EA007926B1

EA007926B1 - Композиции для ингибирования протеинкиназы с-альфа для лечения сахарного диабета и сердечно-сосудистых заболеваний

Info

Publication number: EA007926B1
Application number: EA200500529A
Authority: EA
Inventors: Ян Менне; Херманн Халлер
Original assignee: Фенос Гмбх
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2003-09-23
Publication date: 2007-02-27
Also published as: DK1545560T3; CN1684694A; EA200500529A1; PL374829A1; MXPA05002930A; EP2338498A1; US20090191194A1; EP1545560A2; WO2004028516A3; WO2004028516A2; KR20050059180A; ES2356286T3; NO20051242L; DE50312935D1; DE10393825D2; DE10244453A1; IS7777A; AU2003280288A1; NZ538857A; ATE475422T1

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению агентов, которые предотвращают экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α), в особенности для лечения больных диабетом и осложнений, таких как диабетическая нефропатия, ретинопатия или невропатия. (Иммуногистохимическое исследование срезов показывает, что гепарансульфат-протеогликан у контрольных животных с диабетом (В) более не обнаруживается или едва обнаруживается, однако, у мышей РКС-αс диабетом (D) образуется в нормальной концентрации).

Description

Настоящее изобретение относится к применению агентов, которые уменьшают или ингибируют экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α), для лечения и/или профилактики коронарной болезни сердца, инфаркта сердца, периферического облитерирующего заболевания, инсульта, ассоциированных с протеинурией болезней почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечнососудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией.

Сахарный диабет представляет собой одно из самых частых заболеваний в западном мире, которое затрагивает примерно 5% населения. Сахарный диабет подразделяют на диабет типа I, который возникает, как правило, уже в молодости, и диабет типа II, называемый также старческим сахарным диабетом. Вследствие нарушения метаболизма глюкозы в случае обеих форм диабета имеет место устойчиво повышенный уровень глюкозы в крови, что у соответствующих больных спустя несколько лет приводит к различным осложнениям. Самыми частыми и одновременно чаще всего опасными осложнениями являются диабетическая ретинопатия, которая приводит к потере зрения, диабетическая невропатия, которая может простираться до ампутации стоп или нижних конечностей, и диабетическая нефропатия.

Диабетическая нефропатия развивается у примерно 40% всех больных диабетом и во всем мире является самой частой причиной хронической почечной недостаточности и лечения диализом. Примерно от 30 до 40% всех подвергаемых диализу больных имеют диабетическую нефропатию. Так как повреждение почек за счет диабета развивается медленно, большое клиническое значение имеет уже ранняя идентификация больных с повышенным риском развития почечной недостаточности, для того, чтобы предпринимать пригодные терапевтические меры. Одним из первых клинических признаков начинающегося повреждения почек является появление так называемой микроальбуминурии. При этом происходит выделение 30-300 мг альбумина в собранной за 24 ч моче. В нормальном случае выделяются менее чем 30 мг альбумина в сутки. Микроальбуминурия возникает в современных терапевтических условиях примерно у 25% диабетиков с диабетом типа I или типа II (АНаэб, Э|аЬе1ез Саге, 19, 79089 (1996); К1еш и др., Э1аЬе1ез Саге, 22, 743-751 (1999); Уа1табпб и др., Агсй. Шет. Меб., 160, 1093-1100 (2000)). Риск развивающейся почечной недостаточности у больных с микроальбуминурией примерно в 10 раз выше, чем у пациентов с нормальным выделением альбумина. Диабетическая нефропатия, которая характеризуется протеинурией более, чем 300 мг/сутки и/или ограниченной функцией почек, развивается у примерно 510% всех больных диабетом и микроальбуминурией в год. Также значительно повышен риск развивающейся диабетической ретинопатии у диабетиков с микроальбуминурией по сравнению с диабетиками без микроальбуминурии (У|дз1гир и Модепзеп, Ае1а ОрЫа1то1. (Сорепй.), 63, 530-534 (1985)).

Как показали продолжительные исследования, интенсивно проводимые более 10 лет, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний у дибетиков с диабетом типа I и типа II уже на стадии микроальбуминурии повышена примерно в два раза по сравнению с диабетиками без микроальбуминурии, также с учетом обычных факторов риска, как холестерин и гипертония (Коззшд и др., Вт), 313, 779-784 (1996); Оет81еш и др., Э1аЬе1ез Саге, 23, 8ирр1. 2, В35-39 (2000); УаШабпб и др., (2000)). Повышенная смертность от сердечно-сосудистых заболеваний выявлена также в случае больных с микроальбуминурией без сахарного диабета (Оетз1ет и др., 1ата, 286, 421-426 (2001)).

Существуют различные гипотезы, почему микроальбуминурия представляет собой чрезвычайно важный маркер возникновения осложнений у больных диабетом. Согласно так называемой стеногипотезе (Эескеп, Ре1б1-Казтиззеп и др., П1аЬе1о1од1а, 32, 219-226 (1989)), потеря отрицательно заряженных, следовательно, анионных, молекул во внеклеточной матрице ответственна за возникновение альбуминурии, диабетической ретинопатии и сердечно-сосудистых осложнений, как, например, коронарная болезнь сердца. Эта гипотеза обосновывается данными, полученными как в случае человека, так и на животных модельных системах, и в последние годы подтверждена результатами других рабочих групп.

В почках моча отжимается в почечных тельцах, так называемых клубочках. Для предотвращения прохождения протеинов, например альбумина, кровь от мочи отделена мембраной, называемой базальной мембраной. Базальная мембрана имеет маленькие поры, которые позволяют проникать более мелким молекулам через базальную мембрану, в то время как протеиновые молекулы на основании их размера не могут проходить через мембрану. У больных микроальбуминурией все-таки происходит проникновение протеинов маленького размера, как альбумин, пока размер пор не увеличивается. В качестве объяснения этого явления можно указать на то, что в порах или на краю пор, имеются молекулы с отрицательным зарядом, которые отталкивают также отрицательно заряженные протеины (Куетпе1апб, Ре1б1Казтиззеп и др., П1аЬе1о1од1а, 29, 634-639 (1986); Эескеп, Ре1б1-Казтиззеп и др., К|бпеу Ш., 33, 100-106 (1988); Куегпе1апб, ХУеШбег и др., П1аЬе1о1од1а, 31, 708-710 (1988)). В случае этих молекул с отрицательными зарядами речь идет о протеогликанах. Протеогликаны представляют собой комплексные макромолекулы, которые состоят из протеинов, с которыми ковалентно связаны полисахаридные цепи. Полисахаридные цепи преимущественно состоят из гепарансульфата и сильно отрицательно заряжены. Чаще всего встречающимся в организме протеогликаном является перлекан. Перлекан представляет собой протеин массой 460 кДа и имеет несколько полисахаридных боковых цепей (Мигбосй и кххо, Уйс1ю\\'з Агсй. А. Ра)1ю1. Апа1. Н1з1ора1йо1., 423, 237-242 (1993); !оххо, Сойеп и др., Вюсйет. 1., 302, 625-639 (1994);

- 1 007926

МигПоск, Ьш и др., 1. Н1к1оскет. Су1оскет., 42, 239-249 (1994)). У больных диабетом и микроальбуминурией гепарансульфат практически отсутствует в гломерулярной базальной мембране. Также у больных с прогрессирующей диабетической нефропатией гепарансульфат более невозможно обнаружить в базальной мембране, хотя протеиновые цепи еще имеются. Этот эффект объясняется уменьшенным синтезом гапарансульфата в гипергликемических условиях, которые имеются у диабетиков (Раг!какага1ку и 8рйо, П1аЬе1ек, 31, 738-741 (1982); Ре1П1-Вактиккеп и др., (1988); Ыакатига и Муегк, П1аЬе1ек, 37, 1202-1211 (1988); №гкск и 8ск1е1скег, Ат. 1. Ра1ко1., 139, 889-899 (1991); 1кеПа и др., Ыеркгоп, 61, 415-421 (1992); 8сапП1шд и Муегк, К1Ппеу Ιηΐ., 41, 840-846 (1992); Уегшег, 81е££ек и др., К1Ппеу Ιηΐ., 41, 1070-1080 (1992); Таткта, уап Пеп Вогп и др., П1аЬе1о1од1а, 37, 313-320 (1994); 1оххо и 8ап Ап1ошот, 1. С1ш. 1пуек1., 108, 349-355 (2001)). Далее, показано, что гепарансульфат-протеогликаны не только предотвращают гломерулярную фильтрацию альбумина за счет отрицательного заряда, но и, вероятно, также совместно ответственны за целостность размера пор внутри базальной мембраны (Пескей, Ко£оеП-Епеуо1Пкеп и др., Э|аЬе1о1оща, 36, 244-251 (1993)). Таким образом, потеря гепарансульфат-протеогликанов с прогрессированием почечной недостаточности приводит к разрушению микроструктуры базальной мембраны. Эти изменения могли бы объяснить, почему протекание диабетической нефропатии приводит к большой, неселективной протеинурии с потерей более крупных протеинов, как иммуноглобулин. Гепарансульфатпротеогликаны также являются сильными ингибиторами мезангиальной экспансии в почечных тельцах. Это представляет большой интерес, так как у больных диабетом обычно происходит утолщение мезангиальной соединительной ткани. Поэтому не является неожиданным, что потерю гепарансульфатпротеогликанов у больных диабетом считают важной причиной мезангиальной экспансии.

