EA015636B1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ И/ИЛИ СПИДа, И ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТА - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается способа получения экстракта лекарственных растений из Rosa sp., Urtica dioica и/или Tanacetum vulgare; предпочтительно включающего обработку импульсным электромагнитным полем высокой частоты. Экстракт лекарственных растений, необязательно содержащий селен и/или мочевину, полезен при лечении состояний, обусловленных ослабленной иммунной системой, например ВИЧ-инфекции и СПИД.

Description

Настоящее изобретение касается способа получения экстракта лекарственных растений из Кока кр. (растений рода роза), ИтИса άίοίοα (крапива двудомная) и/или ТапасеГит уи1дате (пижма обыкновенная), предпочтительно предусматривающего обработку импульсным электромагнитным полем. Настоящее изобретение касается также экстракта лекарственных растений, полученного указанным способом и необязательно содержащего селен и/или мочевину, и к применению указанного экстракта для лечения болезней, обусловленных ослабленной иммунной системой, предпочтительно ВИЧ-инфекции и СПИД. Настоящее изобретение касается также фармацевтической композиции и готового лечебного набора.

Предшествующий уровень техники

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является хроническим, опасным для жизни заболеванием, вызываемым вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Выявлены две разновидности данного ретровируса - ВИЧ-1, являющийся причиной СПИД в странах западного полушария и Европы, и ВИЧ-2, являющийся главной причиной СПИД в странах Африки и Юго-Восточной Азии.

Если говорить более подробно, то СПИД характеризуется совокупностью симптомов, проявляющейся на поздних стадиях ВИЧ-инфекции. Без какого-либо лечения инкубационный период, т.е. период времени между ВИЧ-инфекцией и клиническим проявлением СПИД, составляет около 10 лет. ВИЧинфекция вызывает прогрессирующее ослабление иммунной системы, что в конечном итоге приводит к иммунодефициту. Поэтому наиболее важными клиническими симптомами СПИД являются оппортунистические инфекции и, помимо них, характерные злокачественные поражения, такие как саркоматоз Капоши, ВИЧ-ассоциированная энцефалопатия и ВИЧ-ассоциированный синдром истощения. Иммунодефицит обусловлен потерей СЭ4' Т-клеток, которые являются существенно важными как для клеточноопосредованного (клеточного), так и для опосредованного антителами иммунитета. Количественный анализ СИ4⁺ Т-лимфоцитов в циркулирующей крови стал ключевым методом выявления и оценки ВИЧинфекции и СПИД с начала их эпидемии. Ценными параметрами для определения степени тяжести заболевания, его прогноза и терапевтического наблюдения служат процентное содержание СЭ4' Тлимфоцитов и его изменения во времени (кривая снижения).

Первые случаи СПИД были зарегистрированы в начале 80-х гг. прошлого века. С того времени СПИД распространился по всему миру и, более того, приобрел характер эпидемии в некоторых регионах, в частности, в некоторых из развивающихся стран. На сегодняшний день ВИЧ-инфицированными являются около 40 млн человек, в том числе примерно 2,2 млн детей. В 2004 г. было зарегистрировано около 5 млн новых случаев инфицирования, а примерно 3,1 млн. человек умерли от СПИДа, из них 510 тыс. детей (по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ)).

Начиная с 1995 г., число лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции и СПИД утроилось. В настоящее время широкое распространение получила комплексная терапия, обеспечивающая повышение эффективности лечения и предупреждение побочных эффектов. Разработка новых активных агентов или лекарственных средств и терапевтических концепций позволяет успешно замедлить прогрессирование болезни, устранить обратимость симптомов последних стадий болезни и предупредить инфекцию у младенцев, рожденных инфицированными матерями. Так называемая высокоактивная антиретровирусная терапия (НААКТ), т.е. комплексное лечение, включающее прием трех и более лекарственных препаратов, стала стандартным методом лечения. Показано, что НААКТ замедляет прогрессирующее развитие и сокращает смертность. Как правило, два из лекарственных препаратов в рамках НААКТ действуют на обратную транскриптазу и один лекарственный препарат - на вирусную протеазу. Точно установленными ингибиторами обратной транскриптазы являются аналоги нуклеозидов, такие как зидовудин (ζίάονιιάίικ) (А2Т, КеГтоуи·®), ламивудин (1ат1уибте) (Ερίνίτ®) и диданозин (άί банок те) (У1бех®). Эти ингибиторы транскриптазы встраиваются в растущую нить ДНК, благодаря чему предотвращается последующий синтез ДНК. Известны и другие ингибиторы обратной транскриптазы, например У1гатиие®, который ингибирует фермент другими механизмами. Ингибиторы протеазы блокируют вирусную протеазу, так что белки, необходимые для сборки структуры новых вирусов, не способны больше отщепляться от более крупного белкового предшественника. Примерами лекарственных препаратов такого рода являются индинавир (ίηάίηηνίΓ) (Спхтап®). саквинавир (кас.|шпа\'1г) (1п\'йаке®). ритонавир (πΙοηηνίΓ) (Νοτνίτ®) и нелфинавира мезилат (пе1Ппа\'й теку1аГе) (УтасерГ®). Следующие лекарственные препараты, пригодные для терапевтического применения, включают ингибиторы массового слияния, например, энфувиртид (епГЮгБбе) (Е^еои®) и ингибиторы интегразы.

Несмотря на большие успехи, достигнутые в терапии ВИЧ-инфекции и СПИД, она не лишена ещё некоторых недостатков. Лекарственные препараты, используемые в настоящее время, являются весьма дорогостоящими и поэтому они не только опустошают казну в богатых странах, но и являются попросту недоступными во многих бедных странах, где свирепствует эпидемия. Они дают множество неприятных побочных эффектов (например, тошнота, диарея) и к тому же могут вызывать тяжелые побочные действия (например, поражения печени и поджелудочной железы, в ряде случаев с летальным исходом). Они требуют очень сложного режима дозировки, например, более дюжины пилюль в день (не считая тех, которые необходимы для подавления сопутствующих оппортунистических инфекций). И, наконец, они

- 1 015636 нередко теряют свою эффективность, поскольку их выбирают в случае появления у больного вирионов, устойчивых к лекарственным средствам.

Следовательно, существует потребность в альтернативных, улучшенных или превосходящих прежние, фармацевтических средствах, обеспечивающих уменьшение интенсивности симптомов СПИД, предупреждение проявления СПИД после периода его бессимптомного течения и/или воздействие на ВИЧинфекцию. Кроме того, существует необходимость в более эффективных с точки зрения стоимости фармацевтических средствах.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтически активной композиции, пригодной для лечения вирусных инфекций и связанных с ними симптомов и состояний, предпочтительно ВИЧ-инфекции и СПИД.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения достигается способом получения экстракта лекарственных растений, включающим стадии:

(а) подготовки растительного материала, полученного из Вока кр. (растений рода роза) и/или игйса бююа (крапива двудомная), и/или ТапасеШш уи1дате (пижма обыкновенная);

(б) сушки растительного материала;

(в) добавления органического растворителя;

(г) выдержки в термостате смеси растительного материала с органическим растворителем;

(д) получения экстракта лекарственных растений.

В одном из вариантов воплощения изобретения растительный материал получают из Вока кр., итйеа бююа и ТапасеШш уи1дате.

В одном из вариантов растительный материал из Вока кр. получают из Вока сатпа (шиповник собачий).

В одном из вариантов растительный материал, полученный из Вока кр., представляет собой плоды.

В одном из вариантов растительный материал, полученный из итйеа бююа и/или ТапасеШш уи1дате, представляет собой листья и/или тонкие стебли.

В одном из вариантов сушка на стадии (б) проводится при температуре примерно от 20 до 50°С, предпочтительно примерно от 37 до 45°С, наиболее предпочтительно примерно при 42°С.

В одном из вариантов сушка на стадии (б) проводится в течение периода времени примерно от 3 до 4 суток.

В одном из вариантов органическим растворителем является этанол концентрацией предпочтительно примерно от 60 до 96% (об./об.), более предпочтительно примерно от 80 до 95% (об./об.), наиболее предпочтительно около 96% (об./об.).

В одном из вариантов выдержка в термостате на стадии (г) осуществляется в течение периода времени примерно от 20 до 40 суток, предпочтительно примерно от 22 до 38 суток, наиболее предпочтительно примерно от 25 до 35 суток.

В одном из вариантов выдержка в термостате на стадии (г) проводится при температуре примерно от 20 до 50°С, предпочтительно примерно от 37 до 45°С, наиболее предпочтительно примерно при 42°С.

В одном из вариантов способ дополнительно включает стадию:

(е) добавления селена и/или его органической либо неорганической соли.

В одном из вариантов селен добавляется до концентрации свободного селена примерно от 1 до 100 мг/л, предпочтительно примерно от 5 до 50 мг/л, наиболее предпочтительно примерно от 10 до 20 мг/л.

В одном из вариантов способ дополнительно включает стадию:

(ж) добавления мочевины.

В одном из вариантов способ дополнительно включает стадию:

(з) обработки экстракта лекарственных растений импульсным электромагнитным полем.

В одном из вариантов импульс электромагнитного поля имеет синусоидальную, прямоугольную и/или стохастическую (случайную) форму.

В одном из вариантов импульсное электромагнитное поле имеет частоту примерно от 5 до 750 килогерц (кГц), предпочтительно примерно от 50 до 350 мегагерц (МГц), наиболее предпочтительно около 250 МГц.

В одном из вариантов импульсное электромагнитное поле имеет мощность примерно от 10 до 200 ватт (Вт), предпочтительно примерно от 20 до 100 Вт, наиболее предпочтительно около 45 Вт.

В одном из вариантов импульсное электромагнитное поле имеет напряженность магнитного поля от 100 до 150 микроТесла (мкТл).

В одном из вариантов продолжительность обработки на стадии (з) составляет примерно от 2 до 5 мин.

В одном из вариантов обработка на стадии (з) проводится дважды, предпочтительно трижды.

Цель настоящего изобретения достигается также с помощью экстракта растений, полученного способом по настоящему изобретению.

