EA020583B1

EA020583B1 - Способ переноса полипептидов в клетки

Info

Publication number: EA020583B1
Application number: EA201171232A
Authority: EA
Inventors: Саша Барабас; Катрин Эдмайер; Людвиг Демль
Original assignee: Лофиус Биосайенсез Гмбх
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2014-12-30
Also published as: KR20120013373A; AU2010233668A1; AU2010233668B2; EP2239569A1; EP2417451B1; US20170058260A1; CA2758159A1; CN102460161B; SG175153A1; KR101835647B1; US9476878B2; EA201171232A1; ES2653561T3; SG10201401126QA; CA2758159C; WO2010115984A1; US20120093872A1; EP2417451A1; US9850464B2; CN102460161A

Abstract

Изобретение относится к способу переноса полипептидов в клетки. Кроме того, заявленное изобретение относится к детекции специфических к полипептидам иммунных клеток и примированию, выращиванию и реактивации специфических к полипептиду Т-клеток. Помимо этого, заявленное изобретение относится к полипептидам, получаемым при помощи способов согласно заявленному изобретению, в комбинации с мочевиной и их применению в исследованиях, диагностике или лечении и профилактике заболеваний человека и животных.

Description

Изобретение относится к способу переноса полипептидов в клетки. Помимо этого, заявленное изобретение относится к детекции специфических к полипептидам иммуноцитов и примированию, выращиванию и реактивации специфических к полипептиду Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Кроме того, заявленное изобретение относится к полипептидам, получаемым при помощи способов согласно заявленному изобретению, в комбинации с мочевиной и их применению в исследованиях, диагностике или лечении и профилактике заболеваний человека и животных.

Описываемая область иммунной системы включает гуморальную (иммуноглобулины) и клеточную иммунную защиту.

Клеточные и микробные полипептиды получают при помощи процессинга антигенпрезентирующих клеток (АПК) путем специфического расщепления, фрагменты (эпитопы) которого получают вместе с МНС (ГКГ) молекулами класса I и/или класса II на поверхности клетки. При помощи своего рецептора, улавливающего Т-лимфоциты (Т-клетки), Т-лимфоциты целенаправленно узнают эпитопы, презентированные в комплексе с ГКГ белками и вступают с ними в иммунную реакцию.

Т-лимфоциты можно подразделить на различные эффекторные популяции с использованием специфических поверхностных белков. СИ4⁺ Т-клетки (Т-хелпер-клетки) узнают пептиды, которые презентированы на поверхности АПК вместе с белками ГКГ класса II, и играют существенную роль в управлении и поляризации иммунной защиты. Т-хелпер-клетки можно разделить на подклассы клеток Тхелперов типа 1 (Тй-1), Т-хелперов типа 2 (Тй-2) и Т-хелперов типа 17 (Тй-17). Тй-1 клетки характеризуются воспроизводством цитокинов ΓΡΝ-γ и ТИР-а и экспрессией фактора транскрипции Т-Ье1. Тй-1 клетки активируют клеточные иммунные ответы путем увеличения эффективности уничтожения у макрофагов и стимуляции пролиферации цитотоксических СИ8+ Т-клеток (цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ, СТЬ) или СИ4^-СИ8⁺ Т-клетки). Тй-2 клетки характеризуются секрецией !И-4, Ш-5, [И-6, !И-10 и [И-13 и продуцированием фактора транскрипции ОАТА-3 и суппортом воспроизводства антител, а также переключением класса антител (гуморальная составляющая иммунного ответа). Тй-17 клетки характеризуются продуцированием ЕЪ-17 и, по всей видимости, играют ключевую роль в аутоиммунных заболеваниях.

Кроме того, Тй-1, Тй-2 и Тй-17 клетки, а популяция СИ4+ Т-клеток включает примерно 10% регуляторных Т-лимфоцитов, играют существенную роль в ослаблении иммунного ответа, в предотвращении аутоиммунных заболеваний и в оральной толерантности. Регуляторные Т-лимфоциты можно подразделить на СИ4-, СИ25- и ЦТЛА4-позитивные натуральные регуляторные Т-лимфоциты (Тгед), а также на Тй3 и Тг1 лимфоциты, которые характеризуются продуцированием (воспроизводством) ТОР-β (Тй3 лимфоцитов) или Ш-К) (Тг1 лимфоцитов).

Важное значение СИ8+ Т-лимфоцитов заключается в распознавании и уничтожении дегенеративных, опухолевых и раковых клеток, а также ткани и клеток, которые инфицированы микроорганизмами или паразитами. Т-лимфоциты, таким образом, выполняют важную функцию защитного механизма приобретенной иммунной системы для предотвращения и контроля над заболеваниями, вызванными микробами и, в особенности, вирусами, и для распознавания и уничтожения дегенеративных и опухолевых клеток. В дополнение к вышеупомянутым популяциям Т-лимфоцитов описаны другие субпопуляции циркулирующих Т-клеток, имеющих двойной позитивный СИ4+СИ8+ фенотип (например, СИ4⁺СИ8^Й1т, СП4^4тСИ8^Ьг18й‘ и СИ4^й1СИ8^й1 Т-клетки).

СИ4⁺СИ8^Й1т Т-клетки экспрессируют СИ8аа гомодимеры и могут быть подвергнуты детекции с меньшей частотой (менее чем 2% от общего объема популяции СИ3+ Т-клеток) в крови. Наблюдали транзиентную или персистирующую экспансию СЭ4'СО8^Н|т Т-клеток как у здоровых пациентов, так и у пациентов с различными заболеваниями, включая инфекции, вызванные различными вирусами, например вирусом иммунодефицита человека 1 типа (НТУ-1) и вирусом человеческого цитомегаловируса (ЦМВ), а также у пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями. СИ4^Й1тСП8^Ьг1бй1; Т-клетки представляют собой активированный фенотип СИ8+ Т-клеток, как определено повышенным уровнем содержания активационных и функциональных маркеров (СИ95, СИ25, СИ38, СИ69, СИ28 и СИ45КА+ СИ45КА0+) по сравнению с их СИ4^-СИ8⁺ аналогами. СИ4^ыСИ8^й1 Т-клетки экспрессируют высокие уровни содержания СИ4 молекул и ί'.Ό8αβ цепей и повышаются при аутоиммунном ответе.

АПК с каноническими функциями (иммунные АПК), такие, как дендритные клетки, моноциты, макрофаги, а также неиммунные АПК, как, например, В-клетки, нейтрофилы и фибробласты (десмоциты), играют центральную роль как в запуске (триггеринге) реакции Т-клетки на экзогенные и эндогенные иммуногены и в индукции толерантности Т-клетки по отношению к эндогенной ткани. Активация и пролиферация Т-клеток протекает при симультанном запуске двух сигналов. Первый сигнал проводится в Тклетку рецептором Т-клетки, который распознает эпитоп совместно с ГКГ на поверхности АПК.

Второй костимулирующий сигнал опосредуется специфическим взаимодействием костимулирующих молекул, как, например, В7.1 (СИ80) или В7.2 (СИ86) на АПК с релевантным рецептором (как, например, СИ28) на поверхности Т-клетки. В отсутствие костимулирующего сигнала эпитопспецифическая Т-клетка становится анергической (с подавленным иммунитетом). Анергия характеризует состояние, при котором Т-клетки теряют способность к размножению и реакции на антиген.

Состояние полипептида однозначно определяет эффективность и путь процессинга эпитопа и появ- 1 020583 ление посредством АПК. Дополнительно, степень активации АПК и, соответственно, течение индуцированного иммунного ответа испытывают адверсивное влияние в зависимости от лекарственной формы полипептида. Таким образом, концентрация и биохимические свойства полипептида, а также присутствие или отсутствие иммуномодулирующих веществ (в особенности, бактериальных компонентов, таких, как нуклеиновые кислоты (например, СрО-позитивные ДНК), липополисахаридов (ЛПС) и полипептидов (например, е.д. йадеШп), а также цитокинов (например, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-10, 1Ь-12, ΙΡΝ-γ, 1Ь-18, 1Ь-23) оказывают определяющее значение, будет ли активирована клеточная (опосредованный Т-хелпером-1 (ТЛ1)-тип иммунного ответа) или гуморальная (опосредованный Т-хелпером-2 (ТЛ-2)-тип иммунного ответа) составляющая иммунной системы или же иммунный ответ пойдет по толерогенному пути.

До настоящего времени описано всего лишь небольшое количество способов транслокации экзогенных полипептидов в клетки млекопитающих. Более того, описано только совсем незначительное число способов транслокации экзогенных полипептидов в ГКГ классе I пути процессинга АПК. К настоящему времени для переноса белков в клетки с тем или иным успехом применяли, например, механические способы микроинъекций, электропорации и липофекции.

Прочие способы переноса полипептидов в клетки основаны на использовании белковых трансдукционных доменов (РГО). Аминокислотные последовательности, богатые аргинином, содержащие от 10 до 35 аминокислот, происходят, например, из белков Ηΐν Так вируса простого герпеса (Н§У) УР22 или гомеобелка сложного локуса, в котором локализованы гомеозисные мутации дрозофил (Αηΐρ). В дополнение определили синтетические РТО последовательности методом фаговых библиотек. Значительного увеличения мембранной распространенности и транслокации полипептидов можно достичь путем сопряжения оных с РГО.

Описаны другие способы переноса белков в клетки, основанные на использовании различных катионно-липидных композиций или включении полипептидов в частицы 18СОМ® (С8Ь ЫтЛей, νίοΙοπ;Γ АиЧгаПа). Все упомянутые способы чрезвычайно затратны в трудо- и финансовом аспектах при рутинном применении. Помимо этого, многие частные случаи практического воплощения системы переноса обладают цитотоксическими (например, липосомы) или иммуномодулирующими свойствами (частицы 18СОМ®), которые могут, в конечном итоге, оказывать адверсивное влияние на естественные свойства обрабатываемых клеток.

Принимая во внимание исключительное значение клеточного иммунного ответа, в особенности, цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ), при контроле над микробными инфекциями и опухолями, в настоящее время проходят апробацию множество новых технологий примирования ЦТЛ ίη νίνο, в дополнение к Тхелпер-клеткам. Данные технологии включают использование пептидов, полипептидов, белков, вирусоподобных частиц, живых ослабленных бактерий и вирусов, рекомбинантных живых вакцин (на основе различных рекомбинантных бактерий и вирусов) и ДНК вакцин.

Кроме того, обработанные ех νίνο аутогенные АПК, которые представляют специфические пептиды в контексте с ГКГ белками классов I и II, являются подходящим реагентом для индукции специфических к полипептидам иммунных ответов, в особенности, в терапевтическом лечении. На ранних стадиях была доказана эффективность применения АПК, обработанных в пульсирующем поле с опухолевыми извлечениями, клеточные лизаты, экспрессионные плазмиды и иРНК, для симультанной индукции СЭ4' и СЭ8' Т-клеточных ответов (Негг е! а1. (2000), Βίοοά, 96:1857). Более того, в ЕР 0421949 В1 описано, что химически модифицированные аллергены, предварительно обработанные цианатами щелочных металлов, можно применять для индукции специфических антител класса ^О.

В настоящее время существуют различные способы стимуляции различных популяций иммунных клеток, которые эффективны в различной степени для детекции специфических популяций антигенспецифических иммунных клеток.

Прямая загрузка мембраносвязанных ГКГ белков с пептидами определенной длины (оптимально, 812 аминокислот для загрузки ГКГ белков класса I и оптимально от 16 до 22 аминокислот для загрузки ГКГ белков класса II) представляет собой способ, часто используемый для стимуляции определенных популяций иммунных клеток, в особенности ί'.Ό8' Т-клетки и СЭ4' Т-клетки. В дополнение, 14-16мерные пептиды можно использовать для симультанной активации ί'.Ό4' и СЭ8' Т-клеток. Тем не менее, существуют значительные ограничения на применение данного способа стимуляции для измерения белок-специфических Т-клеток, заключающиеся в том, что специфическое распознавание эпитопов Тклеток подвержено влиянию (зависит) рестрикции ГКГ; т.е. пациенты, организм которых экспрессирует различные ГКГ белки, обладают свойством распознавания различных эпитопов в пределах полипептида, что значительно усложняет проведение анализа полипептид-специфических Т-клеток в крови доноров с вариабельными ГКГ структурами.

Кроме того, пептиды различного размера (от 8- до 12- и от 18- до 22-мерных) преимущественно представлены на ГКГ белках класса I или II. Таким образом, только Т-клетки, которые направлены против известных эпитопов в контексте с определенными ГКГ белками, можно специфически регистрировать, применяя данный способ.

Альтернативно, пептидные пулы (например, 14-16-мерные пептиды, перекрывающиеся в 13 амино- 2 020583 кислотах), разматывающие весь белок, можно использовать для симультанной детекции специфических к белкам Т-клеток. Тем не менее, воспроизводство пулов перекрывающихся пептидов, охватывающие все белки, является дорогостоящим и затратным процессом.

Кроме того, применение многих пептидов, включая известные эпитопы Т-клеток, ограничено низким потенциалом активации Т-клеток. Здесь, эффективность активации Т-клеток ГКГ/пептидными комплексами зависит от (ί) аффинности пептида к молекуле ГКГ, (ίί) стабильности пептидно-ГКГ комплексов и (ίίί) аффинности Т-клеточного рецептора к ГКГ/пептидным комплексам.

Однако описан только один способ повышения эффективности эпитопов для стимуляции Т-клеток. Петерсоном (Ре!ег8ои) и соавторами опубликовано подтверждение того факта, что фосфорилированные, НЬЛ А2-рестриктированные ЦТЛ эпитопы показывают измененную емкость по отношению к стимулированным ЦТЛ, по сравнению с их нефосфорилированными аналогами (Ре!ег8еи е! а1. (2009), ΡΝΑ3 106: 2776-2781).

В отличие от этого растворимые полипептиды и белки подходят для детекции полипептидспецифических С.П4 Т-клеток, вне зависимости от ГКГ рестрикции донора и наличия данных о детальной локализации Т-клетки в полипептиде. Растворимые полипептиды практически полностью поглощаются (оттягиваются) и восстанавливаются посредством процессинга ГКГ класса II и пути представления в АПК таким образом, что данный способ практически монопольно применим для детекции С.П4' Тклеток.

Более того, также описаны различные способы денатурации полипептидов, которые позволяют поставлять (переводить) данные полипептиды в процессинг и путь представления ГКГ класса I и ГКГ класса II. Данные способы включают, например, обработку полипептидов термическим способом или с использованием додецилсульфата натрия (3Ό3). Данные способы апробированы для достижения представления эпитопа на молекулах ГКГ классов I и II в АПК мышей (ЗсЫгшЬеск е! а1. (1994), Еиг. I. Iттиηо1, 24:2068); (ЗсЫгшЬеск е! а1. (1995), Уассте, 13:857). В упомянутых исследованиях было доказано, что белки, денатурированные различными способами, оттягиваются в АПК посредством различных механизмов и различаются по своей эффективности индуцирования полипептидной загрузки молекул ГКГ класса I. Таким образом, в сравнении с ДСН-обработанными белками, полипептиды, обработанные при помощи способа термоинактивации (1 ч при 60°С или 15 мин при 100°С), всего лишь индуцировали незначительную стимуляцию представления эпитопов на белках ГКГ класса I в обработанных АПК мышей. С другой стороны, способ денатурации с использованием ДСН доказал свою низкую эффективность для применения в культурах клеток человека вследствие высокой токсичности. Другой способ предварительной обработки полипептидов описан в ЕР 1487497 В1, при котором полипептиды предварительно обрабатывают с использованием мочевины.

Другой способ стимуляции представления эпитопов ГКГ классов I и II основан на инкорпорации полипептидов в определенные структуры, например липосомы, субстанции определенных носителей, вирусоподобные или липопротеиновые частицы. Первые исследования подтвердили применимость НТУ1 Рг55^бад вирусоподобных частиц в диагностике СП4' и СЭ8' Т-клеток (ЗеЛег е! а1. (2000), ΆΣΌδ, 14:2653-60). Тем не менее, воспроизводство частицесвязанных полипептидов является высокозатратным.

Другим способом стимуляции представления эпитопов ГКГ классов I и II на АПК основан на инкорпорации полинуклеотидов, кодирующих требуемые плипептиды с использованием плазмид, невирусных и вирусных векторов. Недостатком использования плазмид в диагностических целях является низкая эффективность и цитотоксический эффект переноса нуклеиновой кислоты в АПК с использованием существующих на данный момент способов трансфекции, например электропорации или липофекции. Вирусные или бактериальные векторы зачастую обладают значительно повышенной интенсивностью трансфекции АПК в сравнении с плазмидами. Тем не менее, данные системы переноса генов зачастую не обладают иммунологической инертностью и модулируют способность АПК к процессингу (обработке) эпитопов и представлению полипептидов. Дополнительно, применение данных способов, основанных на использовании нуклеиновых кислот, ограничено высокими затратами на получение (воспроизводство) генных носителей.

На настоящий момент С.П4' Т-клетки можно детектировать путем детерминации пролиферации клеток или мессенджерных субстанций (цитокинов), воспроизводимых Т-клетками после специфической стимуляции. Пролиферация клеток обычно детектируется с использованием традиционного, меченного тритием тимидина (³Н-ТДК), теста на инкорпорацию или теста на пролиферацию без использования радиомечения, как, например, энзимсвязанный иммуносорбентный метод исследования (ЕЫЗА) с 5-бром2-дезоксиуридином, анализ на планшете с тетразолием и анализ с кислой фосфатазой.

Производство цитокинов из С.П4' Т-клеток после специфической стимуляции с полипептидами можно детерминировать посредством анализа ЕЫЗА с цитокинами, анализа ЕЫЗРОТ или посредством технологии РАСЗ путем определения (детерминации) межклеточных цитокинов (например, окрашивание при помощи межклеточных цитокинов) или секретированных цитокинов (например, секреционный анализ РАСЗ).

СП8' Т-клетки традиционно детектируют посредством детерминации их специфической цитотоксической активности или мессенджерных субстанций (цитокинов), полученных С.П8' Т-клетками после

- 3 020583 специфической стимуляции, в особенности, интерферона-γ (ΙΡΝ-γ). Цитотоксичность обычно детектируют посредством классического теста высвобождения классического хрома или адекватного нерадиоактивного способа, при котором измеряют высвобождение энзимов или АТР из таргетных клеток как результат специфического лизиса эффекторной клетки с цитотоксическими свойствами. Альтернативно, цитотоксическую активность СЭ8' Т-клеток можно измерить детерминацией транзиентной поверхностной экспрессии СЭ107а.Ь (ЬАМР 1,2 белки).

Производство цитокинов из С.П8' Т-клеток после эпитоп-специфической стимуляции можно определить посредством энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ЕБ18А) с цитокинами, иммуноферментного спот-анализа (ЕЫ8РОТ) или с использованием анализа флуоресцентной сортировки клеток (РАС8) посредством детерминации межмолекулярных цитокинов или секретированных цитокинов (секреционный анализ РАС8). ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ и 1Ь-2 обычно применяют в качестве маркерных цитокинов для представления полипептид-специфических С.П8' Т-клеток. К настоящему времени аутологичные АПК, которые представляют эпитопы СЭ8+ Т-клеток в связке с ГКГ белками класса I на их поверхности, применяли, например, для стимуляции эпитоп- или полипептид-специфических С.П8' Т-клеток. К настоящему времени индукцию ГКГ класса Ι, опосредованную представлением эпитопа на АПК, в свою очередь, опосредовали инкубацией данного процесса эпитоп-несущими пептидами требуемой длины (от 8 до 16 аминокислот), инкубацией липополипептидами, в частности полипептидами или полипептидами, упакованными в специальные структуры, лизаты или полипептид-производящие клетки, а также рекомбинантные и живые аттенуированные микроогранизмы, в особенности вирусы или бактерии.