Потеря гепарансульфата у диабетиков происходит, однако, не только в почках, но и почти во всех других органах. Так, отчетливое уменьшение количества гепарансульфата происходит в соединительной ткани сетчатки, скелетной мышцы, стенок артерий и кожи, а также в эритроцитах. Эндотелиальные клетки также проявляют уменьшенный синтез гепарансульфата (Уокоуата, Ноуег и др., П1аЬе1ек, 46, 18751880 (1997); уап Пег Ру1, Эака и др., П1аЬе1о1оща, 41, 791-798 (1998)). Так как гепарансульфатпротеогликаны обладают важными антитромботическими свойствами, потеря гепарансульфатпротеогликанов может способствовать образованию микротромбов, например, в сосудах сетчатки, и, таким образом, благоприятствовать возникновению диабетической ретинопатии (Магсит, Ргкхе и др., Ат. 1. Ркукю1., 245, Н275-33 (1983); Магсит, Мс Кеппеу и др., 1. С1ш. 1пуек1., 74, 341-350 (1984); Магсит и ВокепЬегд, Вюскеткйу, 23, 1730-1737 (1984); Магсит, А1ка и др., 1. Вю1. Скет., 261, 7507-7517 (1986)). Другие важные антиатеросклеротические функции гепарансульфат-протеогликанов (Н8НС) состоят в том, что Н8РС ингибируют пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов, за счет чего происходит возникновение повреждений артериальных сосудов. Н8РС, далее, ингибируют образование моноцитов (воспалительные клетки) в субэндотелиальной соединительной ткани. Н8РС также ингибируют субэндотелиальное связывание и отложение липопротеина-а и окисленных ΕΌΕ, которые играют решающую роль в возникновении артериосклероза. Н8РС также являются важными регуляторами при ангиогенезе, то есть, при образовании новых сосудов в поврежденных областях организма (ВокепЬегд, 8к\гогак и др., 1. С1ш. 1пуек1., 100, 67-75 (1997); РШапкеШ, Тгепк СагПюуакс. МеП., 10, 60-65 (2000); 1оххо 8ап Ап1ошо, (2001)). Потеря гепарансульфат-протеогликана поэтому имеет значение не только в случае возникновения диабетической нефропатии и диабетической ретинопатии, но и при возникновении сердечно-сосудистых осложнений.

Одним важным аспектом является то, что у больных с гипертонией возникает микроальбуминурия. До сих пор это явление объясняли повышенным давлением в почечных тельцах, причем предполагали, что альбумин отжимается в повышенной мере. Однако, если это соответствует действительности, то нужно исходить из того, что больные с постоянным высоким артериальным кровяным давлением также обладают высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, независимо от того, есть ли у них микроальбуминурия. Это, однако, не соответствует действительности, как было показано при различных перспективных исследованиях. Больные с микроальбуминурией, страдающие гипертензией, имеют примерно в 2 раза более высокую смертность от сердечно-сосудистых заболеваний, чем страдающие гипертензией больные с иным сравнимым профилем риска, как, например, гиперхолестеринемия, анамнез за счет курения и диабет (81ещк1, 1. Вешп Апдю1епкш А1Пок1егопе 8ук1., 1, 18-20 (2000); Спрра, 1. Нит. Нурейепк., 16 (дополнение 1), 74-77 (2002); П1егскк, уап Воуеп и др., Сап. 1. СагПю1., 18, 525-535 (2002)). Соответственно этому, микроальбуминурия является независимым фактором риска возникновения и прогноза сердечно-сосудистых заболеваний. Это может объясняться только тем, что у больных с микроальбуминурией происходит изменение во всей сосудистой системе. До сих пор, однако, не ясно, какое нарушение у больных с гипертонией является причиной микроальбуминурии.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении средств, которые можно использовать для лечения микроальбуминурии, в особенности у больных сахарным диабетом и больных с гипертонией, для лечения ассоциированных с диабетом поздних повреждений, в особенности диабетической ретинопатии, диабетической нефропатии и диабетической невропатии, и сердечно-сосудистых осложнений, а также ассоциированных с гипертонией сердечнососудистых осложнений, и/или их предотвращения.

- 2 007926

Поставленная техническая задача решается согласно изобретению применением агентов для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечно-сосудистых заболеваний, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с ретинопатией и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией, которые уменьшают или предотвращают экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС- α).

В уровне техники до сих пор предполагалось, что в2-изоформа протеинкиназы С ответственна за возникновение диабетических осложнений. в2-Изоформа, во-первых, в повышенной мере продуцируется в ткани больных диабетом животных (1иодисЫ и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8Л, 89, 11059-11063 (1992)) и, во вторых, специфичный к протеинкиназе С-β ингибитор Й-У333531 в случае грызунов с диабетом типа I и диабетом типа II приводит к меньшей протеинурии, как показателю уменьшенного повреждения почек фЬл и др., 1. Мо1. Меб., 76, 21-31 (1998); Коуа и др., РакеЬ 1., 14, 439-447 (2000)).

Созданные согласно изобретению, лишенные протеинкиназы С-α мыши, которые не могут вырабатывать протеинкиназы С-α, после провоцирования диабета с помощью стрептозотоцина неожиданно не имеют альбуминурии. Напротив, контрольные животные, которые вплоть до изменения экспрессии протеинкиназы С-α генетически были в значительной степени идентичны, проявляют отчетливую альбуминурию. Дальнейшее исследование лишенных протеинкиназы С-α животных совершенно неожиданно показало, что животные в условиях диабета способны были вырабатывать гепарансульфат в нормальной концентрации. Напротив, контрольные животные в условиях диабета едва еще могли продуцировать гепарансульфат.

Осуществляемые согласно изобретению гистологические исследования показали дальнейшие значительные изменения у лишенных протеинкиназы С-α мышей. При использовании иммуногистохимических способов согласно изобретению обнаружено, что отсутствие протеинкиназы С-α влечет за собой дальнейшие веские различия в экспрессии васкулярного эндотелиального фактора роста (УБОР) и относящегося к нему рецептора (УБОР-К II). В то время как в случае контрольных животных с диабетом можно обнаруживать значительное увеличение экспрессированных количеств УБОР и рецептора УЕОРК II, у лишенных протеинкиназы С-α животных установлено отчетливо меньшее увеличение экспрессированных количеств УЕОР и рецептора УЕОР-К II. Этот результат имеет огромное значение, поскольку повышенная экспрессия УЕОР рассматривается в качестве одного из важнейших медиаторов в отношении возникновения диабетической ретинопатии (А1е11о и \Уопд. К1биеу ЙИ. 8ирр1., 77, 113-119 (2000); Вещами, Ат. 1. РаШо1., 158, 1181-1184 (2001)).

Из результатов согласно изобретению следует, что протеинкиназа С-α играет центральную роль в регуляции образования гепарансульфат-протеогликана и при проявлении протеинурии. Полученные согласно изобретению результаты также показывают, что протеинкиназа С-α в случае проявления протеинурии играет значительно более важную роль, чем протеинкиназа С-β, однако, протеинкиназа С-β, повидимому, способна брать на себя по меньшей мере часть функций протеинкиназы С-α. Полученные согласно изобретению результаты показывают, что ингибирование α-изоформы протеинкиназы С приводит как к целенаправленной защите от развития диабетических поздних осложнений таких как диабетическая нефропатия, диабетическая ретинопатия и/или сердечно-сосудистые осложнения, так и к целенаправленной защите от развития заболеваний, которые ассоциируются с протеинурией.

Согласно изобретению предусматривается применение агентов, уменьшающих или ингибирующих экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α), для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечно-сосудистых заболеваний, ассоциированных с протеинурией болезней почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией.

Согласно настоящему изобретению под термином болезни или заболевания понимают нарушения жизненных процессов в органах или во всем организме последствием субъективно ощущаемых или объективно определяемых физических, психических или умственных изменений. Под термином осложнения или поздние повреждения понимают заболевания, вызванные определенной причиной или вторичные заболевания, то есть, присоединяющееся к первичной картине болезни второе заболевание.

Согласно изобретению в случае заболеваний, на которые направлено лечение, речь идет в особенности о заболеваниях сосудов, сердечно-сосудистых заболеваниях, ассоциированных с протеинурией болезнях почек, ассоциированных или не ассоциированных с сахарным диабетом повреждениях и/или сердечно-сосудистых осложнениях, ассоциированных или не ассоциированных с гипертонией сердечнососудистых осложнениях и/или ассоциированных или не ассоциированных с гиперхолестеринемией сердечно-сосудистых осложнениях.

Согласно настоящему изобретению под термином заболевания сосудов или ангиопатии понимают в особенности заболевания артерий, которые приводят к функциональным или органическим нарушениям кровотока. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения заболевание сосудов представляет собой периферическое артериальное облитерирующее заболевание. Под термином

- 3 007926 артериальное облитерирующее заболевание понимают заболевание, которое провоцируется стенозирующими или облитерирующими изменениями в артериях и приводит к нарушениям кровотока с ишемией в тканях или органах зависимых от снабжения кровью. В случае сахарного диабета в особенности речь идет о хронических облитерирующих заболеваниях, которые провоцируются, в частности, облитерирующим артериосклерозом, также ангиопатиями и ангионевропатиями.

