BRPI0621285A2 - método para a preparação de um extrato vegetal e processo de produção de uma composição farmacêutica para estìmulo imunológico e/ou tratamento de infecções por hiv que compreende o referido extrato vegetal - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA A PREPARAçãO DE UM EXTRATO VEGETAL E PROCESSO DE PRODUçãO DE UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA PARA ESTìMULO IMUNOLóGICO E/OU TRATAMENTO DE INFECçõES POR HIV QUE COMPREENDE O REFERIDO EXTRATO VEGETAL. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de um extrato vegetal a partir de Rosa .sp., Urtica dióica e/ou Tanacetum vul gare, preferivelmente compreendendo um tratamento por campo eletromagnético pulsante de alta frequência. O extrato vegetal, opcionalmente compreendendo selênio e/ou uréia, é útil no tratamento de condições associadas com sistema imunológico debilitado, por exemplo, em infecção por HIV e AIDS.

Description

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO VEGETAL E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA ESTÍMULO IMUNOLÓGICO E/OU TRATAMENTO DE INFECÇÕES POR HIV QUE COMPREENDE O REFERIDO EXTRATO VEGETAL.

A presente invenção refere-se a um método para a preparação de um extrato vegetal de Rosa sp., Urtica dioica e/ou Tanacetum vulgare, preferivelmente compreendendo um tratamento por campo eletromagnético pulsante. A presente invenção refere-se adicionalmente a um extrato vegetal preparado pelo dito método, opcionalmente compreendendo selênio e/ou uréia, e a seu uso no tratamento de uma doença associada com sistema imunológico debilitado,

preferivelmente infecção por HIV e AIDS. A presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica e a um kit.

Antecedentes da Invenção

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) é uma doença crônica fatal causada pelo virus ' da imunodef iciência humano (HIV) . Este retrovirus pode ser adicionalmente especificado, onde o HIV-I é a causa da AIDS no hemisfério ocidental e na Europa, enquanto que o HIV-2 é a causa principal de AIDS na África e sudeste asiático.

Em mais detalhes, a AIDS é caracterizada por uma série de sintomas que se tornam evidentes nos estágios finais da infecção pelo HIV. Sem qualquer tratamento, o período de incubação, isto é, o período de tempo entre a infecção por HIV e a manifestação clínica da AIDS, é de cerca de 10 anos. Uma infecção por HIV causa debilidade progressiva do sistema imunológico, resultando finalmente em imunodeficiência. Da mesma forma, os sintomas clínicos mais importantes da AIDS são infecções oportunistas e, além disto, malignidades características tais como o sarcoma de Kaposi, encefalopatia e a síndrome de emaciação associada a HIV. A imunodeficiência se baseia na perda de células T CD4+ que são essenciais tanto para a imunidade mediada por célula quanto para a imunidade mediada por anticorpo. A análise quantitativa de linfócitos T CD4+ no sangue circulante tem sido o método crucial para a detecção e avaliação da infecção por HIV e AIDS, desde o início da epidemia. Para a determinação da severidade da doença, prognóstico e observação terapêutica, a percentagem de linfócitos T CD4+ e suas alterações no tempo (curva) servem como parâmetros valiosos.

Os primeiros casos de AIDS foram reportados no início dos anos oitenta do século passado. Neste tempo, a AIDS se espalhou em todo o mundo, e, além disto, é epidêmica em algumas regiões, particularmente em alguns dos países em desenvolvimento. Atualmente, cerca de 40 milhões de pessoas são infectadas pelo HIV com aproximadamente 2,2 milhões de crianças entre estas. Em 2004, cerca de cinco milhões de novas infecções foram registradas, e cerca de 3,1 milhões de pessoas morreram de AIDS, 510000 destas eram crianças (de acordo com a Organização Mundial de Saúde - OMS).

Desde 1995, o número de medicamentos para o tratamento de AIDS triplicou. Atualmente, terapias combinadas são de uso comum provendo uma eficiência aumentada e menores efeitos colaterais. 0 desenvolvimento de novos agentes ativos e conceitos terapêuticos tiveram sucesso no retardo do progresso da doença, revertendo os sintomas dos estágios finais da doença e prevenindo a infecção de crianças nascidas de mães infectadas. A assim chamada "terapia anti-retroviral altamente ativa" (HAART), uma terapia combinada compreendendo três ou mais fármacos, se tornou uma terapia padrão. Foi demonstrado que a HAART retarda a progressão da AIDS e reduz a mortalidade. Usualmente, dois dos fármacos envolvidos na HAART são direcionados para a transcriptase reversa e um fármaco direciona-se para a protease viral. Inibidores de transcriptase reversa bem estabelecidos são análogos de nucleosideo tais como zidovudina (AZT, Retrovir®) , lamivudina (Epivir®) e didanosina (Videx®). Tais inibidores de transcriptase reversa são incorporados na fita de DNA crescente com a conseqüência de que a sintese posterior de DNA é evitada. Outros inibidores de transcriptase reversa são conhecidos, por exemplo, Viramune®, que inibe a enzima por outros mecanismos. Inibidores de protease bloqueiam a protease viral de tal forma que as proteínas necessárias para a criação de novos vírus não podem ser clivadas a partir do precursor da proteína maior. Exemplos destes tipos de fármacos são indinavir (Crixivan®) , saquinavir (Invirase®), ritonavir (Norvir®) e mesilato de nelfinavir (Viracept®). Outros fármacos úteis para intervenção terapêutica são inibidores de fusão, por exemplo, enfuvirtide (Fuzeon®) e inibidores de integrase. Apesar dos grandes avanços na terapia de infecção com HIV e AIDS, ainda existem várias desvantagens e obstáculos. Os fármacos atualmente utilizados são muito dispendiosos e, desta forma, não apenas drenam recursos em paises emergentes, mas também simplesmente estão indisponíveis em muitos países pobres onde a epidemia é grande. Estes fármacos apresentam muitos efeitos colaterais desagradáveis (por exemplo, náusea, diarréia), por outro lado, podem causar efeitos colaterais severos (por exemplo, dano hepático e pancreático, algumas vezes de resultado fatal). Requerem um regime de dosagem muito complicado, por exemplo, mais de uma dúzia de pílulas por dia (não contando aquelas necessárias para lidar com as infecções oportunistas associadas). Finalmente, perdem freqüentemente sua efetividade na medida em que selecionam para a emergência de vírus resistentes ao fármaco no paciente.

Conseqüentemente, existe uma necessidade por meios farmacêuticos alternativos, melhorados ou superiores que produzam uma melhora dos sintomas da AIDS, um retardo da manifestação da AIDS e/ou uma intervenção na infecção por HIV. Além disto, há uma necessidade por meios farmacêuticos mais eficientes no que diz respeito ao custo.

Desta forma, é um objetivo da presente invenção prover uma composição farmaceuticamente ativa útil no tratamento de infecções virais e sintomas e condições associados, preferivelmente infecção por HIV e AIDS. Sumário da Invenção

O objetivo da presente invenção é solucionado por um método para a preparação de um extrato vegetal, compreendendo as seguintes etapas:

(a) provimento de um material vegetal derivado de

Rosa sp. e/ou Urtica dioica e/ou Tanacetum vulgare;

(b) secagem do material vegetal;

(c) adição de um solvente orgânico;

(d) incubação da mistura de material vegetal e solvente orgânico;

(e) obtenção do extrato vegetal.

Em uma realização, o material vegetal é derivado de Rosa sp., Urtica dioica e Tanacetum vulgare.

Em uma realização, o material vegetal derivado de Rosa sp. é de Rosa canina.

Em uma realização, o material vegetal derivado de Rosa sp. é um fruto.

Em uma realização, o material vegetal derivado de Urtica dioica e/ou Tanacetum vulgare é uma folha e/ou um ramo pequeno.

Em uma realização, a secagem na etapa (b) é conduzida a uma temperatura na faixa de cerca de 20 a 50°C, preferivelmente de cerca de 37 a 45°C, mais preferivelmente de cerca de 42°C.

Em uma realização, a secagem na etapa (b) é conduzida por um período de tempo de cerca de 3 a 4 dias.

Em uma realização, o solvente orgânico é etanol, preferivelmente a cerca de 60 a 96% (em volume), mais preferivelmente a cerca de 80 a 96% (em volume), mais preferivelmente a cerca de 96% (em volume).

