EA024844B1 - Иммуноконъюгат и его применение для лечения рака - Google Patents

Иммуноконъюгат и его применение для лечения рака Download PDF

Info

Publication number
EA024844B1
EA024844B1 EA201391754A EA201391754A EA024844B1 EA 024844 B1 EA024844 B1 EA 024844B1 EA 201391754 A EA201391754 A EA 201391754A EA 201391754 A EA201391754 A EA 201391754A EA 024844 B1 EA024844 B1 EA 024844B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
antibody
cancer
immunoconjugate
group
Prior art date
Application number
EA201391754A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391754A1 (ru
Inventor
Цянь Чзан
Санжив Гангвар
Чинь Пань
Дэниел Д. Дервин
Original Assignee
Бристол-Майерс Сквибб Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46172969&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA024844(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бристол-Майерс Сквибб Компани filed Critical Бристол-Майерс Сквибб Компани
Publication of EA201391754A1 publication Critical patent/EA201391754A1/ru
Publication of EA024844B1 publication Critical patent/EA024844B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/58—[b]- or [c]-condensed
    • C07D209/60—Naphtho [b] pyrroles; Hydrogenated naphtho [b] pyrroles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Предложен иммуноконъюгат или его фармацевтически приемлемая соль, в котором соединение формулы (II), где X представляет собой Cl, Br или тозилат, Y представляет собой спейсерный фрагмент, Z представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгации с антителом, сконъюгирировано с антителом или с антигенсвязывающим фрагментом антитела. Также предложен способ лечения рака у субъекта с помощью такого иммуноконъюгата.

Description

Настоящее изобретение относится к терапевтическим иммуноконъюгатам и способам применения таких иммуноконъюгатов для лечения рака.
Уровень техники
Натуральные продукты СС-1065 и дуокармицины являются мощными цитотоксическими агентами, которые связываются с малой бороздкой ДНК. Они характеризуются конденсированным циклопропановым кольцом (пунктирная рамка в структурах ниже), которое дестабилизируется посредством конформационных изменений, вызываемых при связывании в малой бороздке, и реагирует с адениновым основанием ДНК в реакции алкилирования с раскрытием кольца. Повреждение ДНК может быть непоправимым, что приводит к гибели клеток.
Активность этих натуральных продуктов стимулировало исследования, направленные на разработку аналогов, полезных в качестве противоопухолевых препаратов. См., например, Сасаап с1 а1. 2000 и 8иск1шд 2004 (полные ссылки на документы, приведенные в настоящем изобретении в виде первого автора или изобретателя и года, перечислены в конце этого описания. Такие перечисленные документы включены в настоящее описание посредством ссылки). Аналоги имеют либо конденсированный циклопропановый фармакофор, либо эквивалент с открытым кольцом (секо), как показано в структурах ниже, где Аг представляет собой ароматическое кольцо, которое обычно представляет собой фенил или пиррол, и X представляет собой уходящую группу, такую как хлор или бром. секо-Форма может превращаться в циклопропановую форму посредством элиминирования НХ, и этот процесс может происходить либо ίη νίίτο или ίη νίνο.
В дальнейшем в настоящем изобретении термин агент, связывающийся с малой бороздкой или МОВА будет использоваться для ссылки на тип соединения СС-1065/дуокармицин, имеющих конденсированное циклопропановое кольцо или его секо-форму, хотя известны и другие типы соединений, связывающиеся с малой бороздкой ДНК.
Иммуноконъюгаты представляют область текущего большого интереса в противоопухолевой терапии. В иммуноконъюгате фрагмент лекарственного препарата конъюгирован (ковалентно связан) с антителом, антиген которого уникально экспрессируется или сверхэкспрессируется раковой клеткой (опухоль-ассоциированный антиген). В связывании с его антигеном антитело функционирует как нацеливающий агент для доставки фрагмента лекарственного препарата к раковой клетки с высокой специфичностью. Антиген может представлять собой белок на поверхности раковой клетки. После связывания антитела с антигеном комплекс антиген-иммуноконъюгат интернализуется и в конечном счете попадает внутрь везикулярного тела, такого как лизосомы, где ковалентный линкер между фрагментом лекарственного препарата и антитела расщепляется, высвобождая молекулу лекарственного препарата, которая оказывает свой цитотоксический эффект. С другой стороны, ассоциированный с опухолью антиген может быть антигеном, который секретируется опухолевыми клетками в близлежащее экстрацеллюлярное пространство.
Предпочтительно, чтобы ковалентный линкер был сконструирован таким образом, чтобы расщепление осуществлялось посредством фактора, предпочтительно находящимся в лизосоме, но не в плазме. Одним из таких факторов является низкое значение лизосомального рН, так что ковалентный линкер
- 1 024844 может быть чувствительной к кислоте группой, такой как гидразон. Другим таким фактором является обычно высокая внутриклеточная концентрация глутатиона, которая обеспечивает расщепление ковалентных дисульфидных линкеров с помощью механизма дисульфидного обмена. Еще один из таких факторов представляет собой присутствие лизосомальных ферментов, таких как катепсин В, который может расщеплять пептидные линкеры, сконструированные, чтобы быть предпочтительными субстратами (ИиЬотоЫк е! а1. 2002).
Их активность делает ΜΟΒΑδ привлекательными кандидатами в качестве остатков лекарственного препарата в иммуноконъюгате. Иллюстративные раскрытия, касающиеся ΜΟΒΆδ и их использования в иммуноконъюгатах, включают Воуб е! а1. 2008 апб 2010; СНеп е! а1. 2010; Сапд\уаг е! а1. 2008; Ν§ е! а1. 2002, 2006а, 2006Ь, 2009а, 2009Ь, апб 2010; и 8ий е! а1. 2010.
Существует возможность случайного расщепления ковалентного линкер, в то время как иммуноконъюгат все еще находится в системном кровотоке и еще не доставлен к целевой раковой клетке, в результате чего происходит преждевременное высвобождение лекарственного фрагмента, что создает риск системной токсичности. Такой риск представляет особый интерес, если остаток лекарственного препарата является сильнодействующим цитотоксином, таким как ΜΟΒΑ. Однако, если иммуноконъюгат использует секо-ΜΟΒΑ, риск может быть уменьшен путем дериватизации фенольной гидроксильной группы для блокирования превращения в циклопропановую форму. Таким образом, в случае случайного расщепления то, что высвобождается, является неактивным производным секо-ΜΟΒΑ. Посредством выбора производного, которое расщепляется внутри лизосомы, функции производной пролекарственной группы и обеспечивает фактор защищённости: два расщепления, линкера и пролекарственной группы, должно произойти перед тем, как высвободится активный цитотоксин.
Одна из таких пролекарственных групп представляет собой карбамат, который может быть расщеплен лизосомальными и/или цитозольными карбоксиэстеразами, как показано ниже (Ка и КЬ представляют родовые радикальные группы.) Иллюстративные раскрытия, относящиеся к секо-ΜΟΒΑ иммуноконъюгатам, являющимися пролекарствами с карбаматной группой см. в Ατίδΐοίί е! а1. 1991; Βο^γ е! а1. 1999; Βοуб е! а1. 2008 апб 2010; СНеп е! а1. 2010; Сапд\уаг е! а1. 2008; КоЬауа8Й 1994; Ν§ е! а1. 2002, 2006а, 2006Ь, 2009а, 2009Ь, и 2010; Зий е! а1. 2010; и 2Нао е! а1. 2010.
Другой пролекарственной группой, которую можно использовать с секо-ΜΟΒΑδ, является фосфат, и в этом случае расщепляющим ферментом является фосфатаза, находящаяся внутри лизосомы и/или в цитозоле. Иллюстративные раскрытия, относящиеся к фосфатным пролекарственным группам в секоΜΟΒΑδ, включают Βοуб е! а1. 2010, СНеп е! а1. 2009, С1а/1ег 2003, Кшд е! а1. 2011, Кйуауш е! а1. 1997, Ν§ е! а1. 2002, 2Нао е! а1. 2002а и 2002Ь и 2Нао е! а1. 2010.
Соединение ΜΟΒΑ, которое интенсивно изучается, имеет структуру (Α) (Лоуб е! а1. 2008 и Зий е! а1. 2010). Оно имеет карбаматную пролекарственную группу; валин-цитруллин (Уа1-С.'П. перечисленные в направлении от Ν- к С-концу, т.е. от амино (ΝΗ2) конца к карбокси (СО2Н) концу) дипептидный линкер, сконструированный для расщепления катепсином В (ИиЬотоЫк е! а1. 2002); и малеимидную группу для иммуноконъюгации посредством присоединения посредством реакции по Михаэлю к сульфгидрильным группам антитела. Иммуноконъюгат соединения (А) и антитела анти-0070 проходят клинические испытания.
Мы заметили, что в некоторых случаях карбамат-пролекарственный секо-ΜΟΒΑ иммуноконъюгат, такой как полученный из соединения (А), не является столь мощным противоопухолевым средством, как хотелось бы. Мы предполагаем, что снижение эффетивности связано с недостаточной активностью карбоксиэстеразы внутри некоторых типов раковых клеток и как следствие неэффективного декарбамоилирования. Таким образом, желательно разработать пролекарственные секо-ΜΟΒΑ иммуноконъюгаты, которые не зависят от карбоксиэстеразы для их активации.
- 2 024844
В одном аспекте данное изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) и фосфатно-пролекарственному секо-ΜΟΒΆ соединения. Удаление фосфатной пролекарственной группы является не зависимым от активности карбоксиэстеразы в клеткемишени, что позволяет избежать недостатки, указанные выше. Напротив, соединения в соответствии с настоящим изобретением зависят от фосфатазы, которая, как показали наши эксперименты, присутствует на достаточном уровне в целом ряде опухолевых клеток человека. Один вариант осуществления представляет собой иммуноконъюгат, в котором соединение формулы (II)
где X представляет собой С1, Вг или тозилат;
ААа и каждый ААЬ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
т равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;
Υ представляет собой спейсерный фрагмент, причем Υ выбран из группы, состоящей из
Ϊ Н г , о , > >
1-Ν-(ΟΗ2)2.β-(ΝΗ)4-1 , |_(СНг)2.в-с-1 ( (СН2>2_в—(ΝΗΪ^,—I о
>11 5
1—С-(СН2>2-б-(МН)ч-| (СН2СН2О)г-СН2СН2-1 о
^-(МН)ч-(СН2СН2О)г-СН2СН2-сЧ и их комбинаций, где индекс μ равен 0 или 1, независимо в каждом случае, а индекс г равен от 1 до 24, независимо в каждом случае;
Ζ представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгации с антителом, где -Ζ представляет собой -ΝΗ2, -ОН, -ΟΝΗ2, -СО2Н, -8Н. циклооктин, -Ν3,
О
О сконъюгировано через группу Ζ к антителу или к антигенсвязывающему фрагменту такого антитела.
В одном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат имеет структуру, соответствующую формуле (111а)
В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат имеет структуру, соответствующую формуле (111а')
где η равно 1, 2, 3, 4 или 5;
- 3 024844
ЛЬ представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Предпочтительно, чтобы антитело представляло бы собой человеческое моноклональное антитело, которое распознает человеческий антиген, выбранный из группы, состоящей из ί'.Ό70. мезотелина, ПСМА, СЭ19, глипикана-3, В7Н4, КС-1, С1)22 и РТК7.
В другом аспекте обеспечивается фосфатное пролекарственное секо-МСВА соединение, адаптированное для конъюгации к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту. Такое соединение содержит остаток фосфатного пролекарственного секо-МСВА, ферментативно расщепляемый пептидный линкер, спейсерный фрагмент и реактивную функциональную группу для присоединения к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту. Один вариант осуществления представляет собой соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль
где X представляет собой С1, Вг или тозилат;
ААа и каждая ААЬ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
т = 0, 1, 2, 3, 4 или 5;
Υ представляет собой спейсерный фрагмент, причем Υ выбран из группы, состоящей из ξ н , , и , г г
Ν-(ΟΗ2)2.6-(ΝΗ)4—1 , ξ—(СН2)2-6-С—1 ; 1-(ΟΗ2)2.6-(ΝΗ)4-Ι, о
с—(СН2)2чз—(ΝΗ)4—I , ξ—(СН^СНгО),-СН,СН?4 , о
^-(ΝΗ)4—(СН2СН2О)[-СН2СН2-сЧ и их комбинаций, где индекс μ равен 0 или 1, независимо в каждом случае, а индекс г равен от 1 до 24, независимо в каждом случае;
Ζ представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгации с антителом, где Ζ представляет собой -ΝΗ2, -ОН, -ΟΝΗ2, -СО2Н, -8Н, циклооктин, -Ν3,
О
О
В одном варианте осуществления ААа выбирается из группы, состоящей из цитруллина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, изолейцина, лейцина и треонина и т равно 0, 1 или 2.
В одном варианте осуществления изобретения -ААа-[ААЬ]т- представляет собой дипептид, выбранный из группы, состоящей из Уа1-СИ, РЬе-СИ, РЬе-Ьук, Уа1-Ьук, Уа1-С1и, Уа1-Акр, Уа1-8ег и Уа1-С1у, каждый дипептид, читаемый в направлении от Ν- к -С.
В одном варианте осуществления изобретения соединение имеет структуру в соответствии с формулой (11а)
или его фармацевтически приемлемая соль.
В одном варианте осуществления изобретения соединение имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из формул (11Ь)-(11д)
- 4 024844
или его фармацевтически приемлемая соль.
В другом аспекте обеспечивается фосфатное пролекарственное соединение, которое может быть использовано для получения иммуноконъюгатов, как воплощено соединением формулы (I)
где X представляет собой С1, Вг или тозилат, или его фармацевтически приемлемую соль. Соединение (I) может быть комбинировано с пептидным линкером, спейсером и реакционноспособной функциональной группой, как описано выше, а затем конъюгировано с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
В еще одном аспекте обеспечивается способ лечения рака у субъекта, предпочтительно человека, страдающего от такого рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества
- 5 024844 иммуноконъюгата в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат имеет структуру, соответствующую формуле (Ша1). Рак может быть раком, чьи клетки экспрессируют антиген, выбранные из группы, состоящей из 0070, мезотелина, ПСМА, СО19, глипикана-3, В7Н4, КО-1, 0022 и РТК7. Примеры раковых заболеваний, которые можно лечить, включают рак почки, рак поджелудочной железы, рак яичников, лимфому, рак толстой кишки, мезотелиому, рак желудка, рак легкого, рак предстательной железы, аденокарциному, рак печени и рак молочной железы.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А и 1В в комбинации показывают синтез соединений в соответствии с настоящим изобретением, имеющих малеимидные реакционноспособные функциональные группы.
Фиг. 2 показывает синтез другого соединения в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 3Α-3Ό в комбинации показывают синтез еще одного соединения в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 4А-4К сравнивают ингибиторные свойства фосфатных пролекарственных иммуноконъюгатов на клеточную пролиферацию в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с ингибиторными свойствами карбаматных пролекарственных иммуноконъюгатов, используя анализ пролиферации по включению 3Н тимидина. Линии исследованных клеток включали следующие раковые клеточные линии человека: 786-0 (рак почки), простатический специфический мембранный антиген (ПСМА), НРАС (рак поджелудочной железы), 0УСАК3 (рак яичников), Каток (лимфома Беркитта), Н226 (мезотелиома), N87 (рак желудка), Н292 (мукоэпидермоидная легочная карцинома), Н1650 (аденокарцинома), Нер 3Ь (гепатоцеллюлярная карцинома), Нер О2 (гепатоцеллюлярная карцинома), НСС-1954 (рак молочной железы), ΜΟΑ-ΜΒ-468 (рак молочной железы), НСТ116 (рак толстой кишки) и Н520 (рак легких). Кроме того, была использована трансфицированная клеточная линия СНО (яичника китайского хомячка), экспрессирующая мезотелин.
Фиг. 5 изображает хроматографические профили, показывающие дефосфорилирование фосфатного пролекарственного соединения в соответствии с настоящим изобретением ферментами микросом печени человека.
Фиг. 6 представляет собой график зависимости количества дефосфорилированного продукта от концентрации микросом в течение 1 ч.
Фиг. 7 показывает синтез еще одного соединения в соответствии с настоящим изобретением, имеющего азидную реакционноспособную функциональную группу для конъюгации с антителом.
Фиг. 8 показывает синтез еще одного соединения в соответствии с настоящим изобретением, имеющего гидроксиламиновую реакционноспособную функциональную группу, для конъюгации с антителом.
Фиг. 9А и 9В в комбинации показывают синтез соединения в соответствии с настоящим изобретением, имеющего трипептид Ьеи-А1а-Ьеи.
Фиг. 10А и 10В в комбинации показывают синтез соединения в соответствии с настоящим изобретением, имеющего дипептид Ьеи-Пе.
Фиг. 11А и 11В в комбинации показывают синтез другого соединения в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 12Α-12Ι показывают результаты различных исследований с ксенотрансплантатом.
Подробное описание изобретения
Определения.
Антитело означает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающая часть) или их отдельные цепи. Целое антитело представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (УЬ) и константную область тяжелой цепи, содержащую три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (Уъ или УК) и константная область легкой цепи содержит один единственный домен Сь. УН и Уъ области могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, называемые области, определяющие комплементарность (СОК), перемежаясь с более консервативными каркасными областями (РК). Каждая УН и Уъ состоит из трех СОК и четырех РК, расположенных от амино- к карбоксиконцу в следующем порядке: РК1, СОК1, РК2, СОК2, РК3, СОК3 и РК4. Вариабельные области содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области могут опосредовать связывание антитела с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1д) классической системы комплемента. Про антитело говорят специфически связывающееся с антигеном X, если указанное антитело связывается с антигеном X с Кс 5х10-8 М или менее, более предпочтительно от 1х10-8 М или менее, более предпочтительно 6х10-9 М или менее, более предпочтительно от 3х10-9 М или менее, еще более предпочтительно от 2х10-9 М или менее. Антитело может быть химерное, гуманизированное или предпочтительно человеческое. Константные области тяжелой цепи могут быть сконструированы так,
- 6 024844 чтобы влиять на тип или степень гликозилирования, увеличивать время полураспада антитела, для повышения или снижения взаимодействия с эффекторными клетками или системой комплемента или для модуляции других свойств. Конструирование может осуществляться посредством замены, вставки или делеции одной или более аминокислот или замещением домена доменом из другого типа иммуноглобулина или комбинацией вышеперечисленного.
