБВ	ОБВ	2,Е+05	Ο,Ε+00	3,Ε+07	2.Ε+07	2Д1	-0,17	1,94
175	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Ε+00	8.Ε+07	5,Ε+07	7,91	-0,20	7,71
176	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	2.Ε+04	Ι,Ε+06	4,29	1,74	6,03
177	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Ε+00	Ι,Ε+08	Ι,Ε+08	8,02	-0,01	8,01
178	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	2.Ε+08	2,Ε+08	8,29	0,07	8,37
179	ОБВ	ОБВ	З.Е+ОЗ	0,Ε+00	4,Ε+08	2,Ε+08	5,04	-0,28	4,76
180	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	6,Ε+07	4,Ε+07	7,75	-0,10	7,65
181	ОБВ	ОБВ	1,Ё+04	0,Ε+00	Ι,Ε+07	5.Ε+06	2,85	-0,32	2,53
182	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	Ο,Ε+00	7.Ε+07	5.Ε+07	3,58	-0,13	3,45

- 17 025042

183	ОБВ	ОБВ	О,Е+О0	0,Е+00	3.Ε+08	Ι,Ε+08	8,50	-0,38	8,12
184	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	2,Ε+08	2.Ε+08	8,28	0,01	8,29
185	ОБВ	ОБВ	З.Е+ОЗ	Ο,Ε+00	3.Ε+07	3,Ε+07	3,93	0,00	3,94
186	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	5,Ε+08	4,Ε+08	8,73	-0,11	8,61
187	ОБВ	ОБВ	3,Е+04	Ο,Ε+00	Ι,Ε+07	8.Ε+06	2,65	-0,13	2,51
188	ОБВ	ОБВ	2,Е+04	Ο,Ε+ΟΟ	9,Ε+06	4,Ε+ϋό	2,60	-0,32	2,28
189	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+ΟΟ	2.Ε+06	8.Ε+05	6,22	-0,30	5,92
190	ОБВ	ОБВ	3,Е+04	Ο,Ε+00	Ι,Ε+08	9.Ε+07	3,49	-0,03	3,46
191	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	ο,ε+οο	δ,Ε+06	7.Ε+06	6,92	-0,07	6,85
192	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	2.Ε+05	ό,Ε+08	2,Ε+08	3,51	-0,43	3,07
193	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	3,Ε+08	2,Ε+08	8,52	-0,30	8,22
194	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	ό,Ε+05	Ι,Ε+06	5,80	0,35	6,14
195	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+ΟΟ	3.Ε+06	2.Ε+08	6,45	1,90	8,34
196	ОБВ	ОБВ	5,Е+04	0,Ε+00	9,Ε+05	2.Ε+06	1,24	0,36	1,60
197	ОБВ	ОБВ	7,Е+03	Ο,Ε+00	4,Ε+08	2.Ε+08	4,73	-0,28	4,45
198	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	0_}Ε+00	9,Ε+04	Ι,Ε+06	1,86	1,14	3,00
199	ОБВ	ОБВ	1,Е+03	Ο,Ε+00	2.Ε+08	Ι,Ε+08	5,20	-0,32	4,87
200	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	5.Ε+06	4,Ε+06	6,70	-0,09	6,62
201	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+05	2,Ε+04	Ι,Ε+07	Ι,Ε+07	1,86	0,00	1,86
202	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	3,Ε+08	2,Ε+08	8,45	-0,10	8,35
203	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+ΟΟ	8,Ε+07	7,Ε+07	7,91	-0,06	7,85
204	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+06	8,Ε+05	6,01	-0,10	5,91
205	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	3.Ε+04	Ι,Ε+06	4,41	1,61	6,03
206	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	2,Ε+02	2,Ε+06	2,30	4,07	6,37
207	ОБВ	ОБВ	4.Е+05	2.Ε+03	2.Ε+08	Ι,Ε+08	2,68	-0,11	2,56
208	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	1,Ε+07	3.Ε+07	3,Ε+Ο7	0,30	0,03	0,33
209	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	2,Ε+08	2,Ε+08	8,28	-0,09	8,19
210	ОБВ	ОБВ	9.Е+03	Ο,Ε+ΟΟ	5,Ε+03	8,Ε+06	-0,23	3,19	2,96
211	ОБВ	ОБВ	5.Е+ОЗ	Ι,Ε+03	2.Ε+06	Ι,Ε+06	2,46	-0,20	2,27
212	ОБВ	ОБВ	З.Е+05	Ο,Ε+00	! ,Ε+07	9.Ε+06	1,51	-0,10	1,41
217	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	9,Ε+03	2,Ε+06	3,95	2,35	6,30
220	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	9,Ε+05	2,Ε+06	5,97	0,34	6,30
221	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+05	6,Ε+06	5,17	1,57	6,74
222	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,Ε+00	Ι,Ε+05	2,Ε+06	5,02	1,28	6,30
224	ОБВ	ОБВ	3,Е+О3	Ο,Ε+00	Ι,Ε+06	3,Ε+06	2,71	0,29	3,01
227	ОБВ	ОБВ	2.Е+05	Ο,Ε+00	5.Ε+06	3,Ε+06	1,50	-0,20	1,30
228	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	4.Ε+08	4,Ε+08	8,57	0,02	8,59
230	ОБВ	ОБВ	1,Е+04	Ο,Ε+00	3.Ε+Ο8	3,Ε+08	4,44	-0,10	4,34
231	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	4.Ε+06	3,Ε+06	6,57	-0,11	6,46
232	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	Ο,Ε+00	8,Ε+05	2,Ε+07	5,88	1,38	7,27
234	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	5,Ε+01	2,Ε+06	1,69	4,61	6,30
235	ОБВ	ОБВ	4,Е+04	Ο,Ε+00	Ι,Ε+06	7,Ε+05	1,55	-0,24	1,31
237	ОБВ	ОБВ	4.Е+03	0,Ε+00	9,Ε+08	9,Ε+Ο8	5,31	0,00	5,32
238	ОБВ	ОБВ	5.Е+03	Ο,Ε+00	2.Ε+08	2,Ε+0»	4,59	-0,04	4,55
239	ОБВ	ОБВ	7.Е+03	Ο,Ε+00	2.Ε+07	Ι,Ε+07	3,40	-0,21	3,19
240	ОБВ	ОБВ	6.Е+03	Ο,Ε+00	ό,Ε+06	5,Ε+06	3,02	-0,15	2,87