Em uma realização, a incubação na etapa (d) é conduzida por um período de tempo na faixa de cerca de 20 a 40 dias, preferivelmente de cerca de 22 a 38 dias, mais preferivelmente de cerca de 25 a 35 dias.

Em uma realização, a incubação na etapa (d) é conduzida a uma temperatura na faixa de cerca de 20 a 50°C, preferivelmente de cerca de 37 a 45°C, mais preferivelmente de cerca de 42°C.

Em uma realização, o método adicionalmente compreende a seguinte etapa:

(f) adição de selênio e/ou um sal orgânico ou inorgânico deste.

Em uma realização, o selênio é adicionado a uma concentração de selênio livre na faixa de cerca de 1 a 100 mg/l, preferivelmente de cerca de 5 a 50 mg/l, mais preferivelmente de cerca de 10 a 20 mg/l.

Em uma realização, o método adicionalmente compreende a seguinte etapa:

(g) adição de uréia.

Em uma realização, o método adicionalmente compreende a seguinte etapa:

(h) exposição do extrato vegetal a um campo eletromagnético pulsante.

Em uma realização, o campo eletromagnético pulsante apresenta um formato sinusoidal, retangular e/ou estocástico.

Em uma realização, o campo eletromagnético pulsante apresenta uma freqüência na faixa de cerca de 5 a 750 kHz, preferivelmente de cerca de 50 a 350 MHz, mais preferivelmente de cerca de 250 MHz.

Em uma realização, o campo eletromagnético pulsante apresenta uma potência na faixa de cerca de 10 a 200 Watt, preferivelmente de cerca de 20 a 100 Watt, mais preferivelmente de cerca de 45 Watt.

Em uma realização, o campo eletromagnético pulsante apresenta uma força de campo magnético na faixa de 100 a 150 μTesla.

Em uma realização, a exposição na etapa (h) é conduzida por um período de tempo de cerca de 2 a 5 minutos.

Em uma realização, a exposição na etapa (h) é repetida, e é preferivelmente conduzida por três minutos.

O objetivo da presente invenção é adicionalmente solucionado por um extrato vegetal preparado pelo método de acordo com a presente invenção.

O objetivo da presente invenção é adicionalmente solucionado pela utilização do extrato vegetal de acordo com a presente invenção, preparado pelo método de acordo com a presente invenção, estimular o sistema imunológico de um indivíduo.

O objetivo da presente invenção é adicionalmente solucionado pela utilização do extrato vegetal de acordo com a presente invenção, preparado pelo método de acordo com a presente invenção, para o tratamento de uma doença associada com sistema imunológico debilitado em um indivíduo.

O objetivo da presente invenção é adicionalmente solucionado pela utilização do extrato vegetal de acordo com a presente invenção, preparado pelo método de acordo com a presente invenção, para a manufatura de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença associada com sistema imunológico debilitado em um indivíduo.

Em uma realização, a doença é uma infecção por HIV e/ou AIDS.

Em uma realização do uso, o indivíduo é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais

preferivelmente um humano.

Em uma realização, o indivíduo não é gestante.

O objetivo da presente invenção é solucionado pela utilização do extrato vegetal de acordo com a presente invenção, preparado pelo método de acordo com a presente invenção, para o tratamento de uma infecção viral em um indivíduo.

O objetivo da presente invenção é solucionado pela utilização do extrato vegetal de acordo com a presente invenção, preparado pelo método de acordo com a invenção, para a manufatura de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma infecção viral em um indivíduo.

Em uma realização, a doença é uma infecção de RNA viral, preferivelmente uma infecção retroviral, mais preferivelmente uma infecção por HIV.

Em uma realização de uso, o indivíduo é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais

preferivelmente um humano.

Em uma realização de uso, o indivíduo não é gestante. O objetivo da presente invenção é adicionalmente solucionado por uma composição farmacêutica, compreendendo o extrato vegetal de acordo com a presente invenção, preparado pelo método de acordo com a presente invenção.

Em uma realização, a composição farmacêutica adicionalmente compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Em uma realização, a composição farmacêutica é formulada para administração oral.

O objetivo da presente invenção é adicionalmente solucionado por um kit compreendendo a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.

O termo "formato estocástico" compreende o fato do campo eletromagnético pulsante ser na forma de um ruido. Preferivelmente, o campo eletromagnético pulsante é de formato retangular e é combinado com uma onda sinusoidal interna. A "potência" (Watt) do campo eletromagnético pulsante significa, por exemplo, uma potência efetiva. 0 valor da "força do campo magnético" (Tesla) do campo eletromagnético pulsante indica, por exemplo, de pico a pico.

O efeito do "estimulo do sistema imunológico" e das condições de um "sistema imunológico debilitado" pode ser determinado utilizando-se métodos e parâmetros conhecidos na técnica. Os alvos de tal determinação podem ser quaisquer componentes do sistema imunológico mediado por célula ou mediado por anticorpo tais como linfócitos T (linfócitos T CD4 e/ou CD8), linfócitos B, anticorpos e componentes do sistema complementar. Um exemplo de um método para a determinação é a análise FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting - classificação de células ativada por fluorescência). Preferivelmente, os linfócitos T CD4 são determinados como contagens ou percentuais, mais preferivelmente de forma dependente do tempo.

O termo "AIDS", conforme utilizado aqui, refere-se a uma condição clinica apresentando sintomas caracteristicos associados com os estágios finais da infecção por HIV.

O termo "infecção por RNA viral", conforme utilizado aqui, refere-se a uma infecção por um virus de RNA, preferivelmente um retrovirus. Exemplos de virus de RNA considerados pela presente invenção são os virus Pólio, Coxsackie, Calici, da hepatite A, hepatite C, hepatite D, hepatite E, Entero, Rhino, da rubéola, CEE (encefalite da Europa central), Influenza, SR (sincicial respiratório), Parainfluenza, do sarampo, da caxumba, Corona, Arena, Lassa, Bunya, Hanta, Rhabdo, Filo, Borna, HTLV (leucemia da célula T humana) e rotavirus.

O termo "composição farmacêutica", conforme utilizado aqui, destina-se a compreender o extrato vegetal da presente invenção. Também considerada é uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um componente farmaceuticamente ativo do extrato vegetal da presente invenção e/ou pelo menos um derivado ou análogo do dito componente ativo e correspondentes sais destes.

A composição farmacêutica pode estar, por exemplo, na forma liquida, por exemplo, uma solução, xarope, elixir, emulsão e suspensão, ou em uma forma sólida, por exemplo, uma cápsula, caplet, tablete, pílula, pó e supositório. Formas granuladas e semi-sólidas e cápsulas gelatinosas são também consideradas. No caso em que a composição farmacêutica é um líquido ou um pó, a dosagem unitária opcionalmente é para ser medida, por exemplo, na dosagem unitária de uma colher de chá. Adicionalmente, ao extrato vegetal ou ao componente farmaceuticamente ativo, a composição farmacêutica pode compreender, por exemplo, agentes flavorizantes, adoçantes, tinturas, conservantes, estabilizantes, agentes corantes, diluentes, agentes de suspensão, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes e agentes de desintegração. Um tablete, por exemplo, pode ser revestido. Um liquido a ser injetado deve ser estéril. Também considerados são sistemas de administração transdérmica e sistemas lipossômicos. Todas as formulações mencionadas podem ser destinadas a liberação imediata, liberação temporizada e liberação sustentada.

O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme utilizado aqui, significa pelo menos não tóxico. 0 termo "veiculo farmaceuticamente aceitável", tal como referido no presente relatório, pode assumir uma ampla variedade de formas dependendo da rota de administração desejada. 0 termo compreende diluentes farmacêuticos convencionais tais como água ou etanol e ingredientes de formação de tabletes convencionais tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio ou gomas.

A administração da composição farmacêutica da presente invenção pode utilizar diferentes rotas, tais como oral, sublingual, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, nasal, vaginal, retal, subcutânea, intradérmica, intramuscular e tópica. Uma dosagem unitária pode ser administrada uma vez ou várias vezes ao dia, semanalmente ou mensalmente. A administração pode ser também continua, por exemplo, por infusão ou através de um sistema de liberação sustentada transdérmico.