Под термином сердечно-сосудистые заболевания понимают заболевания и нарушения, которые затрагивают функцию сердца и кровообращение, как, например, состояние наполнения и тонуса сосудистой системы, мощность выброса сердца, нервные и гуморальные механизмы связывания между сердцем и циркуляцией и т.д. Согласно предпочтительному варианту изобретения, в случае сердечно-сосудистых заболеваний речь идет о коронарной болезни сердца, инфаркте сердца и инсульте.

Под термином коронарная болезнь сердца понимают клиническое проявление первичной коронарной недостаточности, причем за счет сужения или закупорки венечных сосудов сердца происходит уменьшение кровотока и тем самым уменьшение подвода поставляющих энергию субстратов и кислорода к сердечной мышце.

Под термином инфаркт сердца понимают некроз описанного участка сердечной мышцы, который непосредственно возникает чаще всего в виде осложнения при хронической коронарной болезни сердца. Причиной инфаркта сердца являются длительное критическое недостаточное кровоснабжение при коронарной недостаточности и продолжающиеся длительное время спазмы коронарных сосудов, в особенности в области предшествующего эксцентрического стеноза коронарных сосудов сердца. Инфаркт сердца часто возникает при физической или психической нагрузке вследствие повышения потребности в кислороде сердечной мышцы или при непосредственном прерывании кровоснабжения.

Под термином инсульт или апоплексия понимают ишемический инфаркт головного мозга вследствие артериального нарушения кровотока головного мозга. Инсульт провоцируется эмболиями, которые исходят от артериосклеротических изменений внечерепных сосудов или от сердца, реже вследствие стеноза или церебральных микроангиопатий.

Согласно настоящему изобретению под выражением ассоциированные с протеинурией заболевания почек понимают в особенности паренхиматозные заболевания почек, которые характеризуются наличием протеинов в моче. В случае протеинурии речь может идти о гломерулярной протеинурии, тубулярной протеинурии или гломерулярно-тубулярной смешанной протеинурии. Исключительно ренальное выделение альбумина и трансферрина характеризует селективную протеинурию, которая возникает, например, при нефропатии с минимальными изменениями. В случае неселективной протеинурии в моче также обнаруживают иммуноглобулин С (1дС). Эту форму протеинурии можно обнаружить, например, при амилоидозе почек, однако, также в прогрессирующей стадии диабетической нефропатии. Причиной тубулярной протеинурии являются туболоинтерстициальные заболевания, которые затрагивают реабсорбционные процессы, следствием чего является экскрекция низкомолекулярных протеинов. Клинически тубулярная протеинемия является значительной, в особенности, если она ассоциирована с другими дефектами проксимального канальца. Тубулярные протеинурии встречаются, в частности, при таких заболеваниях, как наследственная тубулопатия, ренально-тубулярный ацидоз, бактериально или медикаментозно индуцированный интерстициальный нефрит, острая почечная недостаточность, отравления тяжелыми металлами, нефропатия Вепсе-бопек и в послеоперационной фазе после трансплантации почек. Причиной гломерулярно-тубулярной смешанной протеинурии часто являются первичные гломерулярные заболевания с выраженными вторичными интерстициальными изменениями.

Согласно предпочтительному варианту изобретения в случае ассоциированных с протеинурией заболеваний почек речь идет в особенности о нефропатии с минимальными изменениями, прочих гломерулопатиях, амилоидозе почек, наследственной тубулопатии, ренально-тубулярном ацидозе, медикаментозно или бактериально индуцированной интерстициальной нефропатии, острой почечной недостаточности, нефропатии Вепсе-бопек и послеоперационной фазе трансплантации почек.

Согласно настоящему изобретению под термином сахарный диабет понимают различные формы нарушения метаболизма глюкозы с различной этиологией и симптоматикой. Общим характерным признаком является относительный или абсолютный дефицит инсулина. Заболевания сахарным диабетом отличаются долговременным повышением уровня глюкозы в крови (гипергликемия) или неадекватным по времени расходом вводимой глюкозы. Сахарный диабет подразделяют на тип I (ΙΌΌΜ) и тип II (ΝΙΌΌΜ).

Специфичными для диабета и ассоциированными с диабетом хроническими осложнениями являются микроангиопатия, как ретинопатия, нефропатия и невропатия, полиневропатия, диабетическая стопа, нарушение скелетной, опорной и соединительной ткани, а также магроангиопатия, в особенности коронарная болезнь сердца, церебральное нарушение кровотока и периферическое артериальное облитерирующее заболевание.

Под термином диабетическая ретинопатия понимают возникающую при сахарном диабете микроангиопатию глазного дна. Формами диабетической ретинопатии являются непролиферативная ретинопатия (ретинопатия глазного дна) такая как кровоизлияния в сетчатку, микроаневризмы, неровные экссудаты, отек сетчатки с потерей остроты зрения, а также пролиферативная ретинопатия, причем происходит дополнительное возникновение ватообразных очагов и неоваскуляризации сосудов в сетчатке и перед

- 4 007926 сетчаткой с кровоизлияниями в стекловидное тело за счет закупорки сосудов вследствие ишемии сетчатки. Пролиферативная ретинопатия может приводить к тракционной отслойке сетчатки, неоваскулярной глаукоме и потере зрения.

Согласно настоящему изобретению под термином диабетическая нефропатия, которую называют также как диабетический гломерулосклероз, понимают повреждение гломерулярных почечных капилляров. Диабетическая нефропатия клинически выражается в протеинурии, гипертонии, отеках, диффузном расширении базальной мембраны, увеличении мезангия и более поздних узелкообразных уплотнениях в клубочковых петлях с сужением просвета сосуда, а также в фибриноидных отложениях на стенке капилляра и микроаневризмах.

Согласно настоящему изобретению под термином диабетическая невропатия понимают заболевание периферических нервов. При этом в особенности речь идет о симметричной дистальной чувствительно-двигательной полиневропатии и автономной невропатии. Периферическая полиневропатия обычно проявляется в нижних конечностях, начинаясь со стоп, и продвигается проксимально дальше и нередко также затрагивает верхние конечности. Симптоматология значительно изменяется, причем недуги, такие как боли, ощущение глухоты и парестезия, часто приводят к экзацербации.

Под сердечно-сосудистыми осложнениями при диабете понимают, согласно изобретению, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания сосудов, в особенности периферическое облитерирующее заболевание, коронарную болезнь сердца, инфаркт сердца и инсульт, которые возникают вследствие сахарного диабета.

Согласно настоящему изобретению под термином гипертония понимают высокое кровяное давление или гипертоническую болезнь, которое/которая характеризуется долговременным повышением кровяного давления до значений систолического давления более, чем 140 мм рт.ст., и диастолического давления более, чем 90 мм рт.ст. Под выражением асоциированные с гипертонией сердечно-сосудистые осложнения понимают, согласно изобретению, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания сосудов, в особенности периферическое облитерирующее заболевание, коронарную болезнь сердца, инфаркт сердца и инсульт, которые возникают вследствие гипертонии.

Согласно настоящему изобретению под термином гиперхолестеринемия понимают повышенную концентрацию холестерина в крови, причем вследствие диабета может возникать первичная или вторичная гиперхолестеринемия.

Гиперхолестеринемия представляет собой фактор риска в отношении артериосклероза. Под выражением ассоциированные с гиперхолестеринемией сердечно-сосудистые осложнения понимают, согласно изобретению, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания сосудов, в особенности периферическое облитерирующее заболевание, коронарную болезнь сердца, инфаркт сердца и инсульт, которые возникают вследствие гиперхолестеринемии.

Согласно настоящему изобретению под термином протеинкиназа С или РКС понимают семейство протеинов, которое играет существенную роль в трансдукции, причем протеины РКС выполняют внутриклеточные регуляторные функции путем фосфорилирования субстратов, как ферменты, факторы транскрипции и/или цитоскелетные протеины. Активация протеинов РКС приводит, например, к активации других протеинкиназ, включая митогенактивируемую протеинкиназу (МАРК), которые, таким образом, являются субстратом протеинов РКС. Протеины протеинкиназы С представляют собой основные рецепторы сложных эфиров форбола. Семейство протеинов протеинкиназы С в клетках млекопитающих включает по меньшей мере двенадцать изоформ, которые подразделяют на три различные подсемейства. Так называемые обычные (традиционные) изоформы протеинкиназы С (сРКС) включают изоформы РКС-α, РКС-βΙ и сплайсинговый вариант βΙΙ, а также РКС-γ. Так называемые новые изоформы протеинкиназы (пРКС) включают изоформы РКС-дельта, РКС-эпсилон, РКС-эта и РКС-тета. Так называемые атипичные изоформы протеинкиназы С (аРКС) включают изоформы РКС-дзета и РКС-лямбда (также известна как РКС-йота). Следующими изоформами являются РКС-мю (также обозначают как протеинкиназа Ό), а также родственные РКС киназы (РКК), которые представляют собой возможно собственные подсемейства (Токег, Бтопйетк ίη Вюкшепсек, 3, 61134-1147 (1998)). Изоформы РКС различаются как своими аминокислотными последовательностями, так и кодирующими аминокислотные последовательности нуклеотидными последовательностями (Соиккепк и др., 8с1епсек, 233, 859-866 (1986)). Протеины РКС все в целом обладают доменовой структурой. Также различаются их клеточные типы экспрессии, механизмы их активации и их специфичность к субстрату.

