EA011607B1 - Способ лечения заболеваний, связанных с tweak - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу и агентам для лечения заболеваний, связанных с TWEAK, включая заболевания сердца, печени, почек, легких, ожирение, заболевания скелетных мышц, нервные заболевания, заболевания костей и хрящей. Данное изобретение также относится к способам идентификации агонистов или антагонистов TWEAK для лечения заболеваний, связанных с TWEAK. Кроме того, данное изобретение относится к трансгенным животным, которые экспрессируют экзогенную ДНК, кодирующую полипептид TWEAK или его фрагменты, аналоги или мутеины, и к способам применения таких животных для определения агонистов или антагонистов TWEAK. Данное изобретение также относится к способам диагностики заболеваний, в основе которых лежит экспрессия TWEAK. Данное изобретение также относится к способам воздействия на клеточную пролиферацию или дифференциацию клеток-предшественников, используя полипептиды, агонисты или антагонисты TWEAK.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам и агентам для лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ, включая заболевания сердца, печени, почек, легких, жировой ткани, скелетных мышц, нервные заболевания, заболевания костей, хрящей, кожи, желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, репродуктивных органов и соединительной ткани. Данное изобретение также относится к способам идентификации агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ для лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ. Кроме того, данное изобретение относится к трансгенным животным, которые экспрессируют экзогенную ДНК, кодирующую полипептид ΤνΕΑΚ или его фрагменты, аналоги или мутеины, и к способам использования таких животных для идентификации агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ. Данное изобретение также относится к способам диагностики заболеваний, в основе которых лежит экспрессия ΤνΕΑΚ. Данное изобретение также относится к способам воздействия на клеточную пролиферацию или дифференциацию клеток-предшественников, используя полипептиды ΤνΕΑΚ, агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ.

Предпосылки изобретения

Члены семейства лигандов фактора некроза опухоли (ΤΝΡ), называемые так из-за своего структурного сходства с ΤΝΡ-α, являются ключевыми компонентами различных процессов, таких как воспалительные ответы, клеточный иммунитет и апоптоз. Лиганды ΤΝΡ могут действовать местно, как мембранно-связанные белки типа II, путем прямого контакта клетка-клетка или как секреторные белки с аутокринной, паракринной или эндокринной функциями. Члены семейства ΤΝΡ связываются с членами семейства рецепторов ΤΝΡ (ΤΝΕ-К.) посредством их С-концевого экстрацеллюлярного домена. Различные члены семейства ΤΝΕ включают в себя ΤΝΕ, лимфотоксины (ЬЛ), Рак, СЭ27, СЭ30, СЭ40, 4-1ВВ, ОХ-40, ΤΚΑΜΡ, САК-1, ΤΡΑΙΕ, ΟΙΤΚ, НАЕМ, остеопротегрин, ΝΟΕ, ΤΚΑΙΝ, Кау (ΒΑΕΕ), АРВ1Ь и ΤνΕΑΚ (имеющий родство с ΤΝΕ и обладающей низкой способностью индуцировать клеточную гибель).

Характерным свойством этой семьи рецепторов цитокинов является богатый цистеином экстрацеллюлярный домен, первоначально обнаруженный при молекулярном клонировании двух различных рецепторов ΤΝΕ. Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I, имеющие лигандсвязывающий экстрацеллюлярный домен, один участок, проходящий через мембрану, и цитоплазматический участок, вовлеченный в активацию клеточных функций. Область связывания лиганда, богатая цистеином, представляет собой коровый домен, прочно соединенный дисульфидными мостиками, который в зависимости от конкретного члена семейства, многократно повторяется. Большинство рецепторов имеют четыре домена, хотя возможно наличие только одного домена, а возможно и шести.

Члены семейства ΤΝΕ играют роль в регуляции иммунной системы, контролируя клеточное выживание и дифференциацию, а также системы экстренной иммунной защиты организма, такой как воспаление. Неоднократные попытки в данной области использовать члены семейства ΤΝΕ для терапевтических целей могут дать уникальные способы контроля над заболеванием. Например, некоторые лиганды этого семейства могут непосредственно вызывать апоптоз многих трансформированных клеток, например, СТ, ΤΝΕ, лиганд Рак и ΤΚΑΙΕ. Активация рецептора с помощью Рак и возможно ΤΝΕ и СЭ30 может индуцировать клеточную гибель в нетрансформированных лимфоцитах, проявляя иммунорегуляторную функцию.

Способность индуцировать запрограммированную гибель клеток является важным и хорошо изученным свойством некоторых членов семейства ΤΝΕ. Апоптоз, вызываемый Рак, по-видимому, играет роль в регуляции аутореактивных лимфоцитов на периферии и возможно в тимусе. Также системы ΤΝΕ и СЭ30 вовлечены в выживание Т-клеток и клеток анапластической крупноклеточной лимфомы. Гибель этой клеточной линии в ответ на рецепторный сигнал ΤΝΕ, Рак или ΕΤ-8 характерна для апоптоза.

Семейство лигандов ГИР на основании способности индуцировать гибель клеток может быть разделено на три группы. Первая, к которой относятся ΤΝΈ, лиганд Рак и ΤΡΑΙΕ, может эффективно индуцировать гибель клеток многих линий и их рецепторы наиболее вероятно обладают стандартными доменами клеточной гибели. Предположительно, к этой категории также относится лиганд ЭК-3 (ΤΡΑΜΡ/νδΕ-1). К другой группе относятся лиганды, такие как ΤνΕΑΚ, лиганд СЭ30 и СТа^, которые инициируют слабый сигнал клеточной гибели в отношении ограниченного небольшого числа клеток. На основании исследований этих систем было сделано предположение, что существует отдельный механизм слабого сигнала гибели клеток. Наконец, есть члены, которые не могут эффективно вызывать гибель клеток. Вероятно, все группы могут оказывать антипролиферативные эффекты на некоторые типы клеток, индуцируя вслед за этим клеточную дифференциацию, например, СЭ40.

Обычно, гибель клеток инициируется вслед за агрегацией доменов клеточной гибели, которые находятся в цитоплазматической части рецепторов Τ^. Домен гибели клеток регулирует сборку различных компонентов, передающих сигнал, что приводит к активации каспазного каскада. У некоторых рецепторов канонические домены гибели клеток отсутствуют, например, у рецептора ЫЪ и СЭ30, другие могут индуцировать гибель клеток, хотя и слабо. Напротив, передача сигналов через другие пути, например, через СЭ40, необходима для поддержания жизни клетки. До сих пор существует необходимость в дополнительной идентификации и описании функций членов семейства 'ПР, способствуя, таким обра

- 1 011607 зом, разработке новых подходов к лечению заболеваний, опосредованных семейством ΤΝΡ.

ΤνΕΑΚ был выделен при скрининге РНК, гибридизованной с эритропоэтиновым зондом. СЫсйеротИсйе е! а1., 1. ΒίοΙ. Сйет. 272: 32401-32410 (1997). Пептиды мыши и человека обладают необычно высококонсервативной последовательностью, включающей 93% идентичных аминокислот в рецепторсвязывающем домене. Было показано, что ΤνΕΑΚ эффективно секретируется клетками, высокоэкспрессируемыми в различных тканях, включая сердце, мозг, плаценту, легкие, печень, скелетную мускулатуру, почки, поджелудочную железу, селезенку, лимфатические узлы, тимус, аппендикс и лимфоциты периферической крови.

Одним известным рецептором ΤνΕΑΚ является Рп14, ген раннего ответа, регулируемый фактором роста, который снижает клеточную адгезию на экстрацеллюлярном матриксе и уменьшает рост, стимулируемый белками сыворотки, и миграцию (Ме1дйап-Мап1йа е1 а1., 1. Βίο1. Сйет. 274: 33166-33176 (1999)). Было показано, что Рп14 индуцируется действием ЕСЕ. сыворотки теленка и форболового эфира и экспрессируется с достаточно высокими уровнями в тканях сердца, почек, легких, кожи, скелетных мышц, яичников и поджелудочной железы, а также на модели гепатоцеллюлярной карциномы и других линий клеток рака, и с низкими уровнями в здоровых тканях почек.

ΤνΕΑΚ вовлечен во многие биологические процессы. Например, было показано, что клетки НТ29, обработанные ΙΡΝ-γ и ΤνΕΑΚ, подвергаются апоптозу; хотя ΤνΕΑΚ обладает невысокой способностью индуцировать апоптоз и индуцирует его лишь у небольшого количества клеточных типов. СЫсйеротБсйе е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 272: 32401-32410 (1997). В отличие от этого, было показано, что ΤνΕΑΚ индуцирует ангиогенез и пролиферацию эндотелиальных клеток в АЕСР-зависимом пути. Ьупсй е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 274: 8455-8459 (1999). Астроциты специфически связываются и стимулируются ΤνΕΑΚ. ΤνΕΑΚ может инфильтрировать воспаленный мозг, воздействуя на поведение астроцитов. Астроциты под действием ΤνΕΑΚ секретируют большое количество 1Ь-6 и 1Ь-8, а также повышают экспрессию ΚΑΜ-1. 8аак е! а1., СБ-ΙΑ 32: 102-107 (2000).

ΤνΕΑΚ также вовлечен в регуляцию иммунной системы. При стимуляции ΙΡΝ-γ моноциты быстро экспрессируют ΤνΕΑΚ, и антитела против ΤνΕΑΚ, в частности, ингибируют их цитотоксическую активность в отношении клеток сквамозной карциномы человека. Сочетание антител против ΤνΕΑΚ и антител против ΤΚΑΙΕ практически полностью ингибирует цитотоксичность. Nакауата е! а1., 1. Εχρ. Меб. 192: 1373-1379 (2000). Наоборот, мРНК ΤνΕΑΚ немедленно исчезает у мышей при введении липополисахарида (ЬР8), индуктора иммунно-воспалительных ответов. Более того, мРНК ΤνΕΑΚ также снижается при аутоиммунной гемолитической анемии и системной красной волчанке на моделях мышей. Эти данные дают основание предполагать, что подавление экспрессии ΤνΕΑΚ является важным звеном при остром и хроническом воспалении. СЫсйеротйсйе е! а1., ΒίοΟκιη. Βίορίκκ. Век. Сотт. 279:162-165 (2000).

До последнего времени в данной области не было достигнуто полного понимания о состояниях или заболеваниях, связанных с экспрессией и активностью ΤνΕΑΚ, включая роль ΤνΕΑΚ как при воспалительных, так и в невоспалительных состояниях.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к роли ΤνΕΑΚ в усилении тяжести и в прогрессировании различных патологических состояний, включая заболевания различных тканей и систем органов. Такие патологические состояния включают в себя острую патологию сердца, хроническую сердечную недостаточность, невоспалительную дилатационную кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, гиперплазию эпителиальных клеток печени, гибель гепатоцитов, фиброз печени, вакуолизацию гепатоцитов, другие повреждения печени, патологию желчных протоков, включая гиперплазию желчных протоков, воспалительные заболевания почек, такие как мультиочаговое воспаление, заболевания почек невоспалительного характера, такие как тубулярная нефропатия, гиперплазия канальцев, гломерулярные кисты, гломерулярная нефропатия, синдром Альпорта, почечная тубулярная вакуолизация, образование гиалиновых цилиндров в почках, почечный фиброз, и воспалительные заболевания легких. В настоящем изобретении определена причинная связь между молекулами ΤνΕΑΚ и некоторыми заболеваниями сердца, печени, почек и легких. Изобретение также описывает связь между ΤνΕΑΚ и поведением клеток-предшественников тканей печени, почечных канальцев, клеток кожи, адипоцитов, скелетных мышц, хрящей и костей, а также клеток различных типов соединительной ткани, таких как стромальные клетки костного мозга и фибробласты.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ, т.е. заболеваний, протекающих с поражением или другими патологическими состояниями тканей, в которых экспрессируется рецептор ΤνΕΑΚ, например ΡΝ14. Эти состояния включают в себя фиброз, кардиомиопатию и заболевания почек, легких, печени, кожи, скелетных мышц, метаболизм липидов (например, ожирение), заболевания желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, репродуктивных органов, нервной ткани (включая нейродегенерацию), хрящей, кости и соединительной ткани. В предпочтительном варианте осуществления заболевание, связанное с ΤνΕΑΚ, является по своей природе невоспалительным. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобре

- 2 011607 тение относится к способам лечения состояний, связанных с ΤνΕΑΚ. влияя на взаимодействие полипептида ΤνΕΑΚ с его клеточным рецептором.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к агонистам или антагонистом ΤνΕΑΚ и фармацевтическим композициям. содержащих их. для лечения заболеваний. связанных с ΤνΕΑΚ. Такие агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ (т.е. ингибиторы) могут быть антителами против ΤνΕΑΚ или их производными; антителами против рецептора ΤνΕΑΚ или их производными; полипептидными фрагментами ΤνΕΑΚ; аналогами полипептида ΤνΕΑΚ; мутеинами ΤνΕΑΚ; миметиками ΤνΕΑΚ; белками слияния ΤνΕΑΚ; полипептидными фрагментами рецептора ΤνΕΑΚ; полипептидными аналогами рецептора ΤνΕΑΚ; мутеинами рецептора ΤνΕΑΚ; миметиками рецептора ΤνΕΑΚ; белками слияния рецептора ΤνΕΑΚ; органическими соединениями; и неорганическими соединениями.

В других вариантах осуществления данное изобретение относится к агонистам или антагонистам ΤνΕΑΚ и фармацевтическим композициям. которые могут быть использованы для лечения пациентов. нуждающихся в регенерации или обновлении ткани. Изобретение также относится к применению агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ для модуляции поведения популяций клеток-предшественников ίη νίνο или ίη νίίτο. Клетки-предшественники могут быть клетками-предшественниками различных типов клеток печени. почечных канальцев. кардиомиоцитов. различных типов клеток легких. различных типов клеток кожи. различных типов клеток скелетных мышц. адипоцитов. различных типов клеток желудочнокишечного тракта. различных типов клеток поджелудочной железы. различных типов клеток нервной ткани. различных типов клеток хряща и кости. различных типов клеток соединительной ткани. включая клетки стромы в костном мозге и фибробласты. Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ и фармацевтические композиции. содержащие их. могут вводиться ίη νίνο для стимуляции регенерации и обновления ткани во время болезни или поражения ткани. включая. но ими не ограничиваясь. заболевания. вызванные токсическим поражением. вирусным. действием химиотерапии или радиации. и генетические дегенеративные расстройства. В другом варианте осуществления агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ и их фармацевтические композиции могут использоваться в сочетании с клеточной терапией стволовыми клетками или клетками-предшественниками для регенерации ткани и систем органов. В еще одном варианте осуществления под действием агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ и их фармацевтических композиций может увеличиваться численность популяции стволовых клеток или клеток-предшественников ίη νίίτο. Популяции клеток-предшественников. численность которых увеличиваются при использовании агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ. могут использоваться для трансплантации в организм при необходимости регенерации или обновления ткани.

В других вариантах осуществления данное изобретение относится к способу идентификации агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ. которые могут быть использованы как терапевтические агенты для лечения заболеваний. связанных с ΤνΕΑΚ. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к трансгенным животным. экспрессирующим экзогенные ДНК. кодирующие полипептиды ΤνΕΑΚ. Другой вариант осуществления данного изобретения включает в себя применение ΤνΕΑΚ как молекулярного маркера заболевания.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: Роль ΤνΕΑΚ в развитии дилатационной кардиомиопатии. На фиг. А показан тромбоз правого предсердия и желудочка трансгенной мыши ЕЬ-ΤνΕΑΚ (Τ§). а также сильнейшая дилатация. На фиг. В для сравнения показано нормальное сердце.

Фиг. 2: Сверхсекреция ΤνΕΑΚ в сердце с индуцированным ремоделированием. Поперечный срез сердца при 10Х увеличении при окрашивании гематоксилином/эозином на 20 день после инфицирования взрослых мышей С57ВЬ/6 аденовирусным вектором. содержащим ДНК δΤνΕΑΚ мыши. по сравнению с сердцем мышей. инфицированных конструкцией аденовирус-СЕР. используемой в качестве контроля.

Фиг. 3: Гиперплазия желчных путей и овальных клеток. индуцированная ΤνΕΑΚ. показанная на трансгенных мышах ЕЬ-ΤνΕΑΚ (Τ§) по сравнению с нетрансгенным потомством (ΝΤ§) в возрасте 2 недели и 7 месяцев.

Фиг. 4: Гиперплазия желчных путей и овальных клеток. индуцированная ΤνΕΑΚ. показанная усиленным окрашиванием тΑЬ Α6. которые специфичны в отношении маркеров в эпителиальных клетках желчных протоков и овальных клетках трансгенных мышей ЕЬ-ΤνΕΑΚ (Τ§) по сравнению с нетрансгенным потомством (ΝΤ§).

Фиг. 5: ΤνΕΑΚ индуцирует гиперплазию овальных клеток. что показывает присутствие больших овальных клеток в портальной области трансгенных мышей ЕЬ-ΤνΕΑΚ (Τ§).

Фиг. 6: Вакуоляризация гепатоцитов. вызванная ΤνΕΑΚ. у трансгенных мышей ЕЬ-ΤνΕΑΚ (Τ§) по сравнению с нетрансгенным потомством (ΝΤ§).

Фиг. 7: Уровни ΤνΕΑΚ в сыворотке мышей. инфицированных аденовирусным вектором. содержащим ДНК ΤνΕΑΚ мыши.

Фиг. 8: Сверхэкспрессия ΤνΕΑΚ в печени индуцирует гибель гепатоцитов и гиперплазию желчных путей. Поперечный срез печени при 20Х увеличении. окрашенный гемтоксилином/эозином. на 3 и 11 день после инфицирования взрослых мышей С57ВЬ/6 аденовирусным вектором. содержащим ДНК ΤνΕΑΚ мыши. по сравнению с печенью мышей. инфицированных конструкцией аденовирус-СЕР. ис

- 3 011607 пользуемой в качестве контроля.

Фиг. 9: Рецептор Гп14 ТХУЕАК индуцируется после индукции поражения печени с помощью СС14 у мышей. Гибридизация ίη δίΐιι мРНК Гп14 в печени нормальных мышей и в печени с индуцированным поражением с помощью СС14 показывает незначительную экспрессию или отсутствие экспрессии в печени нормальных взрослых мышей и значительную индукцию экспрессию Гп14 после поражения. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (Н & Е), соответственно показывают нормальную здоровую печень и пораженную СС14 ткань печени.

Фиг. 10: Экспрессии Гп14 супрессируется в эпителиальных клетках желчного протока на мышиной модели лигирования желчного протока, что показано увеличением окрашивания антисмылового РНК зонда в отношении Гп14, используя гибридизацию ш δίΐιι. На срезах, окрашенных гематоксилином и эозином (Н & Е), видны соответствующие области при микроскопии по методу светлого поля.

Фиг. 11: Поперечный срез почек трансгенной мыши ГЬ-Т^ЕАК (Тд) по сравнению с почкой нетрансгенной мыши (ИТд) в возрасте 2 недели, 8 недель и 7 месяцев. Результаты показывают базофильные канальцы в почке мыши ТХУЕАК Тд в возрасте 8 недель и 7 месяцев и дилатацию мочевой области в клубочках, т. е. гломерулярные кисты, с прилежащими базофильными канальцами в возрасте 7 месяцев.

Фиг. 12: Поперечный срез почек трансгенной мыши ГЬ-Т^ЕАК (Тд), окрашенный Н & Е. А. Показана гломерулярная нефропатия с базофильным эпителием прилегающих проксимальных канальцев. В. Сегментарная гиперплазия мезангиальных клеток, гипертрофия эпителия капсулы и утолщение капсулы.