Desta forma, a presente invenção provê um extrato vegetal combinado de Rosa sp., Urtica dioica e/ou Tanacetum vulgare tratado por radiação de campo eletromagnético. Os dados clínicos mostraram um efeito benéfico do extrato no tratamento da AIDS. Estudos conduzidos tanto in vitro quanto em modelos animais experimentais revelaram que o extrato não apresenta toxidez, não é mutagênico ou oncogênico. A gravidez, no entanto, é uma contra- indicação.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção será agora descrita em mais detalhes pelos exemplos que se seguem com a intenção de exemplificação da invenção. Os exemplos, no entanto, não se destinam a ter qualquer efeito limitante da matéria das reivindicações ou do escopo de proteção.

EXEMPLO 1: Preparação dos extratos vegetais brutos

Folhas e pequenos ramos de urtiga (Urtica dioica) e tanaceto (Tanacetum vulgare) são coletados de campos selvagens. Após a separação das partes úteis e limpeza inicial, o material é secado sobre uma rede de madeira em um local escuro por 3-4 dias, preferivelmente a 42°C. Na condição de seco, o material vegetal deve ser verde sem qualquer alteração de cor, e as folhas e ramos devem ser quebradiços. Para a extração, são utilizados vasos de vidro vedados ao ar. 0 material vegetal seco é quebrado em pequenos pedaços (2-5 cm) e colocado nos vasos de vidro de tal forma que não fique qualquer espaço livre. Após empacotamento (compressão), é adicionado EtOH (96%; aqui, % de uma solução etanólica refere-se a % em volume) até que o vaso esteja completamente cheio. Os vasos são colocados em um incubador (37-45°C, preferivelmente 42°C) por 20-40 dias até o aparecimento de uma solução verde escura.

Para a extração de rosa selvagem (Rosa canina) , são utilizados frutos secos. Em realizações adicionais, outras espécies de Rosa sp. podem ser utilizadas alternativamente ou adicionalmente. Os frutos são colocados em vasos impermeáveis ao ar até a metade e é adicionado EtOH. Os vasos são mantidos em um incubador (37-45°C, preferivelmente 42°C) por 20-40 dias até o aparecimento de um extrato de cor laranja avermelhado.

Após o período de incubação, quando o material vegetal está incolor, os extratos são coletados por separação do material vegetal utilizando-se um filtro de pano.

EXEMPLO 2: Tratamento eletromagnético

O extrato de Rosa canina é exposto a um campo eletromagnético por 3 minutos. Então, 50-70 ml do extrato de Rosa canina irradiado são transferidos para 2 L dos extratos combinados de Urtica dioica e Tanacetum vulgare, respectivamente. Para cada litro dos extratos combinados de Urtica dioica e Tanacetum vulgare, respectivamente, são adicionados 16 mg de selênio e 150 mg de uréia. Em realizações alternativas, é adicionado ou selênio ou uréia. Então, os vasos são vedados novamente e mantidos no incubador por 24 h a 42°C. Após a incubação, os vasos são expostos 4 vezes a um campo eletromagnético, 3 minutos a cada vez, e são reunidos. O extrato resultante é passado seqüencialmente através de um filtro de 5, 0,45 e 0,22 μm, respectivamente, e dividido em frascos estéreis. Após a rotulagem e embalagem, o extrato vegetal é pronto para utilização.

O campo eletromagnético, ao qual os extratos brutos são expostos, é pulsante, potente e monopolar no sentido de que a direção da corrente elétrica gerada em um aparelho gerador de impulso magnético (MIG) não se altera. 0 campo magnético pulsante tem uma alta freqüência variando de 5 kHz - 750 kHz. Neste exemplo, é utilizado um pulso de formato retangular. No entanto, em outras realizações, um formato sinusoidal ou estocástico são também considerados. Preferivelmente, o pulso é de formato retangular e é combinado com uma onda sinusoidal interna. Embora não se queira prender a qualquer teoria, a hipótese de o tipo especial de pulso produzido provoca algumas alterações na configuração física dos átomos nas moléculas e/ou alterações nas disposições das moléculas levando assim a propriedades químicas modificadas.

Na preparação dos extratos vegetais, são utilizadas 3-4 radiações de pulsos eletromagnéticos de alta freqüência por 2-5 minutos cada. A potência elétrica (por exemplo, potência efetiva) dos pulsos é de cerca de 20 a 100 Watt, e o melhor efeito é obtido a 45 Watt.

EXEMPLO 3: Estudos pré-clínicos

Nos estudos pré-clínicos, o extrato vegetal da presente invenção foi estudado para toxidez aguda e toxidez crônica. Para o estudo da toxidez aguda do fármaco, camundongos BALB/c e ratos Wistar foram injetados com uma única injeção intramuscular (i.m.). A toxidez crônica do fármaco foi estudada durante 3 meses em ratos Wistar e durante 1 mês em cães. As propriedades mutagênicas, embritóxicas, teratogênicas, alergênicas e imunotóxicas potenciais do extrato vegetal, bem como seu efeito sobre a função reprodutiva foram investigados.

Como resultado dos experimentos conduzidos, ficou evidente que o extrato vegetal da presente invenção apresenta uma baixa toxidez de fármaco após uma injeção única i.m. em camundongos BALB/c e rato Wistar. Sob condições experimentais de toxidez aguda, o LD50 do extrato administrado por rota intraperitoneal (i.p.) em uma diluição de 1:5 em solução salina normal foi de 51-54 ml/kg em ratos e de 56-59 ml/kg em camundongos.

Quando camundongos BALB/c ou ratos Wistar foram injetados i.m. ou i.p. com o extrato vegetal, não foram observadas quaisquer diferenças especificas ou sexuais na sensibilidade dos animais de teste aos efeitos tóxicos do extrato. O padrão de intoxicação dos camundongos BALB/c e ratos Wistar em doses iguais às do LD50 foi similar ao padrão do envenenamento por álcool etílico; foi utilizado etanol como solvente em altas concentrações na preparação do extrato vegetal. 0 estudo da toxidez crônica do extrato vegetal após sua aplicação i.m. a ratos em doses de 0,07 e 0,21 ml/kg uma vez ao dia por 3 meses (10 a 30 vezes maior que a dose diária para humanos) e a cães em uma dose de 0, 07 ml/kg (10 vezes maior que a dose diária para humanos) uma vez ao dia por 1 mês, não demonstrou qualquer efeito negativo nos órgãos e sistemas básicos do corpo animal.

O extrato vegetal da presente invenção obviamente não possui poder mutagênico e não afeta a função reprodutiva dos animais. Quando o extrato vegetal foi aplicado i.m. uma vez ao dia a ratos durante a gestação (a partir do primeiro dia de gestação até o nascimento) em doses de 0,21 ml/kg, o fármaco exibiu propriedades embriotóxicas e teratogênicas. Desta forma, é contra-indicado durante a gestação.

Além disto, utilizando-se doses de 0,07 e 0,14 ml/kg administradas a cobaias em dias alternados durante 10 dias, o extrato vegetal não exibiu propriedades alergênicas ou imunotóxicas.

Em conclusão, os resultados dos experimentos toxicológicos indicam que o extrato vegetal da presente invenção pode ser utilizado para experimentos clínicos sistemáticos, levando-se em conta sua contra-indicação durante a gestação.

3.1 Toxidez aguda

Os estudos foram realizados com 128 camundongos BALB/c (machos e fêmeas, peso corporal 18-20 g) e 47 ratos Wistar (machos e fêmeas, peso corporal 180-220 g) utilizando-se injeção i.m. do extrato vegetal nos camundongos e injeção i.p. nos camundongos e ratos. O extrato vegetal foi diluído para 1:10 e 1:5 em solução salina normal estéril, e então foram aplicados diferentes volumes destas diluições aos animais de teste. Os animais do experimento foram observados por 14 dias para se determinar possíveis efeitos tóxicos da preparação.

A toxidez do extrato vegetal após uma única injeção aos animais de teste foi determinada utilizando-se um método de estágio duplo: primeiro, foi estabelecido um LD50 aproximado pela técnica de Deihman e Leblanc seguida da determinação dos índices precisos de LDi6, LD50 ± DP e LD84 por análise Probit de acordo com Litchfield e Wilcoxon.