Большинство изоформ протеинкиназы С перед активацией не связано с мембраной и посредством диффузии распределено в цитоплазме. Активизация каждой изоформы за счет обработки клеток производным форбола 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатом приводит к изоферментспецифическим изменениям клеточной морфологии, а также к быстрому селективному перераспределению различных изоферментов РКС в различных субклеточных структурах. α-Изоформа протеинкиназы С концентрируется в особенности в эндоплазматическом ретикулуме и на краю клетки, в то время как βΙΙ-изоформа РКС концентрируется в обогащенных актином микрофиламентах цитоскелета. Специфичность к субстрату изоформ РКС по меньшей мере частично опосредуется субклеточным распределением активированных

- 5 007926 изоферментов протеинкиназы С.

Под термином протеинкиназа С-α понимают протеин, который активируется ионами кальция и диацилглицерином, причем активированная протеинкиназа С-α концентрируется в особенности в эндоплазматическом ретикулуме и у края клетки. Аминокислотная последовательность РКС-α и кодирующая РКС-α нуклеотидная последовательность описаны Соиззепз и др., 8с1спес8. 233, 859-866 (1986). Протеин РКС-α обладает подобной доменовой структурой, как остальные протеины сРКС. Протеин включает псевдосубстратный домен, обогащенный цистеином участок, кальцийсвязывающий домен и каталитический домен. РКС-α может активироваться диацилглицерином, сложным эфиром форбола, фосфатидилсерином и кальцием.

Согласно настоящему изобретению под выражением агенты, уменьшающие или ингибирующие экспрессию протеинкиназы С-α следует понимать такие средства, которые, как в условиях ίη νίΐτο, так и в условиях ίη νίνο, полностью предотвращают или по меньшей мере уменьшают синтез функциональноспособного протеина РКС-α, причем ингибируются или уменьшаются транскрипция кодирующей РКС-α последовательности ДНК в комплементарной последовательности мРНК, процессинг мРНК, трансляция мРНК в полипептидной цепи, процессинг полипептида и/или посттрансляционные модификации полипептида. Применение агентов, которые уменьшают или ингибируют экспрессию протеинкиназы С-α, следовательно, может приводить к тому, что либо вообще не продуцируется функциональноспособный, например, активируемый, протеин РКС-α, либо, уменьшается количество продуцируемого функциональноспособного, например, активируемого, протеина РКС-α. Применение агентов, которые уменьшают или ингибируют экспрессию протеинкиназы С-α, однако, может приводить к тому, что продуцируется функциональнонеспособный, например, не активируемый, протеин РКС-α или только частично функциональноспособный протеин РКС-α.

Согласно настоящему изобретению под выражением агенты, уменьшающие или ингибирующие активность протеинкиназы С-α понимают такие средства, которые, как в условиях ίη νίΐτο, так и в условиях ίη νίνο, могут полностью или частично элиминировать биологическую активность функциональноспособного протеина РКС-α. Полную или частичную инактивацию протеина РКС-α можно осуществлять, например, тем, что используемый агент вводят непосредственно во взаимодействие с протеином РКС-α. Прямое взаимодействие между агентом и протеином РКС-α может осуществляться, например, за счет ковалентного или нековалентного связывания. За счет взаимодействия между агентом и протеином РКС-α могут происходить также, например, химические изменения протеинкиназы, которые приводят к потере биологической активности протеинкиназы. Взаимодействие может также приводить, например, к специфической деструкции РКС-α. Агенты, которые уменьшают или ингибируют активность протеинкиназы С-α, могут представлять собой также агенты, которые модифицируют или элиминируют или связывают специфические субстраты, структуры-мишени, или молекулы-мишени РКС-α так, что уменьшают или полностью парализуют биологическую активность протеина РКС-α. Агенты, которые уменьшают или ингибируют активность протеинкиназы С-α, могут представлять собой также агенты, которые предотвращают транслокацию РКС-α после активации, например, за счет обработки форболом, в эндоплазматический ретикулум или к краю клетки, так что РКС-α не может вступать во взаимодействие со специфичными к ней субстратами, структурами-мишенями или молекулами-мишенями.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения в случае используемых согласно изобретению агентов речь идет об агентах, которые специфически уменьшают или ингибируют экспрессию и/или активность РКС-α, но, однако, не экспрессию и/или активность других изоформ РКС, например РКС-β.

Согласно изобретению агенты, которые специфически уменьшают или ингибируют экспрессию и/или активность РКС-α, выбирают из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-α; содержащих нуклеиновую кислоту векторов, содержащих векторы клеток-хозяев, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-α веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-α веществ, антагонистов активности протеинкиназы С-α и ингибиторов активности протеинкиназы С-α.

Согласно изобретению используемую нуклеиновую кислоту предпочтительно выбирают из группы, состоящей из

a) нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческую протеинкиназу С-α, или ее фрагмента;

b) нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте по п.а), или ее фрагмента;

c) нуклеиновой кислоты, которая получена путем замещения, присоединения, инверсии и/или делеции одного или нескольких оснований нуклеиновой кислоты по п.а) или п.Ь), или ее фрагмента; и

ά) нуклеиновой кислоты, обладающей гомологией более чем 80%, к нуклеиновой кислоте по пп.а)с), или ее фрагмента.

Согласно настоящему изобретению под понятием нуклеиновая кислота, кодирующая протеинкиназу С-α или ее фрагмент понимают нуклеиновую кислоту, кодирующую протеин РКС-α или его фраг

- 6 007926 мент, который включает функциональные домены, в особенности псевдосубстратный домен, обогащенный цистеином участок, кальцийсвязывающий домен и каталитический домен нативной протеинкиназы С-α. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемая согласно изобретению нуклеиновая кислота кодирует человеческую РКС-α, соответственно, ее части.

Термин гомология означает согласно изобретению идентичность последовательностей по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85% и особенно предпочтительно по меньшей мере более чем на 90, 95, 97 и 99%. Известное специалисту выражение гомология означает, таким образом, степень родства между двумя или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, которая определяется совпадением между последовательностями.

В случае используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты речь может идти о последовательности ДНК или РНК, в особенности в линейной форме. Нуклеиновая кислота может представлять собой нуклеиновую кислоту, выделенную из естественных источников, например, из эукариотических тканей, предпочтительно из тканей млекопитающих, более предпочтительно из человеческих тканей, или может быть получена синтетическим путем.

Согласно изобретению в особенности предусматривается, что используемая в качестве агента нуклеиновая кислота, если она встроена в вектор, в особенности в вектор экспрессии, в клетке-хозяине в антисмысловой ориентации к промотору, может подавлять экспрессию гена человеческой протеинкиназы С-α. При инсерции в вектор используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты в антисмысловой ориентации, то есть, при наличии антисмысловой конструкции используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты, нуклеиновая кислота транскрибируется в качестве антисмысловой нуклеиновой кислоты. В случае транскрипции нативного гена РКС-α клетки полученный антисмысловой транскрипт используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты за счет копуляций азотистых оснований согласно Уотсону-Крику связывают с находящимся в смысловой ориентации транскриптом мРНК нативного гена протеинкиназы С-α с образованием дуплексной структуры. Таким образом селективно препятствуют трансляции мРНК нативного гена РКС-α в полипептиде и специфически ингибируют экспрессию нативной РКС-α, не ингибируя экспрессию других клеточных изоформ РКС.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что используемая для получения антисмысловых конструкций нуклеиновая кислота включает не всю кодирующую РКС-α последовательность, а только ее фрагменты. Эти фрагменты включают по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов, причем перенапряженные фрагментами нуклеотидные участки кодирующей РКС-α последовательности выбирают таким образом, что при экспрессии фрагментов в антисмысловой ориентации в клетке происходит специфическое ингибирование экспрессии РКС-α, в особенности человеческой РКС-α, но не ингибирование других изоформ РКС, например β-изоформ РКС.

Согласно изобретению предусматривается, что вышеуказанную нуклеиновую кислоту или ее пригодный фрагмент встраивают в вектор под контролем по меньшей мере одного элемента регуляции экспрессии, причем нуклеиновую кислоту или ее фрагмент встраивают в антисмысловой ориентации к элементам регуляции экспрессии. После введения вектора в клетку, например, клетку млекопитающего, в особенности в человеческую клетку, нуклеиновая кислота или ее фрагмент может экспрессироваться в антисмысловой ориентации и благодаря этому можно эффективно ингибировать экспрессию нативной РКС-α клетки. В случае вектора речь идет предпочтительно о плазмиде, космиде, бактериофаге или вирусе.

Настоящее изобретение поэтому относится также к вектору, который включает кодирующую РКСα нуклеотидную последовательность или фрагмент под функциональным контролем по меньшей мере одного элемента регуляции экспрессии, причем нуклеиновая кислота или ее фрагмент встраивается в антисмысловой ориентации к элементу регуляции. В случае элемента регуляции экспрессии речь идет в особенности о промоторе, месте связывания рибосом, сигнальной последовательности или 3'терминаторе транскрипции.