Фрагмент антитела и антигенсвязывающий фрагмент антитела (или просто часть антитела) означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины, например (ί) фрагментом РаЬ, моновалентным фрагментом, состоящим из Уь, Ун, Сь и СН1 доменов; (ίί), Р(аЬ')2-фрагментом, бивалентным фрагментом, содержащим два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) РаЬ'-фрагментом, который является, по существу, РаЬ с частью шарнирной области (см., например, ЛЬЬак с1 а1., Се11и1аг апб Мо1еси1аг 1ттипо1оду, 61Н Еб., Заипбегк Е15е\зег 2007); (ίν) Рб фрагментом, состоящим из Ун и СН1 доменов; (ν) Ρν фрагментом, состоящим из Уь и Ун доменов одного плеча антитела, (νί) фрагментом бАЬ (^агб е1 а1., (1989) Ыа1иге 341:544-546), который состоит из домена Ун; (νίί) изолированной области, определяющей комплементарность (СОК), а также (νίίί) нанотела тяжелой цепи вариабельной области, содержащей один вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, хотя два домена фрагмента РУ, Уь и Ун, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который позволяет им быть составленными в виде одноцепочечного белка, в котором Уъ и Ун области соединяются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Ρν или 8сΡν), см., например, Впб е1 а1. (1988) Заепсе 242:423426; и ни81оп е1 а1. (1988) Ргос. Νηΐ1. Асаб. Зсг ИЗА 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включены в термин антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий фрагмент антитела.
Изолированное антитело означает антитело, которое, по существу, не содержит другие антитела, имеющие различные антигенные специфичности (например, изолированное антитело, которое специфически связывает антиген X, является, по существу, свободным от антител, которые специфически связывают антигены, отличные от антигена X). Изолированное антитело, которое специфически связывает антиген X, может, однако, иметь перекрестную реактивность к другим антигенам, таким как антиген молекулы X из других видов. В некоторых вариантах осуществления изолированное антитело специфически связывается с человеческим антигеном X и не вступает в перекрестную реакцию с другим (не человеческим) антигеном X. Более того, изолированное антитело может быть, по существу, свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела означает препарат молекул антител, композицию, состоящую из единственного типа молекул, которая демонстрирует единственную специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу.
Человеческое антитело означает антитело, имеющее вариабельные области, в которых как каркасная, так и СИК-области (и константная область, если она присутствует), происходят из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела могут включать последующие модификации, в том числе природные или синтетические модификации. Человеческие антитела могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным образом или с помощью сайт-специфического мутагенеза ш уИго или посредством соматической мутации ш νί\Ό). Тем не менее, человеческое антитело не включает в себя антитела, в которых последовательности СИК, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мыши, были привиты на человеческие каркасные последовательности.
Выражение человеческое моноклональное антитело означает антитело, демонстрирующее единственную специфичность связывания, которое имеет вариабельные области, в которых как каркасная, так и СИК-области происходят из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетки, полученные из трансгенного нечеловеческого животного, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, вставленные в иммортализованную клетку.
Если для конкретных стереоизомеров специально не указано (например, утолщенной или пунктирной связью в соответствующем стереоцентре в структурной формуле, посредством изображения двойной связи как имеющей Е- или Ζ-конфигурацию в структурной формуле, или с помощью номенклатуры, обозначающей стереохимию), все стереоизомеры включаются в объем настоящего изобретения, как чистые соединения, а также их смеси. Если не указано иное, индивидуальные энантиомеры, диастереомеры, геометрические изомеры, а также их комбинации и смеси все входят в объем настоящего изобретения.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединения могут иметь таутомерные формы (например, кето- и енольной формы), резонансные формы и цвиттерионные формы, эквивалентные тем, которые изображены в структурных формулах, использованных в настоящем изобретении, и что структурные формулы охватывают такие таутомерные, резонансные или цвиттерионные формы.
- 7 024844
Термин фармацевтически приемлемая соль означает соль соединения, пригодную для фармацевтического препарата. Когда соединение имеет одну или несколько основных групп, соль может быть солью присоединения кислоты, такой как сульфат, гидробромид, тартрат, мезилат, малеат, цитрат, фосфат, ацетат, памоат (эмбонат), гидроиодид, нитрат, гидрохлорид, лактат, метилсульфат, фумарат, бензоат, сукцинат, лактобионат, суберат, тозилат и тому подобное. Когда соединение имеет одну или больше кислотных групп, соль может быть солью, такой как соль кальция, калия, соль магния, меглуминовая соль, аммонийная соль, цинковая соль, соль пиперазина, трометаминовая соль, литиевая соль, соль холина, соль диэтиламина, соль 4-фенилциклогексиламина, бензатиновая соль, натриевая соль, соль тетраметиламмония и тому подобное. Полиморфные кристаллические формы и сольваты также включены в объем в соответствии настоящим изобретением. Что касается фосфатных групп, конкретные примеры фармацевтически приемлемых солей включают натриевые, калиевые и аммониевые соли.
Композиции.
В одном аспекте композиция в соответствии настоящим изобретением является иммуноконъюгатом, в котором соединение формулы (I)
где X представляет собой нуклеофильно замещаемую уходящую группу или его фармацевтически приемлемую соль, конъюгирована с помощью пептидного линкера с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Конъюгация предпочтительно проводится через его 4-ΝΗ2 группу. Пептидиный линкер предпочтительно представляет собой дипептид, выбранный из УаРСЬ, РЬе-СЬ, РЬе-Ьук, Уа1Ьук, О1и-Уа1, Уа1-Лкр, Уа1-8ет и Уа1-О1у, причем каждый дипептид читается в направлении от Ν- к Сконцу.
В одном вариант осуществления иммуноконъюгат имеет структуру, представленную формулой (111а)
в которой ААа, ААЬ, т, и Υ являются такими, как определено выше в отношении формулы (II), АЬ представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, η = 1, 2, 3, 4 или 5; или его фармацевтически приемлемую соль. Предпочтительные варианты осуществления и/или комбинации ААа, ААЬ, т, Υ, АЬ и η описаны ниже.
Предпочтительный иммуноконъюгат согласно формуле (111а) имеет структуру формулы (111а')
в которой АЬ и η являются такими, как определено выше, или его фармацевтически приемлемой солью. Таким образом, этот вариант осуществления имеет дипептидный линкер Уа1-СЬ с пониманием специалистами в данной области того, что в структурной формуле (111а') дипептид изображен в ориентации от С- к Ν-концу при чтении в направлении слева направо.
В другом варианте осуществления иммуноконъюгат имеет структуру, представленную формулой (111Ь)
- 8 024844
в которой ААа, ААЬ, т и Υ являются такими, как определено выше в отношении формулы (II), АЬ представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, η равен 1, 2, 3, 4 или 5; или его фармацевтически приемлемую соль. Предпочтительные варианты осуществления и/или комбинации ААа, ААЬ, т, Υ, АЬ и η описываются ниже.
Предпочтительный иммуноконъюгат в соответствии с формулой (ШЬ) имеет структуру в соответствии с формулой (ШЬ1)
в которой АЬ и η являются такими, как определено выше, или его фармацевтически приемлемой солью. Как указано посредством индекса η в формулах (Ша), (Ша1), (ШЬ) и (ШЬ1), каждое антитело может быть конъюгировано с более чем одним пролекарственным секо-МСВА фрагментом в зависимости от того, какое количества сайтов антитела доступно для конъюгации в используемых экспериментальных условиях. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что, хотя каждое отдельное индивидуальное антитело конъюгируют с целым числом пролекарственных остатков, анализ препарата иммуноконъюгата может давать нецелочисленное отношение пролекарственных секо-МСВА остатков на антитело коэффициент замещения или §К), что отражает среднее статистическое. предпочтительно составляет от 1 до 5, более предпочтительно от 2,5 до 3,5.
Другой аспект в соответствии настоящим изобретением представляет собой соединение, адаптированное для конъюгации с антителом, представленное формулой (II)
О N Н
(II) в которой ААа, ААЬ, т, Υ и Ζ являются такими, как определено выше, или его фармацевтически приемлемой солью. Предпочтительные варианты осуществления и/или комбинации ААа, ААЬ, т, Υ и Ζ описаны ниже.
Предпочтительный вариант осуществления в соответствии с формулой (II) имеет структуру формулы (Па)
или его фармацевтически приемлемой соли.
Другие предпочтительные варианты осуществления в соответствии с формулой (II) имеют структуру формул (ПЬ)-(Пд)
- 9 024844
или их фармацевтически приемлемой соли.
В формулах (I) и (II) X представляет собой нуклеофильнозамещаемую группу, предпочтительно С1, Вг или тозилат, более предпочтительно С1.
В формулах (II), (11а) и (ШЬ), ААа и каждая ААЬ независимо выбирается из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γкарбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина (Сй), цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Предпочтительно ААа и ААЬ выбираются из группы, состоящей из аргинина, аспарагиновой кислоты, цитруллина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, фенилаланина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.
Фрагмент -ААа-[ААЬ]т- в формулах (II), (Ша) и (ШЬ) представляет собой пептидный линкер, где последовательные аминокислоты соединены пептидной связью. Предпочтительно, чтобы одна из них была бы расщепляемой посредством внутриклеточного или экстрацеллюлярного фермента, связанного с клеткой-мишенью.
Фермент может быть, например, катепсином В, катепсином Е, легумаином или СП10. Пептидный линкер предпочтительно состоит из от одной до шести, более предпочтительно от одной до трех и наиболее предпочтительно от одной до двух аминокислот. ААа предпочтительно представляет собой Сй Ьу8, С1и, 8ет, Не, Ьеи, ТЬг или более предпочтительно СП или Ьу8, особенно в комбинации с т, равным 0, 1 или 2.
- 10 024844
Суффикс т в формулах (II), (111а) и (ШЬ) равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5. Предпочтительно т равен 0, 1 или 2, более предпочтительно 1. Таким образом, -ААа-[ААЬ]т- представляет собой линкер из одной аминокислоты, дипептидный линкер, трипептидный линкер и так далее, в зависимости от значения т, причем с ААа на С-конце и ААЬ на Ν-конце. Где т равно 1, так что ААа и ААЬ в комбинации образуют дипептид, предпочтительные дипептиды представляют собой Уа1-СЦ, РНе-Сй, Рйе-Ьук, Уа1-Ьу8, О1и-Уа1, Уа1-А§р, Уа1-8ег и Уа1-О1у, причем каждый дипептид представлен в обычном направлении от Ν-конца к С-концу. Дипептидный линкер Уа1-С'.'П является особенно предпочтительным. Там, где пептидный линкер состоит из одной аминокислоты (то есть т = 0), то он предпочтительно представляет собой СП, О1и, Ьу8 и 8ег, как описано в публикации Сйеп еί а1. 2010, раскрытие которой включено в настоящее изобретение посредством ссылки. Предпочтительно, чтобы вышеупомянутый дипептидные и одинопептидные линкеры расщеплялись бы катепсином В. Другим ферментом, который может быть использован для расщепления пептидных линкеров, является легумаин, лизосомные цистеиновые протеазы, которые предпочтительно расщепляют при А1а-А1а-А§п. Пептиды Ьеи-А1а-Ьеи и Ьеи-Пе предназначены для расщепления посредством СЭ10 и катепсином Е соответственно.
Спейсер Υ в формулах (II), (111а) и (ШЬ) обеспечивает пространственное разделение между пролекарственным секо-МОВА и антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), чтобы исключить стерические препятствия связывания антигена посредством последнего или стерического препятствия расщеплению пептидного линкера последним. Кроме того, спейсер Υ может быть использован, чтобы придать повышенную растворимость или уменьшение агрегационных свойств конъюгатов. Спейсер Υ может содержать один или более модульных сегментов, которые могут быть собраны в любом количестве комбинаций. Примерами подходящих сегментов спейсера Υ являются ΐ Н 5 ί ° ? ΐ з |-Ν-(ΟΗ2)2.6-(ΝΗ)4—1 > |_(сн2)м-с-| > <—(СН2)2.6—<ΝΗ)4—1 >
О с—(СН2)2_е—(ΝΗ)4—| (СН2СК2О)Г-СН2СН2Ч ί ί о
|-(ΝΗ)4—(СН2СН2О)г-СН2СН2-С-| и их комбинаций, где индекс с| равен 0 или 1, независимо в каждом случае, а индекс г равен от 1 до 24, предпочтительно от 2 до 4, независимо в каждом случае. Эти сегменты могут быть объединены, как показано ниже
О н О н |-(ΟΗ2)3-0-Ν-(ΟΗ2ΟΗ20)4-ΟΗ2ΟΗ2-0-Ν-(ΟΗ2)2-(ΝΗ)π-|
О н ~(СН2)3-С-М-(СН2)2-(МН)Чили н 9 ^-(ΟΗ2)2^-Ν-0-(ΟΗ2)2.6-(ΝΗ)£1Спейсер Υ предпочтительно обеспечивает линейное расстояние от 5 до 20 атомов, более предпочтительно от 5 до 15 атомов, между аминокислотой ААа или ААЬ , к которой она присоединена, и реакционноспособной функциональной группой Ζ.
В другом предпочтительном вариант осуществления спейсер Υ присоединен к ААа или ААЬ в зависимости от обстоятельств посредством отличной от карбоксильной ацильной группы, непосредственно присоединяемой к α-аминогруппе ААа или ААЬ. Предпочтительно, чтобы спейсер Υ соединялся с αаминогруппой ААа или ААЬ в зависимости от обстоятельств через метиленовую группу в спейсере Υ.
В формуле (II) Ζ представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгации с антителом. Предпочтительно Ζ представляет собой -ΝΗ2, -ОН, -ΟΝΗ2 (гидроксиламин), -СО2Н, -8Η, циклооктин, азид (-Ν3)
Более предпочтительно, если Ζ представляет собой -ΟΝΗ2, -8Η, -Ν3, или
о
Группа -ОН может быть этерифицирована карбоксильной группой на антителе, например боковой цепью аспарагиновой или глутаминовой кислоты.
Группа -СО2Н может быть этерифицирована -ОН группой или амидирована аминогруппой (например, на боковой цепи лизина) на антителе.
Малеимидная группа может быть конъюгирована группой -8Η на антителе (например, от цистеина или из химической модификации антител, которая ввела сульфгидрильную функцию) в реакции присое- 11 024844 динения по Михаэлю.
Ν-гидроксисукцинимидная группа функциональнирует как активированная карбоксильная группа и может быть удобно амидирована посредствим реакции с аминогруппой (например, от лизина).
Группа -8Н особенно полезна для конъюгации, когда антитело модифицировано, для того чтобы ввести в него малеимидную группу в реакции присоединения по Михаэлю, которая является зеркальным отражением по отношению к описанной выше. Антитела могут быть модифицированы, чтобы иметь малеимидную группу ^сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилатом (§МСС) или его сульфированным вариантом сульфо-8МСС, причем оба реагента производятся фирмой §1§таА1йпсй
Азид и циклооктин являются комплементарными (взаимодействующими) функциональными группами, которые могут быть конъюгированы с помощью так называемой клик-химии, в которой азид присоединяется через напряженную связь алкинациклооктина, образуя 1,2,3-триазоловое кольцо. Азид может быть Ζ-группой в соединении формулы (II) и циклооктин может быть расположен на антителе или на его антигенсвязывающем фрагменте или наоборот. Циклооктиновая группа может быть обеспечена с помощью реагента ΌΙΒΘ (доступного от 1пуйтодеп/Мо1еси1ат РтоЬек, Еидепе, Огедоп).
Способы введения неприродных аминокислот в антитела могут быть использованы с неприродными аминокислотами, обеспечивая функциональные группы для конъюгации с реакционноспособной функциональной группой. Например, неприродная аминокислота п-ацетилфенилаланин может быть инкорпорирована в антитело, как предлагается в Пап е1 а1, \УО 2008/030612 А2 (2008). Кетогруппа в пацетилфенилаланине может оказаться в сайте конъюгации посредством образования оксимов взаимодействием с гидроксиламинными реакционноспособными функциональными группами. Другие неприродные аминокислоты также могут быть инкорпорированы с использованием технологии РеСООЕ™ от АтЬгх, 1пс (Ьа 1о11а, СаПГогша).
В приведенных выше иммуноконъюгатах антитело предпочтительно является антителом против антигена, ассоциированного с опухолью, что позволяет иммуноконъюгату избирательно или предпочтительно нацеливать на раковые клетки. Примеры таких антигенов включают мезотелин, простатический специфический мембранный антиген (ПСМА), СП19. СЭ22. СЭ30, СЭ70. В7Н4 (также известный как О8Е), протеинтирозинкиназу 7 (РТК7), глипикан-3, КС1, СТЬА 4 и также СП44.
Антитело может быть от животного (например, мыши), химерное, гуманизированное или предпочтительно человеческое. Антитело предпочтительно является моноклональным, особенно человеческим моноклональным антителом. Получение человеческих моноклональных антител против некоторых из вышеупомянутых антигенов раскрыто в Когтап е1 а1., υδ 2009/0074660 А1 (В7Н4); Рао-№йк е1 а1., 8097703 В2 (СП19); Кшд е1 а1., υδ 2010/0143368 А1 (СП22); Ке1ег е1 а1., υδ 7387776 В2 (2008) (СП30); Теней е1 а1., υδ 8124738 В2 (СП70); Когтап е1 а1., υδ 6984720 В1 (2006) (СТЬА-4); Когтап е1 а1., υδ 2009/0217401 А1 (ΡΌ-1); Ниапд е1 а1., υδ 2009/0297438 А1 и СатйатеШ е1 а1., υδ 7,875,278 В2 (ПСМА); Ьи е1 а1., И8 2010/0034826 А1 (РТК7); Теней е1 а1., υδ 2010/0209432 (А1) (глипикан-3); Наткшк е1 а1., υδ 7335748 В2 (2008) (КС1); Теней е1 а1., υδ 2011/0262448 А1 (мезотелин); и Хи е1 а1., υδ 2010/0092484 А1 (СЭ44); раскрытие которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительно, чтобы антитело представляло бы собой человеческое моноклональное антитело против СЭ70, мезотелин, СЭ19, глипикан-3, В7Н4, КС-1, СП22 или РТК7.