Os experimentos conduzidos revelaram que uma injeção única i.m. do extrato vegetal diluído para 1:10 em solução salina normal em doses de 25-50 ml/kg a camundongos BALB/c não causa intoxicação e morte dos animais. Quando as doses aumentaram para 75-100 ml/kg, foi observada uma redução da atividade motora, mas nenhum animal morreu. A injeção do extrato vegetal diluído para 1:5 em solução salina normal em doses de 25-50 ml/kg foi seguida de dor, depressão profunda e finalmente morte do animal após algumas horas. O perfil de intoxicação do extrato vegetal em camundongos foi semelhante ao de seu envenenamento pelo álcool etílico (37,3 ml/kg) o qual está presente em altas concentrações no extrato vegetal como veículo. Os resultados em ratos Wistar foram semelhantes aos observados nos camundongos BALB/c. Tabela 1. Parâmetros de toxidez aguda do extrato vegetal e etanol (96%) diluído para 1:5 em solução salina normal a diferentes concentrações após administração i.m. ou i.p. a animais experimentais.

<table>table see original document page 19</column></row><table>

*ND = não determinado

Os dados apresentados na Tabela 1 acima mostram, por exemplo, que a toxidez do extrato vegetal de acordo com os parâmetros de toxicometria não difere significativamente entre as injeções i.m. e i.p.

3.2 Toxidez crônica

3.2.1 Estudos em ratos

Os estudos de toxidez do extrato vegetal da presente invenção foram realizados durante 3 meses por injeção i.m. da preparação a ratos Wistar. Estes experimentos foram realizados com 90 ratos Wistar (machos e fêmeas, peso corporal 180-200 g) , os quais foram divididos em 3 grupos de 30 animais (15 machos e 15 fêmeas) . 0 primeiro grupo serviu como controle (solução salina normal), o segundo grupo recebeu 0,07 ml/kg do extrato vegetal, e o terceiro grupo recebeu 0,21 ml/kg do extrato vegetal. As doses estudadas do extrato vegetal foram de 10 e 30 vezes maior que a dose terapêutica diária recomendada para humanos (0,5 ml do extrato vegetal diluído em 5 ml de solução salina normal ou 0,007 ml/kg da preparação).

Os resultados mostram que a injeção i.m. do extrato vegetal em doses de 0,07 e 0,21 ml/kg não apresentou qualquer efeito sobre o estado geral e comportamento dos ratos. Durante os experimentos de toxidez crônica, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas quantidades de eritrócitos, leucócitos, plaquetas e níveis de hemoglobina nos animais que receberam 0,07 e 0,21 ml/kg, respectivamente, do extrato vegetal em comparação cm o controle (Tabelas 2 e 3).

Tabela 2. Parâmetros hematológicos em ratos machos após 3 meses da injeção i.m. com o extrato vegetal.

Eritrócitos [x10"12/l]

<table>table see original document page 20</column></row><table> Leucócitos [χ109/1]

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Plaquetas [xl09/l] <table>table see original document page 21</column></row><table>

Hemoglobina [g/l] <table>table see original document page 21</column></row><table> Tabela 3. Parâmetros hematológicos em ratos fêmeas após 3 meses da injeção i.m. com o extrato vegetal.

Eritrócitos [xl012/l]

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Leucócitos [xl09/l] <table>table see original document page 22</column></row><table>

Plaquetas [x109/1]

<table>table see original document page 22</column></row><table> Hemoglobina [g/l]

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Sob as condições dos experimentos de toxidez crônica em ratos, as injeções i.e e i.m. da preparação em doses de 0,07 ml/kg e 0,21 ml/kg não foram observadas guaisquer alterações significativas no nível de proteína total no soro sangüíneo. A ausência de efeitos negativos por tratamento prolongado com o extrato vegetal nas doses de 0,07 e 0,21 ml/kg em ratos está suportada pela atividade estável das enzimas hepáticas, tais como aspartato e alanina aminotransferases, lactato desidrogenase, e fosfatase alcalina durante 3 meses do experimento de toxidez crônica. A administração prolongada do extrato vegetal a ratos não influenciou os níveis de bilirrubina, colesterol, triglicerídeos, uréia, creatinina e glicose no soro sangüíneo dos animais experimentais.

A injeção prolongada da preparação em doses de 0,07 e 0,21 ml/kg, diluída para 1:10 em solução salina normal, nos músculos da coxa dos animais não apresentou efeitos locais de irritação.

Os exames macroscópicos não mostraram quaisquer efeitos tóxicos ou tóxico-alérgicos do extrato vegetal neste grupo de animais.

Nenhuma alteração patológica nos órgãos internos (cérebro, glândula pituitária, rins, estômago, e órgãos reprodutores em machos e fêmeas) foi observada neste grupo de animais durante 3 meses após a injeção i.m. do extrato vegetal em uma dose de 0,21 ml/kg.

3.2.2 Estudos em cães

Os experimentos foram conduzidos em 8 cães (machos, peso corporal inicial de 12-14,5 kg) os quais foram divididos em 2 grupos, 4 animais em cada: primeiro grupo - controle, segundo grupo - extrato vegetal 0,07 ml/kg. A dose aplicada da preparação foi 10 vezes maior que a maior dose diária terapêutica para humanos. A preparação estudada em uma dose de 0,07 ml/kg foi diluída em solução salina normal estéril a 1:10, e foi então injetada nos músculos da coxa dos cães uma vez ao dia por 1 mês.

O eletrocardiograma (ECG) realizado antes do início dos experimentos em cães e 1 mês após o início do tratamento utilizando uma dose de 0,07 ml/kg não revelou um aumento da taxa cardíaca ou alterações nos parâmetros do ECG. Todos os parâmetros do ECG não se alteraram antes e após os experimentos no grupo tratado em comparação com os animais de controle (Tabela 4). Tabela 4. Parâmetros de ECG dos cães que receberam o extrato vegetal por injeção i.m. em uma dose de 0,07 ml/kg durante 1 mês.

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Os resultados mostraram que a administração do extrato vegetal a cães por injeção i.m. a cada dia durante 1 mês em uma dose de 0,07 ml/kg (10 vezes maior que uma dose diária para humanos) não causou qualquer efeito sobre o estado geral e comportamento dos animais, e este tratamento também não altera o estado funcional dos órgãos e sistemas principais do corpo animal.

De acordo com os dados dos exames histológicos não foram revelados quaisquer efeitos tóxicos ou de irritação local do extrato vegetal durante 1 mês de injeção i.m. em uma dose de 0,07 ml/kg em cães.

3.3 Mutagenicidade

3.3.1 Mutação genética em microrganismos (teste de Ames)

A avaliação da atividade mutagênica do extrato vegetal foi conduzida por meio da técnica da capacidade de uma substância em induzir mutações genéticas em microrganismos indicadores no sistema de ativação metabólica in vitro e sem tal sistema. Foi utilizado o método de placa de identificação de mutações. Este método foi provido por Ames et al., e foram utilizadas três cepas autotróficas em histidina, a saber Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 e TA 1537, como microrganismos indicadores.

De maneira a conduzir o teste de Ames, foram obtidas diluições dos extratos vegetais da seguinte forma: a solução inicial da preparação foi medida e pesada e diluída com água destilada para uma concentração de 10 mg/ml. Diluições adicionais foram preparadas em água destilada e adicionadas a placas de Petri. Foram examinadas as concentrações da preparação de 0,1 a 1000 μg/placa. Foi utilizada água destilada como controle negativo. Tabela 5. Efeito do extrato vegetal sobre a cepa bacteriana indicadora T98 no teste de Ames.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Sinais convencionais e abreviações: Mi - número de revertentes por placa, M - número geométrico médio, M0/Mk - razão do número de revertentes no teste para o número de revertentes no controle negativo, MA - atividade mutagênica: " + " - presença de atividade, - ausência de atividade. Tabela 6. Efeito do extrato vegetal sobre a cepa bacteriana indicadora Ta 100 no teste de Ames.

<table>table see original document page 28</column></row><table> Tabela 7. Efeito do extrato vegetal sobre a cepa bacteriana indicadora TA 1537 no teste de Ames.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

A partir dos dados fornecidos pode-se concluir que o extrato vegetal em concentrações de 0,1-1000 μg/placa não causa um aumento no número de revertentes em cepas de Salmonella murium Ta 98, TA 100, TA 1537. Desta forma, o extrato vegetal não apresenta um efeito mutagênico de acordo com o teste de Ames. 3.3.2 Mutações letais dominantes em células germinativas de murino

Os experimentos foram conduzidos de maneira a se avaliar as propriedades mutagênicas potenciais do extrato vegetal nos experimentos objetivando o estudo de mutações letais dominantes em camundongos híbridos Fi (CBA x C57BI6).