Следующий вариант осуществления изобретения относится к клетке-хозяину, которая содержит вышеописанный вектор. В случае клетки-хозяина речь идет в особенности о клетке млекопитающего, предпочтительно человеческой клетке. Согласно особенно предпочтительному варианту в случае человеческой клетки речь идет о зрелой стволовой клетке.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения для ингибирования экспрессии РКС-α используют синтетически получаемые антисмысловые олигонуклеотиды, которые включают по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов. Такие антисмысловые олигонуклеотиды можно непосредственно использовать для ингибирования экспрессии РКС-α, то есть, не нужно встраивать в вектор и экспрессировать в условиях клетки. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления, в случае этих специфичных к РКС-α антисмысловых олигонуклеотидов речь идет о продукте 1818 3521 фирмы Ιδΐδ РйатшасеиДсаН, который является сильным селективным ингибитором экспрессии протеинкиназы-α. Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения в случае ис

- 7 007926 пользуемых согласно изобретению специфичных к РКС-α антисмысловых олигонуклеотидов речь идет об антисмысловых олигодезоксинуклеотидах, описанных ВикиЛ и др., 1. 8итд. РаЛо1., 63, 137-142 (1996).

Согласно изобретению как вышеуказанные нуклеиновые кислоты, содержащие эти нуклеиновые кислоты векторы, также содержащие векторы клетки-хозяева можно использовать в качестве агентов для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечно-сосудистых заболеваний, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, ассоциированных с сахарным диабетом поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений, ассоциированных с гипертонией сердечно-сосудистых осложнений и/или ассоциированных с гиперхолестеринемией сердечно-сосудистых осложнений, например, в рамках генотерапии.

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что для ингибирования или уменьшения экспрессии протеинкиназы-α используют активатор протеинкиназы С-α. Активатором предпочтительно является производное форбола, в особенности 12-0тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТРА) или форбол-12,13-дибутират (РЭВи). Известно, что инкубация клеток, например, с РЭВи в течение периода времени от 16 до 24 ч приводит к полной регуляции по типу обратной связи РКС-α (ВикиЛ и др., 1. 8игд. Век., 63, 137-142 (1996)). Также известно, что обработка с помощью более высокой концентрации ТРА, например 1,6 мкМ, полностью ингибирует экспрессию РКС-α. Согласно изобретению поэтому предусматривается обработка больной ткани с помощью сложных эфиров форбола в концентрации предпочтительно более, чем 1,6 мкМ, в течение периода времени по меньшей мере 15 ч для частичного или полного блокирования экспрессии РКС-α в соответствующих тканях или органах.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления предусматривается использование ингибитора для ингибирования или уменьшения активности протеинкиназы-α. Согласно настоящему изобретению под термином ингибитор понимают вещество, которое конкурирующе ингибирует биологическую активность протеинкиназы С-α, аллостерически изменяет пространственную структуру РКС-α или ингибирует РКС-α путем ингибирования субстрата.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения ингибитором является специфически реагирующее с протеинкиназой С-α антитело. Под термином антитело понимают полипептиды, которые кодируются по существу геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов, или их фрагменты, которые могут специфически связывать и распознавать анализируемое вещество, то есть, антиген. За счет связывания антитела с РКС-α ингибируется его биологическая активность. Согласно изобретению антитела против протеинкиназы С-α могут находиться в виде интактных иммуноглобулинов или в виде ряда фрагментов, которые образуются за счет расщепления с помощью различных пептидаз. Используемое согласно изобретению понятие антитело относится также к модифицированным антителам, например, олигомерным антителам, восстановленным антителам, окисленным антителам и маркированным антителам. Понятие антитело включает также фрагменты антител, которые получают либо путем модификации всего антитела, либо бе ηονο при использовании способов рекомбинации ДНК. Понятие антитело поэтому включает как интактные молекулы, так и также их фрагменты, как РаЬ, Р(аЬ')₂ и Ρν, которые могут связываться с эпитопными детерминантами. Эти фрагменты антител сохраняют способность селективно связывать соответствующий антиген. Способы получения антител, соответственно, их фрагментов известны в уровне техники.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемым согласно изобретению для ингибирования активности протеинкиназы С-α антителом является моноклональное или поликлональное антитело. Согласно изобретению антитело может представлять собой также гуманизированное антитело. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемыми для ингибирования активности протеинкиназы С-α антителами являются таковые, описанные СообшдЫ и др., 1. Вю1. С1ет., 270, 9991-10001 (1995).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что используемый согласно заявке для ингибирования РКС-α ингибитор изменяет статус фосфорилирования протеинкиназы С-α и благодаря этому ингибирует и по меньшей мере уменьшает активность РКСα. Из публикации Такша1о и др., Вюейет. 1., 334, 243-249 (1998), известно, что α-токоферол может инактивировать клеточную протеинкиназу С-α тем, что изменяется статус фосфорилирования РКС-α. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения поэтому предусматривается применение α-токоферола для ингибирования активности РКС-α и вследствие этого для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечно-сосудистых заболеваний, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией.

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается применение антагонистов РКС-α для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечнососудистых заболеваний, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних

- 8 007926 повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечнососудистых осложнений у больных с гипертонией и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией. Согласно настоящему изобретению под термином антагонист понимают вещество, которое конкурирует с РКС-α в отношении связывания со специфичным к РКС-α субстратом, однако, после связывания с субстратом не оказывая такого же действия, как РКС-α. Под антагонистами понимают также вещества, которые благодаря своей структуре адаптируются к инактивной конформации специфичного к РКС-α субстрата и поэтому предотвращают активацию субстрата за счет РКС-α.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения в качестве антагониста для ингибирования активности РКС-α используют производное РКС-α, которое, правда, может связываться с субстратами нативной РКС-α, однако, после связывания с ними не может оказывать такое же биологическое действие, как нативная РКС-α.

Согласно настоящему изобретению под производными понимают функциональные эквиваленты или производные протеинкиназы С-α, которые получают, при сохранении основной структуры РКС-α, за счет замены атомов или молекулярных групп, соответственно, остатков, и/или аминокислотные последовательности которых отличаются от естественно встречающихся человеческих или животных молекул РКС-α по меньшей мере в одном положении, которые, однако, по существу обладают высокой степенью гомологии в аминокислотной области. Согласно изобретению понятие производное включает также слитые протеины, в случае которых в Ν-терминальной части, соответственно, в С-терминальной части находятся функциональные домены другого протеина, например, другого ингибитора РКС-α.

Различие между производным и нативной РКС-α может возникать, например, за счет мутаций, например, за счет делеций, замещений, инсерций, присоединений, замены оснований и/или рекомбинаций кодирующих аминокислотные последовательности РКС-α неуклеотидных последовательностей. Понятно, что при этом речь может идти также о естественно встречающихся вариациях последовательностей, например, о последовательностях из другого организма или о последовательностях, которые мутируют естествнным образом, или мутациях, которые целенаправленно вводят в соответствующие последовательности с помощью обычных, известных специалисту средств, например, химических агентов и/или физических агентов.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения в качестве антагониста для ингибирования активности РКС-α используют аналог РКС-α. Согласно настоящему изобретению под термином аналоги протеинкиназы С понимают соединения, которые не обладают идентичной с протеинкиназой С-α аминокислотной последовательностью, однако, трехмерная структура которых очень подобна структуре протеинкиназы С-α. Используемые согласно изобретению аналоги РКС-α предпочтительно обладают подобными, специфичными к субстрату свойствами, как РКС-α, то есть, могут связываться со специфичными к РКС-α субстратами, однако, предпочтительно не обладают каталитическими свойствами РКС-α. В случае используемых согласно изобретению аналогов протеинкиназы С-α поэтому речь может идти, например, о соединениях, которые содержат ответственные за связывание протеинканазы С-α с субстратами РКС-α аминокислотные остатки в пригодной конформации и которые поэтому могут имитировать основные свойства места связывания протеинкиназы С-α, однако, без обладания такими же каталитическими свойствами, как протеинкиназа С-α.

Согласно дальнейшему варианту осуществления изобретения предусматривается, что для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечно-сосудистых заболеваний, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией используют агенты, которые уменьшают или ингибируют экспрессию и/или активность не только протеинкиназы С-α (РКС-α), но и также одновременно экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β (РКС-β). ТакайакЫ и Каттига в 1. 1пус51. Эсгта1о1.. 117, 605-611 (2001), сообщают, что иммуносупрессор циклоспорин А одновременно уменьшает экспрессию α-, βΙ- и βΙΙ-изоформ протеинкиназы С. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается применение циклоспорина А для уменьшения экспрессии РКС-α и РКС-β и, таким образом, для лечения вышеуказанных заболеваний.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что агент, который специфически уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α, используют в сочетании с агентом, который специфически уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β. Согласно изобретению под термином протеинкиназа Сβ понимают как протеинкиназу С-βΙ, так и сплайсинговый вариант βΙΙ.