- 18 025042

241	ОБВ	ОБВ	5.Е+03	Ο,Ε+ΟΟ	7,Ε+07	4, Ε+07	4,20	-0,28	3,92
242	ОБВ	ОБВ	7.Е+05	Ο,Ε+ΟΟ	Ι,Ε+06	6.Ε+05	0,16	-0,23	-0,07
243	ОБВ	ОБВ	4.Е+03	Ο,Ε+ΟΟ	4.Ε+06	Ι,Ε+07	3,01	0,42	3,43
244	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,Ε+ΟΟ	3.Ε+07	3,Ε+07	4,42	-0,04	4,38
245	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,Ε+ΟΟ	3,Ε+08	4,Ε+08	5,50	0,09	5,59
247	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	2,Ε+04	Ι,Ε+06	4,37	1,65	6,02
249	ОБВ	ОБВ	З.Е+04	Ο,Ε+ΟΟ	5,Ε+04	Ι,Ε+06	0,27	1,32	1,59
252	ОБВ	ОБВ	2.Е+04	Ο,Ε+ΟΟ	1,Ε+07	2,Ε+07	2,74	0,32	3,06
253	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	0,Ε+00	Ι,Ε+07	2,Ε+07	7,10	0,15	7,24
254	ОБВ	ОБВ	5.Е+03	0,Ε+00	1,Ε+07	3,Ε+07	3,43	0,35	3,78
256	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	4,Ε+04	Ι,Ε+06	4,60	1,42	6,02
257	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,Ε+ΟΟ	8,Ε+05	Ι,Ε+06	2,83	0,10	2,94
258	ОБВ	ОБВ	5,Ε+03	ΰ,Ε4 00	3,Ε+Ο8	3,Ε+08	4,81	0,00	4,81
259	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	3.Ε+08	4.Ε+08	8,49	0,11	8,60
260	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	7.Ε+05	Ι,Ε+06	5,87	0,16	6,02
261	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	2.Ε+05	Ι,Ε+06	5,40	0,63	6,02
262	ОБВ	ОБВ	2.Ε+03	Ο,Ε+ΟΟ	7.Ε+06	Ι,Ε+08	3,60	1,21	4,81
263	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	2,Ε+06	2.Ε+06	6,36	-0,17	6,19
264	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+ΟΟ	Ο,Ε+ΟΟ	4.Ε+05	Ι,Ε+06	5,57	0,45	6,02
265	ОБВ	ОБВ	4.Ε+04	Ο,Ε+ΟΟ	6.Ε+05	Ι,Ε+06	1,19	0,25	1,44
267	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	Ο,Ε+ΟΟ	8,Ε+05	Ι,Ε+06	2,90	0,09	2,99
268	ОБВ	ОБВ	7.Ε+03	Ο,Ε+ΟΟ	1,Ε+07	7.Ε+06	3,19	-0,24	2,95
269	ОБВ	ОБВ	4.Ε+08	7,Ε+ 07	4,Ε+05	5.Ε+08	-3,00	3,07	0,07
270	ОБВ	ОБВ	2,Ε+04	ΐ,Ε-ЮЗ	1 ,Ε+08	1 ,Ε+08	3,74	-0,05	3,69