Цель настоящего изобретения достигается также применением экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению, полученного способом по настоящему изобретению, для стимулирования

- 2 015636 иммунной системы у субъекта.

Цель настоящего изобретения достигается также применением экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению, полученного способом по настоящему изобретению, для лечения заболевания, обусловленного ослабленной иммунной системой у субъекта.

Цель настоящего изобретения достигается также применением экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению, полученного способом по настоящему изобретению, для производства фармацевтической композиции для лечения заболевания, обусловленного ослабленной иммунной системой у субъекта.

В одном из вариантов указанное заболевание является ВИЧ-инфекцией и/или СПИД.

В одном из вариантов применения под субъектом имеется в виду позвоночное животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человек.

В одном из вариантов субъект не находится в состоянии беременности.

Цель настоящего изобретения достигается применением экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению, полученного способом по настоящему изобретению, для лечения вирусной инфекции у субъекта.

Цель настоящего изобретения достигается применением экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению, полученного способом по настоящему изобретению, для производства фармацевтической композиции для лечения вирусной инфекции у субъекта.

В одном из вариантов заболевание является РНК-вирусной инфекцией, предпочтительно - ретровирусной инфекцией, наиболее предпочтительно - ВИЧ-инфекцией.

В одном из вариантов применения под субъектом имеется в виду позвоночное животное, предпочтительно - млекопитающее, наиболее предпочтительно - человек.

В одном из вариантов применения субъект не находится в состоянии беременности.

Цель настоящего изобретения достигается также с помощью фармацевтической композиции, содержащей экстракт лекарственных растений по настоящему изобретению, полученный способом по настоящему изобретению.

В одном из вариантов фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из вариантов фармацевтическая композиция предназначена для перорального приема.

Цель настоящего изобретения достигается также с помощью готового лечебного набора, включающего фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.

Термин стохастическая (случайная) форма означает, что импульс электромагнитного поля генерируется в виде шума. Предпочтительно импульс электромагнитного поля имеет прямоугольную форму и комбинируется с синусоидальной волной внутри. Мощность (в ваттах (Вт)) импульсного электромагнитного поля обозначает, например, полезную мощность. Величина напряженности магнитного поля (в тесла (Тл)) импульсного электромагнитного поля указывается, например, от пика до пика.

Эффект стимулирования иммунной системы и состояний, обусловленных ослабленной иммунной системой, может определяться методами и параметрами, известными из уровня техники. Целью такого определения может быть любой компонент клеточно-опосредованной и опосредованной антителами иммунной системы, такой как Т-лимфоциты (СИ4 и/или СИ8 Т-лимфоциты), В-лимфоциты, антитела и компоненты системы комплемента. Примером метода определения является РЛС8-анализ (активируемый флуоресценцией сортинг клеток). Предпочтительно СИ4 Т-лимфоциты определяются путем подсчета их количества или в процентах, наиболее предпочтительно в зависимом от времени режиме.

Термин ΑΙΌ8 (СПИД) в контексте описания относится к клиническому состоянию, имеющему характерные симптомы, ассоциируемые с поздними стадиями ВИЧ (Н1У)-инфекции.

Термин РНК-вирусная инфекция в контексте описания относится к инфекции РНК-вирусом, предпочтительно ретровирусом. Примерами РНК-вирусов, охваченных настоящим изобретением, являются полиовирус (вирус полиомиелита), вирус Коксаки, калицивирус, вирус гепатита А, вирус гепатита С, вирус гепатита Ό, вирус гепатита Е, энтеровирус, риновирус, вирус краснухи, СЕЕ-вирус (вирус центральноевропейского энцефалита), вирус гриппа, К.8-вирус (респираторно-синцитиальный вирус), вирус парагриппа, вирус кори, вирус паротита (свинки), коронавирус, ареновирус, Ьабва-вирус, бунья-вирус, ханта-вирус, рабдовирус, фило-вирус, Вота-вирус, НТЬУ-вирус (вирус Т-клеточной лейкемии человека) и ротавирус.

Термин фармацевтическая композиция в контексте описания включает экстракт лекарственных растений по настоящему изобретению. Он обозначает также фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один фармацевтически активный компонент экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению и/или по меньшей мере одно производное либо аналог указанного активного компонента и его соответствующие соли.

Фармацевтическая композиция может быть, например, в жидкой форме, такой как раствор, сироп, эликсир, эмульсия и суспензия, или в твердой форме, такой как капсула, облатка, таблетка, пилюля, порошок и суппозиторий. Изобретение охватывает также гранулы или полужидкие формы и гелевые облатки. В том случае, когда фармацевтическая композиция представляет собой жидкость или порошок, её

- 3 015636 стандартную (унифицированную) дозу (необязательно) необходимо измерять, например, количеством композиции в чайной ложке. В дополнение к экстракту лекарственных растений или фармацевтически активному компоненту, фармацевтическая композиция может включать, например, ароматизаторы, подсластители, пигменты, консерванты, стабилизаторы, красители, разбавители, суспендирующие средства, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связующие вещества и размельчающие агенты. Таблетка, например, может иметь оболочку. Жидкость, предназначенная для инъекции, должна быть стерильной. Изобретение охватывает также системы для трансдермального введения и заключенные в липосомы системы. Все упомянутые композиции могут быть моментального действия, пролонгированного действия и замедленного действия.

Термин фармацевтически приемлемый в контексте описания означает по меньшей мере нетоксичный. Фармацевтически приемлемый носитель в контексте описания может включать множество форм в зависимости от требуемого способа введения. Термин включает традиционные фармацевтические разбавители, такие как вода или этанол, и общеупотребительные ингредиенты таблетированных форм, такие как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или камеди.

Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению может осуществляться различными путями, такими как пероральный, сублингвальный, парентеральный, внутривенный, внутрибрюшинный, назальный, вагинальный, ректальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный и локальный. Стандартная доза может вводиться один или несколько раз в день, неделю или месяц. Введение может осуществляться также непрерывно путем внутривенного вливания или через трансдермальную систему пролонгированного действия, например.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает комбинированный экстракт лекарственных растений, полученный из Вока кр., Игйса άίοίοα и/или ТапасеШт уи1дате и обработанный излучением электромагнитного поля. Клинические данные подтвердили целебный эффект экстракта при лечении СПИД. Исследования, проведенные как ίη νίΐτο, так и на экспериментальных моделях заболевания на подопытных животных, показали, что экстракт не обладает токсичностью, мутагенными или канцерогенными свойствами. Однако он противопоказан при беременности.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Ниже изобретение описывается более подробно с приведением нижеследующих примеров для иллюстрации изобретения. Однако эти примеры ни в коей мере не ограничивают предмет или масштаб изобретения.

Пример 1. Получение свежих экстрактов лекарственных растений

Листья и тонкие стебли крапивы двудомной (итйса бююа) и пижмы обыкновенной (ТапасеШт νυ1даге) собирают в дикорастущем виде. После отделения пригодных для использования частей растений и их начальной очистки материал подвергают сушке на деревянной решетке в темноте в течение 3-4 суток предпочтительно при 42°С. В высушенном состоянии растительный материал должен быть зеленого цвета без какого-либо изменения его окраски, а листья и стебли должны быть ломкими. Для получения экстракта используют герметичную стеклянную посуду. Высушенный растительный материал измельчают на мелкие фрагменты (2-5 см) и помещают в склянки, заполняя последние до отказа. После утрамбовки (сдавливания) добавляют этиловый спирт (96%; в описании %-ная концентрация раствора этанола выражается в об.%) до тех пор, пока склянки не будут полностью наполнены. Склянки помещают в термостат (37-45°С, предпочтительно 42°С) на 20-40 суток до образования раствора темно-зеленого цвета.

Для получения экстракта шиповника собачьего (Вока сашпа) используют сушеные плоды. В других вариантах альтернативно или в дополнение можно использовать другие виды растений рода Вока. Плоды помещают в герметичные склянки, заполняя их до половины, и добавляют этиловый спирт. Склянки выдерживают в термостате (37-45°С, предпочтительно 42°С) в течение 20-40 суток, пока не образуется раствор оранжево-красного цвета.

После выдержки в термостате, когда растительный материал полностью обесцветится, экстракты собирают путем отделения их от растительного материала через тканевый фильтр.

Пример 2. Обработка электромагнитным полем

Экстракт Вока сапша подвергают обработке электромагнитным полем в течение 3 мин. Затем от 50 до 70 мл облученного экстракта Вока сашпа добавляют к 2 л экстрактов Игйса бююа и ТапасеШт νи1да^е соответственно. На каждый литр комбинированных экстрактов иШса/Вока и Тапасе1ит/Вока добавляют соответственно 16 мг селена и 150 мг мочевины. В альтернативных вариантах добавляют либо селен, либо мочевину. Затем склянки вновь укупоривают и выдерживают в термостате в течение 24 суток при 42°С. После выдержки в термостате склянки 4 раза подвергают обработке электромагнитным полем по 3 мин каждый раз, после чего содержимое склянок объединяют. Готовый экстракт последовательно пропускают через фильтры с размером отверстий соответственно 5; 0,45 и 0,22 мкм и распределяют по стерильным флаконам. После маркировки и упаковки экстракт готов к употреблению.

Электромагнитное поле, воздействию которого подвергают свежеполученные экстракты, является импульсным, мощным и однополюсным, поскольку направление электрического тока, генерируемого генератором магнитных импульсов (МЮ), остается неизменным. Импульсное магнитное поле характе

- 4 015636 ризуется очень высокой частотой - от 5 до 750 кГц. В настоящем примере используется импульс прямоугольной формы.

Однако в других вариантах рассматривается также синусоидальная или стохастическая форма импульса. Предпочтительно импульс имеет прямоугольную форму и объединяется внутри с синусоидальной волной. Не желая останавливаться на теории, авторы изобретения выдвинули гипотезу, что особый вид генерируемых импульсов вызывает некоторые изменения в физической конфигурации атомов в молекулах и/или в пространственном расположении молекул, что приводит к изменению химических свойств.