Другой аспект в соответствии настоящим изобретением представляет собой пролекарственное соединение формулы (I)
или его фармацевтически приемлемая соль, где Х представляет собой нуклеофильнозамещаемую уходящую группу, которая предпочтительно представляет собой С1, Вг или тозилат и более предпочтительно С1. Соединение формулы (I) может быть конъюгировано с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, что дает терапевтически полезный иммуноконъюгат посредством соответствующего линкера, спейсера и реакционноспособной функциональной группы, как описано выше. Предпочтительный вариант осуществления формулы (I), в которой X представляет собой С1, соответствует структуре формулы (Ш)
- 12 024844
Биологическая активность
Проводили серию экспериментов пролиферации клеток, в которых сравнивали способность иммуноконъюгатов, полученных из соединения (11а), и известное соединение (А). В каждом случае использованная методика представляла собой анализ включения Н-тимидина, процедурные детали которой обеспечиваются в приведенных ниже примерах.
Поскольку иммуноконъюгаты идентичны, за исключением пролекарственной группы - фосфат против карбамата - и то же самое лекарственное вещество формулы (1У) высвобождается после расщепления пептидного линкера и удаления пролекарственной группы, эксперименты обеспечивают сравнение эффекта от пролекарственной группы на потенцию иммуноконъюгата. Эти параллельные результаты показывают, что, неожиданно, иммуноконъюгаты соединения (11а) значительно более эффективны, чем у соединения (А), хотя одно и то же конечное активное соединение (1У) участвует в каждом конкретном случае.
Фиг. 4А показывает ингибирующую активность двух иммуноконъюгатов в отношении пролиферации 786-0 клеток, которые представляют собой клетки рака почки человека, экспрессирующие СЭ70. В каждом случае конъюгированное антитело представляло собой 2Н5, моноклональное антитело человека анти-СЭ70. Соединение (11а) иммуноконъюгат не только имело более низкую ЕС50 (0,1000 нМ по сравнению с 0,5725 нМ), но также имело более высокий общий процент ингибирования, о чем свидетельствует глубина ее кривой ингибирования (полная информация о последовательности антитела 2Н5 раскрыта в Сосаа е! а1. 2010 и Тегге! е! а1. 2012Ь; раскрытие которой включено в настоящем изобретении посредством ссылки. Последовательности Ун СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 и Ук СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 для антитела 2Н5 приведены в 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:4, 8ЕО ГО N0:5 и 8ЕО ГО N0:6 соответственно).
Фиг. 4В представляет аналогичное исследование, но с использованием клеток НРАС, которые являются мезотелин-экспрессирующими клетками рака поджелудочной железы человека. В каждом случае конъюгированными антителами были 6А4, антимезотелин человеческими моноклональными антителами. В этом эксперименте были получены два различных конъюгата соединения (11а) с коэффициентом замещения 1,25 и 3. (Концентрации цитотоксина на оси X корректируется с учетом коэффициент замещения.) Фиг. 4В показывает, что иммуноконъюгат соединения (А), по существу, неактивное, в то время как иммуноконъюгаты соединения (11а) имели приблизительно наномолярные ЕС50. Следует также отметить, что выше коэффициент замещения иммуноконъюгата соединения (11а), тем он показывает более высокий общий процент ингибирования (более глубокая кривая). (Полная информация о последовательности антитела 6А4 раскрыта в Тетгей е! а1. 2011Ь, раскрытие которого включено посредством ссылки. Последовательности Ун СЭРЕ СГОР2 и СГОР3 и Ук СЭРЕ СГОР2 и СГОР3 для антитела 6А приведены в 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0: 11 и 8ЕО ГО N0:12 соответственно).
Фиг. 4С представляет другое аналогичное исследование на этот раз с использованием СНОмезоклеток, которые представляют собой клетки яичника китайского хомячка, трансфицированные для экспрессии мезотелина. Конъюгированным антителом представляло собой опять же 6А4. Иммуноконъюгат соединения (А) был, по существу, неактивным, в то время как иммуноконъюгат соединения (11а)
- 13 024844 имел ЕС50 около 2 нМ.
Фиг. 4Ό представляет еще одно аналогичное исследование, на этот раз с использованием клеток 0УСАКЗ, которые представляют собой клетки рака яичников человека, экспрессирующие мезотелин. Конъюгированным антителом представляло собой опять же 6А4. ЕС50 для иммуноконъюгата соединения (11а) было приблизительно в 1000 раз ниже, чем для иммуноконъюгата соединения (А).
Фиг. 4Е представляет еще одно аналогичное исследование, на этот раз с использованием клеток Каток, которые представляют собой клетки лимфомы Беркитта человека, экспрессирующие СЭ19. Конъюгированным антителом представляло собой 21Ό4, анти-СЭ19 моноклональное антитело человека. Вновь отмечается различия между иммуноконъюгатами соединений (А) и (11а), причем первый является, по существу, неактивным, тогда как второй имел субнаномолярную ЕС50. (Полная информация о последовательности антитела 21Ό4 раскрыта в Κίη§ с1 а1. 2010а и Као-№ик с1 а1. 2012; описания которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Последовательности Ун СЭК1. СИК2 и СОКЗ и Ук СГОКЕ СГОК2 и СПКЗ антитела 21Ό4 приведены в 8НС) ГО N0:13, 8НС) ГО N0:14, 8НС) ГО N0:15, 8НС) ГО N0:16, 8ЕЦ ГО N0:17 и 8ЕЦ ГО N0:18 соответственно)
Фиг. 4Р представляет еще одно аналогичное исследование, на этот раз с клетками N0^226 (Н226), которые представляют собой клетки, экспрессирующие мезотелин, полученные из мезотелиомы легких человека. Конъюгированным антителом представляло собой опять же 6А4. Кроме того, в качестве изотипического контроля соединение (11а) было конъюгировано с 2А10, которое является человеческим моноклональным антителом против простатического специфического мембранного антигена (ПСМА). Как и ожидалось, иммуноконъюгат ПСМА обладал очень незначительной активностью или не обладал вовсе, так как клетки Н226 не экспрессируют ПСМА. Иммуноконъюгат соединения (А) так же обладал низкой или нулевой активностью. В противоположность этому каждый из двух иммуноконъюгатов соединения (11а) обладали субнаномолярными ЕС50. Как и в предыдущих примерах, иммуноконъюгат с более высокой степенью замещения демонстрировал более высокий общий процент ингибирования пролиферации. (Полная информация о последовательности антитела 2А10 раскрыта в Ниапд с1 а1. 2009 и СагйагеШ с1 а1. 2011; описания которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Последовательности Ун СИК1, СИК2 и СИКЗ и Ук СИК1, СИК2 и СИКЗ для антитела 2А10 приведены в 8НС) ГО N0:19, 8НС) ГО N0:20, 81ГО ГО N0:21, 8НС) ГО N0:22, 8НС) ГО N0^ и 81ГО ГО N0:24 соответственно).
Фиг. 40 показывает активность иммуноконъюгата антимезотелин антитела 6А4 и соединения (11а) против клеток карциномы желудка человека N87, которые экспрессируют мезотелин. Наблюдались субнаномолярные ЕС50.
Фиг. 4Н показывает активность иммуноконъюгатов антитела 6А4 и соединения (11а) при различных коэффициентах замещения (8К) против клеток Н292, которые представляют собой клетки мукоэпидермоидной легочной карциномы человека, экспрессирующие мезотелин. Иммуноконъюгат анти-ПСМА антитела 2А10 и соединения (11а) использовали в качестве контроля. Значения ЕС50 показаны в таблице ниже. Они показывают, что существует значительное увеличение активности, когда 8К увеличивается до приблизительно двух или выше.
Таблица I - активность против клеток Н292
Иммуноконъюгат ЕС50 (нМ)
ПСМА - Ср<4 Па 44,8
Мезотелин - Ср4 Па (ЗК 1,17) 86,5
Мезотелин - Срс1 Па (8К 2,1) 8,36
Мезотелин - Ср4 Па (ЗК 3,6) 11,9
Фиг. 41 показывает исследование, аналогичное исследованию на фиг. 4Н, но против клеток Н1650, которые представляют собой клетки аденокарциномы человека, экспрессирующие мезотелин. Величины ЕС50 представлены в табл. II. Опять же, скачок активности был отмечен при 8К выше приблизительно двух.
Таблица II - активность против клеток Н1650
Иммуноконъюгат ЕС50 (нМ)
ПСМА - С рс1 Па 95,3
Мезотелин - Срй Па (ЗК 1,17) 180
Мезотелин - Срй Па (ЗК 2,1) 16,6
Мезотелин - Срс1 Па (ЗК 3,6) 12,1
Фиг. 41 и 4Κ представляют исследования иммуноконъюгатов в соответствии с настоящим изобретением в отношении двух клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы человека Нер ЗВ и Нер 02, обе из которых экспрессируют глипикан-З. Сравнивали эффективность человеческого моноклонального
- 14 024844 антитела анти-глипикан-3 4А6 одного и в конъюгированном виде с соединением (Па) вместе с контрольным иммуноконъюгатом анти-0070 антитела 2Н5 и соединения (Па). (Ни Нер 3В, ни Нер С2 клетки не экспрессируют СЭ70). Результаты показывают, что иммуноконъюгат 4А6 был очень эффективен, приблизительно в 1000 раз более активен, чем контрольный иммуноконъюгат СЭ70. Одно антиглипикан-3 антитело 4А6 было неактивным. (Информация о последовательности для антитела 4А6 раскрыта в Теттей е1 а1. 2010Ь, раскрытие которого включено посредством ссылки. Последовательности νΗ СЭР1. СЭК2 и СГОК3 и νκ С1ЖЕ С1Ж2 и С1Ж для антитела 4А6 приведены в 8ЕО II) N0:25, ЖХ) II) N0:26, ЖХ) II) N0:27, ЖХ) II) N0:28, ЖХ) II) N0:29 и ЖХ) II) N0:30 соответственно)
Фиг. 4Ь, 4М и 4N представляют исследования активности иммуноконъюгата анти-В7Н4 человеческого моноклонального антитела 2А7 и соединения (Па) на клеточных линиях МОА-МВ-468, НСС-1954 и 0VСАК3. Первые две линии представляют собой клетки рака молочной железы человека, а третья является линией раковых клеток яичника человека, каждая из которых экспрессирует В7Н4, но не 0070. Иммуноконъюгат анти-ПСМА антитела 2А10 и соединения Па использовали в качестве контроля. Как можно видеть из чертежей, существует некоторая специфическая активность против клеточных линий рака молочной железы, но незначительная активность или ее отсутствие против клеток 0VСАК3 (полная информация о последовательности антитела 2А7 раскрыта в Когтап е1 а1. 2009 апй Теттей е1 а1. 2011а; описания которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Последовательности νΗ С1ЖЕ С1Ж2 и С1Ж и V С1ЖЕ С1Ж2 и СОК3 для антитела 2А7 приведены в ЖХ) II) N0:31, ЖХ) II) N0:32, 8Е0 ГО N0:33, 8Е0 ГО N0:34, 8Е0 ГО N0:35 и 8Е0 ГО N0:36 соответственно).
Фиг. 40 представляет исследования активности иммуноконъюгатов анти-ПСМА человеческого моноклонального антитела 2А10 и анти-КС-1 человеческого моноклонального антитела 19С9, каждое конъюгированное с соединением (Па), против раковых клеток простаты человека ЕУСар, которые экспрессируют как ПСМА, так и НС-1. Сравнительные данные в качестве контроля обеспечивались в виде иммуноконъюгата антимезотелинового антитела 6А4 и соединения (Па). Можно видеть, что конъюгаты как ПСМА, так и НС-1 были эффективными, каждый с субнаномолярными ЕС50 (полная информация о последовательности антитела 19С9 раскрыта в Κίη§ е1 а1. 2011, раскрытие которой включено в настоящее изобретение посредством ссылки. Последовательности νΗ СЭРЕ СГОК2 и СГОК3 и V/ С0К1, СГОК2 и СГОК3 для антител 19С9 приведены в 8ЕО ГО N0:37, 8ЕО ГО N0:38, 8ЕО ГО N0:39, 8ЕО ГО N0:40, 8ЕО ГО N0:41 и 8Е0 ГО N0:42 соответственно).
Фиг. 4Р представляет исследования активности иммуноконъюгатов анти-СГО19 человеческого моноклонального антитела 21Ό4 и анти-СГО22 человеческого моноклонального антитела 12С5, каждое конъюгированное с соединением (Па), против клеток Каток, которые экспрессируют как 0019, так и СГО22. Сравнительные данные обеспечивались в виде иммуноконъюгата анти-6А4 мезотелин антитела и анти-0070 антитела 2Н5 с соединением (Па). Иммуноконъюгаты как анти-С019, так и анти-СГО22 показали прекрасную эффективность, каждый с субнаномолярными ЕС50 (полная информация о последовательности антитела 12С5 раскрыта в Κίη§ е1 а1. 2010Ь, раскрытие которого включено посредством ссылки. Последовательности νΗ СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 и νκ С0К1, СГОК2 и СГОК3 для антител 12С5 приведены в 8Е0 ГО N0:43, 8Е0 ГО N0:44, 8Е0 ГО N0:45, 8Е0 ГО N0:46, 8Е0 ГО N0:47 и 8Е0 ГО N0:48 соответственно).
Фиг. 40 показывает активность иммуноконъюгата анти-РТК7 человеческого моноклонального антитела 4Ό5 с соединением (Па) против клеток НСТ116, которые представляют собой клетки карциномы толстой кишки человека. Иммуноконъюгат имел ЕС50 равную 1,87 нМ, в то время как контрольный иммуноконъюгат на основе анти-ПСМА антитела 2А10 был гораздо менее эффективным, с ЕС50 равным 951 нМ (полная информация о последовательности антитела 4Ό5, раскрыта в Теттей е1 а1. 2010а и Теттей е1 а1. 2012а; описания которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Последовательности νΗ СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 и νκ СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 для антитела 4Ό5 приведены в 8Е0 ГО N0:49, 8Е0 ГО N0:50, 8Е0 ГО N0:51, 8Е0 ГО N0:52, 8Е0 ГО N0:53 и 8Е0 ГО N0:54 соответственно).
Фиг. 4К показывает активность иммуноконъюгата вышеупомянутого анти-РТК7 антитела 4Ό5 против клеток Н520, которые представляют собой плоскоклеточную карциному легких человека. Иммуноконъюгат РТК7 имел ЕС50 равную 0,224 нМ, в то время как контрольный иммуноконъюгат ПСМА снова имел гораздо меньшую эффективность, с ЕС50 равную 61,6 нМ.
Приведенные выше результаты показывают, что неожиданно природа пролекарственной группы фосфат по сравнению карбамата - играет существенную роль в эффективности иммуноконъюгатов, которые по всем остальным параметрам идентичны. Не вдаваясь в теорию, наша гипотеза состоит в том, что разные клетки человека (в том числе раковые клетки) содержат различные уровни карбоксиэстеразы и что многие, если не большинство, содержат недостаточные уровни карбоксиэстеразы для расщепления карбаматной пролекарственной группы эффективным образом. Однако пролекарственные иммуноконъюгаты с фосфатной группой не страдают от такой проблемы, по-видимому, потому что в большинстве, если не во всех клетках, уровень активности фосфатазы является достаточно высоким для эффективного расщепления фосфатной группы.
- 15 024844
Применение.
Иммуноконъюгаты в соответствии с настоящим изобретением можно применять для лечения заболеваний, таких как, но не ограничиваясь этим, гиперпролиферативные заболевания, в том числе рак головы и шеи, который включают опухоли головы, шеи, полости носа, околоносовых пазух, носоглотки, ротовой полости, ротоглотки, гортани, глотки, слюнных желез и параганглиомы; рак печени и желчных протоков, в частности гепатоцеллюлярной карциномы; рака кишечника, особенно рака толстой кишки; рак яичников, мелкоклеточный рак и немелкоклеточный рак легких (МРЛ и НМРЛ); рак молочной железы, саркомы, такие как фибросаркомы, злокачественная фиброзная гистиоцитома, эмбриональная рабдомиосаркома, лейомиосаркома, нейрофибросаркома, остеосаркома, синовиальная саркома, липосаркома и альвеолярная саркома мягких тканей; лейкозы, такие как острый промиелоцитарный лейкоз (ХМЛ), острый миелобластный лейкоз (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (АЬЬ), и хронический миелолейкоз (ХМЛ), опухоли центральной нервной системы, в частности рака мозга, множественная миелома (ММ), лимфомы, такие как лимфома Ходжкина, лимфоплазмацитоидная лимфома, фолликулярная лимфома, лимфома лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфома клеток мантийной зоны, В-крупноклеточная лимфома, лимфома Беркитта, и Т-клеточная анапластическая крупноклеточная лимфома. В клиническом отношении применение способов и использование описанных в настоящем изобретении композиций приводит к уменьшению размеров или количества злокачественных опухолей и/или снижению сопутствующих симптомов (где это применимо). В патологическом отношении применение способа и применение композиций, описанных в настоящем изобретении, будет производить патологически соответствующий ответ, такой как ингибирование пролиферации раковых клеток, уменьшение размеров рака или опухоли, предотвращение дальнейшего метастазирования и ингибирование опухолевого ангиогенеза. Способ лечения таких заболеваний, включает введение терапевтически эффективного количества предлагаемой в изобретении комбинации пациенту. Способ может быть повторен, если необходимо. В частности, рак может быть раком, клетки которого экспрессируют СИ70, мезотелин, СИ19, глипикан-3, В7Н4, КО-1, СИ22 или РТК7. В предпочтительном варианте осуществления рак, который лечат, является раком почки, раком поджелудочной железы, раком яичников, лимфомой, раком толстой кишки, мезотелиомой, раком желудка, раком легкого, раком предстательной железы, аденокарциномой, раком печени или раком молочной железы.
Иммуноконъюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться в комбинации с другими терапевтическими агентами, в том числе антителами, алкилирующими агентами, ингибиторами ангиогенеза, антиметаболитами, ДНК-расщепляющими агентами, ДНК-сшивающими агентами, интеркаляторами ДНК, агентами, связывающимися в малой бороздке ДНК, ендиинами, ингибиторами белка теплового шока 90, ингибиторами гистондеацетилазы, иммуномодуляторами, стабилизаторами микротрубочек, аналогами нуклеозидов (пуриновых или пиримидиновых), ингибиторами ядерного экспорта, ингибиторами протеасомы, ингибиторами топоизомеразы (I или II), ингибиторами тирозинкиназы и ингибиторами сериновой/треониновой киназы. Специфические терапевтические агенты включают адалимумаб, ансамитоцин Р3, ауристатин, бендамустин, бевацизумаб, бикалутамид, блеомицин, бортезомиб, бусульфан, каллистатин А, камптотецин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, цисплатин, кладрибин, цитарабин, криптофицины, дакарбазин, дазатиниб, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, дуокармицин, динемицин А, эпотилоны, этопозид, флоксуридин, флударабин, 5-фторурацил, гефитиниб, гемцитабин, ипилимумаб, гидроксимочевина, иматиниб, инфликсимаб, интерфероны, интерлейкины, βлапахон, леналидомид, иринотекан, майтансин, мехлоретамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митомицин С, нилотиниб, оксалиплатин, паклитаксел, прокарбазин, субероиланилид гидроксамовой кислоты (ЗАНА), 6-тиогуанидин, тиотепа, тенипозид, топотекан, трастузумаб, трихостатин, винбластин, винкристин и виндезин.
Иммуноконъюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены и введены с использованием способов, обычных для биологических препаратов. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как приводятся в Оеппаго, еб., Кеттфоп: ТЬе Заепсе аиб Ргасбсе о£ РЬагтасу, 201Ь Еб. (Ырршсой ХУПЬапж & ХУПкиж 2003), раскрытие которого включено в настоящее изобретении посредством ссылки. Типичные вспомогательные вещества включают, без ограничения, буферные агенты (например, фосфаты, ацетаты, трис(гидроксиметил)аминометан (Трис)), солюбилизаторы и эмульгаторы (например, полисорбат), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт), соли (например, ЫаС1, КС1) хелатирующие агенты (например, ЭДТА), углеводороды (например, сахароза, глюкоза, мальтоза, трегалоза), носители (например, альбумин), аминокислоты и их соответствующие соли: гидрохлориды, цитраты, сорбит, декстран и тому подобное.
Иммуноконъюгаты могут быть представлены в виде лиофилизированных порошков с или без вспомогательных веществ, которые затем могут быть растворены в носителе, таком как стерильная вода для инъекций, раствор хлорида натрия для инъекций, или раствор глюкозы для инъекций, с добавлением наполнителей или без.
С другой стороны, иммуноконъюгат может быть предоставлен в виде концентрированного раствора, необязательно включающей вспомогательные вещества, который затем разбавляют до нужной концентрации перед введением. Альтернативные формы включают дисперсии, микроэмульсии и липосомы.
- 16 024844
Предпочтительно фармацевтическая композиция пригодна для внутривенного (IV), внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). Термин парентеральное введение означает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Предпочтительные способы введения включают IV инфузию, IV болюсную, подкожную, внутримышечную.
Терапевтически эффективное количество предпочтительно приводит к уменьшению выраженности симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов болезни или предотвращению патологии или инвалидности из-за болезни. Например, для лечения опухоли у субъектов терапевтически эффективное количество предпочтительно ингибирует рост опухоли по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40 %, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% по сравнению с нелеченными субъектами. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иным образом улучшать симптомы у субъекта, который обычно представляет собой человека, но может быть другим млекопитающим.
Режимы дозирования могут корректироваться, чтобы обеспечить терапевтический ответ. Например, может быть введена одна доза, могут быть введены несколько раздельных доз в течение долгого времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указано в конкретной ситуации. Особенно предпочтительным является приготовление парентеральных композиций в единичной дозированной форме для облегчения введения и равномерности дозирования. Лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов, подлежащего лечению, и каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Устройства, такие как предварительно заполненные шприцы, двухкамерные шприцы и автоинжекторы могут быть использованы.
Доза будет варьироваться в зависимости от заболевания, которое лечат, характеристик пациента, таких как возраст, пол и генотип, и стадии лечения. Как правило, доза может составлять от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 300 мг/кг.
Примеры
Применение в соответствии с настоящим изобретением может стать более понятным посредством следующих примеров, которые приведены в качестве иллюстрации, но не как ограничения.
Пример 1 - соединение (11а).
В этом примере описан синтез соединения 12 в соответствии с настоящим изобретением (также упоминаемое в настоящем изобретении как соединение (11а)). Фиг. 1А и 1В в совокупности показывают схему его синтеза.
Соединение 2. Трифторуксусную кислоту (ТРА Икйет, 5 мл) добавляли к раствору соединения 1 (1 г, 2,36 ммоль) в безводном дихлорметане (ДХМ Шдта-АМпсЬ, 5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ, приблизительно 25°С) в течение 30 мин. Анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показал, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали и сушили в высоком вакууме в течение ночи с получением 1,15 г соединения 2 в виде зеленоватого твердого вещества (ТРА соль).
Соединение 4. ди-трет-Бутилдикарбонат ((Вос)2О, 10,24 г, 46,97 ммоль) в безводном метаноле (Асгок, 100 мл) и палладий (А1йпс1т 10% на активированном угле, 400 мг) добавляли к суспензии этилового эфира 5-нитроиндол-2-карбоксилата (соединение 3, Асток, 10 г, 42,7 ммоль). Реакционную смесь гидрировали в атмосфере Н2 (30 фунтов на кв.дюйм) в течение 8 ч. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 4 (10,5 г, 81%) в виде желтого твердого вещества.
Ή-ЯМР (ДМСО) δ 11,68 (с, 1Н), 9,19 (с, 1Н), 7,76 (с, 1Н), 7,26 (м, 2Н), 7,02 (д, 1Н), 4,30 (д, 2Н), 1,46 (с, 9Н), 1,33 (т, 3Н).
Соединение 5. Раствор моногидрата ЫОН (§1§та-А1йт1сЬ) в воде (150 мл, 0,57 М) добавляли к раствору соединения 4 (10,5 г, 34,5 ммоль) в ацетонитриле (150 мл). Реакционную смесь нагревали при 40°С в течение ночи, после чего гидролиз был завершен согласно анализу ВЭЖХ. Реакционную смесь разбавляли водой (300 мл) и концентрировали в вакууме для удаления ацетонитрила. Полученный раствор экстрагировали ЫОАс (2x150 мл) и органические слои отбрасывали. Водный слой подкисляли до рН 4 добавлением 10% раствора КН§О4 (А1йпск). Полученную смесь снова экстрагировали этилацетатом (3x150 мл). Органические слои от трех экстракций позже объединяли, сушили над безводным Мд§О4 и концентрировали в вакууме с получением соединения 5 в виде твердого вещества коричневого цвета (9,7 г,
- 17 024844
84%).
Ή-ЯМР (ДМСО) δ 12,84 (с, 1Η), 11,65 (с, 1Η), 9,20 (с, 1Η), 7,73 (с, 1Η), 7,23 (м, 2Н), 6,92 (с, 1 Н), 1,42 (с, 9Н); МС (Ε8Ι) т/ζ 299 (\к\а) +
Соединение 6. Получали раствор соединения 5 (779 мг, 2,83 ммоль) и КК№,№-тетраметил-О-(7азабензотриазол-1-ил)урония гексафторфосфата (НАТи Оак\уоой, 1,07 г, 2,83 ммоль) в безводном Ν,Νдиметилформамиде (ДМФА 8щта-А1йпск 10 мл). Ν,Ν-Диизопропилэтиламин (ΌΙΡΕΑ) добавляли для доведения рН реакционного раствора до значения выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Неочищенное соединение 2 (1,15 г, оценивается как 2,36 ммоль) с последующим добавлением дополнительно Э1РЕА, чтобы довести рН реакционной смеси до значения выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ВЭЖХ-анализ показал, что реакция была почти завершена. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой и затем солевым раствором. Органические фазы концентрировали до суспензии с 2 г силикагеля. Суспензию очищали на 40 г колонке СотЫИакЬ с 0-50% градиентом ЕЮАс в гексане с получением соединения 6 в виде желтого твердого вещества (1,05 г, 76%).
Ή-ЯМР (ДМСО-й6): δ 11,61 (с, 1Н), 9,18 (с, 1Н), 8,22 (д, 1Н), 8,16 (м, 1Н), 7,95 (м, 1Н), 7,81 (с, 1Н), 7,58 (м, ЗН), 7,42 (м, ЗН), 7,33 (м, ЗН), 7,15 (с, 1Н), 5,15 (с, 2Н), 4,82 (т, 1Н), 4,59 (д, 1Н), 4,30 (м, 1Н), 4,04 (м, 1Н), 3,90 (м, 1Н), 1,48 (с, 9Н).
Соединение 7. Реакционная смесь, состоящую из соединения 6 (780 мг, 1,34 ммоль) и Ρά/С (81дтаА1йпск 10%, 150 мг), в безводном ДХМ (8|дта-А1йг1ск, 10 мл) и безводном метаноле (5 мл) перемешивали в атмосфере под водородом из баллона в течение ночи. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь фильтровали через СЕЫТЕ™ и фильтрат концентрировали, получая соединение 7 в виде светло-желтого твердого вещества (562 мг, 86%), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 9. Раствор соединения 7 (260 мг, 0,53 ммоль), ди-трет-бутилдиэтилфосфорамидита (8щта-А1йпск 0,58 мл, 2,1 ммоль) и тетразола (8щта-А1йпск 0,45 М в ацетонитриле 14 мл) в тетрагидрофуране (ТГФ 8щта-А1йпск безводный, 25 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. ВЭЖХ анализ показал, что исходное вещество 7 полностью превратилось в соединение 8. Без выделения соединения 8 прибавили раствор м-хлорпербензойной кислоты (тСРВА, 8щта-А1йпск 365 мг, 2,12 ммоль) в ДХМ (безводный, 8щта-А1йпск 10 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали с 0,5 г силикагеля с образованием суспензии. Суспензию подвергали очистке на колонке 4 г СотЫИакЬ с 10-50% градиентом ЕЮАс в гексане. Фракции, содержащие продукт, объединяли и сушили в высоком вакууме, получая соединение 9 в виде белого твердого вещества (212 мг, 59%).
Соединение 10. ТРА (ТКНсг, 3 мл) добавляли к раствору соединения 9 (212 мг, 0,031 ммоль) в безводном ДХМ (81дта-А1йт1сЬ, 3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали и сушили в высоком вакууме в течение ночи, получая соединение 10 в виде зеленоватого твердого вещества (271 мг).
Ή-ЯМР в виде соли ТФУ (ДМСО-й6): δ 11,81 (с, 1Н), 8,42 (с, 1Н), 8,12 (д, 1Н), 7,94 (д, 1Н), 7,55 (м, 1Н), 7,42 (м, ЗН), 7,18 (с, 1Н), 7,02 (д, 1Н), 4,78 (т, 1Н), 4,68 (д, 1Н), 4,32 (с, 1Н), 4,02 (м, 1Н), 3,90 (м, 1Н).
Соединение 12. Значение рН раствора соединения 11 (179 мг, 0,25 ммоль предположительно моноТФУ-соли, полученной в соответствии с 8ий с1 а1. 2010, раскрытие которой включено в настоящее изобретение посредством ссылки), и НАТИ (Оак\уоой, 84,4 мг, 0,222 ммоль) в безводном ДМФА (81дтаА1йпск 3 мл) доводили до значения выше 8 добавлением Э1РЕА. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. ВЭЖХ-анализ показал, что большая часть соединения 11 была активирована. Соединение 10 (130 мг, 0,222 ммоль предположительно моно-ТФУ-соль) добавляли к реакционной смеси. Значение рН доводили до значения выше 8 добавлением Э1РЕА. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. ВЭЖХ-анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь вводили в препаративную ВЭЖХ и очищали с 10-100% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА) в качестве элюента. Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 12 в виде белого твердого вещества (138 мг, 55%). Масс-спектр: [М+Н] 1055.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что синтез, описанный выше и на фиг. 1А и 1В, включает конвергентную сборку предшественников фрагментов а и а' и что альтернативные стратегии синтеза могут быть использованы, например, посредством сборки фрагментов предшественников Ь, Ь' и Ъ или фрагментов с, с' и с, как показано ниже. Последние две стратегии проиллюстрированы в 8ий с1 а1. 2010, раскрытие которого включено посредством ссылки, и могут быть адаптированы для синтеза соединений в соответствии с настоящим изобретением с соответствующими изменениями.
- 18 024844
ух ,--С1 н а °Ύ ί ΗΝ, X О νη2 \ о „ ϊ Η Λ, Η а' 0
-1 Ь I- Ь' Ь Г-
- с С' - с
Пример 2 - соединение (1а).
Этот пример относится к синтезу соединения 14, также упоминаемого в настоящем изобретении как соединение (Та). Схема синтеза приведена на фиг. 2.
Соединение 13. Э1РЕА (А1бпс1т 17 мкл, 01 ммоль) добавляли к раствору соединения 10а (81дтаΛΐάπαίι. 15,7 мг, 0,051 ммоль) и НАТИ (Оак\уооб. 19,4 мг, 0,051 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 1 мл). Значение рН реакционной смеси было выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. ВЭЖХ анализ показал, исходное вещество было полностью активировано. Соединение 10 (30 мг, 0,051 ммоль предположительно, моно-ТФУ-соль) добавляли к этому раствору. Добавляли дополнительно ΌΙΡΕΑ, чтобы довести рН реакционной смеси до значения выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Сырой продукт очищали препаративной ВЭЖХ с 10-100% градиентом ацетонитрила в воде (0,1% ТФУ по объему) в качестве элюента с получением соединения 13 (25 мг, 71%) в виде не совсем белого твердого вещества.
Соединение 14. ТФУ (УАК, 1 мл) добавляли к раствору соединения 13 (25 мг, 0,036 ммоль) в безводном ДХМ (Асгок, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали и очищали препаративной ВЭЖХ с 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (0,1% ТФУ по объему) в качестве элюента, с получением соединения 14 (21 мг, 82% предположительно, моно-ТФУ-соль) в виде не совсем белого твердого вещества.
Ή-ЯМР (ДМСО-66): δ 11,65 (с, 1Н), 9,67 (с, 1Н), 8,46 (с, 1Н), 8,07 (д, 2Н), 7,91 (м, 2Н), 7,69 (д, 2Н), 7,35-7,55 (м, 4Н), 7,15 (с, 1Н), 6,57 (д, 2Н), 4,82 (т, 1Н), 4,57 (д, 1Н), 4,03 (т, 1Н), 3,954 (т, 1Н). 31ΡΝΜΚ (ДМСО-66): δ 5,909 (с, 1Н), Μ8: [Μ + Н] 591.
Пример 3 - соединение (ПЬ).
Фиг. 3 Α-3Ό показывают в комбинации синтез соединения 28, также упоминаемое в настоящем изобретении как соединение (11Ь). Специалистам в данной области техники будет понятно, что общая стратегия, используемая в настоящем изобретении соответствует образцу Ь/Ь'/Ь, описанному выше в примере 1.
Фиг. 3А показывает синтез первого промежуточного соединения 18.
Соединение 17. Раствор трет-бутилового эфира (2-оксоэтил)карбамата (соединение 16, АИпск 5 г, 31,4 ммоль) в метаноле (безводный, Асгок, 15 мл) добавляли к раствору (8)-метил 2-амино-3метилбутаноата (соединение 15, ВасЬет, соль НС1, 5,26 г, 31,4 ммоль), ацетат натрия (АИпсЬ 10,3 г, 82,06 ммоль) в метаноле (безводный, Асгок, 65 мл). Затем добавляли NаВНзСN (АИпсЬ 3,95 г, 62,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре 22,5°С в течение 16 ч и концентрировали до суспензии. Суспензию растворяли в воде (100 мл) и полученный раствор экстрагировали этилацетатом (3x100 мл). Органические фазы объединяли, промывали солевым раствором (1x100 мл), концентрировали и сушили в вакууме с получением соединения 17 (масло, 9,4 г неочищенного). [М + Н] 275.
Соединение 18. Раствор гидрата ЫОН (А1бтюЬ, 2,88 г, 68,6 ммоль) в воде (40 мл) добавляли к раствору сырого соединения 17 (9,4 г) в метаноле (40 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и разбавляли водой (40 мл). Полученный раствор экстрагировали ДХМ (40 мл). Водный слой отделяли и подкисляли раствором КН§О4 (А1бпсЬ 20% в воде) до рН 5. Суспензию фильтровали и твердое вещество сушили в высоком вакууме, получая соединение 18 (4,85 г, 60,2% из расчета на соединение 15) в виде белого твердого вещества. Масс-спектр: [М + Н] 261.
Ή-ЯМР (ДМСО-66) δ 6,82 (т, 1Н), 3,06 (м, 2Н), 2,83 (д, 1Н), 2,62 (м, 2Н), 2,31 (м, 1Н), 1,88 (м, 1Н), 1,38 (с, 9Н), 0,86 (д, 6Н).
Фиг. 3В показывает синтез второго промежуточного соединения 22.
Соединение 21. трет-Бутил-4-аминобензойную кислоту (соединение 19, Р1ика, 8,75 г, 45,3 ммоль), №(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид ЕЭС, Р1ика, 8,68 г, 45,3 ммоль), 1гидроксибензотриазол (СЬет-1трех, 6,12 г, 45,3 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 150 мл) и СиС12 (А1бпсЬ 6,08 г, 45,3 ммоль) добавляли к раствору Ν^-Ртос-Ь-цитруллина (соединение 20, Р1ика, 15 г, 37,74
- 19 024844 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли Е1оАс (600 мл) и полученный раствор промывали раствором №-ьСО3, (5%, 200 мл), насыщенным раствором №-1НСО3, (1 х200 мл) и солевым раствором (1х200 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Мд§О4 и концентрировали, получая неочищенное соединение 21 в виде желтого твердого вещества.
Ή-ЯМР (ДМСО-Й6) δ 10,39 (с, 1Н), 7,82 (кв, 4Н), 7,68 (м, 4Н), 7,28-7,40 (м, 5Н), 6,01 (т, 1Н), 5,42 (синглет, 2Н), 4,10-4,29 (м, 4Н), 2,90-3,05 (м, 2Н), 1,32-1,70 (м, 13Н), МС: [М + Н] 573.
Соединение 22. Пиперидин (А1йпсН. 14 мл) добавляли к раствору сырого соединения 21 в безводном ДМФА (Асгок, 140 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в ЕЮАс (600 мл). Органическую фазу промывали насыщенным раствором соли (1х200 мл), сушили над безводным Мд§О4 и концентрировали с силикагелем до суспензии. Суспензию очищали флэшхроматографией с 0-20% градиентом метанола в ДХМ в качестве элюента с получением соединения 22 в виде белого твердого вещества (9,5 г, выход 72% из расчета на соединение 20).