Из табл. 2-4 видно, что для всех образцов значение показателя [ДНК Вас] превышает 10⁵ ГЭ/мл, т.е. интерпретировать значения ниже этого порога не представляется возможным, поэтому в качестве нижнего порога валидности образцов было принято значение [ДНК Вас] 10⁵ ГЭ/мл.

Далее было определено нормальное количество бактерий на слизистой влагалища женщины репродуктивного возраста. Для этого оценили распределение пациенток по общему количеству бактерий и путём отсечения пяти процентов наименьших значений была принята нижняя граница нормы [ДНК Вас] 10⁶ ГЭ/мл (фиг. 1).

Таким образом, на основании вышеприведённых данных, а также статистической обработки рассчитанных коэффициентов соотношений концентраций бактерий были сформированы критерии дифференциальной диагностики отсутствия бактериального вагиноза, в том числе частного случая отсутствия бактериального вагиноза - снижения степени бактериальной обсеменённости влагалища, промежуточного состояния микрофлоры и бактериального вагиноза.

При 1§ [ДНК Вас]>5, КС1>1 и КС2<1 констатируют отсутствие бактериального вагиноза, при этом при 5<1д [ДНК Вас]<6 дополнительно констатируют снижение степени бактериальной обсеменённости влагалища.

При 1§ [ДНК Вас]>5, 0,5<КС1<1, КС2<1 и КС3<2 констатируют промежуточное состояние микрофлоры.

При 1§ [ДНК Вас]>5, КС1<0,5 и КС3<2 диагностируют бактериальный вагиноз.

При 1§ [ДНК Вас]<5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа.

При констатации промежуточного состояния микрофлоры дополнительно определяют наличие у пациентки жалоб на патологические выделения и рН выделений. При рН<4,5 и отсутствии жалоб на патологические выделения пациентке рекомендуют повторить анализ в следующем менструальном цикле, а при рН>4,5 и наличии жалоб на патологические выделения у пациентки диагностируют бактериальный вагиноз.

Суммарные данные по распределению заключений, полученных с использованием расширенного золотого стандарта и способа по изобретению, представлены в табл. 5.

- 19 025042

Совпадение результатов, полученных с использованием расширенного золотого стандарта и способа по изобретению

Таблица 5

Заключение («расширенный золотой стандарт»)	Количество пациенток	Заключение (способ но изобретению)
Бактериальный вагиноз	66	65 бактериальный вагиноз 1 отсутствие бактериального вагиноза
Отсутствие бактериального вагиноза	156	152 отсутствие бактериального вагиноза 4 бактериальный вагиноз

Таким образом, чувствительность способа по изобретению для диагностики бактериального вагиноза составила 98,5%, специфичность - 97,4%.

На втором этапе разработки способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры для дальнейшего анализа были выбраны образцы, снижение количества лактобактерий в которых не могло объясняться наличием БВ-ассоциированных микроорганизмов, N=22 (табл. 6).

Таблица 6

Результаты, полученные при обследовании 22 пациенток, у которых имеется нарушение баланса вагинальной микрофлоры, не объясняемое наличием БВ-ассоциированных микроорганизмов, с применением критериев Амселя, баллов Ньюджента и метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