В процессе получения экстрактов проводится 3-4-разовое облучение электромагнитными импульсами высокой частоты продолжительностью 2-5 мин каждый раз. Электрическая мощность (например, полезная мощность) импульсов составляет примерно от 20 до 100 Вт; наилучший эффект достигается при 45 Вт.

Пример 3. Доклинические исследования

В доклинических исследованиях экстракт лекарственных растений по настоящему изобретению испытывался на острую и хроническую токсичность. В исследованиях экстракта на острую токсичность мышам линии ВЛЬВ/е и крысам линии №181ат вводились одноразовые внутримышечные (в/м) инъекции. Хроническая токсичность экстракта изучалась в продолжение 3 месяцев на крысах №181ат и в продолжение 1 месяца на собаках. Исследовались потенциальные мутагенные, эмбриотоксические, тератогенные, аллергенные и иммунотоксические свойства экстракта лекарственных растений, а также его действие на репродуктивную функцию.

Из результатов проведенных экспериментов стало очевидным, что экстракт лекарственных растений по настоящему изобретению показал себя как малотоксичное лекарственное средство при одноразовой в/м инъекции мышам ВЛЬВ/е и крысам ХУМаг. В условиях экспериментов на острую токсичность ЬО₅₀ (летальная доза) экстракта при внутрибрюшинном (в/б) введении в виде разведения 1:5 в нормальном физиологическом растворе составила от 51 до 54 мг/кг для крыс и от 56 до 59 мл/кг для мышей.

При в/м или внутрибрюшинном (в/б) введении экстракта лекарственных растений мышам ВЛЬВ/е или крысам ХУЬ1аг не наблюдалось видовых или половых различий в чувствительности подопытных животных к токсическому действию экстракта. Картина интоксикации мышей ВЛЬВ/е и крыс У181ат при введении им доз, равных ЬО₅₀, была такой же, что и при отравлении этиловым спиртом; этиловый спирт использовался в высоких концентрациях в качестве растворителя при получении экстракта лекарственных растений. В исследованиях хронической (долговременной) токсичности экстракта при в/м введении его крысам в дозах 0,07 и 0,21 мг/кг один раз в день в течение 3 месяцев (превышающих в 10-30 раз суточную дозу для человека) и собакам в дозе 0,07 мл/кг (превышающей в 10 раз суточную дозу для человека) один раз в день в течение 1 месяца не наблюдалось его повреждающего действия на основные органы и системы животного организма.

Экстракт лекарственных растений по настоящему изобретению не обладал мутагенными свойствами и не влиял на репродуктивную функцию животных. При в/м введении экстракта один раз в день крысам в течение беременности (с первого дня до родов) в дозе 0,21 мл/кг экстракт проявил эмбриотоксические и тератогенные свойства. Именно по этой причине он противопоказан при беременности.

Далее при введении экстракта морским свинкам в дозах 0,07 и 0,14 мл/кг через день в течение 10 дней он не показал аллергенных или иммунотоксических свойств.

Вывод: результаты токсикологических экспериментов показывают, что экстракт лекарственных растений по настоящему изобретению можно использовать в систематических клинических испытаниях с учетом его противопоказания при беременности.

3.1. Острая токсичность

Исследования проводились на 128 мышах ВЛЬВ/е (самцах и самках с массой тела от 18 до 20 г) и 47 крысах У181ат (самцах и самках с массой тела от 180 до 220 г) с в/м введением экстракта лекарственных растений мышам и в/б введением его мышам и крысам. Экстракт лекарственных растений сначала разводился в соотношении 1:10 и 1:5 в стерильном нормальном физиологическом растворе, а затем различные объемы его указанных разведений вводились подопытным животным. Наблюдения над подопытными животными проводились в продолжение 14 суток с целью установления возможного токсического действия экстракта.

Токсичность экстракта лекарственных растений при его одноразовом введении подопытным животным определялась двухступенчатым методом: сначала устанавливалась примерная ЬО₅₀ по методике Эсйипап и ЬеЫаис, а затем определялись точные показатели ЬИ^, ЬО₅₀, ± 80 (стандартное отклонение) и ЬИ₈₄ путем пробит-анализа по ЬйсййеИ и ХУПсохоп.

Проведенные эксперименты выявили, что однократная в/м инъекция экстракта лекарственных растений в разведении 1:10 в нормальном физиологическом растворе в дозах от 25 до 50 мг/кг мышам ВЛЬВ/с не вызывала интоксикации и летального исхода животных. При увеличении доз до 75-100 мл/кг наблюдалось снижение двигательной активности у животных, но без летального исхода. Инъекция экстракта лекарственных растений в разведении 1:5 в нормальном физиологическом растворе в дозах от 25 до 50 мг/кг вызывала боль, глубокую депрессию и, в конце концов, приводила к гибели животного спус

- 5 015636 тя несколько часов. Профиль интоксикации экстрактом лекарственных растений у мышей был сходен с профилем интоксикации их при отравлении этиловым спиртом (37,3 мл/кг), который присутствует в высоких концентрациях в экстракте лекарственных растений в качестве носителя. Результаты, полученные на крысах У181ат, были аналогичны результатам, наблюдавшимся у мышей Ва1Ь/с.

Таблица 1. Параметры острой токсичности экстракта лекарственных растений и этанола (96%) в разведении 1:5 в нормальном физиологическом растворе при в/м или в/б введении их в различных концентрациях подопытным животным

Способ		Параметры токсичности [мл/кг]
введения	1ЛЭ16	1Л>50 ± 8 Г)		ЬИ16	ЬИ5о±8И	ЬИ84
		самцы			самки
	Мыши	ВАЬВ/с (экстракт лекарственных растений)
в/м	53	66 ± 4,6	82	49	66 ± 4,6	78
в/б	46	59 ±3,8	75	43	56 ± 3,7	72

Мыши ВАЬВ/с (этиловый спирт)

в/б	30,4 I 37,3 ±2,1 I 44,8	ΝΌ* 1 ΝΟ* I	ИИ*
	Крысы У/тЧаг (экстракт лекарственных растений)
в/б	42 | 54 ±4,3 | 71	38 | 51 ±4,2 |	67

* ΝΌ - не определялись

Данные, представленные в табл. 1, показывают, например, что токсичность экстракта лекарственных растений в соответствии с параметрами токсикометрии не показала существенных различий между его в/м и в/б введениями.

3.2. Хроническая токсичность

3.2.1. Исследования на крысах

Исследования токсичности экстракта лекарственных растений по настоящему изобретению выполнялись в течение 3 месяцев при в/м введении его крысам \УМаг. Эти исследования проводились на 90 крысах \УМаг (самцах и самках с массой тела от 180 до 200 г), которые были распределены по 3 группам по 30 животных в каждой (15 самцов и 15 самок). Первая группа служила контролем (получала нормальный физиологический раствор), вторая группа получала 0,07 мл/кг экстракта лекарственных растений, а третья группа - 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений. Исследуемые в экспериментах дозы были в 10 и 30 раз выше суточной терапевтической дозы, рекомендованной для человека (0,5 мл экстракта лекарственных растений, разведенного в 5 мл нормального физиологического раствора, или 0,007 мл/кг экстракта).

Результаты показали, что в/м инъекция экстракта лекарственных растений в дозах 0,07 и 0,21 мл/кг не оказывала никакого действия на общее состояние и поведение крыс. В ходе экспериментов на хроническую токсичность не наблюдалось статистически значимой разницы в количестве эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и в уровнях гемоглобина между животными, получавшими соответственно 0,07 и 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений и контролем (табл. 2 и 3).

Таблица 2. Гематологические показатели у самцов крыс спустя 3 месяца после в/м инъекции экстракта лекарственных растений

Эритроциты [х 10¹²/л]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	7,3 ± 0,6	7,4 ± 0,4	7,3 ± 0,2
Спустя 1 месяц	7,3 ± 0,5	7,5 ± 0,4	7,7 ± 0,5
Спустя 3 месяца	7,6 ±0,4	7,8 ± 0,3	7,7 ± 0,6

Лейкоциты [х 10⁹/л ]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы^ получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	11,4 ± 0,7	11,0± 0,5	11,0 ±0,5
Спустя 1 месяц	11,7 ±0,6 1 11,1 ±0,3	11,2 ±0,4
Спустя 3 месяца	11,2 ±0,7 1 11,2 ±0,4	11,3 ±0,6

Тромбоциты [х 10⁹/л]

- 6 015636

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	660 ± 30	660 ± 30	660 ±30
Спустя I месяц	672 ±33	663 ± 23	669 ± 24
Спустя 3 месяца	667 ± 29	669 ±31	665 ± 28

Гемоглобин [г/л]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	111 ±4	110± 3	111 ±2
Спустя 1 месяц	114 ± 3	115±4	117 ± 5
Спустя 3 месяца	116 ± 4	115 ± 3	118 ± 3

Таблица 3. Гематологические показатели у самок крыс спустя 3 месяца после в/м инъекции экстракта лекарственных растений

Эритроциты [х 10¹²/л]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	7,2 ± 0,4	7,2 ± 0,3	7,0 ±0,3
Спустя 1 месяц	7,1 ± 0,4	7,4 ±0,5	7,6 ± 0,4
Спустя 3 месяца	7,3 ± 0,4	7,7 ±0,4	7,8 ± 0,3

Лейкоциты [х 10⁹/л]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	11,3 ±0,4	11,6 ±0,5	11,4 ±0,3
Спустя 1 месяц	11,5 ±0,5	11,2 ±0,3	11,5 ±0,5
Спустя 3 месяца	11,2 ±0,6	11,1 ±0,4	11,2 ±0,3

Тромбоциты [х 10⁹/л]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	670 ± 27	660 ± 20	671 ±25
Спустя I месяц	678 ± 24	669 ± 27	673 ± 22
Спустя 3 месяца	667 ± 25	668 ± 21	662 ± 22

Гемоглобин г/л]

Период наблюдений	Контрольная группа	Группы, получавшие экстракт лекарственных растений
		0,07 мл/кг	0,21 мл/кг
Начальный показатель	112 ±4	110 ± 3	111 ±4
Спустя 1 месяц	114 ± 3	118 ± 4	119 ± 4
Спустя 3 месяца	ИЗ ± 5	119 ± 6	119 ± 7

В условиях экспериментов на выявление хронической токсичности на крысах, т.е. при в/м инъекции экстракта в дозах 0,07 мл/кг и 0,21 мл/кг не наблюдалось существенных изменений в уровне общего белка сыворотки крови. Отсутствие наносящего ущерб здоровью действия экстракта лекарственных растений при длительном введении его крысам в дозах 0,07 мл/кг и 0,21 мл/кг подтверждается стабильной активностью печёночных ферментов, таких как аспартат- и аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназа и щелочная фосфатаза, в продолжение 3 месяцев экспериментов на хроническую токсичность. Длительное введение экстракта лекарственных растений крысам не оказывало влияния на уровни билирубина, холестерина, триглицеридов, мочевины, креатинина и глюкозы в сыворотке крови под опытных животных.