O extrato vegetal diluído em solução salina normal foi administrado por i.m. a camundongos machos em uma dose de 0,7 ml/kg. Esta dose era 100 vezes maior que a dose diária recomendada para humanos (0,007 ml/kg).

Tabela 8. Resultados da capacidade do extrato vegetal em induzir mutações letais dominantes em células germinativas de camundongos.

<table>table see original document page 30</column></row><table> Como pode ser observado na Tabela 8, o nível de perdas pós-implante em animais sob o efeito de uma única injeção i.m. do extrato vegetal na dose de 700 μΐ/mg não excede o nível dos animais de controle.

3.3.3 Aberrações cromossômicas em células de medula óssea de murino.

A essência deste método consiste em uma avaliação do efeito da substância examinada introduzida no corpo de um animal sobre o sistema genético das células de medula óssea sensíveis a efeitos de agentes químicos e fatores físicos. As aberrações cromossômicas foram analisadas após a administração do extrato vegetal de acordo com o esquema descrito em "Instructions for experimental (pre-clinical) study of new pharmacologic substances". Tabela 9. Alterações estruturais dos cromossomos de células de medula óssea de camundongos sob o efeito do extrato vegetal

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Conforme pode ser observado a partir dos dados experimentais, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no nivel de alterações cromossômicas na medula óssea de camundongos sob o efeito do extrato vegetal nas doses estudadas quando em comparação com o controle. Por esta razão, de acordo com o teste de alterações cromossômicas nas células da medula óssea, o extrato vegetal não apresenta atividade mutagênica.

3.3.4 Efeito de danificação no DNA no cromoteste SOS.

Um dos testes de danificação de DNA é o teste para a determinação da indução da resposta SOS de uma célula bacteriana ao efeito do agente investigado, o assim chamado cromoteste SOS. O teste baseia-se no conhecimento da resposta SOS aos danos em DNA. A base do teste é a cepa PQ 37 de E. coli construída por meio da associação de LacZ responsável pela síntese da enzima beta-galactosidase com o gene sfiA controlado pelo repressor geral do sistema SOS. A expressão de sfiA é induzida após um dano de DNA como uma parte da resposta SOS. Neste teste, a expressão SOS é medida de acordo com a determinação qualitativa da atividade enzimática da beta-galactosidase, que pode ser mensurada de acordo com uma reação colorida. 0 marcador do crescimento celular é a fosfatase alcalina, a atividade da qual pode ser também mensurada de acordo com uma reação colorida. Como resultado da análise, são obtidas as curvas de dependência da síntese de beta-galactosidase quanto a concentração da substância investigada e as curvas que caracterizam as alterações no crescimento bacteriano em tais condições. De acordo com estes índices, a potência da indução SOS é calculada. Esta potência reflete a capacidade da substância em induzir a expressão do gene sfiA.

Os resultados obtidos mostraram que o extrato vegetal não induziu a ativação do sistema reparo de DNA em qualquer das concentrações investigadas na cepa PQ de E. coli. Desta forma, o extrato vegetal não apresenta um efeito de danificação de DNA.

3.4 Embriotoxidade e teratogenicidade

Os experimentos foram conduzidos em 36 ratas Wistar gestantes divididas em 2 grupos, 18 ratas em cada: primeiro grupo - controle, segundo grupo - extrato vegetal (em uma dose de 0,21 ml/kg que é 30 vezes maior que a dose diária máxima para humanos). A preparação foi diluída em solução salina normal e administrada por rota i.m. às ratas uma vez ao dia durante todo o período da gestação (a partir do primeiro dia até o nascimento) . Os animais de controle receberam a quantidade aproximada de solução salina normal todos os dias a partir do primeiro dia de gestação até o nascimento. No 20° dia de gestação, 70% das ratas gestantes foram sacrificadas por deslocamento da vértebra cervical para o exame subseqüente dos esqueletos ósseos e órgãos internos dos fetos e determinação dos índices de morte pré-implante e pós-implante.

Tabela 10. Alterações no peso corporal das ratas gestantes (% do inicial)

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Nota: * indica diferença significativa (P<0,05)

Como resumido na Tabela 10, a injeção i.m. de extrato vegetal a fêmeas gestantes em uma dose de 0,21 ml/kg não influenciou o aumento de peso corporal das fêmeas gestantes quando em comparação com o grupo de controle durante o período de gestação.

Tais critérios de avaliação da embriotoxidade do extrato vegetal na duração da gestação como número de fetos vivos, locais de implante, corpos amarelos, e peso corporal do embrião foram menores no grupo de ratas que receberam a preparação. O índice de morte pré-implante no grupo experimental foi significativamente mais alto que no de controle, no entanto o nível de morte pós-implante foi mais baixo. O tamanho crânio-caudal dos fetos das ratas gestantes que receberam a preparação na dose de 0,21 ml/kg não foi estatisticamente diferente do tamanho apropriado no grupo de controle (Tabela 11).

Tabela 11. índices dos efeitos embriotóxicos do extrato vegetal em uma dose de 0,21 ml/kg após a administração i.m. da preparação a partir do primeiro dia até o 20° dia de gestação.

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Nota: * indica diferença significativa (P<0,05) Os exames macroscópicos e microanatômicos (incisões padrão de acordo com Wilson-Diban) dos fetos sob efeito do extrato vegetal em seus períodos pré-natal em uma dose de

0.21 ml/kg revelaram um sub-desenvolvimento do feto em 6,7% dos casos. Δ freqüência de patologias tais como

hidronefrose e hemopericárdio no grupo de ratas que receberam o extrato vegetal durante a gestação excedeu ao do grupo de controle.

Quando se analisa preparações do corpo fetal total marcadas com alizarina com o propósito de se estudar o desenvolvimento do sistema ósseo nos fetos sob efeito do extrato vegetal em uma dose de 0,21 ml/kg no período pré- natal, nenhum defeito de desenvolvimento do esqueleto foi revelado. Entretanto, foi observada uma inibição da ossificação na maioria dos locais investigados do esqueleto ósseo.

Em conclusão, deve-se observar que a administração

1.m. do extrato vegetal em uma dose de 0,21 ml/kg (esta dose é 30 vezes maior que a dose terapêutica máxima para humanos) a ratas gestantes a partir do primeiro ao 20° dia de gestação apresentou um efeito negativo no que diz respeito a alterações no peso corporal de ratas gestantes e quanto a duração da gestação. Foram observados efeitos da preparação sobre os índices de embriotoxidade tais como o número de fetos vivos, peso do embrião, número de locais de implante e corpos amarelos, parâmetros de morte pré e pós- implante, e também na inibição da ossificação dos locais ósseos.

Durante o desenvolvimento pós-natal dos ratos jovens, foi notado um retardo significativo no desenvolvimento físico. No grupo experimental, um sub-desenvolvimento dos fetos foi revelado ser de 6,7%. Este sub-desenvolvimento pode ser considerado como um defeito de desenvolvimento dos embriões.

Desta forma, foram revelados os efeitos embriotóxicos e teratogênicos do extrato vegetal na dose de 0,21 ml/kg.

Em conexão com isto, a gravidez deve ser considerada como uma contra-indicação à administração da preparação.

3.5 Efeito sobre a função reprodutiva

Foram conduzidas investigações em ratos Wistar (machos e fêmeas; peso corporal inicial de 180-200 g). Um grupo de fêmeas, consistindo em 60 animais, foi dividido em dois sub-grupos: o grupo de controle (40 animais) e o grupo experimental (20 animais). As fêmeas do grupo experimental foram injetadas todos os dias de forma i.m. com 0,21 ml/kg do extrato vegetal durante um período de 2 semanas (3-4 ciclos estrais). Antes da injeção, a preparação foi diluída em solução salina normal.

A injeção intramuscular de 0,21 ml/kg do extrato vegetal a ratos machos e fêmeas não alterou os índices da função reprodutiva na medida em que os corpos amarelos, implantes, fetos vivos e reabsorções. O valor das mortes pré-implante e pós-implante não foi muito diferente do controle; foi verdadeiro tanto para as fêmeas que receberam a preparação quanto para as fêmeas que foram engravidadas pelos machos que receberam a injeção da preparação.