Ή-ЯМР (ДМСО-Й6) δ 7,82 (д, 2Н), 7,72 (д, 2Н), 5,97 (т, 1Н), 5,38 (с, 2Н), 3,43 (м, 1Н), 2,98 (т, 2Н), 1,30-1,62 (м, 13Н), МС: [М + Н] 351.
Фиг. 3С показывает синтез третьего промежуточного соединения 25.
Соединение 23. Э1РЕА (А1йпсЬ) добавляли к раствору соединения 18 (1,5 г, 5,77 ммоль), бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфоний гексафторфосфата (ВОР, ВасЬет, 2,87 г, 6,5 ммоль) и соединения 22 (1,84 г, 5,26 ммоль) в ДМФА (Асгок, безводный, 15 мл) в количестве, достаточном для доведения рН раствора до значения выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. ДХМ (100 мл) и насыщенный раствор NаНСОз (100 мл) добавляли к реакционной смеси. Водный слой экстрагировали ДХМ (2х25 мл). Органические фазы объединяли и концентрировали с силикагелем (8 г) до суспензии. Суспензию очищали на 80 г колонке СотЫР1акЬ с 0-10% градиентом метанола в ДХМ в качестве элюента. Содержащие продукт фракции объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 23 в виде белого твердого вещества (2,1 г, 68%). Масс-спектр: [М + Н] 593.
Соединение 24. НС1 в диоксане (ЛИпсЬ, N 4, 7 мл) добавляли к раствору соединения 23 (1,8 г, 3,03 ммоль) в ацетонитриле (квалификации для ВЭЖХ, А1йпсЬ, 20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Продукт собирали фильтрацией и сушили в высоком вакууме в течение ночи, получая соединение 24 в виде почти белого твердого вещества (1,45 г, 94%). Масс-спектр: [М + Н] 437.
Соединение 25. ЭГРЕА добавляли к раствору соединения 24 (200 мг, 0,39 ммоль, предположительно, двойная соль НС1) и (Вос)2О (94,2 мг, 0,43 ммоль) в ДМФА (безводный, 2 мл) в количестве, достаточном для приведения рН реакционной смеси к значению выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. ВЭЖХ анализ показал, что реакция завершена. Добавляли диэтиловый эфир (20 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Продукт выделяли в виде полутвердого вещества. Растворитель декантировали и полученный продукт сушили в высоком вакууме в течение ночи, получая соединение 25 в виде белого твердого вещества (178 мг, 85%, НС1 соль). Масс-спектр: [М + Н] 537.
Ή-ЯМР (ДМСО-Й6) δ 10,51 (с, 1Н), 8,85 (шир., 1Н), 7,88 (д, 2Н), 7,71 (д, 2Н), 7,03 (шир., 1Н), 6,18 (д, 1Н), 5,42 (шир., 2Н), 4,48 (с, 1Н), 2,75-3,10 (м, 7Н), 2,18 (шир., 1Н), 1,42-1,78 (м, 4Н), 1,38 (с, 9Н), 0,92 (м, 6Н).
Фиг. 3Ό показывает завершение синтеза соединения 28, также упоминаемого в настоящем изобретении как соединение (11Ь).
Соединение 26. Э1РЕА (А1йпсЬ, 0,142 мл, 0,816 ммоль) добавляли к раствору соединения 25 (394 мг, 0,734 ммоль) и НАТИ (Оак^оой, 186 мг, 0,489 ммоль) в ДМФА (Асгок, безводный, 3 мл). Значение рН реакционной смеси было выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Прибавляли соединение 10 (пример 1, 192 мг, 0,407 ммоль). Прибавляли дополнительно ЭГРЕА для поддержания рН реакционной смеси выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь вводили в препаративную ВЭЖХ и очищали элюированием 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 26 (205 мг, 51%) в виде белого твердого вещества. Масс-спектр: [М + Н] 990.
Соединение 27. ТФУ (У\УР, 5 мл) добавляли к раствору соединения 26 (205 мг, 0,207 ммоль) в ДХМ (Асгок, безводный, 5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали и лиофильно сушили с получением соединения 27 в виде его ТФУ-соли (210 мг, 100%). Масс-спектр: [М + Н] 890.
Соединение 28. Э1РЕА (А1йпсЬ, 0,147 мл, 0,842 ммоль) добавляли к раствору 3меркаптопропионовой кислоты (АИпсЬ, 59,6 мг, 0,562 ммоль), соединения 27 (100 мг, 0,112 ммоль) и ВОР (АИпсЬ, 124 мг, 0,281 ммоль) в ДМФА (Асгок, безводный, 2 мл). Значение рН реакционной смеси
- 20 024844 было выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь вводили в препаративную ВЭЖХ и очищали элюированием 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,01% ТФУ) с получением соединения 28 (45 мг, 45,5%). Масс-спектр: [М + Н] 978.
Пример 4 - получение иммуноконъюгатов.
Ниже приведена в качестве иллюстрации общая процедура для получения иммуноконъюгатов в соответствии настоящим изобретением, основанная на введении свободных тиольных групп на антитело реакцией с лизиновой δ-аминогруппы с 2-иминотиоланом, с последующей реакцией с малеимидсодержащим пролекарственным фрагментом, таким как соединение (11а). Первоначально заменяли буфер в растворе антитела на 0,1 М фосфатный буфера (рН 8,0), содержащий 50 мМ №С1 и 2 мМ диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ΌΤΡΑ) и концентрировали до 5-10 мг/мл. Тиолирование достигалось за счет добавления 2-иминотиолана к антителу. Количество 2-иминотиолана, которое должно быть добавлено, может быть определено в предварительном эксперименте, и оно изменяется от антитело к антителу. В предварительном эксперименте осуществляли титрование добавлением возрастающих количеств 2иминотиолана к антителу и последующей инкубацией с антителами в течение 1 ч при комнатной температуре 25°С), антитело обессоливали в 50 мМ ΗΕΡΕ8 буфере, рН 6,0 с помощью колонки 8ΕΡΗΑΌΕΧ™ Ο-25 и число введенных тиоловых групп быстро определяли реакцией с дитиодипиридином (ΌΤΌΡ). Реакция тиольных групп с ΌΤΌΡ приводило к освобождению тиопиридина, что можно контролировать спектроскопически при 324 нм. Как правило, использовали образцы с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл. Оптическая плотность при 280 нм могла быть использована для точного определения концентрации белка в образцах, а затем аликвоту каждой пробы (0,9 мл) инкубировали с 0,1 мл ΌΤΌΡ (5 мМ исходный раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Чистый образец одного буфера плюс ΌΤΌΡ также инкубировали параллельно. Через 10 мин измеряли поглощение при 324 нм и количественно определяли число тиоловых групп с использованием коэффициента экстинкции для тиопиридина равного 19800 М-1.
Как правило, желательным является уровень тиолирования около трех тиоловых групп на антитело. Например, для некоторых антител это может быть достигнуто посредством добавления 15-кратного молярного избытка 2-иминотиолана с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Антитело затем инкубировали с 2-иминотиоланом в желаемом молярном соотношении и затем обессоливали в буфере для конъюгации (50 мМ, рН 6,0 ΗΕΡΕ8 буфер, содержащий 5 мМ глицина и 2 мМ ΌΤΡΑ). Тиолированное вещество выдерживали на льду, пока количество введенных тиолов не определят количественно, как описано выше.
После проверки количества введенных тиолов, фрагмент лекарственное средство-линкер добавляли при 3-кратном молярном избытке, считая на тиол. Реакции конъюгации дают возможность протекать в буфере для конъюгации, также содержащем конечную концентрацию, равную 5 % диметилсульфоксида (ДМСО), или подобного альтернативного растворителя. Как правило, исходный раствор лекарственное средство-линкер растворяется в 100% ДМСО. Исходный раствор добавляли непосредственно к тиолированному антителу, которое имеет достаточно ДМСО для доведения конечной концентрации до 10% или предварительно разбавленного в буфере для конъюгации, содержащим конечную концентрацию в 10% ДМСО, с последующим добавлением к равному объему тиолированного антитела.
Реакционную смесь конъюгации инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации реакционную смесь конъюгации центрифугировали и фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Очистка конъюгата могла быть достигнута посредством хроматографии с использованием ряда способов. В одном способе конъюгат очищали с использованием гель-фильтрационной хроматографии на δΕΡΗΑΟΚΥΌ™ 8200, предварительно уравновешенным 50 мМ ΗΕΡΕ3 буфером, рН 7,2, содержащей 5 мМ глицина и 50 мМ №С1. Хроматографию осуществляли с линейной скоростью потока 28 см/ч. Фракции, содержащие конъюгат собирали, объединяли и концентрировали. В альтернативном способе очистка могла быть достигнута путем ионообменной хроматографии. Условия варьировались от антитело к антителу и должны быть оптимизированы в каждом случае. Например, реакционную смесь конъюгат антитело-лекарственная субстанция наносли на колонку с 8Ρ- 8ΕΡΗΑΚΌ8Ε™, предварительно уравновешенную в 50 мМ ΗΕΡΕ8, рН 5,5, содержащим 5 мМ глицина. Конъюгат антитела элюировали с использованием градиента 0-1 М Ν;·ιΟ в уравновешивающем буфере при рН 5,5. Соответствующие фракции, содержащие иммуноконъюгат, объединяли и диализовали против буфера для композиции (50 мМ, рН 7,2 ΗΕΡΕ8 буфер, содержащий 5 мМ глицина и 100 мМ №С1).
В соответствии с описанной выше процедурой иммуноконъюгаты соединения (11а) получали с антиПСМА человеческим моноклональным антителом (2А10, Ниапд е! а1. 2009 и СагбагеШ е! а1. 2011); антимезотелин человеческим моноклональным антителом (6А4, Τе^^еи е! а1. 2009а), анти-СО70 человеческим моноклональным антителом (2Н5, Τе^^еи е! а1. 2009а), и анти-СО19 человеческим моноклональным антителом (21Ό4, Рао-№пк е! а1. 2009). Иммуноконъюгаты сравнения с соединением (А) были получены подобным образом.
Специалистам в данной области техники очевидно, что вышеописанные условия и методология являются иллюстративными и не ограничивающими, и что другие подходы для конъюгации известны в
- 21 024844 данной области техники и могут быть использованы в настоящем изобретении.
Пример 5 - исследование инкорпорации 3Н-тимидина.
Этот пример в целом описывает процедуру, используемую для исследования антипролиферативной активности иммуноконъюгатов в соответствии настоящим изобретением. Линии опухолевых клеток человека были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС), Р.О. Вох 1549, Маиаккак, УА 20108, И8А, и культивировались в соответствии с инструкциями АТСС. Клетки СНО-мезо получали посредством трансфекции клеток СНО ДНК, содержащей ген человеческого мезотелина, и подвергнутый селекции для (получения) стабильных клонов, экспрессирующих человеческий мезотелин. Клетки высевали при 1,0х 104 клеток/лунку в 96-луночных планшетах для 3 часового анализа Н тимидина в указанном порядке. Серийные разведения (1:3) иммуноконъюгатов добавляли к лункам. Планшеты инкубировали в течение 72 ч. Планшеты загружали 1,0 мкКи 3Н-тимидина на лунку в течение последних 24 ч общего периода инкубации собирали и считывали на сцинтилляционном счетчике Тор Соип1 8спИП1а1юп СоиПег (Раскагй 1пк1гитеп15, Меййеи, СТ). Величины ЕС50 - концентрация, при которой агент ингибирует или уменьшает пролиферацию клеток на 50% от максимального ингибирования - определяли с помощью программного обеспечения РК18М™, версия 4.0 (СгарЬРай 8оП\уаге, Ьа 1о11а, СА, США).
Антипролиферативные результаты показаны на фиг. 4А-4Р, рассмотренных выше.
Пример 6 - дефосфорилирование с помощью клеточных лизатов.
Этот пример демонстрирует, что фосфатные пролекарственные соединения секо-МСВА в соответствии с настоящим изобретением могут дефосфорилироваться посредством лизатов человеческих опухолевых клеток.
Клетки 786-0 в виде замороженных гранул с предполагаемым количеством 107 клеток на пробирку для вортекса ресуспендировали и гомогенизировали в 500 мкл буфера для лизиса (25 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы, 0,1% Тгйои Х-100, рН 5,5). Гомогенизация включает перемешивание на вортексе в течение 30 с, после чего следует одна минута охлаждении на льду. Для каждой пробирки выполняли по три цикла вортекса и охлаждения. Образцы клеток затем дополнительно смешивали, пропуская через иглу 19 три раза.
После гомогенизации ДНК клеточного лизата гидролизовали, используя ДНКазу ВЕNΖΟNА8Е™. Образцы сначала вносили в 1 мМ М§8О4. После перемешивания 2 мкл ДНКазы ВЕNΖΟNА8Е™ (неразбавленной) добавляли в каждую ампулу лизата (4 мкл/мл, об./об., конечная концентрация). Затем образцы хранили при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем охлаждали на льду. На этой стадии об успешной активности ДНКазы свидетельствовало появление хлопьевидного осадка. Затем образцы центрифугировали при максимальной скорости в микроцентрифуге в течение 5 мин для удаления клеточного дебриса. Супернатант замораживали при 70°С для последующего использования. Концентрацию белка в лизате определяли с помощью Р1егсе ВСА Рго!еш ЭеЮтипабоп теШойо1оду (ТЬегто 8с1еиййс). Было найдено, что образцы в этом исследовании содержали 2,85 мг/мл белка.
Получали 2000 мкМ исходный раствор соединения формулы (1а). Лизат разбавляли до 2,1 мг/мл в буфере для лизиса. Для реакции добавляли 5 мкл исходного раствора соединения (1а) к 95 мкл лизата. Конечные концентрации составляли 100 мкМ соединения (1а) в лизате, содержащем 2 мг/мл белка. Буфер, содержащий 25 мМ ацетата натрия, 1 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы, 0,1% Тгйои х 100 и 1 мМ М§8О4 обеспечивал буферизацию при рН5,5.
Использовали отрицательные контроли с буфером для лизиса вместо клеточного лизата с ДНКазой ВЕNΖΟNА8Е™ и также добавляли М§8О4.
Исследуемые и контрольные образцы помещали в нагревательный блок, установленный на уровне 37°С. Через определенные промежутки времени (5 мин, 1, 2, 4 и 8 ч) отбирали 50 мкл аликвоты и реакции в каждой аликвоте останавливали добавлением 150 мкл (3Х) холодного этанола. Образцы хранили на льду в течение 1 ч и центрифугировали для удаления белка. Супернатант сохраняли для ИРЬС (сверхпроизводителъная жидкостная хроматография) анализа, при следующих условиях:
Колонка: \а1егз Н88 Т3 2,1х50 мм С18 ИРЬС.
Подвижная фаза: А буфер: вода/0,1% ТРА; В буфер: ацетонитрил/0,1% ТРА.
Система ВЭЖХ: \а1еге ИРЬС.
Объем инъекции: 4 мкл.
Элюирование: от 25 до 40% В, через 1,8 мин.
Расход: 1 мл/мин.
Обнаружение: А340.
За реакцией следили с помощью мониторинга за продукцией соединений (1Уа) и (1УЬ), которые являются секо- и циклопропановой формами дефосфорилированного соединения (1а) соответственно.
- 22 024844
Было установлено, что дефосфорилирование происходит достаточно быстро, заканчиваясь полностью в течение 8 ч. Поскольку рН реакционной смеси составляла 5,5, близкая к найденной в лизосомальных органеллах, результаты показывают вовлечение кислой фосфатазы в реакцию дефосфорилирования.
Аналогичный эксперимент осуществляли с использованием лизатов клеток Н226. Было обнаружено, что дефосфорилирование полностью заканчивалось в течение 3 ч.
Пример 7 - дефосфорилирование с помощью микросом печени.
Этот пример демонстрирует дефосфорилирование соединения (1а) с помощью ферментов микросом печени человека и мыши.
Микросомы печени человека, полученные из пулированных печеночных источников, получали из XеηоΐесЬ (Рай ЫитЬег н-0630). Они поставлялись с номинальной концентрацией белка 20 мг/мл в 20% растворе сахарозы. Содержание белка проверяли с помощью ВСА (бицинхониновая кислота) анализа с использованием реагента от ТНегто-РРНег.
Микросомы печени человека разбавляли до 8,42 мг/мл в реакционном буфере (100 мМ Трис-нС1, 1 мМ МдС12, 0,9% ЫаС1, рн 7,4). Количественно разбавление было спроектировано для обеспечения точной доставки 0,8 мг в 95 мкл конечного 100 мкл реакционного объема. Исходный раствор затем серийно разбавляли 1:1 по объему, получая десять сток-растворов для доставки от 8 до 0,0156 мг/мл микросом в сток-растворе.
Получали исходный раствор 2000 мкМ соединения формулы (1а). Для реакций по 95 мкл каждого сток-раствора микросом уравновешивали при 37°С в нагревательном блоке. Аликвоту в 5 мкл стокраствора соединения (1а) затем добавляли в каждую реакционный флакон в шахматном порядке в точности через 30-секундные интервалы. Конечная концентрация соединения (1а) была 100 мкМ. Образцы выдерживали для протекания реакции при температуре в течение 1 ч, после чего реакцию останавливали добавлением 100 мкл холодного этанола. Остановку осуществляли снова точно через 30-секундные интервалы, так что в каждом флаконе реакция протекала в течение ровно 1 ч. Образцы готовили в двух повторах. Белок осаждали на льду в течение 30 мин. Супернатант собирали после центрифугирования. Хроматографический анализ ЦРЬС проводили с использованием тех же условий, как описано в предыдущем примере, снова контролируя получение соединений (1Уа) и (1УЬ). Хроматограммы, показывающие превращение соединения (1а) в соединения (1Уа) и (1УЬ) как функцию концентрации микросом, показаны на фиг. 5.
Фиг. 6 представляет собой график зависимости количества соединений (1Уа) и (1УЬ), получаемых из соединения (1а) через 60 мин как функцию концентрации микросом. Скорость образования была, по существу, линейной для концентраций микросом от 0,00156 до 0,0125 мг/мл. Используя данные в этом диапазоне, рассчитали скорость образования соединений (1Уа) и (1УЬ), равную 0,0054 мкмоль/мин/мг.
Используя такую же методику, но с микросомами печени мыши (ЖевоКсН. Рай Ыо. М-3000), получали скорость равную 0,0018 мкмоль/мин/мг.