Технологии Тетрамер (СоиНег), Пентамер (Ргоштипе) и Стрептамер (1ВА, СоДтдеп) являются способами детекции эпитоп-специфических С.П8' Т-клеток и СП4' Т-клеток. Тем не менее, ограничения, препятствующие широкому внедрению данных способов для диагностики Т-клеток, связаны с крайне высокими затратами на производство данных реагентов. К тому же, тетрамеры, пентамеры и стрептамеры на настоящий момент применяют только в ограниченном ассортименте ГКГ типов, в особенности, для часто встречающихся белков ГКГ класса I, например НЬА А2. Дополнительно, данная технология всего лишь позволяет проводить детекцию определенных эпитоп-специфических Т-клеток. Реакции Тклетки по отношению к множественным эпитопам можно определить только используя данный способ при значительных временных и финансовых затратах.

Таким образом, целью заявленного изобретения является новый способ переноса полипептидов в клетки.

Данную цель достигают практическим воплощением предмета изобретения, раскрытого в формуле заявленного изобретения.

Объяснению сути заявленного изобретения служат следующие фигуры.

Фиг. 1 представляет механизм реакции на карбамилирование первичных аминов. (А) Мочевина находится в равновесии с аммонием и цианатом. Воздействие тепла и/или времени склоняют течение реакции к расщеплению мочевины, вызывая накопление циановой кислоты. (Б) При показателе рН от нейтрального до основного циановая кислота подвергается нуклеофильной атаке первичных аминов, образующих карбамилированный амин, как следует из процесса карбамилирования белков, при котором в особенности Ν-конец, но также и лизины в общем и другие аминокислоты белка подвергаются карбамилированию (Апде1 е! а1. (2007), Рар|Д Соттип. Ма88 8рее!гот. 21:1623).

Фиг. 2 представляет аккумуляцию цианата в растворах мочевины, хранящихся при низкой температуре. Кривые А, В и С - 6,66, 3,33, и 1,11 М мочевины соответственно, выдерживают при 25°С, кривая Ό - 6,66 М мочевины выдерживают при 5°С (Мапег е! а1. (1964), Апа1уДса1 ВюсНеппзЕу 7:304).

Фиг. 3 представляет аккумуляцию цианата и соответствующие изменения в 6,66 М мочевины при 85°С (Мапег е! а1. (1964), Аиа1уИса1 ВюсБет18!гу 7:304).

Фиг. 4 представляет изменения в концентрации цианата в 6,66 М мочевины при 25 °С. Кривая А повторное равновесие подогретого раствора (например, 85°С, 50 мин). Кривая В - прямое равновесие (Мапег е! а1. (1964), Апа1у!юа1 ВюсНепщЕу 7:304).

Фиг. 5 представляет изменения в концентрации цианата в 8 М мочевины, выдерживаемой при -40°С, при 4 и 25°С (СНШйоп е! а1., Рпес! РеЮгпппаДоп о£ Суапа!е ίη а Игеа 8о1Шюп апД а Игеа Сойат1пд Рго!еш Вийег И8шд а Кеадеп!-Ргее 1оп СБгота!одгарБу 8у8!ет, Рюпе\ (\\л\лу.Дюпе\.сот)).

Фиг. 6 иллюстрирует подтверждение факта, что нагревание полипептидов в растворе 2 М мочевины (конечная концентрация) приводит к измененному миграционному поведению белков в полиакриламидных гелях. (А) 0,84 мг/мл НТУ капсидного белка р24 (растворенного в 150 мМ №С1, 50 мМ NаР, рН 7,6), (В) 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) или (С) 0,64 мг/мл частиц парвовируса В19 УР2 (растворенного в 38% (по весу) С8С1) смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с (Β,Ό,Ε) Н₂О и 30 мМ Тп8 рН 3,9 или (А,С,Р) 6 М раствора мочевины и 30 мМ Тп8 рН 3,9, затем инкубировали в течение 60 мин при 96°С в термомиксере. Затем, белки подвергли сепарации при помощи электрофореза в (А) 12,5% или (В,С) 10% ДСН-полиакриламидном геле (РАСЕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: маркеры молекулярного веса (А, В): Со1оиг Р1и8 предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Р7703; (С): предварительно окрашенный маркерный белок, ши- 4 020583 рокий спектр ΝΕΒ Р7703. Размеры указаны в килодальтонах (кДа).

Фиг. 7 иллюстрирует подтверждение факта, что обработка с мочевиной в соответствии с различными протоколами карбамилирования приводит к образованию модифицированных белков бычьего сывороточного альбумина, с увеличенным молекулярным весом, что подтверждено измененной миграцией в полиакриламидных гелях. 1 мг/мл БСА смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с (А) Н₂О/НС1 (рН 3,6) и 30 мМ трис рН 3,6 или (Β, С) 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,6, инкубировали (А) в течение 0 мин при 96°С или (В) 30 мин при 96°С, или (С) 60 мин при 96°С. (Ό) БСА обработали в соответствии с протоколом карбамилирования белка, описанным Апде1 и соавторами (Апде1 с1 а1. (2007), Βαριά Соттип. Ма88 8рес1гот. 21:1623). 10 нМ БСА растворили в 100 мкл 8 М раствора мочевины/200 мМ трис-НС1, рН 7,4. Данный раствор восстановили с 20 мМ дитиотреитола (ДТТ) в течение 2 ч при 50°С, с последующим карбамидометилированием с 45 мМ иодоацетамида (ИДА) при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор денатурированных, восстановленных алкилированных белков разбавили 1:8 с 50 мМ бикарбоната аммония для коррекции концентрации мочевины до 1 М и инкубировали в течение ночного времени суток при 37°С. (Е) ВСА обработали в соответствии с описанием (Ό). Затем, раствор просушили под вакуумом при 37°С и растворили в 300 мкл 8 М мочевины/200 мМ трис-НС1, рН 8,5. Затем, образец перемешали на вортексе до полного растворения и затем инкубировали в течение 4 ч при 80°С, с периодическим перемешиванием на вортексе (согласно Апде1 е1 а1. (2007), Βαριά Соттип. Ма88 8рес1гот. 21:1623). Затем, белки подвергли сепарации с использованием электрофореза в 10% ДСН-полиакриламидном геле (РАСЕ) и визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Р7702. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 8 иллюстрирует подтверждение факта, что обработка БСА с мочевиной в соответствии с различными протоколами карбамилирования приводит к образованию модифицированных БСА белков, что подтверждено измененным значением рК₁, как показано на примере двумерного электрофореза. 1 мг/мл БСА смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с (А) Н₂О/НС1 (рН 3,6) и 30 мМ трис рН 3,6 или (В, С) с 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,6 и инкубировали в течение для (А) 0 мин (В) 30 мин или (С) 60 мин при 96°С. (Ό) БСА обработали в соответствии с протоколом карбамилирования белка, описанным Апде1 и соавторами (Апде1 е1 а1. (2007), Βαριά Соттип. Ма88 8рес1гот. 21:1623). 10 нМ БСА растворили в 100 мкл 8 М мочевины/200 мМ трис-НС1, рН 7,4. Данный раствор восстановили с 20 мМ дитиотреитола (ДТТ) в течение 2 ч при 50°С, с последующим карбамилометилированием с 45 мМ иодоацетамида (ИДА) при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор денатурированных, восстановленных алкилированных белков разбавили 1:8 с 50 мМ бикарбоната аммония для коррекции концентрации мочевины до 1 М и инкубировали в течение ночного времени суток при 37°С. Затем белки подвергли сепарации при помощи изоэлектрического фокусирования на ИЭФ полосках (1ттоЫ1ше™ Эгу81г1р рН 3-10, 11 см, СЕ НеаЬЬсаге) при 26350 УЬ, с последующим электрофорезом в 10% ДСН-полиакриламидном геле (РАСЕ). Белки визуализировали при помощи окрашивания серебром. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Р7702. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 9 иллюстрирует подтверждение факта, что на модификацию БСА путем обработки с 2 М мочевины, 10 мМ трис (инкубация в течение 2 ч при 96°С) не оказывает существенного влияния значение рН в диапазоне от 3,9 до 8,7. 1 мг/мл БСА смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с (А-С) 6 М мочевины и (А) 30 мМ трис рН 3,9, или (В) 30 мМ трис рН 6,8, или (С) 30 мМ трис рН 8,7, или (Ό-Р) Н₂О и (Ό) 30 мМ трис рН 3,9, или (Е) 30 мМ трис рН 6,8, или (Р) 30 мМ трис рН 8,7 и затем инкубировали в течение 2 ч при 96°С в термомиксере (300 об/мин). Затем, белки сепарировали (разделили) при помощи электрофореза в 10% ДСН-полиакриламидном геле (РАСЕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Р7702. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 10 иллюстрирует подтверждение факта, что эффективность модификации БСА с мочевиной зависит от времени инкубации. (А) 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 и инкубировали при 96°С в течение предписанного времени инкубации (от 0 до 60 мин). (В) 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 и инкубировали при 96°С в течение предписанного времени инкубации (от 0 до 8 ч). Затем, белки сепарировали (разделили) при помощи электрофореза в 10% ДСН-полиакриламидном геле (РАСЕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Р7702. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 11 иллюстрирует подтверждение факта, что эффективность модификации БСА с мочевиной зависит от температуры. 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в Н2О смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 (дорожка А-Ь) и инкубировали в течение 2 ч при заданных температурах (от 0 до 96°С). Затем, белки сепарировали (разделили) при помощи электрофореза в 10% ДСН-полиакриламидном геле (РАСЕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Р7702. Размеры указаны в кДа.

- 5 020583

Фиг. 12 иллюстрирует подтверждение факта, что обработка белка ΙΕ1 цитомегаловируса (ЦМВ) человека с осажденной мочевиной (от 7 до 14 дней при комнатной температуре, с последующим нагревом в течение более чем 1 ч при 96°С) приводит к образованию модифицированных ΙΕ1 белков, что подтверждено измененным значением рК₁, как показано на примере двумерного электрофореза. (А) Либо 100 мкл белка ΙΕ1 (0,89 мкг/мл в ФСБ) или (В) ΙΕ1 в ФСБ, смешанном 1:1 (об./об.) с 8 М осажденной мочевины (нагретой в течение более 1 ч при 96°С, затем выдержанной в течение от 7 до 14 дней при комнатной температуре) инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Затем белки подвергли сепарации при помощи изоэлектрического фокусирования на ИЭФ полосках (рН 3-10, линейные) при 38300 УН, с последующим электрофорезом в 10% ДСН-полиакриламидном геле (ΡΆΟΕ). Белки визуализировали при помощи окрашивания серебром. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Ρ7703. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 13 представляет результаты масс-спектрометрического анализа с использованием времяпролетной ионизации лазерной десорбцией, необработанных БСА и БСА, обработанных с осажденной мочевиной. Получены спектры (А) немодифицированных БСА; сдвоенно-изотопическая протонированная масса 33230.3 и (В) БСА после смешивания (1:1; об./об.) с осажденной мочевиной 8 М (от 7 до 14 дней при комнатной температуре, с последующим нагревом в течение более 1 ч при 96°С); сдвоенноизотопическая протонированная масса 33497. Таким образом, при упомянутых условиях проведения опыта, обработка мочевиной ВСА индуцировала сдвиг массы на 226,7 Да.

Фиг. 14 иллюстрирует подтверждение факта, что температура инкубации и время предварительного нагрева мочевины являются критическими факторами для эффективности индуцированной мочевиной модификации БСА. 1 мг/мл БСА в Н₂О смешали 1:1 (об./об.) с либо (А, С, Ε, С) свежеприготовленного 4 М раствора мочевины или (Β, Ό, Ρ, Н) 4 М мочевины, который был предварительно нагрет в течение 1 ч при 96°С и затем быстро охлажден. Затем образцы инкубировали в течение для (А, В) 0 ч, (С, Ό) 2 ч, (Ε, Ρ) 4 ч или (С, Н) 17 ч при 40°С в термомиксере (при 300 об/мин). Затем белки сепарировали при помощи электрофореза в 10% ДСН-полиакриламидном геле (ΡАСΕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Ρ7703. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 15 иллюстрирует подтверждение факта, что инкубация с осажденной мочевиной в течение 24 ч при 40°С индуцирует сдвиг массы у БСА. 1 мг/мл БСА в Н₂О смешали 1: 1 (об./об.) с осажденной мочевиной 4 М (которую предварительно нагрели в течение 1 ч при 96°С и затем инкубировали в течение 8 дней при комнатной температуре) и инкубировали в течение рекомендованных временных промежутков (от 0 до 24 ч) при 40°С. Затем белки сепарировали при помощи электрофореза в 10% ДСНполиакриламидном геле (ΡАСΕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Ρ7703. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 16 иллюстрирует подтверждение факта, что обработка БСА с мочевиной в соответствии с различными протоколами карбамилирования приводит к образованию модифицированных БСА белков, что подтверждено измененным значением рК₁, как показано на примере двумерного электрофореза. 1 мг/мл БСА смешали 1:1:1 (объем/объем/объем) с (А) Н₂О/НС1 (рН 3,6) и 30 мМ трис рН 3,6 или (В, С) с 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,6 и инкубировали в течение для (А) 0 мин (В) 30 мин или (С) 60 мин при 96°С. (Ό) Альтернативно, 10 мМ БСА смешали 1:1 (об./об.) с 4 М осажденной мочевины (нагрев в течение 1 ч при 96°С, затем выдерживание в течение 3 месяцев при комнатной температуре) и инкубировали в течение 20 ч при температуре 40°С. Затем белки подвергли сепарации при помощи изоэлектрического фокусирования на ИЭФ полосках при примерно (А-Э) 26350 УН, с последующим электрофорезом в 10% ДСН-полиакриламидном геле (ΡАСΕ). Белки визуализировали при помощи окрашивания серебром. Размеры стандартов белков указаны в килодальтонах (кДа).

Фиг. 17 иллюстрирует результаты опыта по химическому карбамилированию БСА с цианатом калия (цианово-кислым калием). БСА (1 мг/мл в воде) смешали 1:1 (об./об.) в течение 1 ч при 40°С в термомиксере с цианово-кислым калием при конечной концентрации (А) 0 мМ, (В) 25 мМ, (С) 100 мМ, (Ό) 500 мМ и (Е) 1000 мМ. Продукты реакции сепарировали при помощи электрофореза в 10% ДСНполиакриламидном геле (ΡАСΕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр ΝΕΒ Ρ7702. Размеры указаны в кДа.

Фиг. 18 иллюстрирует результаты опыта по химическому карбамилированию БСА с цианатом калия (цианово-кислым калием). БСА (1 мг/мл в воде) смешали 1:1 (об./об.) с возрастающей концентрацией водных растворов цианово-кислого калия (конечная концентрация КОС№ (А) 0 мМ, (В) 1 мМ, (С) 5 мМ, (Ό) 10 мМ, (Е) 20 мМ, (Ρ) 50 мМ, (С) 100 мМ, (Н) 200 мМ, (1) 500 мМ. Затем, белки инкубировали в течение 19,5 ч при 40°С в термомиксере с последующей сепарацией при помощи электрофореза в 10% ДСН-полиакриламидном геле (ΡАСΕ) и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. М: маркер молекулярного веса (предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр (ΝΕΒ Ρ7708)). Размеры указаны в кДа.

- 6 020583

Фиг. 19 представляет аффинную очистку белков ΙΕ1 цитомегаловируса человека от лизатов рОЕХΚΟ-ΙΕ1 трансфицированных бактерий (М15[рКЕР4]). Образцы, полученные в результате выполнения указанных этапов очистки, сепарировали при помощи электрофореза в 12,5% ДСН-полиакриламидном геле (РАОЕ) и визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. Маркер: предварительно окрашенный маркерный белок, широкий спектр (Вю1аЪ§; ΝΕΒ7703), Размеры указаны в кДа.

Фиг. 20 иллюстрирует повышенную способность модифицированных с мочевиной полипептидов для специфической реактивации СЭ4' и/или СЭ8+ Т-клеток путем проточных цитометрических анализов гепаринизированной цельной крови ЦМВ-позитивного НЬА А2-позитивного пациента после рестимуляции синтетическими пептидами или рекомбинантным ЦМВ ΙΕ1 белком, как в карбамилированной, так и некарбамилированной формах. При проведении данных опытов, очищенный ΙΕ1 белок (0,89 мкг/мл в ФСБ) смешали 1:1 (об./об.) с 8 М осажденной мочевины (предварительно инкубированной в течение ночного времени суток при 96°С) и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Пептиды (10 мкг/мкл в 100% ДМСО) смешали 1:1 (об./об.) с 8 М осажденной мочевины (предварительно инкубированной в течение ночного времени суток при 96°С) и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Показаны СЭ4' Тй-клетки и СЭ8' цитотоксические Т-клетки, проанализированы на ΙΡΝ-γ секрецию, как определено в соответствии с окрашиванием межклеточных цитокинов. Гепаринизированную цельную кровь НЬА А2-позитивного, ЦМВ-серопозитивного пациента стимулировали в течение 6 ч с либо необработанным или обработанным с мочевиной белком ΙΕ1 или УШ пептидом (представляя НЬА А2- рестрикционный ЦТЛ эпитоп внутри белка ΙΕ1) и активацию ΙΕ1 или УГО-специфических СЭ4' и СЭ8' Т-клеток определили путем межклеточного ΙΡΝ-γ окрашивания. Клетки стимулировали контрольным пептидами, представляя мышиный ЦТЛ эпитоп внутри ΗΙν р24 белка в качестве отрицательного контроля. Секрецию цитокинов из активированных клеток ингибировали путем добавления брефелдином А в течение последних 4 ч стимуляции. Диаграммы представляют данные по интенсивности флуоресценции.

Фиг. 21 иллюстрирует повышенную способность карбамилированных с цианатом и мочевиной пептидов для специфической реактивации СЭ8' Т-клеток в гепаринизированной цельной крови ЦМВпозитивного НЬА А2-позитивного пациента, в соответствии с результатами проточных цитометрических анализов. В данных опытах синтетический пептид ΥΙΕ (10 мкг/мкл в 100% ДМСО) смешали 1:1 (об./об.) либо с 8 М осажденной мочевины (предварительно инкубированной в течение ночного времени суток при 96°С), либо с 200 мМ цианово-кислого калия в Н₂О,|„, и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Затем, гепаринизированную цельную кровь НЬА А2-позитивного, ЦМВсеропозитивного пациента стимулировали в течение 9 ч либо с 10 мкг/мл Ε10Ρ пептида, с покрытием мышиного ЦТЛ эпитопа внутри р24 капсидной области ШУП^о) Оад (аа291-300) (^ί16 с1 а1. (2004), ναεείηο. 2004; 22:1732-1743) или ΥΙΕ пептида (представляя НЬА А2-рестрикционный ЦТЛ эпитоп внутри белка ΙΕ1), или, альтернативно, ΥΙΕ пептида, который был карбамилирован либо с 100 мМ ΚОСN или 4 М осажденной мочевины. В качестве контроля, стимулировали клетки либо с 4 мМ мочевины, либо с 200 мМ КОСИ Активацию активацию ΥΙΕ или Р8А-специфических СЭ8' Т-клеток определили путем межклеточного ΙΡΝ-γ окрашивания с применением клеточного сортера с активацией флуоресценции. Секрецию цитокинов из активированных клеток ингибировали путем добавления брефелдином А в течение последних 7 ч стимуляции. Диаграммы представляют данные по интенсивности флуоресценции.