№	Амсель	Ньюд- жент	\|ДНКСу]	(ДНК Αν]	\|ДНК 1.ас\|	(ДНК Вас\|	КС1	КС2	КСЗ
19	БВ	пт	0,Е+00	0,ЕИЮ	Ι,Ε+05	Ι,Ε+06	5,11	1,03	6,14
67	ОБВ	пт	0,Е+00	0.Е+00	4.Ε+03	1, Ε+Οό	3,65	2,40	6,05
80	ОБВ	пт	Ο,Ε+00	0,Ечю	Ι,Ε+06	3,Ε+07	6,08	1,44	7,51
81	ОБВ	пт	2.Е+03	4,Е+04	7.Ε+04	2,Ε+06	0,15	1,37	1,52
91	ОБВ	пт	2.Е+03	Ο,Ε+00	Ι,Ε+05	2.Ε+08	1,62	3,20	4,81
126	ОБВ	пт	0.Е+00	0,Е+00	7,Ε+04	Ι,Ε+06	4,82	1,19	6,01
127	ОБВ	пт	2.Е+03	0,Е+00	Ι,Ε+03	Ι,Ε+06	-0,20	2,97	2,77
130	ОБВ	пт	0,Е+00	0,ЕЮ0	3,Ε+04	2,Ε+06	4,54	1,80	6,33
176	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,ЕЮ0	2,Ε+04	Ι,Ε+06	4,29	1,74	6,03
195	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,ЕЮ0	3,Ε+06	2,Ε+08	6,45	1,90	8,34
198	ОБВ	ОБВ	Ι,Ε+03	0.ЕЮ0	9,Ε+04	Ι,Ε+06	1,86	1,14	3,00
205	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,ЕЮО	3,Ε+04	Ι,Ε+06	4,41	1,61	6,03
206	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,ΕΠΗ)	2,Ε+02	2.Ε+06	2,30	4,07	6,37
210	ОБВ	ОБВ	9,Е+03	0,ЕКЮ	5.Ε+03	8.Ε+06	-0,23	3,19	2,96
216	ОБВ	ПТ	Ο,Ε+00	Ο,ΕΠΗ)	Ι,Ε+05	4.Ε+07	4,98	2,61	7,59
217	ОБВ	ОБВ	Ο,Ε+00	0,Е+00	9,Ε+03	2,Ε+06	3,95	2,35	6,30
221	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	Ο,ΕτΰΟ	1 ,Ε+05	6,Ε+06	5,17	1,57	6,74
222	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Е+00	Ι,Ε+05	2.Ε+06	5,02	1,28	6,30
232	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Е+00	8.Ε+05	2,Ε+07	5,88	1,38	7,27
234	ОБВ	ОБВ	О.Е-ЩО	0,Ε+00	5,Ε+0Ι	2,Ε+06	1,69	4,61	6,30
247	ОБВ	ОБВ	0.Е+00	0,Ε+00	2,Ε+04	Ι,Ε+06	4,37	1,65	6,02
249	ОБВ	ОБВ	3,Е+04	0,Ε+00	5,Ε+04	Ι,Ε+06	0,27	1,32	1,59
256	ОБВ	ОБВ	0,Е+00	0,Ε+00	4.Ε+04	Ι,Ε+06	4,60	1,42	6,02
262	ОБВ	ОБВ	2,Е+03	0,Ε+00	7.Ε+06	Ι,Ε+08	3,60	1,21	4,81
274	ОБВ	пт	1,Е+04	2,Ε+04	ό,Ε+04	Ι,Ε+06	0,26	1,35	1,61

Второй этап включал в себя следующее.

1. Диагностику аэробного вагинита, основанную на микроскопии нативных препаратов (влагалищных мазков) и подсчётом баллов аэробного вагинита (АВ баллы). Методика определения АВ баллов включает в себя оценку лактобациллярной степени и морфотипов сопутствующей флоры, а также подсчёт лейкоцитов и парабазальных эпителиоцитов |Эопбег8 О.О.О. с1 а1. ОсГпШюп оГ а 1уре оГ аЬпотта1 уадша1 йота 1Па1 ίδ άίδΐίικ! Ггот Ьас1епа1 уадшок1к: аетоЫс уад1тЙ8. ВГОС. 2002 1ап; 109(1): 34-43]. В соответствии с классификацией, предложенной Эопбег8 С.С.С. е! а1., при получении 3 АВ баллов и более у пациентки диагностируют аэробный вагинит.

- 20 025042

2. Выбор оптимальных количественных диагностических маркеров аэробного вагинита:

а) оценка информативности основных четырёх групп аэробных микроорганизмов (Ейег οЬас!е^^асеае, Б^рНу^^сс^ δρρ., Б!^еρ!οсοссиδ δρρ., Е^ею^сс^ !рр.) показала непригодность Е^ею^сс^ δρρ. в качестве количественного диагностического маркера аэробного вагинита (фиг. 2);

б) оценка возможности выявления отдельных видов аэробных микроорганизмов для диагностики аэробного вагинита ^сНепсЫа той, Б^рНу^^сс^ ангещ, Б^ерй^сс^ ада1асйае) установила низкую чувствительность (48%) данной совокупности маркеров для диагностики аэробного вагинита.

Таким образом, в качестве количественных диагностических маркеров аэробного вагинита были выбраны следующие три группы аэробных микроорганизмов на уровне родов/семейств: ЕйегоЬайепасеае, Б^рНу^^сс^ δρρ., Б^ерй^сс^ δρρ.