Фиг. 13: Серийные срезы почек трансгенной мыши ГЬ-Т^ЕАК (Тд), окрашенные Н & Е (сверху) и на ядерный антиген пролиферирующих клеток (Ρί'ΝΑ) (снизу). Базофильные канальцы соответствуют канальцам с экспрессией Ρί’ΝΑ. т.е. пролиферирующим канальцам.

Фиг. 14: Серийные срезы почек трансгенной мыши ГЬ-Т^ЕАК (Тд), окрашенные Н & Е, лектином, полученным из Т. Ригригеак (маркер проксимальных канальцев) и лектин, полученный из А. Нуродаеа, (маркер дистальных канальцев). Результаты показывают, что базофильные канальцы не экспрессируют никаких эпителиальных маркеров.

Фиг. 15: Сверхэкспрессия ТХУЕАК в почках индуцирует гиперплазию канальцев и гломерулопатию. Поперченный срез почек с 20Х и 40Х увеличением при окрашивании гематоксилином/эозином на 11 день после инфицирования взрослых мышей С57ВБ/6 аденовирусным вектором, содержащим ДНК 5Т\УЕАК мыши, по сравнению со срезом почек мышей, инфицированных конструкцией аденовирус6ГР, используемой в качестве контроля.

Фиг. 16: мРНК ТХУЕАК широкоэкспрессируется в почках у взрослой мыши дикого типа. Поперечный срез почек с 5Х увеличением при окрашивании гематоксилином или при микроскопии по методу темного поля после гибридизации т δίΐιι со смысловыми или антисмысловыми Т^ЕАК зондами.

Фиг. 17: мРНК Гп14 экспрессируется в проксимальных канальцах внутреннего коркового слоя взрослой мыши дикого типа. Поперечный срез почек с 5Х увеличением при окрашивании гематоксилином или при микроскопии по методу темного поля после гибридизации ш кйи с смысловыми или антисмысловыми Гп14 зондами.

Фиг. 18: Роль ТХУЕАК при развитии фиброза почек о чем говорит подавление экспрессии мРНК Гп14 в почках при болезне Альпорта. Кратное увеличение уровней мРНК Гп14 показано на двух разных мышах с мутацией, приводящей к болезни Альпорта, являющимися животными дикого типа в возрасте 4, 5, 6 и 7 недель. Уровни мРНК определяли гибридизацией с участком гена, содержащим нуклеотидную последовательность, соответствующую части гена Гп14. На 4 и 7 недели показаны результаты повторных экспериментов для каждой из двух мышей (блоки диаграммы обозначены как мышь 1 повтор и мышь 2 повтор, соответственно). На 7 неделе показано снижение мРНК Гп14 при двух вариантах ингибирования заболевания, т.е. при введении кТСГвВ-Гс и у мышей с нокаутом УЪА-1 (на фиг. 18 показано либо введение двум разным мышам кТСГЗЕ-Гс («введение кТСГЬК.»), либо две разные мыши Альпорт/УЪА-1 КО (« Альпорт/УЪА-1КО»)).

Фиг. 19: Введение антагониста ТХУЕАК при односторонней обструкции мочеточника (ИИО) на мышиной модели фиброза почек значительно снижало фиброз почки. Морфометрическая оценка области, окрашенной в синий цвет (фиброзная область) при окрашивании Тпс11готе-Ма55оп парафиновых срезов почек показал, что содержание коллагена снижено в образцах почек АВ.611 (моноклональное АЬ против ТХУЕАК) до сходных уровнях, наблюдаемых в образцах почек 8Т6Г-вК.-1д, используемых в качестве положительного контроля. Напротив, в почках, обработанных антителом хомячка (НА4/8), используемым в качестве изотипического контроля, не наблюдается снижения фиброза почек, как и в почках, обработанных носителем (РВ8).

Фиг. 20: Трансгенный Т^ЕАК вызывает грануломатозное и лимфогистиоцитарное воспаление в легких. А. Поперечный срез легкого трансгенной мыши ГЬ-Т^ЕАК (Тд), окрашенный Н & Е. В. Поперченный срез легкого мыши кТ^ЕАК Тд, окрашенный Н & Е.

Фиг. 21: мРНК ТХУЕАК экспрессируется в клетках, расположенных в бронхиолах и альвеолах взрослых мышей дикого типа. Поперечный срез легкого с 10Х увеличением при окрашивании гематоксилином или при микроскопии по методу темного поля после гибридизации т δίΐιι со смысловыми или

- 4 011607 антисмысловыми ТХУЕЛК зондами.

Фиг. 22: мРНК Еи14 экспрессируется в бронхиолах и альвеолах взрослых мышей дикого типа. Поперечный срез легкого с 10Х увеличением при окрашивании гематоксилином или при микроскопии по методу темного поля после гибридизации ίη δίίυ со смысловыми или антисмысловыми Еи14 зондами.

Фиг. 23: Ингибиторный эффект ТХУЕЛК на дифференциацию адипоцитов 3Т3-Б1 ίη νίίτο. Клетки 3Т3-Б1 индуцировали для дифференциации, используя стандартный способ. На 0 день клетки не обрабатывали, обрабатывали контрольным агентом (рекомбинантный растворимый СП40Ь-ЕЬЛС, 100 нг/мл) или различными вариантами ТХУЕЛК. 100 нг/мл: рекомбинантный растворимый Т^ЕАК-ЕЬАО человека, рекомбинантный растворимый ТХУЕЛК человека, Ес-Т\УЕАК человека, вместе с дексаметазоном и инсулином и ежедневно пополняли. К первой экспериментальной группе одновременно с добавлением Ес-11Т\УЕЛ1< также добавляли блокирующее тЛЬ против ТХУЕЛК ЛБ.С11. Клетки окрашивали 011-геб 0 на 7 день.

Фиг. 24: Ингибиторный эффект ТХУЕЛК на миогенез ίη νίίτο. Миобласты С2С12 растили приблизительно до конфлюэнтности в среде для роста, основанной на ΌΜΕΜ, и на 0 день среду заменяли средой для дифференцировки с низким содержанием сыворотки, которая содержала 2% лошадиной сыворотки, для запуска дифференциации. Клетки не обрабатывали или обрабатывали Ес-11Т\УЕА1< (100 нг/мл) на 0 день. Образование мышечных трубочек оценивали, используя фазоконтрастную микроскопию, и делали снимки на 6 день дифференциации. К другим экспериментальным группам одновременно с добавлением Ес-11Т\УЕЛК добавляли Еи14-Ес или нейтрализующее антитело против ТИР, таким образом, демонстрируя тот факт, что ингибиторный эффект Ес-11Т\УЕЛК был специфичен для ТХУЕЛК и не вызывался ТИР.

Фиг. 25: ТХУЕЛК может связывать мезенхимальные стволовые клетки человека. Мезенхимальные стволовые клетки человека (11М8Сз) инкубировали с рекомбинантным белком Ес-ТХУЕАК, а затем с РЕконъюгированными вторыми антителами козла против Ес человека или козла против Ес мыши. Способность Ес-Т\УЕАК связываться с 11М8Сз определяли с помощью анализа, сортирующего флуоресцентно активированные клетки (ЕЛС8). Фоновое окрашивание получали окрашиванием только вторыми антителами (2-е только).

Подробное описание изобретения

Если не указано иного, научные и технические термины, использующиеся в настоящем изобретении, имеют значения, которые в большинстве случаев понятны специалистам в данной области. Более того, если в данном контексте не требуется иного, термины, использующиеся в единственном числе, могут включать в себя множественное число, а термины, использующиеся во множественном числе, могут включать в себя единственное число. Как правило, номенклатура, использующаяся при описании клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, вирусологии и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации и их способов, хорошо известна специалистам в данной области и обычно используется в данной области. Способы и методы по настоящему изобретению обычно осуществляют в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области, и они описаны в различных общих и более специфических ссылках, которые цитируются и обсуждаются на протяжении настоящего подробного описания, если не указано иного. См., например, ЗатЬтоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, 26 еб., Со1б Зртшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, Со1б 8рт1ид НагЬог, N. Υ. (1989) и АизиЬе1 е! а1., Ситтеи! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Отееие РиЬйзЫид Аззос1а(ез (1992); и Нат1оте аиб Ьаие, АибЬоб1ез: А ЕаЬогаЮгу Маииа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬота1огу Ргезз, Со1б 8ρτίη§ НагЬог, N. Υ. (1990), которые включены в качестве ссылки. Ферментативные реакции и способы очистки, осуществляемые в соответствии со способами, указанными производителями, являются стандартными для данной области или такими, как описаны здесь. Номенклатура, использующая при описании лабораторных способов и подходов аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанных здесь, хорошо известна и, как правило, используется в данной области. При химическом синтезе, химическом анализе, получении фармацевтических препаратов, композиций и способах доставки и лечения пациентов используются стандартные методы.

Для того чтобы данное изобретение, описанное здесь, было более понятно, ниже приводится подробное описание. В описании используются следующие термины.

«Антитело» относится к интактному иммуноглобулину или к его антигенсвязывающей части, которая конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Антигенсвязывающие части могут быть получены способами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Антигенсвязывающие части включают в себя, в числе других, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Εν, бАЬ и участки, определяющие комплементарность (СЭВ), антитела с одной цепью (зсЕу), химерные антитела, диатела и полипептиды, которые содержат по крайней мере часть иммуноглобулина, которая является достаточной для осуществления специфического связывания антигена с этим полипептидом. Фрагмент ЕаЬ является моновалентным фрагментом, состоящим из доменов УБ, УН, СБ и СН1; фрагмент Е(аЬ')2 является бивалентным фрагментом, содержащим два фрагмента ЕаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; фрагмент Еб содержит домены УН и СН1; фрагмент Εν содержит домены УБ и УН одного плеча антитела; и фрагмент бАЬ (^атб е! а1., ИаШге 341: 544-546, 1989) содерит домен УН. Антитело с одной цепью (зсΕν) представляет собой антитело, в котором области УЪ и УН

- 5 011607 образуют пары с получением моновалентных молекул посредством синтетического линкера, который дает им возможность находиться в виде единичной белковой цепи (Βίτά е! а1., 8с1епсе 242: 423-426 (1988) и Ηυκΐοη е! а1., Ргос. №111. Лсаб. 8с1. И8Л 85: 5879-5883, (1988)). Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых домены УН и УЬ экспрессированы на одной полипептидной цепи, но из-за того, что линкер слишком короткий, чтобы образовать пару между этими двумя доменами на одной цепи, домены вынуждены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два сайта, связывающих антиген (см., например, НоШдег е! а1., Ргос. №111. Лсаб. δα. ϋδΆ 90: 6444-6448 (1993), и Ро1)ак е! а1., 81гисШге 2: 1121-1123 (1994)). Один или несколько СЭК могут встраиваться в молекулу с помощью ковалентной или нековалентной связи с образованием иммуноадгезина. Иммуноадгезин может содержать СЭК как часть длинной полипептидной цепи, может ковалентно присоединять СЭК с другой полипептидной цепью или может содержать СЭК с образованием нековалентной связи. СЭК позволяют иммуноадгезину специфически связываться с конкретным интересующими антигеном.

Антитело может содержать один или несколько сайтов связывания. Если антитело содержит более одного сайта связывания, сайты связывания могут быть идентичны друг другу или различаться между собой. Например, природный иммуноглобулин имеет два идентичных сайта связывания, антитело с одной цепью или фрагмент ЕаЬ имеет один сайт связывания, тогда как «биспецифичные» или «бифункциональные» антитела имеют два различных сайта связывания.

Под «набором антител» понимают все различные виды антител животных или человека. Разнообразие наборов антител является результатом, в числе прочих, рекомбинации генов иммуноглобулинов, различных объединений генов иммуноглобулинов, активности концевой диокситрансферазы и соматических гипермутаций.

«Химерными антителами» являются антитела, которые содержат аминокислотные последовательности других белков и, таким образом, изменены по сравнению с природной формой. Химерные антитела сохраняют по крайней мере одну область аминокислотной последовательности природного антитела, обычно область, содержащую антигенсвязывающий фрагмент (ЕаЬ). Примеры химерных антител включают в себя, но ими не ограничиваются, биспецифические антитела и антитела, полученные слиянием с последовательностями других белков, не являющихся иммуноглобулинами.

«Цис-регуляторный элемент» обычно относится к последовательностям, которые регулируют индуцибильную или конститутивную экспрессию последовательностей генов в специфических условиях или в специфических клетках. Примеры клеточных процессов, экспрессия которых регулируются контрольными последовательностями, включают в себя, но ими не ограничиваются, транскрипцию генов, трансляцию белков, сплайсинг информационной РНК, переключение изотипов иммуноглобулинов, гликолизилирование белков, расщепление белков, секрецию белков, внутриклеточную локализацию белков и экстрацеллюлярный белковый хоминг.

«Цитокины» обычно относятся к сигнальным молекулам иммунной системы. Цитокины включают в себя, но ими не ограничиваются, интерлейкины (1Ь), трансформирующие факторы роста (ТСЕ). фактор некроза опухолей (ΤΝΕ), лимфотоксины (ЬТ), интерфероны, гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е), макрофагальный С8Е, гранулоцитарный С8Е и факторы, ингибирующие миграцию.

«Эмбриональные стволовые (Εδ) клетки» относятся к плюрипотентным или мультипотентным клеткам, которые при введении в бластоцит могут способствовать образованию многих или всех тканей животного в пренатальный, постнатальный период или во взрослом состоянии. Животные, которые образуются при введении в бластоцит Εδ клеток, часто называются «химерными» животными, так как их соматические и/или зародышевые клетки часто получены как из доноров бластоциста, так и введенных Εδ клеток. Одним из важных свойств Εδ клеток является их способность к образованию зародышевых линий животных, что позволяет давать любые желаемые наследуемые свойства потомству химерных животных. Бессмертные Εδ клетки являются мощным набором для создания животных с заданными нарушениями эндогенных последовательностей генов или для создания животных с чужеродными генами (трансгенные животные).

«Последовательности, контролирующие экспрессию» относятся к последовательностям, которые позволяют осуществлять основную или индуцибильную экспрессию последовательностей генов в специфических условиях или в специфических клетках. Примеры клеточных процессов, экспрессия которых регулируются контрольными последовательностями, включают в себя, но ими не ограничиваются, транскрипцию генов, трансляцию белков, сплайсинг информационной РНК, переключение изотипов иммуноглобулинов, гликолизилирование белков, расщепление белков, секрецию белков, внутриклеточную локализацию белков и экстрацеллюлярный белковый хоминг.

«Белки слияния» относятся к химерным белкам, содержащим аминокислотные последовательности двух или более различных белков. Обычно белки слияния получают рекомбинантными способами ίη νί1го, хорошо известными специалисту в данной области. Однако белки, полученные слиянием, могут быть результатом кроссовером ίη νί\Ό или других рекомбинантных событий.

«Молекулы иммуноглобулина человека» относятся к иммуноглобулиновым белкам, которые коди

- 6 011607 руются последовательностями генов иммуноглобулинов человека. Последовательности генов иммуноглобулинов могут экспрессироваться в любой клетке животного. включая человека.

«Гуманизированные антитела» представляют собой антитела. полученные от видов. кроме человека. у которых определенные аминокислоты в основных и константных доменах тяжелых и легких цепей были мутированы так. чтобы избежать или отменить иммунный ответ у человека. В качестве альтернативы. гуманизированные антитела могут быть получены путем слияния константных доменов человеческого антитела и различных доменов животных. Примеры того. как могут быть получены гуманизированные антитела. можно найти в патентах США № 6054297. 5886152 и 5877293.

«Воспаление» или «воспалительное заболевание» относится к главному патологическому процессу. включающему в себя цитологические и гистологические реакции. которые возникают в кровеносных сосудах и расположенных рядом с ними тканях в ответ на повреждение. патологическую стимуляцию или биологические агенты. «невоспалительные состояния» или «заболевание невоспалительного характера» относится к любому состоянию или заболеванию. который не имеет воспалительной природы. как описано здесь.

«Выделенный белок» или «выделенный полипептид» относится к белку или полипептиду. которые в силу своего происхождения или источника получения: (1) не связан с природными компонентами. с которыми он связан в нативном состоянии. (2) свободен от других белков того же вида. (3) экспрессируется клетками других видов или (4) не встречается в природе. Таким образом. полипептид. который синтезируют химическим путем. синтезируют в бесклеточных биологических системах (например. в лизате ретикулоцитов кролика) или синтезируют в клеточных системах. отличных от клеточных систем. из которых полипептид был первоначально «выделен». из связанных с ним природных компонентов. Белок также может быть получен. по существу. свободным от связанных с ними в природе компонентов путем выделения. используя способы очистки белка. хорошо известные в данной области.

«Миметики» или «миметические пептиды» являются непептидными аналогами. которые обычно используются в фармацевтической промышленности как препараты со свойствами. аналогичными свойствам пептида. используемого в качестве образца. Еаисйеге. ί. Αάν. Эгид Кек. 15: 29 (1986); УеЬег и Еге1йтдег. ΤΙΝ8 р. 392 (1985); и Εναηκ е1 а1.. ί. Мей. Сйет. 30: 1229 (1987). которые приведены здесь в качестве ссылки. Миметики зачастую получают с помощью молекулярных моделей. созданных компьютером. Миметические пептиды. которые сходы по своей структуре с пептидами. применяемыми для лечения. могут быть использованы для получения эквивалентного лечебного или профилактического эффекта. Обычно миметики структурно сходы с полипептидами. используемыми в качестве образца (т.е. полипептидом. который обладает желаемыми биохимическими свойствами или фармакологической активностью). например с ΤνΕΑΚ. но имеют одну или несколько пептидных связей. необязательно замененных связями. выбранными из группы. включающей --ΟΗ₂ΝΗ--.--0Η₂8--. --СН₂-СН₂--. --СН=СН-- (цис и транс). --СОСН₂--. --СН(ОН)СН₂-- и --СН₂§0--. способами. хорошо известными в данной области. Для получения более стабильных пептидов также может быть использовано направленное замещение одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же типа (например. Ό-лизин взамен Ь-лизина). Кроме того. ограниченные пептиды. содержащие консенсусную последовательность или по существу идентичный вариант консенсусной последовательности. могут быть получены различными способами. известными в данной области (Κίζο апй С|егакс11. Αηη. Кеу. Вюсйет. 61: 387 (1992). приведены здесь в качестве ссылки); например. путем добавления внутренних цистеиновых остатков. способных образовывать дисульфидные мостики. которые циклизируют пептиды.

«Полипептидные аналоги» относятся к полипептидам. которые получают из полипептидов дикого типа. но отличные от них по своей аминокислотной последовательности. Полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью могут быть мутеинами. белками слияния или миметиками. Полипептидные аналоги также относятся к полипептидами. которые имеют отличия. но не в аминокислотной последовательности. от полипептидов дикого типа. Эти различия могут быть химическими или биохимическими. включая. но ими не ограничиваясь. типы модуляций. подробно описанных здесь.

«Полипептидные фрагменты» относятся к полипептидам. которые имеют делецию на аминоконце и/или карбоксиконце. но у которых аминокислотная последовательность остается идентичной соответствующим положениям природных последовательности. Фрагменты обычно являются фрагментами длиной по крайней мере из 5. 6. 8 или 10 аминокислот. предпочтительно по крайней мере из 14 аминокислот. более предпочтительно по крайней мере из 20 аминокислот. обычно не менее чем из 50 аминокислот и еще более предпочтительно не менее чем из 70 аминокислот.