Согласно изобретению предусматривается, что агент, уменьшающий или ингибирующий экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β, выбирают из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-β, содержащих нуклеиновую кислоту векторов, содержащих векторы клеток-хозяев, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-β веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-β веществ, антагонистов ак

- 9 007926 тивности протеинкиназы С-β и ингибиторов активности протеинкиназы С-β.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемую в качестве агента нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из

a) нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческую протеинкиназу С-β, или ее фрагмента;

c) нуклеиновой кислоты, которую получена путем замещения, присоединения, инверсии и/или делеции одного или нескольких оснований нуклеиновой кислоты по п. а) или Ь), или ее фрагмента; и

б) нуклеиновой кислоты, обладающей гомологией более чем 80%, к нуклеиновой кислоте по пп.а)с), или ее фрагмента.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемая согласно изобретению нуклеиновая кислота кодирует человеческую РКС-α, соответственно, ее части.

В случае используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты речь может идти о последовательности ДНК или РНК, в особенности в линейной форме. Нуклеиновой кислотой может быть нуклеиновая кислота, выделяемая из естественных источников, например, из эукариотических тканей, предпочтительно из тканей млекопитающих, более предпочтительно из человеческих тканей, или нуклеиновая кислота может быть получена синтетическим путем.

Согласно изобретению в особенности предусматривается, что используемая в качестве агента нуклеиновая кислота, если она встроена в вектор, в особенности в вектор экспрессии, в клетке-хозяине в антисмысловой ориентации к промотору, может ингибировать экспрессию гена человеческой протеинкиназы С-β. При инсерции в вектор используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты в антисмысловой ориентации, то есть, при наличии антисмысловой конструкции используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты, нуклеиновая кислота транскрибируется в качестве антисмысловой нуклеиновой кислоты. В случае транскрипции гена нативной РКС-β клетки, полученный антисмысловой транскрипт используемой согласно изобретению нуклеиновой кислоты можно связывать с находящимся в смысловой ориентации транскриптом мРНК гена нативной протеинкиназы С-β с образованием дуплексной структуры. Таким образом, селективно препятствуют трансляции мРНК гена нативной РКС-β в полипептиде и специфически ингибируют экспрессию нативной РКС-β, не ингибируя экспрессии других клеточных изоформ РКС.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что используемая для получения антисмысловых конструкций нуклеиновая кислота включает не всю кодирующую РКС-β последовательность, а только ее фрагменты. Эти фрагменты включают по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов, причем перенапряженные фрагментами нуклеотидные участки кодирующей РКС-β последовательности выбирают таким образом, что при экспрессии фрагментов в антисмысловой ориентации в клетке происходит специфическое ингибирование экспрессии РКС-β, в особенности человеческой РКС-β, но, не ингибирование других изоформ РКС.

Согласно изобретению предусматривается, что вышеуказанную нуклеиновую кислоту или ее пригодный фрагмент встраивают в вектор под контролем по меньшей мере одного элемента регуляции экспрессии, причем нуклеиновую кислоту или ее фрагмент встраивают в антисмысловой ориентации к элементам регуляции экспрессии. После введения вектора в клетку, например, клетку млекопитающего, в особенности в человеческую клетку, таким образом, нуклеиновая кислота или ее фрагмент может экспрессироваться в антисмысловой ориентации и благодаря этому можно эффективно ингибировать экспрессию нативной РКС-β клетки. В случае вектора речь идет предпочтительно о плазмиде, космиде, бактериофаге или вирусе.

Настоящее изобретение поэтому относится также к вектору, который включает кодирующую РКС-β нуклеотидную последовательность или фрагмент под функциональным контролем по меньшей мере одного элемента регуляции экспрессии, причем нуклеиновая кислота или ее фрагмент встраивается в антисмысловой ориентации к элементу регуляции. В случае элемента регуляции экспрессии речь идет в особенности о промоторе, месте связывания рибосом, сигнальной последовательности или З'-терминаторе транскрипции.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения для ингибирования экспрессии РКС-β используют синтетически получаемые антисмысловые олигонуклеотиды, которые включают по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов. Такие антисмысловые олигонуклеотиды можно прямо использовать для ингибирования экспрессии РКС-β, то есть, не нужно встраивать в вектор и экспрессировать в клеточных условиях.

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления изобретения для ингибирования активности протеинкиназы С-β предусматривается использование специфически реагирующего с

- 10 007926 протеинкиназой С-β антитела или его пригодного фрагмента. Согласно изобретению в случае антитела речь может идти о монокональном или поликлональном антителе. Используемым согласно изобретению антителом может быть также гуманизированное антитело.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения для ингибирования активности протеинкиназы С-β предусматривается использование вещества, которое изменяет статус фосфорилирования протеинкиназы С-β.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения для ингибирования активности протеинкиназы С-β предусматривается использование производного или аналога протеинкиназы С-β, которые действуют в качестве антагонистов РКС-β. В случае используемых согласно изобретению производных или аналогов РКС-β речь идет о веществах, которые конкурируют с нативной РКС-β в отношении связывания со специфичными к РКС-β субстратами, однако, после связывания с субстратами не оказывая такого же действия, как РКС-β.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения для специфического ингибирования или уменьшения экспрессии и/или активности протеинкиназы С-β используют соединения, описанные в следующих документах: патент США 5491242, патент США 5661173, патент США 5481003, патент США 5668152, патент США 5672618, заявка №0-95/17182, заявка №0-95/35294 и заявка №0-02/......

Следующий предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению агентов, которые специфически уменьшают или ингибируют экспрессию и/или активность протеинкиназы Сα (РКС-α), для получения фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики коронарной болезни сердца, инфаркта сердца, периферического облитерирующего заболевания, инсульта, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечнососудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией. Согласно изобретению в случае сердечно-сосудистых осложнений речь идет предпочтительно о коронарной болезни сердца, инфаркте сердца, периферическом облитерирующем заболевании и инсульте. В случае диабетических поздних повреждений речь идет в особенности о диабетической ретинопатии, диабетической невропатии и диабетической нефропатии.

Согласно настоящему изобретению под фармацевтической композицией или лекарственным средством понимают используемую для диагностических, терапевтических и/или профилактических целей, следовательно, способствующую или восстанавливающую здоровье организма человека или животного, смесь, которая включает по меньшей мере одно натуральное или синтетически полученное биологически активное вещество, оказывающее терапевтическое действие. Фармацевтическая композиция может представлять собой как твердую, так и жидкую смесь. Например, фармацевтическая композиция, включающая биологически активное вещество, может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов. Сверх того, фармацевтическая композиция может включать обычно используемые в данной области добавки, как, например, стабилизаторы, вспомогательные средства, смазки, порофоры, эмульгаторы или другие вещества, обычно используемые для получения фармацевтической композиции.

Согласно изобретению предусматривается в особенности применение агентов, которые специфически уменьшают или ингибируют экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α), в качестве биологически активного вещества для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики вышеуказанных заболеваний. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемые для получения фармацевтических композиций агенты выбирают из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-α; содержащих нуклеиновую кислоту векторов, содержащих векторы клеток-хозяев, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-α веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-α веществ, антагонистов активности протеинкиназы С-α и ингибиторов активности протеинкиназы С-α.

В случае используемых для получения предлагаемой согласно изобретению фармацевтической композиции агентов речь идет особенно предпочтительно о антисмысловых олигонуклеотидах кодирующего протеинкиназу С-α гена, токофероле, производных форбола, производных протеинкиназы С-α или аналогах протеинкиназы С-α.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что фармацевтическую композицию используют для парентерального, в особенности внутривенного, внутримышечного, чрескожного или подкожного введения.

Лекарственное средство, содержащее используемые согласно изобретению агенты, предпочтительно находится в форме для инъекции или инфузии.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается, что фармацевтическую композицию, содержащую используемые согласно изобретению агенты, вводят перорально. Например, лекарственное средство вводят в жидкой форме такой как раствор, суспензия или эмульсия, или в твердой форме, такой как таблетка.

Настоящее изобретение поэтому относится также к фармацевтическим композициям для профилак

- 11 007926 тики и/или лечения коронарной болезни сердца, инфаркта сердца, периферического облитерирующего заболевания, инсульта, протекающих с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией, включающим по меньшей мере один агент, который специфически уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α), в качестве биологически активного вещества.

Согласно предпочтительному варианту осуществления агенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, выбирают из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-α; содержащих нуклеиновую кислоту векторов, содержащих векторы клеток-хозяев, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-α веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-α веществ, антагонистов активности протеинкиназы С-α и ингибиторов активности протеинкиназы С-α.

Предлагаемая согласно изобретению композиция особенно предпочтительно содержит антисмысловые олигонуклеотиды кодирующего протеинкиназу С-α гена, токоферол, производные форбола, производные протеинкиназы С-α или аналоги протеинкиназы С-α.

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления предлагаемая согласно изобретению фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно другое биологически активное вещество. В случае другого биологически активного вещества речь идет в особенности об агенте, который специфически уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β.

Агент, уменьшающий или ингибирующий экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-β; содержащих нуклеиновую кислоту векторов, содержащих векторы клеток-хозяев, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-β веществ, ингибиующих транслокацию протеинкиназы С-β веществ, антагонистов активности протеинкиназы С-β и ингибиторов активности протеинкиназы С-β.

Дальнейшие предпочтительные варианты осуществления изобретения следуют из зависимых пунктов формулы изобретения.

Изобретение поясняется подробнее с помощью следующих фигур и примеров.