3. Определение концентрации ДНК Ейег οЬас!е^^асеае, концентрации ДНК бактерий δ^^ο^οου! δρρ., концентрации ДНК бактерий БЛер^отсс^ !рр. во влагалищном мазке методом амплификации нуклеиновых кислот - мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Для проведения исследования методом мультиплексной ПЦР из ранее полученных вагинальных образцов проводили экстракцию нуклеиновых кислот с использованием комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала АмплиПрайм ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. № 102-22). Для дальнейшей амплификации использовали 10 мкл полученного элюата, содержащего ДНК изучаемых микроорганизмов (объём полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).

Во время приготовления реакционной смеси использовали 100-кратный ТЕ-буфер для получения необходимой концентрации праймеров, зондов и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (άΝΤΡ). Состав реакционной смеси приведён в табл. 7.

Таблица 7

Состав реакционной смеси (ПЦР-смесь-1)

Название	Последовательность	Флуо- рофор	Концентрация, пмоль/мкл
Праймеры
Еп(Ь-Р1	§Св-еСС-ССС-Тв§-АСв-АА§-А		0.7
ЕпЛ-К1	§СС-ТСА-Ав§-§СА-САА-ССТ-ССА-А		0.7
ЕтЬ-Рго[-К1	Сев-ТТС-ААв-АСС-АСА-АСС-ТСТ-АА		0.7
81-ё-П	еСТ-АСА-САС-еТе-СТА-САА-Тве-АСА-А		0.7
81-В-К.1-1	СвТ-АТТ-САС-С§Т-А@С-АТ§-СТв-АТС-ТА		0.7
8(герт-§-Г1	ВСТ-АСА-САС-вТв-СТА-САА-Твв-ТТ		0.7
81гер1-§-К.1с	СА£-ССТ-АСА-АТС-С§А-АСС-£А£-АТТ		0.6
81гер1-§-рп-К.с	СА§-ССТ-АСА-АТС-СяА-АСС-§А£-АСТ		0.6
8ΤΙ-11	§С_е-Т_ёС-вАТ-8_§Т-ССё-АСТ-ТАТ-Т		0.4
8ΤΙ-2	СвС-АСв-ТАС-ввС-ААС-ТТТ-СвТ-А		0.4
Зонды
Εη(6-Ζ2-Ρ	(РАМ)СёС-ТСА-ввТ-₈Сё-ААА-яСё-Тё£- ё(вн<зи	РАМ	0.2
δι-β-ζυ	(К6О)САё-СёА-ААС-СёС-ёАё-§ТС-ААё- С(КТ<3)	К6О	0.2
δΙ-Β-δβρΓ-ΖΙ-Ι	(КбО)САв-СТА-ААС-СёС-вАв-вТС-АТв- С(КТф)	К6О	0.25
5ΐκρΙ-£-Ζ1(-Κ.)	(КОХ)СдС-ЛЛё-СС_е-_еТ_г-ЛС_е-_еСЛ-ЛеС(КТЭ·)	КОХ	0.2
νΚΟ-Ζ-ΰγ5	(Су5)СТА-ёСТ-в88-С8Т-СА_ё-₈АА-ТСС-САё-₈ (ВНфЗ)	Су5	0.2
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
άΝΤΡ (4 4 тМ)			5,0

Для получения реакционной смеси в пробирку вносили 10 мкл ПЦР-смеси-1 и 5 мкл ПЦР-смеси-2гей (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. № 863).

Далее в каждую амплификационную пробирку вносили 15 мкл реакционной смеси и 10 мкл элюата ДНК. Кроме того, в каждой постановке использовали калибраторы для количественного анализа микроорганизмов (в соответствующие пробирки вносили по 10 мкл калибраторов). В каждой постановке участвовали 2 калибратора с концентрацией 10 и 10³ копий/реакция.

- 21 025042

Состав калибраторов (К1 и К2).

Калибраторы включают в себя четыре препарата, клонированных в плазмиды: концентрированный раствор положительный контрольный образец (КР ПКО) Еп1егоЬас1епасеае, КР ПКО §1арку1ососсик крр., КР ПКО 81арЬу1ососсик каргоркуйсик, КР ПКО 81гер1ососсик крр. Для разведения исходных КР используется ДНК-буфер с ро1у(А). Конечная концентрация каждого препарата для калибратора К1 составляет 1 · 10⁶ копий/мл; для калибратора К2 - 1 -10⁴ копий/мл.

Амплификацию проводили на приборе КоЮг-Сепе О (ΟΙΑΟΕΝ, 1011132).