«Клетки-предшественники» относятся к клеткам. которые дают развитие одной или нескольким клеточным линиям. К ним относятся стволовые клетки. тотипотентные клетки. плюрипотентные клетки. мультипотентные клетки. бипотентные клетки. эмбриональные клетки или клетки взрослого организма. Также к ним относятся тканеспецифические клетки. включая. но ими не ограничиваясь. клетки. относящиеся к определенной линии дифференцировки. способной претерпевать окончательную дифференцировку. клеткам. которые получают из резидентных клеток ткани. и циркулирующих клеток. которые образуются в специфических тканях.

«Субъектом» является человек или животное. Примером субъекта является пациент.

- 7 011607 «Состояние, связанное с ΤνΕΑΚ» относится к любому состоянию, которое является результатом патологической функции или регуляции ΤνΕΑΚ. Данный термин может относиться к любому состоянию, которое напрямую не связано с патологической функцией или регуляцией ΤνΕΑΚ и возникновение которого связано с некоторыми другими механизмами, но где нарушение, увеличение или другое изменение активности ΤνΕΑΚ в определенной степени влияет на это состояние. Состояния, связанные с ΤνΕΑΚ, могут иметь воспалительную или невоспалительную природу и включать в себя, но этим не ограничиваясь, состояния и заболевания, подробно описанные здесь.

«Векторы» относятся к молекулам ДНК, в которые могут быть клонированы, копированы, введены рекомбинантным путем, мутированы или экспрессированы интересующие последовательности ДНК из своих природных клеток. Часто векторы имеют последовательности, контролирующие экспрессию, которые допускают индуцибельную или конститутивную экспрессию последовательностей генов в специфических условиях или в специфических клетках. Примеры векторов включают в себя, но ими не ограничиваются, плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей (ΥΑС), вирусы, эписомы, полученные из вируса Эпштейна-Бар (ΕΒν), бактериофаги, космиды и фагемиды.

«Ксеногенные животные» относятся к животным, имеющим значительную часть локусов иммуноглобулинов человека. Зачастую ксеногенные животны несут гомологичные заданных эндогенные локусы иммуноглобулинов, делающих их неспособными экспрессировать их энедогенные гены иммуноглобулинов. Примеры включают в себя мыши линии ХепоМоике™ (Αϋ^βηίχ, 1пс., Ргетоп!, СаШогша), которые способны к соматическим перестановкам трансгенных генов иммуноглобулинов человека, к гипермутациям различных генов человека, к экспрессии генов иммуноглобулинов и к переключению изотипов иммуноглобулинов. Ксеногенные животные способны к эффективному гуморальному ответу на введение в организм антигена, используя последовательности генов иммуноглобулина человека. Антитела, продуцируемые ксеногенными животными, полностью являются человеческими и могут быть выделены у животных или их потомства, из культивируемых клеток, взятых у животных или их потомства, и из гибридомы, созданной от ксеногенной линии В-лимфоцитов у животных или их потомства. Более того, реогранизованные последовательности генов человека, кодирующие иммуноглобулины в ответ на введение специфического антигена, могут быть выделены обычными рекомбинантными способами.

«Ксеногенные антитела» относятся к антителам, которые кодируются чужеродными локусами иммуноглобулинов. Например, у мыши линии ХепоМоике™ ксеногенные антитела кодируются локусом антител человека.

«Ксеногенные моноклональные антитела» относятся к гомогенным популяциям антител, которые продуцируются в клонированных, иммортализованных клетках, например, гибридоме, полученной от ксеногенных животных. Например, гибридома, полученная от мыши ХепоМоике™, дает ксеногенные антитела.

Фундаментальное понимание болезней делает возможным определение молекулярных механизмов или биохимических путей, лежащих в их основе. Врачи и исследователи, таким образом, могут разработать терапевтические средства и готовить фармацевтические композиции, которые специфически направлены на эти молекулярные механизмы или биохимические пути.

К некоторым из самых сложных и ослабляющих здоровье заболеваний, поражающих людей, относятся заболевания сердца, печени, почек, легких, кожи, скелетных мышц, нарушения метаболизма липидов, болезни желудочно-кишечного тракта, нервной системы, поджелудочной железы, репродуктивных органов, хрящей, костей, соединительной ткани и патологии клеток-предшественников или стволовых клеток. В настоящем изобретении преимущественно показаны важные достижения в понимании этих болезней. Более конкретно, данное изобретение относится к трансгенным животным, которые экспрессируют экзогенные белки ΤνΕΑΚ, и впервые показывает связь между экспрессией белка ΤνΕΑΚ и некоторыми патологическими состояниями сердца, печени, почек и легких. Изобретение также относится к способам лечения или профилактики таких патологических состояний, так же как и к способам идентификации агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ для применения их в этих способах. Патологические состояния включают в себя острую патологию сердца, хроническую сердечную недостаточность, невоспалительную дилатационную кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, гиперплазию эпителиальных клеток печени, гибель гепатоцитов, фиброз печени, вакуолизацию гепатоцитов, поражение печени, патологии желчных протоков, включая гиперплазию желчных протоков, воспалительные заболевания почек, такие как воспаление почек со множественными очагами, заболевания почек невоспалительного характера, такие как тубулярная нефропатия, тубулярная гиперплазия, гломерулярные кисты, гиперплазия почек, утолщение почечной капсулы, гломерулярная нефропатия, синдром Альпорта, почечная тубулярная вакуолизация, образование гиалиновых цилиндров в почках, почечный фиброз, и воспалительные заболевания легких. Изобретение, кроме того, относится к способам обнаружения структур ΤνΕΑΚ или их активности как маркеров заболевания, включая белки ΤνΕΑΚ или их активность, антитела ΤνΕΑΚ и нуклеиновые кислоты ΤνΕΑΚ.

Для лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ, описанных здесь, могут использоваться агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ, которые способны изменять активности ΤνΕΑΚ или нарушать взаимодейст

- 8 011607 вие между мембраносвязанной формой или целого полипептида ТХУЕЛК с его клеточными рецепторами. Альтернативно, терапевтические средства и способы лечения нарушают взаимодействие между мембраносвязанной формой или целым полипептидом ТХУЕЛК с другим полипептидом ТХУЕЛК. Такое взаимодействие может происходить на поверхности клетки, внутри клетки, экстрацеллюлярно или ίη νίΐτο, при связывании с твердой фазой, или в растворе. В качестве альтернативы, терапевтические средства и способы лечения нарушают взаимодействие между мембраносвязанной формой или целым полипептидом Τ\νΕΛΙ< и агентами, взаимодействующими с ТХУЕЛК. Такими взаимодействующими агентами могут быть белки, нуклеиновые кислоты, сахариды, липиды, жирные кислоты и стероиды.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, заболевание, связанное с ΈνΕΑΚ, является невоспалительным.

В другом предпочтительном варианте осуществления заболеванием, связанным с ΕνΕΑΚ, является фиброз, кардиомиопатия, болезнь почек, заболевание легких или болезнь печени.

В другом предпочтительном варианте осуществления заболеванием, связанным с ΕνΕΑΚ, является заболевание скелетных мышц, заболевание жировой ткани, заболевания желудочно-кишечного тракта, заболевание поджелудочной железы, заболевание репродуктивных органов, заболевание нервной ткани, клеточная смерть, кожное заболевание, заболевание хрящей, заболевание костей или коллагеноз.

В другом варианте осуществления агонисты или антагонисты ΕνΕΑΚ могут использоваться для лечения пациентов с заболеванием, болезнью или поражением, при котором требуется обновление или регенерация ткани (например, пациенты с термическими или радиационными ожогами), воздействуя на клетки-предшественники ίη νίνο. Агонисты или антагонисты ΕνΕΑΚ также могут использоваться при лечении пациентов ίη νίνο вместе с трансплантацией клеток-предшественников или ткани. Агонисты или антагонисты ΕνΕΑΚ также могут использоваться для увеличения популяции клеток ίη νίνο или для увеличения популяции клеток-предшественников ίη νίίτο для последующей трансплантации пациентам вместе или без дополнительного лечения. Популяции клеток-предшественников, используемые для клеточной терапии ίη νίνο или увеличении числа ίη νίίτο, для последующей трансплантации могут быть популяцией эмбриональных клеток или клеток взрослого организма. Клетки-предшественники, выделенные из взрослого организма, могут быть мультипотентными или тканеспецифическими (Ьадакке οί а1., 1ттиийу 14: 425-436 (2001); ΤκΕδοη οί а1. ί. С1ш. ЕчуеЧ. 107: 1355-402 (2001); Лоуегеа и №йа1-Стагй. №11иге 415: 240-243 (2002); Οιι^οιιι οί а1., ЫаШге 401: 390-394 (1999); БгагеИсп οί а1., 8с1еисе 290: 1672-1674 (2000); ΡοΙοιέοπ еί а1., 8с1еисе 284: 1168-1170 (1999); Ьадакке еί а1., ЫаШге Мейкте 6: 1229-1234 (2000)).

Болезни сердца являются главной причиной инвалидности и смерти в промышленно развитых странах. В США болезни сердца вызывают приблизительно 40% всех смертельных случаев, составляя приблизительно 750000 смертных случаев ежегодно. Основной нормального функционирования сердца является миокард, состоящий прежде всего из разветвляющихся и анастомозирующих поперечнополосатых мышечных клеток (кардиальные миоциты). Кардиальные миоциты являются гораздо больше промежуточных интерстициальных клеток и составляют более 90% объема миокарда. В нормальном миокарде практически отсутствуют воспалительные клетки и количество коллагена очень мало.

Болезни миокарда очень распространены, но возникают вторично при большом числе заболеваний сердца. Примеры болезней миокарда включают в себя воспалительные заболевания (например, миокардиты) и невоспалительные заболевания сердца, такие как дилатационная кардиомиопатия, системные метаболические расстройства, дистрофия мышц и генетические патологии клеток мышечных клеток сердца.

Главные типы кардиомиопатии включают в себя дилатационные, гипертрофические и рестриктивные кардиомиопатии. Целью данного изобретения являются способы лечения дилатационной кардиомиопатии, которая обычно имеет невоспалительную природу. В случае невоспалительной дилатационной кардиомиопатии, которая составляет приблизительно 90% клинических случаев болезней миокарда, происходит прогрессивная гипертрофия, расширение сердца и сократительная (систолическая) дисфункция.

Дилатационная кардиомиопатия может возникать в любом возрасте, но наиболее часто она возникает у людей в возрасте от 20 до 60 лет. Диагноз часто ставят на основании данных неинвазивного анализа с получением изображения сердца, особенно с помощью двухмерной эхокардиографии. Гистопатология дилатационной кардиомиопатии характеризуется дегенерацией миоцитов с гипертрофией от небольшой до умеренной, отсутствием воспалительных клеток и интерстициальным фиброзом.

Дилатационная кардиомиопатия клинически протекает параллельно с медленно развивающейся застойной сердечной недостаточностью, но состояние пациента может резко перейти от стадии с сохраненной компенсаторной функцией до декомпенсаторной стадии. Часто требуется пересадка сердца. 50% пациентов умирают в течение двух лет и 75% - в течение пяти лет. Причиной смерти обычно является прогрессирующая сердечная недостаточность или аритмия, однако, может происходить эмболия, вызванная смещением внутрисердечного тромба.

Сердце, в котором происходит дилатационная кардиомиопатия, увеличено, дряблое и весит в два или три раза больше, чем нормальное сердце. Все камеры расширены, с утонченными стенками, фиброзированы и обычно с пристеночными тромбами. В небольшом количестве случаев при дилатационной

- 9 011607 кардиомиопатии наблюдается митральная или трикуспидальная регургитиация в результате расширения камеры левого желудочка. Мышечные клетки сердца гипертрофированы и их ядра увеличены. К некоторым причинам дилатационной кардиомиопатии относятся миокардиты, злоупотребление алкоголем или других токсических веществ, беременность (перипартальная кардиомиопатия), ишемия, коронарная болезнь артерий, гипертония и генетические причины.

Идиопатическая дилатационная кардиомиопатия (ГОС) неизвестной этиологии характеризуется расширением одного или обоих желудочков, систолической дисфункцией и часто приводит к застойной сердечной недостаточности. Следует отметить, что термин «ГОС» используется некоторыми специалистами в данной области как аналог термина «дилатационная кардиомиопатия», предполагая, что фактически ГОС является более широкой категорией дилатационных кардиомиопатии, которые не являются результатом злоупотребления алкоголя, токсического поражения или миокардита.

Микроскопически ГОС характеризуется гипертрофией миокардиоцитов, кариомегалией и интерстициальным и периваскулярным фиброзом. В отличие от миокардита у пациентов с ГОС обычно не встречается некроз и клеточная инфильтрация, что говорит о невоспалительной этиологии. Тот факт, что противовоспалительные препараты, такие как преднизон, абсолютно не эффективны для лечения ГОС, согласуется с невоспалительной этиологией ГОС.

Целью данного изобретения являются способы лечения или профилактики дилатационной кардиомиопатии, связанной с активностью ΤνΕΑΚ. Так как причина дилатационной кардиомиопатии (например, ГОС) зачастую не известна, были разработаны определенные подходы для ее лечения. Лечение пациентов обычно направлено на снижение сердечной недостойности, используя физические, диетические и фармакологические способы (например, антагонисты бета-адренорецепторов, антагонисты кальция и антикоагулянты) для контроля симптомов. Также, если возможно, применяется пересадка сердца.

Специалистам в данной области не удалось идентифицировать какой-либо иммунологический, гистохимический, морфологический, ультраструктурный или микробиологический маркер, который мог бы использоваться для диагностики ГОС. Однако на основании эпидемиологических данных можно сделать предположение, что предрасположение к ГОС может быть обусловлено генетически. У 20% пациентов с ГОС родственники первого уровня также имеют симптомы ГОС, что нередко предполагает семейную передачу. Специалистам в данной области необходимо определить молекулярно-генетические маркеры ГОС у пациентов с субклиническими и клиническими болезнями сердца.

В настоящее время список генов, связанных с дилатационной кардиомиопатией, включает в себя сердечный тропонин Т, б-саркогликан, сердечный миозин Ь с тяжелой цепью, актин сердца, атропомиозин, ламин А/С, десмин, рецептор рианодина сердца, десмоплакин, плакоглобин, дистрофин и тафаззин. До сих пор существует потребность в дополнительных генетические факторах, которые могут вносить вклад в развитие дилатационной кардиомиопатии, и в разработке терапевтических средств для их обнаружения. Настоящее изобретение впервые демонстрирует причинную связь между ΤνΕΑΚ и дилатационной кардиомиопатией. Таким образом, целью данного изобретения является способ идентификации дилатационной кардиомиопатии у пациента, путем обнаружения изменений в экспрессии белка ΤνΕΑΚ, акивности белка ΤνΕΑΚ, экспрессии мРНК ΤνΕΑΚ или хромосомных изменений. Способы и реактивы для обнаружения этих молекулярных маркеров заболевания хорошо известны в данной области и включают в себя иммунологические или иммуногистохимические исследования, ферментативные или другие исследования функций белка и стандартные способы гибридизации, такие как Нозерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, анализ точечного нуклеотидного полиморфизма (8ΝΡ) и флуоресцентная гибридизация ίη кйи (ΡΙ8Η).

Необходимо отметить, что невоспалительная дилатационная кардиомиопатия характеризуется прогрессивной гипертрофией сердца, расширением и сократительной дисфункцией. Напротив, болезнь Чагаса является редкой формой миокардита и представляет собой воспалительную болезнь сердца, которая возникает у людей и экспериментальных животных вслед за хронической инфекцией, вызванной Чтурапокота сги/ί. Изучение болезни Чагаса, которая распространена в Центральной и Южной Америке, позволило идентифицировать антиантитела в сыворотке больных болезнью Чагаса. 1окйиа Vуηηе апб Иидепе Β^аиη\νа1б. Неай Пйеаке, Α Τеx!Ьοοк οί Сагбюуакси1аг Мебюте, Уо1ите 2, СИ. 41, рр. 1442-1444 (5111 еб. 1997). Описанные здесь способы направлены на лечение более привычных невоспалительных дилатационных кардиомиопатий, связанных с активностью ΤνΕΑΚ.

Почки взрослого человека обрабатывают более 1700 л крови в день и выделяют приблизительно 1 л мочи. Функцией почек является выведение отходов, поддержание метаболизма, водного и солевого баланса и рН гомеостаза, так же эндокринная функция. Болезни почек в большей степени являются причиной заболеваемости, чем смертности, с приблизительно 35000 смертных случаев ежегодно в Соединенных Штатах. Напротив, миллионы людей ежегодно страдают от болезней почек, не приводящих к смерти, таких как инфекции, почечные камни и непроходимость мочевых путей.

Как правило, гломерулярные заболевания возникают в результате иммунологических нарушений, тогда как патологии канальцев и интерстициальной ткани обычно связаны с токсинами или инфекционными агентами. Неполный список почечных болезней включает в себя острый нефротический синдром, бессимптомную гематурию или протеинурию, острую почечную недостаточность, хроническую почеч

- 10 011607 ную недостаточность, поражения почечных канальцев, инфекции мочевых путей, мочекаменную болезнь, непроходимость мочевых путей и фиброз почки.

В поражения почек, в которые обычно вовлечены канальцы, также вовлечена интерстициальная ткань. Болезни канальцев могут иметь воспалительный или невоспалительный характер и включают в себя ишемическое или токсическое поражение канальцев. Неполный список тубулярных болезней включает в себя острую почечную недостаточность с некрозом канальцев; воспалительные реакции канальцев и интерстиция (тубулоинтерстициальный нефрит); гиперплазия канальцев; тубулоинтерстициальный фиброз (болезнь, вызывающая рубцевание, в развитии которой принимают участие эпителиальные клетки канальцев и интерстициальные фибробласты, мононуклеарные клетки, клубочковый ультрафильтрат, цитокиновый и хемокиновый компоненты); и аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек (ΛΌΡΚΌ) (наследственное заболевание, характеризующееся большими, заполненными жидкостью кистами канальцами и выводящих протоков, вызванное мутацией либо гена ΡΚΌ1, либо гена ΡΚΌ2).

Гломерулярные болезни представляют собой наиболее опасные болезни почек. Например, хронический гломерулонефрит является самой распространенной причиной хронической почечной недостаточности человека. При так называемых вторичных гломерулярных заболеваниях, клубочки могут повреждаться в результате иммунологических нарушений, таких как системная красная волчанка (8ЬЕ), а так же в результате сосудистых нарушений, например, гипертонии и нодозного полиартрита. Также гломерулярный аппарат почек затрагивают нарушения обмена веществ, такие как сахарный диабет (т.е. диабетическая нефропатия) и наследственные заболевания, такие как болезнь Фабри. Первичные гломерулярные болезни включают в себя первичный гломерулонефрит и гломерулопатию.

Группа болезней, которые объединены под названием наследственный нефрит, включают в себя семейные почечные заболевания, связанные, прежде всего, с повреждением клубочков. Синдром Альпорта является формой нефрита, которая сопровождается глухотой, связанной с поражением слухового нерва, и различными глазными болезнями, включая вывих хрусталика, задняя катаракта и дистрофия роговицы. Заболевание больше распространено у мужчин из-за его доминантного Х-связанного генотипа. Однако некоторые женщины также страдают этим заболеванием вследствие либо аутосомнодоминантного и рецессивного генотипа. При синдроме Альпорта клубочковый аппарат почек сегментарно поражается пролиферирующими эпителиальными клетками или склеротизируется. Иногда эпителиальные клетки кажутся пенистыми из-за нейтрального жира и скоплений мукополисахаридов. Базальная мембрана клубочков и трубочек неравномерно утолщена или истончена, с расщеплением и расслоением плотной пластинки (1атша бейка).