As investigações auxiliaram em se estabelecer que a injeção i.m. de 0,21 ml/kg do extrato vegetal (que é 30 vezes maior que a dose diária máxima recomendada para humanos) não influencia seja a atividade sexual, índices reprodutivos (quantidade de fetos vivos, seus pesos corporais, quantidade de corpos amarelos, taxa crânio- caudal, reabsorções), seja o desenvolvimento neonatal dos ratos. Desta forma, não foi revelada qualquer influência da preparação investigada sobre a função reprodutiva de ratos adultos sexualmente saudáveis.

3.6 Efeitos relacionados à imunologia 3.6.1 Efeitos alergênicos e anafiláticos Este estudo foi realizado de acordo com o "Methodical instructions for evaluating allergenic properties of pharmacological substances" (Guia de estudo experimental de novas substâncias farmacológicas. Moscou, 2000, pg. 25-32).

As investigações foram realizadas em 15 cobaias (machos, peso corporal de 270-320 g) , os quais foram divididas em três grupos. Cada grupo continha 5 animais; primeiro grupo - controle (solução salina normal), segundo grupo - 0,07 ml/kg de extrato vegetal, terceiro grupo - 0,14 ml/kg de extrato vegetal. A preparação das doses utilizadas correspondeu a 10 e 20 vezes mais que as doses diárias recomendadas para um humano. As investigações mostraram que 0,14 ml/kg do extrato vegetal (20 vezes mais que a dose terapêutica diária para um humano) não provoca choque anafilático por injeção i.m. no dia 14° e no dia 21° de sensibilização.

3.6.2 Reações de hipersensibilidade do tipo retardado Os exames foram realizados na pele de 15 cobaias, as quais apresentavam pele de cor branca (machos, peso corporal de 260-310 g) . As cobaias foram divididas em 3 grupo de 5 animais em cada grupo: primeiro grupo controle, segundo grupo - 0,007 ml/kg de extrato vegetal, terceiro grupo - 0,035 ml/kg do extrato vegetal. As doses de extrato vegetal mencionadas acima foram diluidas em solução salina normal estéril, e então misturadas com adjuvante de Freund completo em uma proporção de 1:1 e então injetadas nos animais. De acordo com os resultados das investigações anteriores, a reação de hiper- sensibilidade de um tipo retardado às doses de extrato vegetal mencionadas acima foi negativa para as cobaias.

Quarenta e nove camundongos híbridos Fl (CBA * C57B16) (machos, peso corporal de 18-20 g) foram divididos em 7 grupos, cada grupo com 7 animais. Os camundongos foram imunizados com uma injeção subcutânea (s.c.) de RCR (dose: 2 χ IO8 células por camundongo) em uma região interescapular. A diferença de massa caracterizou o grau do edema e intensidade de uma reação de hipersensibilidade do tipo retardado. 0 índice da reação foi calculado de acordo com a fórmula:

U= (P0- Pcontrole/Pcontrole) X 100

onde P0 é a massa da pata experimental, e PControle é a massa da pata de controle.

A análise dos dados provou que as doses testadas do extrato vegetal, isto é, 0,18 e 0,07 ml/kg, não influenciam a formação de reação de hipersensibilidade do tipo retardado para camundongos ou imunidade celular. Desta forma, os resultados dos experimentos mostraram que o extrato vegetal não apresentou propriedades de imunotoxicidade. 3.6.3 Efeitos sobre a massa e número de células dos nodos linfáticos poplíteos em camundongos

De maneira a se avaliar as propriedades alergênicas do extrato vegetal, o método da alteração da massa e peso dos nodos linfáticos popliteos para ratos foi utilizado como uma resposta a um antigeno irritante, um assim chamado "ensaio de nodo linfático poplíteo", PLNA. Dez camundongos hibridos Fl (CBA * C57B16) (machos, peso corporal de 18-20 g) foram injetados com 50 μΐ de solução salina normal estéril (controle), e com 0,07 ml/kg do extrato vegetal, respectivamente.

Após 7 dias, foram determinados o peso e a celularidade dos nodos linfáticos popliteos direitos e esquerdos dos camundongos. O índice relativo foi calculado por meio da divisão dos índices do nodo linfático esquerdo por índices similares do nodo linfático direito. Os índices relativos de peso e celularidade dos nodos linfáticos para o grupo de controle e grupo experimental são iguais a 0,95 e 0,98. Desta forma, avaliando-se a influência do extrato vegetal sobre o peso e celularidade dos nodos linfáticos, foi estabelecido que a preparação não apresenta propriedades alergênicas.

3.6.4 Efeito imunotóxico

Um estudo sobre diferentes propriedades imunotóxicas do extrato vegetal foi conduzido de acordo com as recomendações da OMS. 0 exame da influência do extrato vegetal sobre a resposta imunológica humoral foi determinado pelo número de células formadoras de anticorpo no baço de acordo com Erne. A influência do extrato vegetal sobre a imunidade celular foi determinada pela reação de hipersensibilidade de um tipo retardado para camundongos. De acordo com as recomendações do Labor Meeting em Arlington, foi definida a influência da prepara ção sobre a celularidade do baço contra um antecedente de estimulo antigênico.

3.6.5 Efeito sobre a quantidade de células de baço de murino formadoras de anticorpo

De maneira a se estudar a influência do extrato vegetal sobre a quantidade de células formadoras de anticorpo em baços de camundongos, um método direto de hemólise local foi utilizado. Este método auxilia em definir as células formadoras de anticorpo M de imunoglobulina com uma alta atividade hemolitica. Quarenta e nove camundongos híbridos F1 (CBA * C57B16) foram selecionados (machos com um peso corporal de 18-20 g) . Os camundongos foram divididos em 7 grupos, cada grupo consistindo em 7 animais. Os camundongos foram imunizados com uma injeção i.v. de células vermelhas de sangue de ovelha (SRBC). No quarto dia após a imunização, o número de colônias formadoras de anticorpo (AFC) em um baço de camundongo foi definido de acordo com o método de Jerne. A partir dos resultados obtidos concluiu-se que o extrato vegetal não influencia a quantidade de AFC nos baços de camundongos, que foram imunizados por SRBC utilizando-se as doses e esquema conforme mencionados, e correspondentemente, não influencia a resposta imunológica primária. 3.6.6 Efeito sobre o número de células de baço de murino contendo núcleo

Os exames foram conduzidos em 4 9 camundongos (CBA * C57B16; machos, peso corporal de 18-20 g). Os animais foram divididos em 7 grupos, cada grupo consistindo em 7 camundongos. Estes foram imunizados com uma injeção i.v. de SRBC em uma dose de 5 χ IO8 células por camundongo. Os dados mostraram que uma injeção única i.m. do extrato vegetal aos camundongos não influencia a celularidade do baço se doses da preparação iguais a 0,18, 0,07 ml/kg foram fornecidas antes do dia da imunização, bem como no dia e depois do dia.

3.7 Conclusão

Resumindo-se o resultado do estudo de toxidez do extrato vegetal que foi considerado para ser um fármaco imunomodulador, pode-se notar que a preparação foi inofensiva a uma injeção i.m. única do extrato vegetal a animais de laboratório e foi bem assimilada pelos ratos Wistar e cães durante a injeção i.m.

A investigação conduzida mostrou que uma injeção i.m. única do extrato vegetal diluído para 1:10 em solução salina normal em doses de 0,5-1,0 ml por camundongo (camundongos BALB/c) não provocou intoxicação e morte dos animais. Uma dose aumentada da preparação (diluída para 1:10 em solução salina normal em doses de 1,5-2,0 ml por camundongo, 75-100 ml/kg) levou a uma redução da atividade motora e depressão nos animais, mas não foi observada morte destes.

A injeção intramuscular e i.p. do extrato vegetal dissolvido com solução fisiológica 1:5 a camundongos BALB/c foi acompanhada de uma alta depressão dos animais, narcose e sono. A intoxicação animal com o extrato vegetal no nivel LD50 foi similar a seu envenenamento por álcool etílico, este último sendo parte da preparação.

De acordo com os índices LD50, o extrato vegetal pode ser classificado como pertencendo ao grupo de preparações seguras no caso de uma injeção i.m, de 51-66 ml/kg da substância da preparação após solubilização 1:5 com uma solução fisiológica. Ao mesmo tempo, nenhuma diferença significativa específica e sexual na sensibilidade sob condições de um experimento crônico foi observada nos ratos Wistar tratados diariamente por 3 meses com injeção i.m. de 0,07 e 0,21 ml/kg da preparação e em cães tratados diariamente por 1 mês com injeção i.m. de 0,07 ml/kg do extrato vegetal. As doses marcadas da preparação foram diluídas 1:10 em solução salina normal estéril antes da injeção. As doses do extrato vegetal testadas em camundongos e cães em experimentos crônicos excederam à dose diária terapêutica para humanos (0,5 ml/pessoa ou 0,007 ml/kg; 10 ou 30 vezes).