Программа амплификации:

Этан	Температура, °С	Время	Измерение флуоресценции	Кол-во циклов
Но1<1/ удерживание температуры	95	15 мин	-	1
1 СусПпу/ Циклирование	95	5 с	-	5
60	20 с	-
72	15 с	-
2 СусНпд/ Циклирование	95	5 с	-	40
60	20 с	РАМ, ЮЕ, КОХ, Су5
72	15с

Результаты исследования образцов от 22 пациенток приведены в табл. 8. Для каждого образца приведены следующие данные:

концентрации бактерий, выраженные в единицах ГЭ/мл, определенные методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени: [ДНК Су] - концентрация ДНК бактерии Сагбиеге11а уадтаПк, [ДНК Αν] - концентрация ДНК бактерии АЮроЬшт уадтае, [ДНК Бас] - концентрация ДНК бактерий БасЮЬасШик крр., [ДНК Вас] - концентрация ДНК всех бактерий, [ДНК Εηΐ] - концентрация ДНК ЕШегоЬааепасеае, [ДНК 5>1арк| - концентрация ДНК бактерий §1арку1ососсик крр., [ДНК 51гер| - концентрация ДНК бактерий §1гер1ососсик крр.;

рассчитанные коэффициенты соотношений концентраций бактерий: КС1 = 1д [ДНК Бас] - 1д ([ДНК Су] + [ДНК Αν]), КС2 = 1д [ДНК Вас] - 1д [ДНК Бас], КС3 = 1д [ДНК Вас] - 1д ([ДНК Су] + [ДНК Αν]);

АВ баллы, определённые по методике Эопбегк С.С.С. е! а1.

- 22 025042

Таблица 8

Результаты, полученные при обследовании 22 пациенток, у которых имеется нарушение баланса вагинальной микрофлоры, не объясняемое наличием

БВ-ассоциированных микроорганизмов, с применением критериев Амселя, баллов Ньюджента, АВ баллов и метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