Поскольку болезни почек имеют существенное клиническое значение, специалистам в данной области необходимо понимать их физиологические и генетические причины. Кроме того, специалисты в данной области понимают важность разработки новых терапевтических средств для лечения хронических и острых почечных болезней. Данное изобретение впервые показывает причинную связь между Τ\νΕΛΚ и болезнями почек.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления данное изобретение относится к способам лечения болезней почек. В более предпочтительном варианте осуществления болезнью почек может быть синдром Альпорта. В других более предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения характерными признаками болезней почек, лечение которых может осуществляться, являются множественноочаговые воспаления, турбулярная нефропатия, турбулярная гиперплазия, кисты, гломерулярная нефропатия, турбулярная вакуолизация, фиброз или гиалиновые цилиндры.

Болезни легких были и остаются самыми распространенными заболеваниями. Первичные респираторные инфекции, такие как бронхит, бронхопневмония и другие типы пневмонии, наиболее часто встречаются в практике врача. Болезни легких могут осложняться экологическими факторами, такими как дым сигарет, загрязнение воздуха и другими вдыхаемыми агентами. Также распространены хронический бронхит, эмфизема, фиброз и злокачественные новообразования легких. Легкие также вторично вовлечены во многие смертельные заболевания; отек легких, ателектаз или бронхопневмония встречаются у тяжело больных пациентов.

Астма является хроническим рецидивирующим воспалительным заболеванием, отличительным признаком которого является гиперреактивность дыхательных путей. Характерными симптомы обычно являются эпизодические обратимые бронхоспазмы. Астма возникает в результате повышенной реактивности трахеоброхиального дерева к различным стимулам и часто связана с ответом 1дЕ на внешние аллергены.

Существует два главных типа астмы. Первый тип представляет собой экзогенная астма, которая инициируется реакцией гиперчувствительности 1-ого типа, вызываемой действием внешнего антигена. Список заболеваний, относящихся к экзогенной астме, включает в себя атопическую (аллергическую) астму, профессиональную астму и аллергический бронхолегочный аспергиллез. Вторым типом является эндогенная астма, которая возникает в результате неиммунных механизмов, и вызвана факторами, такими как приема аспирина, легочные инфекции, стресс, холод, вдыхание раздражителей и физическая нагрузка.

Специалистам в данной области необходимо лучше понимать механизмы болезней легких, включая

- 11 011607 заболевания, как с воспалительным, так и невоспалительным характером, такие как астма. Более полное понимание облегчит создание улучшенных фармацевтических агентов для лечения заболеваний легких. Настоящее изобретение впервые показывает причинную связь между ТХУЕАК и болезнями легких, и способы их лечения. В более предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения характерными признаками болезни легких являются грануломатозное и/или лимфогистоцитарное воспаление.

Печень является главным регулятором пищеварения и метаболического гомеостаза, включая обработку аминокислот, углеводов, липидов и витаминов пищи, а так же синтез белков сыворотки, детоксикацию и выделение с желчью эндогенных продуктов жизнедеятельности и загрязняющих ксенобиотиков. Таким образом, болезни печени обычно очень серьезны, иногда опасны для жизни.

Печень уязвима в отношении многих типов заболеваний, включая метаболические, токсические, микробные, циркуляторные и неопластические поражения. Токсины или иммунологические нарушения могут вызывать увеличение гепатоцитов, и делать их отечными, с нерегулярными скоплениями цитоплазмы и большими светлыми промежутками. Также задерживаемые желчные вещества могут вызывать появление пенистых и вспученных гепатоцитов. В гепатацитах может происходить накопление веществ, таких как железо, медь и капли жира (стеатоз). В случаях заболеваний печени при алкоголизме и острой жировой печени при беременности, появляются крошечные капли, которые не замещают ядро (известные как микровезикулярный стеатоз).

Некроз гепатоцитов в результате серьезного поражения печени, в числе других, может быть охарактеризован как ишемический коагулятивный некроз. Часто отличительными признаками клеточной смерти при токсических состояниях или состояниях, связанных с иммунологическими нарушениями, являются округлые гепатоциты и сморщенные пикнотические в высокой степени эозинофильные «тельца Каунсильмена», содержащие фрагментированные ядра (результат апоптоза). Альтернативно, гепатоциты могут становиться осмотически надутыми и с разрывами (литический некроз).

Гепатит возникает в результате некоторых патологий печени, связанных с притоком клеток острого или хронического воспаления. Некроз гепатоцитов может предшествовать началу воспаления или наоборот. Фиброз, необратимое последствие поражения печени, обычно является результатом воспалительных или невоспалительных механизмов, таких как прямое токсическое поражение. Характерное выпадение коллагена влияет на поток крови и перфузию гепатоцитов. При развивающемся фиброзе печень разделяется на узлы регенерации гепатоцитов, окруженные рубцовой тканью (цирроз печени).

Овальные клетки, называемые так из-за своей морфологии, представляют собой маленькие, пролиферирующие эпителиальные клетки с яйцеобразным ядром и истонченной базофильной цитоплазмой. Овальные клетки обычно находятся в терминальных желчных протоках, которые соединяют внутрипеченочные протоки, расположенные в портальной триаде, с тяжами гепатоцитов. Эти клетки могут быть получены из резидентных клеток-предшественников печени, или клеток-предшественников костного мозга, которые циркулируют и постоянно находятся в печени. Эти клетки-предшественники протоков способны дифференцироваться как в эпителиальные клетки протоков, так и в гепатоциты. В настоящем изобретении показано, что экспрессия ТХУЕАК трансгенных мышей может увеличивать популяцию клеток-предшественников протоков.

В результате высокого уровня заболеваемости и смертности при болезнях печени, специалистам в данной области необходимо полное понимание молекулярных и генетических основ этих заболеваний. Идентификация причинных факторов облегчает разработку терапевтических средств для лечения хронических и острых заболеваний печени. Настоящее изобретение показывает причинную связь между ТХУЕЛК и болезнями печени, и преимущественно относится к способам их лечения. В более предпочтительных воплощениях, болезнью печени является эпителиальная гиперплазия, вакуолизация гепатоцитов, поражения желчных протоков в результате фиброза, гибели гепатоцитов или патологии печени.

Скелетно-мышечная система является важной системой для принятия положения и передвижения. Скелетные мышцы могут атрофироваться в ответ на отмену введения препаратов, например, глюкокортикоидов, что может быть вторично по сравнению с заболеваниями нерва или отсутствием кровоснабжения. Скелетные мышцы также могут атрофироваться при генетических или дегенеративных заболеваниях. Эти болезни или состояния могут иметь воспалительный или невоспалительный характер. Мышечная дистрофия составляет большую группу наследственных миопатий, характеризующихся атрофией и потерей мышечных волокон в отсутствии нервного заболевания; одной из обычных форм, которая относится к этой группе заболеваний, является мышечная дистрофия Дюшена. Наследственное мышечное заболевание также может встречаться вместе с заболеванием, связанным с накоплением гликогена, таким как дефицит мальтазы, который проявляется мышечной слабостью новорожденных, астеническим телосложением, увеличением сердца и зачастую с ранней смертью от сердечной недостаточности. Наследственные заболевания, приводящие к атрофии мышц, также включают в себя, но ими не ограничиваются, митохондриальные миопатии, липидные миопатии, болезнь центрального стержня и рабдомиолиз. Миопатические состояния также могут возникать у взрослых, одной из наиболее часто наблюдаемых миопатий является алкогольная миопатия. Слабость скелетных мышц также может встречаться как часть нервного заболевания, включая, но ими не ограничиваясь, амиотрофический боковой склероз (АББ). Кроме того, слабость скелетных мышц, также известная как кахексия, является важным патологическим состоянием,

- 12 011607 наблюдаемым у тяжело больных пациентов со злокачественными заболеваниями и зачастую непосредственно связанна со смертью больного. Заболевания скелетных мышц, которые возникают при воспалительных или аутоиммунных заболеваниях, включают в себя полимиозит, воспалительные миопатии и атрофии, вызванные приемом глюкокортикоидом. Настоящее изобретение устанавливает связь между ТХУЕАК и способностью миобластов к дифференцировке в мышечные трубочки. Таким образом, объектом настоящего изобретения являются способы лечения заболеваний скелетных мышц, активируя регенерацию скелетных мышц, используя способы ш νίνο или ш νίΐΓΟ.

Накопление жировых клеток происходит при ожирении, включая ожирение, связанное с метаболическими расстройствами, такими как диабет II типа. Проростание жировых клеток в органы, так называемая жировая инфильтрация, возникает при различных условиях и является патологическим компонентом мышечной дистрофии. Настоящее изобретение показывает связь между ТХУЕАК и способность преадипоцитов дифференцироваться в адипоциты. Таким образом, объектом данного изобретения являются способы лечения расстройств, связанных с накоплением или недостаточностью адипоцитов, путем модуляции дифференцировки адипоцитов с помощью агонистов или антагонистов ТХУЕАК или их фармацевтических композиций.

В способах лечения состояний, связанных с Т^ЕАК, по настоящему изобретению, применяют агонисты или антагонисты ТХУЕАК или содержащие их композиции. Агонисты или антагонисты Т^ЕЛК, которые могут быть использованы для лечения состояний, связанных с Т^ЕАК, по данному изобретению, описаны здесь и известны в данной области. Такие средства включают в себя средства, описанные, например, в международных публикациях РСТ \УО 98/05783, \УО 98/35061, \УО 99/19490, \УО 00/42073 и \УО 01/45730, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки. Антагонисты Т^ЕАК, которые могут использоваться в способах по данному изобретению, включают в себя антитела против Т^ЕЛК, такие как человеческие, нечеловеческие, гуманизированные или ксеногенные антитела, как описано здесь, и эти антитела являются поликлональными, моноклональными или синтетическими. Кроме того, антитела могут быть антителами полной длины, их фрагментами или белками слияния, которые содержат антигенраспознающие последовательности.

ТХУЕАК антагонисты, которые могут использоваться в способах по данному изобретению, также включают в себя антитела против рецептора ТХУЕАК. Здесь рецептором ТХУЕАК может быть ΕΝ14 или другие члены семейства ТИГ-В, которые связывают ТХУЕАК. Антитела к рецептору ТХУЕАК могут быть человеческими, нечеловеческими, гуманизированными или ксеногенными антителами, как описано здесь, и является многоклональными, моноклональными или синтетическими. Кроме того, антитела могут быть антителами полной длины, их фрагментами или белками, полученными слиянием, которые содержат антигенраспознающие последовательности.

Иммунизация животных антигенами ТХУЕАК или рецептора ТХУЕАК может осуществляться любым способом, известным в данной области. См., например, Наг1о\у апб Ьапе, АпйЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, №\ν Уогк: Со1б 8рппд НагЬог Рге§8, 1990. Способы иммунизации животных, но не человека, таких как мыши, крысы, овцы, козы, свиньи, крупный рогатый скот, лошади и тому подобное, хорошо известны в данной области. См., например, Наг1о\у апб Ьапе и патент США № 5994619. В предпочтительном воплощении, антиген для стимуляции иммунного ответа вводят с или без адъюванта. Такие адъюванты включают в себя, среди прочего, полный или неполный адъювант Фрейнда, ΒΙΒΙ (дипептиды мурамила) или 18СОМ (иммуностимулирующие комплексы).

Антиген, выбранный для иммунизации, может быть любым из нижеследующих антигенов: полипептид ТХУЕАК; полипептидный фрагмент ТХУЕАК; мутеин Т^ЕАК; миметик ТХУЕАК; белок слияния Т^ЕАК; полипептид рецептора ТХУЕАК; фрагмент рецептора ТХУЕАК; мутеин рецептора ТХУЕАК; миметик рецептора ТХУЕАК; белок слияния рецептора ТХУЕАК; клетка, экспрессирующая полипептид Т^ЕАК, его фрагмент, мутеин или белок слияния; или клетка, экспрессирующая полипептид рецептора ТХУЕАК, его фрагмент, мутеин или белок слияния. Иммуноглобулины, возникающие в организме животных в ответ на иммунизацию, могут быть получены из различных тканей или жидкостей животных, включая сыворотку, молоко, асцитную жидкость, селезенку, тимус, клетки периферической крови, эмбриональную печень, костный мозг, перитонеальную жидкость и любые другие ткани или жидкости, содержащие значительные концентрации иммуноглобулинов. Также, могут быть получены и выделены гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, секретируемые в среду.

В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения антитела представляют собой поликлональные антитела, моноклональные антитела или гуманизированные антитела. В более предпочтительном варианте осуществления, гуманизированные антитела включают в себя константную область и каркасные области антитела человека. В другом предпочтительном варианте осуществления антитела представляют собой ксеногенные антитела. В более предпочтительном варианте осуществления ксеногенные антитела являются поликлональными антителами или моноклональными антителами.

Ксеногенные антитела представляют собой целые антитела одного вида, которые экспрессируются в совершенно других видах. Например, мышь может экспрессировать ДНК, необходимую для продукции полных антител человека, получаемые антитела являются ксеногенными (т.е. человеческие антитела, продуцируемые мышью). Способы прицельной инактивации (нокаут) дают возможность прекратить нор

- 13 011607 мальную экспрессию эндогенных генов иммуноглобулин животного. Технологии получения трансгенных животных делают возможным получение животных, которые продуцируют ксеногенные иммуноглобулины. Такие ксеногенные животные могут спариваться с животными с нокаутом генов иммуноглобулинов, описанными выше, что приводит к потомству, которое продуцирует только ксеногенные иммуноглобулины и неэндогенные иммуноглобулины.

Экспрессия ксеногенных генов иммуноглобулинов обеспечивает продукцию большого разнообразия антител человека, включая моноклональные антитела. Это происходит потому, что (1) гены экзогенных иммуноглобулинов сохраняют свои цис регуляторные элементы и подвергаются нормальной изменчивости (У), разнообразию (Ό) и принимают участие (I) в рекомбинантных событиях в организме животного; (2) гены экзогенных иммуноглобулинов экспрессируются таким же образом, как и локусы эндогенных иммуноглобулинов; и (3) получающиеся антитела, по-видимому, поддерживают нормальное развитие В-лимфоцитов и гуморальные ответы.

Гены экзогенных иммуноглобулинов могут вводиться животным как полные локусы иммуноглобулинов, как часть локуса иммуноглобулина или как «минилокус», в котором более полный экзогенный локус 1д имитирован посредством включения небольшого количества отдельных генов этого локуса 1д. Кроме того, трансгенные животные могут быть спроектированы для экспрессии трансгенов, кодирующих модинфицированные антитела, такие как антитела с одной цепью или химерные антитела.

Агонисты ΤνΕΑΚ или антагонисты, которые могут быть использованы в способах по данному изобретению, также могут быть полипептидами ΤνΕΑΚ или их фрагментами, аналогами, мутеинами или миметиками, как описано здесь. Аналоги могут отличаться от природной аминокислоты ΤνΕΑΚ либо последовательностью, либо отличаются без изменения последовательности, либо и то, и другое. В предпочтительном варианте осуществления аналоги полипептида ΤνΕΑΚ являются мутеинами. Способы получения мутеинов хорошо известны в данной области молекулярной биологии, и включают в себя изменение молекул ДНК случайным мутагенезом, сайт-направленным мутагенезом и укорочением. Способы получения мутированной ДНК хорошо известны в данной области и включают в себя мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции (РСК), интенсивный (т. е. химический или радиационный) мутагенез, химический синтез ДНК, метод аланинового мутагенеза, мутагенез, направленный на олигонуклеотиды (гибридизация с матричной ДНК ίη νίΙΐΌ с последующей ферментативной элонгацией), кассетный (рекомбинантный) мутагенез и комбинированный мутагенез (введение случайной вырожденной последовательности в ДНК ΤνΕΑΚ).

Полипептиды ΤνΕΑΚ связываются с рецепторами ΤνΕΑΚ, с другими полипептидами ΤνΕΑΚ или с другими агентами, связывающимися с ΤνΕΑΚ. Фрагменты ΤνΕΑΚ могут быть мембраносвязанными и могут быть доставлены в составе фармацевтической композиции, содержащей липосомы и другие клеточные или псевдоклеточные системы доставки. Фрагменты ΤνΕΑΚ также могут быть растворенными полипептидами ΤνΕΑΚ, которые содержат либо усечение, либо внутреннюю делецию, которая удаляет трансмембранный домен. Более того, полипептиды ΤνΕΑΚ, которые могут быть эффективны в способах по данному изобретению, могут либо блокировать ответ ΤνΕΑΚ, либо изменять ответ ΤνΕΑΚ. Примерами таких полипептидов ΤνΕΑΚ являются аналоги белка ΤνΕΑΚ, включая мутанты с делециями или усечением, пептиды, содержащие одну или несколько аминокислотных последовательностей, миметики ΤνΕΑΚ, а также полипептиды ΤνΕΑΚ, модинфицированные вне аминокислотной последовательности.

Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ, которые могут быть эффективны в способах по данному изобретению, также могут быть полипептидными рецепторами ΤνΕΑΚ или их фрагментами, аналогами, мутеинами или миметиками, как описано выше. Полипептидный рецептор ΤνΕΑΚ связывается с полипептидами ΤνΕΑΚ, с другими полипептидными рецепторами ΤνΕΑΚ или с другими агентами, взаимодействующими с рецепторами ΤνΕΑΚ. Фрагменты рецептора ΤνΕΑΚ могут быть мембраносвязанными и могут быть доставлены в составе фармацевтической композиции, содержащей липосомы и другие клеточные или псевдоклеточные системы доставки. Фрагменты рецептора ΤνΕΑΚ также могут быть растворенными полипептидами рецептора ΤνΕΑΚ, которые содержат либо усечение, либо внутреннюю делецию, которая удаляет трансмембранный домен. Более того, полипептиды рецептора ΤνΕΑΚ, которые могут быть эффективны в способах по данному изобретению, могут либо блокировать ответ ΤνΕΑΚ, либо изменять ответ ΤνΕΑΚ. Примерами таких полипептидов рецептора ΤνΕΑΚ являются аналоги рецепторных белков ΤνΕΑΚ, включая мутанты с делециями или усечением, пептиды, содержащие одну или несколько аминокислотных последовательностей, миметики ΤνΕΑΚ, а также полипептиды рецептора ΤνΕΑΚ, модинфицированные без изменения аминокислотной последовательности.

Более того, агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ, которые могут быть эффективны в способах по данному изобретению, могут быть органическими или неорганическими соединениями. Органические соединения могут быть либо маленькими органическими соединениями, такими как соединения из химических библиотек, хорошо известных в данной области. Другие органические соединения включают в себя, но ими не ограничиваются, нуклеиновые кислоты, пептиды, сахариды, липиды и жирные кислоты, стероидные соединения или их производные.

Неорганические соединения могут быть на основе кремнезема или на основании других минералов

- 14 011607 и солей. Органические или неорганические соединения могут связываться с полипептидами ΤνΕΑΚ, полипептидами рецептора ΤνΕΑΚ или другими агентами, взаимодействующими с ΤνΕΑΚ, как описано здесь.

Модификации, не затрагивающие последовательность полипептидов ΤνΕΑΚ или полипептидов рецептора ΤνΕΑΚ, могут быть результатом химических преобразований ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ полипептидов, и включая, но ими не ограничиваясь, изменения в сайте ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования, окисления или гликозилирования. Кроме того, химическое преобразование может включать в себя присоединение к органическим полимерам, таким как полиэтиленгликоль (ΡΕΟ) или другим полимерам, известным в области медицины. Следовательно, полипептидные аналоги ΤνΕΑΚ могут быть результатом модификации без изменения аминокислотной последовательности.

ΤνΕΑΚ или полипептиды ΤνΕΑΚ могут быть экспрессированы как белок, полученный слиянием. Белки, полученные слиянием, хорошо известны в данной области. Специалист в данной области может выбрать из большого числа различных групп для слияния, включая прокариотические и эукаритоические группы.