Длительное введение экстракта, разведенного 1:10 в нормальном физиологическом растворе, в дозах 0,07 мл/кг и 0,21 мл/кг в бедренную мышцу животных не оказывало местного раздражающего дейст вия.

Макроскопические исследования не показали токсических или токсико-аллергенных реакций у животных в группе, получавшей экстракт лекарственных растений.

Не наблюдалось также патологических изменений внутренних органов (мозга, шишковидной железы, тимуса, трахеи, лёгких, сердца, пищевода, селезёнки, печени, поджелудочной железы, надпочечников, почек, желудка и репродуктивных органов у самок и самцов) у животных указанной группы в течение 3 месяцев в/м введения им экстракта лекарственных растений в дозе 0,21 мл/кг.

3.2.2. Исследования на собаках

Исследования проводились на 8 собаках (самцах с начальной массой тела от 12 до 14,5 кг), которых

- 7 015636 распределили по 2 группам по 4 животных в каждой: первая группа служила контролем, вторая группа получала экстракт лекарственных растений в дозе 0,07 мл/кг. Вводимая доза экстракта в 10 раз превышала предельно допустимую суточную терапевтическую дозу для человека. Исследуемый экстракт в дозе 0,07 мл/кг разбавлялся в стерильном нормальном физиологическом растворе в соотношении 1:10, а затем инъецировался в бедренную мышцу собак один раз в сутки в течение 1 месяца.

Анализ электрокардиограмм (ЭКГ), полученных до начала исследований на собаках и спустя 1 месяц после начала введения экстракта в дозе 0,07 мл/кг, не выявил увеличения частоты сердечных сокращений или изменения параметров ЭКГ. У подопытных животных все параметры ЭКГ не отличались до и после экспериментов от параметров ЭКГ у животных контрольной группы (табл. 4).

Таблица 4. Параметры ЭКГ у собак, получавших экстракт лекарственных растений в виде в/м инъекции в дозе 0,07 мл/кг в течение 1 месяца

Параметры ЭКГ	Начальный показатель	Спустя 1 месяц
Контрольная группа	Группа, получавшая экстракт лекарственных растений в дозе 007 мл/кг	Контрольная группа	Группа, получавшая экстракт лекарственных растений в дозе 007 мл/кг
К.-К., м сек	467 ±38	458 ± 35	466 ±32	462 ± 22
Р-Р, м сек	86 + 12	89 ±16	85 + 21	89+ 16
Ο-Т.м сек	139± 19	146± 18	138 ± 15	139+15
ОК.8, м сек	40 ±6	39 ±3	39 ±4	39 ±6
8Т, м сек	0,4 ±0,2	0,4 ± 0,2	0,4 ± 0,2	0,4 + 0,2
ТР, м сек	189± 19	1392±28	186 ±22	194 ±23
Р, м сек	0,30 ± 0,03	0,29 ±0,05	0,26 ±0,04	0,28 ± 0,04
К., м сек	1,38 ±0,12	1,39 ±0,24	1,42 ±0,22	1,38 ±0,23
Т, м сек	0,30 ± 0,06	0,32 ± 0,06	0,29 ± 0,06	0,28 ± 0,05
Частота сердечных сокращений/мин.	139 ± 15	145 ± 15	138 ± 12	146+ 12

Результаты показали, что ежедневное в/м введение экстракта лекарственных растений собакам в течение 1 месяца в дозе 0,07 мл/кг (в 10 раз выше суточной дозы для человека) не оказывало какого-либо воздействия на общее состояние и поведение животных и не вызывало изменения функционального состояния основных органов и систем животного организма.

В соответствии с полученными авторами изобретения данными гистологических исследований у собак не было отмечено никаких токсических или местных раздражающих реакций при в/м инъекциях в течение 1 месяца экстракта лекарственных растений в дозе 0,07 мл/кг.

3.3. Мутагенность

3.3.1. Генные мутации у микроорганизмов (тест Эймса)

Оценка мутагенной активности экстракта лекарственных растений проводилась согласно методике определения способности вещества индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации ίη νίίτο и вне такой системы. Применялся чашечный метод идентификации мутаций. Этот метод был разработан Эймсом с сотр.; в качестве индикаторных микроорганизмов авторами изобретения использовались три автотрофных штаммов на гистидин, а именно: 8а1топе11а 1урЫтипит ТА 98, ТА 100 и ТА 1537.

Для проведения теста Эймса были приготовлены разведения экстракта лекарственных растений путем измерения и взвешивания начального раствора экстракта и разбавления его дистиллированной водой до концентрации 10 мг/мл. Были приготовлены также последующие разведения в дистиллированной воде, которые вносились в чашки Петри. В ходе теста испытывались концентрации экстракта от 0,1 до 1000 мкг/чашку. Дистиллированная вода использовалась как отрицательный контроль.

- 8 015636

Таблица 5. Действие экстракта лекарственных растений на бактериальный индикаторный штамм ТА 98 в тесте Эймса

Исследуемое вещество	Доза мкг/чашку	Штамм ТА 98
-59	+89
		М, 1.2.2	Среднее	Мо/Мк	МА	М, 1.2.2	Среднее	М()/Мк	МА
Отрицательный контроль №О)	0	33 29 37	32,8	1	-	40 36 31	35,5	1	-
Положительный контроль (2АА)	20	0 0 0	0 0 0	0 0 0	-	1211 1280 1140	1209	34,0	Ч-
Положительный контроль (ΑΝ2Ο)	0,5	568 567 614	6	17,8	+	0 0 0	0 0 0	0 0 0	-
Экстракт лекарственных растений	0,!	35 32 35	34,0	1,04	-	30 42 45	38,4	1,08
1,0	29 32 37	32,5	0,99		40 35 29	34,4	0,97
10,0	28 34 38	33,1	1,01	-	36 35 32	34,3	0,97
100,0	27 30 26	27,6	0,84	-	192731	25,1	0,71
1000,0	29 28 33	29,9	0,91	-	30 28 39	32	0,90

Общепринятые обозначения и сокращения: М₁ - число ревертантов/чашку; М - геометрическое среднее; М₀/М_к - отношение числа ревертантов в тесте к числу ревертантов в отрицательном контроле; МА - мутагенная активность: + - наличие активности, - отсутствие активности.

Таблица 6. Действие экстракта лекарственных растений на бактериальный индикаторный штамм ТА 100 в тесте Эймса

Исследуемое вещество	Доза мкг/чашку	Штамм ТА 100
-89	+89
		М, 1.2.2	Среднее	Мо/Мк	МА	М, 1.2.2	Среднее	Мо/Мк	МА
Отрицательный контроль (Н2О)	0	144 223 228	194,2	!	-	188 287 206	223,2	1	-
Положительный контроль (2АА)	20	0 0 0	0 0 0	0 0 0	-	2712 2008 2200	2288,2	10,2	+
Положительный контроль (азид натрия)	0,5	1240 1368 1288	1297,6	6,68	+	0 0 0	0 0 0	0 0 0	-
Экстракт лекарственных растений	0,1	185 154 225	185,8	0,96		190 253 284	239,0	1,07
1,0	154 169 213	177	0,91		176 185 222	193,3	0,87
10,0	153 201 242	195,2	1,00		175 185 193	184,2	0,82
100,0	165 221 213	198,0	1,02		146 202 201	181,0	0,81
1000,0	209 207 202	206	1,06		131 136 194	151,2	0,68

- 9 015636

Таблица 7. Действие экстракта лекарственных растений на бактериальный индикаторный штамм ТА 1537 в тесте Эймса

Исследуемое вещество	Доза мкг/чашку	Штамм ТА 100
-89	+89
		М, 1,2.2	Среднее	Мо/Мк	МА	Μ 1.2,2	Среднее	Мо/Мк	МА
Отрицательный контроль (Н2О)	0	6 6 10	7,11	1	-	9 9 11	9,62	1	-
Положительный контроль (2АА)	20	0 0 0	0 0 0	0 0 0	-	126 144 118	128,9	13,4
Положительный контроль (9АА)	20	5448 5632 5752	5609,3	788,5	+	0 0 0	0 0 0	0 0 0	-
Экстракт лекарственных растений	0,1	6 6 4	5,24	0,74	-	7 6 8	6,95	0,72
1,0	8 7 7	7,32	1,03	-	10 8 8	8,62	0,90
10,0	10 10 9	9,65	1,36	-	5 3 3	3,56	0,37
100,0	5 5 5	5,00	0,70	-	8 7 9	7,96	0,83
1000,0	10 8 9	8,96	1,26	-	7 6 5	5,94	0,62

На основании вышеприведенных данных сделан вывод, что экстракт лекарственных растений в концентрациях от 0,1 до 1000 мкг/чашку не вызывает увеличения числа ревертантов в штаммах 8а1шопе11а (урЫшипиш ТА 98, ТА 100, ТА 1537. Следовательно, экстракт лекарственных растений не обладает мутагенным действием согласно тесту Эймса.