Пример 8 - соединение (11с).
Этот пример и фиг. 7 описывают синтез соединения 30, также упоминаемое в настоящем изобретении как соединение (11с).
Соединение 30. И1РЕА (А1бйсЬ, 7,85 мкл, 0,045 ммоль) добавляли к раствору соединения 27 (20 мг, 0,022 ммоль), 5-азидопентаноевой кислоты 29 (ВасНет, 6,43 мг, 0,045 ммоль) и ВОР (А1бпсН, 19,87 мг, 0,045 ммоль) в ДМФА (Асгок, безводный, 0,5 мл). Значение рН реакционной смеси оставалась выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь наносили на колонку препаративной ВЭЖХ и очищали элюированием 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА), получая соединение 30 (5 мг, 21,9%). Масс-спектр: [М + Н] 1015.
Соединение 30 (11с) имеет азидную реакционноспособную функциональную группу, что делает его пригодным для конъюгации использующей клик-химию.
Пример 9 - соединения (11б).
Этот пример и фиг. 8 описывают синтез соединения 34, также упоминаемое в настоящем изобретении как соединение (11б).
Соединение 32. Дициклогексилкарбодиимид (ИСС ХоуаЬюсНет, 277 мг, 1,098 ммоль) добавляли к раствору 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (Асгок, 126 мг, 1,098 ммоль), (Вос-аминокси)уксусной кислоты 31 (ТС1, 200 мг, 1,046 ммоль) в 1,4-диоксане (А1бйсЬ, безводный, 2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь фильтровали через СЕЫТЕ™ и фильтрат концентрировали. Остаток растворяли в ЕЮАс (30 мл), промывали насыщенным раствором ЫанСОз (20 мл) и водой (20 мл). Органические фазы концентрировали и сушили в высоком вакууме с
- 23 024844 получением соединения 32 (275 мг, 91,2%).
Ή-ЯМР (400 МГц, СОС13): δ 7,66 (с, 1Н), 4,78 (с, 2Н), 2,87 (с, 4Н), 1,49 (с, 9Н).
Соединение 33. ΌΙΡΕΆ (А1бпск 36,5 мкл, 0,21 ммоль) добавляли к раствору соединения 32 (20 мг, 0,07 ммоль) и соединения 27 (31 мг, 0,035 ммоль) в ДМФА (А1бпск безводный, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 33 (24 мг, 64,5%). Масс-спектр: [М + Н] 1063.
Соединение 34. ТФУ (Асгок, 0,5 мл) добавляли к раствору соединения 33 (24 мг, 0,023 ммоль) в ДХМ (АИпск безводный, 0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 34 (10 мг, 45,7%). Масс-спектр: [М + Н] 963.
Соединение 34 (ΙΙά) имеет гидроксиламиновые реакционноспособные функциональные группы, что делает его пригодным для конъюгации посредством образования оксима с антителом, модифицированным, чтобы содержать кетогруппу, например, посредством включения неприродной аминокислоты пацетилфенилаланина.
Пример 10 - соединение (11е).
Этот пример и фиг. 9А-9В в комбинации описывают синтез соединения 48, также называемое в настоящем изобретении соединением (11е).
Соединение 37. Хлорид меди(11) (А1Пг1сП, 1,252 г, 9,31 ммоль) добавляли к раствору трет-бутил-4аминобензойной кислоты 36 (Р1ика, 1,5 г, 7,76 ммоль), Ртос-защищенного лейцина 35 (Васкет, 2 г, 5,66 ммоль), ЕЭС (Р1ика, 1,786 г, 9,31 ммоль) и трет-бутанола (Скет-1трех, 1,426 г, 9,31 ммоль) в ДМФА (А1бпск безводный, 15 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (30 мл), водой (30 мл) и солевым раствором (30 мл). Органические фазы концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 37 (3,7 г). Масс-спектр: [М + Н] 529.
Соединение 38. Пиперидин (А1бпск 3 мл) добавляли к раствору неочищенного соединения 37 (3,7 г) в ДМФА (А1бпск безводный, 15 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 38 (1,7 г, 70,8% за две стадии). Масс-спектр: [М + Н] 307.
Соединение 41. Э1РЕА (А1бпск 0,97 мл, 5,5 ммоль) добавляли к раствору трет-бутилового эфира аланина гидрохлорида 39 (Васкет, 0,4 г, 2,22 ммоль) и соединения 40 (Васкет, 1 г, 2,22 ммоль) в ДМФА (А1бпск безводный, 20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и смесь обрабатывали этилацетатом (100 мл), водой (50 мл) и солевым раствором (50 мл). Органические фазы концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 41 (1,3 г). Масс-спектр: [М + Н] 481.
Соединение 42. ТФУ (Асгок, 10 мл) добавляли к раствору неочищенного соединения 41 (1,3 г) в ДХМ (Асгок, безводный, 10 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч, концентрировали и очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-100% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 42 (0,68 г, 72,2% за две стадии). Масс-спектр: [М + Н] 425.
Соединение 43. Э1РЕА (А1Пг1сП, 0,246 мл, 1,413 ммоль) добавляли к раствору соединения 38 (289 мг, 0,842 ммоль), соединения 42 (200 мг, 0,471 ммоль) и ВОР (Васкет, 313 мг, 0,707 ммоль) в ДМФА (А1бпск безводный, 3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и обрабатывали этилацетатом (30 мл), водой (20 мл) и солевым раствором (20 мл). Органические фазы концентрировали и очищали на колонке с 4 г СотЫР1а8к™, элюируя 0-60% градиентом ЕЮАс в гексане. Органические фазы объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 43 (126 мг, 37,5 %). Масс-спектр: [М + Н] 713.
Соединение 44. ТФУ (Асгок, 3 мл) добавляли к раствору соединения 43 (126 мг) в ДХМ (Асгок, безводный, 3 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 0,5 ч, концентрировали и очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-100% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 44 (84 мг, 72%). Масс-спектр: [М + Н] 657.
Соединение 45. Э1РЕА (АИпск 21 мкл, 0,122 ммоль) добавляли к раствору соединения 44 (40 мг, 0,061 ммоль), НАТИ (ОаЮооД, 18,53 мг, 0,049 ммоль) в ДМФА (А1бпск безводный, 1 мл). Значение рН реакционной смеси было выше 8. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. К этой реакционной смеси добавляли соединение 10 (34,5 мг, 0,073 ммоль) с последующим добавлением Э1РЕА (АЮг1сП, 21 мкл, 0,122 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-100% градиентом ацето- 24 024844 нитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 45 (20 мг, 30%). Масс-спектр: [М + Н] 1110.
Соединение 46. Пиперидин (ЛИпсЬ, 0,2 мл, 2,02 ммоль) добавляли к раствору соединения 45 (20 мг) в ДМФА (Асгок, безводный, 0,5 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 46 (8 мг, 50%). Масс-спектр: [М + Н] 888.
Соединение 48. О1РЕА (А1бпсЬ, 10 мкл, 0,006 ммоль) добавляли к раствору соединения 46 (8 мг, 0,009 ммоль) и ^сукцинимидил-6-малеимидогексаноата 47 (ТС1, 5,55 мг, 0,018 ммоль) в ДМФА (Асгок, безводный, 1 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-100% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТРА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 48 (2 мг, 20%). Масс-спектр: [М + Н] 1081.
Трипептид ^еи-Л1а-^еи соединения 48 (Не) является субстратным мотивом для фермента СЭ10, так что конъюгаты, полученные с этим соединением, должны быть чувствительными к расщеплению посредством СЭИ).
Пример 11 - соединение (ИГ).
Этот пример и фиг. 10А-10В в комбинации описывают синтез соединения 56, также называемого в настоящем изобретении как соединение (ΙΙΓ).
Соединение 50. Хлорид меди (II) (А1бпсЬ, 0,913 г, 6,79 ммоль) добавляли к раствору трет-бутил-4аминобензойной кислоты 36 (Р1ика, 1,312 г, 6,79 ммоль), Ртос-защищенного изолейцина 49 (ВасЬет, 2 г, 5,66 ммоль), ЕЭС (Р1ика, 1,302 г, 6,79 ммоль) и трет-бутанола (СЬетЧтрех, 1,040 г, 6,79 ммоль) в ДМФА (АМпсЬ, безводный, 20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (30 мл), водой (30 мл) и солевым раствором (30 мл). Объединенные органические фазы концентрировали и очищали на колонке с 40 г СотЫР1акЬ™, элюируя 0-20% градиентом этилацетата в гексане. Содержащие продукт фракции объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 50 (0,85 г, 28,4%). Масс-спектр: [М + Н] 529.
Соединение 51. Пиперидин (А1бпсЬ, 0,5 мл) добавляли к раствору сырого соединения 50 (3,7 г) в ДМФА (АМпсЬ, безводный, 5 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (20 мл), водой (15 мл) и солевым раствором (15 мл). Органические фазы объединяли, концентрировали и очищали на колонке с 12 г СотЫР1акЬ™, элюируя 0-75% градиента Е!0Ас в гексане. Содержащие продукт фракции объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 51 (0,38 г, 76,9%). Масс-спектр: [М + Н] 307.
Соединение 52. ЭРЕА (А1бпсЬ, 0,228 мл, 1,305 ммоль) добавляли к раствору соединения 51 (0,2 г, 0,653 ммоль) и соединения 40 (ВасЬет, 294 мг, 0,653 ммоль) в ДМФА (А1бпсЬ, безводный, 3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (50 мл), водой (20 мл) и солевым раствором (20 мл). Объединенные органические фазы концентрировали и очищали на колонке с 4 г СотЫР1акЬ™, элюируя 0-40% градиентом Е!0Ас в гексане. Фракции, содержащие продукт, концентрировали с получением остатка, который сушили в высоком вакууме, получая соединение 52 (178 мг, 42,5%). Масс-спектр: [М + Н] 642.
Соединение 53. ТФУ (Асгок, 3 мл) добавляли к раствору соединения 52 (178 мг, 0,277 ммоль) в ДХМ (Асгок, безводный, 3 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Реакционную смесь концентрировали и сушили посредством лиофилизации с получением соединения 53 (145 мг, 89,5%). Масс-спектр: [М + Н] 586.
Дипептид Ьеи-Пе соединения 56 (ИГ) является субстратным мотивом для фермента катепсина Е, поэтому иммуноконъюгаты, полученные с этим соединением, должны быть чувствительными к расщеплению катепсином Е.
Пример 12 - соединение (Ид).
Этот пример и фиг. 11А-11В в комбинации описывают синтез соединения 67, также называемого в настоящем изобретении как соединение (Ид).
Соединение 57. Хлорид меди(П) (А1бпсЬ, 0,913 г, 6,79 ммоль) добавляли к раствору метилового эфира 4-аминобензойной кислоты 56 (АИНсЬ, 0,913 г, 6,05 ммоль), Ртос-защищенного цитруллина 20 (ВасЬет, 2 г, 5,04 ммоль), ЕЭС (Р1ика, 1,160 г, 6,05 ммоль) и трет-бутанола (СЬетЧтрех, 0,926 г, 6,05 ммоль) в ДМФА (А1бг1сЬ, безводный, 20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (100 мл), водой (30 мл) и солевым раствором (30 мл). Органические фазы концентрировали и очищали на колонке с 40 г СотЫР1акЬ™, элюируя градиентом 0-20% метанола в ДХМ. Содержащие продукт фракции объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 57 (1,825 г, 68,2%). Масс-спектр: [М + Н] 531.
Соединение 58. Пиперидин (АМпсЬ, 0,2 мл) добавляли к раствору соединения 57 (1,25 г, 3,437
- 25 024844 ммоль) в ДМФА (ЛИпск безводный, 3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (40 мл), водой (15 мл) и солевым раствором (15 мл). Органические фазы объединяли, концентрировали и очищали на колонке с 12 г СотЫБ1акЬ™, элюируя 0-30% градиентом метанола в ДХМ. Содержащие продукт фракции объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 58 (0,778 г, 73,1%). Масс-спектр: [М + Н] 309.
Соединение 59. ЭРЕА (АМпсЬ, 1,0 мл, 5,71 ммоль) добавляли к раствору соединения 58 (778 мг, 2,52 ммоль), соединения 18 (655 мг, 2,52 ммоль) и ВОР (ВасЬет, 1,12 г, 2,52 ммоль) в ДМФА (А1йпсЬ безводный, 10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (50 мл), водой (20 мл) и солевым раствором (20 мл). Объединенные органические фазы концентрировали и очищали на колонке с 40 г СотЬ1Б1акЬ™, элюируя 0-15% градиентом метанола в ДХМ. Органические фазы объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 59 (1,06 г, 76%). Масс-спектр: [М + Н] 551.
Соединение 60. ТФУ (Асгок, 5 мл) добавляли к раствору соединения 59 (1,06 г, 1,92 ммоль) в ДХМ (Асгок, безводный, 5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Реакционную смесь концентрировали и сушили посредством лиофилизации с получением соединения 60 в виде его ТФУ-соли (1,09 г). Масс-спектр: [М + Н] 451.
Соединение 62. ЭРЕА (АМпсЬ, 1,02 мл, 5,838 ммоль) добавляли к раствору соединения 60 (500 мг, 1,109 ммоль), 6-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексановой кислоты 61 (Р1ика, 450 мг, 1,946 ммоль) и ВОР (ВасЬет, 0,720 г, 1,629 ммоль) в ДМФА (АМпсЬ, безводный, 10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом (60 мл), водой (30 мл) и солевым раствором (30 мл). Объединенные органические фазы концентрировали и очищали на колонке с 12 г СотЫИакЬ™, элюируя градиентом 0-20% метанола в ДХМ. Органические фазы объединяли, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением соединения 62 (427 мг, 58%). Масс-спектр: [М + Н] 664.
Соединение 63. Раствор ΜΟΗ (АМпсЬ, 150 мг в 10 мл воды) добавляли к раствору соединения 62 (0,427 г, 0,643 ммоль) в ацетоне (Вакег, 10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и нейтрализовали уксусной кислотой (ПкНег, ледяная, 0,3 мл). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТБА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 63 (325 мг, 77,8%). Масс-спектр: [М + Н] 650.
Соединение 64. ЭРЕА (АМпсЬ, 27 мкл, 0,153 ммоль) добавляли к раствору соединения 63 (59,5 мг, 0,092 ммоль), ΗАТυ (Оак^оой, 23,21 мг, 0,061 ммоль) в ДМФА (А1йпсЬ, безводный, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. К полученному раствору добавляли соединение 10 (36 мг, 0,076 ммоль), с последующим дополнительным ОГРЕА (А1йпсЬ, 27 мкл, 0,153 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТБА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 64 (38 мг, 55,7%). Масс-спектр: [М + Н] 1103.
Соединение 65. ТФУ (Асгок, 1 мл) добавляли к раствору соединения 64 (38 мг, 0,034 ммоль) в ДХМ (Асгок, безводный, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Реакционную смесь концентрировали и сушили посредством лиофилизации с получением соединения 65 в виде его ТФУ соли (43 мг). Масс-спектр: [М + Н] 1003.
Соединение 66. ЭРЕА (АМпсЬ, 29 мкл, 0,159 ммоль) добавляли к раствору соединения 32 (15,4 мг, 0,053 ммоль) и соединения 65 (43 мг, 0,043 ммоль) в ДМФА (АМпсЬ, безводный, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТБА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 66 (22 мг, 43,5%). Масс-спектр: [М + Н] 1176.
Соединение 67. Раствор соединения 66 (22 мг, 0,019 ммоль) в 4н. Η0 в растворе 1,4-диоксана (А1йпсН, 10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали и очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя 10-65% градиентом ацетонитрила в воде (с 0,1% ТБА). Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением соединения 67 (12 мг, 58,7%). Масс-спектр: [М + Н] 1076.
Пример 13 - результаты ίη νί\Ό.
Фиг. 12А-12Т демонстрируют эффективность ίη νί\Ό иммуноконъюгатов в соответствии с настоящим изобретением в ксенотрансплантатных исследованиях на мышах, в отношении различных типов рака.
Исследования клеток ОУСАК3. Пять миллионов клеток рака яичников ОУСАК3, ресуспендированных в 0,1 мл фосфатно-солевом буфере (РВ8), плюс 0,1 мл матригеля имплантировали подкожно в паховую область 8СГО (тяжёлая комбинированная иммунная недостаточность) мышей. Измерения опухоли,
- 26 024844 начинали через 23 дня, и мышей рандомизировали на группы по 6 мышей в каждой со средним размером опухоли равном 90 мм3, оцениваемом как Ь\УН/2 опухолей. Через 24 дня после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемое соединение. Фиг. 12А показывает, что в отношении клеток ОУСАК3, иммуноконъюгаты антимезотелин антитела 6А4 с соединением (Па) подавляли рост опухоли, особенно при более высокой дозе цитотоксина, равной 0,314 мкмоль/кг. Сравнительные данные для соответствующего иммуноконъюгата анти-СИ19 антитела 21Ό4 также представлены в качестве изотипического контроля.
Исследования клеток N87. Два с половиной миллиона клеток рака желудка N87, ресуспендированных в 0,1 мл РВ§ плюс 0,1 мл матригель, имплантировали подкожно в паховую область §СГО мышей. Измерения опухоли начинали через 12 дней и мышей рандомизировали на группы по 7 мышей в каждой со средним размером опухоли равном 110 мм3, оцениваемом как Ь^Н/2 опухолей. На 14 день после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемые соединения. Фиг. 12В показывает, что в отношении клеток N87 иммуноконъюгат антимезотелин антитела 6А4 с соединением (Па) в значительной степени ингибирует рост опухоли. Сравнительные данные для одного буфера композиции или иммуноконъюгата анти-СИ19 антитела 21Ό4 и соединения (Па) представлены, последние в качестве изотипического контроля.
Исследования клеток Н226. Пять миллионов клеток мезотелиомы Н226, ресуспендированных в 0,1 мл РВ§, содержащим 0,1 мл матригеля, имплантировали подкожно в паховую область §СГО мышей. Измерения опухоли начинали через 14 дней и мышей рандомизировали на группы по 9 мышей в каждой со средним размером опухоли равном 110 мм3, оцениваемом как Ь^Н/2 опухолей. На 15 день после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемые соединения. Фиг. 12С показывает дозозависимый эффект иммуноконъюгата антимезотелин антитела 6А4 и соединения (Па) на рост опухоли. §К в каждом случае был 3,6.