В соответствии с данным изобретением, любой пациент, включая человека и животных, может подвергаться лечению фармацевтически приемлемым способом фармацевтически эффективным количеством агониста или антагониста ΤνΕΑΚ или композицией, содержащей такие агенты, в период времени, достаточный для лечения состояний, связанных с ΤνΕΑΚ, пациента, которому вводят это количество в течение определенного периода времени. В качестве альтернативы, пациенты могут получать профилактическое эффективное количество агониста или антагониста ΤνΕΑΚ или композиции, содержащей такие агенты, которые эффективно предотвращают развитие состояний, связанных с ΤνΕΑΚ, у субъектов, которым в определенный период времени их вводят. С агонистами или антагонистами ΤνΕΑΚ, которые могут быть эффективны в способах по данному изобретению, могут быть получены фармацевтические композиции способами, описанным здесь, и могут быть доставлены парентеральным путем, инъекцией, через слизистую, перорально, ингаляторно, окулярно, ректально, имплантантом длительного действия, местно, способами длительного высвобождения или покрытием эндопротеза сосуда. Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ могут находиться в различных подходящих формах, применяемых для введения. К ним относятся, например, твердые, полутвердые и жидкие дозированные формы, такие как жидкие растворы или суспензии, взвеси, гели, кремы, бальзамы, эмульсии, лосьоны, порошки, спреи, пены, пасты, мази, линименты и капли.

Кроме того, агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ могут быть доставлены способами генной терапии. Кратко, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки или экспрессирующие антисмысловые молекулы, доставляют пациенту, применяя любые векторы, известные в данной области, подходящие для доставки молекул нуклеиновой кислоты к целевым тканям или органам.

Обычные векторы включают в себя липосомы, плазмиды и вирусные векторы (например, ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы).

Наиболее эффективный путь введения и режим дозирования агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ, или композиций, содержащих их, будет зависеть от желаемого эффекта, лечения, проводимого до этого, если имеет место, состояния здоровья больного, тяжесть его заболевания, ответ на агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ и назначения лечащего врача. Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ, или соединения, содержащие их, могут вводиться в любых дозированных дозах, приемлемых для фармацевтических препаратов или препаратов, используемых в ветеринарии, однократно или серией введений.

Количество агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ, или композиции, содержащие их, которые составляют единичную дозу, может изменяться в зависимости от конкретного пути введения, конкретных агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ, или композиции, уровня дозы и частоты введения. Обычные препараты могут содержать от около 0,01% до около 99%, предпочтительно между около 1% и около 50%, агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ или их композиций (мас./мас.).

В качестве примера, не ограничивая диапазон, терапевтически или профилактически эффективного количества агониста или антагониста ΤνΕΑΚ находится между около 0,005-10,00 мг/кг массы тела, более предпочтительно, между около 0,05-1,0 мг/кг массы тела.

Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ, или композиции, их содержащие, могут вводиться самостоятельно или как часть фармацевтического препарата или препарата, используемого в ветеринарии, или как часть препарата, используемого для профилактики, вместе или без адъюванта. Они могут вводиться парентеральным или пероральным путями. Например, они могут вводиться пероральным путем, через легкие, нос, уши, дермальным, окулярным, внутривенным, внутримышечным, внутриартериальным, внутрибрюшинным путем, через слизистую, подъязычным, подкожным, чрескожным, местным или интракраниальным путями, или буккально. Как в фармацевтических препаратах, так и в препаратах для применения в ветеринарии, агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ могут вводиться местно на любую эпителиальную поверхность. К таким поверхностям относятся поверхность рта, глаза, уха, заднего прохода и носа. Фармацевтические композиции могут быть получены обычными способами смешения, растворения, грануляции, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения или лиофилизации.

- 15 011607

Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены обычным способом. используя один или несколько физиологически приемлемых носителей. включая эксципиенты и дополнительные компоненты. которые способствуют действию активных соединений в препаратах. которые могут быть фармацевтически применены. Соответствующая композиция будет зависеть от предназначенного пути введения.

Для введения через слизистую в композиции могут использоваться агенты для проникновения через соответствующий барьер. Такие агенты для проникновения хорошо известны в данной области. Для введения в глаза используются суспензии в соответствующем физиологическом растворе. что хорошо известно в данной области.

Для перорального введения композиции с агонистами или антагонистами ΤνΕΑΚ могут быть легко получены объединением активных агентов с обычными фармацевтически приемлемыми носителями. Композиции с агонистами или антагонистами ΤνΕΑΚ могут быть получены в виде таблеток. пилюль. липосом. гранул. сфер. драже. капсул. жидкостей. гелей. сиропов. взвесей. суспензий и тому подобное. для перорального приема пациентами. лечение которых проводится.

Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ. или композиции. их содержащими. также могут содержать любые обычные носители или адъюванты. применяемые в фармацевтических препаратах или препаратах. используемых в ветеринарии. Эти носители и адъюванты включают в себя. например. адъювант Фрейнда. ионно-обменные вещества. окись алюминия. стеарат алюминия. лецитин. буферные агенты. такие как фосфаты. глицин. сорбиновая кислота. сорбат калия. частичные глицеридные смеси насыщенных жирных растительных кислот. вода. соли или электролиты. такие как сульфат протамина. динатрий гидрофосфат. хлорид натрия. соли цинка. коллоидный клемнезем. магний. трисиликат. вещества на основании целлюлозы и полиэтиленгликоль. Адъюванты для местных форм или форм на основе геля включают в себя. например. натрий карбоксиметилцеллюлозу. полиакрилаты. блок-полимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен. полиэтиленгликоль и спирты. полученные из воска дерева.

Фармацевтические композиции для парентерального применения могут быть получены как твердые эксципиенты. необязательно измельчая полученную смесь. и гранулируя смесь. после добавления вспомогательных веществ. если желательно. с получением таблеток или ядер драже. Подходящие эксципиенты включают в себя наполнители. такие как сахара. включая лактозу. сахарозу. манит или сорбит; препараты целлюлозы. такие как. например. кукурузный крахмал. пшеничный крахмал. рисовый крахмал. картофельный крахмал. желатин. трагакантовая камедь. метилцеллюлоза. гидроксипропилметил-целлюлоза. карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон (РУР). Если желательно могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты. такие как поливинилпирролидон с поперечными сшивками. агар или альгиновая кислота или их соли. такая как альгинат натрия.

Ядра драже покрывают подходящими покрывающими агентами. Для этой цели могут использоваться концентрированные растворы сахара. которые необязательно могут содержать гуммиарабик. тальк. поливинилпирролидон. карбополовый гель. полиэтиленгликоль и/или диоксид титана. лакообразные растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К таблеткам или агентам для покрытия драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или для того. чтобы различать различные сочетания доз активных соединений.

Фармацевтические композиции. которые могут использоваться перорально. включают в себя сборные капсулы. сделанные из желатина. а также мягкие. герметизированные капсулы. сделанные из желатина и пластификатора. такого как глицерин или сорбит. Сборные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями. такими как лактоза. связывающие агенты. такие как крахмалы. и/или лубриканты. такие как тальк или стеарат магния и. необязательно. стабилизаторы. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях. таких как жирные масла. жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того. могут быть добавлены стабилизаторы. Все композиции для перорального введения могут быть подходящим образом дозированы для такого введения.

Композиции для буккального применения могут быть в форме таблеток или лепешек. полученных обычным способом.

Агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ для ингаляций обычно доставляются в форме аэрозольного спрея. подаваемого из контейнеров с содержимым. находящимся под давлением. или распылителя. используя подходящий пропеллент. например. дихлордифтометан. трихлорфторметан. дихлортетрафторэтан. диоксид углерода иди другой подходящих газ. В случая аэрозоля с содержимым. находящимся под давлением. доза может быть определена с помощью клапана для получения дозированного количества. Капсулы и картриджи. например. желатиновые. для применения в ингаляторе или вдувателе. могут содержать смесь порошка соединения с подходящей основой для порошка. такой как лактоза или крахмал.

Композиции с агонистами или антагонистами ΤνΕΑΚ могут быть получены либо для парентерального введения путем инъекции. например. болюсной инъекцией. либо длительной инфузией. Агенты могут быть приготовлены в виде водных растворов. водных суспензий. масляных суспензий или эмульсий. и они могут содержать средства для приготовления композиций. такие как суспендирующие. стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Композиции для инъекции могут находиться в виде единичной

- 16 011607 дозированной форме, например, в ампулах, или в контейнерах с множеством доз, с добавлением консерванта.

Обычные композиции в виде водных растворов включают в себя физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой раствор. Обычные масляные суспензии могут содержать липофильные растворители или носители, которые включают в себя масла жирных кислот, такие как кунжутное масло или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные растворы для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Необязательно, суспензии могут также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, давая возможность получать высококонцентрированные растворы. В качестве альтернативы, агонисты или антагонисты ТХУЕЛК могут быть в виде порошка для восстановления перед применением подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода.

С агонистами или антагонистами Т^ЕАК также могут быть получены ректальные композиции, такие как суппозитории или клизмы, например, содержащие обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Кроме описанных композиций с агонистами или антагонистами Т^ЕАК также могут быть получены композиции в форме депо. Такие композиции длительного действия могут вводиться путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Таким образом, например, соединения могут быть смешаны с подходящими полимерными или гидрофобными веществами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионно-обменными смолами, или как слаборастворимые производные, например, как слаборастворимая соль.

Фармацевтический носитель агонистов или антагонистов Т^ЕАК, которые являются гидрофобными, представляет собой систему нескольких растворителей, содержащую бензиловый спирт, непротонное поверхностно-активное вещество, водорастворимый органический полимер и водную фазу. Система, содержащая несколько растворителей, может быть системой УРЭ. УРЭ система представляет собой раствор 3% мас./об. бензилового спирта, 8% мас./об. неполярного поверхностно-активного вещества полисорбат 80 и 65% мас./об. полиэтиленгликоля 300, доведенный до объема в абсолютном этаноле. Система УРЭ (УРЭ:5\У) содержит УРЭ, разведенный 1:1 5% декстрозой в водном растворе. В этой системе нескольких растворителей хорошо растворяются гидрофобные соединения, и само по себе она является низкотоксичной при системном применении. Естественно, пропорции системы нескольких растворителей могут значительно изменяться, не влияя на их свойства растворимости и токсичности. Более того, компоненты этой системы могут изменяться: например, вместо полисорбата 80 можно использовать другие низкотоксичные неполярные поверхностно-активные вещества; может изменяться размер фракции полиэтиленгликоля; полиэтиленгликоль может быть заменен другими биосовместимыми полимерами, например, поливинилпирролидоном; и декстроза может быть заменена другими сахарами или полисахаридами.

Альтернативно, могут использоваться другие системы доставки гидрофобных фармацевтических соединений. Примерами средств доставки или носителей гидрофобных лекарственных средств являются липосомы и эмульсии. Также могут использоваться определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид, хотя они являются более токсичными.

Кроме того, агонисты или антагонисты Т^ЕАК могут быть доставлены, используя системы длительного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих терапевтический агент. Доступны различные вещества с длительным высвобождением, и они хорошо известны в данной области. Капсулы с длительным высвобождением могут, в зависимости от своей химической природы, высвобождать соединения в течения периода от нескольких недель до более чем 100 дней.

В зависимости от химической природы и биологической стабильности агониста или антагониста Т^ЕАК, могут использоваться дополнительные приемы для стабилизации белка.

Фармацевтические композиции также могут содержать подходящие твердые или гелеобразные носители или эксципиенты. Примеры таких носителей или эксциентов включают в себя, но ими не ограничиваются, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Агонисты или антагонисты ТХУЕАК могут быть представлены как соли с фармацевтически приемлемыми противоионами. Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены с большим количеством кислот, включая, но ими не ограничиваясь, хлористо-водородную, серную, уксусную, молочную, винную, яблочную, янтарную и так далее. Соли, которые более растворимы в водных или других протонных растворителях, соответствуют формам свободного основания.

С агонистами или антагонистами ТХУЕАК также могут быть получены фармацевтические композиции, которые эффективны для покрытия эндопротезов сосудов, для лечения заболеваний сердца, связанных с Т^ЕАК.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации агонистов или антагонистов ТХУЕАК. Такие агонисты или антагонисты ТХУЕАК могут быть эффективны для лечения состояний, свя

- 17 011607 занных с ΤνΕΑΚ, т.е. заболеваний, с поражением или другими патологическими состояниями тканей в которых экспрессируется рецептор ΤνΕΑΚ, например, ΡΝ14. Эти состояния включают в себя фиброз и заболевания сердца (например, кардиомиопатии), почек, легких, печени, кожи, скелетных мышц, липидного обмена (например, ожирение), желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, репродуктивных органов, нервной ткани (включая нейродегенерацию), хряща, кости и соединительной ткани. Такие агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ также эффективны для стимуляции обновления ткани, модулируя поведение клеток-предшественников ш νίνο или ш νίίτο в соответствии с настоящим изобретением.

В одном из вариантов осуществления, способ идентификации антагониста ΤνΕΑΚ включает в себя стадии: 1) введения исследуемому трансгенному животному, которое экспрессирует экзогенную ДНК, кодирующую полипептид ΤνΕΑΚ или его фрагмент, аналог, мутеин или миметик, с соединением, которое возможно является антагонистом ΤνΕΑΚ; 2) сравнение фиброзной ткани, сердечной ткани, почек, печени, легких, кожи, скелетных мышц, жировой ткани, органов желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, репродуктивных органов, нервной ткани, хрящевой ткани, костной или соединительной ткани исследуемого трансгенного животного с тем же органом или тканью указанных животных, экспрессирующих экзогенную ДНК, но не получавшим это соединение; и 3) определение эффекта данного соединения на фиброзную ткань, сердечную ткань, почки, печень, легкие, кожу, скелетные мышцы, жировую ткань, органы желудочно-кишечного тракта, поджелудочную железу, репродуктивные органы, нервную ткань, хрящевую ткань, костную или соединительную ткань. В другом варианте осуществления трансгенное животное является либо млекопитающим, либо не является млекопитающим, как описано здесь.

Трансгенные животные, описанные здесь, экспрессируют экзогенные ДНК, кодирующие полипептиды ΤνΕΑΚ, где экспрессия приводит к развитию заболевания, связанного с ΤνΕΑΚ. В примерах были получены трансгенные мыши, экспрессирующие экзогенные белки ΤνΕΑΚ либо в измененной растворимой форме, либо в виде полной мембранно-связанной формы. У мышей, экспрессирующих экзогенные белки ΤνΕΑΚ, наблюдали фенотип, который включал в себя невоспалительную дилатационную кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, гиперплазию эпителиальных клеток печени, вакуолизацию гепатоцитов, поражение печени и воспалительные заболевания почек, такие как мультиочаговое воспаление, невоспалительные заболевания почек, такие как тубулярная нефропатия, кисты, гломерулярная нефропатия, гиперплазия почечных канальцев, фиброз почек и воспалительные заболевания легких. Более того, у мышей дикого типа, которых инфицировали вирусными векторами, экспрессирующими экзогенные белки ΤνΕΑΚ, также наблюдали гиперплазию желчных протоков, гибель гипатоцитов, фиброз печени и поражение печени.

Обладая такими животными, специалисты в данной области имеют мощный способ поиска препаратов.

В частности, животные, которые экспрессируют экзогенные белки ΤνΕΑΚ, являются модельной системой для применения способа при поиске агонистов или антагонистов ΤνΕΑΚ, которые могут быть эффективны для профилактики или лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ, описанных здесь.

В предпочтительном варианте осуществления животные, которые могут быть эффективны в качестве таких модельных систем, являются либо млекопитающими, либо не являются млекопитающими. В более предпочтительном варианте осуществления млекопитающими являются мыши, крысы, хомячки, кролики, собаки, кошки, коровы, свиньи, козлы, лошади, овцы, морские свинки и приматы. В другом более предпочтительном варианте осуществления животные, не являющиеся млекопитающими, представляют собой птиц, рыб, амфибий, насекомых и беспозвоночных.

Экзогенная ДНК, кодирующая полипептид ΤνΕΑΚ, экспрессируется в трансгенных животных с помощью контролирующей экспрессию последовательности, которая контролирует экспрессию экзогенной ДНК у животного. Контролирующие экспрессию последовательности, которые контролируют транскрипцию, включают в себя, например, промоторы, энхансеры сайтов, прекращающих транскрипцию, области, контролирующие локусы, сигналы, процессирующие РНК-полимеразу и элементы, перестраивающие хроматин. Контролирующие экспрессию последовательности, которые контролируют посттранскрипционные события, включают в себя донорные и акцепторные сайты и последовательности, которые модифицируют время полураспада транскрибируемой РНК, например, последовательности с непосредственным добавлением ро1у(А) или сайты связывания РНК-связывающих белков. Контролирующие экспрессию последовательности, которые контролируют трансляцию, включают в себя сайты связывания рибосом, последовательности, которые непосредственно направлены на экспрессию полипептида в определенный клеточный компартмент или внутри него, и последовательности в 5' и 3' нетранслируемых областях, которые модифицируют скорость или эффективность транскрипции.

Предпочтительными контролирующими экспрессию последовательностями, в случае экспресси ΤνΕΑΚ у трансгенных мышей, включают в себя вирусные элементы, высокоэкспрессирующие белок, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных ЬЕК, цитомегаловируса (СМУ) (такие как промотор/энхансер СМУ), вируса обезьян 40 (8У40) (такие как протомотор/энхансер 8У40), аденовируса, (например, главный последний промотор аденовируса (ΑбМ^Ρ)), полиомы и сильные белки млекопитающих, такие как нативные иммуноглобулины и промоторы актина. В одном из вариантов

- 18 011607 осуществления, ДНК, кодирующие полипептиды ΤνΕΑΚ, контролируются промотором альфа антитрипсина (ААТ). Более подробное описание вирусных элементов, контролирующих экспрессию, и их последовательности, можно найти, например, в патентах США 5168062; 4510245 и 4968615.

Экзогенные ДНК также могут экспрессироваться в трансгенных животных из элементов, котролирующих тканеспецифическую экспрессию, включая промоторы. Такие специфические элементы контроля экспрессии хорошо известны в данной области. Не ограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают в себя альбуминовый промотор, специфичный для печени (Рткей е! а1., Сенек Эеу. 1: 268-277 (1987)), промоторы, характерные для лимфоидной ткани (например, Са1ате апб Еа!оп, Α6ν. 1ттипо1. 43: 235-275 (1988); νίηοΐο апб Ва1бтоге, ΕΜΒΟ I. 8: 729-733 (1989); Вапегр е! а1., Се11 33: 729-740 (1983); и Циееп апб ВаШтоге, Се11 33:741-748 (1983)), промоторы, характерные для нервной ткани (например, Вугпе апб Внбб1е. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 86: 5473-5477 (1989)), промоторы, характерные для поджелудочной железы (например, Еб1ипб е! а1., 8с1епсе 230: 912-916 (1985)), промоторы, характерные для молочных желез (например, патент США 4873316 и европейская патентная заявка 264166) и промотры, регулирующие развитие (например, Кекке1 апб Сгикк, 8аепсе 249: 374-379 (1990); Сатрек апб ТбдЬтап, Сепек Эет. 3: 537-546 (1989)). Другие неограничивающие примеры тканеспецифических промоторов включают в себя промотор тяжелой цепи альфа миозина сердечной ткани (α МНС), промотор кератина-14 кожной ткани (Κ14), промотор поверхностного белка С ткани легких (8РС) и промоторы ткани почек Ккр-кадгерин и почечного белка, регулирующего андрогены (КАР). Экзогенная ДНК может быть экспрессирована из индуцибильного эукариотического промотора, такого как металлотиониновый (МТ) промотор, или других индуцибильных эукариотических промоторов, хорошо известных в данной области.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения полипептиды ΤνΕΑΚ, экспрессирующиеся в трансгенных животных по данному изобретению, могут быть целыми полипептидами ΤνΕΑΚ. В другом варианте воплощения, полипептиды, экспрессируемые в трансгенных животных, являются фрагментами полипептида ΤνΕΑΚ. В одном из предпочтительных вариантах воплощения фрагменты полипептида ΤνΕΑΚ являются растворимыми ΤνΕΑΚ.