Os resultados dos estudos mostraram gue doses de 0,07 e 0,21 ml/kg do extrato vegetal em um experimento crônico de 3 meses em camundongos e 0,07 ml/kg em um experimento crônico de 1 mês em cães foram bem assimiladas pelos animais e não influenciaram os índices hematológicos ou condições funcionais dos órgãos principais dos animais de teste (de acordo com os dados dos testes bioguímicos utilizados e do ECG) . A ausência de danos tóxicos nos órgãos internos, reações tóxico-alérgicas gerais e locais relativas ao efeito do extrato vegetal, foi confirmada pelos resultados das investigações patomorfológicas, realizadas após o final dos experimentos crônicos. Não foi observado qualquer efeito de irritação local da preparação nos experimentos crônicos em camundongos e cães utilizando- se doses de 0,07 e 0,21 ml/kg em injeções i.m. de longo prazo com diluições de 1:10 em solução salina normal estéril. De acordo com as exigências do Comitê Estatal Farmacológico do Ministério da Saúde Pública, foi realizada uma investigação quanto as propriedades mutagênicas do extrato vegetal.

Paralelamente, foi estudada a capacidade da preparação em provocar mutações genéticas em culturas indicadas de Salmonella typhimurium no teste de Ames, para estimular alterações cromossômicas nas células da medula óssea de camundongos híbridos Fl (CBA * C57B16) , para influenciar a quantidade de mutações letais dominantes em células embriogênicas de camundongo e para influenciar o sistema de reparo de DNA da cepa PQ 37 de E. coli no cromoteste SOS.

Durante a investigação realizada foi estabelecido que o extrato vegetal não apresentava propriedades mutagênicas.

Em uma dose igual a 0,21 ml/kg (que é 30 vezes maior que a dose diária recomendada para humanos) , o extrato vegetal reduziu o aumento do peso corporal de ratas gestantes pela injeção i.m. para o primeiro dia até o 20° dia de gestação, também reduziu a duração da gestação, a quantidade de fetos vivos, locais de implante, corpos amarelos e peso corporal dos embriões. Ao mesmo tempo, o índice de morte pré-implante foi muito menor para os camundongos que receberam 0,21 ml/kg do extrato vegetal durante a gestação que para os camundongos de controle, e os índices de morte pós-implante foram mais baixos para o primeiro grupo.

Durante o exame macroscópico e investigação microscópica das seções padrão de fetos (de acordo com Wilson-Diban) que sofreram a influência de 0,21 ml/kg do extrato vegetal durante o período pré-natal, em 6,7% dos casos foi possível se sugerir o sub-desenvolvimento dos fetos. 0 efeito pode ser avaliado como um defeito de desenvolvimento embrionário.

Uma análise das preparações marcadas com alizarina que foi necessária para se estudar o desenvolvimento do sistema ósseo em fetos de ratos expostos a 0,21 ml/kg do extrato vegetal durante o período pré-natal, não mostrou defeitos no desenvolvimento do esqueleto. Mas ao mesmo tempo, foi observado um retardo da ossificação na maioria dos pontos de calcificação.

Sob a influência de injeção i.m. de 0,21 ml/kg do extrato vegetal a partir do primeiro dia até o 20° dia de gestação, foi observada uma redução de ratos recém nascidos e um aumento de ratos natimortos em comparação com o grupo de controle. 0 peso corporal dos ratos expostos ao extrato vegetal durante o período pré-natal foi menor que os índices do grupo de controle. Os resultados do experimento de desenvolvimento dos descendentes não se desviaram das restrições temporais típicas para um desenvolvimento fisiológico normal deste tipo de animal.

Desta forma, os experimentos foram realizados para se estabelecer que uma injeção i.m. de 0,21 ml/kg do extrato vegetal (30 vezes a maior dose diária para um humano) do primeiro dia ao 20° dia de gestação apresenta um efeito embriotóxico e teratogênico em animais expostos ao extrato vegetal. Desta forma, a gravidez pode ser considerada como uma contra-indicação para a prescrição do extrato vegetal.

Com uma injeção i.m. diária de 0,21 ml/kg do extrato vegetal a ratos machos durante 10 semanas e ratas fêmeas durante 2 semanas, a influência da preparação sobre a função reprodutiva dos animais não foi estabelecida.

Estudando-se as propriedades alergênicas do extrato vegetal em cobaias mostrou-se que a uma injeção i.m. de 5 vezes do extrato vegetal em doses de sensibilização de 0,07 e 0,14 ml/kg e injeção i.p. de uma dose determinante de 0,14 ml/kg do extrato vegetal nos 14° e 21° dias após a sensibilização, a preparação não provocou choque anafilático.

O extrato vegetal, nas doses estudadas e esquemas de sensibilização, não apresentou um efeito alergênico de reação de hipersensibilidade do tipo retardado em cobaias e na reação do nodo linfático popliteo em camundongos.

Nas doses de 0,07 ml/kg e 0,18 ml/kg, o extrato vegetal não influenciou o número de células formadoras de anticorpo e contendo núcleo no baço, e não influenciou a reação de hipersensibilidade em camundongos. Os dados são evidência da ausência de uma influência negativa do extrato vegetal sobre a imunidade humoral e celular e, desta forma, da ausência de imunotoxidade da preparação.

Finalmente, com base em todos os experimentos conduzidos e nos resultados obtidos, o extrato vegetal é recomendado para ensaios clínicos com a única contra- indicação nos casos de gravidez. EXEMPLO 4: Efeitos farmacológicos do extrato vegetal Foram conduzidos estudos de maneira a se determinar o potencial do extrato vegetal em pacientes.

O primeiro estudo foi realizado no ano de 2000. Este estudo foi projetado para um ensaio clinico. O primeiro objetivo deste projeto foi a determinação da toxidez ou efeitos colaterais do extrato vegetal em pacientes com HIV, e o objetivo seguinte foi a determinação da provável efetividade do extrato vegetal no curso da doença e as imunidades humoral, celular e não especifica em pessoas infectadas com HIV.

Foram selecionados para o estudo pacientes positivos para HIV com de 16 a 40 anos de idade que estavam sob alto risco de desenvolverem a AIDS pelo exame geral. Os pacientes utilizaram o extrato vegetal por 80 dias. Neste projeto, 0,4 ml do extrato vegetal, que foi diluído em solução salina normal para 4 ml, foram injetados i.m. e i.v. diariamente. Durante este período, os pacientes foram examinados diariamente e os efeitos do tratamento foram registrados. Após um período de tratamento de 3 meses, os pacientes foram convocados e seus fatores pré-clínicos foram estudados. As percentagens de linfócitos T CD4 foram determinadas a 21 í 11 no primeiro dia do estudo, 23 ± 1,5% após 30 dias de tratamento com o extrato vegetal, 32 ± 0,8% após 60 dias de tratamento, 32 ± 0,7% após 80 dias de tratamento e 39 í 1,6% três meses após o final do período de tratamento. Estes dados mostram um aumento na

quantidade de linfócitos T CD4 durante o tratamento com o extrato vegetal. As percentagens de linfócitos CD8 nos pacientes foram 25 ± 1,5% no primeiro dia do estudo, 24 ± 1,5% após 30 dias de tratamento com o extrato vegetal, 22 ± 0.8% após 60 dias de tratamento e após 80 dias de tratamento foi de 23 ± 0,8%. No seguir de três meses após o final do tratamento foi de 20 ± 2%.

As percentagens de linfócitos T incluindo CD9 foram de 40 ± 9,2% no primeiro dia do estudo, 47 ± 2% após 30 dias de tratamento com o extrato vegetal, 25 ± 1,4% após 60 dias de tratamento, 30 ± 1,3% após 80 dias de tratamento. No seguir de três meses após o final do tratamento foi de 25 ± 1,5%. Na comparação estatística do primeiro dia e 80 dias após o tratamento com o extrato vegetal, não houve diferenças óbvias entre CD4, CD8 e CD95 nos pacientes (P<0,01).