№

Ам- еель

Ньюд- жент

и ы X 3

> Μ

υ Д и X 4

и ¢9 са а а Ξ

КС1

КС2

КСЗ

Ε ώ α χ 3

иг ο. 63 55 я 3

Ο. ν и 55 а 3

Ζα ς ϋ Ό Μ

19

БВ

пт

0,Е+00

Ο,Ε+00

Ι,Ε+05

Ι,Ε+06

5,11

1,03

6,14

2,Ε+03

5,Ε+05

3.Ε+06

3

67

ОБВ

пт

0,Е+00

Ο,Ε+00

4.Ε+03

Ι,Ε+06

3,65

2,40

6,05

3,Ε+02

8,Ε+Ο3

2,Ε+06

6

80

ОБВ

пт

0.Е+00

Ο,Ε+00

Ι,Ε+06

3.Ε+07

6,08

1,44

7,51

7,Ε+02

Ι,Ε+07

Ι,Ε+04

4

81

ОБВ

пт

2,Е+03

4,Ε+04

7.Ε+04

2,Ε+06

0,15

1,37

1,52

2,Ε+06

7,Ε+05

Ι,Ε+05

3

91

ОБВ

пт

2,Е+03

Ο,Ε+ΟΟ

Ι,Ε+05

2,Ε+08

1,62

3,20

4,81

7,Ε+03

Ι,Ε+05

Ι,Ε+08

7

126

ОБВ

ПТ

0,Е+00

Ο,Ε+00

7,Ε+04

Ι,Ε+06

4,82

1,19

6,01

4,Ε+05

2,Ε+04

2,Ε+06

3

127

ОБВ

ПТ

2,Е+03

Ο,Ε+00

1,Ε+03

1 ,Ε+06

-0,20

2,97

2,77

6,Ε+Ο3

Ι,Ε+04

8,Ε+Ο5

6

130

ОБВ

пт

0,Е+00

Ο,Ε+00

3,Ε+04

2, Ε+06

4,54

1,80

6,33

3.Ε+Ο3

2,Ε+Ό5

5.Ε+Ο5

5

176

ОБВ

0,Е+00

Ο,Ε+00

2,Ε+04

Ι,Ε+06

4,29

1,74

6,03

7.Ε+02

Ι,Ε+05

2,Ε+06

4

195

ОБВ

0,Е+00

Ο,Ε+00

3,Ε+06

2.Ε+08

6,45

1,90

8,34

2,Ε+03

Ι,Ε+08

3

198

ОБВ

1.Е+03

Ο,Ε+00

9,Ε+04

Ι,Ε+06

1,86

1,14

3,00

2,Ε+06

9,Ε+04

4.Ε+05

4

205

ОБВ

0,Е+00

Ο,Ε+00

3,Ε+04

Ι,Ε+06

4,41

1,61

6,03

4,Ε+04

2,Ε+05

3,Ε+Ό6

5

206

ОБВ

0,Е+00

Ο,Ε+00

2,Ε+02

2. Ε+06

2,30

4,07

6,37

3,Ε+06

3.Ε+06

5,Ε+04

4

210

ОБВ

9,Е+03

Ο,Ε+ΟΟ

5.Ε+03

8. Ε+06

-0,23

3,19

2,96

8.Ε+03

Ι,Ε+04

8,Ε+06

7

216

ОБВ

ПТ

Ο,Ε+00

Ι,Ε+05

4Ε+07

4,98

2,61

7,59

5,Ε+06

Ι,Ε+07

8,Ε+03

8

217

ОБВ

Ο,Ε+00

9,Ε+03

2.Ε+06

3,95

2,35

6,30

5,Ε+02

2.Ε+02

3.Ε+06

5

221

ОБВ

Ο,Ε+00

Ι,Ε+05

6. Ε+06

5,17

1,57

6,74

2,Ε+06

Ο,Ε+ΟΟ

6,Ε+02

3

222

ОБВ

Ο,Ε+ΟΟ

Ο,Ε+00

Ι,Ε+05

2. Ε+06

5,02

1,28

6,30

2,Ε+05

Ι,Ε+06

3,Ε+05

7

232

ОБВ

Ο,Ε+00

8,Ε+05

2Ε+07

5,88

1,38

7,27

3,Ε+07

Ι,Ε+06

2,Ε+06

8

234

ОБВ

Ο,Ε+ΟΟ

Ο,Ε+00

5,Ε+0Ι

2 Ε+06

1,69

4,61

6,30

2,Ε+04

2.Ε+02

Ι,Ε+06

8

247

ОБВ

Ο,Ε+ΟΟ

Ο,Ε+00

2,Ε+04

1 ,Ε+06

4,37

1,65

6,02

5.Ε+04

2,Ε+06

2.Ε+05

5

249

ОБВ

3,Ε+04

Ο,Ε+00

5,Ε+04

1 Ε+06

0,27

1,32

1,59

3,Ε+06

ό,Ε+02

7.Ε+05

4

256

ОБВ

Ο,Ε+00

Ο,ΕΗ 00

4,Ε+04

1 Ε+06

4,60

1,42

6,02

2,Ε+02

Ο,Ε+ΟΟ

Ι,Ε+06

Ί

262

ОБВ

2.Ε+03

Ο,Ε+00

7,Ε+06

Ι,Ε+08

3,60

1,21

4,81

3.Ε+08

7.Ε+03

3,Ε+06

6

274

ОБВ

ПТ

Ι,Ε+04

2,Ε+04

ό,Ε+04

1 Ε+06

0,26

1,35

1,61

8.Ε+04

9,Ε+05

2.Ε+03

9

Расчёты подтвердили, что во всех случая снижения количества лактобактерий в отсутствие бактериального вагиноза произошло замещение лактобактериий аэробными микроорганизмами. Во всех этих случаях у пациенток установлен аэробный вагинит по методике ΌοηάβΓδ О.О.О. с1 а1.

Таким образом, на основании статистической обработки полученных экспериментальных данных были сформированы критерии дифференциальной диагностики отсутствия нарушений баланса вагинальной микрофлоры, бактериального вагиноза в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры и преобладания аэробной микрофлоры.

При 1д [ДНК Вас]>6, ([ДНК Εηΐ] + [ДНК 5>1арН] + [ДНК §1гер]) < [ДНК Бае] и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено.

При 1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]) - 1д ([ДНК Εηΐ] + [ДНК 5>1арН] + [ДНК 5>1гер|) < 1 диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры.

При 1д [ДНК Вас]>5, ([ДНК Εηΐ] + [ДНК 81арП| + [ДНК 8£гер]) > [ДНК Бас], КС2>1 и КС3>2 констатируют преобладание аэробной микрофлоры.