В другом варианте воплощения данное изобретение относится к трансгенным животным, которые экспрессируют экзогенно ДНК, кодирующее полипептиды ΤνΕΑΚ, в тканях, выбранных из группы, включающей в себя: сердце; кровь; сосуды; легкие; печень; почки; мозг; плаценту; скелетные мышцы; поджелудочную железу; селезенку; лимфу; тимус; аппендикс; лимфоциты периферической крови; желудочно-кишечный тракт; нейроны; кожу; адипоциты; хрящ; кости; соединительную ткань. В одном из вариантов осуществления ДНК ΤνΕΑΚ экспрессируется из конститутивного промотора. В другом варианте осуществления ДНК экспрессируется из индуцибильного промотора. В другом варианте осуществления ДНК экспрессируется из тканеспецифического промотора.

Настоящее изобретение также относится к способам идентификации агонистов ΤνΕΑΚ, которые могут действовать как терапевтические агенты для лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ или для стимулирования обновления ткани, модулируя поведение клеток-предшественников ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ в соответствии с настоящим изобретением. Возможные агонисты могут быть введены нормальным животным и их эффект на системы органов может оцениваться. Фиброзная ткань, сердечная ткань, почки, печень, легкие, кожа, скелетные мышцы, жировая ткань, органы желудочно-кишечного тракта, поджелудочная железа, репродуктивные органы, нервная ткань, хрящевая ткань, костная или соединительная ткань обработанных животных затем сравнивали с той же тканью необработанного животного; таким образом определяли, индуцирует ли соединение биологический эффект на любую указанную ткань.

Данное изобретение также относится к способу идентификации генов, регулируемых ΤνΕΑΚ, которые могут действовать в качестве терапевтических мишеней для лечения заболеваний, связанных с ΤνΕΑΚ. Например, перепрофилирование ΚΝΑ может быть осуществлено у трансгенных мышей ΤνΕΑΚ по сравнению с нормальными животными в различных тканях и таким образом могут быть идентифицированы мишени для действия препарата.

Кроме того, целью настоящего изобретения являются способы, влияющие на стволовые клеткипредшественники или дифференциацию, включая дифференциацию стволовых мезенхимальных клеток, которые преобразуются в мышечные клетки, хрящевые клетки, костные клетки или клетки соединительной ткани, такие как клетки стромы, фибробласты, адипоциты и клетки кожи.

Также целью данного изобретения являются способы воздействия на пролиферативную или дифференциальную способность овальных клеток, которые могут давать эпителиальные клетки желчных протоков или гепатоциты и клетки-предшественники почек, которые могут давать клетки эпителия канальцев.

Примеры

Для лучшего понимания данного изобретения приводятся нижеследующие примеры. Эти примеры даны в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения границ данного изобретения любым способом.

Пример 1. Получение трансгенных мышей с ΤνΕΑΚ.

Для идентификации активности ΤνΕΑΚ и биологических последовательностей сигнальных путей ΤνΕΑΚ в целевом(ых) органе(ах) ш ν^νο, были созданы две конструкции, экспрессирующие ΤνΕΑΚ у

- 19 011607 мышей и они использовались для сверхэкспрессии белков ΈνΕΑΚ у нормальных мышей (С57В1/6 х ΌΒΑ/2) Е1 и (С57В1/6 х ΜΕ/ί) Е2, используя обычные трансгенные способы. К.8. \νί11ίηιη5 апй Ρ.Ό. ^аднег. ί. ЛррНей ΡΗ\·5ίο1οβ\· 88: 1119-1126 (2000). Использовались следующие конструкции, экспрессирующие Т^БЛЕ: (1) кДНК ^νΕΑ/ аминокислот 101-249 8ΕΟ ΙΌ N0:1, кодирующую растворимую форму мышиного ^νΕΑ!/ (обозначен как δ^νΕΑ!/) в направлении 5'-3' после сигнальной последовательности 1дО мыши, вводили в вектор экспрессии СН269 (вектор, полученный из вектора Ρ0ΩΕΡ4 (Iην^ί^οдеη) и содержащий дополнительную последовательность 8У40 ροΕ А) после промотора альфа-антитипсина (ААТ) человека и бета-глобинового интрона и перед последовательностью гормона роста человека (ЙСН) ροΕ А; и (2) кДНК, кодирующую весь трансмембранный белок (обозначен как Ε^-ΤVΕЛΚ), соответствующую аминокислотам 1-249 8Ε0 ΙΌ N0:1, вводили в вектор экспрессии рВ1ие8сг1р1 (как описано в Οο5ρΕ·ιΙ-.1ο8ο еί а1., ί. Nеи^ο^ттиπο1οду 133: 116-123 (2002)), содержащий дополнительный сайт 8У40 ροΕ А. Последовательность Ε^-Τ\VΕЛI< и дополнительный сайт ροΕ А затем выделяли и клонировали в другой вектор; перед ними вставляли фрагмент регуляторной области, содержащий энхансер АроЕ - промотор ААТ человека, для создания вектора экспрессии СА300. Было показано, что промотор ААТ непосредственно транскрибируется в основном в печени и с низкими уровнями в других тканях, включая почки. Р. Κοορтаη еί а1., Сопок Эеу. 3: 16-25 (1989).

В случае трансгенной конструкции κΕνΕΑΚ, с помощью ПЦР концевой ДНК, используя зонды, соответствующие последовательности нуклеотидов 468-488 (5' праймер) и последовательности нуклеотидов 693-713 (3' праймер) комплементарной цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 2, были идентифицированы 23 независимых «родоначальника» трансгенной линии. Кроме того, ΕΕΙ8Α сыворотки на содержание ^νΕΑ!/. показал, что 10 из этих 23 «животных-родоначальников» имели определяемые уровни ^νΕΑ!/. в своей сыворотке, в количестве от 0,06 до 3,0 мкг/мл. Оставшиеся 13 животных-родоначальников не имели определяемых уровней ΕνΕΑ/ в сыворотке, т.е. уровни были < 10 нг/мл. Девять из 10 «родоначальников» с РСК+ Τ\VΕЛI<+ в сыворотке заболевали приблизительно в возрасте 4-5 месяца. Была отмечена потеря веса, согнутое положение тела, взъерошенный мех и выпучивание глаз. Пять из этих «родоначальников» неожиданно умирали и, следовательно, для эксперимента убивали только оставшихся четырех с признаками заболевания. Напротив, только 1 животное из 13 «родоначальников» с РСК+ с негативной сывороткой заболевало или умирало. Также 0 из 4 РСК- детенышей одного помета заболевали/умирали.

В случае трансгенной конструкции Ε^-Τ\VΕЛI<. с помощью ПЦР и Нозерн-блоттинга концевой ДНК было идентифицировано два «родоначальника» трансгенной линии, экспрессирующие мРНК Τ\VΕЛI< в печеночной ткани. Кроме того, анализ ΕΕΙ8Α сыворотки в отношении Τ\VΕЛI< показал, что ни один из этих двух «животных-родоначальников» не имел определяемые уровни ΈνΕΑ/. в своей сыворотке, т.е. уровни были меньше 10 нг/мл. Мыши «родоначальники» Ε^-Τ\VΕЛI< Тд не имели клинически видимого фенотипа.

Пример 2. Сверхэкспрессия ΥνΕΑ/ у мышей, инфицированных вектором аденовируса с экзогенной ДНК, кодирующей ΤVΕΑΚ.

Для идентификации биологических эффектов сверхэкспресси ΥνΕΑ/ ίη νίνο, самки взрослых мышей С57ВЬ/6 в возрасте 8-10 недель инфицировали аденовирусным вектором с дефектом репликации, с промотором цитомегаловируса (СМУ), несущим кДНК либо мышиный ^νΕΑ/ («Лάеηο-ΤVΕΑΚ»), либо зеленый флуоресцентный белок медузы («СЕР»), используя стандартные способы, использующие аденовирус, как описано Τаο οί а1., Μο1οαι13Γ Τйе^аρу 3: 28-35 (2001). Аденовирусный вектор, содержащий СЕР («Αάοηο-ΟΕΡ»), использовали как отрицательный контроль. Для определения была ли мышь успешно инфицирована адено-ΤVΕЛΚ конструкцией, определяли уровни белка Τ\VΕЛI< в сыворотке и контролировали их в различные моменты времени, используя стандартный анализ.

Системную сверхэкспрессию мышиного κΤVΕЛΚ у взрослых мышей индуцировали тканевыми изменениями по крайней мере в трех главных органах: печени, почках и сердце. См. табл. 1. Фенотип этих мышей, экспрессирующих аденовирусную конструкцию, сравнивали с фенотипом мышей Т^ГАХ Тд примера 1, как показано на табл. 1. Эти наблюдения более подробно описаны в примерах, следующих ниже.

- 20 011607

Таблица 1

Сверхэкспрессия ΤνΕΑΚ, индуцированная реконструкцией тканей у взрослых мышей

Орган	Фенотип	ТИЕАК Тд	АсЭепо-ТИЕАК у взрослых мышей	А0епо-6ГР у взрослых мышей
Печень	Гиперплазия желчных протоков	+	+
	Гибель гепатоцитов		+
Почки	Тубулярная гиперплазия	+	+
Сердце	Дилатационная кардиомиопатия	4-	+

Пример 3. Дилатационная кардиомиопатия, вызванная δΤνΕΑΚ и ЕЬ-ΤνΕΑΚ.

Четыре выживших родоначальника примера 1, РСК+, ΤνΕΑΚ+ в сыворотке, убивали для проведения эксперимента и исследовали на явные морфологические патологии. См. табл. 2.

Макроскопическое исследование в момент вскрытия показало увеличение сердца, у некоторых размер сердца был в 2-3 раза больше размера нормальных животных. Так как увеличение размера сердца наблюдали у нескольких независимых трансгенных родоначальников δΤνΕΑΚ, невозможно, чтобы такое увеличение размера сердца было связано с независимыми результатами вскрытия. Более того, химический анализ сыворотки трансгенных мышей δΤνΕΑΚ показал увеличение специфической креатинкиназы сердца.

Таблица 2

Трансгенные мыши δΤνΕΑΚ

Родоначальник	Сывороточный ТИЕАК	Фенотип
10 РСК+	0,06-3,0 мкг/мл	9/10 умерли на 4-5 месяц у 4/5, подвергавшихся гистопатологическому исследованию, было увеличенное сердце
13 РСК+	< 10 нг/мл	1/13 умерли на 6 месяц и имели увеличенное сердце
4 РСК-	—	0/4 умерли на 6 месяц

Фенотип с увеличенным сердцем также наблюдали у отдельных мышей трансгенной линии ЕЬΤνΕΑΚ, полученной последовательным обратным скрещиванием линии С57ВЬ/6. См. табл. 3. У трансгенного Ε^-ΤVΕΑΚ-негативного потомства не было выявлено патологий сердца.

Таблица 3

Трансгенные мыши ЕЬ-ΤνΕΑΚ

Представители	Сывороточный ТИЕАК	Фенотип
7 РСВ+		7/7 показали увеличение сердца на 5 месяц
4 РСК-	< 10 нг/мл	0/4 умерли на 5 месяц

Эти данные, взятые вместе, убедительно показывают, что фенотип с увеличенным сердцем не связан с ΤνΕΑΚ.

Гистопатологический анализ сердца трансгенных мышей δΤνΕΑΚ и ЕЬ-ΤνΕΑΚ показал сходные данные. Микроскопия с низким разрешением сердца трансгенной мыши ЕЬ-ΤνΕΑΚ («Τ§») в сравнении с нормальным сердцем трансгенного негативного («ΝΤ§») потомства показана на фиг. 1. Показанное сердце трансгенных мышей ЕЬ-ΤνΕΑΚ характерно для трансгенных мышей δΤνΕΑΚ (РСК+, ΤνΕΑΚ+ в сыворотке). В сердце трансгенных мышей наблюдается дилатационная кардиомиопатия, отличительным признаком которой является дилатация желудочков и предсердий. Наряду с этим дефектом был отмечен тромбоз предсердия и желудочка у большого числа животных (фиг. 1). Исследование у некоторых животных ткани легких и печени показало закупорку кровеносных сосудов.

Микроскопия с высоким разрешением выявила другие гистопатологические нарушения в сердце,

- 21 011607 включая гипертрофию миокардиоцитов и кариомегалию. Необходимо отметить, что гистопатологический анализ желудочков трансгенных мышей ΤνΕΑΚ не показал следов воспаления. Следовательно, наблюдаемая кардиомиопатия, связанная с ΤνΕΑΚ, по своему характеру является невоспалительной.

Химический анализ сыворотки всего объема крови трансгенных мышей к'1'νΕΑΚ (3 родоначальника и 1 потомство) показал патологически высокие уровни креатинкиназы (СК), особенно в сердце (т.е. ΜΒ тип СК), подтвержденные значительным уровнем сердечного напряжения/повреждения.

У самок мышей С57ВЬ/6 в возрасте 8-10 недель, инфицированных Αάеηо-ΤVΕΑΚ (см. пример 2), наблюдалась дилатационная кардиомиопатия, которая возникала на третий день после инфицирования, по сравнению с мышами, инфицированными негативным контролем, вирусом Αάеηо-СРΡ. У мышей, инфицированных ΤνΕΑΚ, сердце имело расширенные камеры, как показано на гистопатологической картине (фиг. 2).

Анализируя данные, было показано, что ΤνΕΑΚ играет важную роль в развитии кардиомиопатий, включая дилатационную кардиомиопатию, и застойной сердечной недостаточности (СНР).

Пример 4. Гиперплазия эпителиальных клеток печени, вакуолизация гепатоцитов, гибель гепатоцитов, гиперплазия желчных путей, фиброз печени и поражение печени, вызванные ΤνΕΑΚ.

Роль ΤνΕΑΚ в гиперплазии эпителиальных клеток печени и вакуолизации гепатоцитов, а также поражение мышей дикого типа, инфицированных аденовирусом, содержащим ДНК, экспрессирующую полипептид ^νΕΑΚ, была показана на трансгенных мышах ΜνΕΑΚ и РЬ-ΤνΕΑΚ.

В печени мышей ΤνΕΑΚ Τ§ в возрасте 2 недели примера 1 наблюдали значительную гиперплазию желчных путей и овальных клеток по сравнению с мышами ΝΤ§. См. фиг. 3. Как показано на табл. 4, печень трансгенных мышей-родоначальниц РЬ-ΤνΕΑΚ имела умеренную гиперплазию желчных путей и овальных клеток даже при уровне ΤνΕΑΚ в сыворотке < 10 нг/мл. У трансгенных мышей РЬ-ΤνΕΑΚ, полученных обратным скрещиванием начальной линией С57ВЬ/6, наблюдали значительную гиперплазию желчных путей и овальных клеток (табл. 4).

Таблица 4

Трансгенные мыши РЬ-ΤνΕΑΚ

Мыши	Сывороточный ТНЕАК	Фенотип
2 родоначальника	< 10 нг/мл	Умеренная гиперплазия желчных путей и овальных клеток
1 потомок, полученный обратным скрещиванием в линии С57ВЬ/6		Заметная гиперплазия желчных путей и овальных клеток

Аналогично, у трансгенных родоначальников ^νΕΑΚ, которые имели уровни ΤνΕΑΚ в сыворотке между 0,2 и 3,0 г/мл, наблюдалось значительная гиперплазия желчных путей и овальных клеток (табл. 5).

Таблица 5

Трансгенные мыши ΜνΕΑΚ

Мыши	Сывороточный ТИЕАК	Фенотип
9 родоначальников	0,2-3,0 мкг/мл	Заметная гиперплазия желчных путей и овальных клеток
1 потомок	0,06 мкг/мл	Умеренная гиперплазия желчных путей и овальных клеток

Эта гиперплазия желчных путей и овальных клеток подтверждена иммуногистохимическим (1НС) окрашиванием срезов печени РЬ-ΤνΕΑΚ Τ§, полученные у мышей Τ§ примера 1, с помощью Α6 тΑЬ, который дифференцировал эпителиальные клетки желчных протоков и овальных клеток от гепатоцитов (ЬпдеПии'Ш е1 а1., ЭйГегепДайоп 45: 29-37 (1990)). На фиг. 4 показано увеличение Α6 положительных клеток, связанных с портальными областями, а также расширение паренхимы печени в РЬ-ΤνΕΑΚ Τ§ по сравнению с ΝΤ§. Большее накопление гематоксилина и эозина в окрашенных срезах РЬ-ΤνΕΑΚ Τ§ мыши также ясно указывает на явное увеличение количества овальных клеток, расположенных рядом с желчными путями в портальных областях (фиг. 5). Иммуногистохимия в отношении ядерного антигена пролиферирующих клеток (Ρί'ΝΑ) подтвердила увеличение количества пролиферирующих клеток желчных путей и овальных клеток у мышей ΤνΕΑΚ Τ§ по сравнению с мышами ΝΤ§ уже в возрасте 2 неде- 22 011607 ли. Позже, т.е. в возрасте между 8 неделей и 7 месяцем (не показано), наблюдалось увеличение количества пролиферирующих гепатоцитов у мышей ТХУЕАК Тд по сравнению с мышами ΝΤ§. Более того, как ЕБ-ΤΧνΕΑΚ. так и хТХУЕАК индуцировали гепатоцеллюлярную вакуолизацию мышей Тд примера 1 в возрасте 7 месяцев по сравнению с потомством NΤд (фиг. 6).

У мышей С57ВБ/6 и ВАЬВ/с 8СГО в возрасте 8-10 недель, сверхэкспрессирующие кТ^ЕАК, при введении вируса Айепо-Т^ЕАК, как в примере 2, наблюдали значительные уровни Т^ЕАК в сыворотке. См. фиг. 7, на которой показан эффект, возникающий при введении различных доз аденовируса, на измеренные уровни Т^ЕАК в сыворотке. Мышей инфицировали либо внутривенно 10¹¹ частицами аденовируса на мышь (показано как линия «В»), либо внутривенно 10¹⁰ частицами аденовируса на мышь (показано как линия «1») или внутримышечно 10¹¹ частиц аденовируса на мышь (показано как линия «Н»). У мышей, инфицированных Айепо-кТ^ЕАК, наблюдалось поражение печение, с желтухой в сыворотки, на 3 и 7 день у мыши С57ВЬ/6 линии и на 3 и 4 день у мыши ВАЬВ/с 8СГО линии. Несколько мышей линии ВАЬВ/с 8СГО умерли на 4 день.