O estudo seguinte foi realizado para se considerar os efeitos colaterais iniciais e tardios do extrato vegetal nos pacientes com AIDS e pessoas infectadas com HIV. Neste projeto, seis voluntários que eram HIV positivos foram selecionados. Os critérios de inclusão foram: HIV positivo com infecção fúngica ou outra infecção oportunista severas, redução de peso corporal acima de 10%, zoster secundária, febre por mais de um mês. Após a seleção dos pacientes e incorporação no projeto, os parâmetros pré-clínicos foram determinados inicialmente e então a determinação se repetiu semanalmente.

Foram tomados 0,4 ml do extrato vegetal em uma seringa de 5 ml, diluídos com 3,5 ml de solução salina normal morna e foram injetados i.m. por dois dias e então i.v. por mais dois dias. Após o término das injeções, os pacientes foram examinados para os efeitos colaterais do fármaco o aparecimento de sinais clínicos relacionados com a AIDS. Os dados são mostrados na Tabela 12.

Tabela 12. Dados clínicos obtidos no segundo estudo clínico do extrato vegetal com seis voluntários.

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* P - valor pelo teste classificatório de sinais de Wilcoxon

O estudo seguinte foi realizado para se comparar a efetividade e efeitos colaterais iniciais do extrato vegetal com o tratamento HAART de rotina na recuperação dos fatores imunológicos em pacientes com AIDS. Neste estudo, 27 voluntários foram estudados. Os pacientes foram randomicamente divididos em dois grupos de tratamento tratados ou com o extrato vegetal ou HAART (com seleção de 4 blocos de blocos randômicos). Dois pacientes mostraram nenhuma tolerância ao HAART, e, desta forma, foram transferidos para o grupo de extrato vegetal. Os critérios de admissão e saída dos pacientes foram: HIV positivo, afecção severa por infecções fúngicas ou outras infecções oportunistas no momento ou anteriormente, redução do peso corporal acima de 10%, zoster secundária, febre por mais de um mês e afecções oportunistas menos importantes. Estes pacientes não utilizaram quaisquer fármacos anti-AIDS ou fármacos de reforço para o sistema imunológico. Antibióticos ou outros fármacos, entretanto, para a eliminação dos efeitos da AIDS não foram proibidos. Após a seleção dos pacientes e sua admissão no projeto, foram mensurados fatores pré-clínicos como contagem de célula sangüínea, triglicerídeos, colesterol, ácido úrico, creatinina, nitrogênio de uréia no sangue, fosfatase alcalina, aspartato transaminase, alanina transaminase, glicemia, carga de RNA viral, CD4 (Thl, Th2), CD4/CD8, CD8, análise da urina/cultura da urina, antes do tratamento e 1, 2 e 3 meses após o tratamento.

No grupo do extrato vegetal, 0,4 ml do extrato vegetal foram tomados em uma seringa de 5 ml e diluídos com 3, 5 ml de soro salino normal morno, e a mistura foi injetada i.m. ou i.v. uma vez ao dia por 90 dias. O tratamento HAART foi conduzido de acordo com o regime padrão. O tratamento foi de 9 tabletes de Caplet Nelfinavir 250 mg por 90 dias juntamente com 2 cápsulas de Zidovudina 300 mg por 90 dias juntamente com 2 tabletes de Lamivudina 150 mg por 90 dias. Todos os pacientes foram examinados para os efeitos colaterais do fármaco e aparecimento dos sinais e sintomas clínicos relativos à AIDS. Os dados foram registrados em questionários. Foram examinados 16 pacientes do grupo de extrato vegetal e 11 pacientes no grupo HAART. As comparações das características entre os 2 grupos são mostradas na Tabela 13.

Tabela 13. Comparação dos dois grupos de estudo (CBS - células brancas do sangue)

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Os resultados na Tabela 14 indicam que o número de CD4 aumentou em ambos os grupos, mas que não houve qualquer diferença significativa entre os grupos. Tabela 14. Comparação da percentagem de CD4, CD8, células brancas do sangue (CBS) e linfócitos nos dois grupos de estudo.

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A Tabela 15 mostra os diferentes parâmetros no grupo de pacientes que recebeu o extrato vegetal. 0 aumento na percentagem de CD4 é óbvia e evidente.

Tabela 15. Comparação das percentagens de CD4, CD8, células brancas do sangue e linfócitos no grupo tratado com o extrato vegetal no inicio e no final do estudo

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* CBS - células brancas do sangue EXEMPLO 5: Determinação da dose máxima tolerável do extrato vegetal

Este estudo foi conduzido para se determinar a dose máxima tolerável (MTD) do extrato vegetal em pacientes infectados com HIV e seu possível efeito colateral e toxidez que possa causar uma limitação da dose (toxicidades limitantes de dose, DLTs)

O protocolo do estudo baseou-se no método de escalonamento de dose. Os efeitos do extrato vegetal sobre a carga viral e contagem de CD4 dos pacientes foram avaliados como sub-produtos. Quatro grupos de pacientes (3 pacientes em cada grupo) foram selecionados e tratados por 28 dias (4 semanas) com doses escalonadas do extrato. Uma dose base do extrato vegetal foi determinada de acordo com o LD50 (10% da dose letal) de experimentos em animais anteriores. Os pacientes foram observados cuidadosamente para sinais e sintomas de efeitos colaterais e toxidez por exame físico e exames de laboratório de acordo com o protocolo.

Todos os pacientes eram do sexo masculino com idade de 28-60 anos (média: 41,6 anos). No primeiro grupo, a dose diária de 2 ml do extrato vegetal em 100 ml de solução salina normal morna foi infundida durante 0,5-1 hora por via intravenosa por 28 dias. Não foram observados toxidez ou efeitos colaterais importantes, exceto um aumento da sudorese e perda de peso em 2 pacientes. No segundo grupo, três outros pacientes receberam uma dose diária de 4 ml. Não ocorreram efeitos colaterais importantes e toxidez neste grupo. No terceiro grupo originalmente de 4 pacientes, um paciente foi excluído devido à não aceitação e incapacidade de atendimento diário regular, e a dose diária administrada foi de 6,7 ml. Neste grupo não ocorreu não apenas nenhuma toxidez limitante de dose importante e efeitos colaterais, mas também nenhum destes menos importantes. No quarto grupo, três outros pacientes receberam a dose diária de 10 ml, e não ocorreu nenhum efeito colateral e toxidez importantes também neste grupo.

Em resumo, um total de 12 pacientes foi incluído no estudo que foram tratados por 4 semanas com doses escalonadas do extrato vegetal. Não ocorreu toxidez ou efeitos colaterais em nenhum dos grupos.

Claims (11)

1. Método para a preparação de um extrato vegetal caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) provimento de um material vegetal derivado de Rosa sp., Urtica dióica e/ou Tanacetum vulgare; (b) secagem do material vegetal; (c) adição de um solvente orgânico; (d) incubação da mistura do material vegetal e do solvente orgânico; (e) obtenção do extrato vegetal; (f) adição de selênio e/ou um de seus sais orgânico ou inorgânico; e /ou (g) adição de uréia; e (h) exposição do extrato vegetal a um campo eletromagnético pulsante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do campo eletromagnético pulsante apresentar um formato sinusoidal, retangular e/ou estocástico.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do campo eletromagnético pulsante apresentar uma freqüência na faixa de cerca de 5 a 750 kHz, preferivelmente de cerca de 50 a 350 kHz, mais preferivelmente de cerca de 250 kHz.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do campo eletromagnético pulsante apresentar uma potência na faixa de cerca de 10 a 200 Watt, preferivelmente de cerca de 20 a -100 Watt, mais preferivelmente de cerca de 45 Watt.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do campo eletromagnético pulsante apresentar uma força de campo magnético na faixa de 100 a 150 μΤββίΒ.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da exposição na etapa (h) ser conduzida por um período de tempo de cerca de 2 a 5 minutos.

7 . Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ia 6, caracterizado pelo fato da exposição na etapa (h) ser repetida, e preferivelmente ser realizada três vezes.

8. Uso do extrato vegetal preparado conforme definido em qualquer uma as reivindicações 1 a 7 caracterizado por ser destinado à produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma infecção por HIV e/ou SIDA em um indivíduo.

9. Processo de produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma infecção por HIV e/ou SIDA caracterizado pelo fato de compreender um extrato vegetal preparado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Uso do extrato vegetal de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato do indivíduo ser um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais pref erivelmente um humano.

11. Uso do extrato vegetal de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato do indivíduo não ser uma gestante.