Фиг. 22 представляет результаты проточно-цитометрических анализов мышиных (клеток), иммунизированных либо с немодифицированными, либо с карбамилированными р24 в отсутствие или в присутствии иммуностимулирующих СрО ΟΌΝ 1668 после рестимуляции с синтетическими пептидами, представляющими р24-специфические ЦТЛ эпитопы или не нерелевантные ЦТЛ эпитопы. В качестве контроля использованы специфически или неспецифически рестимулированные селезеночные клетки мышей, иммунизированные либо с ФСБ, либо с НА Оад УЬР. Показаны номера СЭ8' Т-клеток, подвергнутые анализу на ΙΡΝ-γ секрецию, в соответствии с окрашиванием межклеточных цитокинов. В данных опытах 6 ВАЬВ/с белых мышей иммунизировали с немодифицированным или модифицированным с мочевиной НА р24 белком в отсутствие или в присутствии иммуностимулирующих СрО ΟΌΝ 1668 (Ваиег с1 а1. (1999), Ιιηιηιιηο1ο§γ 97:699). В качестве отрицательного и положительного контроля мышей иммунизировали с ФСБ или НА Оад вирусоподобными частицами (УЬР) (Эсш1 е1 а1. 2005, Мо1. Iттиηο1. 42:259). На неделе 2 и 4 после первичной иммунизации мышам сделали бустер-инъекцию, содержащую тот же самый иммуноген. По истечении 7 дней после первой и второй бустер-инъекций получили селезеночные клетки от каждой третьей мыши в группе и каждые 2х10⁶ клеток рестимулировали в течение 6 ч с 10 мкг либо НТУ С-тип р24 пептида (ΛΜΟΙυΟΤΙ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1); аа!_97-205 в случае р24 иммунизированных мышей), либо с НГ^м А9Т пептида (АМрМЕКЕИ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2); аа_!97-205 (^ί16 е1 а1. (2004), νπ^ίη; 22:1732)) в случае мышей, иммунизированных с вирусоподобными частицами (УЬР) в присутствии брефельдина А. В качестве контроля, селезеночные клетки стимулировали с контрольным пептидом, представляющим человеческий ЦТЛ эпитоп внутри простат-специфического антигена (Р8А 141-150 ЕЕТРККЕ-ОСУ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3); СйакгаЪойу е1 а1. (2003), Сапсег Iттиηο1. Iттиηοΐйе^. 52:497) в присутствии брефельдина А. Показаны средние значения плюс стандартное отклонение (СО) от номеров ΙΡΝ-γ,

- 7 020583 экспрессирующих СГО8' клетки.

Фиг. 23 иллюстрирует повышенную способность карбамилированных с цианатом и мочевиной (А) У1Ь пептида и (В) СМУ рр65 белка для специфической реактивации СЭ8' Т-клеток в гепаринизированной цельной крови ЦМВ-позитивного НЬА А2-позитивного пациента, в соответствии с результатами проточных цитометрических анализов. В данных опытах синтетический пептид У1Ь, представляющий НЬА А2-рестрицированный ЦТЛ эпитоп внутри СМУ ΙΕ1 белка (УГОЕЕТЗУМЬ (ЗЕЦ ГО N0: 4); аминокислоты 315-324; РтойЪотте е! а1. (2003), Т 1ттипо1. 170:2030) растворили в 100% ДМСО с конечной концентрацией 2 мкг/мкл. Область антигенной детерминанты ЦМВ (линия АЭ169) белка рр65 (аа 8621048; КееМо1 ИЬ83-рр65, Са!. Νο 1В023А) растворили в Н₂О, включая 140 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 10 мМ №-1₂НР0₄. 1,8 мМ КН₂Р0₄ и возрастающую концентрацию ΚΟΟΝ (0 мМ, 100 мМ, 200 мМ и 500 мМ) и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Затем, гепаринизированную цельную кровь НЬА А2-позитивного, ЦМВ-серопозитивного пациента стимулировали в течение 6 ч с 10 мкг/мл указанных карбамилированных с цианово-кислым калием УТЬ пептидов или белков рр65 в присутствии 0,04 М свежеприготовленной мочевины. Анти-СГО49й и анти-СО28 моноклональные антитела (ΒΌ) добавили для ко-стимуляции в соответствии с протоколом производителя. Активацию УЗЬ- или рр65специфических СГО8' Т-клеток детерминировали (определили) путем межклеточного ΙΡΝ-γ окрашивания с применением клеточного сортера с активацией флуоресценции. Секрецию цитокинов из активированных клеток ингибировали путем добавления 10 мкг/мл брефелдина А (сигма) в течение последних 4 ч стимуляции. Следующие реагенты использовали для проточного цитометрического анализа, если не указано иначе: флуоресцинизотиоцианат (Р1ТС-конъюгированное анти-СЭ8 (клон В9.11), фикоэритринтехасский-красный (ЕСО)-конъюгированное анти-СГО3 (клон ИСНТ1) и фикоэритрин (РЕ)конъюгированное анти-ΙΡΝ-γ антитело (клон 45.15) (все - Весктап СоиДет). Межклеточные маркеры окрасили после окрашивания поверхностных маркеров, фиксации и пермеабилизации клеток. Окрашенные клетки пропустили через проточный цитометр РАСЗ Ерюк ХЬ МСЬ (Весктап СоиДет). Пропускание живых лимфоцитов и СГО3' событий осуществили во время забора. Для каждого анализа взяли до 2х10⁶ событий. Результаты оформили в процентном выражении от пропущенных СГО8' Т-клеток, производящих ΙΡΝ-γ в ответ на специфическую стимуляцию.

В описании заявленного изобретения использованы следующие общепринятые сокращения терминов, обозначающих нуклеотиды и аминокислоты.

Термин полинуклеотид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает полимерную форму нуклеотидов произвольной длины, предпочтительно дезоксирибонуклеотиды (ДНК) или рибонуклеотиды (РНК). Термин эксклюзивно обозначает первичную структуру молекулы. Термин включает двух- и одноцепочечные ДНК или РНК, например полинуклеотиды - ловушки или антисмысловые полинуклеотиды, а также синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН) и ОДН с устойчивым к нуклеотидам остовом.

Термин полипептид или белок, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает полимер из аминокислот произвольной длины. Предпочтительно термин полипептид, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к полимеру аминокислот, состоящему из более чем 6 аминокислотных остатков. Термин полипептид также включает термины эпитоп, пептид, олигопептид, белок, полибелок и совокупности (агрегаций) полипептидов. Также включены те полипептиды с пост-трансляционными модификациями, например гликолизаты, ацетилаты, фосфорилаты и подобные модификации, а также химические модификации, как, например, карбамоилаты, тиокарбамоилаты, гуанидин-замещенные группы и подобные модификации. Данный термин, помимо этого, включает, например, полипептиды, которые обладают одним или множеством аналогов аминокислот (например, ненатуральные аминокислоты), полипептиды с замещенными звеньями, а также другие модификации, которые известны из уровня техники, вне зависимости от натуральности происхождения.

Термин карбамилирование, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает перенос карбамоила из карбамоилсодержащей молекулы (например, карбамоил фосфата) в акцепторную группу, как, например, аминогруппу, карбоксигруппу, сульфгидрильную группу, фосфатную группу, гидроксильную группу или имидазольную группу. Помимо этого, термин карбамилирование, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, также обозначает тиокарбамоилирование полипептидов.

Термин карбамоил, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает ацил радикал, NН₂-СΟ-. Перенос карбамоил-группы играет существенную роль в определенных биохимических реакциях; например, в орнитиновом цикле (цикле образования мочи), через карбамоил фосфат. Термин карбамоил также обозначает тиокарбамоил-группу ХН₂-С3-).

Термин цианат, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает анион NСΟ^-, полученный из циановой кислоты (НNСΟ) и любой соли циановой кислоты. Помимо этого, термин цианат относится к любому органическому соединению, содержащему моновалентную группу -ΟΟΝ, и, следовательно, к любому органическому соединению со структурой Κ-ΟΟΝ,

- 8 020583 где К - любая органическая группа (фрагмент, молекула). В частности, термин цианат также относится к изоцианату и изотиоцианату.

Термины очищенный и изолированный, в том смысле, в котором они используется в описании заявленного изобретения, обозначают тот факт, что молекула, например полипептид или последовательность нуклеиновой кислоты, присутствует в возможно полном отсутствие биологических макромолекул сравнимого типа. Термины обозначают фракционный вес требуемого продукта на уровне как минимум 65%, более предпочтительно как минимум 75%, более предпочтительно как минимум 85%, наиболее предпочтительно как минимум 95% и в наибольшей степени предпочтительно как минимум 98% от общей массы (веса) присутствующих биологических макромолекул. Помимо этого, вода, буфер и прочие небольшого размера молекулы, в особенности, молекулы с молекулярной массой менее 1000 Да, не охвачены термином биологические макромолекулы, в том смысле, в котором этот термин используется в описании заявленного изобретения.

Термин эпитоп, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает область полипептида, которая обладает свойствами антигена, и, например, выполняет функцию сайта распознавания Т-клеток или иммуноглобулинов. В контексте заявленного изобретения, эпитопы, например, представляют собой такие участки полипептидов, которые распознаются иммунными клетками, такими, как, например, иммунные клетки, к примеру, С.П4' Т-клетки, С.П8' Т-клетки, СЭ4'СЭ8' Т-клетки, П)4'С1)8'· Т-клетки, СП56+СП8+ и СП56^-СП57⁺СП8⁺ ΝΚΤ клетки или С1)4' регуляторные Т-клетки. Эпитоп может состоять из 3 или более аминокислот. Как правило, эпитоп состоит из как минимум от 6 до 7 аминокислот, или, более привычно, от 8 до 12 аминокислот, или от 13 до 18 аминокислот. Тем не менее, эпитоп может также состоять из более чем 18 аминокислот и совсем редко из более чем 30 аминокислот. Термин эпитоп также включает уникальную пространственную конформацию конкретного эпитопа. Данную пространственную конформация получают из последовательности аминокислот в области эпитопа.

Термин микроорганизм, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает вирусы, прокариотные и эукариотные микробы, как, например, архебактерии, бактерии, одноклеточные и грибки, при этом последняя группа включает, например, дрожжевые клетки и гифомицеты (нитчатые грибки).

Термин иммунные клетки, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает лимфоциты с хелперными, цитолитическими или регуляторными свойствами, как, например, СЭ4' Т-клетки, СЭ8' Т-клетки, СЭ4'СЭ8' Т-клетки, ί'.Ό4'ΤΌ8'¹ Т-клетки, СЭ4' регуляторные Т-клетки (Т-лимфоциты), ΤΌ56'ΤΌ8' и ΤΌ56Τ.Ό57'ΤΌ8' ΝΚΤ-клетки, а также ΤΌ16'ΤΌ56' ΝΚ клетки. Тем не менее, термин иммунные клетки, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, обозначает не только иммунные клетки, выращенные и воспроизводимые ίη νίίτο в культуральной среде, но также и популяции иммунных клеток, взятые из здоровой донорской крови, пациента или животного, а также соответствующим образом очищенные иммунные клетки.

Термин полипептид-специфические Т-клетки, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится ко всем типам Т-клеток, обладающим рецепторами для специфических сайтов связывания специфических полипептидов, как, например, С'.П4' Т-клетки, СЭ8' Тклетки и СП4' регуляторные Т-клетки. Термин полипептид-специфические Т-клетки также относится к эпитоп-специфическим, антиген-специфическим и иммуноген-стимулированным клеткам.

Термин СП4' Т-клетки, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к Т-хелпер-клеткам, которые либо управляют активацией макрофагов и С'.П8' Т-клеток (Тй-1 клетки), производством антител В клетками (Тй-2 клетки) или которые играют существенную роль в аутоиммунных заболеваниях (Тй-17 клетки). Дополнительно, термин СП4' Т-клетки также относится к регуляторным Т-клеткам, которые представляют примерно 10% от общей популяции С'.П4' Т-клеток. Регуляторные Т -клетки выполняют важную функцию в демпфировании (ослаблении) иммунных ответов, в предотвращении аутоиммунных заболеваний и в оральной толерантности.

Термин натуральные регуляторные Т-лимфоциты или регуляторные Т-клетки, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к Тгед, Тй3 и Тг1 клеткам. Тгед характеризуются экспрессией поверхностных маркеров С.П4. С.П25. ЦТЛА4 и фактору транскрипции Рохр3. Тй3 и Тг1 клетки представляют собой СЭ4' Т-клетки, которые характеризуются экспрессией ТСРβ (Тй3 клетки) или 1Ь-10 (Тг1 клетки) соответственно.

Термины СЭ8' Т-клетки или ЦТЛ, в том смысле, в котором они используется в описании заявленного изобретения, относятся к цитотоксичным Т-клеткам, распознающим и разрушающим дегенерированные, опухолевые и злокачественные клетки, а также тканям и клеткам, которые инфицированы микроорганизмами или паразитами. СЭ8' Т-клетки также именуют СП4^-СП8' Т-клетками или Тй-1 клетками.

Термин антиген-презентирующие клетки (АПК), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к клеткам, которые обладают способностью захвата, переработки полипептидов и презентирования фрагментов данных полипептидов (эпитопов) в иммунную систему в ассоциации с белками ГКГ класса I и ГКГ класса II. В частности, термин антиген- 9 020583 презентирующие клетки (АПК), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к профессиональным АПК, как, например, дендритные клетки, моноциты, макрофаги и В клетки, но также к непрофессиональным АПК, как, например, нейтрофилы, фибробласты, а также васкулярные эпителиальные клетки и различные эпителиальные, мезенхимные (мезенхимальные) клетки, а также микроглиальные клетки головного мозга.

Термин осажденная мочевина, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к мочевине, прошедшей предварительную обработку при некоторых режимах инкубации. В частности, предварительная обработка мочевины может включать инкубацию мочевины при температуре примерно от -20 до примерно 40°С, предпочтительно при примерно комнатной температуре в течение нескольких часов, дней, недель или месяцев и/или подогрев мочевины при температурах от примерно 40 до примерно 100°С в течение нескольких минут, часов или дней. Термин осажденная мочевина, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, предпочтительно относится к раствору мочевины с повышенной концентрацией цианата в сравнении с неосажденной мочевиной. Более предпочтительно термин осажденная мочевина, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к раствору мочевины с концентрацией цианата от примерно 0,2 до примерно 50 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 до примерно 0,9 до примерно 50 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 50 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 45 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 40 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 40 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 20 до примерно 40 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 30 до примерно 40 ммоль/л.

Термин белковые трансдукционные домены (ΡΤΌ), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к доменам и цепочкам белков, которые обладают способностью перемещать указанные белки в цитоплазму клеток. Таким образом, белковые трансдукционные домены облегчают перенос внеклеточных белков в цитоплазму клеток и, в частности, в эндогенный путь АПК процессинга именно пути ГКГ класса I. В частности, термин белковые трансдукционные домены (ΡΤΌ), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к:

(ί) натурально-белковым трансдукционным доменам, как, например, аргинин-обогащенные ΡΤΌ, включая Ηΐν Та! (трансактиватор транскрипции), ОгоюрНПа Άηίρ (ЛШсппарсФа) и ΡΤΌ-5;

(ίί) гидрофобной сигнальной последовательности (лидерному пептиду), как например, сигнальной последовательности фактора роста фибробластов, также относящемуся к мембранной трансдукционной последовательности (ΜΤδ);

(ίίί) синтетически-белковым трансдукционным доменам, как, например, лизиновым, орнитиновым и аргининовым гомополимерам, и (ίν) мембранным транслокационным доменам бактериальных токсинов, таких, как, например, дифтерийный и столбнячный токсины.

Авторами заявленного изобретения неожиданно было обнаружено, что полипептиды, инкубированные с цианатом, можно с высокой эффективностью перемещать в клетки в присутствии мочевины. Помимо этого, авторы заявленного изобретения обнаружили, что полипептиды, инкубированные с цианатом, индуцируют значительное презентирование эпитопа на белках ГКГ классов I и II в иммунных клетках в присутствии мочевины и, таким образом, обладают способностью эффективного примирования, реактивации и выращивания полипептид-специфических Т-клеток (например, СЭ4' Т-клетки и СЭ8' Тклетки).

Таким образом, заявленное изобретение относится к способу переноса полипептидов в клетки, включающему следующие этапы:

а) инкубирование полипептидов в растворе, содержащем ионы цианата, в котором ионы цианата присутствуют в концентрации от примерно 0,2 до примерно 9000 ммоль/л;

б) инкубирование клеток с полипептидами согласно этапу а) в присутствии мочевины.

Способ в соответствии с заявленным изобретением можно применять для инфильтрации полипептидов в произвольные клетки, которые являются прокариотными, например, бактерии, и эукариотными, например, грибки (дрожжи и филаментные (нитчатые) грибки), клетки насекомых, птиц, рептилий, рыб, земноводных и млекопитающих, например, клетки мышей или человека, в частности, антигенпрезентирующие клетки (АПК), как, например, дендритные клетки (например, клетки Лангерганса), моноциты, макрофаги, В-клетки, а также клетки васкулярного эндотелия и различные клетки эпителия, мезенхимные, а также клетки микроглии головного мозга.

Другим способом в соответствии с заявленным изобретением является способ детекции полипептид-специфических иммунных клеток, включающий следующие этапы:

б) инкубирование АПК-содержащих клеточных культур с полипептидами согласно этапу а) в присутствии мочевины;

в) инкубирование АПК-содержащих клеточных культур или биологических жидкостей, получен- 10 020583 ных согласно этапу б) с иммунными клетками или с биологическими жидкостями, содержащими иммунные клетки;

г) симультанную и/или специфическую детекцию и/или количественный анализ различных подтипов полипептид-специфических иммунных клеток, которые специфичны по отношению к полипептидам согласно этапу а).

АПК-содержащая биологическая жидкость предпочтительно представляет собой цельную кровь и/или жидкость. В одном из вариантов практического воплощения способа детекции согласно заявленному изобретению, АПК-содержащая клеточная культура содержит популяцию клеток костного мозга (лейкеферезат), изолированные моноцитные клетки и/или сепарированные популяции АПК, предпочтительно содержащие дендритные клетки (клетки Лангерганса), моноциты, макрофаги и/или В-клетки. Термин АПК-содержащие клеточные культуры, в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится не только к клеткам, содержащим АПК, удерживаемым и воспроизводимым ίη νίίτο в культуральной среде, но также и к клеточным популяциям, взятым у пробанда, пациента или животного и содержащим очищенные АПК. К примеру, кровь или другую АПК-содержащую биологическую жидкость можно взять у здорового донора крови или пациента. Биологическую жидкость можно использовать напрямую, согласно этапу б) способа в соответствии с заявленным изобретением или можно очистить АПК-содержащие клеточные популяции, а затем использовать их. Очищение АПКсодержащих клеточных популяций, взятых (полученных) из крови или прочих АПК-содержащих биологических жидкостей соответствует уровню развития техники и известно специалистам в соответствующей области техники.

После инкубирования АПК-содержащих клеточных культур или биологических жидкостей с карбамилированными полипептидами в присутствии раствора мочевины, клетки инкубируют с иммунными клетками или с биологическими жидкостями, содержащими иммунные клетки. Иммунные клетки или биологические жидкости, содержащие иммунные клетки, предпочтительно получают у того же самого здорового донора крови, пациента или животного, у которых получили АПК-содержащие клеточные культуры или биологические жидкости. Альтернативно, иммунные клетки или биологические жидкости, содержащие иммунные клетки, получают у здоровых доноров крови, пациентов или животных, у которых присутствует ГКГ-набор, совместимый с АПК-содержащими клеточными культурами или биологическим жидкостями. Биологические жидкости, содержащие полипептид-специфические иммунные клетки, могут представлять собой цельную кровь и/или жидкость. Полипептид-специфические иммунные клетки могут представлять собой Т-клетки (Т-лимфоциты), предпочтительно СЭ4' Т-клетки, СИ8+ Тклетки, СО4⁺СЭ8^4т Т-клетки и/или СЭ4' регуляторные Т-клетки, и/или они могут представлять собой прочие иммунологические клеточные популяции, предпочтительно ί'Ό56'ί'.Ό8'. СО56^-СО57⁺СО8⁺ ΝΚΤ клетки и/или СИ56+ ΝΚ клетки.

Способы получения и очищения требуемых АПК и популяций иммунных клеток соответствуют передовому уровню развития техники.

АПК-содержащая клеточная культура или биологическая жидкость, например цельная кровь, жидкость или очищенные клетки костного мозга, используемые в этапе б), уже могут содержать популяции иммунных клеток, которые необходимо подвергнуть детекции. В данном случае отпадает необходимость добавления иммунных клеток или биологических жидкостей, содержащих иммунные клетки в ходе этапа

в).