На фиг. 1 представлено выделение альбумина в моче лишенных РКС-α мышей с сахарным диабетом и без сахарного диабета (контроль) и мышей 8У129 с диабетом и без диабета (контроль). При этом концентрацию альбумина определяли при использовании непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Определенные величины содержания альбумина относили к концентрации креатинина. Мыши 8У129 и РКС-α^7- без диабета имеют сравнимую долю альбумин/креатинин, которая, как правило, составляет менее 10 г/моль. Напротив, у мышей 8У129 с диабетом доля значительно выше (р=0,04). Значения в случае мышей РКС-α⁷^ диабетом были значительно ниже, чем значения в случае мышей 8У129 с диабетом (Р<0,001). Поперечная линия означает среднее значение. Значимость определяли с помощью υ-критерия Мапп-\С1Шпеу.

На фиг. 2 представлена гломерулярная экспрессия УЕСР в случае лишенных РКС-α мышей с сахарным диабетом и без сахарного диабета (контроль) и мышей 8У129 с диабетом и без диабета (контроль). При этом на группу животных полуколичественно оценивали иммуногистохимическими способами в каждом случае 40 клубочков, причем осуществляли подразделение на слабую, среднюю и сильную иммунофлуоресценцию. Значимость рассчитывали с помощью υ-критерия Мапп-\У1Шпеу. Экспрессия УЕСР в случае животных с диабетом была значительно выше, чем в случае контрольных животных (р<0,001). Однако экспрессия УЕСР в случае животных 8У129 с диабетом была значительно выше, чем в случае животных РКС-α^7- с диабетом (р<0,001).

На фиг. 3 представлена гломерулярная экспрессия рецептора II УЕСР в случае лишенных РКС-α мышей с сахарным диабетом и без сахарного диабета (контроль) и мышей 8У129 с диабетом и без диабета (контроль). При этом на группу животных полуколичественно оценивали иммуногистохимическими способами в каждом случае 40 клубочков, причем осуществляли подразделение на слабую, среднюю и сильную иммунофлуоресценцию. Значимость рассчитывали с помощью υ-критерия Мапп-\С1Шпеу. Экспрессия УЕСРК.-П в случае животных с диабетом была значительно выше, чем в случае контрольных животных (р<0,001). Однако экспрессия УЕСРК.-П в случае животных 8У129 с диабетом была значительно выше, чем в случае животных РКС-α^7- с диабетом (р<0,001).

На фиг. 4 представлена гломерулярная экспрессия перлекана в случае лишенных РКС-α мышей с сахарным диабетом и без сахарного диабета (контроль) и мышей 8У129 с диабетом и без диабета (контроль). При этом на группу животных полуколичественно оценивали иммуногистохимическими способами в каждом случае 40 клубочков, причем осуществляли подразделение на слабую, среднюю и сильную иммунофлуоресценцию. Значимость рассчитывали с помощью υ-критерия Мапп-\У1Шпеу. Экспрессия перлекана в случае животных 8У129 с диабетом была значительно ниже, чем в случае контрольных животных 8У129 (р<0,001).

- 12 007926

Пример 1. Экспериментальное провоцирование диабета.

При использовании мышей, которых содержали в стандартных условиях при температуре 22°С и которые имели свободный доступ к корму и воде, в соответствии с разрешением Общества по охране животных Нижней Саксонии, проводили следующие опыты.

Перед началом опыта у всех животных по сыворотке определяли уровень сахара в крови. Результаты представлены в таблице. У 16 контрольных мышей 8У129 и 14 лишенных протеинкиназы С-α (РКСα^-/-) мышей 8У129 индуцировали диабет путем инъекции стрептозотоцина. Стрептозотоцин приводит к разрушению продуцирующих инсулин клеток островкового аппарата поджелудочной железы. За счет возникающего дефицита инсулина имеет место долговременное повышение уровня сахара в крови, то есть, гипергликемия, и тем самым сахарный диабет. Для провоцирования гипергликемии животным в дни 1 и 4 интраперитонеально вводили, в каждом случае 125 мг стрептозотоцина/кг массы тела. Для этого стрептозотоцин растворяли в 50 мМ растворе цитрата натрия со значением рН=4,5.

Для контроля 7 мышам 8У129 и 6 мышам РКС-а^-/- интраперитонеально в дни 1 и 4 вводили только растворитель. Затем у мышей каждые 2 дня отбирали каплю крови из хвоста для контролирования уровня сахара в крови. Определение содержания сахара в крови осуществляли с помощью измерительного прибора С1исоте1ег Е1Де® фирмы Байер. Для определения использовали тест-полоски С1исоте1ег Εΐίΐο Зепзог®.

На 7-10 день у животных, которым был введен стрептозотоцин, был провоцирован диабет при содержаниях сахара в крови выше 350 мг/дл. Перед инъекцией стрептозотоцина исходные значения составляли в среднем 200 мг/дл. У животных, которые получали только растворитель, не произошло никакого повышения уровня сахара в крови и у них не обнаружили сахарного диабета. Спустя 10 дней после первой инъекции животных наблюдали в течение следующих 8 недель. В течение этого времени каждые две недели контролировали содержание сахара в крови, для того, чтобы удостовериться, что животные с диабетом далее оставались больными диабетом. Содержания сахара у животных с диабетом в течение этого времени колебались в среднем в пределах около 500-550 мг/дл, а в случае животных без диабета составляли около 200 мг/дл.

Спустя 8 недель животных анестезировали наркотическим средством авертином. Под наркозом затем из сплетения глазных вен отбирали 400 мкл крови и из мочевого пузыря путем пункции с помощью иглы 27 О отбирали всю мочу. После этого почки через брюшную аорту перфундировали с помощью лактатного раствора Рингера и почки удаляли. Животных тотчас после этого умерщвляли под наркозом. Содержания сахара в крови затем определяли по сыворотке. Уровни сахара в крови представлены в таблице. Как видно, животные с диабетом имеют примерно в 2,5-3 раза более высокие содержания глюкозы, чем в начале опыта и также по сравнению с контрольными животными без диабета.

Содержание глюкозы в сыворотке у мышей с диабетом и без диабета до начала опыта и в конце опыта

	Содержание глюкозы в сыворотке до начала опыта (мг/дл)	Содержание глюкозы в сыворотке в конце опыта (мг/дл)
5У129, контроль (п=7)	205 ± 40	223 ± 43
ЗУ129, с диабетом (п=1б)	192 ± 36	505 ± 80*
РКС-а^/”, контроль (п=6)	223 ± 27	197 ± 21
РКС-а^/“, с диабетом (п=14)	225 ± 31	589 ± 98*

* р<0,001 по сравнению с контрольными животными без диабета

Пример 2. Определение концентрации альбумина.

Возникновение альбуминурии у больных диабетом представляет собой известное явление. Поэтому определяли выделение альбумина в моче лишенных РКС-α мышей с сахарным диабетом и без сахарного диабета (контроль) и мышей 8У129 с диабетом и без диабета (контроль). Для этого определяли концентрацию альбумина в собранной моче. Для определения концентрации альбумина использовали непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЕ18Л) (Л1Ьитее11 М®, фирма Ехосе11 1пс., Филадельфия, США). Этот ЕЕ18Л специфичен для мышиного альбумина. Определение осуществляли соответственно

- 13 007926 указаниям изготовителя. Для того, чтобы можно было учитывать колебания в выделении мочи, определенные значения содержания альбумина соотносили к концентрации креатинина в моче. Результаты представлены на фиг. 1. При этом оказалось, что мыши ЗУ129 и РКС-α без диабета имеют сравнимый коэффициент альбумин/креатинин, который, как правило, составляет менее 10 г/моль. Напротив, в случае мышей ЗУ129 с диабетом этот коэффициент значительно выше (р=0,004). Среднее значение составляет 21,5 г/моль по отношению к 7,48 г/моль у контрольных животных ЗУ129 без диабета. По сравнению с этим, в случае мышей РКС-α^- с диабетом не происходит никакого значительного увеличения альбуминурии. Коэффициент альбумин/креатинин составляет всегда ниже 20 г/моль и среднее значение соответствует 10,2 г/моль. Среднее значение в случае контрольных мышей РКС-а^-/- без диабета составляет 8,5 г/моль. Значения в случае мышей РКС-а^-/- с диабетом были значительно ниже, чем значения в случае мышей ЗУ129 с диабетом (Р<0,001). Результаты представлены на фиг. 1.

Пример 3. Определение экспрессии УЕСЕ и рецептора-ΙΙ УЕСЕ.