Более того, у мышей С57ВЬ/6, инфицированных Айепо-кТ^ЕАК, как описано в примере 2, также происходила гибель гепатоцитов уже на 2-3 день после введения, что показывает высокий уровень аспартат-аминотрансферазы («А8Т») и аланин аминотрансферазы («АЬТ») маркерных ферментов печени в печени мышей, инфицированных Т^ЕАК (Айепо-кТ^ЕАК) по сравнению с печенью мышей, инфицированных СЕР (Айепо-СЕР) на 3 день (см. табл. 6 и фиг. 8). На 7 день после инфицирования количество обоих ферментов печени увеличивалось у мышей, обработанных Айепо-СЕР, что следует ожидать в результате воспаления, вызванном одним только аденовирусным вектором. Смерть гепатоцитов также наблюдается в печени мышей, инфицированных Т^ЕАК, что показывает гистологическая морфология, отличающаяся округлыми гепатоцитами и сморщенными, пикнотическими, в высокой степени эозинофильными «тельцами Каунсильмена», содержащими фрагментированные ядра (фиг. 8). У мышей, которым вводили Айепо-кТ^ЕАК, кроме того, развивается сильная гиперплазия желчных путей, которая достигает пика на 7 день после инфицирования и остается хорошо видимой на 11 день (фиг. 8). В печени мышей, инфицированных Т^ЕАК, наблюдались гиперпластические структуры, экспрессирующие маркер А6, специфичный для эпителиальных клеток желчных путей и овальных клеток, что было идентифицировано с помощью микроскопией по методу светлого пятна.

Таблица 6

Количество ферментов печени у животных, инфицированных

Ай-Т\\'ЕАК и Ай-СЕР

Айепо-СЕР	Айепо-зТИЕАК
День	А5Т (Ед/л)	АЬТ (Ед/л)	АЗТ (Ед/л)	АЬТ (Ед/л)
3	148	110	1715	672
7	2140	1545	1910	1194
11	2540	2304	795	508
20	683	420	451	320

Еп14, являющийся клеточным рецептором Т^ЕАК, был индуцирован после введения в печень токсинов, таких как галактозамин (СаШ) и тетрахлорид углерода (СС1₄). На фиг. 9 показано, что Еп14 не определяется в печени здоровых взрослых мышей в анализе гибридизации ш δίΐιι (Ι8Η), используя зонд в отношении Еп14, и при микроскопии методом темного поля. Однако Еп14 индуцировался в высокой степени при поражении СС1₄. Сходные результаты были получены после повреждения СаШ (не показано).

У мышей С57ВЬ/6, инфицированных Айепо-Т^ЕАК, как описано в примере 2, в гепатоцитах и некоторых гиперпластических структурах также в высокой степени идуцировался Еп14, что отмечалось в печени Айепо-кТ^ЕАК по сравнению с печенью контрольных мышей Айепо-СЕР (данные не показаны).

Кроме того, была показана роль Еп14 на модели желчных путей, в которых поражение печени у мышей С57ВЬ/6 в возрасте 10 недель индуцировали лигированием желчных путей, как описано Ьш е( а1., Нера1о1оду 28: 1260-1268 (1999); О1упус е( а1., Ат. I. Ра1Ьо1. 152: 347-352 (1998). Общий желчный проток лигировали на 0 день проводя хирургическую операцию и пять мышей С57ВЬ/6 в возрасте 10 недель затем подвергали эвтаназии на 4 день и 8 день после операции. Затем готовили парафиновые срезы печени и определяли экспрессию Т^ЕАК и Еп14 с помощью гибридизации ш кйи, используя антисмысловые зонды Т^ЕАК и ΡΝ14 мыши с радиоактивной меткой, содержащие весь ген ΡΝ14. Как показано на фиг. 10, на 4 день Еп14 активно экспрессировался в эпителиальных клетках желчных путей, но не в гепатоцитах. На 8 день экспрессия Еп14 в эпителиальных клетках желчных путей значительно снижалась, но у некоторых мышей определяли низкие уровни экспрессии Еп14 (данные не показаны). Однако экспрессия Т^ЕАК не изменялась и не определялась на моделях с лигированными желчными протоками. Эти результаты показали, что экспрессия Еп14 стимулируется в эпителиальных клетках желчных путей в ответ на определенные факторы, поражающие печень, и таким образом, играют важную роль в развитии фиброза печени.

Анализ этих наблюдений показал, что Т^ЕАК является важным фактором гиперплазии эпители

- 23 011607 альных клеток печени, вакуолизации гепатоцитов, поражения печени, гибели гепатоцитов, гиперплазии клеток желчных путей и фиброза печени.

Пример 5. Заболевания почек, вызванные ЕЬ-Т^ЕАК и 5Т\УЕАК.

У трансгенных мышей ЕБ-ТХУЕАК примера 1 наблюдали явное заболевание почек, включая умеренное мультиочаговое воспаление, тубулярную нефропатию, кисты, гломерулярную нефропатиию, тубулярную базофилию, тубулярную дилатацию, тубулярную вакуолизацию и образование гиалиновых цилиндров.

У мышей С57ВБ/6, инфицированных Абепо-Т^ЕАК в возрасте 10 недель, как описано в примере 2, наблюдали гломерулярную нефропатию и тубулярную гиперплазию по сравнению с отрицательным контролем у мышей, инфицированных Абепо-СЕР. Также, в результате увеличения экспрессии Ри14 на мышиной модели болезни Альпорта была показана роль ТХУЕАК в синдроме Альпорта. Более того, роль ТХУЕАК при фиброзе почек была показана на мышиной модели односторонней обструкции мочеточника, вызывающей фиброз почек, при введении антагониста ТХУЕАК.

Расширение интерстиции коркового слоя обычно возникает при отеке или инфильтрации при остром или хроническом воспалении клеток и фиброзе ткани. У трансгенных мышей РЬ-Т^ЕАК примера 1 наблюдается тубулярная нефропатия и умеренное мультиочаговое воспаление интерстиции. Более конкретно, в поперечном срезе почек при сравнении почек нетрансгенных мышей и почек трансгенных мышей ЕБ-ТХУЕАК в возрасте 8 недель отчетливо видна тубулярная базофилия (фиг. 11, снимки, расположенные в середине).

Гломерулярная нефропатия может отличаться лейкоцитарной инфильтрацией, как нейрофильной, так и моноцитарной, и пролиферацией эндотелия, эпителиальных и мезангиальных клеток. У трансгенных мышей ЕЬ-Т^ЕАК, как описано в примере 1, наблюдается явная гломерулярная нефропатия вследствие повышенного содержания мезангиальных клеток и гипертрофии эпителия капсулы и умеренного утолщения капсулы с базофилией подлежащего эпителия канальцев (фиг. 12). Также у трансгенных мышей ЕЬ-Т^ЕАК наблюдается дилатация мочевого пространства, что приводит к образованию гломерулярных кист с умеренным перигломерулярным фиброзом (фиг. 11, нижний снимок справа), по сравнению с нормальной морфологией клубочков мыши (фиг. 11, верхний снимок справа).

Базофилия канальцев, наблюдаемая у мышей ЕЬ-Т^ЕАК Тд, показывает увеличение РНК в цитоплазме клеток этих канальцев, т.е. транскрипционную активность, и предполагает, что эти клетки являются пролиферирующими.

Окрашивание ядерным антигеном пролиферирующих клеток (РСЫА) подтверждает, что в почках мышей Т\УЕАК-Тд. как описано в примере 1, находится группа пролиферирующих клеток канальцев и что эти клетки соответствуют базофильным канальцам (фиг. 13). Для определения, являются ли базофильные канальцы проксимальными или дистальными, три серии тканевых срезов мышей ТХУЕАК Тд окрашивали (1) гематоксилином и эозином (Н & Е) для выявления расположения базофильных канальцев, (2) лектином, специфичным для проксимальных канальцев (лектин Т. Ритритеак) и (3) лектином, специфичным для дистальных канальцев. На фиг. 14 показано, что базофильные (пролиферирующие) канальцы у мышей ТХУЕАК Тд, как описано в примере 1, не экспрессируют эпителиальные маркеры, характерные для проксимальных, не дистальных канальцев.

Наличие пролиферирующих канальцев, у которых отсутствуют некоторые эпителиальные маркеры, у мышей ТХУЕАК Тд согласуется с моделью вызванного поражения почек, где клетки, полученные из 83 сегмента проксимального канальца, демонстрируют свойства клеток-предшественников, т.е. они начинают пролиферировать и экспрессировать маркеры мезинхимальных клеток, характерные для дедифференцирования. Последующее дифференцирование этих клеток может играть роль в восстановлении ткани путем регенерации новых канальцев (\Убхда11 е1 а1., 1. С11п. 1пуе51. 93: 2175-2188 (1994)). Альтернативно, может происходить пролиферирование и дифференцирование существующих клетокпредшественников, которые находятся в 83 области.

Наличие пролиферирующих клеток, у которых отсутствуют некоторые эпителиальные маркеры, у мышей ТХУЕАК Тд также согласуется с моделью развития почек, где эпителиальные канальцы образуются из мезенхимальных клеток-предшественников, которые подвергаются дифференцировке, и, следовательно, приобретают эпителиальные маркеры и свойства, характерные для канальцев.

Аналогично, инфицирование мышей С57ВБ/6 в возрасте 10 недель вирусом Абепо-кТ^ЕАК, как описано в примере 2, вызывает гломерулярную нефропатию и базофилию эпителия канальцев, а также случайное утолщение и гиперплазию гломерулярной капсулы на 11 день после инфицирования (фиг. 15). Это отличается от нормальной гистологии, наблюдаемой у мышей отрицательного контроля, инфицированных Абепо-СЕР. Более того, базофилия, которая указывает на пролиферацию эпителиальных клеток, наблюдается на 3 день, но своего пика достигает приблизительно через неделю после введения.

Было показано, что мРНК ТХУЕАК широко экспрессируется в почках взрослой мыши С57ВБ/6 (фиг. 16) и было показано, что мРНК Еп14 экспрессируется в проксимальных канальцах внутреннего коркового слоя/наружной части мозгового слоя (фиг. 17), как показано гибридизацией ίη δίΐιι (Ι8Η), используя антисмысловые зонды ТХУЕАК и Еп14 с радиоактивной меткой, визуализируя микроскопией по методу темного поля, что согласуется с ролью ТХУЕАК при заболеваниях почек. Также было показано,

- 24 011607 что мРНК Рп14 индуцируется в почках мышей в модели синдрома Альпорта. На фиг. 18 показано увеличение мРНК Рп14 у двух мышей с синдромом Альпорта по сравнению с животными дикого типа при развитии заболевания у мышей с синдромом Альпорта в возрасте от 4 до 7 недель.

Роль ТАБАК на модели болезни Альпорта у мыши непосредственно исследовали введением антагониста ТАБАК, белка слияния Бп14-Бе мыши. Мышам двух групп, состоящих из 5 мышей с нокаутом Альпорта (КО), полученные в соответствии с Сокдгоуе е! а1., Сепек Эех. 10 (23): 2981-2992 (1996), вводили контрольный 1д62а (тиР1.17) или белок слияния ιιιιιΡΝ 14-Бе (полученный Вюдеп (СашЬпбде)). Используемый контрольный 1д62а представляет собой белок миеломы мыши Р1.17, полученный из гибридомы и очищенный стандартными способами очистки шАЬ. Белок шиЕЫ14-Ес представляет собой белок слияния экстрацеллюлярного домена Рп14 мыши и области Рс 1дС2а мыши. Белок слияния получали либо из клеток эмбриональной почки человека 293 или из клеток яичника китайского хомячка (СНО) и очищали стандартными способами очистки шАЬ. Первое введение осуществляли мышам в возрасте три недели с дозой 100 мкг белка внутрибрушинным путем (1Р). Введение продолжали осуществлять в течение следующих четырех недель в той же дозе два раза в неделю. Мышей убивали в конце 7-ой недели (возраст 7 недель). Почки отделяли и помещали в парафин и замораживали. Степень фиброза и воспаления почек оценивали по морфологии клубочков при окрашивании Н & Е парафиновых срезов, активных миофибробластов при окрашивании актином гладких мышц и активных моноцитов при окрашивании СЭ11Ь замороженных срезов. Срезы, окрашенные актином гладких мышц и СЭ11Ь. использовали для количественной оценки окрашенных областей для определения степени фиброза и воспаления, соответственно, с помощью компьютерной программы Ме(аМогрй. Результаты анализа показали, что состояние клубочков у мышей, которым вводили ЕЫ14-ЕС, значительно улучшалось (59% клубочков с патологией у контрольных мышей, которым вводили 1д, по сравнению лишь с 39% клубочков с патологией у мышей, которым вводили Еп14-Ес, значение Р=0,03). Патология клубочков характеризуется серповидностью и/или фиброзом клубочков. Кроме того, фиброз кортикальной области почек у мышей, которым вводили ΡΝ14-ΡΟ был значительно меньше при измерении окрашивания альфа-актином гладких мышц, значение р = 0,04. Общей тенденцией также было снижение моноцитарной инфильтрации у мышей, которым вводили ЕЫ14-ЕС. Эти результаты ясно показывают, что введением мышам ΡΝ 14-Рс с болезнью Альпорта снижает фиброз кортикальной области почек и улучшает общую морфологию клубочков.

Роль ТАЕАК также исследовали на мышиной модели односторонней обструкции мочеточника, вызывающей фиброз почек, при введении антагониста ТАЕАК, моноклональных антител против ТАЕАК хомяка. На модели мыши с прогрессирующим фиброзом почек, мочеточник лигировали, что приводило к односторонней обструкции мочеточника (ииО). (К1айг е! а1., Аш 1 К1бпеу Όίκ 18: 689-699 (1991); Мопуаша е! а1., К1бпеу 1п! 54 (1): 110-119 (1998)). ИИО вызывала прогрессивный нефросклероз без острой почечной недостаточности у мыши, так как почка без обструкции мочеточника могла относительно нормально поддерживать функцию почек. Тогда как в почке с обструкцией мочеточника быстро развивался фиброз клубочков, почка без обструкции адаптивно гипертрофировалась.

Действие вводимого антагониста ТАЕАК на ϋϋθ-вызванный фиброз почек оценивалась морфометрически. Использовали четыре группы из восьми самцов мышей С57ВБ/6 без вирусного антигена (1асккоп БаЬога!опек, Ваг НагЬог МЕ) в возрасте 8-10 недель. Мышей разделяли на следующие группы введения: только РВ8 (УЕН), контрольное антитело хомячка против гемоцианина лимфы улитки (КЕН) (НА4/8; приобретено у ВО Вюкаепсек (8ап 1оке)), антитела хомячка против мышиного ТАЕАК (АВ.С11; получено от Вюдеп (СашЬпбде)), растворимого рецептора ТСР-β 1д мыши (ТСР-β, положительный контроль; получено от Вюдеп (СашЬпбде)) и без введения (ИЫОР).

Для индукции фиброза почек левый мочеточник асептически изолировали и перерезали в почке на оперируемой стороне на 0 день, как описано Нанимай е! а1., Кгбпеу 1п! 58: 242-250 (2000). Мышам следующих групп: РВ8, НА4/8 и АВ.С11 (анти-ТАЕАК шАЬ) осуществляли дополнительные введения на 2, 6 и 9 день после хирургического вмешательства и мышам группы кТ6Е-вК.-1д на 1, 3, 6 и 8 день. На 10 день после операции левую лигированную почку удаляли и разрезали пополам, делая разрез поперек через центр почечной лоханки, и готовили для получения парафиновых срезов.

Парафиновые срезы почки окрашивали Тпсйгоше-Маккоп на коллаген. Для количественной оценки коллагена и определения степени фиброза прооперированных почек на срезах, окрашенных ТпсйгошеМаккоп, с помощью программы Ме(ашогрй измеряли области, окрашенные в голубой цвет (фиг. 19).

Неожиданно на срезах почки животных, которые получали моноклональные антитела против ТАЕАК (АВ.С11), было обнаружено 42% снижение содержания коллагена по сравнению с животными, которым вводили РВ8, и 30% снижение содержания коллагена по сравнению с животными контроля, которые получали антитела (НА4/8). Напротив, в почках животных, которым вводили растворимый рецептор ТСР-β 1д (Т6Е-К.) было только 33% снижение количества коллагена по сравнению с животными, которым вводили РВ8, и 19% снижение количества коллагена по сравнению с животными контроля, которые получали антитела (НА4/8). Эти результаты ясно показывают, что введение антагониста ТАЕАК, такого как моноклональные антитела против ТАЕАК, гораздо эффективней снижают фиброз почек по сравнению с растворимый рецептор ТСР-β 1д (Т6Е-К.).

- 25 011607

Анализ полученных в этом эксперименте результатов показал. что ΤνΕΑΚ играет важную роль в воспалительных заболеваниях почек. таких как мультиочаговое воспаление. и невоспалительные заболевания почек. таких как тубулярная нефропатия. кисты. гломерулярная нефропатия. синдром Альпорта. тубулярная базофилия. тубулярная дилатация. тубулярная вакуолизация. образование гиалиновых цилиндров. тубулярная гиперплазия и фиброз почек.

Пример 6. Воспалительные заболевания легких. вызываемые ΤνΕΑΚ.

В поперечных срезах легких трансгенных мышей ЕЬ-ΤνΕΑΚ и контрольных мышей. как описано в примере 1. наблюдается выраженное грануломатозное и лимфогистиоцитарное воспаление как у мышей ЕЬ-ΤνΕΑΚ. так и у κΤνΕΑΚ Τ§ (фиг. 20). Также была обнаружена эндогенная экспрессия ΤνΕΑΚ в клетках легких. выстилающих брохиолы и альвеолы нормальных мышей. как показано анализом гибридизации ίη κίΐιι (Ι8Η). используя антисмысловые зонды ΤνΕΑΚ с радиоактивной меткой. визуализированные микроскопией по методу темного поля (Ι8Η) (фиг. 21).

С помощью Ι8Η. используя антисмысловые зонды Еп14 с радиоактивной меткой. визуализируя микроскопией по методу темного поля. было показано. что мРНК Еп14 экспрессируется в высокой степени в легких взрослых мышей С57ВЬ/6. что согласуется с ролью ΤνΕΑΚ при заболеваниях легких (фиг. 22).

Анализ этих данных показал. что ΤνΕΑΚ является важным фактором. вызывающим воспалительные заболевания легких. включая грануломатозное и лимфогистиоцитарное воспаление.

Пример 7. ΤνΕΑΚ ингибирует как адипогенез. так и миогенез.

Эффект ΤνΕΑΚ на клеточную дифференциацию исследовали. используя две модели ίπ νίίτο адипогенеза и миогенеза. хорошо известные в данной области (Сгееп и Меи111. Се11 3: 127-133 (1974); Уайе апй 8ахе1. Νοίυιβ 270: 725-727 (1977)).

Для адипогенеза сначала выращивали клетки 3Τ3-Ε1 до конфлюэнтности в модинфицированной по Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ) для роста и затем индуцировали для адипогенеза в соответствии со способами. известными в данной области. Сгееп апй 1<е1ипйе. Се11 5: 19-27 (1976). Кратко. клетки стимулировали на 0 день средой ΌΜΕΜ. модинфицированной средой ΜΌΙ. содержащей дексаметазон. инсулин и ΙΒΜΧ в течение двух дней. а затем средой ΌΜΕΜ только с инсулином в течение еще двух дней. На 5 день клетки культивировали в нормальной среде ΌΜΕΜ для роста и адипогенез оценивали на 7 день окрашиванием 011-Кей.

Для миогенеза клетки С2С12 растили приблизительно до конфлюэнтности в среде ΌΜΕΜ для роста и на 0 день. меняли на среду для дифференциации с низким содержанием сыворотки. содержащим 2% сыворотки лошади для стимуляции дифференциации (Уайе апй 8ахе1. №11иге 270: 725-727 (1977)). Образование миотрубочек оценивали. используя фазоконтрастый микроскоп. и делали снимки на 6 день дифференциации.