3.3.2. Доминантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей

Настоящие эксперименты проводились с целью оценки потенциальных мутагенных свойств экстракта лекарственных растений на основе изучения доминантных летальных мутаций у гибридных мышей Т1(СВАхС₅₇В1₆).

Экстракт лекарственных растений, разведенный в нормальном физиологическом растворе, вводился в/м мышам-самцам в дозе 0,7 мл/кг. Эта доза в 100 раз превышает рекомендованную для человека суточную дозу (0,007 мл/кг).

Таблица 8. Результаты оценки способности экстракта лекарственных растений индуцировать доминантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей

Стадии сперматогенеза	Доза	Общее число самок мышей	Число беременных самок	Фертильность (%)	Гибель зародышей после имплантации (прикрепления зародыша к эндометрию)	X2
Нормальные	0(контроль)	41	33	80,5	0,112
(зрелые)	Экстракт
сперматозоиды	лекарственных растений 700 мкл/кг	39	34	75,6	0,011
Позднего	0(контроль)	42	30	71,4	0,082
созревания	Экстракт
сперматиды	лекарственных
(предшественники	растений	39	29	74,4	0,037
сперматозоидов)	700 мкл/кг
Раннего	0(контроль)	42	38	90,5	0,055
созревания	Экстракт
сперматиды	лекарственных растений 700 мкп/кг	38	29	76,3	0,143	9,87
Повторные	Экстракт
эксперименты	лекарственных растений 700 мкл/кг	32	24	75,0	0,061	0,018
Среднее 2-х	Экстракт
экспериментов	лекарственных растений 700 мкл/кг	35	27	90,5	0,099	2,93
Суммарный	Экстракт
показатель	лекарственных
экспериментов и	растений	70	53	76,0	0,097
повторных экспериментов	700 мкл/кг

Результаты 4-й	Экстракт
недели	лекарственных растений 700 мкл/кг	33	33	100	0,040

Как можно видеть из табл. 8, уровень гибели зародышей после имплантации (т.е. прикрепления зародышей к эндометрию) у животных, подвергшихся действию одноразовой в/м инъекции экстракта ле- 10 015636 карственных растений в дозе 700 мкл/кг, не превышает уровня гибели у контрольных животных.

3.3.3. Хромосомные аберрации в клетках костного мозга мышей

Суть этого метода заключается в оценке воздействия изучаемого вещества, введенного в организм животного, на генетическую систему клеток костного мозга, чувствительных к действию химических агентов и физических факторов. Хромосомные аберрации анализировались после введения экстракта лекарственных растений в соответствии со схемой, описанной в Инструкции по экспериментальному (доклиническому) исследованию новых фармакологических веществ.

Таблица 9. Повреждения структуры хромосом в клетках костного мозга мышей под действием экстракта лекарственных растений

Варианты	№	Количество клеток	Аберрации
ПО результатам подсчета	с аберрациями	Фрагменты	Обмен	Кол-ва	Промежутки
одиноч- ные	пар- ные
Экстракт лекарственных растений, 700 мкл/кг (спустя 24 часа после подсчета)	1	100	0	0	0	0	0	0
2	100	1	0	0	0	0	1
3	100	2	2	0	0	0	0
4	100	2	2	0	0	0	0
5	100	0	0	0	0	0	0
Всего		500	5	4	0	0	0	1
Экстракт лекарственных растений, 700 мкл/кг, инъекция в течение 4 дней (6 часов после 4-го дня подсчета)	1	100	0	0	0	0	0	0
2	100	1	0	0	0	0	1
3	100	2	2	0	0	0	0
4	100	1	1	0	0	0	0
5	100	0	0	0	0	0	0
Всего		500	4	3	0	0	0	1
Нормальный физиологический раствор	1	100	2	2	0	0	0	0
2	100	1	0	0	0	0	1
3	100	2	1	0	0	0	1
4	100	0	0	0	0	0	0
5	100	0	0	0	0	0	0
Всего		500	5	3	0	0	0	2

Как можно видеть из данных эксперимента, статистически значимой разницы в уровне хромосомных аберраций в костном мозге мышей, подвергшихся воздействию экстракта лекарственных растений в исследуемых дозах, по сравнению с контролем не наблюдалось. Таким образом, согласно методу оценки хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей экстракт лекарственных растений не обладает мутагенной активностью.

3.3.4. Разрушающее действие на ДНК в 808-хромотесте

Одним из тестов для оценки повреждения ДНК является тест на определение способности бактериальной клетки индуцировать 808-отклик на действие изучаемого агента - так называемый 808хромотест. Тест основан на знании 808-отклика на повреждение ДНК. Основу теста составляет штамм Е. сой Рр 37, созданный посредством ассоциации гена Ьас2, ответственного за синтез фермента бетагалактозидазы, с геном 8ЙЛ, контролируемым общим репрессором 808-системы. Экспрессия δίϊΆ индуцируется после повреждения ДНК как часть 808-отклика. В настоящем тесте 808-экспрессия измеряется путем качественной оценки активности фермента бета-галактозидазы, которую можно измерить посредством цветной реакции. Маркером клеточного роста в указанном штамме служит щелочная фосфатаза, активность которой можно также измерить посредством цветной реакции. В результате анализа получают кривые зависимости синтеза бета-галактозидазы от концентрации исследуемого вещества и кривые, характеризующие изменения бактериального роста в данных условиях. По этим показателям можно рассчитать 808-индуцирующую способность. Эта способность отражает свойство вещества индуцировать экспрессию гена δίϊΆ.

Полученные результаты показали, что экстракт лекарственных растений не индуцировал активацию системы восстановления ДНК при всех изучавшихся в тесте концентрациях в Е. сой РО 37. Следовательно, экстракт лекарственных растений не обладает разрушающим ДНК действием.

3.4. Эмбриотоксичность и тератогенность

Эксперименты проводились на 36 беременных крысах ХУМаг распределенных по 2 группам по 18 животных в каждой: первая группа служила контролем, вторая группа получала экстракт лекарственных растений (в дозе 0,21 мл/кг, что в 30 раз превышает предельно допустимую суточную дозу для человека). Композиция разводилась в нормальном физиологичексом растворе и вводилась крысам в/м один раз в день в течение всего периода беременности (с первого дня до родов). Контрольные животные получали соответствующее количество нормального физиологического раствора ежедневно с первого дня бере

- 11 015636 менности до родов. На 20-й день беременности 70% беременных крыс были умерщвлены посредством смещения шейных позвонков с целью последующего изучения костного скелета и внутренних органов плода каждой крысы и определения признаков гибели до и после имплантации.

Таблица 10. Изменения массы тела беременных крыс (% от начальной массы тела)

Группа животных	Спустя 1 неделю	Спустя 2 недели	Спустя 3 недели
Контрольная	123 ± 1,9	136,7 ±2,2	145,7 ± 2,8
Получавшая экстракт лекарственных растений в дозе 0,21 мо/кг	112,5 ± 1,5*	120,5 ±3,4*	131,6±4,5*

Примечание: * указывает на существенное различие (Р < 0,05)

Как видно из суммированных в табл. 10 данных, в/м инъекция экстракта лекарственных растений беременным самкам крыс в дозе 0,21 мл/кг не оказывала влияния на увеличение массы тела беременных крыс по сравнению с контрольной группой в течение всего периода беременности.

Такие критерии оценки эмбриотоксичности экстракта лекарственных растений в период беременности, как количество жизнеспособных эмбрионов, мест имплантации, желтых тел и масса тела эмбриона, были ниже в группе крыс, получавших композицию экстракта. Показатель гибели до имплантации в экспериментальной группе был значительно выше, чем в контрольной, а после имплантации - ниже. Краниокаудальный (черепно-хвостовой) размер плода беременных крыс, получавших композицию в дозе 0,21 мл/кг, статистически не отличался от соответствующего показателя в контрольной группе (табл. 11).

Таблица 11. Показатели эмбриотоксического действия экстракта лекарственных растений в дозе 0,21 мл/кг при в/м введении композиции с первого дня по 20-й день беременности

Изучаемые показатели	Контрольная группа	Группа, получавшая экстракта лекарственных растений в дозе 0,21 мл/кг
Продолжительность беременности (дней)	24,5 ± 0,2	23,3 ± 0,2*
Количество эмбрионов/крысу	9,5 ±1,3	5,5 ± 0,6*
Количество желтых тел/крысу	10,0 ± 1,2	6,0 ± 0,8*
% гибели до имплантации	13,5	40,8
% гибели после имплантации	8	5,1
Кранио-каудальный размер плода (см)	3,3 ± 0,1	3,0 ±0,1
Масса плода (г)	3,0 ±0,1	2,2 ± 0,2*

Примечание: * указывает на существенную разницу (Р < 0,05)

Макроскопические и микроанатомические исследования (стандартные срезы по Χνίΐχοη-Ωίόηη) зародышей, подвергшихся воздействию экстракта лекарственных растений в пренатальный период в дозе 0,21 мл/кг, выявили недоразвитие плода в 6,7% случаев. Частота таких патологий, как гидронефроз и гемоперикард, в группе крыс, получавших экстракт лекарственных растений в течение беременности, превысила аналогичный показатель в контрольной группе.

При анализе общих препаратов тела зародышей, окрашенных ализарином с целью изучения развития костной системы у зародышей крыс, подвергшихся воздействию экстракта лекарственных растений в пренатальный период в дозе 0,21 мл/кг, не было выявлено пороков развития скелета. Однако в большинстве исследованных очагов окостенения наблюдалось ингибирование этого процесса.

В заключение следует отметить, что в/м введение экстракта лекарственных растений в дозе 0,21 мл/кг (указанная доза превышала в 30 раз предельно допустимую терапевтическую дозу для человека) беременным крысам с 1-го по 20-й день беременности оказало отрицательное действие на изменение массы тела беременных крыс и на длительность беременности. Было отмечено влияние композиции экстракта на показатели эмбриотоксичности, такие как количество жизнеспособных зародышей, масса зародыша, количество мест имплантации и желтых тел, параметры гибели до и после имплантации, а также на ингибирование процесса окостенения в очагах окостенения.