Инкубирование согласно этапу в) занимает примерно от 1 мин до примерно 240 ч или дольше, предпочтительно от примерно 2 до примерно 6 ч, или примерно от 6 до примерно 12 ч, или от примерно 12 до примерно 36 ч, или примерно от 36 до примерно 72 ч, или от 72 до примерно 240 ч при приемлемых условиях культивации, например при 37°С в атмосфере с повышенным уровнем влажности, в присутствии от 5 до 8% СО₂ в Т-клеточной среде (ΚΡΜΙ 1640 с 2 до 10% инактивированной нагреванием (30 мин, 56°С) человеческой плазмы или сыворотки эмбриона теленка (РС8), 2 мМ глутамина и 100 мг/мл канамицина или гентамицина (все компоненты производства фирмы Рап§ув1ет5, АЛепЬасН). Тем не менее, могут применяться также и другие подходящие условия, известные из уровня техники, с вариациями в составе среды, температуре, влажности воздуха, времени инкубирования.

Детекция определенных популяций полипептид-специфических иммунных клеток основана на принципе, что после специфического распознавания полипептидов, которые презентированы совместно с ГКГ белками классов ΙΙ и/или Ι на поверхности АПК, иммунных клеток, подтверждает повышенную экспрессию характеристических цитокинов, в особенности ΙΡΝ-γ и/или ΤΝΡ и/или ЕЬ-2, или 1Ь-4 и/или 1Ь-5, или 1Б-17 или ЕЬ-10 и/или ΤΟΡ-β. Как результат совмещенного анализа поверхностных белков, которые характерны для определенных популяций иммунных клеток, и цитокинов, присутствие и/или концентрация определенных популяций полипептид-специфических имуунных клеток можно подвергнуть детекции из смеси различных популяций иммунных клеток. Детекция и/или количественный анализ согласно этапу г), таким образом, происходит путем симультанной детекции поверхностных белков и цитокинов.

Таким образом, в одном из вариантов практического воплощения заявленного способа детекции и/или количественного анализа проводится путем детекции специфических поверхностных маркеров

- 11 020583 полипептид-специфических иммунных клеток и производства маркерных цитокинов, как, например, 1Ь2, ΤΝΡ, ΙΡΝ γ, 1Ь4 или 1Ь5, 1Ь10, ΤΟΡ-β. Детекцию и/или количественный анализ можно проводить методами ЕЫ§А, ЕЬРЗро! или РАС8. Альтернативно, детекцию и/или количественный анализ можно проводить путем измерения транзиентной поверхностной экспрессии СР107а,Ь или путем пролиферации Тклеток, или, в случае, если, например СР8+ Т-клетки подвергаются детекции или количественному анализу, путем проведения классического теста с радиоактивным хромом или эквивалентного нерадиоактивного теста.

Помимо этого, детекцию определенных клеточных популяций через специфические поверхностные белки можно проводить, например, через СР4 для Т-хелпер-клеток, СР8 для цитотоксических Т-клеток, СР4 и СР8 для С’Р4'С’Р8'¹ и СР4+СР8+ Т-клеток, СР56 для ΝΚ клеток, СР4 и СР25 для Тгед клеток и СР56 и СР8 или СР57 и СР8 для различных популяций ΝΚΤ клеток. Специфическое состояние клеточных популяций (необученные, активированные и клетки памяти) и степень активируемости могут быть определены путем детекции дополнительных поверхностных белков (например, СР69, СР45К0, СР45КА, ССК7) и межклеточных белков (например, гранзимов, перфоринов, РохРЗ), межклеточных цитокинов (например, 1Ь-2, ΤΝΡ, ΙΡΝ-γ, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-10, ΤΟΡ-β) или поверхностно-обученные белки, как, например, СР107а,Ь. Таким образом, специфическая детекция специфических клеточных популяций становится осуществимой в соответствии с заявленным способом. Перечисленные характеристические поверхностные маркеры для определенных клеточных популяций известны из уровня техники, как же, как и детекция и описание характеристических свойств различных популяций иммунных клеток, например, с использованием технологии ΡАСδ (клеточный сортер с активацией флуоресценции).

Специфическую активацию иммунных клеток определяют после инкубации с АПК-содержащими клеточными культурами или биологическими жидкостями, полученными в соответствии с этапом б) путем измерения любого повышенного уровня производства цитокинов активированных иммунных клеток. Например, СР4+ Т-клетки, СР8+ Т-клетки, С’Р4'С’Р8'¹ и СР4'СР8' Т-клетки, СР56' ΝΚ клетки, и СР56+СР8+ или СР57+СР8+ ΝΚΤ клетки вызывают повышение ΙΡΝ-γ после специфической стимуляции, в то время, как СР4' Τ-хелпер-клетки Т-хелпер 2 типа (ΤΗ-2) показывают повышенное производство цитокинов ЕЬ-4 и 1Ь-5. Регуляторные Т-клетки (Τκ§, Τ1ι3, Ττ1 клетки) показывают повышенную экспрессию 1Ь-10 и/или ΤΟΡ-β. Полученные цитокины можно детерминировать с использованием уже известных из техники способов, либо внутриклеточно, либо после секреции в супернатанте, с использованием, в некоторых случаях, доступных на рынке способов, например, ΡАСδ (например, внутриклеточным окрашиванием цитокинов, или анализом на секрецию цитокинов), энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ЕЫ§А) или методом иммуноферментных пятен (иммуноферментный спот-анализ ЕЫзроЕ). Детекция также возможна через другие цитокины, проивзодимые после специфической активации иммунных клеток или прочих производимых маркеров.

Активированные иммунные клетки можно определить и характеризировать, к примеру, путем проточной цитометрии (ΡΛί’δ: ΡΙιιοϊΌδίχικχ асЕуйеб се11 ксап - клеточный сортер с активацией флуоресценции). Данный способ позволяет измерить при помощи проточного цитометра флуоресцентную интенсивность отдельных (индивидуальных) клеток в смешанной клеточной популяции. Проточноцитометрический анализ клеток затем проводят с использованием системы ΡАСδ, например проточного цитометра ΡАСδ Ерюк ХЬ МСЬ и программного обеспечения Ехро 32 (ВесЮп СоиИет) или проточного цитометра ΡАСδ Сайо II и программного обеспечения Ρίνα 6.1.1. (ВескЮп Рюкшкоп).

Флуоресцеин-сопряженные, например, с К-фикоэритрином (К-РЕ), пиридин хлорофиллом с (РегСР), флуоресцеином (ΡΙΤΟ), техасским красным (ТХ), аллофикоцианином (АРС), Атсуапе, тихоокеанским голубым, Τаηάет РЕ-ТХ, Τапάет РЕ-Су5, РЕ-Су7 или Τапάет АРС-Су7, различные флуорохромы А1еха, первые или вторичные антитела приемлемы для детекции уже упомянутых характеристических поверхностных белков и цитокинов, с использованием ΡАСδ и других имеющихся на рынке способов (например, производства Вейоп Рюкшкоп, Рако, СоиНет, еВюкшепсе, Вю1едепб). В дополнение к ΡАСδ, приемлемы другие способы детерминации факта производства через иммунные клетки, к примеру методы ЕЫ§А, Ейкрор биосенсоры и определение профиля экспрессии также подходят для детекции полипептид-специфических иммунных клеток. Данные методы известны из уровня техники.

Другой способ, заявленный в данном изобретении, является способом примирования, выращивания и/или реактивации полипептид-специфических Т-клеток, включающий следующие этапы:

б) инкубирование клеток с полипептидами согласно этапу а) в присутствии мочевины и в отсутствие или в присутствии иммуномодулирующих веществ.

При данном способе полипептид-специфические Т-клетки предпочтительно представляют собой С'Р4' Т-клетки и/или СР8' Т-клетки.

Способ примирования, выращивания и/или реактивации полипептид-специфических Т-клеток можно осуществить ш νί\Ό, ш уйго и/или ех νί\Ό.

Клетки, инкубированные согласно этапу б), могут представлять собой АПК и/или Т-клетки, про- 12 020583 шедшие очистку от крови, мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) или другую биологическую жидкость, содержащую упомянутые АПК и/или Т-клетки. Альтернативно, кровь, МКПК или другую биологическую жидкость, содержащую АПК и/или Т-клетки, напрямую используют в этапе б). Кровь, МКПК или другая биологическая жидкость, содержащая АПК и/или Т-клетки, может представлять собой образец, предварительно полученный от пациента - человека или животного.

В одном из вариантов практического воплощения заявленного способа примирования, выращивания и/или реактивации полипептид-специфических Т-клеток, инкубацию по этапу б) предпочтительно осуществляют несколько раз, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или даже более раз. Повторение этапа б), в частности, предпочтительно для способа выращивания полипептид-специфических Т-клеток.

Все способы согласно заявленному изобретению основаны на инновационных технологиях, подразумевающих, что перенос полипептидов в клетки значительно улучшается в случае, если полипептиды предварительно обрабатывают вместе с цианатом, инкубируют с упомянутыми клетками в присутствии мочевины. Таким образом, данная основополагающая идея относится ко всем вышеописанным заявленным в данном изобретении способам.

Полипептиды могут быть получены (произведены) синтетически или экспрессированы в различных клетках с использованием традиционных про- или эукариотных систем экспрессии. Примерами приемлемых систем экспрессии могут служить бактерии, как, например, ВасШик киЫШк, Е. сой, 81тер1ососсик сгетопк или 81тер1ососсик йуШапк, дрожжевые клетки, как, например, СапйШа а1Ысаи5, СапйШа тайока, Напкепи1а ро1утотрйа, К1иууетотусек ГгадШк, 8ассНаготусек сегеу1К1ае, 8сН|/окассНаготусек ротйе, или Уагго\\1а йро1уйса, клетки насекомых, как, например, Аейек аедурй, АШодгарйа саШотшса, Вотйух топ, ЭгокорНИа те1аподак1ег, 8ройор1ета Ггищрегйа или ТпсНорйыа ηί, клетки млекопитающих, как, например, овариальные клетки китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (СО8), или клетки растений.

Используемые полипептиды можно очищать традиционными молекулярно-биологическими способами, например путем расщепления клеток, ферментацией нуклеиновыми кислотами, применением способов концентрирования белков, аффинной хроматографией, ионообменной хроматографией и гельхроматографией, или в сочетании с методами денатурирования полипептидов, например осаждения кислотой, обработкой мочевиной, обработкой щелочью, термической обработкой, обработкой ДСН или сонификацией. Данные способы очистки полипептидов могут дополнительно сочетаться с друг с другом в определяемой пользователем форме.

Полипептиды могут быть синтетическими, т.е. ненатурально полученными, или полученными из живых организмов, например млекопитающих, как, например, людей, приматов, мышей, крыс, кроликов, коз, овец, коров, свиней или других животных, паразитов, микроорганизмов или вирусов. Тем не менее, они также могут происходить из растений или водорослей. Помимо этого, они могут происходить из белков приона.

Полипептиды, используемые в этапе а) заявленных в данном изобретении способов, можно разделить на две группы в зависимости от присущего им свойства проникать в цитозоль (гиалоплазму) клеток, в частности АПК.

Первая группа полипептидов обладает внутренней способностью проникать в цитозоль клеток, в частности, АПК. Соответственно, такие белки перерабатываются и презентируются через путь ГКГ класса I, без каких-либо добавлений. Упомянутое присущее свойство может быть вызвано трансдукционным доменом (РТО) упомянутого белка. Упомянутый трансдукционный домен может представлять собой встречающийся в природе трансдукционный домен (РТО) или рекомбинантно добавленный трансдукционный домен. Примерами белков со встречающимся в природе трансдукционным доменом являются белки Ηΐν трансактивации или транскрипции (Та!) и Кеу, вирус простого герпеса УР22 и гомеобелок ИтокорНИа айеппареШа (сложного локуса дрозофилы, в котором локализованы гомеозисные мутации) (ап!р) (8идйа е! а1. (2008), Вг 1. РНагтасо1. 153: 1143-1152). Тем не менее, упомянутое присущее свойство также может быть вызвано естественной функцией специфической цепи полипептидов, как то тяжелой цепи токсина столбняка. Прочие примеры полипептидов с присущими свойствами проникновения в цитозоль - токсин дифтерии. В данном случае транслокация опосредуется транслокацией или Т доменом. Помимо этого, доказали, что гидрофобная сигнальная последовательность фибробластного фактора роста, также именуемая мембранной трансдукционной последовательностью (МТ8), принадлежит к другому типу проникающего в клетку пептида (СРР). Помимо этого, сопряжение полипептидов в микро узлы, антитела, липиды, белки теплового шока и аргинин-обогащенные белковые трансдукционные домены (РТО) приводит к доставке в НЬА класс I требуемых свойств АПК.

Вторая группа полипептидов не обладает присущей способностью проникновения в цитозоль клеток, в частности АПК. Такие белки не могут проникнуть в цитозоль АПК без какой-либо помощи, но остаются в эндосомальном/эндолизосомальном компартменте упомянутой АПК. Соответственно, упомянутые белки, как правило, не перерабатываются и не презентируются через путь ГКГ класса I, а перерабатываются и презентируются только через путь ГКГ класса II. Вторая группа включает подавляющее большинство встречающихся в природе и рекомбинантных искусственных человеческих, микробных, вирусных, животных или растительных белков и, в частности, соответствующие растворимые полипеп- 13 020583 тиды и полипептиды лизатов клеток, тканей, бактерий, вирусов и паразитов.

В одном варианте практического воплощения заявленного изобретения заявленные способы осуществляют с полипептидами первой группы, т.е. с полипептидами, обладающими вышеупомянутой способностью проникать в цитозоль клеток, в частности АПК. Таким образом, заявленные способы упрощают перенос полипептидов в цитозоль клеток, в частности АПК. Таким образом, эффективность переноса полипептидов можно повышать для вышеупомянутых пептидов при помощи заявленных способов.

В другом варианте практического воплощения заявленного изобретения заявленные способы осуществляют с полипептидами второй группы, т.е. с полипептидами, не обладающими вышеупомянутой способностью проникать в цитозоль клеток, в частности АПК. Для такого полипептида заявленное изобретение описывает способ, позволяющий осуществлять очень эффективный перенос полипептида в цитозоль клетки, в частности АПК.

Предпочтительными полипептидами второй группы являются все типы полипептидов, имеющих эпитопы Т-клеток, но не обладающие (ί) натуральным белковым трансдукционным доменом и/или (ιί) любым вектором или доменом, связанным с упомянутым полипептидом рекомбинантной связью, которая вызывает транслокацию полипептида в клетки, в частности АПК.

Примерами полипептидов второй группы служат микробные белки, в частности белки:

(ί) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, Ηΐν), как, например, др120, др160, р24, дад, полимераза, обратная транскиптаза и пе£;

(и) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ), как, например, ΕΒΝΑ1, ΕΒΝΑ2, ΕΒΝΑ3Α, ΕΒΝΑ3Β, ΕΒΝΑ3Ο, ΕΒΝΑ4, ΕΒΝΑ6, ΒΖΕΡ1, ΒΜΕΕ1, ΒΜΚΕ1, ΒΗΚΕ1, ΒΑΚΕ0, БКЬЕ1, ΒΙΈΕ4, др85, др110, др220/350, νΟΑ р150, ΕΒΝΑ-ΕΒ, ЬМР-1 и ЬМР-2 (например, описанные Кйаииа е1 а1. (2000), Αηηυ. Кеу, Μίοτοϋίοΐ. 54:1948);

(ίίί) цитомегаловируса (ЦМВ), как, например, иЬ123 (ΙΕ1), иЬ122 (ΙΕ-2), иЬ83 (рр65), иЬ82, НЬ99, иЬ28, иЬ33, иЬ37, И83, иЬ94, иЬ16, ϋΕ55(§Β), ИЬ85, иЬ25, И818, иЬ45 и иЬ32 (рр150) (например, описанные Стоидй е1 а1. (2009), СЬи Μίοτοϋίοΐ Кеу. 22:76-98);

(ίν) вируса ветряной оспы (ВВО), как, например, ОКЕ1, ОКЕ4, ОКЕ10, ОКЕ14, ОКЕ29, ОКЕ62 и ОКЕ68 (дБ);

(ν) Μ. Τι.ι^ΐΌΐι1ο5ί5. как, например, СЕР10, Ε8ΑΤ6, ТВ7.7, ТВ37.6, МРТ63;

(νί) борреллий бургдорфери, как, например, ОδРΑ и О8РС;

(νίί) вируса гепатита В, как, например, ΗΒδΑд и ΗΒсΑд;

(νίίί) аденовируса, как, например, Αάν5 №χοη.

Помимо этого, человеческие белки предпочтительно являются полипептидами упомянутой второй группы, например, антигены опухолевых клеток, как, например, простат-специфический антиген (Р8Л). НРК-2/пеи, муцин 1 Μϋ^1, точечно мутированный или сверхэкспрессированный дикого типа р53, ΜΑΟΕ антиген и СЕА (карциноэмбриональный антиген). Также предпочтительными полипептидами упомянутой второй группы являются белки, представляющие релевантные мишени для аутоагрессивных Т-клеток при аутоиммунных заболеваниях. Примерами таких белков в аспекте множественного склероза (аутоиммунного генеза) являются основной миелиновый белок (МВР), миелин-олигодендроцитарный гликопротеин ^ОО), протеолипид протеин (РЬР), миелин, гибридный белок ΜΒР/Р^Р (ΜР4), миелинассоциированный гликопротеин (ΜΑΟ). Примерами таких протеинов в аспекте диабета по I типу (аутоиммунного генеза) являются инсулин В, препроинсулин (РР1), ΙΑ-2, ΟΑΌ65, 1ОКР, еб4, хромогранин Α (С^Д) (например, как описано Vе1ΐЬш5 е1 а1. (2010), Э|аЬе1е5). Также предпочтительны в применении фрагменты вышеупомянутых белков в аспекте заявленных способов.

Для определения, принадлежит ли полипептид первой или второй группе, можно тестировать способность проникновения в цитозоль эукариотных клеток, в частности, АПК, методами флуоресцентной микроскопии, при которой клеточные компартменты и полипептиды можно определить как флуоресцент-конъюгированные. Соответствующие способы известны специалистам в области техники и описаны, к примеру, в Кар1ап е1 а1. (ίοιΐΓη;·ι1 ο£ СогИгоПеб Ке1еа5е 102 (2005) 247-253) и в \УО 99/55899.

Полипептиды согласно этапу а) в соответствии с заявленными способами можно использовать в произвольных концентрациях. Предпочтительно концентрация составляет от примерно 0,01 до примерно 200 мкг/мл или выше, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мкг/мл, от примерно 0,1 до примерно 0,5 мкг/мл, от примерно 0,5 до примерно 2 мкг/мл, от примерно 2 до примерно 10 мкг/мл, от примерно 10 до примерно 50 мкг/мл или от примерно 50 до примерно 200 мкг/мл. Наиболее предпочтительны полипептидные концентрации от примерно 0,1 до примерно 50 мкг/мл, более предпочтительны от примерно 1 до примерно 40 мкг/мл, от примерно 3 до примерно 30 мкг/мл или от примерно 5 до примерно 20 мкг/мл. В наибольшей степени предпочтительна полипептидная концентрация примерно 10 мкг/мл.

Предварительная обработка полипептидов с цианатом согласно этапу а) в заявленных способах приводит к карбамилированию аминогрупп полипептидов. Карбамилирование представляет собой перенос карбамоила из карбамоилсодержащей молекулы (например, карбамоил фосфата) в акцепторную группу, как, например, аминогруппу, карбоксигруппу, сульфгидрильную группу, фосфатную группу, гидроксильную группу или имидазольную группу. Карбамоил представляет собой ацил радикал со структурой ΝΗ₂-ί'Ό-. Тем не менее, карбамилирование может также осуществляться с участием тиокар- 14 020583 бамоильной группы со структурой ΝΗ₂-ί'.'δ-.

Карбамилирование полипептида в соответствии с заявленным изобретением может представлять собой карбамилирование аминогруппы, карбоксигруппы, сульфгидрильной группы, фосфатной группы, гидроксильной группы или имидазольной группы. Более предпочтительно карбамилирование полипептидов в соответствии с заявленным изобретением представляет собой карбамилирование простейших аминогрупп полипептида, в частности конечной аминогруппы и эпсилон-аминогруппы остатков лизина. Альтернативно, или дополнительно, можно карбамилировать гидроксильную группу тирозина, сульфгидрильную группу цистеина, карбоксильную группу аспарагиновой и глутаминовой кислот и имидазольной группы гистидина.