Для постановки диагноза аэробный вагинит пациенткам с повышенным содержанием или преобладанием аэробной микрофлоры необходимо дополнительно оценить наличие местной воспалительной реакции. Для этого определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца. При наличии клинических признаков воспаления и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют аэробный вагинит.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры, включающий определение концентрации ДНК всех бактерий, концентрации ДНК бактерии Оагйпеге11а уадшаПк, концентрации ДНК бактерии АЮроЬшт уадтае, концентрации ДНК бактерий ЬайоЬасШий йрр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что на основании полученных данных рассчитывают коэффициенты соотношений концентраций:

КС1 = 1д [ДНК Ьас] - 1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]),

КС2 = 1д [ДНК Вас] - 1д [ДНК Ьас],

КС3 = 1д [ДНК Вас] - 1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]), где [ДНК Ьас] - концентрация ДНК бактерий БасЮЬасШий йрр., ГЭ/мл;

[ДНК Ον] - концентрация ДНК бактерии Оагйпеге11а уад1па115. ГЭ/мл;

[ДНК Αν] - концентрация ДНК бактерии АЮроЬшт уадтае, ГЭ/мл;

[ДНК Вас] - концентрация ДНК всех бактерий, ГЭ/мл;

при 1д [ДНК Вас]>5, КС1>1 и КС2<1 констатируют отсутствие бактериального вагиноза;

при 1д [ДНК Вас]>5, 0,5<КС1<1, КС2<1 и КС3<2 констатируют промежуточное состояние микрофлоры;

при 1д [ДНК Вас]>5, КС1<0,5 и КС3<2 диагностируют бактериальный вагиноз; при 1д [ДНК Вас]<5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при отсутствии бактериального вагиноза и 5<1д [ДНК Вас]<6 констатируют снижение степени бактериальной обсеменённости влагалища.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Еп1егоЬас1епасеае, концентрацию ДНК бактерий §1арЪу1ососсий йрр., концентрацию ДНК бактерий 5>1герЮсоссий йрр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот и при

1д [ДНК Вас]>6 и ([ДНК Ей] + [ДНК 8!арЪ] + [ДНК §!гер]) < [ДНК Ьас], где [ДНК Ей] - концентрация ДНК ЕйегоЬайепасеае, ГЭ/мл;

[ДНК §1арЪ] - концентрация ДНК бактерий §1арЪу1ососсий йрр., ГЭ/мл;

[ДНК §!гер] - концентрация ДНК бактерий §!гер!ососсий йрр., ГЭ/мл, и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение: нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено.
4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Еп1егоЬас1епасеае, концентрацию ДНК бактерий §1арЪу1ососсий йрр., концентрацию ДНК бактерий §1гер!ососсий йрр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот и при

1д ([ДНК Ον] + [ДНК Αν]) - 1д ([ДНК Ей] + [ДНК 8йрЪ] + [ДНК 8йер]) < 1, где [ДНК Ей| - концентрация ДНК ЕйегоЬайепасеае, ГЭ/мл;

[ДНК §1арЪ] - концентрация ДНК бактерий §1арЪу1ососси5 йрр., ГЭ/мл;

[ДНК §!гер] - концентрация ДНК бактерий §!гер!ососсий йрр., ГЭ/мл, диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры.
5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют бактериальный вагиноз в сочетании с аэробным вагинитом.
6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Еп1егоЬас1епасеае, концентрацию ДНК бактерий §1арЪу1ососсий йрр., концентрацию ДНК бактерий 5>1герЮсоссий йрр. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот и при

1д [ДНК Вас]>5, ([ДНК Ей] + [ДНК 8йрЪ] + [ДНК 8йер]) > [ДНК Ьас],

КС2>1 и КС3>2, где [ДНК Ей] - концентрация ДНК ЕйегоЬайепасеае, ГЭ/мл;

[ДНК §1арЪ] - концентрация ДНК бактерий §1арЪу1ососсий йрр., ГЭ/мл;

[ДНК §!гер] - концентрация ДНК бактерий 5>1гер1ососсий йрр., ГЭ/мл, констатируют преобладание аэробной микрофлоры.
7. Способ по п.6, характеризующийся тем, что дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют аэробный вагинит.
8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при констатации промежуточного состояния микрофлоры дополнительно определяют рН выделений пациентки и наличие жалоб на патологические выделения у пациентки и при рН<4,5 и отсутствии жалоб на патологические выделения пациентке рекомен- 24 025042 дуют повторить анализ в следующем менструальном цикле, а при рН>4,5 и наличии жалоб на патологические выделения у пациентки диагностируют бактериальный вагиноз.
9. Способ по пп.1-8, характеризующийся тем, что образец представляет собой влагалищный мазок.
10. Способ по пп.1-9, характеризующийся тем, что метод амплификации нуклеиновых кислот представляет собой метод количественной полимеразной цепной реакции.
11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что метод количественной полимеразной цепной реакции представляет собой метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
12. Способ по п.10 или 11, характеризующийся тем, что полимеразная цепная реакция представляет собой мультиплексную полимеразную цепную реакцию.

Распределение пациенток по общему количеству бактерий в образце (в 1д)