Для оценки действия ΤνΕΑΚ на эти два пути дифференцировки на 0 день добавляли различные варианты рекомбинантного ΤνΕΑΚ человека (ΤVΕΑΚ-Е^ΛС. ΤνΕΑΚ или Ес-ΤνΕΑΚ) до конечной концентрации 100 нг/мл и каждый день обновляли. ΤνΕΑΚ ингибировал как адипогенез. так и миогенез в обеих системах (фиг. 23 и 24). Специфичность ингибиторного эффекта ΤνΕΑΚ подтверждали. используя в качестве нейтрализующего агента либо моноклональные антитела против ΤνΕΑΚ хомячка ΑΒΌ11. либо 1Еп14-Ес.

Эти результаты показали. что ΤνΕΑΚ играет важную роль в клеточной дифференцировке. Настоящее изобретение. таким образом. относится к способам воздействия на клеточную дифференциацию клеток-предшественников. описанных здесь. используя полипептиды. пептиды. агонисты или антагонисты ΤνΕΑΚ. описанные здесь.

Пример 8. Связывание ΤνΕΑΚ с мезинхимальными стволовыми клетками человека.

Мезинхимальные стволовые клетки человека (1Μ8&) (СатЬгех С'огр.. ΕηκΙ Ки111ег[огй. Νί) культивировали в среде Μ8№Μ (СатЬгех) и выращивали их. инкубируя с РВ8. содержащим 5 мМ ΕΌΤΑ. и готовили для анализа по сортировке флуоресцентно активированных клеток (ЕΛС8).

Клетки инкубировали в буфере ЕΛС8. содержащем РВ8 и 1% ЕВ8 вместе с 100 нг/мл Ес-ΤνΕΑΚ в течение 1 ч на льду. После промывки дважды буфером ЕΛС8. клетки затем инкубировали с фикоэритрин-конъюгированными вторыми козьими антителами против Ес человека или козьими антителами против Ес мыши с разбавлением 1:200 (йаскюп IттиποКеκеа^сЬ. Vеκί Стоге. РΛ) (фиг. 25). Фоновое окрашивание измеряли окрашиванием только вторичными антителами. как показано в виде пунктирной линии.

Как показано на фиг. 25. ΤνΕΑΚ связывался с мезинхимальными клетками человека. что видно как измерение характера окрашивания Ес-ΤνΕΑΚ по сравнению с изображением. полученным при обработке только вторым антителом. Таким образом. способность ΤνΕΑΚ связывать мезенхимальные клетки (клетки-предшественники. способные дифференцироваться в мышечные клетки. а также в клетки хряща. кости. соединительной ткани. такие как клетки стромы. фибробласты. адипоциты и клетки кожи). что показывает. что ΤνΕΑΚ играет важную роль в дифференциации этих типов клеток. как в моделях нормальной. так патологической ткани.

- 26 011607

Пример 9. Ри14 экспрессируются в нейрональных стволовых клетках.

Экспрессию Ри14 оценивали в мозге эмбрионов мышей в возрасте 13,5 день в смеси основных линий С57ВЬ/6 и 129/8ус. Мозг подвергали гибридизации ίη δίΐιι. используя антисмысловой Ри14 зонд. Положительный сигнал определяли в субвентрикулярной зоне желудочков эмбриона. что коррелировало с расположением стволовых клеток (данные не показаны). Эти результаты показывают. что Ри14 играет важную роль в клеточной дифференциации.

Пример 10. Способы идентификации терапевтических агентов для лечения заболеваний. связанных с Т\\'ЕЛК.

Для идентификации антагонистов ТХУЕЛК. которые могут действовать как терапевтические агенты для лечения заболеваний. связанных с ТХУЕЛК. по настоящему изобретению. были получены животные для исследования. такие как мыши. экспрессирующие экзогенную ДНК. кодирующую полипептид ТХУЕЛК. его фрагмент. аналог. мутеин или миметик. Животным затем вводили соединение. которое предположительно может действовать как терапевтический агент для лечения заболеваний. связанных с ТХУЕЛК. Фиброзную ткань. сердечную ткань. почки. печень. легкие. кожу. скелетные мышцы. жировую ткань. органы желудочно-кишечного тракта. поджелудочную железу. репродуктивные органы. нервную ткань. хрящевую ткань. костную или соединительную ткань исследуемого животного затем сравнивали с той же тканью указанного животного. которое экспрессирует ДНК. но которому не вводили соединение; и. таким образом. определяли. влияет ли соединение на заболевание. связанное с ТХУЕЛК. фиброзной ткани. сердечной ткани. почек. печени. легких. кожи. скелетных мышц. жировой ткани. желудочнокишечного тракта. нервной ткани. хрящевой ткани. костной или соединительной ткани.

Для идентификации агонистов ТХУЕЛК. которые действуют как терапевтические агенты для лечения заболеваний. связанных с ТХУЕЛК. по настоящему изобретению. исследуемому животному. например. мыши. которое экспрессирует экзогенную ДНК. кодирующую полипептид ТХУЕЛК. его фрагмент. аналог. мутеин или миметик. вводили соединение. которое вероятно может действовать как терапевтический агент для лечения заболеваний. связанных с ТХУЕЛК. Фиброзную ткань. сердечную ткань. почки. печень. легкие. кожу. скелетные мышцы. жировую ткань. органы желудочно-кишечного тракта. поджелудочную железу. репродуктивные органы. нервную ткань. хрящевую ткань. костную или соединительную ткань исследуемого животного затем сравнивали с той же тканью указанного животного. которому не вводили соединение; и. таким образом. определяли. индуцирует ли соединение какое-либо биологическое изменение указанных тканей. описанных здесь. в результате передачи сигналов ТХУЕЛК ίη νίνο.

Все публикации и патентные заявки. перечисленные в этом подробном описании. приведены здесь в качестве ссылки. как если бы каждая публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как приведенная в качестве ссылки.

Хотя вышеуказанное изобретение для иллюстрации было подробно описано и для большего понимания были приведены примеры. понятно. что специалисту в данной области будет понятно в свете методик настоящего изобретения. что определенные изменения и модификации могут быть сделаны не выходя за рамки или отходя от сущности описанного здесь. включая прилагаемую формулу изобретения.

- 27 011607

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <ио> виккьу, ыыла

ЦАКиВОЯЗК!, ΑΝΙΕ1Α

НАНМ, ΚΥυΐΚ3ΜΙΝ

2ΗΕΝ6, ΤΙΜΟΤΗΥ <120> способ лечения заболеваний, связанных с ТТЛ/ЕАК <1зо> анорсг <140 >

<141>

<150> 60/371,611 <151> 2002-04-09 <160> 2 <170> РаЬепЫп Уег. 2.1 <210> 1 <211:» 249 <212> РКТ <213> Мигеле зр.

<400> 1

Не! А1а А1а Агд Агд Зег О1п Агд Агд Агд 01у Агд Агд Й1у 01ч Рго

1

5

10

15

<Э1у

ТЬг

А1а

Ъеи

Ъеи

А1а

Рго

ъеи

Уа1

ьей

Зег

Ьей

С1у

Ьей

А1а

Ьей

20

25

30

А1а

Сув

Ьей

<31у

Ьей

Ьей

Ьей

Уа1

Уа1

Уа1

Вег

Ьей

01/

Зег

Тгр

А1а

35

40

45

ТЬг

Ъеи

Зег

А1а

О1п

31и

Рго

бег

С1п

С1и

01и

Ьей

ТЬг

А1а

014

Азр

50

55

60

Агд

Агд

С1и

Рго

Рго

С1и

Ьей

Авп

Рго

01п

ТЬг

С1и

С1и

Зег

С1П

Авр

65

70

75

90

Уа1

Уа1

Рго

РЬе

Ьей

61«

С1ь

ьей

Уа1

Агд

Рго

Агд Агд

Зег

А1а

Рго

95

ЭО

95

Ьуз

01 у Агд

Ъуз

А1а

Агд

Рго

Агд

Агд

А1а

Не

А1а

А1а

Ηίβ

Туг

61и

100

105

110

Ча1

ΗΪΒ

Рго

Агд

Рго

Б1у <ИЛ Акр 01у А1а

С1п

А1а

<31у

Уа1

Азр 01у

115

120

125

ты

Уа1

Зег

С1у Тгр

θΐιι

<31и

ТЬг Ьув

11е

Авп

бег

Зег

Зег

Рго

Ьей

130

135

140

Агд

Туг Азр

Агд αία

Не

С1у

С1и

РЬе

ТЬг

Уа1

11е

Агд

А1а

В1у Ьей

145

150

155

160

Туг Туг

Ьеи

Туг

Суз

О1п

Уа1

Н1в

РЬе

Аар

О1и

01 у Ьув

А1а

Уа1

Туг

165

170

175

Ьеи

ЬуВ

Ьеи

Авр

ьеи

Ьеи

Уа1

Авп

<31у

Уа1

Ьеи

АГ а Ьеи

Агд

Сув

Ьеи

180

185

190

С1и

С1и

РЬе

Зег

А1а

ТЬг

А1а

А1а

Зег

Зег

Рго

01у Рго

<31п

Ьеи

Ахд

195

200

205

Ьеи

Суз

<31п

Уа1

Зег

е1у

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

Агд

РГО О1у

Зег

Зег

ьеи

210

215

220

Агд

Не

Агд

©1Г

Ьеи

Рго

Тгр

А1а

Ηίβ

Ьеи

Ьув

А1а А2а

Рго

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

ТЬг

Туг

РЬе

В1у

Ьеи

₽Ье

81п

Уа1

Шз

245

<210> 2 <211ь 1239 <212ь ДНК <213> Мигхпе ар.

<4005 2 аЕддссдссс дЕсддадсса даддсддадд дддсдссддд дддадссддд сассдсссЕд 60 сЕддссссдс ЕддЕдсЕдад сскдддесЕд дсдсЕддссЕ дссЕЬддссЕ ссЕдсЕддЕс 120 дЕддЕсадос ЕддддадсЕд ддсаасдсЕд ЕсЕдссЬадд адссЕЕсЕса ддаддадсЕд 180 асадсададд ассдссддда дсссссЕдаа сЕдааЕйссс адасададда аадссаддаЕ 240 дЕддЕассЕЕ ЕСЕЕддааса асЕадЕссдд ссЕсдаадаа дЕдсЕссЕаа аддссддаад 300 дсдсддссЕс дссдадсСаС ЕдсадссеаЕ ЕаЕдаддЕЕс аЕссЕсддсс аддасаддаЕ 360 ддадсасаад саддЕдЕдда ЕдддасадЕд адЕддсЕддд аададассаа ааЕсаасадс 420 ЕссадсссЕс ЕдсдсЕасда ссдссадаЕЕ ддддааЕЕЕа садЕсаЕсад ддсЕдддсЕс 480 ЕасЕассЕдЕ аСЕдЕсаддЕ дсасЕЕЕдаЕ дадддааадд сСдЕсЕассЕ даадсЕддас 540 ЕЕдсЕддЕда асддЕдЕдсЕ ддссседсдс ЕдссЕддаад ааЕЕсЕсадс сасадсадеа 600 адсЕсЕссЕд ддссссадсЕ ссдЕЕЕдЕдс саддЕдЕсЕд ддсЕдЕЕдсссдсЕдсддсса 660 дддЕсЕЬссс ЕЕсддаЕссд сасссЕсссс ЕдддсЕсаЕс ЕЕааддсЕдс ссссЕЕссЕа 720 ассЕасЕЕЕд дасЕсЕЕЕса адЕЕсасЕда ддддссЕЕдс ЕсЕсссадаЕ ЕссЕЕааасЕ 780 ЬЕсссЕддсЕ ссаддадсаЕ сассааассЕ сссЕасссса сссссасЕса ЕссасссссЕ 840 сдсЕдсЕссс ЕддЕссадЕс сЕдЕсЕсЕсс Есаааддсад ссададсЕЕд ЕЕсасаЕдЕЕ 900 ЕссаЕЕссас адасдЕаЕсс ЕЕдсЕсЕЕсЕ ЕаасаЕссоа Есссассаса асЕаЕссасс 960 ЕсасЕадсЕс ссааадсссс ЕасЕЕаЕссс ЕдасЕссссс асссасЕсас ссдассасдЕ 1020 дЕЕЕаЕЕдас ЕЕЕдЕдсасс аддсасЕдад аЕдддсЕдда ссЕддЕддса ддаадссада 1080 даассЕддда сЕаддссада адЕЕсссаас ЕдЕдаддддд аададсЕддд дасаадсЕсс 1140 ЕсссЕддаЕс ссЕдЕддаЕЕ ЕЕдаааадаЕ асЕаЕЕЕЕЕа ЕЕаЕЕаЕЕдЕ дасааааЕдЕ 1200 ЕаааЕддаЕа ЕЕааададаа ЬаааЕсаЕда ЕЕЕеЕсЕЕе 1239

Claims (40)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение антагониста ΤνΕΑΚ для получения лекарственного средства для лечения патологического состояния, выбранного из группы, включающей нейродегенеративное заболевание, заболевание, связанное с поражением ткани или дегенерацией, кардиомиопатию, заболевание печени, заболевание почек и воспалительное заболевание легких.
2. 2. Применение по п.1, где антагонист ΤνΕΑΚ включает:

   (a) антитело против ΤνΕΑΚ;

   (b) антитело против рецептора ΤνΕΑΚ;

   (c) полипептидный фрагмент рецептора ΤνΕΑΚ.
3. 3. Применение по п.2, где антагонист ΤνΕΑΚ включает полипептидный фрагмент рецептора ΤνΕΑΚ, включающий фрагмент рецептора ΤνΕΑΚ Рп14, слитый с доменом Рс.
4. 4. Применение по п.2, где антагонист ΤνΕΑΚ включает антитело против ΤνΕΑΚ.
5. 5. Применение по п.2, где антагонист ΤνΕΑΚ включает антитело против рецептора ΤνΕΑΚ.
6. 6. Применение по п.4 или 5, где антитело представляет собой антитело человека или является гуманизированным.
7. 7. Применение по п.4 или 5, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
8. 8. Применение по п.4 или 5, где антитело представляет собой полноразмерное антитело.
9. 9. Применение по п.4 или 5, где антитело представляет собой фрагмент антитела или слитый белок, включающий антигенраспознающую последовательность антитела.
10. 10. Применение по п.1, где лекарственное средство вводят парентерально.
11. 11. Применение по п.1, где пациентом является человек.
12. 12. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой невоспалительное нейродегенеративное заболевание.
13. 13. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой заболевание, связанное с поражением ткани или дегенерацией, и антагонист ΤνΕΑΚ вызывает дифференциацию пересаженных клеток-предшественников.

    - 29 011607
14. 14. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой дилатационную кардиомиопатию или застойную сердечную недостаточность.
15. 15. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой фиброз печени или патологическое состояние, связанное с гиперплазией эпителиальных клеток печени, вакуолизацией гепатоцитов, повреждением печени, гибелью гепатоцитов или гиперплазией желчевыводящих протоков.
16. 16. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой воспалительное патологическое состояние почек.
17. 17. Применение по п.16, где воспалительное патологическое состояние почек представляет собой мультиочаговое воспаление.
18. 18. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой невоспалительное патологическое состояние почек.
19. 19. Применение по п.18, где невоспалительное патологическое состояние почек представляет собой тубулярную нефропатию, кисты, гломерулярную нефропатию, синдром Альпорта, тубулярную базофилию, тубулярную дилатацию, тубулярную вакуолизацию, образование гиалиновых цилиндров, тубулярную гиперплазию или почечный фиброз.
20. 20. Применение по п.1, где патологическое состояние представляет собой грануломатозное или лимфогистиоцитарное воспаление легких.
21. 21. Применение агониста ΤνΕΑΚ для получения лекарственного средства для обеспечения регенерации или обновления ткани у пациента.
22. 22. Применение по п.21, где агонист ΤνΕΑΚ включает белок, содержащий полноразмерный полипептид ΤνΕΑΚ, антитело против рецептора ΤνΕΑΚ, или представляет собой фрагмент полипептида ΤνΕΑΚ.
23. 23. Применение по п.21, где агонист ΤνΕΑΚ вызывает рост популяции клеток печени, легких, кожи, поджелудочной железы, нервной или сердечной ткани.
24. 24. Применение по п.21, где лекарственное средство предназначено для использования в лечении в виде комбинации с клетками-предшественниками или с трансплантацией ткани.
25. 25. Применение (ί) агониста ΤνΕΑΚ, который представляет собой фрагмент полипептида ΤνΕΑΚ, (ίί) антагониста ΤνΕΑΚ, который включает полипептидный фрагмент рецептора ΤνΕΑΚ, (ίίί) антитела против ΤνΕΑΚ или рецептора ΤνΕΑΚ для получения лекарственного средства для воздействия на популяцию клеток-предшественников ίη νί\Ό.
26. 26. Способ обеспечения дифференцировки клеток-предшественников, включающий обработку клеток-предшественников ίη νίΙΐΌ антагонистом ΤνΕΑΚ, который вызывает их дифференцировку.
27. 27. Способ по п.26, где антагонист ΤνΕΑΚ представляет собой:

    (a) антитело против ΤνΕΑΚ;

    (b) антитело против рецептора ΤνΕΑΚ или (c) белок, включающий полипептидный фрагмент рецептора ΤνΕΑΚ.
28. 28. Способ по п.27, где антагонист ΤνΕΑΚ включает растворимый полипептидный фрагмент рецептора ΤνΕΑΚ.
29. 29. Способ по п.27, где антагонист ΤνΕΑΚ представляет собой Еп14-Ес.
30. 30. Способ ингибирования дифференцировки клеток-предшественников или обеспечения клеточной пролиферации, включающий обработку клеток-предшественников ίη νίΙΐΌ агонистом ΤνΕΑΚ, который ингибирует дифференцировку клеток-предшественников адипоцитов или миоцитов или обеспечивает пролиферацию клеток почечных канальцев, эпителиальных клеток печени, овальных клеток или клеток желчных путей.
31. 31. Способ по п.30, где агонист ΤνΕΑΚ включает полноразмерный полипептид ΤνΕΑΚ, фрагмент полипептида ΤνΕΑΚ или антитело против рецептора ΤνΕΑΚ.
32. 32. Способ по любому из пп.26-29, где указанные клетки-предшественники выбраны из группы, включающей в себя:

    (a) стволовые клетки;

    (b) тотипотентные клетки;

    (c) плюрипотентные клетки;

    (ά) мультипотентные клетки;

    (е) бипотентные клетки;

    (ί) тканеспецифические клетки;

    (д) эмбриональные клетки и (11) клетки-предшественники, полученные из взрослого организма.
33. 33. Способ по любому из пп.26-29, где указанные клетки-предшественники представляют собой недифференцированные адипозные, миогенные, хрящевые, костные или клетки соединительной ткани.
34. 34. Способ по любому из пп.26-29, где клетки-предшественники представляют собой клеткипредшественники молочных протоков, клетки-предшественники скелетной мускулатуры, преадипоциты или мезинхимальные стволовые клетки.
35. 35. Способ по любому из пп.26-29, где клетки-предшественники представляют собой невральные

    - 30 011607 стволовые клетки.
36. 36. Способ по любому из пп.26-29, где клетки-предшественники представляют собой предшественники клеток печени, почечных канальцев, кардиомиоцитов, клеток легких, клеток кожи, клеток желудочно-кишечного тракта или клеток поджелудочной железы.
37. 37. Способ по п.36, где клетки-предшественники представляют собой предшественники клеток печени.
38. 38. Способ по п.36, где клетки-предшественники представляют собой овальные клетки.
39. 39. Применение по п.22, где полипептидный фрагмент Т^ЕЛК представляет собой растворимый полипептидный фрагмент Т^ЕАК.
40. 40. Способ по п.31, где полипептидный фрагмент Т^ЕАК представляет собой растворимый полипептидный фрагмент Т^ЕАК.

    Роль Т\Л/ЕАК в сердце: дилатация в сердце ТУУЕАК Тд