Реакция карбамилирования может протекать путем инкубирования полипептидов в растворе, содержащем цианат. В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения концентрация цианата составляет от примерно 0,3 до примерно 5000 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или от примерно 0,9 до примерно 5000 ммоль/л, от примерно 1,2 или от примерно 5 до примерно 5000 ммоль/л, от примерно 2 до примерно 5000 ммоль/л, от примерно 10 до примерно 4000 ммоль/л, от примерно 25 до примерно 3000 ммоль/л, от примерно 100 до примерно 2000 ммоль/л или от примерно 500 до примерно 1000 ммоль/л. Наиболее предпочтительны концентрации цианата от примерно 1 до примерно 1000 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 900 ммоль/л, от примерно 10 до примерно 800 ммоль/л, от примерно 20 до примерно 700 ммоль/л или от примерно 50 до примерно 600 ммоль/л. В частности, предпочтительны концентрации цианата от примерно 100 до примерно 500 ммоль/л, как, например, концентрации цианата от примерно 100, примерно 150, примерно 200, примерно 250, примерно 300, примерно 350, примерно 400, примерно 450 или примерно 500 ммоль/л.

Время инкубации согласно этапу а) в соответствии с заявленными способами, может составлять от примерно нескольких минут до нескольких часов, дней, недель или месяцев. Инкубирование может проходить при температуре от примерно -20 до примерно 100°С, предпочтительно от примерно комнатной температуры до примерно 96°С или от примерно 40 до примерно 96°С. Инкубация при низких температурах требует более продолжительного времени инкубирования, а при высоких температурах - более короткого времени инкубирования, в частности, вследствие того факта, что полипептиды распадаются в случае, если их инкубируют при высокой температуре в течение длительного времени. Предпочтительна температура инкубации от примерно комнатной температуры до примерно 60°С, от примерно 30 до 50°С или от примерно 37 до 45°С. Наиболее предпочтительна температура инкубации примерно 40°С. Таким образом, предпочтительным является время инкубации от примерно 5 мин до примерно 24 ч или от примерно 30 мин до примерно 2 ч. В особенности, предпочтительно время инкубации 1 ч.

В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения полипептид инкубируют для карбамилирования в растворе мочевины, содержащем цианат. Предпочтительно концентрация мочевины в упомянутом растворе мочевины составляет от примерно 0,01 до примерно 8 моль/л, от примерно 0,1 до примерно 0,5 моль/л, от примерно 0,5 до примерно 5 моль/л или от примерно 5 до примерно 8 моль/л.

Концентрация цианата свежеприготовленного раствора мочевины составляет менее 0,2 ммоль/л. Тем не менее, согласно этапу а) заявленных способов полипептиды необходимо инкубировать в растворе с концентрацией цианата на уроне примерно 0,2 ммоль/л. Предпочтительным является раствор, содержащий мочевину с концентрацией цианата от примерно 0,2 до примерно 50 ммоль/л, более предпочтительно от примерно 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или примерно 0,9 до примерно 50 ммоль/л, от примерно 1 до примерно 50 ммоль/л, от примерно 2 до примерно 45 ммоль/л, от примерно 5 до примерно 40 ммоль/л, от примерно 10 до примерно 40 ммоль/л, от примерно 20 до примерно 40 ммоль/л или от примерно 30 до примерно 40 ммоль/л.

С целью повышения концентрации цианата в растворе мочевины возможны следующие способы.

В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения концентрация цианата в растворе мочевины повышается путем инкубирования упомянутого раствора мочевины при специфических условиях инкубации. Мочевина в растворе находится в равновесном состоянии с цианатом аммония. Форма, которая вступает в реакцию с аминогруппами полипептидов, представляет собой изоциановую кислоту. Изоциановая кислота реагирует с Ν-концом полипептидов и боковыми цепями остатков лизина и аргинина. Таким образом, карбамилирование полипептидов в растворе мочевины можно сделать более эффективным путем повышения концентрации цианата в упомянутом растворе мочевины и, таким образом, путем манипуляций равновесной реакции мочевины и цианата аммония. На течение упомянутой равновесной реакции могут оказывать влияние нагрев и/или время инкубации.

Накопление цианата в водных растворах мочевины было подробно проанализировано Мапег и соавторами (Мапег е1 а1. (1964), Апа1у11са1 ВюсйетМгу 7:304). Они описали, что максимальный уровень цианата был достигнут при 25°С приблизительно по истечении 60 дней. При заданной концентрации мочевины максимальный уровень цианата при 25°С составлял приблизительно 60% от полученного при 38°С (7 дней) и приблизительно 23% от полученного при 85°С (50 мин).

- 15 020583

Для увеличения концентрации мочевины в растворе мочевины можно инкубировать раствор мочевины в течение от примерно нескольких минут до примерно нескольких часов, дней, недель или месяцев. Инкубация может происходить при температурах от примерно -20°С до примерно 100°С, от примерно комнатной температуры до примерно 98°С, от примерно 37 до примерно 96°С, от примерно 40 до примерно 96°С или от примерно 70, 80 или примерно 90 до примерно 96°С. Для повышения концентрации цианата, очевидно, что инкубация при низких температурах требует длительного времени инкубации, в то время как инкубация при высоких температурах требует более короткого времени инкубации. Например, инкубация при -20°С может занять от примерно нескольких недель до нескольких месяцев, в то время как инкубация при 96°С может занять от примерно нескольких минут до примерно 1 ч или нескольких часов.

Если описанный выше предварительно обработанный раствор мочевины используют в инкубации согласно этапу а) в заявленных способах, инкубация согласно этапу а) происходит предпочтительно при температурах от примерно комнатной температуры до примерно 100°С, от примерно 30 до примерно 70°С или от примерно 37 до примерно 40°С. Таким образом, предпочтительно время инкубации от примерно 5 мин до примерно 48 ч. Тем не менее, более предпочтительно время инкубации от примерно 30 мин до примерно 24 ч.

В другом варианте практического воплощения заявленного изобретения концентрацию цианата в растворе мочевины повышают в течение этапа инкубации а) заявленных способов. Таким образом, полипептиды можно инкубировать в растворе мочевины в течение от примерно нескольких минут до примерно нескольких часов, дней, недель или месяцев. Инкубация может проходить при температурах от примерно -20 до примерно 100°С, от примерно комнатной температуры до примерно 96°С или от примерно 40 до примерно 96°С. Для повышения концентрации цианата очевидно, что инкубация при низких температурах требует длительного времени инкубации, в то время, как инкубация при высоких температурах требует более короткого времени инкубации. Тем не менее, необходимо учитывать возможность деградации (распада) полипептида при более высоких температурах. Предпочтительно, например, время инкубации от примерно 20 мин до примерно 4 ч или от примерно 30 мин до примерно 2 ч. В особенности, предпочтительно время инкубации от примерно 1 ч при температуре примерно 96°С. Также предпочтительно время инкубации от примерно 1 до примерно 3 ч, предпочтительно 2 ч при температуре от примерно 60 до примерно 90°С, в особенности предпочтительно от примерно 70 до примерно 80°С.

Приемлемые для инкубации условия повышения концентрации цианата в чистом растворе мочевины или в растворе мочевины, содержащем полипептиды. Можно определить путем измерения концентрации цианата. Способы измерения концентрации цианата известны из уровня техники специалисту в данной области техники (см. е.д. Мапег е1 а1. (1964), Апа1уЕса1 ВюсНетЩгу 7:304).

Значение рН согласно этапу а) в заявленных способах предпочтительно находится от примерно 3,0 до примерно 9,0, более предпочтительно примерно 3,9, 6,8 или 8,7. В частности, карбамилирование фосфатных групп можно улучшить путем повышения значения рН. Тем не менее, карбамилирование лизиновых групп происходит предпочтительно при кислых значениях рН.

Еще в одном из вариантов практического воплощения карбамилирование полипептида достигается применением методов количественного карбамилирования полипептидов, описанных Апде1 и соавторами (Апде1 е1 а1. (2007), ВарИ Соттип. Маев 8рес1гот. 21:1623). Соответственно, полипептиды растворяют в 100 мкл 8 М мочевины, 200 мМ ТГ15-НС1, рН 7,4. Данный раствор восстанавливают с 20 мМ дитиотреитола (ДТТ) в течение 2 ч при 50°С, с последующим карбамидометилированием с 45 мМ иодоацетамида (ИДА) при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор денатурируют, восстанавливают и алкилированные полипептиды растворяют 1:8 с 50 мМ бикарбоната аммония с целью коррекции концентрации мочевины до 1 М и инкубируют в течение ночного времени суток при 37°С. После расщепления (настаивания) раствор просушили и растворили в 300 мкл 8 М мочевины, 200 мМ Тт15-НС1, рН 8,5. После этого образцы перемешали на вортексе до полного растворения и затем инкубировали в течение 4 ч при 80°С с периодическим перемешиванием образцов.

В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения цианат добавляют к раствору мочевины согласно этапу а) заявленных способов. Таким образом, конечная концентрация цианата находится в предпочтительных пределах от примерно 1 до примерно 1000 ммоль/л. Более предпочтительна концентрация цианата от примерно 5 до примерно 900 ммоль/л, от примерно 10 до примерно 800 ммоль/л, от примерно 20 до примерно 700 ммоль/л или от примерно 50 до примерно 600 ммоль/л. В частности, предпочтительна концентрация цианата от примерно 100 до примерно 500 ммоль/л, как, например, концентрация цианата примерно 100, примерно 150, примерно 200, примерно 250, примерно 300, примерно 350, примерно 400, примерно 450 или примерно 500 ммоль/л.

В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения карбамилирование полипептида согласно этапу а) можно получить путем инкубации полипептида в цианате щелочных металлов, органическом цианате или органическом изотиоцианате в щелочной среде. Время инкубации может занимать от нескольких минут до примерно 36 ч, предпочтительно от примерно 30 мин до примерно 24 ч, предпочтительно от примерно 1 до примерно 12 ч. Температура инкубации предпочтительно составля- 16 020583 ет как минимум примерно 20°С, примерно 30°С, примерно 40°С или примерно 50°С. Значение рН предпочтительно составляет от примерно 7 до 11, более предпочтительно от примерно 8 до примерно 10. Предпочтительно использование цианово-кислого калия, цианово-кислого натрия, цианово-кислого серебра или β-ΕδΙπιύίοΙ 6 ох1те (конъюгат изоцианата БСА флуоресцеина).

Карбамилированные полипептиды затем применяют для инкубирования клеток согласно этапу б) заявленных способов. Количество полипептида, используемого в расчете на приблизительно 10⁶ клеток, должно составлять от примерно 0,1 до примерно 200 мкг или выше, от примерно 0,1 до примерно 200 мкг, от примерно 0,1 до примерно 2 мкг, от примерно 0,1 до примерно 10 мкг, от примерно 10 до примерно 50 мкг или от примерно 50 до примерно 200 мкг полипептида.

В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения концентрация мочевины согласно этапу б) составляет от примерно 0,001 до примерно 0,8 моль/л, предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 0,2 моль/л, от примерно 0,001 до примерно 0,1 моль/л, от примерно 0,001 до примерно 0,01 моль/л, от примерно 0,01 до примерно 0,2 моль/л, от примерно 0,01 до примерно 0,1 моль/л или от примерно 0,1 до примерно 0,8 моль/л. Тем не менее, концентрация мочевины также может составлять менее 0,001 моль/л. В случае присутствия общего большого количества жизнеспособных (живых) клеток, и если соотношение живых клеток к фиксированным получается в пользу доминирования живых клеток, концентрация мочевины согласно этапу б) должна составлять менее чем приблизительно 0,8 моль/л, предпочтительно менее чем приблизительно 0,3 моль/л. Наиболее предпочтительна концентрация мочевины согласно этапу б) от примерно 0,01 до примерно 0,1 моль/л, от примерно 0,015 до примерно 0,09 моль/л, от примерно 0,02 до примерно 0,08 моль/л, от примерно 0,025 до примерно 0,07 моль/л, от примерно 0,03 до примерно 0,06 моль/л или от примерно 0,035 до примерно 0,05 моль/л. Наиболее предпочтительна концентрация мочевины согласно этапу б) на уровне примерно 0,04 моль/л.

Помимо этого, раствор мочевины согласно этапу б) заявленных способов может дополнительно содержать №С1, предпочтительно в концентрации в пределах примерно от 0,25 до примерно 200 ммоль/л или от примерно 0,25 до примерно 75 ммоль/л. Альтернативно или дополнительно, раствор мочевины согласно этапу б) заявленных способов может содержать ДТЭ или ДТТ, предпочтительно с концентрацией от примерно 0,25 до примерно 200 нмоль/л или от примерно 0,25 до примерно 75 нмоль/л. Кроме того, концентрация ДТЭ или ДТТ может составлять менее 0,25 или выше 200 нмоль/л.

Карбамилированные полипептиды инкубируют с клетками согласно этапу б) по заявленному изобретению, предпочтительно в течение примерно от 1 мин до примерно 240 ч или дольше, предпочтительно в течение примерно от 2 до примерно 6 ч, или от примерно 6 до примерно 12 ч, или от примерно 12 до примерно 36 ч, или от примерно 36 до примерно 240 ч.

В другом варианте практического воплощения заявленных способов инкубацию согласно этапу б) проводят в среде, содержащей липополисахариды (ЛПС). Активность ЛПС согласно этапу б) предпочтительно составляет от примерно 0,001 до примерно 10000 ед./мл, примерно от 0,01 до примерно 8000 ед./мл, от примерно 0,2 до примерно 6000 ед./мл, примерно от 1 до 1000 ед./мл или от примерно 10 до 100 ед./мл.

Инкубация полипептидов согласно этапу а) приводит к повышению молекулярного веса полипептидов и/или сдвигу значения рК₁ полипептида в сторону более кислотного значения рК₁.

Для подтверждения факта карбамилирования обработанных полипептидов согласно этапу а) и наличия повышенного молекулярного веса в сравнении с некарбамилированными полипептидами, могут применять традиционные способы, известные специалистам в области техники. Например, сравнение молекулярного веса могут анализировать путем сепарации и анализа δ^δ-ΡΑСΕ (анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), анализа ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ (времяпролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы в масс-спектрометрии) или ЯМРспектроскопия (ядерная магнитно-резонансная спектроскопия).

Анализ ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ представляет собой метод, при котором копреципитат УФ-абсорбирующей матрицы и биомолекулу облучают наносекундным импульсным лазером. Большую часть энергии лазера абсорбируется матрицей, что предотвращает нежелательную фрагментацию биомолекулы. Ионизированные биомолекулы ускоряются в электрическом поле и поступают в пролетную трубку. Во время пролета в данной трубке различные молекулы сепрарируют в соответствии с их весом (в зависимости от удельного заряда) и достигают детектора в различное время. Таким образом, каждая молекула производит характерный сигнал. Метод применяют для детекции и описания характеристических свойств биомолекул, как, например, белков, пептидов, олигосахаридов и олигонуклеотидов, с молекулярным весом от 400 до 350,000 Да.

Например, значения рК₁ можно сравнить и проанализировать путем двумерного электрофореза.

Метод детекции полипептид-специфических Т-клеток в соответствии с заявленным изобретением применим в различных научно-исследовательских и медицинских областях, например, для анализа, в диагностике и лечении. Применяя заявленный способ, можно определить одновременно различные популяции полипептид-специфических иммунных клеток, например, для мониторинга (контроля) эффективности терапевтических и профилактических вакцинаций или индуцирования иммунных клеток, для

- 17 020583 определения эффективности терапевтического лечения заболеваний с применением иммунных клеток, с целью скринингового отбора безопасных и эффективных медикаментозных средств, которые вызывают делецию анергических иммунных клеток или приводят к общему подавлению иммунитета, с целью мониторинга и диагностики заболеваний, вызванных микроорганизмами и паразитами, включающими иммунные клетки, с целью мониторинга и диагностики хронических воспалительных заболеваний с применением иммунных клеток, с целью мониторинга и диагностики иммунных клеток, специфических к опухолевым антигенам, с целью мониторинга и диагностики иммунных клеток, которые играют роль при отторжении трансплантатов, с целью диагностики аутоиммунных заболеваний или специфического отбора доноров крови для испытаний вакцин и клинических испытаний терапевтических средств. Предпочтительно способ детекции в соответствии с заявленным изобретением осуществляется ίη νίίΓο или ех νίνο.

Способ в соответствии с заявленным изобретением можно применять у всех позвоночных, которые вырабатывают иммунные клетки, в особенности Т-клетки, в особенности у человека, приматов и грызунов. Полипептид-специфические иммунные клетки можно детектировать и количественно определить, к примеру, при взятии у пациентов, страдающих от микробных инфекций, опухолевых заболеваний, хронических воспалительных заболеваний, отторжения трансплантатов или аутоиммунных заболеваний или же у здоровых доноров крови или участников группы клинических испытаний. Дополнительно, эпитопспецифические Т-клетки можно детектировать с использованием клеток, полученных заявленным способом, предпочтительно, АПК, полученные у приматов или других животных, которые вырабатывают эпитоп-специфические иммунные клетки.

Способ детекции полипептид-специфических иммунных клеток в соответствии с заявленным изобретением можно применять в диагностике микробных инфекций, аутоиммунных заболеваний, отторжений трансплантатов и опухолевых заболеваний.

В сравнении с уже известными способами детекции полипептид-специфических иммунных клеток заявленный способ характеризуется следующими преимуществами.

(1) Одновременно можно подвергать детекции различные популяции полипептид-специфических иммунных клеток.

(2) Детекцию различных популяций полипептид-специфических иммунных клеток можно проводить на образцах небольшого объема.

(3) Одновременно можно определить количественные и качественные характеристики различных популяций полипептид-специфических иммунных клеток.

(4) Отсутствуют ограничения по выбору специального оборудования, т.е. способ можно осуществить при помощи имеющегося в свободной продаже и постоянно используемого во многих диагностических лабораториях оборудования (РЛС8, ЕЫ8А-, ЕЫ§ро!).

(5) Способ можно повсеместно применять для детекции реактивных полипептид-специфических иммунных клеток, вне зависимости от НЬА-констелляции донора крови/пациента.

(6) Диагностический способ в соответствии с заявленным изобретением примемлем для детерминации пациент-специфической реактивности лимфоцитов по сравнению с комплексным полипептидом. В данном случае при осуществлении способа отпадает необходимость определения структур-мишеней данных иммунных клеток.

(7) В сравнении с традиционными методами диагностики, основанными на стимуляции Т-клеток с пептидами, растворимыми белками, клеточными лизатами, экспрессионными плазмидами или РНК, данный способ детекции полипептид-специфических иммунных клеток можно применять повсеместно, является намного более простым в применении, значительно менее затратен в финансовом и временном аспектах и более точен.

Способ улучшенного примирования, выращивания и реактивации специфических к полипептиду Тклеток в соответствии с заявленным изобретением можно применять в диагностических, терапевтических и профилактических целях. В частности, реактивация специфических к полипептиду Т-клеток является наиболее важным этапом детекции и/или количественного анализа специфических к полипептиду Тклеток в диагностических целях. В сравнении, выращивание специфических к полипептиду Т-клеток можно применять для подготовки клеток для терапевтических или исследовательских целей.

В частности, полипептиды, полученные согласно этапу а) в соответствии с заявленными способами, можно использовать для примирования и реактивации специфических к полипептиду Т-клеток ίη νίνο для, к примеру, лечения или предотвращения заболеваний. Предпочтительно полипептиды, полученные согласно этапу а) в соответствии с заявленными способами, можно использовать в качестве профилактических или лечебных вакцин. В связи с этим, полипептиды, полученные согласно этапу а) в соответствии с заявленными способами, предпочтительно диализируют в буферсодержащей мочевине, предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 0,2 моль/л, более предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 0,1 моль/л. Кроме того, буфер содержит предпочтительно ФСБ. Более предпочтительно упомянутый буфер не содержит двухвалентные ионы.