В течение постнатального развития молодых крыс отмечалось значительное отставание в физическом развитии. В экспериментальной группе недоразвитие плода было выявлено в 6,7% случаев. Это недоразвитие можно рассматривать как порок развития эмбрионов.

Таким образом, было выявлено эмбриотоксичное и тератогенное действие экстракта лекарственных растений в дозе 0,21 мл/кг. В связи с этим, беременность следует рассматривать как противопоказание к приему композиции экстракта.

3.5. Влияние на репродуктивную функцию

Исследования проводились на крысах νίχΟΐΓ (самцах и самках с начальной массой тела от 180 до 200 г). Группу самок, состоящую из 60 животных, разделили на две подгруппы - контрольную (40 животных) и экспериментальную (20 животных). Самкам экспериментальной подгруппы ежедневно вводили в/м экстракт лекарственных растений в дозе 0,21 мл/кг в течение 2 недель (3-4 эстральных цикла).

- 12 015636

Перед инъекцией экстракт разводили в нормальном физиологическом растворе.

Внутримышечная инъекция 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений крысам обоих полов не изменяла такие показатели репродуктивной функции крыс, как количество желтых тел, мест имплантации, жизнеспособных зародышей и резорбций. Число случаев гибели зародышей до и после имплантации в экспериментальной подгруппе почти не отличалось от контроля; это было справедливо как для самок, получавших композицию, так и для самок, оплодотворенных самцами, получавшими инъекции композиции.

Исследования позволили установить, что в/м инъекция 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений (указанная доза в 30 раз превышала предельно допустимую суточную дозу, рекомендованную для человека) не оказывала влияния ни на половую активность, репродуктивные показатели (количество жизнеспособных зародышей, их масса тела, количество желтых тел, кранио-каудальный размер, места имплантации, резорбции), ни на неонатальное развитие крыс. Таким образом, не было выявлено какоголибо влияния исследуемой композиции экстракта на репродуктивную функцию сексуально здоровых взрослых крыс.

3.6. Действие экстракта на иммунитет

3.6.1. Аллергенное и анафилактическое действие

Настоящее исследование проводилось в соответствии с Методическими указаниями по оценке аллергенных свойств фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2000, с. 25-32).

Исследования проводились на 15 морских свинках (самцах с массой тела от 270 до 320 г), которые распределили по трем группам. В каждую группу входило 5 животных: первая группа - контроль (получала нормальный физиологический раствор), вторая группа получала 0,07 мл/кг экстракта лекарственных растений, а третья группа - 0,14 мл/кг экстракта лекарственных растений. Указанные дозы композиции в 10 и 20 раз превышали суточные дозы, рекомендованные для человека. Исследования показали, что доза 0,14 мл/кг экстракта лекарственных растений (т.е. превышающая в 20 раз суточную терапевтическую дозу для человека) не вызывала анафилактического шока при в/м инъекции на 14-й и на 21-й день сенсибилизации.

3.6.2. Реакции гиперчувствительности замедленного типа

Исследования проводились на коже 15 морских свинок (самцов с массой тела от 260 до 310 г) с кожным покровом белого цвета. Их распределили по 3 группам по 5 животных в каждой: первая группа служила контролем, вторая группа получала 0,007 мл/кг экстракта лекарственных растений, а третья группа - 0,035 мл/кг экстракта лекарственных растений. Указанные дозы экстракта лекарственных растений сначала разводили в стерильном нормальном физиологическом растворе, а затем смешивали с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, после чего инъецировали животным. По результатам предыдущих исследований реакция гиперчувствительности замедленного типа на указанные дозы экстракта лекарственных растений у морских свинок была отрицательной.

Сорок девять мышей-гибридов Р1 (СВА*С57В16) (самцов с массой тела от 18 до 20 г) разделили на 7 групп по 7 животных в каждой. Мышей иммунизировали подкожной (п/к) инъекцией ВСЯ (доза: 2х10⁸ клеток/мышь) в межлопаточную область. Разница в их массе характеризовала степень отёчности и интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа. Показатель реакции рассчитывался по формуле:

и = [(Ро- Ρςοηΐτοί) /РсотгоО X 100, где Р₀ - масса в экспериментальной группе; Р_СОп4го1 - масса в контрольной группе.

Данные анализа подтвердили, что тестируемые дозы экстракта лекарственных растений, т.е. 0,18 и 0,07 мл/кг, не оказывали действия на индуцирование реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей или на формирование клеточного иммунитета. Таким образом, результаты экспериментов показали, что экстракт лекарственных растений не обладает иммунотоксическими свойствами.

3.6.3. Влияние на массу и количество клеток подколенных лимфатических узлов у мышей

Для оценки аллергенных свойств экстракта лекарственных растений применялся метод контроля массы подколенных лимфатических узлов и её изменения у крыс в ответ на антигенный раздражитель, так называемый анализ подколенных лимфатических узлов (ΡΤΝΑ). Десяти гибридным мышам Р1 (СВА* С57В16) (самцам с массой тела от 18 до 20 г) вводили 50 мкл стерильного нормального физиологического раствора (контроль), а другим десяти - 0,07 мл/кг экстракта лекарственных растений.

Спустя 7 дней определяли массу и насыщенность клетками правого и левого подколенных лимфатических узлов. Относительный показатель рассчитывали путем деления показателей левого лимфатического узла на такие же показатели правого лимфатического узла. Относительные показатели массы и насыщенности клетками лимфатических узлов в экспериментальной и контрольной группах составили соответственно 0,95 и 0,98. Таким образом, оценка влияния экстракта лекарственных растений на массу и насыщенность клетками лимфатических узлов показала, что указанный экстракт не обладает аллергенными свойствами.

- 13 015636

3.6.4. Иммунотоксический эффект

Исследование различных иммунотоксических свойств экстракта лекарственных растений проводилось в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Оценка влияния экстракта лекарственных растений на гуморальный иммунный ответ осуществлялась по количеству продуцирующих антитела клеток в селезенке по Егпе. Влияние экстракта лекарственных растений на клеточный иммунитет определялось по реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Согласно рекомендациям рабочего совещания в Арлингтоне, было выявлено действие указанного экстракта на насыщенность клетками селезенки на фоне антигенного раздражителя.

3.6.5. Влияние на количество антитело-образующих клеток в селезенке мышей

Для изучения влияния экстракта лекарственных растений на количество клеток-продуцентов антител в селезенке мышей применялся прямой метод локального гемолиза. Этот метод позволяет определить клетки, образующие антитела к иммуноглобулину М, с высокой гемолитической активностью. Были отобраны 49 гибридных мышей Е1 (СВА* С57В16) (самцов с массой тела от 18 до 20 г), которых разделили на 7 групп по 7 животных в каждой. Мышей иммунизировали внутривенной (в/в) инъекцией эритроцитов овцы (8КВС). На 4-й день после иммунизации определяли методом 1егпе количество антител, образующих колонии (АБС) в селезенке мышей. На основании полученных результатов был сделан вывод, что экстракт лекарственных растений не оказывал влияния на количество АБС в селезенке мышей, иммунизированных 8КВС в указанных выше дозах по описанной выше методике, и соответственно на первичный иммунный ответ.

3.6.6. Влияние на количество ядросодержащих клеток в селезенке мышей Исследования проводились на 49 гибридных мышах Р1 (СВА* С57В16) (самцах с массой тела от 18 до 20 г), которых разделили на 7 групп по 7 животных в каждой. Мышей иммунизировали в/в инъекцией 8КВС в дозе 5х10⁸ клеток/мышь. Данные подтвердили, что одноразовая в/м инъекция мышам экстракта лекарственных растений не оказывала влияния на насыщенность клетками селезенки мышей, если дозы экстракта, равные 0,18 и 007 мл/кг, вводились за день до иммунизации, в день иммунизации, а также спустя сутки после иммунизации.

3.7. Заключение

Суммировав результаты изучения токсических свойств экстракта лекарственных растений, рассматриваемого в качестве иммуномодулирующего лекарственного средства, заявитель отмечает, что указанный экстракт безвреден при одноразовом в/м введении его лабораторным животным и хорошо переносится крысами А181аг и собаками в процессе в/м инъецирования.

Проведенные исследования показали, что в/м инъекция экстракта лекарственных растений, разведенного 1:10 в нормальном физиологическом растворе, в дозах от 0,5 до 1,0 мл/мышь (линии ВАЬВ/с) не вызывала интоксикации и гибели животных.

Увеличенная доза экстракта (разведенного 1:10 в нормальном физиологическом растворе, в дозах от 1,5 до 2,0 мл/мышь, от 75 до 100 мл/кг) приводила к понижению двигательной активности и подавленному состоянию животных, но летального исхода не наблюдалось.

Внутримышечные и внутрибрюшинные (в/б) инъекции экстракта лекарственных растений, разведенного 1:5 в физиологическим растворе, мышам линии ВАЬВ/с сопровождались сильно выраженным подавленным состоянием животных, наркотическим состоянием и сном. Интоксикация животных экстрактом лекарственных растений на уровне ЬП₅₀ была сходна с отравлением их этиловым спиртом, который входит в состав композиции экстракта.

В соответствии с показателями БЭ₅₀ экстракт лекарственных растений можно классифицировать как относящийся к группе безопасных препаратов в случае в/м введения от 51 до 66 мл/кг экстракта после разведения его 1:5 в физиологическом растворе. В то же время в условиях длительного в/м введения указанного экстракта не было установлено существенных специфических или половых различий в чувствительности к экстракту у крыс А181аг, получавших экстракт ежедневно в течение 3 месяцев в дозах 0,07 и 0,21 мл/кг, и у собак, получавших экстракт ежедневно в течение 1 месяца в дозе 0,07 мл/кг. Указанные дозы экстракта перед инъекцией разводились 1610 в стерильном нормальном физиологическом растворе. Дозы экстракта лекарственных растений, испытываемые на мышах и собаках в хронических экспериментах, превышали суточную терапевтическую дозу для человека (0,5 мл/чел. или 0007 мл/кг; в 10 или 30 раз).