Как указано выше в примере 1, всех животных по окончании опыта умерщвляли. Непосредственно после этого извлекали почки и замораживали при температуре -70°С. Последующий анализ извлеченных почек показал в почечных тельцах (клубочках) контрольных животных с диабетом значительное увеличение экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕСЕ) и рецептора-ΙΙ УЕСЕ (УЕСЕК-ΙΙ). Обнаружение экспрессии УЕСЕ и УЕСЕК-ΙΙ осуществляли с помощью иммуногистохимических способов. Для этого замороженные при температуре -70°С почки разрезали в замороженном состоянии с получением срезов толщиной 6 нм и высушивали на воздухе. Затем замороженные срезы фиксировали с помощью холодного ацетона, высушивали на воздухе и промывали с помощью Трис-буфера (ТВЗ: 0,05М Трис-буфера, 0,15 М №101. рН=7,6). Замороженные срезы затем инкубировали в течение 60 мин во влажной камере с первичным поликлональным кроличьим антителом против мышиного УЕСЕ (8ап!а Сгих, А-20), соответственно, УЕСЕК-ΙΙ (8ап!а Сгих, С-1158). После новой промывки с помощью ТВЗ срезы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с Су3-маркированным вторичным антикроличьим антителом Оаскхоп [ттипгс5сагс11 ЬаЬогаЮпех, 711-165-152) и еще раз промывали с помощью ТВ8. Затем препараты оценивали и фотографировали при использовании микроскопа Хебх Ахюр1ап-2 (2е188, 1епа, Германия). В случае всех животных оценивали, в каждом случае 40 почечных телец, причем интенсивность флуоресценции подразделяли на сильную, среднюю и слабую. При этом у контрольных животных ЗУ129 с диабетом обнаружено значительное увеличение (р<0,001) экспрессии УЕСЕ и УЕСЕК-ΙΙ по сравнению с контрольными животными без диабета. По сравнению с этим увеличение экспрессии у мышей ЗУ129 и РКС-а^-/-с диабетом выражено значительно меньше (р<0,001). Результаты представлены на фиг. 2 и 3.

Пример 4. Определение экспрессии перлекана.

Так как установленную различную экспрессию УЕСЕ можно объяснять не только различием в альбуминурии, исследовали экспрессию гепарансульфат-протеогликана, перлекана, в почках животных с диабетом и без диабета при использовании иммуногистохимических способов. При этом, как описано в Примере 3, готовили и фиксировали криосрезы почек. В качестве первого антитела использовали моноклональное крысиное антитело, направленное против мышиного перлекана (ΚΌΙ 8у51ет5, А7Ь6). В качестве вторичного антитела использовали СуЗ-маркированное ослиное антикрысиное антитело Оаскхоп ЬаЬогаЮпех, 712-165-153). Иммуногистохимическое исследование срезов совершенно неожиданно показало, что перлекан в случае контрольных мышей с диабетом более не обнаруживают или еще едва обнаруживают (см. фиг. 4). Таким образом, ни в клубочке, ни в стенке сосуда артериол перлекан нельзя обнаружить. Напротив, экспрессия перлекана в случае мышей ЗУ129 и РКС-α остается неизмененной или только незначительно уменьшается. Так как отсутствие гепарансульфата в качестве одного из основных медиаторов имеет значение при возникновении протеинурии, нужно исходить из того, что этот результат может объяснять отсутствие альбуминурии.

Claims

1. Применение агентов, уменьшающих или ингибирующих экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α), для получения фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики заболеваний сосудов, сердечно-сосудистых заболеваний, коронарной болезни сердца, заболеваний со сниженным сердечным выбросом, инфаркта сердца, периферического облитерирующего заболевания, инсульта, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии и диабетической нефропатии, сердечно-сосудистых осложнений у больных с гипертонией и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией, причем агенты выбраны из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-α; векторов, содержащих указанную нуклеиновую кислоту, клеток-хозяев, содержащих указанные векторы, веществ, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-α, веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-α, антагонистов активности протеинкиназы Сα и ингибиторов активности протеинкиназы С-α.

2. Применение по п.1, где ассоциированными с протеинурией заболеваниями почек являются па

- 14 007926 ренхиматозные заболевания почек, причем протеинурией является гломерулярная протеинурия, тубулярная протеинурия или гломерулярно-тубулярная смешанная протеинурия, заболеваниями почек являются нефропатия с минимальными изменениями, прочие гломерулопатии, амилоидоз почек, наследственная тубулопатия, ренально-тубулярный ацидоз, медикаментозно или бактериально индуцированный интерстициальный нефрит, острая почечная недостаточность, нефропатия Бенс-Джонс или трансплантация почек.

3. Применение по п.2, где нуклеиновая кислота в клетке-хозяине в антисмысловой ориентации к промотору может ингибировать экспрессию гена человеческой протеинкиназы С-α.

4. Применение по любому из пп.1-3, где агентами являются антисмысловые олигонуклеотиды гена, кодирующего протеинкиназу С-α, производные протеинкиназы С-α или аналоги протеинкиназы С-α.

5. Применение по п.2 и/или 3, где нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из

a) нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческую протеинкиназу С-α или ее фрагмента;

c) нуклеиновой кислоты, которая получена путем замещения, присоединения, инверсии и/или делеции одного или нескольких оснований нуклеиновой кислоты по п.а) или Ь), или ее фрагмента; и

6. Применение по п.5, где фрагмент нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов.

7. Применение по любому из пп.2-6, где нуклеиновой кислотой является ДНК или РНК.

8. Применение по любому из пп.2-7, где нуклеиновая кислота или ее фрагмент встраивается в вектор под контролем по меньшей мере одного элемента регуляции экспрессии в антисмысловой ориентации к нему.

9. Применение по п.8, где вектором является плазмида, космида, бактериофаг или вирус.

10. Применение по п.8 или 9, где элементом регуляции экспрессии является промотор, место связывания рибосом, сигнальная последовательность или З'-терминатор транскрипции.

11. Применение по любому из пп.8-10, где вектор содержится в клетке-хозяине, такой как клетка млекопитающего, в особенности человеческая клетка, и клеткой-хозяином не является клетка человека или млекопитающего в своем естественном состоянии.

12. Применение по любому из пп.2-4, где веществом, ингибирующим или уменьшающим экспрессию протеинкиназы С-α, является антитело, реагирующее с протеинкиназой С-α, в частности, моноклональное или поликлональное антитело, такое как гуманизированное антитело, причем ингибитор изменяет статус фосфорилирования протеинкиназы С-α, и антагонистом является производное или аналог протеинкиназы С-α.

13. Применение по любому из пп.1-12, где агентом, уменьшающим или ингибирующим экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α, является агент, который одновременно уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β.

14. Применение по любому из пп.1-12, где используется агент, который специфически уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α, в сочетании с агентом, который специфически уменьшает или ингибирует экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β.

15. Применение по п.14, где агент, уменьшающий или ингибирующий экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β, выбран из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, которые уменьшают или ингибируют экспрессию гена протеинкиназы С-β, векторов, содержащих указанную нуклеиновую кислоту, клеток-хозяев, содержащих указанные векторы, веществ, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-β, веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-β, антагонистов активности протеинкиназы С-β и ингибиторов активности протеинкиназы С-β.

16. Применение по п.15, где нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из

b) нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте по п. а), или ее фрагмента;

б) нуклеиновой кислоты, обладающей гомологией более чем 80% к нуклеиновой кислоте по пп.а)с), или ее фрагмента.

17. Применение по п.16, где фрагмент нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов, причем нуклеиновой кислотой является ДНК или РНК.

18. Применение по любому из пп.15-17, где нуклеиновая кислота или ее фрагмент встраивается в вектор под контролем по меньшей мере одного элемента регуляции экспрессии, например, промотор, место связывания рибосом, сигнальная последовательность или 3'-терминатор транскрипции в антисмысловой ориентации к нему.

- 15 007926

19. Применение по п.18, где вектором является плазмида, космида, бактериофаг или вирус, например, промотор, место связывания рибосом, сигнальная последовательность или З'-терминатор транскрипции.

20. Применение по п.18 и/или 19, где вектор содержится в клетке-хозяине, в особенности клетке млекопитающего, в особенности человеческой клетке.

21. Применение по п.15, где ингибитором является антитело, реагирующее с протеинкиназой С-β, в частности, антителом является моноклональное или поликлональное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.

22. Применение по п.15, где ингибитор изменяет статус фосфорилирования протеинкиназы С-β.

23. Применение по п.15, где антагонистом является производное или аналог протеинкиназы С-β.

24. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения коронарной болезни сердца, инфаркта сердца, заболеваний со сниженным сердечным выбросом, периферического облитерирующего заболевания, инсульта, ассоциированных с протеинурией заболеваний почек, диабетических поздних повреждений и/или сердечно-сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом, сердечнососудистых осложнений у больных с гипертонией и сердечно-сосудистых осложнений у больных с гиперхолестеринемией, включающая в качестве активного вещества по меньшей мере один агент, специфически уменьшающий или ингибирующий экспрессию и/или активность протеинкиназы С-α (РКС-α) и протеинкиназы С-β, причем агенты выбраны из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, уменьшающих или ингибирующих экспрессию гена протеинкиназы С-α, векторов, содержащих указанную нуклеиновую кислоту, клеток-хозяев, содержащих указанные векторы, веществ, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-α, веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-α, антагонистов активности протеинкиназы С-α и ингибиторов активности протеинкиназы С-α.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, где агентами являются антисмысловые олигонуклеотиды гена, кодирующего протеинкиназу С-α, производные протеинкиназы С-α или аналоги протеинкиназы С-α.

26. Фармацевтическая композиция по любому из пп.24 и/или 25, где агент, уменьшающий или ингибирующий экспрессию и/или активность протеинкиназы С-β, выбран из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, уменьшающих или ингибирующих экспрессию гена протеинкиназы С-β, векторов, содержащих указанную нуклеиновую кислоту, клеток-хозяев, содержащих указанные векторы, веществ, ингибирующих или уменьшающих экспрессию протеинкиназы С-β, веществ, ингибирующих транслокацию протеинкиназы С-β, антагонистов активности протеинкиназы С-β и ингибиторов активности протеинкиназы С-β.