Таким образом, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептиды согласно этапу а) и предпочтительно подвергнутые вышеописанному диализу в буферсо- 18 020583 держащей мочевине, предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 0,2 моль/л, более предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 0,1 моль/л. Более того, буфер содержит предпочтительно ФСБ. Более предпочтительно упомянутый буфер не содержит двухвалентные ионы. Кроме того, фармацевтическая композиция предпочтительно содержит адъюванты или иммуностимулирующие вещества. Предпочтительно фармацевтическая композиция применима для введения пациенту, предпочтительно путем инъекции. Фармацевтическая композиция предпочтительно применима для использования в качестве вакцины или для лечения и профилактики инфекционных заболеваний и/или опухолей.

Кроме того, заявленное изобретение относится к применению клеток, полученных в соответствии с заявленными способами, в различных областях. Клетки, обработанные в соответствии с заявленными способами, можно применять в исследовательских, диагностических и лечебных целях и профилактике заболеваний у животных и человека. Например, АПК, полученные с применением заявленных способов, применимы в терапевтических и профилактических целях для борьбы с инфекционными заболеваниями и опухолями.

В еще одном аспекте заявленное изобретение относится к применению заявленных способов в совокупности различных научно-исследовательских, медицинских и диагностических областях, например, для:

(а) исследования важности роли данных полипептидов в клеточных процессах, (б) индукции гуморального и клеточного иммунных ответов в экспериментах с участием животных и у человека, (в) получения сыворотки и антител в диагностических, терапевтических и профилактических целях, (г) индукции достаточно эффективных иммунных ответов для защиты от или в лечении микробных инфекций и опухолевых заболеваний, (д) терапевтических и профилактических вакцин или (е) стимуляции ех νί\Ό Т-клеток в диагностических, терапевтических и профилактических целях, (ж) идентификации неоструктур-мишеней (эпитопов) цитотоксических Т-клеток.

Таким образом, заявленное изобретение относится к применению карбамилированных полипептидов для индуцирования специфических Т-клеток у животных, в особенности у млекопитающих, например мышей, крыс, кроликов, овец, коз, лошадей, рогатого скота, свиней, собак, кошек и приматов. Карбамилированные полипептиды можно также применять для индукции клеточных иммунных ответов у человека. В данном случае карбамилированные полипептиды можно вводить по отдельности или в сочетании в иммуностимулирующими агентами (адъювантами) или иммуномодулирующими веществами (например, липополисахаридами (ЛПС)) и/или в сочетании с мочевиной.

Наиболее приемлемыми адъювантами и иммуномодулирующими стимулирующими агентами для повышения эффективности описанных выше сочетаний вакцин и вакцин, являются, например: (1) гелеподобные адъюванты, как, например, алюминиевые соли, как, например, гидроокись алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и фосфат кальция; (2) микробные адъюванты, как, например, бактериальные нуклеиновые кислоты и синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН), включая СрС-мотивы (например, СрС 1668 или СрС 2216; (^а1Ыег е! а1. (2008), Еигор. 1. 1ттипо1. 38:3127), эндотоксины, как, например, монофосфорил липид А, экзотоксины, как, например, токсины дифтерии, холеры, столбнячный токсин, термолабильный энтеротоксин Е.соН и мурамоил дипептиды, как, например, МЭР; (3) масляные эмульсии и вакцины на основе эмульсий, как, например, неполный адъювант Фрейнда (1РА), МР59, 8АР и ВЫ™ адъювантные системы (ВА8), (Βίόί 1ттипосЬет, НатЫоп. Моп!.); (4) некоторые адъюванты, как, например, иммуностимулирующие комплексы (18СОМ8), липосомы, РЬС полимеры, биоразлагаемые микросферы и сапонины (08-21). и синтетические адъюванты, как, например, неионные блок-полимеры, аналоги мурамилпептидов, полифасфазен и синтетические полинуклеотиды и (5) цитокины, например интерлейкины (1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-12, помимо прочих), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор/макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р) или колониестимулирующий фактор макрофагов (М-С8Р), а также фактор некроза опухолей (ΤΝΡ). В дополнение к адъювантам могут применяться все прочие вещества, которые оказывают иммуностимулирующий эффект повышения эффективности составов упомянутых вакцин. Перечень применимых доступных на рынке адъювантов доступен во всемирной сети Интернет по адресу (1Шр://\у\у\у.Ьу1.Ы.11Ибе/пп_510850/ЕШ)4_Р1ап1Рго1ес1юпРгсЫ.1с18/03_Р1ап1Ве8181апсе1тргоуег8А1ИА0ц.1Уап ΐ8/04_^^8ΐАά^иνапΐ8/^^8ΐАά^иνапΐ8_поάе.Ьΐт1_ппп=ΐ^ие).

Упомянутые сочетания (комбинации) вакцин (например, карбамилированные полипептиды в соединении с фармацевтически приемлемым компонентом-носителем и/или адъювантом) добавляют к растворам, как, например, водные, солевые растворы, глицерол, этанол. Дополнительно, в данных композициях могут присутствовать добавочные компоненты, как, например, увлажняющие и эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и прочие подобные компоненты.

Сочетания вакцин можно комбинировать в бустерных режимах с прочими вакцинами, например пептидами, рекомбинантными белками, ДНК-экспрессионными плазмидами, рекомбинантными вирусами и бактериями и жизнеспособными аттенюированными (ослабленными) патогенами. Данные комбинации вакцин обычно присутствуют в приемлемой для инъекций форме, либо в качестве жидких раство- 19 020583 ров, либо суспензий.

Иммуногенные композиции можно эмульгировать или включать в липосомы с целью повышения адъювантных свойств, в соединении с фармацевтически приемлемым компонентом-носителем. Вакцинные композиции можно вводить различными приемлемыми путями, например перорально, наружно, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутриартериально, подкожно, интраназально, внутрикожно или кожно. Вакцинную композицию вводят согласно инструкциям. Определение подходящей дозировки для различных организмов соответствует современному уровню техники. Упомянутую вакцинную комбинацию могут применять в профилактических или терапевтических целях. Кроме того, АПК, модифицированные с применением карбамилированных полипептидов, приемлемы для использования в терапевтических и профилактических целях. Способы получения и выращивания АПК ех νίνο, а также для реинфузии модифицированных ех νίνο АПК в организм, описаны в многочисленных публикациях и соответствует современному уровню техники.

Нижеследующие примеры объясняют суть заявленного изобретения без ограничения касательно сути заявленного изобретения.

Пример 1. Карбамилирование полипептидов путем обработки с мочевиной при высокой температуре.

Очищенный ШУ капсидный белок р24 (0,84 мг/мл; растворенный в 150 мМ ИаС1, 50 мМ ИаР, рН

7.6) , имеющийся в свободной продаже альбумин бычьей сыворотки (БСА; альбуминовая фракция У, Аррйсйет); (1 мг/мл в Н₂О) или частицы парвовируса В19 УР2 (Ыпйпег е1 а1. (2008), 1оигпа1 οί Шесйоиз О1зеазез, 198:1677); (0,64 мг/мл растворили в 38% (по весу) СзС1) смешали 1:1:1 (по объему) либо с Н₂О и 30 мМ трис рН 3,9 или 6 М свежеприготовленного раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 и затем инкубировали в течение 60 мин при 96°С в термошейкере (300 об/мин). Затем, белки сепарировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 12,5% (НТУ р24) или 10% (РАОЕ) (БСА, Парвовирус В19 УР2) и белки визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. Сепарацию белков при помощи δΌδ РАОЕ и окрашивание белков осуществили в соответствии с практикумом Мо1еси1аг с1отп§: А 1аЬога1огу тапиа1, йигй еййюп (ЗатЬгоок е1 а1. (2001), Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу, Ие\у Уогк).

Данные опыты показали, что инкубация с мочевиной при высоких температурах приводит к химической модификации полипептидов, как показано при помощи измененной миграции в δΌδ полиакриламидном геле. Таким образом, различные полипептиды, например НТУ р24, БСА и парвовирус В19 УР2 показали значительное различие в наблюдаемом сдвиге массы, в зависимости от числа участков карбамилирования и его эффективности.

Пример 2. Карбамилирование полипептидов в соответствии с различными протоколами карбамилирования.

Доступный в свободной продаже БСА (1 мг/мл в Н₂О) смешали 1:1:1 (по объему) с Н₂О/НС1 (рН

3.6) и 30 мМ Тпз рН 3,6 или с 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,6 и инкубировали образцы в течение 0 мин, 30 мин или 60 мин при 96°С в термошейкере (300 об/мин). Альтернативно, БСА обработали в соответствии с протоколом карбамилирования белков, описанным Апде1 и соавторами (Апде1 е1 а1. (2007), Кар1й Соттип. Мазз 8рес1гот. 21:1623). 10 нмоль БСА растворили в 100 мкл 8 М мочевины/200 мМ трис-НС1, рН 7,4. Данный раствор восстановили с 20 мМ дитиотреитола (ДТТ) в течение 2 ч при 50°С, с последующим карбамидометилированием с 45 мМ иодоацетамида (ИДА) при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор денатурированных, восстановленных и алкилированных белков разбавили 1:8 с 50 мМ бикарбоната аммония с целью коррекции концентрации мочевины до 1 М и инкубировали в течение ночного времени суток при 37°С. Затем, раствор просушили и растворили в 300 мкл 8 М мочевины/200 мМ трис-НС1, рН 8,5. Затем, образцы подвергли перемешиванию на вортексе до полного растворения, после чего инкубировали в течение 4 ч при 80°С, с периодическим перемешиванием образцов на вортексе (Апде1 е1 а1. (2007), КарМ Соттип. Мазз Зресйот. 21:1623). Затем, карбамилированные белки сепарировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 10% (РАОЕ) и визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым.

Данный опыт показывает, что инкубация БСА с мочевиной в соответствии с различными протоколами карбамилирования приводит к различной эффективности карбамилирования белков. При этом инкубация БСА с мочевиной при 96°С в течение 60 мин индуцирует более эффективное карбамилирование БСА, чем обработка с мочевиной в течение 30 мин, что подтверждается пониженной миграцией в δΌδ полиакриламидных гелях. В сравнении с обработкой с осажденной мочевиной при высоких температурах, карбамилирование по протоколу, описанному Апде1 и соавторами, индуцировало более эффективное карбамилирование БСА. Тем не менее, упомянутое карбамилирование согласно протоколу Апде1 и соавторов привело к повышенной деградации БСА. Результаты данных опытов показывают, что эффективность карбамилирования полипептидов можно контролировать с использованием различных протоколов карбамилирования, варьируя, таким образом, исходные продукты и/или время инкубации.

Пример 3. Карбамилирование БСА с мочевиной согласно различным протоколам карбамилирования приводит к появлению модифицированных БСА белков с измененным значением рК₁.

- 20 020583

3,6) и 30 мМ трис рН 3,6 или с 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,6 и инкубировали образцы в течение 0 мин, 30 мин или 60 мин при 96°С. Альтернативно, обработали БСА согласно протоколу карбамилирования белков, описанному Апде1 и соавторами (Апде1 е! а1. (2007), КарМ Соттип. Ма88 3рес!гот. 21:1623), как описано в примере 2. Затем, модифицированные БСА белки сепарировали при помощи изоэлектрического фокусирования на полосках ИЭФ 26350 УЬ, с последующим электрофорезом в 10% 3Ό3РАОЕ и визуализировали белки окрашиванием серебром. 2-Ό (двумерный) электрофорез осуществили в соответствии с руководством по эксплуатации ЬптоЬШпе¹'' Эгу31пр Κι! Гог 2-Ό е1ес1горЬоге818 \\ЬЬ ПптоЬШпе^К Эгу31пр апЬ Ехсе10е1™ 3Ό3 18-1038-63 ЕФЬоп АВ (РЬагташа Вю!есЬ) при помощи МиМрЬог II Е1ес!горЬоге818 3у§!ет (РЬагтааа) и Е1ес!горЬоге818 Ро\уег 3ирр1у ЕР3 3500 ХЬ.

Данные опыты показали, что химическая модификация БСА в соответствии с различными протоколами карбамилирования приводит к снижению изоэлектрической точки БСА. Таким образом, снижение изоэлектрической точки находится в соотношении со степенью (интенсивностью) карбамилирования. Таким образом, обработка белков согласно протоколу, описанному Апде1 и соавторами, приводит к индукции значительного сдвига изоэлектрической точки БСА, после нагрева БСА при 96°С в мочевине в течение 60 мин или нагреванию БСА при 96°С в мочевине в течение 30 мин. Дополнительно, нагрев БСА в мочевине при 96°С в течение 60 мин приводит к появлению 2 форм частично карбамилированных белков.

Пример 4. Влияние значения рН на карбамилирование БСА путем обработки с 2 М раствора мочевины.

В данном опыте альбумин бычьей сыворотки (БСА; 1 мг/мл в Н2О) смешали 1:1:1 (по объему) с 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 или 30 мМ трис рН 6,8 или 30 мМ трис рН 8,7 или альтернативно БСА (1 мг/мл в Н₂О) смешали 1:1:1 (по объему) с Н₂О и 30 мМ трис рН 3,9 или 30 мМ трис рН 6,8 или 30 мМ трис рН 8,7. Затем, образцы инкубировали в течение 2 ч при 96°С в термошейкере (300 об/мин) и сепарировали при помощи 10% 3Э3-РАСЕ. Белки визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым.

Данные опыты показали, что на химическую модификацию (частичное карбамилирование) БСА, наблюдаемое после обработки с 2 М мочевины, 10 мМ трис в течение 2 ч при 96°С, не оказывает значительного влияния значение рН, составляющее от 3,9 до 8,7.

Пример 5. Роль времени инкубации в карбамилировании БСА с мочевиной.

БСА (1 мг/мл в Н₂О) смешали 1:1:1 (по объему) с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 и инкубировали в течение от 0 до 60 мин (0, 2, 3, 4, 5, 20, 30, 45, 60 мин) при 96°С. В отдельном опыте, БСА смешали 1:1:1 (по объему) с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 и инкубировали в течение от 0 до 8 ч (0, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ч) при 96°С. Затем, сепарировали образцы при помощи 10% 3Э3-РАОЕ и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым.

Данные опыты показали, что обработка БСА с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 при 96°С приводит к зависимому от времени повышению степени карбамилирования БСА, как показано при помощи замедленной седиментации модифицированных БСА белков в 3Ό3 полиакриламидных гелях. При этом определяемое (детектируемое) повышение в молекулярной массе БСА наблюдали уже по истечении от 2 до 3 мин инкубации. Повышение в молекулярной массе БСА наблюдали в течение до 2 ч инкубации. При более поздних временных точках, обработка БСА с мочевиной при 96°С приводит к уменьшению количества детектируемого БСА белка, что предполагает несомненную деградацию модифицированного БСА.

Пример 6. Влияние температуры инкубации на карбамилирование БСА с мочевиной.

БСА (1 мг/мл в Н₂О) смешали 1:1:1 (по объему) с 6 М мочевины и 30 мМ трис рН 3,9 и инкубировали в течение 2 ч при температурах от 0 до 96°С (0, 4, 18, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96°С). После этого сепарировали образцы при помощи 10% 3Э3-РАСЕ и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым.

При описываемых условиях опытов наблюдали детектируемое карбамилирование БСА при температурах инкубации выше 60°С.

Пример 7. Модуляция изоэлектрической точки ГЕ1 белка человеческого цитомегаловируса (ЦМВ) путем обработки с осажденной мочевиной (подвергнутой нагреву в течение более 1 ч при 96°С, затем инкубировали в течение от 7 до 14 дней при комнатной температуре).

Либо 100 мкл ГЕ1 белка (0,89 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (Еоп/а)), либо ГЕ1 (в ФСБ) смешали 1:1 (по объему) с 8 М осажденной мочевины (нагретой в течение более 1 ч при 96°С, затем инкубировали в течение от 7 до 14 дней при комнатной температуре) инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Затем, белки сепарировали при помощи изоэлектрического фокусирования на полосках ИЭФ ДттоЬШпе™ Огу31пр рН 3-10, 13 см, ОЕ Неа1!Ьсаге) при 37500 УЬ с последующим 10% 3Э3-РАСЕ. Белки визуализировали окрашиванием серебром.

Результаты данных опытов показывают, что инкубация с осажденной мочой индуцирует химические модификации, снижая изоэлектрическую точку ЦМВ ТЕ1.

- 21 020583

Пример 8. Анализ МАРШ-ТОР МЗ (время-пролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы) необработанных и карбамилированных БСА.

Для МАЬП1-ТОР-мишени применили способ высушенной капли. Таким образом, растворили полипептиды в буфере (50% ацетонитрила (АЦН), сорт ЬС/№ (Л.Т. Вакег), 0,01% трифлуоруксусной кислоты (ТРА), степень чистоты для секвенирования полипептидов (АррДей ЬюкуЧепъ) и затем растворили напрямую с матричным раствором, содержащим а-циано-4-гидроксикоричную кислоту в соотношении матрица-образец от 1:1 до 10:1. После этого 1 мкл смеси матрица-образец нанесли на чашку с образцами, высушили при комнатной температуре и подвергли анализу с использованием анализатора МАРШ-ТОР 4800 р1и8 Апа1у/ег производства АррБей В1о8у81ет8. Массовые спектры зарегистрировали рефлектором Вгикег гейех У замедленной экстракцией массспектрометром МАРШ-ТОР, оборудованным цифрователем 2СН/ ЬеСгоу и 337 нм N2 лазером, используя следующие параметры: положительная полярность, ускоряющее напряжение 20 кВ; Ι3/2 17 кВ; напряжение фокусирующих линз 8,90 кВ; задержка экстракции 400 нс. Детектор пропускного типа. Примерно 100 столкновений зафиксировали в трех до пяти различных положениях в пределах одного образца. Идентификацию белков осуществили с использованием МАЗСОТ (МайгхЗаепсе) и путем поиска отпечатков соответствующих белковых масс в базе данных по белкам. Применяемые критерии поиска - фиксированная модификация карбоксиамидометилирования цистеина, вариабельная модификация окисления метионина и точность проведения опыта касательно теоретической изоэлектрической точки и молекулярного веса. Белковые скоры имеют повышенное значение при значении р менее 0,05 (значение р - возможность того, что наблюдаемое совпадение представляет собой случайное событие).

Спектры измерили у немодифицированных БСА; сдвоено-изотопическая протонированная масса 33230,3 и БСА после смешивания (1:1; по объему) с осажденной 8 М мочевиной (нагретой в течение более 1 ч при 96°С, затем инкубированная в течение от 7 до 14 дней при комнатной температуре); сдвоеноизотопическая протонированная масса 33497. Таким образом, при данных условиях реакции, обработка мочевиной БСА индуцировала сдвиг массы 226,7 Да, относительно 12,4±2 карбамилирования.

Пример 9. Анализ карбамилирования полипептидов при помощи ядерной магнито-резонансной (ЯМР)-спектроскопии.

С немеченым белком традиционно регистрируют совокупность 2Ό гомоядерных опытов: корреляционная спектроскопия (СОЗУ), ТОСЗУ и NΟΕЗΥ. Таким образом, 190 мкл раствора полипептида, 190 мкл ФСБ (Ьоп/а) и 20 мкл стандартного раствора З5 (И₂О плюс триметилсилил-2,2,3,3тетрадейтеропропионную кислоту (ТЗР)) поместили в 5 мм ампулу для ЯМР-спектроскопии (№ге11 502). Образцы гомогенно смешали путем осторожного переворачивания закрытой ампулы и проанализировали с использованием ЯМР-спектрометра Вгикег ЛУЛNСΕ ΙΙ+ 600 МГц при следующих параметрах:

Температура: 283 К (10°С)

Образец: ТXI

Метод: 500-ΧΧΧ-ΡιΙ'600-Ί'ΧΙ-\Ί № (переходы): 128 (ГО-Зресйа), а именно 16 (2И-Зрес!га)

З\УН (спектральное окно): 9591 Гц (эквивалентно 16 мг/м³)

Ό1 (время между перескоками): 2 с

Пример 10. Роль температуры и времени инкубации в карбамилировании БСА с мочевиной.