Результаты исследований показали, что дозы 0,07 и 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений в условиях продолжавшегося 3 месяца хронического эксперимента на мышах и 0,07 мл/кг в условиях продолжавшегося 1 месяц хронического эксперимента на собаках хорошо переносились животными и не оказывали влияния на гематологические показатели или функциональные состояния основных органов подопытных животных (по данным проводившихся биохимических тестов и ЭКГ). Отсутствие токсических поражений внутренних органов, общих и местных токсико-аллергических реакций, связанных с действием экстракта лекарственных растений, было подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных по окончании хронических экспериментов. Не наблюдалось и локально раздражающего действия композиции экстракта в хронических экспериментах на мышах и собаках с применением доз 0,07 и 0,21 мл/кг при длительном в/м введении разведений 1:10 в стерильном нормальном

- 14 015636 физиологическом растворе. В соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета Министерства здравоохранения проводилось также исследование мутагенных свойств экстракта лекарственных растений.

Кроме того, изучалась способность композиции экстракта вызывать генные мутации в индикаторных культурах 8а1топе11а 1ур1итипит в тесте Эймса, стимулировать хромосомные аберрации в клетках костного мозга гибридных мышей Е1 (СВА*С57В16), оказывать влияние на количество доминантных летальных мутаций в клетках эмбрионов мышей и на систему восстановления ДНК Е. со11 РО 37 в 808хромотесте.

В ходе проведенных исследований было установлено, что экстракт лекарственных растений не обладает мутагенными свойствами.

В дозе 0,21 мл/кг (которая в 30 раз превышает суточную дозу, рекомендованную для человека) экстракт лекарственных растений снижал прибавку массы тела у беременных крыс при в/м введении его с 1го по 20-й день беременности, а также сокращал длительность беременности, количество жизнеспособных зародышей, мест имплантации, желтых тел и массы тела эмбрионов. В то же время процент гибели до имплантации был намного ниже у мышей, получавших 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений в период беременности, чем у контрольных мышей, а процент гибели после имплантации был ниже у первой группы.

В ходе макроскопических и микроскопических исследований стандартных срезов зародышей (по ^11коп-Э1Ьап), подвергавшихся воздействию 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений в пренатальном периоде, в 6,7% всех случаев можно было предположить недоразвитие плода. Этот эффект можно расценить как порок эмбрионального развития.

Анализ композиций экстракта, окрашенных ализарином, который необходим для изучения развития костной системы у зародышей крыс, подвергавшихся воздействию 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений в пренатальный период, не выявил пороков развития скелета. Но в то же время наблюдалась задержка окостенения в большинстве точек кальциноза.

Под воздействием в/м инъекции в дозе 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений с 1-го по 20-й день беременности отмечалось уменьшение числа новорожденных крыс и увеличение числа мертворожденных крыс по сравнению с контрольной группой. Масса тела крыс, подвергавшихся воздействию экстракта лекарственных растений в пренатальный период, была меньше, чем в контрольной группе. Результаты изучения развития приплода не выходили за временные рамки, типичные для его нормального физиологического развития.

Таким образом, проведенные эксперименты позволили установить, что в/м инъекции 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений (что в 30 раз превышает предельно допустимую суточную дозу для человека) с 1-го по 20-й день беременности оказывают эмбриотоксическое и тератогенное действие на животных. Поэтому беременность можно рассматривать как противопоказание к назначению экстракта лекарственных растений.

При ежедневном в/м введении 0,21 мл/кг экстракта лекарственных растений самцам крыс в течение 10 недель и самкам крыс в течение 2 недель не было установлено действия композиции экстракта на репродуктивную функцию животных.

Изучение аллергенных свойств экстракта лекарственных растений на морских свинках показало, что 5-кратное в/м введение экстракта лекарственных растений в сенсибилизирующих дозах 0,07 и 0,14 мл/кг и в/б введение определяющей дозы 0,14 мл/кг экстракта лекарственных растений на 14-й и 21-й день после сенсибилизации композиция экстракта не вызывала анафилактического шока.

Экстракт лекарственных растений в испытуемых дозах по схеме сенсибилизации не оказывал аллергенного действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок и в реакции подколенных лимфоузлов у мышей.

В дозах 0,07 мл/кг и 0,18 мл/кг экстракт лекарственных растений не оказывал влияния на количество формирующих антитела и ядросодержащих клеток в селезенке и на реакцию гиперчувствительности у мышей. Эти данные свидетельствуют об отсутствии отрицательного влияния экстракта лекарственных растений на гуморальный и клеточный иммунитет и, следовательно, об отсутствии иммунотоксичности экстракта.

И, наконец, на основании всех проведенных экспериментов и полученных результатов можно рекомендовать экстракт лекарственных растений для клинических испытаний с единственным противопоказанием - беременность.

Пример 4. Фармакологическое действие экстракта лекарственных растений

Исследования проводились с целью определения потенциальной возможности применения экстракта лекарственных растений для больных субъектов.

Первое исследование было проведено в 2000 г. Оно планировалось как клиническое испытание. Главной целью этого проекта было выявление токсичности или побочных действий экстракта лекарственных растений у ВИЧ-инфицированных больных, а последующей целью - определение возможного эффективного действия экстракта лекарственных растений на течение болезни и гуморальный, клеточный и неспецифический иммунитет у ВИЧ-инфицированных больных.

- 15 015636

Для исследования были выбраны пациенты в возрасте от 16 до 40 лет с положительной реакцией на ВИЧ с высоким риском развития СПИД. Они получали экстракт лекарственных растений в продолжение 80 дней. В рамках данного проекта 0,4 мл экстракта лекарственных растений, разбавленные нормальным физиологическим раствором до 4 мл, ежедневно вводились в/м и в/в участникам исследования. В течение указанного периода больные проходили ежедневное обследование с регистрацией выявленного действия экстракта. Спустя 3-месячный период лечения больные прошли полное обследование, и был проведен анализ их доклинических данных. Процентное содержание СЭ4 Т-лимфоцитов в 1-й день исследования составило 21 ± 1%, спустя 30 дней лечения экстрактом лекарственных растений - 23 ± 1,5%, спустя 60 дней лечения -32 ± 0,8%, спустя 80 дней лечения - 32 ± 0,7% и спустя 3 месяца по окончании периода лечения - 39 ± 1,6%. Эти данные показывают увеличение количества СЭ4 Т-лимфоцитов в ходе лечения экстрактом лекарственных растений. Процентное содержание ί.Ό8 лимфоцитов у больных в 1-й день исследования составило 25 ± 1,5%, спустя 30 дней лечения экстрактом лекарственных растений - 24 ± 1,5%, спустя 60 дней лечения - 22 ± 0,8% и спустя 80 дней лечения - 23 ± 0,8%. В последующие три месяца по окончании лечения оно составило 20 ± 2%.

Процентное содержание Т-лимфоцитов, включая ί.Ό95. в 1-й день исследования составило 40 ± 9,2%, спустя 30 дней лечения экстрактом лекарственных растений - 47 ± 2%, спустя 60 дней лечения - 25 ± 1,4% и спустя 80 дней лечения - 30 ± 1,3%. В последующие три месяца по окончании лечения оно составило 25 ± 1,5%. Статистическая сравнительная оценка показателей в 1-й день и спустя 80 дней лечения экстрактом лекарственных растений выявила существенные различия между СЭ4, СЭ8 и СЭ95 у больных (Р < 0,01).

Следующее исследование проводилось с целью определения побочных действий экстракта лекарственных растений на ранней и поздней стадиях лечения больных СПИД и ВИЧ-инфицированных. В рамках этого проекта были отобраны 6 добровольцев с положительной реакцией на ВИЧ. Критериями отбора служили положительная реакция на ВИЧ с тяжелой грибковой или другой оппортунистической инфекцией, снижение массы тела более чем на 10%, вторичный герпес, лихорадка в течение более одного месяца. После отбора добровольцев и включения их в проект сначала у них были измерены доклинические параметры, а впоследствии измерения повторялись каждую неделю.

0,4 мл экстракта лекарственных растений набирались в шприц на 5 мл, разводились 3,5 мл подогретого нормального физиологического раствора и вводились в/м в течение двух дней, а затем в течение еще двух дней. После проведения инъекций больные обследовались на наличие побочных действий экстракта и проявление связанных со СПИД клинических признаков и симптомов. Данные представлены в табл. 12.

Таблица 12. Клинические данные, полученные во втором клиническом испытании экстракта лекарственных растений на шести добровольцах

№	Возраст	Пол	Масса тела	СО4 (%) ДО лечения	СО4 (%) на 3-й месяц лечения	СО4 (подсчет) до лечения	СО4 (подсчет) на 3-й месяц лечения	СО8 (%) ДО лечения	СО8 (%) на 3-й месяц лечения	СПЗ (подсчет) ДО лечения	СО8 (подсчет) на 3-й месяц лечения
I	38	муж.	76	2	12	28	260	62	62	881	1345
2	42	муж.	63	21	21	177	318	58	56	490	894
3	48	муж.	56	22	23	352	636	15	47	688	799
4	23	муж.	67	22	23	350	360	23	38	318	574
5	23	жен.	54	24	41	352	651	41	43	632	683
6	28	муж.	56	19	51	221	1273	51	25	252	624
Ср* **	33,6		62	17,5	27,1	247	517	40	45	543	812
				0,04	0,02	0,1	0,02

* среднее;

** коэффициент Р по результатам теста ранговых оценок ХУПсохоп

Следующее исследование проводилось с целью сравнительной оценки эффективности и побочных действий экстракта лекарственных растений на ранней стадии с общепринятой НААВТ-терапией по восстановлению иммунологических факторов у больных СПИД. В этом исследовании участвовало 27 добровольцев, которых произвольно разделили на две группы, в одной из которых лечение проводилось экстрактом лекарственных растений, в другой - НААВТ (с отбором 4 блоков случайной выборки). У двух пациентов обнаружилась непереносимость НААВТ, поэтому они были переведены в группу, получавшую экстракт лекарственных растений. Критериями отбора участников и включения их в испытания служили положительная на ВИЧ реакция, наличие тяжелой грибковой или других оппортунистических инфекций на момент исследования или ранее, снижение массы тела более чем на 10%, вторичный герпес, лихорадка в течение более одного месяца и минорные оппортунистические поражения. Отобранным добровольцам предписывалось не принимать никаких лекарственных препаратов против СПИД или ле- 16 015636 карственных препаратов, стимулирующих иммунную систему. Однако прием антибиотиков или других лекарственных средств для снятия проявлений СПИД не запрещался. После отбора пациентов и включения их в проект у них измеряли доклинические показатели, такие как анализ крови, содержание триглицеридов, холестерина, мочевой кислоты, креатинина, азота мочевины в крови, щелочной фосфатазы, аспартат-трансаминазы, аланин-трансаминазы, содержание сахара в крови натощак, РНК-вирусная нагрузка, СЭ4 (ТЫ, Т112). СЭ4/СЭ8. СИ*, анализ мочи/посев мочи; данные показатели измеряли перед началом лечения и спустя 1, 2 и 3 месяца лечения.