Исследования клеток Н1650. Два с половиной миллиона клеток опухоли легких Н1650 (аденокарцинома), ресуспендированных в 0,1 мл РВ§ плюс 0,1 мл матригеля, имплантировали подкожно в паховую область мышей §СГО. Измерения опухоли начинали через 7 дней и мышей рандомизировали на группы по 6 мышей в каждой со средними размерами опухоли 110 мм3, оцениваемом как Ь\УН/2 опухолей. На 9, 14 и 21 день после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемые соединения. Фиг. 12Ό показывает ингибирование опухоли иммуноконъюгатом антимезотелин антитела 6А4 и соединения (Па). Сравнительные данные контроля в виде носителя и иммуноконъюгата анти-СИ19 антитела 21Ό4 и соединения (Па) представлены, последние в качестве изотипического контроля.
Исследования клеток Нер 3В. Четыре миллиона опухолевых клеток печени Нер 3В, ресуспендированных в 0,1 мл РВ§, плюс 0,1 мл матригеля, имплантировали подкожно в паховую область §СГО мышей. Измерения опухоли начинали через 10 дней и мышей рандомизировали на группы по 7 мышей в каждой со средним размеров опухоли равном 90 мм3, оцениваемом как Ь^Н/2 опухолей. На 11 день после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемые соединения. Фиг. 12Е показывает дозозависимый ингибирующий эффект на рост опухоли иммуноконъюгата антиглипикан 3 антитела 4А6 и соединения (Па). Самый сильный эффект наблюдался при дозе 0,1 мкмоль/кг. Сравнительные данные для одного носителя, для одного антитела 4А6 или для иммуноконъюгата антиСИ19 антитела 21Ό4 и соединения (Па) также показаны, последний в качестве изотипического контроля. Фиг. 12Р представляет собой график из того же исследования, но демонстрирующий способность иммуноконъюгата антитела 4А6-соединение (Па) облегчать ассоциированную с опухолью кахексию. Также представлены данные для иммуноконъюгата анти-СИ19-соединение (Па), показывающие, что конъюгат анти-СО19, что хотя он снижает рост опухоли (на фиг. 12Е), но не облегчает кахексию (на фиг. 12Р).
Исследования клеток ЬНСаР. Два с половиной миллиона клеток опухоли простаты Ь-НСаР, ресуспендированных в 0,1 мл РВ§ плюс 0,1 мл матригель, имплантировали подкожно в паховую область §СГО мышей. Измерения опухоли начинали через 30 дней и мышей рандомизировали на группы по 7 мышей в каждой со средними размерами опухоли равном 150 мм3, оцениваемом как Ь^Н/2 опухолей. На 31 день после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемые соединения. Фиг. 12О показывает ингибирование роста опухоли иммуноконъюгатом анти-ПСМА антители 2А10 и соединения (Па) по сравнению с буфером композиции и иммуноконъюгатом анти-СИ19 антитела 21Ό4 и соединения (Па) в качестве изотипического контроля. В каждом случае концентрация цитотоксина составляла 0,1 мкмоль/кг. Фиг. 12Н показывает другой набор результатов из того же исследовании с иммуноконъюгатом анти-КО-1 антитела 19О9 и соединения (Па) с изотипическим контролем иммуноконъюгата анти-СИ19.
Исследования клеток Ка_р. Десять миллионов клеток человеческой лимфомы Беркитта Ка_р, ресуспендированных в 0,1 мл РВ§, плюс 0,1 мл матригель, имплантировали подкожно в паховую область §СГО мышей. Измерения опухоли начинали через 6 дней и мышей рандомизировали на группы по 8 мышей в каждой со средним размером опухоли, равном 90 мм3, оцениваемом как Ь^Н/2 опухолей. Через 7 дней после имплантации опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно тестируемые соединения. Фиг. 12Т показывает ингибирующее действие на рост опухоли иммуноконъюгатов антимезотелин
- 27 024844 антитела 6А4, анти-СГО19 антитела 21Ό4, анти-СЭ22 антитела 12С5 и анти-СЭ70 антитела 1Р4, каждое с соединением (11а) (полная информации о последовательности антитела 1Р4 раскрыта в Сосаа е! а1. 2010, раскрытие которой включено в настоящее изобретение посредством ссылки. Последовательности Ун СГОКЕ СГОК2 и СГОК и νκ СГОКЕ СГОК2 и СГОК для антитела 1Р4 приведены в 8ЕЦ ГО ЫО:55, 8ЕЦ ГО ЫО:56, 8ЕЦ ГО ЫО:57, 8ЕЦ ГО ЫО:58, 8ЕЦ ГО ЫО:59 и 8ЕЦ ГО ЫО:60 соответственно).
Приведенное выше подробное описание в соответствии настоящим изобретением включает пассажи, которые являются главным образом или исключительно связанными с конкретными частями или аспектами изобретения. Следует понимать, что это сделано для ясности и удобства, и что конкретный признак может относиться более чем к одному пассажу, в котором он раскрыт, и что настоящее раскрытие охватывает все соответствующие комбинации информации, найденной в различных пассажах. Кроме того, хотя различные чертежи и описания относятся к конкретным вариантам осуществления изобретения, следует понимать, что если специфический признак раскрыт в контексте конкретного чертежа или варианта осуществления, такой признак также может быть использован в соответствующей степени в контексте другого чертежа или варианта осуществления в комбинации с другим признаком или в изобретении в целом.
Кроме того, хотя настоящее изобретение особенно описывается в отношении некоторых предпочтительных вариантов осуществления, настоящее изобретение не ограничивается такими предпочтительными вариантам осуществления. Напротив, объем изобретения определяется посредством прилагаемой формулой изобретения.
Ссылки
Полный перечень ссылок для следующих ссылок, процитированных в сокращенном виде посредством первого автора (или изобретателя) и даты ранее в этом описании, приведены ниже. Каждая из этих ссылок включена в настоящее изобретение в качестве ссылки во всех отношениях.
Апк!окк е! а1., АО 91/16324 (1991).
Век!, Вюсйет1кйу 2009, 48, 6571-6584.
Водег е! а1., 8уп!йек1к 1999, 1505-1509.
Воуй е! а1., И8 2008/0279868 А1 (2008).
Воуй е! а1., И8 7691962 В2 (2010).
Сасаап е! а1., Ехрей Оршюп Тйегареийс Ра!еп!к 2000, 70(12), 1853-1871.
СагйагеШ е! а1., И8 7875278 В2 (2011).
Скеп е! а1., И8 7517903 В2 (2009).
Скеп е! а1., И8 2010/0113476 А1 (2010).
Сосша е! а1., И8 2010/0150950 А1 (2010).
ОиЬо\Ус1ик е! а1., Вюсоп)ида!е Скет. 2002, 13, 855-869.
Сапд^аг е! а1., И8 2008/0293800 А1 (2008).
СНа/лег АО 03/000201 А2 (2003).
Ниапд е! а1., И8 2009/0297438 А1 (2009).
Кшд е! а1., И8 2010/0104509 А1 (2010) [2010а].
Кшд е! а1., И8 2010/0143368 А1 (2010) [2010Ь]
Ктд е! а1., И8 2011/0020329 А1 (2011).
КоЬауакЫ е! а1., Сапсег Кек. 1994, 54, 2404-2410.
Когтап е! а1., И8 2009/0074660 А1 (2009).
Ки1уауш е! а1., И8 5659022 (1997).
Ыд е! а1., АО 02/096910 А1 (2002).
Ыд е! а1., И8 6989452 В2 (2006) [2006а].
Ыд е! а1., И8 7129261 В2 (2006) [2006Ь].
Ыд е! а1., И8 7498302 В2 (2009) [2009а].
Ыд е! а1., И8 7507420 В2 (2009) [2009Ь].
Ыд е! а1., И8 КЕ41252 Е (2010).
Као-Ыайс е! а1., И8 8097703 В2 (2012).
8иск1шд, Ехрей Оршюп ТЬегареийс Ра!еп!к 2004, 14(12), 1693-1724.
8ий е! а1., И8 2010/0145036 А1 (2010).
Теггей е! а1., И8 2010/0034826 А1 (2010) [2010а].
Теггей е! а1., И8 2010/0209432 А1 (2010) [2010Ь].
Теггей е! а1., Ик 2011/0085970 А1 (2011) [2011а].
Теггей е! а1., И8 2011/0262448 А1 (2011) [2011Ь].
Теггей е! а1., И8 2012/0027782 А1 (2012) [2012а].
Теггей е! а1., И8 8124738 В2 (2012) [2012Ь].
2йао е! а1., Рок!ег 45, 281й Ыа!юпа1 Мейюша1 Сйет1к!гу 8утрокшт (8ап О1едо, СА, 8-12 йте 2002), Ап 1тргоуей куп!йек1к ок СС-1065 апа1одк апй йеуе1ортеп! ок ргойгцдк (аЬкйас!). [2002а].
2йао е! а1., Рок!ег МЕЭ1 147, 224(1 Ыа!юпа1 Меейпд ок !ке Атепсап Сйетюа1 8ос1е1у (Вок!оп, МА, 18-22 Аидик! 2002), Ые\у \уа1ег-ко1иЬ1е СС-1065 апа1од ргойгцдк: Оекгдп, куп!йекгк апй еуайШоп (аЬкйас!)
- 28 024844 [2002Ь].
Ζ^ е1 а1., υδ 7655660 В2 (2010).
Перечень последовательностей
Списки последовательностей, включенные в настоящее изобретение посредством ссылки во всей своей полноте под названием ’^Е0Т_11770^ОРСТ.1:х1, содержат от δΕΟ Ш N0:1 до δΕΟ Ш N0:60, которые включают в себя последовательности нуклеиновых кислот и/или аминокислот, описанные в настоящем изобретении. Список последовательностей был представлен в текстовом формате А8СП через ΕΡδ-^еЬ, и таким образом, представляет собой как бумажную, так и пригодною для ввода в компьютер формы. Перечень последовательностей была впервые создан с использованием Ра1епНп 3.5 27 апреля 2012 г. и составляет 10 кБ.
В следующей таблице приведены описания последовательностей, раскрытых в этой заявке.
ΚΕφΙϋΝΟ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
1 2Н5 Ун СОК.1 аминокислота
2 2Н5 Ун СОК2 аминокислота
3 2Н5 Ун СОКЗ аминокислота
4 2Н5 Ук СОК1 аминокислота
5 2Н5 Ук СОК2 аминокислота
6 2Н5 Ук СОКЗ аминокислота
7 6А4 Ун СОК.1 аминокислота
8 6А4 Ун СОК2 аминокислота
9 6А4 Ун СОК-3 аминокислота
10 6А4 Ук СОК1 аминокислота
11 6А4 Ук СОК2 аминокислота
12 6А4 Ук СОКЗ аминокислота
13 2104 Ун СОК1 аминокислота
14 2Ю4 Ун СОК2 аминокислота
15 2104 Ун СОКЗ аминокислота
16 2104 Ук СОК1 аминокислота
17 2Ю4 Ук СОК2 аминокислота
18 2Ю4 Ук СОКЗ аминокислота
19 2А10 Ун СОК1 аминокислота
20 2А10 Ун СОК2 аминокислота
21 2А10 Ун СОКЗ аминокислота
22 2А10 Ук СОК1 аминокислота
23 2А10 Ук СОК2 аминокислота
24 2А10 Ук СОКЗ аминокислота
- 29 024844
8Е<3 ГО ΝΟ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
25 4Α6 Ун СОК-1 аминокислота
26 4А6 Ун СОК2 аминокислота
27 4А6 Ун СОКЗ аминокислота
28 4А6 Ук СИК.1 аминокислота
29 4А6 Ук СИК2 аминокислота
30 4А6 Ук СИКЗ аминокислота
31 2А7 Ун СОК1 аминокислота
32 2А7 Ун СОК2 аминокислота
33 2А7 Ун СОКЗ аминокислота
34 2А7 УЕ СОК1 аминокислота
35 2А7 Уь СИК2 аминокислота
36 2А7 Уь СИКЗ аминокислота
37 1909 Ун СИК1 аминокислота
38 1909 Ун СОК2 аминокислота
39 1909 Ун СОКЗ аминокислота
40 1909 Уь СОК1 аминокислота
41 1909 Уь СПК2 аминокислота
42 1909 Уь СИКЗ аминокислота
43 12С5 Ун СИК1 аминокислота
44 12С5 Ун СОК2 аминокислота
45 12С5 Ун СОКЗ аминокислота
46 12С5 Ук СОК1 аминокислота
47 12С5 Ук СОК2 аминокислота
48 12С5 Ук СОКЗ аминокислота
49 405 Ун СОК1 аминокислота
50 405 Ун СОК2 аминокислота
51 405 Ун СОКЗ аминокислота
52 4ϋ5 Ук СОК1 аминокислота
53 4ϋ5 Ук СОК2 аминокислота
54 405 Ук СОКЗ аминокислота
55 1Р4 Ун С0К1 аминокислота
56 1Р4 Ун С0К2 аминокислота
8ΕΟ ГО ΝΟ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
57 1Р4 Ун СИКЗ аминокислота
58 1Р4 Ук СИК.1 аминокислота
59 1Р4 Ук СОК2 аминокислота
60 1Р4 Ук СОКЗ аминокислота
- З0 024844
<110> Список последовательностей БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ КОМПАНИ ЧЗАН, Цянь ГАНГВАР, Санжив ПАНЬ, Чинь ДЕРВИН, Дэниел Д.
<120> ИММУНОКОНЪЮГАТЫ, КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИХ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБЫ их ПОЛУЧЕНИЯ И
ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 11770
<150> <151> иЗ 61/490117 2011-05-26
<160> 60
<170> Раеепе1п νθΓ3ίοη 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 5 РЕТ Ното зараепз
<400> 1
Зег Туг Не Мее Ηϊδ 1 5
<210> <211> <212> <213> 2 17 РЕТ Ното зараепз
<400> 2
Уа1 Не Зег Туг Азр С1у Агд Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 5 10 15
С1у
<210> <211> <212> <213> 3 9 РЕТ Ното зараепз
<400> 3
Азр ТНг Азр О1у Туг Азр РНе Азр Туг
1 5
<210> <211> <212> <213> 4 11 РЕТ Ното зартепз
<400> 4
Агд АГа Зег Θΐη Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи АГа
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 5 7 РЕТ Ното зартепз
<400> 5
Азр АГа Зег Азп Агд АГа ТНг
1 5
<210> <211> <212> <213> 6 9 РЕТ Ното зархепз
<400> 6
С1п СГп Агд ТНг Азп Тгр Рго Ьеи ТНг 1 5
<210> <211> <212> <213> 7 5 РЕТ Ното зархепз
<400> 7
11е Туг О1у Мее ΗΪ3 1 5
<210> <211> <212> <213> 8 17 РЕТ Ното заргепз
<400> 8
УаГ Ьеи Тгр Туг Азр СГу Зег Ηίβ ОГи Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 5 10 15
ОГу
- 31 024844
- 32 024844
- 33 024844
- 34 024844
- 35 024844
- 36 024844 <400> 59
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТНг 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарбепз <400> 60
С1п С1п Туг С1у Зег Зег Рго Туг ТНг 1 5

Claims (13)

1. Иммуноконъюгат или его фармацевтически приемлемая соль, в котором соединение формулы (II) где X представляет собой С1, Вг или тозилат;
ААа и каждый ААЬ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
т равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;
Υ представляет собой спейсерный фрагмент, причем Υ выбран из группы, состоящей из и их комбинаций, где индекс ς равен 0 или 1, независимо в каждом случае, а индекс г равен от 1 до 24, независимо в каждом случае; и
Ζ представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгации с антителом, где -Ζ представляет собой -Ын2, -ОН, -ОЫн2, -СО2Н, -Зн, циклооктин, -Ν3, сконъюгировано через группу Ζ к антителу или к антигенсвязывающему фрагменту такого антитела.
2. Иммуноконъюгат по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где иммуноконъюгат имеет структуру, соответствующую формуле (111а) где ААа и каждый ААЬ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
т равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;
Υ представляет собой спейсерный фрагмент, причем Υ выбран из группы, состоящей из
- 37 024844 и их комбинаций, где индекс μ равен 0 или 1, независимо в каждом случае, а индекс г равен от 1 до 24, независимо в каждом случае;
и равно 1, 2, 3, 4 или 5 и
АЬ представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
3. Иммуноконъюгат по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где иммуноконъюгат имеет структуру, соответствующую формуле (111а') где и равно 1, 2, 3, 4 или 5 и
АЬ представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
4. Иммуноконъюгат по п.3, в котором антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое распознает человеческий антиген, выбранный из группы, состоящей из ί'.Ό70, мезотелина, ПСМА, СЭ19, глипикана-3, В7Н4, КС-1, СО22 и РТК7.
5. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль, где соединение имеет структуру в соответствии с формулой (II) где X представляет собой С1, Вг или тозилат;
ААа и каждый ААЬ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
т равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;
Υ представляет собой спейсерный фрагмент, причем Υ выбран из группы, состоящей из
I—Ν—(СН2)2_е—(ΝΗ)4—ξ
1—(СН2)2-в—(ΝΗ)^—I ξ-С-(СН2)2.в-(ΝΗ)4-Д(СН2СН2О)Г-СН2СН2о
1-<ΝΗ)4—(СН2СН2О)Г-СН2СН2-С— и их комбинаций, где индекс μ равен 0 или 1, независимо в каждом случае, а индекс г равен от 1 до 24, независимо в каждом случае; и
Ζ представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгации с антителом, где -Ζ представляет собой -ΝΗ2, -ОН, -ΟΝΗ2, -СО2Н, -8Н, циклооктин, -Ν3
6. Соединение по п.5, в котором ААа выбирается из группы, состоящей из цитруллина, лизина, ас- 38 024844 парагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, изолейцина, лейцина и треонина и т равно 0, 1 или 2.
7. Соединение по п.5, где -ААа-[ААЬ]т- представляет собой дипептид, выбранный из группы, состоящей из Уа1-Ск, Рке-Ск, Рке-Ьук, Уа1-Ьу8, Уа1-О1и, Уа1-А§р, Уа1-8ег и Уа1-О1у, каждый дипептид, читаемый в направлении от Ν- к -С.
8. Соединение по п.5, имеющее структуру в соответствии с формулой (11а) или его фармацевтически приемлемая соль.