В данном опыте БСА (1 мг/мл в Н2О) смешали 1:1 (по объему) либо со свежеприготовленным раствором 4 М мочевины, либо с 4 М мочевины, предварительно обработанной в течение 1 ч при 96°С, затем быстро охладили до 40°С и выдержали в течение 10 мин при 40°С. Затем образцы инкубировали в течение 0, 2, 4 или 17 ч при 40°С в термошейкере (300 об/мин). Затем сепарировали белки при помощи 10% ЗИЗ-РАСЕ и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым.

Данные опыты показали, что свежеприготовленный раствор 4 М мочевины был менее эффективен в карбамилировании БСА, чем подогретая мочевина. Дополнительно, детектировали значительное увеличение молекулярной массы БСА по истечении 17 ч, но не ранее 2 и 4 ч после инкубации, как в случае использования свежеприготовленной, так и подогретой мочевины. При вышеописанных условиях обработанные с мочевиной БСА показали всего лишь незначительное увеличение в молекулярной массе, подтверждая частичное карбамилирование БСА.

Пример 11. Карбамилирование БСА с осажденной мочевиной.

БСА (1 мг/мл в Н2О) смешали 1:1 (по объему) с осажденной 4 М мочевиной (которую предварительно обработали в течение 1 ч при 96°С и затем инкубировали в течение 8 дней при комнатной температуре) и затем инкубировали в течение 0 до 24 ч (0, 2, 4, 6, 8, 10, 24 ч) при 40°С. Затем сепарировали образцы при помощи 10% ЗИЗ-РАСЕ и визуализировали белки окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым.

В данных опытах детектируемое увеличение молекулярной массы БСА наблюдали после 24 ч, но не после 2 до 10 после инкубации с осажденной мочевиной.

Пример 12. Химическая модификация (карбамилирование) БСА с осажденной мочевиной приводит к появлению модифицированных БСА белков, с измененным значением рК₁.

- 22 020583

БСА (1 мг/мл в Н₂О) смешали 1:1:1 (по объему) с Н₂О/НС1 (рН 3,6) и 30 мМ трис рН 3,6 или с 6 М раствора мочевины и 30 мМ трис рН 3,6 и инкубировали образцы в течение 0, 30 или 60 мин при 96°С. Альтернативно, 10 мМ БСА смешали 1:1 (по объему) с 4 М осажденной мочевины (подогретой в течение 1 ч при 96°С, затем выдержанной в течение 3 месяцев при комнатной температуре) и инкубировали в течение 20 ч при 40°С. После этого сепарировали белки при помощи изоэлектрического фокусирования на полосках ИЭФ (1ттоЫ1ше™ Огу81пр рН 3-10, 11 см, СЕ Неаййсаге) при 26350 УЬ, с последующим электрофорезом в 10% 8Э8-РАСЕ и визуализировали белки окрашиванием серебром.

Данные опыты продемонстрировали, что и нагрев смесей мочевина/БСА, и инкубация БСА с осажденной мочевиной приводит к появлению модифицированных БСА белков, с измененной изоэлектрической точкой. При описанных условиях подогрев смесей БСА/мочевина при 96°С приводит к значительно более выраженному восстановлению изоэлектрической точки, по сравнению с инкубацией БСА с осажденной мочевиной при 40°С. Дополнительно, более длительный нагрев смесей БСА/мочевина приводит к непрерывному понижению изоэлектрической точки БСА, подтверждая повышенное карбамилирование БСА.

Пример 13. Химическое карбамилирование БСА при помощи обработки с цианово-кислым калием.

В данных опытах БСА (1 мг/мл в Н₂О) инкубировали в течение 1 ч при 40°С, либо с 25, 100, 500 или 1000 мМ цианово-кислого калия в термошейкере (300 об/мин). Затем, образцы сепарировали при помощи 12,5% 8Ό8 РАСЕ и визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. В данных опытах инкубация с цианово-кислым калием индуцировала значительное увеличение молекулярной массы БСА путем карбамилирования.

Пример 14. Химическое карбамилирование БСА при помощи обработки с цианово-кислым калием.

В данных опытах В8А (1 мг/мл в Н₂О) инкубировали в течение 19,5 ч при 40°С, либо с 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 или 500 мМ цианово-кислого калия в термошейкере (300 об/мин). Затем, образцы сепарировали при помощи 10% 8Ό8 РАСЕ и визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. В данных опытах инкубация с цианово-кислым калием индуцировала значительное увеличение молекулярной массы БСА путем карбамилирования.

Пример 15. Получение и очищение 1Е1 белка человеческого цитомегаловируса (ЦМВ) в Е.соП.

С целью получения 1Е1 белка человеческого цитомегаловируса (ЦМВ) плазмиду рСЕХ-КС-1Е1 трансформировали в штамм Е.соП М15[рКер4]. Для построения рСЕХ-КС-1Е1 ген, кодирующий белок 1Е1, удалили из плазмиды ρс^NА-IЕ1 с использованием рестрикционных энзимов НЙ1б111/ЕсоР1 и обработали с энзимом К1епоте. Полученный фрагмент затем клонировали в 8та1/ЕсоР1 дигестированную плазмиду рСЕХ-КС, которую обработали с щелочной фосфатазой, до сшивания, с целью предотвращения самоотжига вектора. Для генерации ρс^NА-IЕ1, удалили кодирующую область белка 1Е1 с Крп1/ВатН1 из плазмиды рСС^1Е1 (Nеνе18 еί а1. (2004), ί. У1го1. 78:7803) и вставили в Крп1/ВатН1 дигестированную плазмиду ρс^NА3 Нпуйгодеп). Все этапы клонирования осуществили в соответствии с практикумом Мо1еси1аг с1отпд: А 1аЬога1огу тапиа1, ίΠίτά еФйоп (8атЬгоок еί а1. (2001), Со16 8ргшд НагЬог БаЬогаЮгу, Νον Уогк).

Плазмида рКер4 кодирует репрессор промотора 1ас (1ас1^ч), что, таким образом, делает возможной практически полную репрессию получения (производства) белка рСЕХ-экспрессирующими векторами в отсутствие индуктора экспрессии белка. Для получения ЦМВ 1Е1, выдержанные в течение ночного времени суток культуры рСЕХ-КС-1Е1 трансформированного штамма Е.сой М15[рКер4] растворили в СВ_атр/_капа среде и индуцировали экспрессию 1Е1 в течение 16 ч с 1 мМ изопропилтиогалактозида (1РТС). Индуцированные клетки вызвали производство повышенного уровня 1Е1 белков с молекулярной массой примерно 80 и 32 кДа, соответствующие массам глутатион-8-трансферазы (С8Т)-1Е1 и белков С8Т и добавочных белков с более низкой молекулярной массой, презентирующие продукты деградации С8Т1Е1 и С8Т белка. Идентичность данных белков подтвердили при помощи иммуноблоттинга с использованием 1Е1-специфического мышиного анти-ЦМВ 1Е1 моноклонального антитела ((клон 1В12) (Ζΐη.ι еί а1. 1995, I. У1го1. 69: 7960). Таким образом, М15[рКер4] клетки трансфицировали с плазмидой рСЕХ-КС-1Е1 и лизировали аликвоты клеток до и после 16 ч индукции 1РТС. После этого клеточные лизаты подвергли электрофорезу 10% 8Э8-РАСЕ и перенесли сепарированные белки в нитроцеллюлозу. Затем, 1Е1 белки визуализировали с использованием анти-1Е1 моноклонального антитела (клон 1В12). Сепарацию белков при помощи 8Ό8 РАСЕ и последующий анализ белков методом иммуноблоттинга осуществили в соответствии с описанием в практикуме Мо1еси1аг с1отп§: А 1аЬога1огу тапиа1, 1йп6 еФйоп (8атЬгоок еί а1. (2001), Со16 8ргшд НагЬог БаЬогаЮгу, №ν Уогк).

Для очищения 1Е1 белков рСЕХ-КС-1Е1 трансформированные М15[рКер4] клетки седиментировали после 16 ч индукции ЕРТС при помощи центрифугирования в течение 10 мин при 11000 об/мин в центрифуге ЕррепбогГ СегИпГиде 5417К и пеллету ресуспендировали в ФСБ (Боп/а) без бивалентных ионов (140 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 10 мМ №₂НРО₄; 1,8 мМ КН₂РО₄). Дополнительно, добавили смесь ингибиторов протеаз (комплект, Косйе, 1 таблетка в 50 мл ФСБ (Боп/а)) с целью предотвращения деградации белков. Затем, клетки подвергли полному лизированию с использованием французского жима (1,5 кбар, 4°С) и седиментировали клеточные детриты при помощи центрифугирования (15000 об/мин, 30 мин, 4°С

- 23 020583 в роторе 8огуа11 8834). Растворимую фракцию клеточного лизата, включающего гибридный белок С8ТΙΕ1, затем подвергли очистке в С8Т колонке. При этом обогащения гибридного белка С8Т-1Е1 достигли путем связывания с С1и!а!йопе 8ерБаго8е™ и последующим элюированием с восстановленным глутатионом (50 мМ трис/НС1, 10 мМ восстановленного глутатиона, рН 8,5). Элюат собрали в 2 мл фракции и определили содержание белка в каждой фракции путем измерения оптической плотности при 280 нм. Белоксодержащие фракции анализировали при помощи 12,5% 8Ό8 РАСЕ и визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. Фракции, содержащие гибридный белок С8Т-1Е1, соединили вместе и инкубировали в течение 3 ч с тромбином (7 ед./мг гибридного белка С8Т-1Е1) для сепарации С8Т 1ад. Затем, 1Е1 сепарировали от С8Т-1Е1 гибридных белков при помощи анионообменной хроматографии с использованием колонок НЦ-Рого8^К (АррНеД Вю8у8!ет8). Таким образом, С8Т и 1Е1 показали существенные различия в изоэлектрических точках (С8Т: 6.52; 1Е1: 4.58). Поскольку С8Т не связан с колонкой и может быть детектирован в проходящем потоке, 1Е1 связывает и может подвергнуться элюированию из колонки с 540 мМ №С1 с использованием линейного №С1 градиента (50 мМ до 1 М). Элюат собрали в фракции 2 мл, а содержание белка в каждой фракции определили измерением оптической плотности при 280 нм. Белоксодержащие фракции проанализировали при помощи электрофореза 12,5% 8Ό8 РАСЕ и окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым. Соединили фракции, содержащие 1Е1 белок. Для сепарации остаточных С8Т-1Е1 гибридных белков, комбинированные антигены подвергли второй сепарации в колонке С8Т. Таким образом, С8Т-1Е1 связывается с матрицей С1и1а!йопе 8ерНаго8е™, при этом 1Е1 не связующий и не может быть детектирован в проходящем потоке. С целью анализа чистоты и идентичности, полученный 1Е1 подвергли электрофорезу 12,5% 8Э8-РАСЕ, а гель проанализировали путем окрашивания кумасси бриллиантовым голубым. Дополнительно, белки перенесли из отдельных гелей в нитроцеллюлозу, а белки 1Е1 специфически визуализировали иммуноблоттингом с использованием 1Е1-специфического моноклонального антитела (клон 1В12).

Полученный 1Е1 белок вывел значение чистоты > 90%. Белок подвергли концентрированию с использованием концентрационного оборудования Атюоп и фильтров с отсекаемым размером частиц 25 кДа. Концентрацию очищенного 1Е1 определили при помощи определения молярного коэффициента экстинкции. Таким образом, значение ОЭ₂₈₀ на уровне 21500 относится к 1 моль 1Е1 белка. От 4 до 8 мг очищенного 1Е1 белка получили из 1 л культуральной жидкости.

Пример 16. Емкость карбамилированного 1Е1 белка и УББ пептида касательно специфической реактивации СЭ4' и/или СЭ8' Т-клеток.

В данном опыте презентировали стабильность карбамилированных 1Е-1 белка и ΥΙΕ пептида на молекулах ГКГ I и II классов, с последующим анализом способности реактивации полипептидспецифических СЭ4' и СЭ8' Т-клеток при помощи проточной цитометрии. К данному выводу логически приводит наблюдение, что практически все НЬА А2-позитивные, ЦМВ-позитивные доноры крови вырабатывают СЭ8' цитотоксические Т-клетки, которые узнают специфический эпитоп (УББЕЕТ8УМБ (8ЕЦ ГО ΝΟ: 4); аминокислота 315-324), (РгоД'Нотте е! а1. (2003), I. Iттиηо1 170:2030) внутри ЦМВ белка ГЕ1.

В качестве контроля стимулировали образцы с пептидом Е10Р, с покрытием мышиного ЦТЛ эпитопа в течение р24 капсидной области ШУШ^ню) Сад (аа291-300) (\УНД е! а1. (2004), Уассше. 2004;22:17321743).

Таким образом, гепаринизированную цельную кровь серопозитивного донора инкубировали в аликвотах 1 мл в стерильных пробирках фирмы Ра1соп (ВЭ) с немодифицированными и карбамилированными ГЕ-1 белком и УШ- пептидом. Для карбамилирования очищенный БЕ1 белок (0,89 мкг/мл в ФСБ(Боп/а)) или очищенный УШ пептид смешали 1: 1 (по объему) с 8 М осажденной мочевины (предварительно инкубированной в течение ночного времени суток при 96°С) и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. После этого осуществили следующие стимуляции:

1: контрольный пептид: немодифицированный НТУ Рг55^дад извлеченный пептид (10 мкг/мл);

2: немодифицированный ЕЕ1 белок (10 мкг/мл);

3: карбамилированный ЕЕ1 белок (10 мкг/мл);

4: немодифицированный ЕЕ1 извлеченный пептид УШ· (10 мкг/мл);

5: карбамилированный ЕЕ1 извлеченный пептид УШ- (10 мкг/мл).

В дополнение к белкам или пептидам моноклональные антитела, эффективные в отношении костимулирующих молекул СЭ28 и СЭ49Д (Вес!оп Эюкиъоп) добавили к конечной концентраци 1 мкг/мл. Клетки затем инкубировапри 37°С в течение 2 ч. Затем, 10 мкг/мл брефелдина А добавили к образцам с целью предотвращения секреции цитокинов. После этого образцы тщательно перемешали на вортексе и инкубировали при 37 °С в течение еще 7 ч.

После 9 ч инкубации добавили 100 мкл охлажденного до 0°С раствора ЭДТК (ЭДТК в ФСБ (Боп/а), 20 мМ). Образцы быстро перемешали на вортексе и затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого образцы тщательно перемешали на вортексе и инкубировали с 9 мл лизирующего раствора РАС8 (ВЭ) в течение 10 мин при комнатной температуре. Образцы затем центрифугировали при 4°С в течение 8 мин при 340д. Супернатант тщательно слили и дважды промыли клетки с 9 мл буфера РАС8 (ФСБ (Боп/а) + 0,1% вес./об. ΝπΝ₃ + 1% вес./об. РС8). Клетки затем ресуспендировали в

- 24 020583 небольшом объеме ЕАСδ буфера для окрашивания поверхностных молекул. Таким образом, конъюгированные с флуорохромом (меченные флуоресцином) моноклональные антитела против поверхностных молекул (СЭ3 ЕРТС, СЭ4 ΕΟΌ и СЭ8 АПК) добавили в соответствии с протоколом производителя и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин в темном помещении. Затем, клетки промыли с ЕАСδ буфером, как описано выше, зафиксировали через добавление 0,5 мл 2% параформальдегида (2% в ФСБ (Ьоп/а)) и инкубировали в течение 10 мин в темном помещении. После этого клетки переместили в пробирки ЕАСδ (ВО) и промыли с 3 мл буфера ЕАСδ. Затем, провели пермеабилизацию и внутриклеточное окрашивание. Для этого 10 мкл пермеабилизированного раствора (2% сапонинов в ФСБ) и конъюгированных с флуорохромом моноклональных IЕN-γ-ΡΕ антител (в соответствии с протоколом производителя) пипеткой поместили на клетки. Образцы тщательно перемешали на вортексе и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темном помещении. Затем, клетки дважды промыли с 3 мл 0,1% раствора сапонина (0,1% сапонина в ФСБ (Ьоп/а)) и зафиксировали в 0,5 мл параформальдегида (1% в ФСБ (Ьо^а)). Окрашенные клетки пропустили через проточный питометр ЕАСδ Брюх ХЬ МСЬ (Весктап Сои11сг) и интерпретировали результаты с использованием программного обеспечения СсПОией δοΠ\γа^с (ВесЮп Оюкнъоп).

Результаты показали, что значительно больше СЭ3 и СЭ8 экспрессирующих клеток можно извлечь путем стимуляции с карбамилированными полипептидами.

Пример 17. Емкость пептидов, карбамилированных с мочевиной и цианатом, касательно специфической реактивации СЭ8' Т-клеток.

Емкость карбамилированных пептидов касательно реактивирования пептид-специфических СЭ8' Т-клеток проанализировали с применением проточного цитометра внутриклеточного производства ΙΡΝ-γ после пептид-специфической инкубации. Для этого цельную кровь инкубировали с различными композициями пептида ΥΙΕ в течение 9 ч и окрасили МКПК в соответствии с протоколом, описанным в примере 16. В данных опытах пептид ΥΙΕ (10 мкг/мкл в 100% ДМСО) смешали 1:1 (по объему) либо с 8 М осажденной мочевины (предварительно инкубированной в течение ночного времени суток при 96°С), либо с 200 мМ ΚΟСN и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. После этого осуществили следующие стимуляции:

1: 10 мкг/мл контрольного пептида ΗΤV р24 извлеченный пептид Ε10Ρ;

2: 10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 извлеченного пептида ΥΙΕ;

3: 10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 извлеченного пептида ΥΙΕ карбамилированного с 100 мМ ΚΟСN (включая конечную концентрацию 200 мкМ ΚΟСN в образце стимулированной крови);

4: 10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 извлеченного пептида ΥΙΕ карбамилированного с 4 М мочевины (включая конечную концентрацию 8 мМ мочевины в образце стимулированной крови);

5: 200 мкМ ΚΟСN (конечная концентрация в образце стимулированной крови);

6: 8 мМ мочевины (конечная концентрация в образце стимулированной крови).

Результаты показали, что с 200 мМ ΚΟСN карбамилированного ΥΙΕ пептида значительно реактивирует больше СЭ8' Т-клеток, чем некарбамилированный ΥΙΕ пептид.

Пример 18. Емкость пептидов и белков, карбамилированных с цианатом, касательно специфической реактивации СЭ8' Т-клеток.

В данном опыте проанализировали емкость карбамилированного с цианатом ЦМВ ΥΙΕ пептида и рр65 белка, касательно специфической реактивации СЭ8' Т-клеток. Для этого цельную кровь инкубировали с различными композициями ΥΙΕ пептида в течение 6 ч и окрасили МКПК в соответствии с протоколом, описанным в примере 16. В данных опытах пептид ΥΙΕ (2 мкг/мкл в 100% ДМСО) смешали 1:1 (по объему), либо с 200 мМ, 400 мМ или 1000 мМ ΚΟΟΝ в Н₂О и инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. Область антигенной детерминанты ЦМВ (штамм АО169) рр65 (аа 862-1048; КесМо1 иЬ83-Рр65, Са!. Ν 1В023А) растворили в Н₂О, включая 140 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 10 мМ Nа₂ΗΡΟ₄, 1,8 мМ ΚΗ₂ΡΟ₄, а также различные концентрации ΚΟСN от 0 до 500 мМ инкубировали в течение ночного времени суток при 40°С. После этого осуществили следующие стимуляции:

1: нестимулированные клетки (отрицательный контроль);

2: 10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 пептида ΥΙΕ;

3:10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 пептида ΥΙΕ карбамилированного с 100 мМ ΚΟСN (включая конечную концентрацию 1 мМ ΚΟСN в образце стимулированной крови);

4: 10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 пептида ΥΙΕ карбамилированного с 200 мМ ΚΟСN (включая конечную концентрацию 2 мМ ΚΟСN в образце стимулированной крови);

5: 10 мкг/мл ЦМВ ΙΕ1 пептида ΥΙΕ карбамилированного с 500 мМ ΚΟСN (включая конечную концентрацию 5 мМ ΚΟСN в образце стимулированной крови);

6: 10 мкг/мл ЦМВ рр65 белка (область антигенной детерминанты);

7: 10 мкг/мл ЦМВ рр65 белка карбамилированного с 100 мМ ΚΟСN (включая конечную концентрацию 1 мМ ΚΟСN в образце стимулированной крови);

8: 10 мкг/мл ЦМВ рр65 белка карбамилированного с 200 мМ ΚΟСN (включая конечную концентрацию 2 мМ ΚΟСN в образце стимулированной крови);

- 25 020583

9: 10 мкг/мл ЦМВ рр65 белка карбамилированного с 500 мМ КОСЫ (включая конечную концентрацию 5 мМ КОСЫ в образце стимулированной крови).

Результаты показали, что карбамилированный с цианово-кислым калием УББ пептид и рр65 белок в присутствии 0,04 М мочевины проявляют значительно большую емкость специфической реактивации ί'.Ό8' Т-клеток, чем некарбамилированный УТБ пептид и рр65 белок соответственно. При этом обработка рр65 с возрастающей концентрацией цианово-кислого калия от 100 до 500 мМ напрямую связана возрастающей емкостью рр65 касательно специфической реактивации СЭ8' Т-клеток в БРЫ-γ производстве. В сравнении для УГО пептида предварительная обработка с 100 мМ и 200 мМ цианово-кислого калия более эффективна для повышения потенциала УГО специфически стимулировать СЭ8 Т-клетки, чем предварительная обработка УТО с 500 мМ цианово-кислого калия.

Пример 19. Емкость модифицированного с мочевиной ΗТV р24 капсидного антигена в комбинации с СрО ΟΌΝ 1668 касательно специфической активации СЭ8' Т-клеток у мышей.

Емкость карбамилированного НУ р24 капсидного белка для стимуляции р24-специфических СЭ8' Т-клеток проанализировали в мышиной модели (белая мышь, популяция ВАЬВ/с). Таким образом, аликвот очищенного рекомбинантного р24 обработали в течение ночного времени суток при 40°С с осажденной мочевиной (предварительно нагретой в течение 1 ч при 96°С) и затем подвергли интенсивному диализу в присутствии 0,04 М мочевины в ФСБ (Боп/а). Шесть белых мышей женского пола популяции ВАЬВ/с в возрасте от 40 до 60 дней иммунизировали внутримышечно, либо с 10 мкг немодифицированного р24 в отсутствие (группа 4) или в присутствии 50 мкг/дозу СрО ΟΌΝ1668 (группа 5) или обработанного с мочевиной, модифицированного р24 (ир24) в отсутствие (группа 2) или в присутствии 50 мкг/дозу СрО ΟΌΝ1668 (группа 3). Иммуногены ввели в общем объеме 100 мкг в ФСБ (Боп/а). В качестве контроля, иммунизировали группы из шести мышей, либо с 0,04 М раствора мочевины (группа 1) или 10 мкг НУ извлеченных из клеток насекомых НУ Оад вирусоподобных частиц (νΕ-Р) (Оепи е! а1. 2005, Мо1. Iттиηо1. 42:259) в общем объеме 100 мкл в ФСБ (Боп/а). Всех животных иммунизировали на неделе 0 и ввели бустерную инъекцию с теми же самыми иммуногенами на неделях 2 и 4. На неделях 3 и 6 три мыши из каждой группы умертвили путем смещения шейных позвонков, с асептическим изъятием селезенки.

После этого селезенки поместили в 50 мл трубки Ра1соп (ВО Не1йе1Ьег§, Оегтапу), содержащие 10 мл среды со спленоцитами (селезеночными макрофагами) (КРМЕраствор, 5% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (РС8), 20 мМ Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы2-этансульфоновой кислоты НЕРЕ8, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1% Реп/8!ер раствора) и выдержали при комнатной температуре (не более 15 мин). Среду заменили эквивалентным объемом свежей среды со спленоцитами и перенесли селезенки в клеточное сито 70 мкМ (ВО са!. Ыо. 352350), которую поместили в 50 мл трубки Ра1соп. Генерировали одноклеточные суспензии путем затирания селезенки против клеточного сита с поршнем 5 мл, пока в невыдавленном остатке не получили практически только волокнистую фиброзную ткань. Выделенные из совокупности клетки аспирировали из клеточного сита путем повторяющегося добавления 2 мл среды со спленоцитами. Полученные клеточные суспензии седиментировали путем центрифугирования при 300д в течение 5 мин при комнатной температуре и пеллетированные клетки ресуспендировали в 5 мл/спленоцитного АСК гемолизного буфера (150 мМ ЫН₄С1, 1 мМ КНСО₃, 0,1 мМ Ыа₂ЕОТА (ТИпр1ех III); корректировали рН 7,2 до 7,4 с 1 N НС1) путем осторожного добавления пластмассовой пипеткой 10 мл или 25 мл. После этого клеточную суспензию центрифугировали при 300д в течение 5 мин при комнатной температуре и трижды промыли с 10 мл/среды с селезеночными спленоцитами. На каждом этапе промывания, клеточные суспензии сепарировали от собранной волокнистой фиброзной ткани. В конце, клетки ресуспендировали в 5 мл/среды с селезеночными спленоцитами, подсчитали и скорректировали до уровня конечной концентрации 2х10⁶ клеток/мл среды с селезеночными спленоцитами и презервировали при 37С° (не более 30 мин) до использования.

2х10⁶ мышиных спленоцитов культивировали в 100 мкл среды со спленоцитами на лунку тестплашки с плоским дном на 96 лунок при 37°С. Клетки стимулировали с 10 мкг либо с НУ С-типа р24 пептида (АМЦГОКОИ (8ЕЦ ГО ЫО: 1); аа19_7-205 в случае р24 иммунизированных мышей), либо с НТУ._МАЯ пептида (АМОМБКЕТ! (81 (С) ГО ЫО: 2); аа_197-205 (№Пй е! а1. (2004), Vасс^ηе 22:1732) в случае \’БРстимулированных мышей) или для отрицательного контроля с иррелевантным пептидом, репрезентирующим НЬА А2-рестрикционный ЦТЛ эпитоп внутри простатоспецифического антигена (Р8А 141-150 ББТРККБОСУ (8ЕЦ ГО ЫО: 3); СНакгаЬойу е! а1. (2003), Сапсег Iттиηо1. ПптипоШег. 52:497). Комбинацию ФМА (форбол 12-миристат 13-ацетата) и иономицина использовали в качестве положительного контроля. Каждую стимуляцию полипептидов проводили дважды. Стимуляционные иммуногены смешали следующим образом:

негативный контроль: 1,5 мл среды со спленоцитами + 3 мкл брефелдина А (5 мкг/мкл) + 3 мкл Р8А-пептида (10 мкг/мкл);

положительный контроль: 1 мл среды со спленоцитами + 2 мкл брефелдина А (5 мкг/мкл) + 1 мкл ФМА (1 мкг/мкл) + 1 иономицина (1 мкг/мкл);

НУ С-типа р24 пептидного раствора: 1,5 мл среды со спленоцитами + 3 мкл брефелдина А (5

- 26 020583 мкг/мкл) + 3 мкл пептида (10 мкг/мкл);

Н1Уьд1 Α9Ι рерййе 8о1ийоп: 0,5 мл среды со спленоцитами + 1 мкл брефелдина А (5 мкг/мкл) + пептид (10 мкг/мкл).

Чашки Петри затем инкубировали в стандартном инкубаторе при 37°С. После 6 ч образцы перенесли в колонки РАСА, содержащие 1 мл буфера РАСА (ФСБ (Боп/а). 1% (по объему) РСА. 0,1% по весу/по объему ΝαΝ₃). Образцы затем центрифугировали при 4°С в течение 5 мин при 300д. Супернатант затем осторожно декантировали, а клетки затем промыли с 1 мл РАСА-буфера и снова центрифугировали при 300д в течение 8 мин. Затем, клетки ресуспендировали в малом объеме (примерно 100 мкл) РАСА буфера и первый раз инкубировали в течение 10 мин при 4°С с анти-РсК11/111 тАЬ (РЬатМтдеи, НатЪигд, Сегтапу) с целью блокирования неспецифического связывания флуоресцент-меченых антител. Затем, поверхностные маркеры окрасили в течение 30 мин на льду в объеме окрашивающей среды 100 мкл с использованием следующих антител в соответствии с протоколом производителя: ΟΌ3 Р1ТС, ΟΌ4 РегСР и ΟΌ8 АПК. Клетки затем промыли с 5 мл РАСА буфера и центрифугировали в течение 5 мин при 300д. После этого клетки зафиксировали с 250 мкл Су1оП\/Су1орегт (4% (по весу/по объему) РРА + 1% (по весу/по объему) сапонина) в течение 20 мин на льду. Клетки затем дважды промыли с 5 мл перм/промывке (0,1% (по весу/по объему) сапонина в ФСБ (Боп/а)) и центрифугировали в течение 5 мин при 500д при 4°С после каждого этапа промывания. Клетки ресуспендировали в 100 мкл перм/промывке и окрасили внутриклеточные ΙΕΝ-γ с использованием ΙΕΝ-γ-РЕ антител в соответствии с протоколом производителя в течение 20 мин на льду в темном помещении. После этого клетки промыли дважды с 5 мл РАСА буфера и центрифугировали в течение 5 мин при 300д после каждого этапа промывания. Наконец, клетки ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора параформальдегида (полиоксиметилена). Провели анализ РАСА на проточном цитометре РАСАСаНЬш (ВесЮп Эюктвоп, Сегтапу), с забором 30,000 СЭ8' Т-клеток на образец. Данные РАСА были затем проанализированы с использованием программного обеспечения СеПОнеЯ юГйтаге.

Результаты четко показали, что иммунизация мышей карбамилированным р24 в комбинации с СрС ΘΌΝ 1668 индуцирует значительно больше СЭ8+ Т-клеток по сравнению с мышами, иммунизированными с немодифицированными р24 в отсутствие и в присутствии СрС ΘΌΝ 1668 или карбамилированными р24 в отсутствие СрС ΘΌΝ 1668.

Пример 20. Поглощение Н1У р24 капсидного белка в зрелых дендритных клетках.

Для определения факта, обладает ли Н1У р24 капсидный белок присущей способностью внедряться в цитозоль зрелых дендритных клеток и, таким образом, классифицировать ли оный в первую или вторую группу полипептидов, как описано выше, провели следующий опыт:

6-9х10⁵/мл зрелых дендритных клеток в КТ0 (ΡΡΜΙ 1640, 10% человеческой сыворотки АВ) инкубировали с 10 мкг/мл рекомбинантного Н1У р24 капсидного белка в течение 15 мин при 37°С. Соответственно, 333 мкл клеточной суспензии поместили в цитоцентрифугу (НейюЬ, ТийЬпдеп) и центрифугировали в течение 3 мин при 300д. После высушивания стекол в течение 60 мин, клетки покрыли параформальдегидом (4% в ФСБ) для фиксации и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Клетки затем промыли три раза с 10 мл ФСБ. Область фиксации клеток окружили слоем вазелина. После этого окрасили цитоплазматическую мембрану клеток с 150 мкл (5 мкг/мл) красителя А1е\а Р1иог (1пуЬтодеп, И8А) в течение 10 мин. После этого стекла промыли дважды с 10 мл ФСБ, покрыли клетки 4°С холодным ацетоном с целью пермеабилизации клеток. Затем, клетки насытили (пропитали) 150 мкл КТ0 в течение 30 мин. После удаления Κ10, на клетки нанесли р24 детекционного флуоресцирующего антитела КС57Р1ТС (Сои11ег С1опе, И8А) на клетки в течение 2 ч в соответствии с протоколом производителя. После этого стекла промыли три раза с 10 мл ФСБ. Затем, ядра клеток маркировали 150 мкл (10 нг/мл) 4',6диамино-2-фенилиндол (ЭАР1) (КосЬе, МаппЬеш). Стекло промыли с 10 мл ФСБ и высушили в течение 60 мин. Затем, добавили к стеклу 15 мкл МоЫС1о\у среды для заключения ткани (МоВГТес, Сойшдеп) и накрыли покровным стеклом.

После этого осуществили флуоресцентную микроскопию с использованием микроскопа ЬЕ1САΌΜΚΧ (Ьеюа, \Уе1х1аг). Результаты интерпретировали с использованием программного обеспечения 1таде-Рго Р1и8 6.2 (МеФаСуЪетейск, И8А). Снимки, полученные при помощи микроскопа, показали, что Н1У р24 капсидный белок не проникает в цитозоль дендритных клеток. Таким образом, Н1У р24 капсидный белок является полипептидом в соответствии со второй группой полипептидов согласно приведенному выше описанию.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) инкубирование полипептидов в растворе, содержащем ионы цианата, в котором ионы цианата присутствуют в концентрации от примерно 1 до примерно 1000 ммоль/л;

1. Способ переноса полипептидов в клетки, включающий следующие этапы:

2) инкубирование АПК-содержащих клеточных культур или биологических жидкостей с полипептидами согласно этапу а) в присутствии мочевины;

2. Способ по п.1, при котором клетки представляют собой прокариотные клетки, предпочтительно бактерии, или эукариотные клетки, предпочтительно грибки, более предпочтительно дрожжи и филаментные (нитчатые) грибки, клетки насекомых, птиц, рептилий, рыб, земноводных и млекопитающих, предпочтительно клетки мышей или человека, в частности антиген-презентирующие клетки (АПК), предпочтительно дендритные клетки (более предпочтительно клетки Лангерганса), моноциты, макрофаги, В-клетки или клетки васкулярного эпителия и различные клетки эпителия, мезенхимные и клетки микроглии головного мозга.

2) инкубирование клеток с полипептидами согласно этапу а) в присутствии мочевины.

3) инкубирование АПК-содержащих клеточных культур или биологических жидкостей, полученных согласно этапу б) с иммунными клетками или с биологическими жидкостями, содержащими иммунные клетки;

3. Способ детекции полипептид-специфических иммунных клеток, включающий следующие этапы:

4. Способ по п.3, при котором АПК-содержащая клеточная культура представляет собой популяцию клеток костного мозга - лейкеферезат, изолированные моноцитные клетки и/или сепарированные популяции АПК, предпочтительно содержащие дендритные клетки (более предпочтительно клетки Лангерганса), моноциты, макрофаги и/или В-клетки, а АПК-содержащая биологическая жидкость представляет собой цельную кровь или жидкость, и/или при котором полипептид-специфические иммунные клетки представляют собой Т-клетки, предпочтительно СЭ4' Т-клетки, СЭ8' Т-клетки, СО4'СЭ8^Н|т Тклетки или ί'Ό4' регуляторные Т-клетки, или другие популяции иммунологических клеток, предпочтительно ί'Ό56' ί'Ό8', СЭ56^-СЭ57'СЭ8' ΝΚΓ клетки или СЭ56' ΝΚ клетки, или смесь оных, и/или при котором биологические жидкости, содержащие иммунные клетки, представляют собой цельную кровь и/или жидкость.

4) симультанную и/или специфическую детекцию и/или количественный анализ различных подтипов полипептид-специфических иммунных клеток, которые специфичны по отношению к полипептидам согласно этапу а).

5. Способ по любому из пп.3, 4, при котором детекцию и/или количественный анализ осуществляют путем детекции специфических поверхностных маркеров для полипептид-специфических иммунных клеток и производством маркерных цитокинов ΊΝΡ, №Ν-γ, Ш-2, Ш-4, Ш-5, Ш-10, Ш-17 или ТОР-β.

6. Способ примирования, выращивания и/или реактивации полипептид-специфических Т-клеток, включающий следующие этапы:

а) инкубирование полипептидов в растворе, содержащем ионы цианата, в котором ионы цианата присутствуют в концентрации от примерно 1 до примерно 1000 ммоль/л;

б) инкубирование клеток с полипептидами согласно этапу а) в присутствии мочевины и в отсутствие или в присутствии иммуномодулирующих веществ, при котором полипептид-специфические Тклетки предпочтительно представляют собой ί'Ό4' Т-клетки и/или СЭ8' Т-клетки.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором ионы цианата присутствуют в концентрации от примерно 5 до примерно 900 ммоль/л, от примерно 10 до примерно 800 ммоль/л, от примерно 20 до примерно 700 ммоль/л, от примерно 50 до примерно 600 ммоль/л или от примерно 100 до примерно 500 ммоль/л.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором раствор согласно этапу а) содержит дополнительно мочевину, предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 8 моль/л, от примерно 0,1 до примерно 0,5 моль/л, от примерно 0,5 до примерно 5 моль/л или от примерно 5 до примерно 8 моль/л.

9. Способ по п.8, при котором мочевину предварительно обработали путем инкубации, при котором параметры инкубации предпочтительно определяются нагревом и/или временем.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором концентрация мочевины согласно этапу б) составляет от примерно 0,001 до примерно 0,8 моль/л, от примерно 0,01 до примерно 0,1 моль/л, от примерно 0,015 до примерно 0,09 моль/л, от примерно 0,02 до примерно 0,08 моль/л, от примерно 0,025 до примерно 0,07 моль/л, от примерно 0,03 до примерно 0,06 моль/л или от примерно 0,035 до примерно 0,05 моль/л и, в частности, при котором концентрация мочевины по этапу б) составляет примерно 0,04 моль/л.

11. Способ по любому из пп.8-10, при котором раствор мочевины дополнительно содержит Ν;·ιί'Ί с концентрацией от примерно 0,25 до примерно 200 ммоль/л или от примерно 0,25 до примерно 75

- 28 020583 ммоль/л и/или дитиоэритрит (ДТЭ) или дитиотреитол (ДТТ) с концентрацией от примерно 0,25 до примерно 200 нмоль/л или от примерно 0,25 до примерно 75 нмоль/л.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором полипептиды в:

(ΐ) этапе а) присутствуют в концентрации от примерно 0,1 до примерно 50 мкг/мл, от примерно 1 до примерно 40 мкг/мл, от примерно 3 до примерно 30 мкг/мл или от примерно 5 до примерно 20 мкг/мл и, в частности, в концентрации примерно 10 мкг/мл; и/или (ίί) этапе б) присутствуют в количестве от примерно 0,1 до примерно 200 мкг или выше, или от примерно 0,1 до примерно 200 мкг, или от примерно 0,1 до примерно 2 мкг, или от примерно 0,1 до примерно 10 мкг, или от примерно 10 до примерно 50 мкг или от примерно 50 до примерно 200 мкг в расчете на примерно 10⁶ клеток.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором инкубация полипептидов согласно этапу а) приводит к повышению молекулярной массы полипептидов и/или сдвигу в рК₁-значении полипептидов в сторону более кислотного рК₁-значения.

14. Применение полипептидов в сочетании с мочевиной в исследовательских, диагностических или лечебных целях и предотвращении заболеваний у животных и человека, характеризующееся тем, что полипептиды предварительно инкубированы в растворе, содержащем ионы цианата в концентрации от 1 до 1000 ммоль/л.

15. Применение полипептидов в сочетании с мочевиной в качестве медикаментозного средства предпочтительно для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний и опухолей, характеризующееся тем, что полипептиды предварительно инкубированы в растворе, содержащем ионы цианата в концентрации от 1 до 1000 ммоль/л.

Распад мочевины

О

II

Η₂Ν-Ο-ΝΗ₂

Мочевина нагрев

ΝΗ₄ ⁺ + ΝΟΟи время

Цианат аммония

Карбамилирование белков

Ν-конец пептида, используемого в качестве примера о

Η-Ν=Ο=Ο ⁺ Η,Ν^λΑ -* Η₂Ν-0-ΝηΛΛ

Изоциановая кислота

Пептидный

Ν-конец (или боковая цепь лизина или аргинина)

Карбамилированный пептид или белок

₆ ₁₂ ₂ ₂ ₂