В группе, получавшей экстракт лекарственных растений, 0,4 мл экстракта набирались в шприц на 5 мл и разводились 3,5 мл нормального физиологического раствора, и полученная смесь вводилась в/м или в/в один раз в день в течение 90 дней. НЛЛЯТ-лечение проводилось в стандартном режиме: 9 таблеток в облатке нелфинавира (250 мг) в течение 90 дней вместе с 2 капсулами зидовудина (300 мг) в течение 90 дней и с 2 таблетками ламивудина (150 мг) в течение 90 дней.

Все пациенты обследовались с целью выявления побочных действий лекарственного средства и связанных со СПИД клинических признаков и симптомов. Данные регистрировались по каждому участнику испытания. Были обследованы 16 пациентов из группы, получавшей экстракт лекарственных растений, и 11 пациентов из НЛЛКТ-группы. Характеристики сравнительной оценки 2 групп показаны в табл. 13.

Таблица 13. Сравнительная оценка двух групп, участвовавших в испытании (\УВС = лейкоциты)

Переменная	Группа, получавшая экстракт лекарственных растений	НААКТгруппа	Коэффициент Р
Возраст (средний, 80)	34,9 (8,1)	38.6	0,4
Пол (жен./муж.)	4/12	0/11	0,12
Масса тела	62,2 (8)	57,3 (8)	0,3
% СО4 (среднее, ЗЭ)	14,0 (6,0)	18,3 (13)	0,5
Количество СО4 (среднее, 80)	227 (90)	239(136)	0,8
% СО8 (среднее, 8ϋ)	39,3 (28,1)	48,6(30,1)	0,6
Количество СО8 (среднее, 8ϋ)	686 (538)	624 (408)	0,8
ШВС (среднее, 80)	5500 (3238)	4662 (667)	0,8
% лимфоцитов (среднее, 50)	35,5 (12,2)	31,0(9,0)	0,5
Вирусная нагрузка (среднее, 80)	2161721 (1278272)	270983 (228802)	0,4

Результаты табл. 14 указывают на то, что количество СЭ4 увеличилось в обеих группах, но между группами не отмечалось существенного различия.

Таблица 14. Сравнительная оценка процентного содержания СЭ4, СЭ8, лейкоцитов (УВС) и лимфоцитов в двух группах, участвовавших в испытании

Переменная	Группа, получавшая экстракт лекарственных растений	НААКТгруппа	Коэффициент Р
% СО4 (среднее, 80)	17,2 (6,6)	26,2 (8,6)	0,02
Количество СО4 (среднее, 8ϋ)	349 (232)	470(191)	0,21
% СО8 (среднее, 80)	39,5 (20,5)	30,4 (19,4)	0,3
Количество СО8 (среднее, 8ϋ)	871 (910)	507 (303)	0,4
ШВС (среднее, 8Э)	5242(1819)	4900 (2225)	0,2
% лимфоцитов (среднее, ЗЭ)	38,1 (7,7)	38,2 (5,3)	0,5

Табл. 15 доказывает различные параметры в группе, получавшей экстракт лекарственных растений. Из данных табл. 15 очевидно увеличение процентного содержания СЭ4.

- 17 015636

Таблица 15. Сравнительная оценка процентного содержания СЭ4. СЭ8. лейкоцитов и лимфоцитов у пациентов группы, лечившейся экстрактом лекарственных растений, в начале и в конце исследования

Переменная	Группа, получавшая экстракт лекарственных растений	ΗΑΑΪΓΓ- группа	Коэффициент Р
% СО4 (среднее, Ж)	14,0 (6)	17,2 (6,6)	0,01
Количество СО4 (среднее, 80)	227 (90)	349 (232)	0,002
% СОЯ (среднее, 8Е>)	39,3 (28,1)	39,5 (20,5)	0,9
Количество СОЗ (среднее, 8ϋ)	686 (538)	871(910)	0,3
\УВС* (среднее, 81»	5500 (3238)	5242(1819)	0,4
% лимфоцитов (среднее, 80)	35,5 (12,2)	38,1 (7,7)	0,06

* \УВС - лейкоциты

Пример 5. Определение предельно допустимой дозы экстракта лекарственных растений

Настоящее исследование проводилось с целью определения предельно допустимой дозы (ΜΤΏ) экстракта лекарственных растений для ВИЧ-инфицированных больных и его побочных эффектов и токсичности, которые могут стать причиной сокращения дозы (лимитирующие дозу токсичности (ОЬТ)).

В основу протокола исследования был положен метод эскалации (наращивания) дозы. Действие экстракта лекарственных растений на вирусную нагрузку и количество СЭ4 у больных оценивались как побочное. Были выбраны 4 группы больных (по 3 чел. в каждой), которых в течение 28 дней (4 недели) лечили наращиваемыми дозами экстракта. Базовая доза экстракта была установлена в соответствии с БО|₀ (10% летальной дозы) в ранее проводившихся экспериментах на животных. Согласно протоколу исследования больные внимательно обследовались на появление признаков и симптомов побочных эффектов и токсичности путем физического осмотра и лабораторных анализов.

Все отобранные для исследования пациенты были мужчинами в возрасте от 28 до 60 лет (средний возраст 41,6 года). В первой группе суточная доза 2 мл экстракта в 100 мл подогретого нормального физиологического раствора инъецировалась внутривенно (в/в) в течение от 0,5 до 1 ч в течение 28 дней. Признаков интоксикации или серьезных побочных эффектов в этой группе отмечено не было, за исключением усиленного потоотделения и потери веса в 2 пациентов. Во второй группе трое других пациентов получали суточную дозу экстракта 4 мл. В этой группе также не было отмечено выраженных побочных эффектов и интоксикации. Из третьей группы, включавшей первоначально 4 пациентов, один больной был исключен из-за несоблюдения режима приема суточной дозы 6,7 мл и нежелания проходить регулярный ежедневной медицинский осмотр. В указанной группе не было отмечено не только признаков токсичности, лимитирующей базовую дозу, и побочных эффектов, но и их минимальных проявлений. В четвертой группе трое больных получали суточную дозу 10 мл, и в этой группе также не было отмечено выраженных побочных эффектов и признаков интоксикации.

В целом в настоящее исследование было включено 12 пациентов, которые в течение 4 недель лечились наращиваемыми дозами экстракта лекарственных растений. Во всех группах не наблюдалось признаков токсичности экстракта или его побочных эффектов.

Claims (13)

1. Способ получения экстракта лекарственных растений, предназначенного для производства фармацевтической композиции для лечения ВИЧ-инфекции и/или СПИДа, включающий следующие стадии:

(a) сбор, подготовка и сушка растительного материала, полученного из Вока кр., ИФса άίοίοα и ТаиасеФт уи1дате;

(b) добавление в каждый из растительных материалов органического растворителя;

(c) инкубация смесей растительного материала и органического растворителя;

(ά) отделение свежеполученных экстрактов лекарственных растений от растворителя;

(е) обработка экстракта Вока кр. импульсным электромагнитным полем;

(ί) введение обработанного экстракта Вока кр. в экстракты иптса Фо1са и ТаиасеФт уи1дате и добавление в них селена и/или мочевины с последующей выдержкой экстрактов;

(д) обработка экстрактов после выдержки импульсным электромагнитным полем;

(Б) объединение экстрактов, при этом используют импульсное электромагнитное поле, имеющее частоту в интервале 5-750 кГц, мощность в интервале 10-200 Вт и напряженность в интервале 100-150 мкТ, а селен вводят в количестве, обеспечивающем его содержание в интервале 1-100 мг/л.

2. Способ по п.1, где импульс электромагнитного поля имеет синусоидальную, прямоугольную или стохастическую форму.

3. Способ по п.1 или 2, где импульсное электромагнитное поле имеет частоту в интервале, составляющем примерно 50-350 кГц.

- 18 015636

4. Способ по п.1, где импульсное электромагнитное поле имеет частоту, составляющую примерно 250 кГц.

5. Способ по любому из пп.1-4, где импульсное электромагнитное поле имеет мощность, составляющую 20-100 Вт.

6. Способ по п.5, где импульсное электромагнитное поле имеет мощность, составляющую 45 Вт.

7. Способ по любому из пп.1-6, где экспонирование на стадии (д) проводят в течение периода времени, составляющего 2-5 мин.

8. Способ по любому из пп.1-7, где экспонирование на стадии (д) проводят повторно.

9. Способ по п.8, где экспонирование на стадии (д) проводят три раза.

10. Способ по любому из пп.1-9, где селен добавляют до получения концентрации свободного селена в интервале 5-50 мг/л.

11. Способ по п.10, где селен добавляют до получения концентрации свободного селена в интервале 10-20 мг/л.

12. Применение экстракта лекарственного растения, полученного способом по любому из пп.1-11, для производства фармацевтической композиции для лечения у субъекта ВИЧ-инфекции и/или СПИДа.

13. Применение по п.12, где субъектом является млекопитающее, не находящееся в состоянии беременности, предпочтительно человек.