9. Соединение по п.5, имеющее структуру, выбранную из группы, состоящей из формул (11Ь)-(11д)
- 39 024844 или его фармацевтически приемлемая соль.
10. Соединение в соответствии с формулой (I) где X представляет собой С1, Вг или тозилат, или его фармацевтически приемлемая соль.
11. Способ лечения рака у субъекта, страдающего от такого рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества иммуноконъюгата, имеющего структуру по п.3.
12. Способ по п.11, в котором рак представляет собой рак почки, рак поджелудочной железы, рак яичников, лимфому, рак толстой кишки, мезотелиому, рак желудка, рак легкого, рак предстательной железы, аденокарциному, рак печени или рак молочной железы.
13. Способ по п.11, в котором рак характеризуется раковыми клетками, которые экспрессируют человеческие ί'Ό70, мезотелин, ПСМА, СЭ19, глипикан-3, В7Н4, КО-1, СЭ22 или РТК7.
- 40 024844
Фиг. 2
- 41 024844
Фиг. 3В
- 42 024844
Анализ пролиферации по включению Ή тимидина ·
НРАС клетки
Конъюгат мезотелин
АТ (К5)
100000 ф
3 0-1-1-1-1-1
5 10-4 10-2 10 10! 10*
Концентрация цитотоксина (нМ)
Фиг. 4В
- 4З 024844
Фиг. 4Ό
- 44 024844
Анализ пролиферации по включению 3Н тимидина Н226 клетки с
ω
Концентрация цитотоксина (нМ) Фиг. 4Р
Фиг. 4Н
Анализ пролиферации по включению 3Н тимидина Н1650 клетки ί 150000ί10000050000“Ά
ПСМА-Срй На (ЗК 1.14) Мезотелин - Срс! На (ЗК 1,17) Мезотелин - Срс! На (ЗК 2.1) Мезотелин - СрО На (ЗК 3,6)
104 10г 10° 102 104
Концентрация цитотоксина (нМ)
Фиг. 4Ι
- 45 024844
Фиг. 4К
- 46 024844
Фиг. 4Р
- 47 024844
Дефосфорилирование соединения (1а) посредством микросом печени человека
Поглощение при 340 нм (условные единицы
0.00 0.66 1.10 1.66 2.20 2.76
Минуты
Фиг. 5
- 48 024844
Скорость дефосфорилирования соединения (1а)
Фиг. 6
- 49 024844
Фиг. 9В
- 50 024844
Фиг. 10А
Фиг. 10В
- 51 024844
Фиг. 11В
- 52 024844
Фиг. 12А
Буфер композиции СО19-СрО На (ЗК 1,87, 0,1 мкмоль/кг) Мезотелин-СрН На (ЗК 3,1,0,1 мкмоль/кг)
Дни после первоначальной дозы Фиг. 12В
Средний рост опухоли Н226 в 5СГО мышах
Носитель Мезотелин-Срй На (0,0107 мкмоль/кг) Мезотелин-СрН На (0,1 мкмоль/кг) Мезотелин-СрН На (0,314 мкмоль/кг)
Фиг. 12С
- 53 024844
Средний рост опухоли Нер ЗВ
Носитель
Глипикан 3-Срс1 На (0,01 мкмоль/кг)
Глипикан 3-Срс1 На (8К 3,1, 0,1 мкмоль/кг) Глипикан 3 (АТ только, 0,8 ммоль/кг)
С01Э-Срй Па (0,1 мкмоль/кг)
Дни после первоначальной дозы Фиг. 12Е
Фиг. 12Р
- 54 024844
Буфер композиции
Мезотелин-Срй На (ЗГС 3, 0,3 мкмоль/кг)
Οϋ19-Ορό На (ЗГС 2-3, 0,3 мкмоль/кг)
С022-СрО На (ЗК 2-3, 0,3 мкмоль/кг)
СБ70-Срс1 Па (ЗК 3, 0,3 мкмоль/кг)
Дни после первоначальной дозы
Фиг. 121
EA201391754A 2011-05-26 2012-05-24 Иммуноконъюгат и его применение для лечения рака EA024844B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161490117P 2011-05-26 2011-05-26
PCT/US2012/039312 WO2012162482A1 (en) 2011-05-26 2012-05-24 Immunoconjugates, compositions containing them, and methods of making and use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391754A1 EA201391754A1 (ru) 2014-04-30
EA024844B1 true EA024844B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=46172969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391754A EA024844B1 (ru) 2011-05-26 2012-05-24 Иммуноконъюгат и его применение для лечения рака

Country Status (22)

Country Link
US (2) US8852599B2 (ru)
EP (1) EP2714092B1 (ru)
JP (2) JP6105566B2 (ru)
KR (1) KR102070464B1 (ru)
CN (1) CN103561772B (ru)
AR (1) AR086568A1 (ru)
AU (1) AU2012258750B2 (ru)
BR (1) BR112013029764A2 (ru)
CA (1) CA2837327C (ru)
CL (1) CL2013003393A1 (ru)
CO (1) CO6831975A2 (ru)
EA (1) EA024844B1 (ru)
ES (1) ES2814798T3 (ru)
IL (1) IL229477A (ru)
MA (1) MA35153B1 (ru)
MX (1) MX336806B (ru)
PE (1) PE20141480A1 (ru)
SG (1) SG195011A1 (ru)
TW (1) TW201300401A (ru)
UY (1) UY34100A (ru)
WO (1) WO2012162482A1 (ru)
ZA (2) ZA201309669B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2669807C2 (ru) * 2014-01-27 2018-10-16 Пфайзер Инк. Бифункциональные цитотоксические агенты

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE028737T2 (en) * 2007-07-17 2017-01-30 Squibb & Sons Llc Monoclonal antibodies to GLYPICAN-3
JP2015502397A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用
KR20150119848A (ko) 2012-12-21 2015-10-26 바이오얼라이언스 씨.브이. 친수성 자기-희생 링커 및 그것의 포합체
WO2014146575A1 (en) 2013-03-19 2014-09-25 Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
LT2991683T (lt) 2013-05-02 2019-12-27 Glykos Finland Oy Glikoproteino arba glikano konjugatai su toksine medžiaga
EP3033111B1 (en) 2013-08-12 2019-03-13 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
EP3647322B1 (en) 2014-03-20 2021-10-20 Bristol-Myers Squibb Company Stabilized fibronectin based scaffold molecules
BR112016025291A2 (pt) 2014-04-30 2017-12-26 Abbvie Stemcentrx Llc conjugados de anticorpo anti-ptk7-fármaco
WO2015196089A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Bioalliance C.V. Anti-cd22 antibody-drug conjugates and methods of using thereof
CN106661124A (zh) 2014-06-20 2017-05-10 荷商台医(有限合伙)公司 抗叶酸受体α(FRA)抗体‑药物缀合物及其使用方法
AU2015282627B2 (en) 2014-06-30 2020-04-02 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
PL3221346T3 (pl) 2014-11-21 2021-03-08 Bristol-Myers Squibb Company Przeciwciała ze zmodyfikowanym regionem stałym łańcucha ciężkiego
TWI758928B (zh) 2014-11-21 2022-03-21 美商必治妥美雅史谷比公司 抗cd73抗體及其用途
EP3702367B1 (en) 2014-11-25 2024-05-15 Bristol-Myers Squibb Company Novel pd-l1 binding polypeptides for imaging
WO2016144608A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies conjugatable by transglutaminase and conjugates made therefrom
JP6782250B2 (ja) 2015-03-20 2020-11-11 ファイザー・インク Ｃｔｉファーマコフォアを含有する二官能性細胞毒性剤
JP6797137B2 (ja) 2015-05-29 2020-12-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｘ４０に対する抗体およびその使用
PL3319597T3 (pl) 2015-07-10 2021-10-11 Byondis B.V. Kompozycje zawierające koniugaty przeciwciało-duokarmycyna
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA2996798A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Ventana Medical Systems, Inc. Protein proximity assay in formalin fixed paffafin embedded tissue using caged haptens
CN108884147B (zh) 2015-09-23 2024-02-27 百时美施贵宝公司 结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基于纤连蛋白的支架分子
CR20180279A (es) 2015-11-18 2018-08-24 Merck Sharp & Dohme Enlazadores de ctla4
TWI778491B (zh) 2015-11-30 2022-09-21 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
AU2016377371A1 (en) 2015-12-21 2018-08-09 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
KR20180117102A (ko) 2016-01-08 2018-10-26 바이오얼라이언스 씨.브이. 사가 항-psgl-1 항체 및 이들의 용도
SG10201913033UA (en) 2016-03-04 2020-03-30 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
US20170326249A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate of an anti-glypican-3 antibody and a tubulysin analog, preparation and uses
CN109641911B (zh) 2016-08-19 2023-02-21 百时美施贵宝公司 seco-环丙吡咯并吲哚化合物和其抗体-药物缀合物以及制备和使用方法
HUE057289T2 (hu) 2016-08-31 2022-05-28 Jiangsu Hengrui Medicine Co Oxopikolinamid-származék, annak elõállítási módszere és gyógyszerészeti felhasználása
WO2018048975A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
WO2018064094A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Bristol-Myers Squibb Company Enantioselective synthesis of pyrroloindole compounds
CA3042679A1 (en) * 2016-11-03 2018-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3053275A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding psma, nkg2d and cd16
EP4273258A3 (en) 2017-02-20 2024-01-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
WO2018218056A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Birstol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
CR20200138A (es) 2017-08-25 2020-06-14 Five Prime Therapeutics Inc Anticuerpos de b7-h4 y métodos para usarlos
US11364303B2 (en) 2017-09-29 2022-06-21 Pfizer Inc. Cysteine engineered antibody drug conjugates
CN108148137B (zh) * 2017-12-29 2021-03-23 中国人民解放军第四军医大学 一种b7h4/1e10单克隆抗体及其应用
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
CA3091801A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibodies and methods of use thereof
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
EP3886914B1 (en) 2018-11-30 2023-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody comprising a glutamine-containing light chain c-terminal extension, conjugates thereof, and methods and uses
CN113544155A (zh) 2018-12-12 2021-10-22 百时美施贵宝公司 经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途
TW202112398A (zh) * 2019-06-06 2021-04-01 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司 抗ｂ７－ｈ４抗體－藥物偶聯物及其醫藥用途
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
IL303813A (en) 2020-12-21 2023-08-01 Univ Cornell A peptide-linked drug delivery system
US11964024B2 (en) 2021-01-04 2024-04-23 Mersana Therapeutics, Inc. B7H4-targeted antibody-drug conjugates and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003086318A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Immunogen, Inc. Improved prodrugs of cc-1065 analogs
WO2007038658A2 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007089149A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-09 Syntarga B.V. Water-soluble cc-1065 analogs and their conjugates
WO2008083312A2 (en) * 2006-12-28 2008-07-10 Medarex, Inc. Chemical linkers and cleavable substrates and conjugates thereof

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2078118C (en) 1990-04-25 1999-11-16 Paul A. Aristoff Cc-1065 analogs
US5686072A (en) * 1992-06-17 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5659022A (en) 1996-01-05 1997-08-19 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-cyclopropapyrroloindole conjugates as sequence specific hybridization and crosslinking agents for nucleic acids
CA2381770C (en) 1999-08-24 2007-08-07 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7087600B2 (en) 2001-05-31 2006-08-08 Medarex, Inc. Peptidyl prodrugs and linkers and stabilizers useful therefor
WO2003000201A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Drug Innovation & Design, Incorporated Exponential pattern recognition based cellular targeting, compositions, methods and anticancer applications
NZ534174A (en) 2002-01-09 2007-03-30 Medarex Inc An isolated human monoclonal antibody which binds to human CD30
UY28424A1 (es) 2003-07-22 2005-02-28 Schering Ag Anticuerpos rgi y usos de los mismos.
NZ550934A (en) 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
JP5249587B2 (ja) 2005-02-18 2013-07-31 メダレックス， インク． フコシル残基を欠く前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）に対するモノクローナル抗体
CN101124249B (zh) 2005-02-18 2011-06-29 米德列斯公司 抗前列腺特异性膜抗原（psma）的人单克隆抗体
PL2439273T3 (pl) 2005-05-09 2019-08-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku programowanej śmierci komórki 1(pd-1) oraz metody leczenia nowotworów z wykorzystaniem przeciwciał anty-pd-1 samodzielnie lub w połączeniu z innymi immunoterapeutykami
CA2611814A1 (en) 2005-06-20 2007-01-04 Medarex, Inc. Cd19 antibodies and their uses
NZ566395A (en) 2005-09-26 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to CD70
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
AU2006321553B2 (en) 2005-12-08 2012-03-08 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to O8E
SG177194A1 (en) 2005-12-08 2012-01-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 (ptk7) and methods for using anti-ptk7 antibodies
CN104328086A (zh) 2006-09-08 2015-02-04 Ambrx公司 通过脊椎动物细胞位点特异性并入非天然氨基酸
NZ578064A (en) 2006-12-01 2012-01-12 Medarex Inc Human antibodies that bind cd22 and uses thereof
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
CA2672468A1 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
CN101605906A (zh) * 2006-12-14 2009-12-16 梅达雷克斯公司 结合cd70的人类抗体及其用途
UY30776A1 (es) 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
KR20090122439A (ko) 2007-02-21 2009-11-30 메다렉스, 인코포레이티드 단일 아미노산을 갖는 화학적 링커 및 이의 접합체
HUE028737T2 (en) 2007-07-17 2017-01-30 Squibb & Sons Llc Monoclonal antibodies to GLYPICAN-3
US8268970B2 (en) * 2007-10-01 2012-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof
CA2707443A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Conjugates of anti-rg-1 antibodies
MX2010005966A (es) 2007-11-30 2010-06-15 Bristol Myers Squibb Co Conjugados de anticuerpo monoclonal-molecula asociada dirigidos a la proteina tirosina-cinasa 7 (ptk7).
US20110085970A1 (en) 2007-11-30 2011-04-14 Terrett Jonathan A Anti-b7h4 monoclonal antibody-drug conjugate and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003086318A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Immunogen, Inc. Improved prodrugs of cc-1065 analogs
WO2007038658A2 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007089149A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-09 Syntarga B.V. Water-soluble cc-1065 analogs and their conjugates
WO2008083312A2 (en) * 2006-12-28 2008-07-10 Medarex, Inc. Chemical linkers and cleavable substrates and conjugates thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASAI, A. ; NAGAMURA, S. ; KOBAYASHI, E. ; GOMI, K. ; SAITO, H.: "Synthesis and antitumor activity of water-soluble duocarmycin B1 prodrugs", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, PERGAMON, AMSTERDAM, NL, vol. 9, no. 20, 18 October 1999 (1999-10-18), AMSTERDAM, NL, pages 2995 - 2998, XP025669502, ISSN: 0960-894X, DOI: 10.1016/S0960-894X(99)00518-1 *
BOGER D L ET AL: "1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[c]benz[e]indol-4-one (CBI) analogs of CC-1065 and the duocarmycins: synthesis and evaluation", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, PERGAMON, GB, vol. 03., no. 11., 1 January 1995 (1995-01-01), GB, pages 1429 - 1453., XP002086069, ISSN: 0968-0896, DOI: 10.1016/0968-0896(95)00130-9 *
DENNY W A: "TUMOR-ACTIVATED PRODRUGS-A NEW APPROACH TO CANCER THERAPY", CANCER INVESTIGATION., vol. 22, no. 04, 1 January 2004 (2004-01-01), pages 604 - 619, XP008042300, ISSN: 0735-7907, DOI: 10.1081/CNV-200027148 *
DENNY, W.A.: "Prodrug strategies in cancer therapy", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY., EDITIONS SCIENTIFIQUE ELSEVIER, PARIS., FR, vol. 36, no. 7-8, 1 August 2001 (2001-08-01), FR, pages 577 - 595, XP027556826, ISSN: 0223-5234 *
WARPEHOSKI M A, ET AL: "STEREOELECTRONIC FACTORS INFLUENCING THE BIOLOGICAL ACTIVITY AND DNA INTERACTION OF SYNTHETIC ANTITUMOR AGENTS MODELED ON CC-1065", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 31, 1 January 1988 (1988-01-01), US, pages 590 - 603, XP002244516, ISSN: 0022-2623, DOI: 10.1021/jm00398a017 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2669807C2 (ru) * 2014-01-27 2018-10-16 Пфайзер Инк. Бифункциональные цитотоксические агенты

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201309669B (en) 2015-10-28
CL2013003393A1 (es) 2014-06-13
CA2837327A1 (en) 2012-11-29
EP2714092A1 (en) 2014-04-09
CA2837327C (en) 2017-08-15
KR20140036252A (ko) 2014-03-25
SG195011A1 (en) 2013-12-30
US8852599B2 (en) 2014-10-07
EP2714092B1 (en) 2020-07-15
TW201300401A (zh) 2013-01-01
MA35153B1 (fr) 2014-06-02
JP2014517842A (ja) 2014-07-24
ZA201406168B (en) 2015-03-25
AR086568A1 (es) 2014-01-08
IL229477A (en) 2017-06-29
CO6831975A2 (es) 2014-01-10
US9186416B2 (en) 2015-11-17
ES2814798T3 (es) 2021-03-29
US20120301490A1 (en) 2012-11-29
BR112013029764A2 (pt) 2017-03-28
MX336806B (es) 2016-02-02
JP6359133B2 (ja) 2018-07-18
WO2012162482A1 (en) 2012-11-29
US20140364585A1 (en) 2014-12-11
AU2012258750A1 (en) 2014-01-16
EA201391754A1 (ru) 2014-04-30
JP6105566B2 (ja) 2017-03-29
MX2013013402A (es) 2014-01-31
CN103561772A (zh) 2014-02-05
PE20141480A1 (es) 2014-10-23
JP2017128571A (ja) 2017-07-27
IL229477A0 (en) 2014-01-30
KR102070464B1 (ko) 2020-01-29
AU2012258750B2 (en) 2016-03-03
UY34100A (es) 2012-11-30
CN103561772B (zh) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024844B1 (ru) Иммуноконъюгат и его применение для лечения рака
US11918656B2 (en) Antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
DK2814829T3 (en) RELATIONSHIPS, CONJUGATES THEREOF AND USES AND RELATED PROCEDURES
EP3500574A1 (en) Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
AU2017344198A1 (en) Medical use of anti-c met antibody-cytotoxic drug conjugate
CA3113378C (en) Sulfomaleimide-based linkers and corresponding conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU